Calibracion de Un Cromatografo e HPLC

7/29/2019 Calibracion de Un Cromatografo e HPLC

1/48

Edicin digital 1

PROCEDIMIENTO QU- 004 PARA LACALIBRACIN EQUIPOS DE

CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DEALTA RESOLUCIN HPLC

09


2/48

Edicin digital 1

Este procedimiento ha sido revisado, corregido y actualizado, siha sido necesario.

La presente edicin se emite en formato digital. Hay disponibleuna edicin en papel que se puede adquirir en nuestrodepartamento de publicaciones.

Este procedimiento de calibracin es susceptible de modificacin

permanente a instancia de cualquier persona o entidad. Laspropuestas de modificacin se dirigirn por escrito, justificandosu necesidad, a cualquiera de las siguientes direcciones:

Correo postalCentro Espaol de MetrologaC/ del Alfar, 2,28760 Tres Cantos, Madrid

Correo [email protected]
mailto:[email protected]:[email protected]


3/48

Procedimiento QU-004. Edicin digi tal 1 Pgina 3 de 48

MINISTERIODE INDUSTRIA, TURISMO YCOMERCIO

NDICE

Pgina

1. OBJETO ........................................................................................... 4

2. ALCANCE ......................................................................................... 4

3. DEFINICIONES ................................................................................ 4

4. GENERALIDADES ......................................................................... 15

4.1. Abreviaturas ............................................................................ 154.2. Principios cromatogrficos ...................................................... 174.3. Calibracin .............................................................................. 204.4. Mtodo de la interpolacin entre dos puntos.......................... 21

5. DESCRIPCIN................................................................................ 22

5.1. Equipos y materiales............................................................... 235.2. Operaciones previas ............................................................... 245.3. Proceso de calibracin............................................................ 275.4. Toma y tratamiento de datos .................................................. 29

6. RESULTADOS................................................................................ 31

6.1. Clculo de incertidumbres....................................................... 316.2. Interpretacin de resultados.................................................... 39

7. REFERENCIAS .............................................................................. 42

8. ANEXOS ......................................................................................... 42

Anexo. Ejemplo numrico ............................................................... 43


4/48



1. OBJETO

El presente procedimiento tiene por objeto describir uno de los posiblesmtodos para la calibracin de Equipos de Cromatografa de Lquidosde Alta Resolucin (HPLC), para su uso posterior en determinacionescuantitativas, de analitos.

2. ALCANCE

El presente procedimiento es de aplicacin a cromatgrafos delquidos, usados para la realizacin de determinaciones cuantitativas ycuya calibracin se realice mediante el mtodo de interpolacin entredos puntos.

Este procedimiento se deber aplicar exclusivamente aconcentraciones comprendidas dentro de un rango de trabajo lineal.

Este procedimiento solo es vlido para analitos presentes endisoluciones que puedan ser inyectadas en un cromatgrafo delquidos.

Para la realizacin de determinados anlisis puede ser necesariaspruebas adicionales de validacin que garanticen que no existeinfluencia de la matriz en la determinacin.

No se incluyen en este procedimiento otras operaciones necesarias

para confirmar el correcto funcionamiento del equipo y que en algunoscasos van unidas al tipo de detector empleado (verificacininstrumental).

3. DEFINICIONES

Calibracin [3] (2.39)

Operacin que bajo condiciones especificadas establece, en unaprimera etapa, una relacin entre los valores y sus incertidumbres de


5/48



medida asociadas obtenidas a partir de los patrones de medida, y lascorrespondientes indicaciones con sus incertidumbres asociadas y, enuna segunda etapa, utiliza esta informacin para establecer unarelacin que permita obtener un resultado de medida a partir de unaindicacin.

NOTA 1 Una calibracin puede expresarse mediante unadeclaracin, una funcin de calibracin, un diagrama decalibracin, una curva de calibracin o una tabla de calibracin. En

algunos casos, puede consistir en una correccin aditiva omultiplicativa de la indicacin con su incertidumbrecorrespondiente.

NOTA 2 Conviene no confundir la calibracin con el ajuste de unsistema de medida, a menudo llamado incorrectamenteautocalibracin, ni con una verificacin de la calibracin.

NOTA 3 Frecuentemente se interpreta que nicamente la primera

etapa de esta definicin corresponde a la calibracin.

Coeficiente de VariacinRelacin entre la desviacin tpica y el valor absoluto esperado:

x

sCV=

Desviacin tpica experimental [1] (B.2.17)

Para una serie de n mediciones de un mismo mensurando, la magnitud sque caracteriza la dispersin de los resultados, dada por la frmula:

( )1

1

2

=

=

n

xx

s

n

i

i


6/48



siendo el resultado de la i-sima medicin yix x la media aritmtica delos n resultados considerados.

NOTAS

1. Considerando la serie de n valores como muestra de una distribucin, x es

un estimador insesgado de la media , y es un estimador insesgado de

la varianza de dicha distribucin.

2s2

2. La expresin ns es una estimacin de la desviacin tpica de la

distribucin de x y se denomina desviacin tpica experimental de la media.

3. La desviacin tpica experimental de la media en ocasiones se denomina,incorrectamente, error de la media.

Detector

Elemento del cromatgrafo que suministra una seal, en general,proporcional a la concentracin de la especie de inters (analito);existen diferentes tipos:

Detectores de Absorbancia Ultravioleta con monocromadores.

Detectores de Absorbancia en el infrarrojo.

Detectores de Fluorescencia.

Detectores de ndice de Refraccin.

Detectores de Dispersin de Luz.

Detectores Electroqumicos.

Detectores por Espectrometra de Masas.

Incertidumbre de medida [3] (2.26)


7/48



Parmetro no negativo que caracteriza la dispersin de los valoresatribuidos a un mensurando, a partir de la informacin que se utiliza

NOTA 1 La incertidumbre de medida incluye componentes procedentesde efectos sistemticos, tales como componentes asociadas acorrecciones y a valores asignados a patrones, as como laincertidumbre debida a la definicin. Algunas veces no se corrigen losefectos sistemticos estimados y en su lugar se tratan como

componentes de incertidumbre.

NOTA 2 El parmetro puede ser, por ejemplo, una desviacin tpica, encuyo caso se denomina incertidumbre tpica de medida (o un mltiplode ella), o una semiamplitud con una probabilidad de coberturadeterminada.

NOTA 3 En general, la incertidumbre de medida incluye numerosascomponentes. Algunas pueden calcularse mediante una evaluacin tipo

A de la incertidumbre de medida, a partir de la distribucin estadsticade los valores que proceden de las series de mediciones y puedencaracterizarse por desviaciones tpicas. Las otras componentes, quepueden calcularse mediante una evaluacin tipo B de la incertidumbrede medida, pueden caracterizarse tambin por desviaciones tpicas,evaluadas a partir de funciones de densidad de probabilidad basadasen la experiencia u otra informacin.

NOTA 4 En general, para una informacin dada, se sobrentiende que la

incertidumbre de medida est asociada a un valor determinadoatribuido al mensurando. Por tanto, una modificacin de este valorsupone una modificacin de la incertidumbre asociada.

Material de referencia [3] (5.13)

Material suficientemente homogneo y estable con respecto apropiedades especificadas, establecido como apto para su uso previstoen una medicin o en un examen de propiedades cualitativas


8/48



NOTA 1 El examen de una propiedad cualitativa comprende laasignacin de un valor a dicha propiedad y de una incertidumbreasociada. Esta incertidumbre no es una incertidumbre de medida.

NOTA 2 Los materiales de referencia con o sin valores asignadospueden servir para controlar la precisin de la medida, mientras quenicamente los materiales con valores asignados pueden utilizarsepara la calibracin o control de la veracidad.

NOTA 3 Los materiales de referencia comprenden materiales querepresentan tanto magnitudes como propiedades cualitativas.

EJEMPLO 1 Ejemplos de materiales de referencia que representanmagnitudes:a) agua de pureza declarada, cuya viscosidad dinmica se empleapara la calibracin de viscosmetros.b) suero humano sin valor asignado a la concentracin decolesterol inherente, utilizado solamente como material para el

control de la precisin de la medida.c) tejido de pescado con una fraccin msica determinada dedioxina, utilizado como calibrador.

EJEMPLO 2 Ejemplos de materiales de referencia que representanpropiedades cualitativas:a) carta de colores mostrando uno o ms colores especificados.b) ADN conteniendo una secuencia especificada de nucletido.c) orina conteniendo 19-androstenediona.

NOTA 4 Algunas veces un material de referencia se incorpora a undispositivo fabricado especialmente.

EJEMPLO 1 Sustancia de punto triple conocido en una clula depunto triple.

EJEMPLO 2 Vidrio de densidad ptica conocida, en un soporte defiltro de transmitancia.

EJEMPLO 3 Esferas de granulometra uniforme montadas en unportamuestras de microscopio.


9/48



NOTA 5 Algunos materiales de referencia tienen valores asignados queson metrolgicamente trazables a una unidad de medida fuera de unsistema de unidades. Tales materiales incluyen vacunas a las que laOrganizacin Mundial de la Salud ha asignado UnidadesInternacionales (UI).

NOTA 6 En una medicin dada, un material de referencia puedeutilizarse nicamente para calibracin o para el aseguramiento de la

calidad.

NOTA 7 Dentro de las especificaciones de un material de referenciaconviene incluir su trazabilidad, su origen y el proceso seguido (Accred.Qual. Assur.:2006).

NOTA 8 La definicin segn ISO/REMCO es anloga, pero emplea eltrmino proceso de medida para indicar examen (ISO 15189:2007,3.4), el cual cubre tanto una medicin de la magnitud como el examen

de una propiedad cualitativa.Material de referencia certificado (MRC) [3] (5.14)

Material de referencia acompaado por la documentacin emitida porun organismo autorizado, que proporciona uno o varios valores depropiedades especificadas, con incertidumbres y trazabilidadesasociadas, empleando procedimientos vlidos.

EJEMPLO Suero humano, con valores asignados a la concentracin decolesterol y a la incertidumbre de medida indicados en un certificado,empleado como calibrador o como material para el control de laveracidad de la medida.

NOTA 1 La documentacin mencionada se proporciona en forma decertificado (vase la Gua ISO 31:2000).

NOTA 2 Procedimientos para la produccin y certificacin de materialesde referencia certificados pueden encontrarse, por ejemplo, en lasGuas ISO 34 e ISO 35.


10/48



NOTA 3 En esta definicin, el trmino incertidumbre se refiere tanto ala incertidumbre de la medidacomo a la incertidumbre del valor de lapropiedad cualitativa, tal como su identidad y secuencia. El trminotrazabilidad incluye tanto la trazabilidad metrolgica del valor de lamagnitud como la trazabilidad del valor de la propiedad cualitativa.

NOTA 4 Los valores de las magnitudes especificadas de los materialesde referencia certificados requieren una trazabilidad metrolgica conuna incertidumbre de medida asociada (Accred. Qual. Assur.:2006).

NOTA 5 La definicin de ISO/REMCO es anloga (Accred. Qual.Assur.:2006) pero utiliza el calificativo metrolgica tanto para unamagnitud como para una propiedad cualitativa.

Matriz

Conjunto de sustancias que acompaan a un analito en una muestraconcreta. Se caracteriza por un nombre que indica el tipo de producto

(ej. vino, leche, etc.).Patrn de medida [3] (5.1)

Realizacin de la definicin de una magnitud dada, con un valordeterminado y una incertidumbre de medida asociada, tomada comoreferencia.

EJEMPLO 1 Patrn de masa de 1 kg, con una incertidumbre tpica

asociada de 3 g.EJEMPLO 2 Resistencia patrn de 100 , con una incertidumbretpica asociada de 1 .

EJEMPLO 3 Patrn de frecuencia de cesio, con una incertidumbretpica relativa asociada de 2 x 10-15.

EJEMPLO 4 Electrodo de referencia de hidrgeno, con un valorasignado de 7,072 y una incertidumbre tpica asociada de 0,006.


11/48



EJEMPLO 5 Serie de soluciones de referencia, de cortisol ensuero humano, que tienen un valor certificado con unaincertidumbre de medida.

EJEMPLO 6 Materiales de referencia con valores e incertidumbresde medida asociadas, para la concentracin de masa de diezprotenas diferentes.

NOTA 1 La realizacin de la definicin de una magnitud dada puede

establecerse mediante un sistema de medida, una medida materializada oun material de referencia.

NOTA 2 Un patrn se utiliza frecuentemente como referencia para obtenervalores medidos e incertidumbres de medida asociadas para otrasmagnitudes de la misma naturaleza, estableciendo as la trazabilidadmetrolgica, mediante calibracin de otros patrones, instrumentos osistemas de medida.

NOTA 3 El trmino realizacin se emplea aqu en su sentido msgeneral. Se refiere a tres procedimientos de realizacin, El primero, larealizacin stricto sensu, es la realizacin fsica de la unidad a partir de sudefinicin. El segundo, denominado reproduccin, consiste, no enrealizar la unidad a partir de su definicin, sino en construir un patrnaltamente reproducible basado en un fenmeno fsico, por ejemplo elempleo de lseres estabilizados en frecuencia para construir un patrn delmetro, el empleo del efecto Josephson para el volt o el efecto Hall cunticopara el ohm. El tercer procedimiento consiste en adoptar una medida

materializada como patrn. Es el caso del patrn de 1 kg.NOTA 4 La incertidumbre tpica asociada a un patrn es siempre unacomponente de la incertidumbre tpica combinada (vase la Gua ISO/IEC98-3:2008, 2.3.4) de un resultado de medida obtenido utilizando el patrn.Esta componente suele ser pequea comparada con otras componentesde la incertidumbre tpica combinada.

NOTA 5 El valor de la magnitud y de su incertidumbre de medida debendeterminarse en el momento en que se utiliza el patrn.


12/48



NOTA 6 Varias magnitudes de la misma naturaleza o de naturalezasdiferentes pueden realizarse mediante un nico dispositivo, denominadotambin patrn.

NOTA 7 En el idioma ingls, algunas veces se utiliza la palabraembodiment (materializacin) en vez de realization.

NOTA 8 En ciencia y tecnologa, el vocablo ingls standard se usacon dos significados distintos: como una norma, especificacin,

recomendacin tcnica o documento escrito similar, y como unpatrn de medida (en el idioma francs talon). Este vocabulariose refiere nicamente al segundo significado.

NOTA 9 El trmino patrn se utiliza a veces para designar otrasherramientas metrolgicas, por ejemplo un programa de medidapatrn (software patrn). (Vase ISO 5436-2).

Patrn de medida de trabajo [3] (5.7)

Patrn utilizado habitualmente para calibrar o verificar instrumentos osistemas de medida

NOTA 1 Un patrn de trabajo se calibra habitualmente con relacin aun patrn de referencia.

NOTA 2 Un patrn de trabajo utilizado en verificacin se designatambin como patrn de verificacin o patrn de control.

Repetibilidad de medida [3] (2.21)

Precisin de medida bajo un conjunto de condiciones de repetibilidad.

Condicin de repetibilidad de una medicin [3] (2.20)

Condicin de medicin, dentro de un conjunto de condiciones queincluye el mismo procedimiento de medida, los mismos operadores, elmismo sistema de medida, las mismas condiciones de operacin y el


13/48



mismo lugar, as como mediciones repetidas del mismo objeto o de unobjeto similar en un periodo corto de tiempo

NOTA 1 Una condicin de medicin es una condicin de repetibilidadnicamente respecto a un conjunto dado de condiciones derepetibilidad.

NOTA 2 En qumica, el trmino condicin de precisin intra-serie seutiliza algunas veces para referirse a este concepto.

Resolucin de la Columna [4]

Medida cuantitativa de la capacidad de una columna para separar dosanalitos. Se define como Rs:

Figura 1. Resolucin de la columna de un cromatgrafo

( ) ( )[ ]( )BA

ARBRs

ww

ttR

+

=

2

Con un valor Rs > 1,5, se permite la separacin completa de doscomponentes

Tiempo de Retencin [4]


14/48



Tiempo que transcurre despus de la inyeccin de la muestra hastaque el pico de concentracin del analito alcanza el detector. Sirve paradiferenciar analitos.

Figura 2. Tiempo de retencin.

Trazabilidad metrolgica [3] (2.41)

Propiedad de un resultado de medida por la cual el resultado puederelacionarse con una referencia mediante una cadena ininterrumpida ydocumentada de calibraciones, cada una de las cuales contribuye a laincertidumbre de medida

NOTA 1 En esta definicin, la referencia puede ser la definicin deuna unidad de medida, mediante una realizacin prctica, unprocedimiento de medida que incluya la unidad de medida cuandose trate de una magnitud no ordinal, o un patrn.

NOTA 2 La trazabilidad metrolgica requiere una jerarqua decalibracin establecida.

NOTA 3 La especificacin de la referencia debe incluir la fecha en

la cual se utiliz dicha referencia, junto con cualquier otrainformacin metrolgica relevante sobre la referencia, tal como la


15/48



fecha en que se haya realizado la primera calibracin en lajerarqua.

NOTA 4 Para mediciones con ms de una magnitud de entrada enel modelo de medicin, cada valor de entrada debiera sermetrolgicamente trazable y la jerarqua de calibracin puedetener forma de estructura ramificada o de red. El esfuerzorealizado para establecer la trazabilidad metrolgica de cada valorde entrada debera ser en proporcin a su contribucin relativa al

resultado de la medicin.

NOTA 5 La trazabilidad metrolgica de un resultado de medida nogarantiza por s misma la adecuacin de la incertidumbre demedida a un fin dado, o la ausencia de errores humanos.

NOTA 6 La comparacin entre dos patrones de medida puedeconsiderarse como una calibracin si sta se utiliza paracomprobar, y si procede, corregir el valor y la incertidumbre

atribuidos a uno de los patrones.

4. GENERALIDADES

4.1. Abreviaturas

b Ordenada en el Origen.

CMR Concentracin del Material de Referencia Certificado(valor del Certificado).

CVMAX Coeficiente de Variacin mximo.

IyCV

1Coeficiente de Variacin de la prueba realizada con

10 medidas, para el patrn 1.

IyCV

2Coeficiente de Variacin de la prueba realizada con

10 medidas, para el patrn 2.


16/48



EL Error de lectura producido por la operacin de enrase.

HPLC Cromatgrafos de Lquidos de Alta Resolucin.

m Pendiente.

Rs Resolucin de la columna.

1ys Desviacin tpica de la seal del patrn 1.

2ys Desviacin tpica de la seal del patrn 2.

lys

1

Desviacin tpica de la seal del patrn 1, obtenida

inicialmente y usada para estimar la incertidumbre derepetibilidad cuando no se realiza un nmero derepeticiones suficiente.

lys

2Desviacin tpica de la seal del patrn 1, obtenida

inicialmente y usada para estimar la incertidumbre derepetibilidad cuando no se realiza un nmero derepeticiones suficiente.

VC Volumen asignado por la clase.

VF1 Volumen Final de la Dilucin para el patrn 1.VF2 Volumen Final de la Dilucin para el patrn 2.

VI1 Volumen Inicial de la Dilucin para el patrn 1.

VI2 Volumen Inicial de la Dilucin para el patrn 2.

VM Volumen medido.

xm Concentracin del analito en la muestra.


17/48



x1 Concentracin del patrn 1.

x2 Concentracin del patrn 2.

ym Respuesta del analito en la muestra.

1y Respuesta del equipo correspondiente al patrn 1.

ACT

y1 Respuesta del equipo en el momento de lacalibracin, para el patrn 1.

2y Respuesta del equipo correspondiente al patrn 2.

ACTy2 Respuesta del equipo en el momento de la

calibracin, para el patrn 2.

i Grados de libertad de cada componente.

ef Grados efectivos de libertad de la magnitud de salida.

4.2. Principios Cromatogrficos

La cromatografa agrupa un conjunto importante y diverso demtodos, que permite separar componentes estrechamenterelacionados en mezclas complejas, lo que en muchas ocasionesresulta imposible por otros medios.

En todas las separaciones cromatogrficas, la muestra se disuelveen una fase mvil, que en este caso (HPLC) es un lquido, y cuyanica funcin es transportar el analito a travs de la columna. Estafase mvil se hace pasar a travs de una fase estacionariainmiscible, que es una fase lquida inmovilizada sobre la superficiede un slido inerte, que se mantiene fija sobre una columna. Las

dos fases se eligen de tal forma, que los componentes de la


18/48



Columnas.

Detectores.

muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase mvil y laestacionaria.

Aquellos componentes que son retenidos con fuerza por la faseestacionaria se mueven lentamente a travs de la columna, debidoal flujo de la fase mvil; por el contrario, los componentes que seunen dbilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez.

Las caractersticas principales de esta tcnica son su sensibilidad,

su fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas, suidoneidad para la separacin de especies no voltiles otermolbiles y su gran aplicabilidad.

Existen diferentes tipos de cromatografa de lquidos:

Cromatografa de Reparto.

Cromatografa de Adsorcin.

Cromatografa Inica.

Cromatografa de Exclusin por Tamaos o en Geles.

Se elige cada tipo a utilizar en funcin de las caractersticasqumicas del analito a determinar.

Los componentes principales de un cromatgrafo de lquidos son:

Lquidos portadores y sistemas para el tratamiento de losdisolventes.

Sistemas de bombeo.

Sistema de Inyeccin de la Muestra.


19/48



Sistema de procesamiento de seal y tratamiento de datos.

A continuacin se indica un esquema bsico de los instrumentosque componen un cromatgrafo de lquidos:

DISOLVENTES

Sistema de Mezclay Almacenam iento

DETECTOR

COLUMNA

SISTEMA DE

BOMBEO Y

CONTROL DEL

CAUDAL

SISTEMA DE

ADQUISICIN

Y

TRATAMIENTO

DE DATOS

INYECTOR

Figura 3. Esquema bsico de los instrumentos que componenun cromatgrafo de lquidos

La cromatografa se puede emplear para la identificacincualitativa (que no es objeto de este procedimiento) y para ladeterminacin cuantitativa de los analitos separados. Lacromatografa en columna cuantitativa se basa en la comparacinde la altura, o del rea, del pico del analito con la producida poruna o ms disoluciones del analito de concentracin conocida.


20/48



NOTA:Se entiende por especie la sustancia o in de inters que puede serseparada en la columna y detectada por el detector elegido. En general enHPLC siempre se utiliza como magnitud el rea de la seal.

4.3. Calibracin

La caracterstica principal en estos equipos es la medida de unamagnitud fsica que es transformada en una seal elctrica yregistrada en el sistema de registro y tratamiento de datos. Estaseal en unas condiciones determinadas (temperatura, tiempos deretencin, etc.), se puede relacionar con un parmetro qumico(concentracin, etc.) de una especie determinada.

Debido a esto, en estos equipos se realiza una operacinconsistente en obtener la respuesta dada por el equipo al mediruna serie de muestras de valor conocido (Material de ReferenciaCertificado) y obtener la relacin entre respuesta y concentracin;

esta operacin es una calibracin a la que se denominarCalibracin Indirecta.

Este tipo de calibracin rene unas determinadas caractersticas:

a. No es nica para el equipo, sino que se realiza por parmetro.

b. Requiere evaluar si la relacin obtenida es satisfactoria para eluso previsto del equipo.

c. Al verse afectada por otros factores puede requerir, endeterminadas ocasiones no de forma rutinaria, el empleo demateriales de referencia especiales (de matriz similar a lasmuestras)

Entre los diferentes tipos de calibraciones indirectas que sonposibles realizar, se pueden citar:

Interpolacin entre dos puntos.


21/48



Recta de Calibrado.

Funcin de Calibrado.

Mtodo de Adiciones.

Estndar Interno con recta.

Estndar Interno con punto nico.

En este procedimiento se ha optado por elegir el mtodo deinterpolacin entre dos puntos.

4.4. Mtodo de la interpolacin entre dos puntos

Este mtodo para el anlisis cromatogrfico cuantitativo implica lautilizacin de dos disoluciones de Materiales de ReferenciaCertificados (patrones).

A continuacin se obtienen los cromatogramas de los patrones yse representan las alturas o reas de pico en funcin de laconcentracin.

La seleccin de la seal frente a la que se representa laconcentracin (reas o alturas), se determina a partir de lascaractersticas de ambas:

Altura de pico

Medida desde la base hasta la parte superior. Es un parmetrofcilmente medible, pero tiene como inconveniente que es muysensible a las variaciones de una serie de parmetros, entre losque estn: velocidad de la fase mvil, velocidad de inyeccin,etc.

rea de pico


22/48



Su medida es ms complicada, pero con los equipos dotadosde integradores electrnicos se puede obtener resultados muyreproducibles. Depende en menor medida de los parmetrosque afectaban a las alturas de pico, aunque dependiendo deltipo de detector pueden producirse desviaciones. Depender dela reproducibilidad y linealidad del inyector, y de las deldetector.

La representacin de los datos de cada patrn debera originar

una lnea recta. Siendo cada uno de los patrones un punto de lamisma:

bxmy += 11

bxmy += 22

siempre que la relacin respuesta/concentracin se mantengaen el intervalo definido entre las concentraciones x1 y x2.

A partir de esta suposicin se pueden calcular los valores de my b, partiendo de los valores de los parmetros experimentales(y1, y2, x1, x2).

Conocidas la pendiente (m) y la ordenada en el origen (b) apartir de los valores de la seal obtenidos para los patrones(sistema de ecuaciones anterior), del valor de seal obtenido enel anlisis de la muestra (ym), se podr obtener su

concentracin como:

m

byx m

m

=

5. DESCRIPCIN

A continuacin se indican, de una forma general, las consideraciones atener en cuenta sobre los equipos, los Materiales de Referencia y losreactivos que participan en las actividades de calibracin de


23/48



Cromatgrafos de Lquidos, as como las operaciones necesarias, parallevar a cabo dicha actividad.

5.1. Equipos y Materiales

Cromatgrafo de Lquidos

Equipos auxiliares (columnas, detectores, inyectoresautomticos, etc.), utilizados junto con el cromatgrafo ycaractersticos del analito a determinar.

Mezclas de disolventes adecuados, para utilizarlos como fasemvil, con calidad cromatogrfica. Si es necesario utilizar aguadeber ser de calidad ultrapura o qumicamente pura.

Material Volumtrico calibrado:

Pipetas clase A.

Micropipetas con repetibilidad y exactitud suficiente almenos 2 % de ambas.

Matraces Aforados clase A.

Microjeringas (si el cromatgrafo de lquidos carece deinyector automtico). Debern definirse volumen ycaractersticas de exactitud y precisin

Balanza analtica, con una resolucin de 0,1 mg (slo si losmateriales de referencia o los patrones utilizados en lainterpolacin deben ser pesados).

Disolvente, adecuado al parmetro a ensayar, libre de

impurezas que puedan afectar a la respuesta del equipo en lostiempos de retencin del analito y patrones (generalmente


24/48



pureza cromatogrfica), para realizar las diluciones de lospatrones si fuera necesario.

Soluciones de un Material de Referencia Certificado de unaconcentracin conocida del analito a determinar. Dichaconcentracin debe incluir el rango en el que se esperandeterminar las muestras. La separacin entre ellas debe ser talque se mantenga la linealidad de la recta. Como criterioaproximado se podra indicar que la relacin entre ellas no sea

mayor de 10.

NOTA:La disolucin de concentracin adecuada puede ser preparada a partirde un material de referencia de concentracin superior, por dilucionesadecuadas utilizando el material volumtrico descrito.La disolucin puede contener solo un analito o una mezcla de varios.

Cpsulas o viales portamuestras

Manual/es de instrucciones o procedimiento/s de uso ymantenimiento de los equipos, sus partes y/o accesorios.

5.2. Operaciones previas

Antes de iniciar la calibracin se realizarn las siguientesoperaciones previas:

5.2.1. Control de condiciones ambientalesDadas las caractersticas constructivas y funcionales delequipo, esta calibracin se realizar siempre en ellaboratorio, y no requiere en general condicionesambientales particulares, pudiendo desarrollarse en elintervalo comprendido entre 18 C y 28 C.

En todo caso debern consultarse las condicionesindicadas en el manual de uso del equipo.

NOTA:


25/48



Determinados detectores pueden requerir un control de lasvariaciones de temperatura ms severas.

5.2.2. Elaboracin de patrones de calibracin

Se realizaran a partir del Material de ReferenciaCertificado, haciendo las diluciones que sean necesariaspara que la concentracin se encuentre incluida en elrango de determinacin. Las diluciones se prepararn

justo antes de realizar la calibracin. Estas disolucionespodrn estar preparadas previamente, si el laboratorioposee evidencias que demuestran que la concentracinpreparada no vara con el tiempo de almacenamiento.

Se deber confirmar que el material de referencia cumplelos requisitos de trazabilidad adecuados y definidos, y quesu periodo de caducidad no ha sido sobrepasado.

Se asegurar que el material de referencia se encuentra atemperatura ambiente. En el caso de conservacin ennevera, se atemperar antes de usarlo por un periodo deal menos 2 horas.

NOTA:Si los compuestos son voltiles no se esperar a atemperar ytodas las preparaciones se realizarn por pesada, para minimizarposibles errores por volatilizacin del compuesto de inters.

5.2.3. Puesta en marcha del equipo

Debern tenerse en cuenta las indicaciones del fabricante.En general y para la puesta en marcha del equipo seseguirn los siguientes pasos:

a. Apertura de las botellas de los gases (helio, hidrgeno,etc.), indicados en el ensayo a realizar.

b. Encendido del equipo y del software.


26/48



c. Apertura de los manmetros de presin de los gases, yregulacin.

d. Estabilizacin durante un periodo de 20 minutos a 30minutos.

e. Conectar o comprobar los detectores ultravioleta,fluorescencia, etc.

f. Colocacin de la columna adecuada para el ensayo, sianteriormente no estaba colocada.

g. Seleccin de la temperatura del horno de columnas.

h. Comprobacin del circuito neumtico.

i. Estabilizacin de todo el sistema durante 15 minutos.

j. Bombear agua por todo el sistema hasta eliminartotalmente cualquier residuo de materia orgnica.

k. Bombear 200 ml de agua de calidad HPLC con uncaudal de 5 ml/min.

l. Pasar finalmente de 30 ml a 50 ml de metanol,acetonitrilo o disolvente apropiado.

m. Regulacin del gas portador (helio, etc.).n. Comprobar la presin de la columna.

o. Inyectar un patrn de calibracin, calcular el rea yaltura de pico y compararlo con los obtenidos en dasanteriores (opcional, para confirmar el correcto estadodel detector antes de su uso).

NOTA:

Algunos pasos pueden ser eliminados si el equipo permanece enmarcha habitualmente


27/48



Si surgiera cualquier cuestin, consultar el manual delequipo o la ayuda del software, o bien ponerse en contactocon el servicio tcnico del equipo.

Una vez realizados estos pasos se puede comenzar lasecuencia de anlisis en el cromatgrafo de lquidos.

Las condiciones de trabajo durante la calibracin, deben

ser las mismas que las que posteriormente se utilizarn enlas medidas de las muestras sometidas al ensayo para elcual se est calibrando el equipo.

5.3. Proceso de calibracin

5.3.1. Seleccin de los parmetros instrumentalesMediante comprobacin de las condiciones de trabajo

(temperatura del inyector, temperatura de la columna,parmetros del detector empleado -longitud de onda,temperatura, etc.-, caudal bombeado, volumen deinyeccin, velocidad de flujo), as como las condicionesreflejadas en el software del equipo.

5.3.2. Fijacin de las condiciones de procesamiento de la seal Seleccin del tipo de respuesta: rea o altura.

Seleccin del modo de integracin.

Seleccin del umbral mnimo para considerar laexistencia de seal y proceder a integracin.

5.3.3. Acondicionamiento del equipo

Mediante el anlisis de un blanco, constituido por una

alicuota del disolvente utilizado para la realizacin de lospatrones.


28/48



5.3.4. Comprobacin de la ausencia de seal

Despus del anlisis del blanco. La ausencia de seal enla prctica consiste en el establecimiento por parte dellaboratorio de un intervalo de tolerancia.

En caso contrario repeticin del anlisis, hasta la obtencinde un valor de referencia adecuado.

5.3.5. Realizacin del anlisis

A continuacin se analiza cada una de las dosdisoluciones patrn (Material de Referencia Certificado).

NOTA:El rango de concentraciones de estas disoluciones fijar el rangode determinacin de la concentracin del analito.

5.3.6. Comprobacin del cromatogramaConfirmando:

a) La aparicin de picos en los tiempos de retencinesperados.

b) La resolucin de la columna entre picos es siempresuperior a 1,5.

c) La forma de los picos es adecuada, no presentandocolas o artefactos (desviaciones de la forma gaussianadel pico).

d) Si la integracin se realiza automticamente, la ventanaseleccionada ha sido adecuada y los criteriosestablecidos se han respetado.

e) En caso de integracin manual proceder a larealizacin de la misma.


29/48



Anotacin de los datos requeridos (apartado 5.4).

5.3.7. Repeticin del anlisis

Repeticin del anlisis de las disoluciones patrn elnmero de veces estipulado, para ello realizar los pasosindicados en 5.3.5. y 5.3.6. En general es aconsejablerealizar 10 repeticiones.

5.3.8. Obtencin de la pendiente y ordenada en el origen

A partir de las ecuaciones (3) y (4) del apartado 5.4., secalcular la pendiente y la ordenada en el origen.

5.4. Toma y tratamiento de datos

5.4.1. Toma de datos

Para garantizar la trazabilidad de las medidas realizadasdurante la calibracin, es necesario registrar y evaluar lasactividades llevadas a cabo, adems de los resultadosobtenidos.

Para ello es conveniente disponer de formatos de registrosadecuados (registros manuales o informticos), dondecomo mnimo debern registrarse los siguientes datos:

Parmetro objeto de la calibracin (analito).

Equipo a calibrar (cromatgrafo).

Equipos (balanza) y material volumtrico (si se trata dematerial individual -micropipetas-) utilizados para laelaboracin de los patrones y estndares internos.

Lotes de los Materiales de Referencia Certificados.


30/48



Fecha.

Respuestas obtenidas del equipo, durante el anlisis delos patrones y clculos realizados con ellas para ladeterminacin de la pendiente y ordenada en el origen.

Analista.

Se deben conservar todos los cromatogramas

obtenidos o al menos:

Condiciones Instrumentales.

Respuestas del equipo.

Tiempos de Retencin.

Sistemas de Integracin e intervalo de tiempos

usado en cada pico ventana de integracin- (en elcaso de integracin por reas).

Adems se deber registrar cualquier otro dato que seconsidere necesario para asegurar la trazabilidad yreproducibilidad del proceso.

5.4.2. Tratamiento de datos

El mtodo de calibracin mediante la utilizacin de lainterpolacin entre dos puntos, es un caso de calibracinindirecta, donde se relaciona la respuesta del equipo frentea la concentracin de una serie de muestras/patrones.

Con los datos obtenidos se calcular la pendiente y laordenada en el origen que se utilizar posteriormente parala cuantificacin del compuesto.

bxmy += 11 (1)


31/48



bxmy += 22 (2)

12

12

xx

yym

= (3)

12

2112

xx

yxyxb

= (4)

Las concentraciones de los patrones se obtienen a partirde las del Material de Referencia Certificado mediantediluciones, utilizando las siguientes expresiones:

1

1

1

F

I

MRV

VCx = (5)

2

2

2F

I

MR V

V

Cx = (6)

6. RESULTADOS

6.1. Calculo de Incertidumbre

Para realizar el clculo de incertidumbre en la calibracin del

cromatgrafo de lquidos, hay que tener en cuenta cuales son lasprincipales fuentes de error durante la calibracin. Algunas de ellasse indican a continuacin:

Variaciones de los resultados de las medidas experimentalesde reas o alturas.

Incertidumbre en la concentracin, debidos a la variabilidad delos operadores en el enrase.

Incertidumbre de la concentracin del Material de Referencia.


32/48



Incertidumbre debida a la diferencia de los volmenes de lasdistintas unidades del material volumtrico utilizadas.

NOTA:Pueden ser otras si se realizan pesadas.

La asignacin y expresin de incertidumbres se realizar siguiendolos criterios de la Gua para la expresin de la Incertidumbre [1] y

de la Gua EA-4/02 [2].En nuestro caso las magnitudes de entrada y salida sern:

Magnitud de Salida

m = f( , , V2y 1y F2, VF1, CMR, VI2, VI1)

Magnitudes de Entrada

Magnitud de Salida

b = g( , , V2y 1y F2, VF1, VI2, VI1)

Magnitudes de Entrada

A partir de las expresiones (3) y (4) y suponiendo que los patronesse preparan por dilucin de un nico Material de ReferenciaCertificado (caso habitual), sustituyendo los trminos se obtiene:

( )( )

2112

1212

FIFIMR

FF

VVVVC

VVyym

= (7)

( )2112

2112 21

FIFI

FIFI

VVVV

yVVyVVb

= (8)

6.1.1. Ley de la propagacin de las incertidumbres


33/48



Aplicando la ley de propagacin de las incertidumbres,teniendo en cuenta que todas las magnitudes que quedanen la frmula son independientes y no estncorrelacionadas:

( ) ( )

( )

( )

( )

( )( )

( )( )

( )

( )

( )

2

212

22

2

2

122

2

2

2122

2

212

22

2

2

122

2

2

2

2

22

2112

12

1

2112

21

2

2112

12

2112

12

1

2112

21

2

2112

12

1

2112

12

2

+

+

+

+

+

+

+

+

+

=

FIFIMR

FV

FIFIMR

F

V

FIFIMR

FFC

FIFIMR

IV

FIFIMR

I

V

FIFIMR

FFy

FIFIMR

FFym

VVVVC

yyVVu

VVVVC

yyVVu

VVVVC

VVyyu

VVVVC

yyVVu

VVVVC

yyVVu

VVVVC

VVu

VVVVC

VVuu

F

I

F

IMR

F

F

F

F

(9)

( )

( )

( )

( )

( )( )

( )

( )

( ) ( )

2

2

2

2

212

2

2

212

2

2

2

2

122

2

2

1222

2112

12

2

2112

121

2

2112

221

12112

21

1

2112

221

1

2112

121

2

+

+

+

+

+

+

+

=

FIFI

IFy

FIFI

FIIV

FIFI

IFFV

FIFI

IFy

FIFI

FII

V

FIFI

IFF

Vb

VVVV

VVu

VVVV

yyVVVu

VVVV

yyVVVu

VVVV

VVu

VVVV

yyVVVu

VVVV

yyVVVuu

F

I

FI

(10)

6.1.2. Clculo de las componentes de la incertidumbre

a. Incertidumbre de la respuesta

La respuesta (y1 e y2) ha sido estimada como media deuna serie de resultados (n).

a.1. Su incertidumbre se calcular segn unaestimacin de tipo A, en funcin de la desviacintpica experimental:


34/48



nsu

y

y

2

2 1

1= (11)

n

su

y

y

2

2 2

2= (12)

( )=

=n

jy yy

ns

j

1

2

112

1

11

(13)

( )=

=n

jy yy

ns

j

1

2

222

1

12

(14)

a.2. Si el nmero de repeticiones n, ha sido pequeo(menor que 10 e incluso 1), pero se dispone de unvalor de y obtenido inicialmente para 10

medidas, se realizar una estimacin de lasincertidumbres basndose en el siguienteesquema: se calcularan los coeficientes devariacin de cada patrn:

lys

1 lys

2

Iy

sCV

Iy

Iy

1

1

1= (15)

1

2

1

2y

sCV

Iy

Iy= (16)

Y se obtendr el mximo de los dos (CVMAX),calculndose a continuacin:

n

yCVu ACT

MAX

y

21

2

2

1

= (17)

n

yCVu

ACTMAXy

2

2

2

22

= (18)


35/48



a.3. El laboratorio deber evaluar que los coeficientesde repetibilidad de la seal obtenidos inicialmentese mantienen con el paso del tiempo, repitiendoperidicamente las mismas pruebas de anlisis depatrones.

No se ha tenido en cuenta la resolucin de la integracinde la seal porque en general la variabilidad de la seal

es mucho mayor que la resolucin y por tanto esta noinfluye. No se ha tenido en cuenta la deriva de la sealentre dos medidas, debido a que se realizanconsecutivamente.

NOTA:El laboratorio debe seleccionar condicionesinstrumentales y rangos de concentracin que garanticenque la variabilidad de la seal es mucho mayor que laresolucin, esto se consigue con seguridad, en la

prctica, a partir de seales superiores a 1000.Otras posibles contribuciones no se han tenido encuenta al tratarse de una calibracin indirecta, que no dacomo resultado un valor de correccin igual en todos loslaboratorios, sino una relacin que es la existente eneste momento y para este equipo.El laboratorio deber evaluar que los coeficientes derepetibilidad de la seal obtenidos inicialmente semantienen con el paso del tiempo, repitiendoperidicamente las mismas pruebas de anlisis de

patrones.

b. Incertidumbre de la Concentracin del Material deReferencia Certificado

Ser la obtenida del certificado del Material deReferencia, teniendo en cuenta el factor de cobertura kque lo acompaa:

kUu MR

MR

C

C= (19)


36/48



NOTA:1. En caso de que no se utilizase el valor certificado del

MRC, adems habra que sumar a la incertidumbreexpandida al final la correccin no realizada.

2. El general, la deriva del MRC debera haber sido evaluadae incluida en la incertidumbre declarada (segn normativainternacional).En caso de que se albergaran dudas, sera necesarioestimar un lmite mximo de variacin entre el valor actual

y el certificado y dividirlo por 3 , combinandocuadrticamente este valor con UCMR/kpara obteneruCMR.

3. En general las incertidumbres debidas a la influencia de latemperatura en la densidad de la disolucin seconsiderarn despreciables.

c. Incertidumbre de volumen

Su clculo depender de como se hayan controlado los

equipos utilizados.

En el caso de que se hayan verificado comprobandoque sus marcas de enrase cumplen las tolerancias declase establecidas para el material volumtrico (ocualquier otra establecida por el laboratorio) y que seusen habitualmente realizando una sola medida.

LCMEVV += (20)

NOTA:La verificacin consiste en comprobar que el error ms laincertidumbre es menor que la tolerancia.

Se aplica a los dos patrones, tanto al volumen inicial(VI1, VI2) como al final (VF1, VF2).

De donde:

222

LCM EVVuuu += (21)


37/48



c.1. Incertidumbre del volumen de cada unidad

Se considera que cualquier unidad que haya sidocomprobada cumple el intervalo de clase encualquier momento de su vida til, por lo que setomar la tolerancia de la clase como un intervalomximo, y aplicando la distribucin rectangular:

3Toleranciau

CV = (22)

c.2. Incertidumbre del error de lectura

Se realizarn experimentos en el propio laboratoriopara establecer un error mximo de enrase en lascondiciones de uso, y se calcular la incertidumbreaplicando una distribucin rectangular, de anchura

EMAX, y de valor central 0:

3MAX

E

Eu

L

= (23)

c.3. No se tendrn en cuenta otras componentes como:

Deriva, ya que en general para el material

volumtrico usado en condiciones normales (sinlquidos agresivos, ni cambios de temperatura),se considera despreciable frente a las debidasa las diferencias entre unidades.

Variacin del volumen por la temperatura: se hadespreciado este trmino teniendo en cuenta suescasa influencia (del orden de 10-4 delvolumen medido) respecto del resto de los

trminos.


38/48



6.1.3. Clculo de la incertidumbre expandidaDe acuerdo a lo indicado en las ecuaciones (9) y (10), secalcular la incertidumbre tpica de la pendiente (um) y dela ordenada en el origen (ub).

Para calcular la incertidumbre expandida, se deberevaluar el nmero de grados de libertad de cada una delas componentes con el fin de conocer el factor de

cobertura k utilizado, para calcular la incertidumbreexpandida que corresponde a la probabilidad de coberturade aproximadamente el 95 %:

kuUmm= (24)

El valor de kdepender de los grados de libertad efectivosde , que dependen a su vez de los grados de libertad

de las dems componentes, segn la expresin:m

u

=

=N

i i

i

ef)y(u

)y(u

1

4

4

(25)

Los grados efectivos de cada componente dependen delsistema de estimacin establecido.

Seal (y) ha sido obtenido a partir de la desviacintpica de una distribucin normal estimada a partir de10 repeticiones, obtenida en el momento o inicialmente.

Concentracin de material de referencia (CMR)importada de un certificado, que dispone de su kcorrespondiente.

A partir del kdel certificado se pueden conocer los gradosde libertad efectivos segn la tabla 1:


39/48



ef 1 2 3 4 5 6 7 8 10 20 50 k 13,97 4,53 3,31 2,87 2,65 2,52 2,43 2,37 2,28 2,13 2,05 2,00

Tabla 1

Componentes de volumen: Han sido obtenidos dedistribuciones rectangulares. Si estas se han obtenidoasegurando que con un alto lmite de fiabilidad loslmites de variacin establecidos no se sobrepasan, seconsidera que los grados de libertad son infinitos.

NOTA:En condiciones habituales donde el k del Material deReferencia Certificado es 2, el documento EA-4/02 [2]en su apartado 5 permite el uso de k= 2 para el clculode la incertidumbre de m y de b, siempre que secumplan condiciones de normalidad y fiabilidad, quesuponen que haya ms de tres magnitudes con unacontribucin similar, y que las contribuciones de tipo Ahayan sido evaluadas con al menos 10 repeticiones.

6.2. Interpretacin de resultados

Si la calibracin se realiza en el mismo momento que los anlisis,podra (opcionalmente) evaluarse mediante el establecimiento detolerancias para los trminos Um/m y Ub/m, que influyen en laincertidumbre de medida de la muestra. Dichas toleranciasdependern de los valores de incertidumbre que desee ellaboratorio.

En caso contrario deber evaluarse si la relacin entre lapendiente y la ordenada en el origen actual y la precedente hasuperado una tolerancia especificada (seleccionada por ellaboratorio) y debe estudiarse su influencia en los resultadosanteriores, debido a la prdida o aumento de sensibilidad deequipo.

En general se aconseja que la calibracin se realice en cada uso.


40/48



PENDIENTE (m)

Magnitud EstimacinIncertidumbre

TpicaCoeficiente deSensibilidad

Grados deLibertad

2y Media de 10 o n

repeticiones n

yCVACT2

( )

2112

12

FIFIMR

FF

VVVVC

VV

9

1

y Media de 10 o n

repeticiones n

yCVACT1

( )211212

FIFIMR

FF

VVVVC

VV

9

2FC

V VolumenNominal 3

Tolerancia ( )( )2

12

2

21

FIFIMR

IF

VVVVC

yyVV

2112

2FL

E 03

MAXE ( )

( )212

2

21

FIFIMR

IF

VVVVC

yyVV

2112

1FC

V VolumenNominal 3

Tolerancia ( )( )2

12

2

12

FIFIMR

IF

VVVVC

yyVV

2112

1FL

E 03

MAXE ( )

( )212

2

12

FIFIMR

IF

VVVVC

yyVV

2112

CMR Valor Certificadok

U ( )( )

2112

12

2

12

FIFIMR

FF

VVVVC

VVyy

Correspon-diente a k

2IC

V VolumenNominal 3

Tolerancia ( )( )2

12

2

21

FIFIMR

FF

VVVVC

yyVV

2112

2IL

E 03

MAXE ( )

( )212

2

21

FIFIMR

FF

VVVVC

yyVV

2112

1IC

V VolumenNominal 3

Tolerancia ( )( )2

122

12

FIFIMR

FF

VVVVC

yyVV

2112

1IL

E 03

MAXE ( )

( )212

2

12

FIFIMR

FF

VVVVC

yyVV

2112

Tabla 2


41/48



ORDENADA EN EL ORIGEN (b)

Magnitud EstimacinIncertidumbre

TpicaCoeficiente deSensibilidad

Grados deLibertad

2IC

V VolumenNominal 3

Tolerancia ( )( )2

12

2112

121

FIFI

IFF

VVVV

yyVVV

2IL

E 03

MAXE ( )

( )212

2112

121

FIFI

IFF

VVVV

yyVVV

1FC

V VolumenNominal 3

Tolerancia ( )( )2

12

2112

221

FIFI

FII

VVVV

yyVVV

1FL

E 03

MAXE ( )

( )212

2112

221

FIFI

FII

VVVV

yyVVV

1y Media de 10 o n

repeticiones n

yCVACT1

( )

2112

21

FIFI

IF

VVVV

VV

9

1IC

V VolumenNominal 3

Tolerancia ( )( )2

21

2112

221

FIFI

IFF

VVVV

yyVVV

1IL

E 03

MAXE ( )

( )221

2112

221

FIFI

IFF

VVVV

yyVVV

2FC

V VolumenNominal 3

Tolerancia ( )( )2

21

2112

121

FIFI

FII

VVVV

yyVVV

2FL

E 03

MAXE ( )( )2

21121

FIFI

FII

VVVV

yyVVV

2112

2y Media de 10 o n

repeticiones n

yCVACT2

( )

2112

12

FIFI

IF

VVVV

VV

9

Tabla 3


42/48



7. REFERENCIAS

[1] Gua para la Expresin de la Incertidumbre de Medida. CEM.Segunda edicin en espaol, 2000.

[2] Gua EA-4/02. Expression of the Uncertainty of Measurement inCalibration. Edicin 2. EA. 1999.

[3] Vocabulario Internacional de Metrologa. Conceptosfundamentales y generales, y trminos asociados (VIM). 3 edicinen espaol 2008.

[4] D.A. Skoog, F.J. Holler, T.A. Nieman. Principios de anlisisInstrumental. Quinta Edicin. McGraw-Hill, 2000.

8. ANEXOS

En este capitulo se recoge en un anexo un ejemplo numrico detallado.


43/48



ANEXOEjemplo Numrico

Se proceder a realizar la calibracin de un cromatgrafo de lquidosmediante el mtodo de la interpolacin entre dos puntos, para obtener losvalores de la pendiente (m) y la ordenada en el origen (b):

( )

( )2112

1212

FIFIMR

FF

VVVVC

VVyym

=

( )2112

2112 21

FIFI

FIFI

VVVV

yVVyVVb

=

Los valores de concentraciones de los patrones, que establecen el rangodonde se podrn medir las muestras son 0,1 mg/l y 0,5 mg/l.

En este caso se considera que se pueden realizar 10 repeticiones:

NREP. y1 y2

1 166 817 509 491

2 172 379 502 1273 168 728 495 892

4 171 356 500 314

5 166 426 506 328

6 169 414 504 123

7 169 426 499 326

8 167 625 501 3189 169 425 504 325

10 170 214 506 318

MEDIA (y) 169 181 502 956,2

DESVIACIN TPICA (sy) 1 885,725 3 972,728

COEFICIENTE DE VARIACININICIAL (CVI)

0,011 46 (*) 0,007 898

(*) El coeficiente de variacin as marcado, corresponde al mximo(CVMAX) de entre los dos patrones.


44/48



Todo ello corresponde a la aplicacin de las siguientes frmulas:

n

y

y

n

jj

== 1 ( )=

=n

j

jy yyn

s1

2

1

1

y

sCV

yI =

Posteriormente se obtienen los valores de y1 e y2 actuales, comomedia de tres repeticiones:

y1ACT y2ACT

Rep. 1 189 889 498 862

Rep. 2 191 260 499 254

Rep. 3 190 126 497 762

MEDIA 190 425 498 626

CV 0,003 8 0,001 55

Dado que los coeficientes de variacin (CV) son menores que losdel primer da, se sustituyen por la CVMAX= 0,011 46

De donde:

3

0114601904251

,

Uy

= 3

0114604986262

,

Uy

=

MATERIAL DE REFERENCIA

Concentracin Inicial (CMR) 10 mg/l

Incertidumbre 0,2 mg/lFactor de cobertura (k) 2


45/48



DILUCIN

VALORNOMINAL(ml)

CLASE(ml) ENRASE(ml)

VOLUMENINICIAL 1

1 0,005 0,01

VOLUMEN FINAL1

100 0,08 0,5

VOLUMENINICIAL 2 5 0,01 0,05

VOLUMEN FINAL2

100 0,08 0,5

Con los datos recogidos hasta el momento se completarn lastablas 2 y 3 indicadas en el apartado 6.1.3. del presenteprocedimiento. Sustituyendo los trminos indicados por valoresnumricos:

PENDIENTE (m)

MAGNITUD ESTIMACIN UTPICACOEFICIENTE

DESENSIBILIDAD

CONTRIBUCINTPICA

GRADOSDE

LIBERTADy2 502 956,2 1 256,29 2,5 3 140,72 9y1 169 181 596 318 -2,5 -1 490,80 9

2FCV 100 0,046 10 430,475 481,76

2FL

E 0 0,289 10 430,475 3 011,02

1FC

V 100 0,046 -2 086,095 -96,36

1FL

E 0 0,289 -2 086,095 -602,20

CMR 10 0,1 -83 443,8 8 344,4

2IC

V 5 0,006 -208 609,5 -1 204,41

2IL

E 0 0,029 -208 609,5 -6 022,03

1IC

V 1 0,003 208 609,5 602,20

1ILE 0 0,006 208 609,5 1 204,41


46/48



Se tendr en cuenta que dado que el factor de cobertura delMaterial de Referencia es k= 2, y lo indicado la nota del apartado6.1.3., el factor de cobertura utilizado ser 2, obtenindose lossiguientes datos finales de la calibracin del cromatgrafo delquidos:

PENDIENTE (m)

VALOR (m) 834 438

INCERTIDUMBRE COMBINADA (um) 11 441,78

INCERTIDUMBRE EXPANDIDA (Um) 22 883,56


MAGNITUD ESTIMACIN UTPICACOEFICIENTE

DESENSIBILIDAD

CONTRIBUCINTPICA

GRADOS

DELIBERTAD

2IC

V 5 0,006 20 860,95 120,44

2IL

E 0 0,028 20 860,95 602,20

1FC

V 100 0,046 1 043,05 48,176

1FL

E 0 0,289 1 043,05 301,10

y1 169 181 596,32 1,25 745,398 9

1IC

V 1 0,003 -104 304,75 -301,10

1IL

E 0 0,006 -104 304,75 -602,10

2FC

V 100 0,046 -1 043,05 -48,176

2FL

E 0 0,289 -1 043,05 -301,10

y2 502 956,2 1 256,29 0,25 314,07 9


47/48



Se tendr en cuenta que dado que el factor de cobertura del Material deReferencia es k= 2, y lo indicado la nota del apartado 6.1.3., el factor decobertura utilizado ser 2.

NOTA:Si se calculan los grados de libertad se obtiene un valor de 79 que corresponde aun valor de k= 2,00.

Se obtienen los siguientes datos finales de la calibracin del cromatgrafode lquidos:


VALOR (b) 85 737,2

INCERTIDUMBRE TPICA COMBINADA (ub) 1 292,55

INCERTIDUMBRE EXPANDIDA (Ub) 2 585,10

La incertidumbre expandida de medida se ha obtenido multiplicando laincertidumbre tpica de medicin por el factor de cobertura k= 2 que, parauna distribucin normal, corresponde a una probabilidad de cobertura deaproximadamente del 95 %.


48/48


Calibracion de Un Cromatografo e HPLC

Documents

Transcript of Calibracion de Un Cromatografo e HPLC