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ApplicazioniApplicazioni terapeuticheterapeutiche delledelle cellule cellule staminalistaminali epitelialiepiteliali: : statostato dell’artedell’arte e e

prospettiveprospettive futurefuture

ApplicazioniApplicazioni terapeuticheterapeutiche delledelle cellule cellule staminalistaminali epitelialiepiteliali: : statostato dell’artedell’arte e e

prospettiveprospettive futurefuture

Enzo Calautti

ecalautti@dti.telethon.itCentro Biotecnologie Molecolari

Universita’ di Torino

Torino, 22 gennaio 2011

a) rigenerazione dell’epidermide

b) rigenerazione dell’epitelio corneale

ApplicazioniApplicazioni terapeuticheterapeutiche deidei cheratinociticheratinociti staminalistaminali

L’epidermide:L’epidermide:

••E’ l’epitelio stratificato della pelleE’ l’epitelio stratificato della pelle

••Ha la fondamentale funzione di barriera fisicoHa la fondamentale funzione di barriera fisico--chimica del corpo umanochimica del corpo umano

I cheratinociti rappresentano circa il 90% delle ce llule che compongono l’epidermideI fibroblasti sono il tipo cellulare predominante n el dermaScambi di segnali tra epidermide e derma sono impor tanti per l’omeostasi del tessuto

L’epidermide e’ un tessuto autorinnovante composto da:

•cheratinociti proliferanti , nello strato basale , separati da una lamina basaledal derma sottostante.

•cheratinociti differenzianti negli strati suprabasali

Keratinocyteproliferation(keratinocyte stem cells)

Keratinocyedifferentiation

Keratinocyedesquamation

Desquamation

I cheratinociti staminali presenti nello strato basale dell’epidermide costituisco circa 1-5% delle cellule proliferanti e permettono l’autorinnovamento di questo tessuto le cui cellule vengono rinnovate ogni 4 settimane per tutta la vita dell’individuo

I cheratinociti staminali hanno la capacita’ di dividersi in seguito a certi stimoli generando sia un pool di cellule uguali a se stesse (preservando il compartimento staminale) sia una progenie di cheratinociti indirizzati al differenziamento

TA ProgenyStem Cell

Self-renewal - Differentiation

Il follicolo pilifero , di derivazione epiteliale, contiene cheratinociti staminalinella zona del “bulge”, capaci di rigenerare anche l’epidermide interfollicolaree le ghiandole sebacee in seguito a danni

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Epidermal stem cells properties

- Poorly differentiated- High capacity for self renewal with an increased potential for error-

free proliferation and cell division- Long life span- Long cell cycle under homeostatic conditions (quiescence)- High telomerase activity- Stem Cell division can be asymmetric or symmetric- Molecular markers poorly defined (integrins α6, β1, p63 transcription

factor). Differences in SC markers between humans and rodents

Stem cell transient amplyfing cell post-mitotic cell terminally differentiated cell

Le proprieta’ delle cellule staminali

Cellule differenziatenon-proliferanti

Cellule Staminaliproliferanti

Celluledestinateproliferanti

- Sono indifferenziate e proliferanti

- Danno origine a cellule figlie con destini differenti

• Una mantiene la caratteristica staminale

• L’altra differenzia perdendo la capacità di proliferare.

Transit Amplifying (TA)

Sicuramente i fattori ambientali hanno peso nel determinare la divisione asimmetrica;

Il numero di cellule staminali e’ regolato in modo da favorire l’omeostasi del tessuto (la progenie di una staminale non e’ sempre 1 stem e 1 TA cell).

In casi particolari (danno tessutale) vi puo’ essere amplificazione del numero delle cellule staminali

Si ritiene infatti che l’ambiente in cui risiede una cellula staminale (nicchia staminale) giochi un ruolo chiave nel regolare l’autorinnovamento e il differenziamento di queste cellule

Il microambiente (nicchia) regola la biologia delle cellule staminali

Come sono nate le procedure cliniche basate sull’espansione di cheratinociti staminali in coltu ra?

- Anni ’70: la prima coltura di cellule epiteliali, ottenute da teratoma murino,su un supporto di cellule “feeder” che producono fattori di crescita tali da prevenire la senescenza cellulare e il differenziamento in coltura

Anni ’70 (H. Green): cellule epiteliali, derivate da teratoma murino, potevano essere espanse in coltura se coltivate su un supporto di fibroblasti murini embrionali immortalizzati e irradiati letalmente (feeder layer)

Da questa osservazione si e’ ipotizzato che anche cellule epiteliali umane normali come i cheratinociti potessero crescere su feeder layer

- 1977 (Rheinwald & Green): mezzi addizionati di EGF favoriscono la capacita’ replicativa a lungo termine dei cheratinociti umani in coltura

Saggio funzionale di staminalita’: “Colony Forming Efficiency”

Concetto importante emerso da questi studi: la capacita’ replicativa a lungo termine dei cherat inociti in coltura e’ direttamente proporzionale alla loro capacita’ di formare un numero elevato di colonie grandi e regol ari

Holoclones : large with smooth circular perimeter. Are the stem cells of virtually all humansquamous epithelia and are required to restore massive epithelial defects.

Meroclones : wrinked perimeter. They have intermediate proliferative and clonegenicpotential; they give rise to and are a reservoir for paraclones.

Paraclones : small and highly irregular perimeter. They have the properties of transientamplyfing progenitor cells: grow rapidily at first, but their total lifetime is no more than 15 cellgenerations, after which their growth is arrested (involucrin).

-Anni 80 (Barrandon and Green): Classificazione dei tipi di cloni generati da singoli cheratinociti e aventi una diversa capacita replicativa in coltura.

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I chertatinociti staminali epidermici umani sono ut ilizzati in protocolli terapeutici di medicina rigenerativa

Trapianto autologo di epidermide coltivata in vitro

Keratinocytes grow in macroscopiccolonies when seeded on a feeder layer( lethally irradiated mouse fibroblasts)

Trattamento di pazienti con ustioni estese

Transplantation, 1999, 68(6):868-879

Ustioni sul 45-50% dellasuperfice corporea

Preparazione del sito diinnesto

Escarectomia medianteEscissione tangenzialedel tessuto

Rigenerazione epidermicacompleta e stabile

L’aspetto critico per il successo di questa procedure e’ che nei foglietti epiteliali generati in vitro sia presente un numero adeguato di cellule staminali (holoclone forming cells)

- fibrina + fibrina

L’uso di fibrina:• non altera le funzioni di staminalita’

L’uso di fibrina:• migliora la manipolazione del foglietto epiteliale • evita il trattamento enzimatico per il distacco del foglietto epiteliale

Un foglietto di epidermide umana coltivata in vitro e trapiantata in un topo immunodepresso, dopo 108 giorni, all’analisi istolo gica rivela:

1) la capacita di generare un epidermide umana, le cui cellule sono positive ad anticorpi involucrina uomo-specifici e uno spesso strato corn eo, tipico del tesuto umano2) caratteristiche di autorinnovamento conferitogli dalla presenza di cheratinociti staminali nel foglietto trapiantato. Tali cellule sono state in grado di generare cheratinociti differenzianti e costituire cosi’ tutti gli strati d ell’epidermide e di garantire un ricambio dei diversi strati cellulari ogni 30 giorni circa.

epidermide

InvolucrinaUmana +

La deteminazione degli olocloni nella pratica clinica e’ ancorail miglior indicatore della presenza di keratinocyte stem cells

La determinazione del numero di olocloni in unacoltura e’ difficile e laboriosa .

Nella pratica clinica, abbiamo bisogno di saggi alternativi(spesso quando e’ necessario procedere tempestivamente).

Un buon sostituto e’ la derminazione del numero di colonieabortive (paracloni) che e’ inversamente proporziona leal numero di olocloni (< di 10%)

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Epiteli stratificati della superficie oculare: Congiuntiva, Cornea e Limbus

L

C: Cornea

L: Limbus

CJ: Congiuntiva

Cornea:L’epitelio corneale e’ stratificato, non corneificato e trasparente. Ha la funzione di barriera ma soprattutto grazie alla sua trasparenza permette il Passaggio della luceE’ autorinnovante nonostante i cheratinociti che lo compongono siano gia “committed”al differenziamento

cheratinociti rappresentano circa il 90% delle cellule che compongono l’epitelio corneale

Human Corneal Epithelium

Ex vivo Corneal Cell Therapy

Transplantation(It must contain stem cells)

2) Limbal keratinocyteisolation

3) Limbal keratinocyte in vitro expansion on a feeder layer

Trapianto autologo di epitelio corneale coltivato in vitro

4) Cultured limbal epithelium on a fibrin gel

5) GRAFTING

1) Limbal biopsy

Ad admission Afetr limbal culture

After limbal culture+Keratoplasty

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2) Limbal keratinocyteisolation

3) Limbal keratinocyte in vitro expansion on a feeder layer

Trapianto autologo di epitelio corneale coltivato in vitro

SAGGI FUNZIONALI IN VITRO:•Clonogenic assay•Stem cell marker:

p63+cells>3%

4) Cultured limbal epithelium on a fibrin gel

5) GRAFTING

1) Limbal biopsy

Ad admission Afetr limbal culture

Afetr limbal culture+Keratoplasty

Self-renewalProliferation potential

Dati clinici dimostrano che grafts che contengono < 3% di cellule che esprimono alti livelli dip63 hanno un alto rischio di insuccesso

LIMBUS CORNEA

Proliferation+migration Wound healing and terminal differentiation

Resting stem cells

More than 75% of success rate in a study on 112 pat ients treatedwith autologous limbal stem cells grafts containing >3% p63 bright cells

Rama et al., 2010, the New England Journal of Medicine Rama et al., 2010, the New England Journal of Medicine

The rate of success directly correlates with the pr esence of p63-bright, holoclone-forming cells (stem cells) in the limbal grafts

Opacita’ corneale: Trapianto o non trapianto?

Trapianto di cornea:

• e’ indicato nei casi in cui l’epiteliolimbare sia integro e dunque in grado di colonizzare e rinnovare a lungo termine l’epitelio corneale

•non e’ indicato nei casi di deficit limbari per tra umameccanico, chimico o reazioni immunologiche ocause genetiche

•viene associato al trapianto di cellule limbari col tivate nel caso in cui lo stroma corneale sia molto compromess o :(rimozione del panno congiuntivale, trapianto di fog lietto limbare coltivato, cheratoplastica (trapianto di co rnea)

Le sfide attuali nelle terapie rigenerative della c ornea

E’ possibile mantenere ed espandere cellule stamina li limbariIn pazienti in cui il pool di cellule staminali endo gene è seriamente compromesso?

Possiamo trovare fonti alternative di cellule stami nali per trattare I deficit completi bilaterali di cellule staminali limbari?

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Possiamo manipolare farmacologicamente i segnali ce llulariresponsabili dell’autorinnovamento e differenziament o dei

cheratinociti staminali limbari?

Ricerca di target moleculari per l’espansione ex v ivo di cellule staminali

E’ possibile disegnare strategie per l’espansione ex vivodelle cellule staminali epiteliali?

P63/p-Akt

Limbus Cornea

P63/p-Akt

Activated Akt and p63 are not found in the corneal epithelium, depleted for keratinocyte stem cells

Terapia genica di malattie ereditarie mediante la correzione genetica cellule staminali Gene Therapy ex vivo

Inserimento del gene terapeutico in cheratinocitistaminali tramite vettori virali, seguita da amplificazione delle cellulegeneticamente corrette su feeder layer Generazione di un epitelio

geneticamente corretto

Epidermolisi bollosa

Nell’epidermolisi bollosa, le funzioni adesive delle celluleepidermiche dello strato basale sono compromesse

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Mavilio et al., Nature Medicine, 2006

Mavilio et al., Nature Medicine, 2006

•Cellule staminali embrionali (spesso chiamate “pluripotenti”) capaci di differenziare in tutti i tipi cellulari dell’organi smo

•Cellule staminali adulte o tessuto specifiche (difficili da identificare, isolare, e purificare.

Prospettive terapeutiche: riprogrammazione

Cellule staminali embrionali (ES cells)

pluripotentitotipotenti

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Le ES cells, in vitro (uomo e topo) e in vivo (topo)possono differenziare in tutti i tipi cellulari maturi

Le cellule adulte possono essere riprogrammate a uno stato di pluripotenza analogo a quello delle

cellule staminali embrionali (ES cells)

Induced pluripotent stem cells (IPs cells)(cellule staminali pluripotenti indotte)

Sono state generate cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) a partire da

fibroblasti dermici umani (HDF) introducendo i retrovirus esprimenti i

fattori trascrizionali OCT 3/4, SOX 2, c-Myc e KLF4

Dopo 2 settimane compaiono colonie granulate(C) morfologicamente diverse alle cellule hES, ma dopo

altri 10 giorni si osservano colonie piatte(D) simili a quelle formate da cellule hES

Cheratinociti umani del follicolo pilifero

•Transdifferenziamento in senso limbo-corneale

•Riprogrammazione a cellule iPS

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Ringraziamenti

Fondazione Telethon

Centro Regionale Trapianti del Piemonte

Fondazione Banca degli occhi del Veneto

Molecular Biotechnology Center

Regione Piemonte

ambientale divisionale

Divisione cellulare asimmetrica

Attualmente le applicazioni terapeutiche delle cellu le staminali (terapie cellulari e geniche) sono strett amente regolamentate da norme di. Good Manufacturing Pract ice (GMP)

Le terapie cellulari seguono le stesse regole della produzione di un farmaco (sono regolamentate dall’agenzia AIFA in Italia) che approva le procedureterapeutiche.

Devono essere eseguite in strutture dedicate approv atedall’AIFA come conformi alle GMP

B- DAMAGE

C- CORNEAL CONJUNCTIVALIZATION

In vivo, activated Akt is found in cells expressing high levels of p63,In vivo, activated Akt is found in cells expressing high levels of p63,a putative stem cell marker of the limbal epitheliuma putative stem cell marker of the limbal epithelium

pAkt/p63 Limbal Epithelium

-”Holoclones”:cloni di cheratinociti con la piu’ elevata capacita’ replicativa e sono originati da cheratinociti staminali. Quando colture di cheratinociti contenenti olocloni vengono trapiantati sono capaci di rigenerare un epitelio autorinnovante per tutta la vita

-Merocloni e Paracloni :danno origine a cloni di cheratinociti gia indirizzati al differenziamento e dunque incapaci di mantenere il rinnovamento dell’epidermide

Lo stroma corneale

Nello stroma cornealel’organizzazione del collagene in fasciperpendicolari garantisce la trasparenza del tessuto alla luce

Lo stroma corneale e’avascolare

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Limbus: epitelio stratificato posto tra congiuntiva e cornea riconosciuto come la nicchia staminale dell’epitelio corneale:I cheratinociti staminali sono interdispersi nello strato basale e proliferante

LimbusEpithelium

Bowman Layer

Stroma

Bowman LayerEND

L

L

Le cellule pluripotenti sono in grado di differenzia re in cellule derivate da tutti e tre i foglietti embrio nali

Ricostituzione del follicolo pilifero

H1, H2: Olocloni, cloni di cheratinociti derivanti da una singola cellula staminale in coltura

M1, M2: merocloni, cloni di cheratinociti derivanti da una singola cellula transient amplifying in coltura

Oloclone: H1 Meroclone:M1

Cheratinociti Limbari primari generano cloni di ker atinociti staminali e differenzianti