PETUNJUK PRAKTIKUM TEKNIK KULTUR JARINGAN TUMBUHAN (BIO 3002)

Oleh : TIM PENYUSUN Dr. rer. nat. Ari indrianto, S.U. Dr. Endang Semiarti, M.S., M.Sc. Eko Agus Suyono, M.App.Sc.

LABORATORIUM KULTUR JARINGAN TUMBUHAN FAKULTAS BIOLOGI UNIVERSITAS GADJAH MADA YOGYAKARTA 2011

1

Laboratorium Kultur Jaringan Tumbuhan Fakultas Biologi - Universitas Gadjah Mada Yogyakarta 2011

2

KATA PENGANTARPuji syukur ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa atas berkat rahmat dan hidayahNya, Petunjuk Praktikum Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan (BIO 3002) ini dapat kami susun dan selesaikan tepat pada waktunya. Buku ini disusun dengan tujuan untuk memenuhi kebutuhan praktikum Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan yang diselenggarakan oleh Laboratorium Kultur Jaringan Tumbuhan Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Buku ini disusun dengan memperhatikan dan mengakomodasi teknik-teknik dasar dalam ilmu Kultur Jaringan Tumbuhan semaksimal mungkin. Tim penyusun mengucapkan terima kasih kepada segenap pihak yang telah dengan senang hati membantu proses penyusunan buku petunjuk ini. Kami menyadari sepenuhnya bahwa buku ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu tim penyusun selalu mengharapkan kritik dan saran yang membangun untuk kesempurnaan buku petunjuk ini. Akhir kata, semoga buku ini dapat berguna bagi kemajuan ilmu pengetahuan pada umumnya dan bagi pihak-pihak yang memerlukan pada khususnya.

Yogyakarta, Oktober 2011 TIM PENYUSUN

i

TATA TERTIB PRAKTIKUM1. Praktikan harus hadir selambat-lambatnya 10 menit sebelum praktikum dimulai. 2. Praktikan harus mengikuti seluruh rangkaian acara praktikum mulai dari awal sampai akhir (tidak ada inhal). 3. Selama acara praktikum berlangsung, praktikan diharuskan: a. memakai jas praktikum yang bersih b. menjaga ketenangan dan ketertiban c. memperhatikan setiap pengarahan dari asisten d. tidak diperkenankan makan, minum, merokok, dan mengganggu kelangsungan acara praktikum, 4. Alas kaki harus dilepas saat berada di dalam laboratorium, kecuali menggunakan alas kaki khusus untuk laboratorium. 5. Jika ingin meninggalkan acara praktikum, harus seijin asisten jaga. 6. Praktikan bertanggung jawab penuh terhadap kebersihan laboratorium sebelum, selama, dan sesudah acara praktikum berlangsung. Jika ada kultur yang terkontaminasi HARUS SEGERA DIKELUARKAN dari ruang inkubator dan dibersihkan. 7. Kerusakan sarana dan prasarana oleh praktikan menjadi tanggung jawab sepenuhnya praktikan yang bersangkutan, dan harus diselesaikan dengan pihak laboratorium sebelum responsi. 8. Sebelum dan sesudah acara praktikum berlangsung diadakan tes tertulis (pre test dan post test). Setelah seluruh acara praktikum selesai diadakan responsi. 9. Peraturan yang belum tercantum dalam tata tertib ini akan ditentukan kemudian. 10. JAGALAH KEBERSIHAN LABORATORIUM Yogyakarta, Oktober 2011 Koordinator Praktikum

ii

PETUNJUK PEMBUATAN LAPORAN PRAKTIKUM TEKNIK KULTUR JARINGAN TUMBUHAN1. Laporan praktikum Kultur Jaringan Tumbuhan terdiri dari laporan sementara dan laporan akhir 2. Sebelum mengikuti acara praktikum hari tersebut, praktikan diharuskan mengumpulkan laporan sementara, yang terdiri dari pendahuluan, tinjauan pustaka, metode, dan daftar pustaka 3. Seminggu setelah hari terakhir pengamatan, praktikan diharuskan melengkapi Laporan sementara dengan menambahkan hasil, pembahasan, dan kesimpulan. Laporan sementara dikumpulkan selambat-lambatnya satu minggu kemudian. 4. Setelah dikoreksi, Laporan sementara akan dikembalikan kepada praktikan untuk direvisi dan dikumpulkan kembali dalam bentuk laporan akhir. 5. Laporan akhir berupa laporan keseluruhan acara praktikum yang disusun menjadi satu rangkaian acara (bukan bendel), menurut format yang telah ditentukan, dan dijilid dengan sampul buffalo biru muda. Laporan akhir dikumpulkan di akhir acara praktikum pada hari yang telah ditentukan. 6. Sebelum responsi berlangsung, praktikan harus mengumpulkan laporan akhir dengan format lengkap, sudah dijilid dan telah disahkan oleh asisten masing-masing, sebagai syarat mengikuti responsi. 7. Laporan praktikum Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan mengikuti sistematika penulisan laporan sebagai berikut: Format penulisan Laporan diketik dengan font Arial ukuran 11 pada kertas HVS ukuran A4 dengan batas tepi halaman: 34 3 3 iii

a. Borang Laporan SementaraBORANG LAPORAN PRAKTIKUM LAB. KULTUR JARINGAN TUMBUHANNo. dokumen Berlaku sejak Revisi halaman FO-UGM-BI-07-13 03 Maret 2008 00 1 dari 5

Matakuliah

: Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan

JUDUL ACARA PRAKTIKUM

Nama mahasiswa NIM Golongan / Kelompok Asisten: ..

Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta 2011

iv

BORANG LAPORAN PRAKTIKUM LAB. KULTUR JARINGAN TUMBUHAN

No. dokumen Berlaku sejak Revisi halaman

FO-UGM-BI-07-13 03 Maret 2008 00 2 dari 5

JUDUL ACARA PRAKTIKUM (3 poin) 1. Pendahuluan (15 point) a. Latar Belakang b. Permasalahan c. Tujuan Berisi pernyataan yang menjelaskan tujuan acara praktikum yang akan dikerjakan. 2. Tinjauan Pustaka (15 point) Berisi kajian materi yang relevan dengan acara praktikum yang dikerjakan. Pada dasar teori ini harus disertakan acuan/sitasi, dengan penulisan sistem nama dan tahun. 3. Metode (10 point) a. Alat b. Bahan c. Cara kerja 4. Hasil dan Pembahasan (40 point) Hasil (20 point): Berupa Grafik, Tabel atau Gambar. Pembahasan (25 point) : Berisi uraian hasil, analisis dan diskusi/kajian dari pustaka lain 5. Kesimpulan (5 poin) Berupa pernyataan (paragraf) yang merupakan simpulan dari hasil dan pembahasan. Pernyataan kesimpulan harus sesuai dengan tujuan. 6. Daftar pustaka (5 poin) Berisi pustaka acuan yang digunakan dalam penyusunan laporan. Daftar pustaka setidaknya terdiri 5 pustaka acuan berbahasa Inggris 7. Lampiran (2 point)v

b.

Borang Laporan akhirBORANG LAPORAN PRAKTIKUM LAB. KULTUR JARINGAN TUMBUHANNo. dokumen Berlaku sejak Revisi halaman FO-UGM-BI-07-13 03 Maret 2008 00 3 dari 5

Matakuliah

: Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan

JUDUL KESELURUHAN ACARA PRAKTIKUM

Nama mahasiswa NIM Golongan / Kelompok Asisten: ..

Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta 2011vi

BORANG LAPORAN PRAKTIKUM LAB. KULTUR JARINGAN TUMBUHAN

No. dokumen Berlaku sejak Revisi halaman

FO-UGM-BI-07-13 03 Maret 2008 00 4 dari 5

HALAMAN PENGESAHAN JUDUL Disusun oleh : Nama : NIM :

Disusun untuk melengkapi praktikum Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan Semester I 2011/2012 Yogyakarta, ..................... 2011 Menyetujui, Asisten

(...............................)

vii

BORANG LAPORAN PRAKTIKUM LAB. KULTUR JARINGAN TUMBUHAN

No. dokumen Berlaku sejak Revisi halaman

FO-UGM-BI-07-13 03 Maret 2008 00 5 dari 5

JUDUL KESELURUHAN ACARA PRAKTIKUM (3 point) 1. Pendahuluan (15 point) a. Latar Belakang b. Permasalahan c. Tujuan 2. Tinjauan Pustaka (15 point) a. Pembuatan Medium b. Perkecambahan Biji c. Induksi Kalus d. Organogenesis e. Embriogenesis 3. Metoda : (10 point) a. Alat 1) Pembuatan Medium 2) Perkecambahan Biji 3) Induksi Kalus 4) Organogenesis 5) Embriogenesis b. Bahan Idem alat c. Cara kerja Idem alat 4. Hasil dan Pembahasan (40 point) 5. Kesimpulan (5 poin) 6. Daftar pustaka (5 poin) 7. Lampiran (2 poin) Format lengkap dan tepat waktu: 5 poin Total nilai laporan praktikum: 100 poin

viii

8. Penilaian Penilaian praktikum meliputi hasil test (tes pendahuluan, pre&posttest, dan responsi), aktivitas (kebersihan, keaktifan selama pelaksanaan praktikum, dan hasil praktikum), dan laporan (laporan sementara dan laporan akhir) Keberhasilan (min. 50%) Jika tingkat kontaminasi melebihi 50%, maka praktikan (individu) harus mengulangi percobaan tersebut (hari ditentukan kemudian). Bila terjadi kontaminasi pada kultur: kultur yang terkontaminasi tersebut segera dikeluarkan dari ruang inkubasi dan dibersihkan (dicuci) maksimal 1 x 24 jam. Pengamatan: pengamatan harian dilakukan untuk mengetahui terjadinya kontaminasi pada hasil kultur praktikum. Pengambilan data dilakukan berdasarkan waktu yang ditentukan saat praktikum. Hari penanaman eksplan merupakan hari ke-0. Data pengamatan: dimasukkan ke dalam map masing-masing golongan dan diletakkan di tempat yang disediakan di laboratorium (tidak diperkenankan dibawa pulang!)

ix

DAFTAR ISIHALAMAN JUDUL KATA PENGANTAR TATA TERTIB PRAKTIKUM PETUNJUK PEMBUATAN LAPORAN DAFTAR ISI ACARA I ACARA II ACARA III ACARA IV ACARA V DAFTAR PUSTAKA i ii iii viii 1 10 15 21 27 32

x

ACARA I PEMBUATAN MEDIUM MURASHIGE & SKOOG (MS, 1962)Pengantar Kultur jaringan secara in vitro merupakan salah satu metode perbanyakan tanaman secara vegetatif yang menggunakan sel, jaringan atau organ tanaman yang ditumbuhkan secara aseptis pada medium budidaya buatan yang sesuai. Pemberian nutrisi dalam jumlah dan perbandingan yang benar pada media kultur, merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan pelaksanaan kerja kultur jaringan. Medium yang digunakan pada kultur in vitro tumbuhan bermacammacam tergantung pada jenis tanaman yang digunakan serta tujuan dari penelitian. Medium yang sering digunakan adalah medium MS (Murashige & Skoog) karena mengandung garam mineral dengan konsentrasi tinggi dan senyawa N dalam bentuk amonium dan nitrat (Dodds & Robert, 1983; Indrianto, 2002). Pada kultur kalus dan regenerasi berbagai tanaman digunakan medium MS. Untuk membuat medium kultur jaringan, kita harus menimbang setiap komponen bahan kimia yang tertera pada resep. Langkah ini menjadi kurang praktis, memakan banyak waktu dan mengurangi ketepatan. Selain itu timbangan yang digunakan untuk menimbang sejumlah kecil bahan kimia kadang-kadang tidak tersedia. Jalan keluar yang harus ditempuh adalah dengan membuat larutan stok, setiap larutan stok dapat dipergunakan untuk 40, 50 dan bahkan 100 liter medium (Indrianto, 2002). Larutan stok dibuat menjadi beberapa kelompok: stok besi (iron), stok mikronutrien, stok vitamin dan stok hormon. Untuk makronutrien tidak dibuat stok, jadi harus ditimbang satu persatu, tetapi jika diperlukan dapat dibuat larutan stok secara tunggal, tidak dikelompokkan menjadi satu. Yang perlu diperhatikan dalam pembuatan larutan stok adalah kepekatannya. Larutan stok yang dibuat1

terlalu pekat akan mengalami pengendapan sejalan dengan lama waktu penyimpanan, jika hal ini terjadi stok harus dilarutkan dengan pemanasan terlebih dahulu sebelum digunakan. Larutan stok harus disimpan dalam lemari es (kulkas). Larutan stok kadang-kadang terkontaminasi, ditumbuhi mikroorganisme, stok yang terkontaminasi tidak dapat dipergunakan lagi. Jadi kebersihan harus dijaga dan jangan membuat larutan stok terlalu banyak (Indrianto, 2002). Tujuan Meningkatkan pemahaman dalam mengembangkan protokol pembuatan medium MS yang efisien dan aman. Alat dan Bahan 1. Tabel formula dan bahan-bahan kimia untuk medium MS, 2. Universal indikator pH, HCl 1N, dan atau KOH 1N 3. Alumunium foil, kertas timbang, tissue dan label, 4. Erlenmeyer 1000 mL, Gelas piala 600 mL, gelas ukur 1000 mL 5. Erlenmeyer 100 mL, 50 mL, atau botol kultur (botol infus dan botol saus), 6. pipet, pengaduk, 7. Magnetic stirrer dengan hotplate dan magnet, 8. Timbangan analitik 9. autoclave

2

Tabel 1. Formula Medium Murashige & Skoog (1962)

BAHAN

STOCK

Untuk 1 L medium mg/L 1.650 1.900 440 370 170 ambil 5 mL stok (37,3) (27,8) ambil 1 mL stok (22,3) (8,6) (6,2) (0,83) (0,25) (0,025) (0,025) ambil 4 mL stok (2) (0,5) (0,5) (0,1) (1-5) M (1-5) M (1-10) ppm 100 mg 30.000 mg 8.000-10.000 mg 5,6 6,33

I. MAKRONUTRIEN NH4NO3 KNO3 CaCl2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4 II. BESI mg/200 mL (40X) Na2EDTA 1.492 FeSO4 7H2O 1.112 III. MIKRONUTRIENT mg/100 mL (100X) MnSO4 H2O 2.230 ZnSO4 4H2O 860 H3BO3 620 KI 83 NaMoO4 2H2O 25 CuSO4 5H2O 2,5 CoCl2 6H2O 2,5 IV. VITAMIN mg/200 mL (50X) Glycine 100 Nicotinic acid 25 Pyridoxine-HCl 25 Thiamine-HCl 5 V. ZAT PENGATUR TUMBUH BA NAA 2,4-D VI. Myo-Inositol VII. Sukrosa VIII. Agar pH

I. Pembuatan larutan stok untuk medium MS A. Stok besi (IRON): dalam 200 mL (40 kali konsentrasi) Prosedur kerjanya sebagai berikut : 1. Ditimbang 1.492 mg Na2EDTA dan 1.112 mg Fe2SO4.7H2O. Kedua bahan tersebut dilarutkan dalam kira-kira 75 ml akuades secara terpisah. Larutan Na2EDTA dipanaskan sampai hampir mendidih, kemudian masukkan larutan Fe2SO4.7H2O sedikit demi sedikit sambil diaduk (dengan magnetic stirrer). Kedua larutan akan tercampur, bening dan berwarna kuning emas, jika larutan keruh, tambahkan beberapa tetes HCl 1 N lalu dipanaskan. Biarkan mendingin pada suhu kamar, tambahkan akuades sampai volume menjadi 200 mL. Masukkan dalam botol khusus berwarna gelap, beri label: IRON. MS 40X, 5 mL/L 2. Simpan dalam kulkas, untuk membuat 1 liter medium MS, diperlukan 5 mL larutan stok besi. B. Stok Mikronutrien: dalam 100 mL (100 kali konsentrasi) Mikronutrien diperlukan dalam jumlah sangat sedikit, oleh karena itu stok mikronutrien dibuat dalam satu wadah sebagai stok campuran. Prosedur kerjanya sebagai berikut: 1. Ditimbang bahan-bahan kimia mikronutrien dengan timbangan analitik, masing-masing: MnSO4.H2O 2.230 mg ZnSO4.4H2O 860 mg H3BO3 620 mg KI 83 mg NaMoO4.2H2O 25 mg CuSO4.5H2O 2,5 mg CoCl2.6H2O 2,5 mg

4

2. Masukkan satu persatu dalam gelas piala 200 mL yang berisi akuades kurang lebih 80 mL. Setiap kali memasukan bahan kimia harus segera dilarutkan (diaduk), baru kemudian bahan berikutnya. Jangan memasukkan semua bahan kimia kemudian dilarutkan, akan terjadi presipitat (endapan). Untuk melarutkan bisa dibantu dengan magnetic stirrer, 3. Akuades ditambahkan kedalam larutan yang sudah jadi sampai volume menjadi 100 mL, 4. Masukkan dalam botol khusus, tutup yang rapat, beri label: MIKRO MS. 100X, 1 mL/L 5. Simpan dalam kulkas, untuk membuat medium MS 1 liter, diperlukan 1 mL stok mikronutrient. C. Stok Vitamin: dalam 200 mL (50 kali konsentrasi) Vitamin dapat dibuat dalam satu wadah sebagai stok campuran. Prosedur kerjanya sebagai berikut: 1. Ditimbang bahan-bahan dibawah ini: Glycine 100 mg Nicotinic acid 25 mg Pyridoxine-HCl 25 mg Thiamine-HCl 5 mg 2. Larutkan satu persatu dalam gelas piala 600 ml yang berisi akuades (steril) kira-kira sebanyak 150 mL, 3. Tambahkan akuades steril sampai volume mencapai 200 mL, 4. Masukan dalam botol khusus, tutup yang rapat, beri label: VITAMIN MS. 50X, 4 mL/L 5. Simpan dalam lemari es, untuk membuat 1 liter medium MS, diperlukan 4 mL stok vitamin.

5

D. Stok zat pengatur tumbuh Zat pengatur tumbuh diperlukan dalam jumlah yang sangat terbatas. Kelarutan dari masing-masing zat juga berbeda-beda. Biasanya stok zat pengatur tumbuh dibuat dengan kepekatan 1mM. 1. Stok NAA: 1 mM (1.862 mg/100 mL) BM NAA= 186,2 gram/mol 1. Timbang bahan sebanyak 18,62 mg, tuangkan masing-masing bahan dalam gelas piala 100 ml yang berisi akuades kira-kira 70 ml. 2. Sambil diaduk teteskan sedikit larutan KOH 1 N dengan hati-hati sampai larut benar (jernih). 3. Pindahkan dalam labu takar 100 ml, tambahkan akuades sampai volume menjadi 100 ml. 4. Pindahkan dalam wadah stok, tutup yang rapat, beri label: NAA 1mM, 1 M = 1 ml/L 5. Simpan di dalam lemari es. 2. Stok BA: 1 mM (2.252 mg/100 mL) BM BA = 225,2 gram/mol 1. Timbang BA 22,52 mg, masukkan ke dalam gelas piala 100 mL berisi akuades kira-kira 70 mL, 2. Sambil diaduk, teteskan sedikit larutan KOH 1 N dan dipanaskan sebentar sampai larutan menjadi jernih, 3. Setelah dingin, masukkan ke dalam labu takar 100 mL, tambahkan akuades sampai volume menjadi 100 mL, 4. Pindahkan dalam erlenmeyer 100 mL atau wadah lain yang bersih, tutup rapat beri label: BA 1 mM, 1 M = 1 ml/L 5. Simpan di dalam lemari es.6

3. Stok 2,4-D: 500 mg/L (500 ppm) Prosedur kerjanya sebagai berikut : 1. Timbang bahan sebanyak 50 mg, tuangkan bahan dalam gelas piala 100 mL yang berisi akuades kira-kira 70 mL, 2. Sambil diaduk teteskan sedikit larutan KOH 1 N dengan hati-hati sampai larut benar (jernih), 3. Pindahkan dalam labu takar 100 mL, tambahkan akuades sampai volume menjadi 100 mL, 4. Pindahkan dalam wadah stok, tutup yang rapat, beri label: 2,4-D 500 ppm, 1 mg/L = 2 ml/L 5. Simpan dalam lemari es. E. Myo-Inositol dan Sukrosa: karena jumlahnya cukup banyak, tidak dibuat stok, ditimbang setiap kali membuat media. LABEL MEDIUMMS 0 19-3-2008 XX

Keterangan : MS 0 : kode medium dan zat tambahan 19-3-2008 : tanggal pembuatan medium XX : inisial nama pembuat medium

Be Sp 19-3-2008 XX

Keterangan : Be Sp : nama bagian dan spesies eksplan 19-3-2008 : tanggal penanaman eksplan XX : inisial nama penanam

7

II. Pembuatan medium MS padat sebanyak 1 liter 1. Siapkan erlenmeyer 1000 mL yang berisi 500 mL akuades, 2. Timbang setiap komponen bahan kimia makronutrien (sesuai dengan tabel) dan larutkan satu persatu. Untuk mempercepat pelarutan dapat dibantu dengan magnetic stirrer, 3. Masukkan 5 mL larutan stok BESI, 4. Masukkan 1 mL larutan stok MIKRONUTRIEN, 5. Masukkan 4 mL larutan stok VITAMIN, 6. Timbang 100 mg Myo-Inositol, masukkan dalam erlenmeyer dan larutkan, 7. Timbang 30 g sukrosa, masukkan dalam erlenmeyer dan larutkan, 8. Masukkan zat pengatur tumbuh (bila diperlukan, sesuai kebutuhan), 9. Tambahkan akuades sampai volume mencapai 1000 mL, 10. Ukur pH menjadi 5,6 6,3 dengan penambahan HCl atau KOH, 11. Timbang 8 g agar-agar (tergantung keterangan yang dicantumkan dalam kemasan produk), masukkan dalam erlenmeyer, panaskan (sambil diaduk) sampai agar-agar larut, 12. Dalam keadaan masih cair, bagilah media kedalam botol kira-kira 20 mL/botol, 13. Tutup rapat dengan alumunium foil dan beri label sesuai dengan perlakuan, 14. Masukkan ke dalam autoclave dan disterilisasi pada suhu 121C selama 15 menit dengan tekanan 15 psi (1 atm), 15. Setelah tekanan turun sampai 0 atm, medium yang sudah steril segera dikeluarkan dari autoclave, jangan menunggu sampai dingin di dalam autoclave, karena pemanasan yang terlalu lama dapat merusak medium. 16. Medium yang sudah steril disimpan dalam ruang penyimpanan.

8

III. Pembuatan medium MS 1 liter + zat pengatur tumbuh1. Makronutrien Timbang masing-masing : NH4NO3 1.650 mg KNO3 1.900 mg CaCl2 2H2O 440 mg MgSO4 7H2O 370 mg KH2PO4 170 mg larutkan dalam 500 mL akuades Besi tambahkan 5 mL larutan stok Besi Mikronutrien tambahkan 1 mL larutan stok Mikro Vitamin tambahkan 4 mL larutan stok Vitamin Myo-Inositol Timbang 100 mg larutkan Sukrosa Timbang 30 g larutkan ZPT tambahkan ZPT sesuai kebutuhan ukur pH 5,6 6,3 tambahkan akuades sampai 1000 mL Agar Timbang 8 g masukkan, panaskan sampai agar larut (sambil diaduk) dalam keadaan medium masih cair, tuangkan dalam botol @ 20 mL STERILISASI dengan autoclave (1 atm, 121C, 15 menit)

2. 3. 4. 5.

6.

7.

8.

9

ACARA II PERKECAMBAHAN IN VITROPengantar Sel, jaringan dan organ dari setiap bagian tanaman pada dasarnya dapat dipergunakan sebagai sumber eksplan. Pemilihan eksplan terutama ditentukan oleh tujuan dari penelitian kultur in vitro itu sendiri. Untuk perbanyakan klonal (mikropropagasi) digunakan kuncup aksiler (axillary bud) atau kuncup apikal (apical bud). Untuk induksi kalus digunakan kotiledon, hipokotil, daun, batang, atau embrio. Faktor lain yang juga harus dipertimbangkan pada pemilihan eksplan adalah kondisi fisiologis dan umur tanaman donor, musim pengambilan eksplan (penghujan/kemarau) dan ukuran eksplan. Eksplan terbaik untuk induksi kalus adalah jaringan dari bagian-bagian semai (seedling) yang dikecambahkan dan ditumbuhkan secara in vitro (Indrianto, 2002). Eksplan harus disterilisasi sebelum ditanam pada medium kultur. Bahan pensteril yang umum digunakan adalah sublimat (HgCl2), clorine bleach (Na hipochlorit) yang dipasaran umumnya dijumpai dengan merek Suncline dan alkohol. Konsentrasi dan lama waktu sterilisasi sangat bervariasi tergantung dari jenis eksplan dan tempat tumbuhnya. Eksplan yang ditumbuhkan di dalam rumah kaca relatif lebih bersih, sedangkan yang berasal dari lapangan pada umumnya lebih kotor, lebih terkontaminasi sejak dari awalnya sehingga prosedur sterilisasi harus dibuat lebih keras dengan meningkatkan konsentrasi bahan pensteril atau dengan memperpanjang waktu sterilisasi. Prasterilisasi dengan mencuci eksplan menggunakan detergent atau sabun cair (tween) juga diperlukan. Untuk eksplan yang berdaging (umbi akar wortel), yang tertutup sarung daun (pucuk tebu), dan biji muda yang masih terdapat di dalam buah (anggrek) dapat disterilisasi dengan

10

merendam di dalam alkohol beberapa saat kemudian melalukannya di atas nyala api. Kontaminasi yang disebabkan oleh kurang sempurnanya prosedur sterilisasi biasanya segera terlihat dengan munculnya kontaminan (bakteri/jamur) disekitar medium yang berdekatan (kontak) dengan eksplan. Sedangkan kontaminan yang disebabkan karena kecerobohan kerja dan kondisi ruang kerja yang tidak steril, biasanya terlihat berupa bercak-bercak koloni jamur/bakteri di seluruh permukaan medium (Gamborg & Shylik, 1981). Tujuan 1. Melatih prosedur kerja secara aseptis dengan mengecambahkan biji dan menumbuhkannya secara in vitro. 2. Mendapatkan sumber eksplan yang steril. Alat dan Bahan 1. Biji jagung (Zea mays), dan wortel (Daucus carota) 2. Medium MS tanpa ZPT (MS 0), 3. Bleach 5,25% (Bayclin,Clorox,dsb), Akuades steril, Alkohol 70%, 4. Erlenmeyer 250ml, 100mL, dan pipet steril 5. Petridish berisi kertas saring steril, Pinset steril, 6. Hand sprayer berisi spiritus, Tisu, 7. Plastic seal, Alumunium foil steril, kertas label dan 8. Laminar Air Flow atau Entkas.

11

Cara Kerja A. Persiapan Laminar Air Flow (LAF) 1. Sebelum mulai bekerja, lepaskan asesoris tangan (jam, cincin, gelang, dsb), simpan ditempat yang aman, cuci tangan dengan sabun antiseptik. Matikan UV, bersihkan lantai dan dinding LAF dengan menyemprotkan alkohol 70%/spiritus serta melapnya dengan kertas tissue, kemudian baru LAF dihidupkan. 2. Masukkan alat-alat (satu per satu) ke dalam LAF, sebelumnya alatalat disemprot dengan alkohol 70%/spiritus pada permukaannya. Alat-alat diatur posisinya, jangan meletakkan alat-alat terlalu dekat dengan bagian luar dan letakkan di kanan kiri posisi duduk kita (lihat gambar 1 dan 2). Keterangan : a. Switch on/off UV lamp. b. Switch on/off neon lamp. c. Switch on/off blower.

Gambar 1. Laminar Air Flow (LAF)

Keterangan : a. Lubang untuk tangan/jalan untuk memasukkan alat dan bahan. b. Tablet formalin (untuk sterilisasi ruang). Gambar 2. Entkas

12

B. Sterilisasi dan Penanaman Biji In Vitro Prosedur kerja sterilisasi dan penanaman biji in vitro adalah sebagai berikut:

50 biji dicampur dengan bleach 5,25% lalu digojok selama 10 menit Bleach dibuang dengan pipet Akuades steril dimasukkan lalu digojok lima menit, dibuang dengan pipet, pencucian diulangi dua kali Alkohol 70% dimasukkan, digojok dan segera dibuang Dicuci dengan akuades steril tiga kali, masing-masing tiga menit Biji dipindahkan pada petridish yang berisi kertas filter steril Biji ditanam pada medium MS0. Tida biji per botol untuk Zea mays, dan secukupnya untuk D. Carota dan N. tabacum Botol kemudian ditutup dengan plastik segel, diberi label, dan diinkubasi di tempat terang.

13

C. Pengamatan Selama satu minggu (atau sesuai yang ditentukan saat praktikum), diamati jumlah dan pertumbuhan (panjang) kecambah. Selain itu, perhatikan ada tidaknya kontaminasi, macam kontaminasi (jamur atau bakteri) dan letak kontaminan, apakah berasal dari eksplan, atau medium (akibat kecerobohan kerja).

14

ACARA III INDUKSI KALUSPengantar Kalus adalah masa sel yang tidak terorganisir, hasil proliferasi sel-sel in vitro yang pada mulanya adalah sebagai respon terhadap pelukaan (wounding). Pertumbuhan dan pembelahannya menjadi tidak terkendali karena pengaruh nutrien dan zat pengatur tumbuh eksogen yang ditambahkan pada medium kultur. Selain berasal dari luka bekas irisan, kalus juga bisa berasal dari pembelahan sel-sel kambium yang terus membelah dan berproliferasi. Proliferasi sel-sel akan terjadi lebih baik jika eksplan yang digunakan berasal dari jaringan yang masih muda. Sel-sel yang telah berdiferensiasi seperti mesofil daun, korteks dan berkas pengangkut juga dapat diinduksi untuk membelah lagi dan membentuk kalus, proses ini disebut dediferensiasi (Indrianto, 2002). Pertumbuhan kalus akan menurun setelah periode waktu tertentu, hal ini disebabkan karena kandungan nutrisi yang semakin menyusut, agar-agar yang semakin mengeras karena evaporasi dan terakumulasinya sejumlah senyawa toksik pada medium disekitar eksplan. Untuk itu harus dilakukan subkultur, yaitu pemindahan eksplan kedalam medium baru. Tujuan dilakukannya subkultur adalah untuk memperbanyak kalus, mempertahankan laju pertumbuhan tetap konstan dan untuk diferensiasi kalus. Medium baru yang digunakan dapat sama atau berbeda dengan medium semula. Tekstur, struktur dan morfologi kalus dapat bermacam-macam, ada yang kompak dan keras, kadang-kadang dengan nodular, ada juga yang friabel dan lunak sehingga mudah dipecah-pecah, kadang-kadang juga ada yang berpigmen. Laju pertumbuhan kalus, seperti halnya pada kebanyakan organisme sel tunggal, membentuk kurva sigmoid yang dicirikan dengan adanya 5 fase pertumbuhan, yaitu : 1. fase lag, sel-sel didalam jaringan siap membelah; 2. fase pertumbuhan eksponensial,15

pembelahan sel-sel mencapai maksimal; 3. fase pertumbuhan linier, pembelahan sel-sel melambat tetapi laju pembentangan sel-sel meningkat; 4. fase progressive deceleration, pembelahan dan pembentangan sel-sel menurun; 5. fase stasioner, periode dimana tidak ada pertumbuhan sel-sel karena tidak membelah lagi (George & Sherington, 1954). Tujuan Mempelajari teknik induksi kalus Alat dan Bahan 1. Daun tembakau (Nicotiana tabacum) dari greenhouse 2. Kecambah wortel (Daucus carota) in vitro 3. Medium MS padat dengan zat pengatur tumbuh 2,4-D 2 mg/L dan MS0 sebagai kontrol, 4. Petridish, kertas saring, skalpel, mata pisau, dan pinset steril, 5. Na Hipoklorit (Bleach) 5,25 %, Tween, Akuades steril, 6. Plastic seal, alumunium foil steril, kertas label, pensil 7. Hand sprayer berisi alkohol, tisu 8. Erlenmeyer 250 mL, beker glass 250 mL, 9. Laminar Air Flow.

16

Cara kerja 1. Persiapan eksplan dan prasterilisasi Daun tembakau dicuci bersih dengan menggunakan sabun dan dibilas menggunakan air bersih. Daun yang telah dicuci diletakkan di dalam petridish kemudian ditutup dan segera dibawa ke dalam Laminar Air Flow atau entkas. 2. Sterilisasi eksplan a. Bersihkan permukaan meja kerja dengan menyemprotkan alkohol 70% dan melapnya dengan kertas tissue. Sterilisasi eksplan dilakukan dengan Na Hipoklorit. b. Daun tembakau disterilisasi dengan merendam daun dalam larutan Na Hipoklorit (konsentrasi tergantung eksplan) yang ditambah dengan beberapa tetes tween selama 10 menit (tergantung eksplan), kemudian dicuci dengan akuades steril dua kali masing-masing 5 menit. Pastikan eksplan sudah tidak lagi mengandung sisa-sisa Na hipoklorit c. Kecambah wortel tidak perlu disterilisasi karena sudah steril. 3. Pemotongan eksplan a. Untuk daun tembakau pisahkan helaian daun (lamina) dengan ibu tulang daunnya (costae). Untuk costae dipotong dengan ukuran panjang kira-kira 0,5 cm. Sedangkan untuk lamina dipotong melewati pertulangan daun dengan ukuran (0,5 x 0,5) cm2. b. Untuk kecambah wortel, diambil bagian daun, kotiledon, dan hipokotilnya

17

4. Penanaman dan inkubasi a. Dengan pinset steril, masukan 3 potong eksplan untuk setiap botol kultur, harus dijaga jarak antara eksplan satu dengan lainnya, jangan saling berdempetan. b. Botol kultur yang telah berisi eksplan segera ditutup dan dibawa keruang inkubator, inkubasi dilakukan ditempat terang. 5. Pengamatan Selama empat minggu (atau sesuai yang ditentukan saat praktikum), amati asal terbentuknya kalus, tekstur, dan warna kalus. Perhatikan juga keberadaan, macam, dan letak kontaminasi serta terjadinya browning.

18

Prosedur Kerja Induksi Kalus pada Daun Tembakau (Nicotiana tabacum)

Prasterilisasi Dicuci dengan sabun dan dibilas air mengalir

LAF Larutan dibuang

STERILISASI

Larutan dibuang

Na Hipoklorit/ Dicuci akuades steril Bleach 5,25 Ibu tulang

%

daundaunHelaian 0,5 cm2

daun

1 Ibu tulang 2 daun Helaian daun

Dipotong

19

Prosedur Kerja Induksi Kalus pada Kecambah in vitro Wortel (Daucus carota)

20

ACARA IV ORGANOGENESIS IN VITROPengantar Kemampuan sel-sel tumbuhan selain zigot untuk tumbuh dan berkembang menjadi tanaman utuh dapat dimanfaatkan untuk perbanyakan tanaman secara in vitro (mikropropagasi) (Indrianto, 2002). Regenerasi tanaman secara in vitro terjadi melalui serangkaian proses pertumbuhan dan perkembangan yang disebut morfogenesis. Morfogenesis melibatkan dua proses yang berbeda yaitu organogenesis dan embriogenesis. Pada organogenesis sel-sel kalus, terutama di daerah perifer, mengalami serangkaian pembelahan yang sangat cepat kemudian membentuk jaringan meristemoid. Sel-sel meristemoid selanjutnya mengalami diferensiasi membentuk meristem unipolar yang menghasilkan primordia tunas atau akar (Indrianto, 2002). Pengendalian proses organogenesis diatur oleh zat pengatur tumbuh auksin dan sitokinin. Pada embriogenesis somatik, proses awalnya mirip dengan organogenesis, yaitu dimulai dengan pembentukan kelompok sel-sel yang disebut embrioid. Proses perkembangan selanjutnya mirip dengan proses embriogenesis zigotik, yaitu terbentuknya meristem bipolar yang berupa bakal tunas dan akar, dua meristem yang diperlukan untuk pertumbuhan tanaman utuh. Morfogenesis in vitro dapat terjadi secara langsung dan tidak langsung. Secara langsung terjadi tanpa melalui tahapan kalus terlebih dahulu. Sel-sel pada eksplan dapat diinduksi langsung menjadi embrionik dengan menanam eksplan pada medium dengan kombinasi zat pengatur tumbuh dari kelompok auksin dan sitokinin secara simultan (Gamborg & Shylik, 1981). Ada dua jalur yang dapat ditempuh pada mikropropagasi untuk sampai pada tanaman regenerasi, yang pertama adalah regenerasi dari meristem yang sudah ada seperti misalnya pada meristem apikal atau21

aksiler. Cara ini dapat menghasilkan tanaman yang secara klonal relatif stabil. Yang kedua adalah dengan menginduksi meristem baru (de novo meristems) misalnya adventif dan embrio somatik (George & Sherington, 1954). Cara yang kedua ini ditempuh dengan melalui tahapan kalus terlebih dahulu sehingga lebih produktif, dalam arti tingkat multiplikasinya lebih tinggi. Sejalan dengan bertambahnya tahapan yang harus ditempuh untuk sampai pada tanaman lengkap, tingkat penyimpangan genetiknya juga menjadi semakin tinggi, sehingga lebih banyak menghasilkan variasi somaklonal (Gamborg & Shylik, 1981). Tujuan 1. Mempelajari teknik dasar mikropropagasi tanaman bawang putih (Allium sativum L.) dan kecambah tembakau (Nicotiana tabacum). 2. Mengamati proses morfogenesis in vitro. Alat dan Bahan : 1. Embrio bawang putih (Allium sativum L.) yang sehat, 2. Kecambah Tembakau (Nicotiana tabacum) in vitro, 3. Medium MS padat dengan variasi zat pengatur tumbuh NAA dan BA, dan MS0 sebagai kontrol. 4. Alkohol 70% 5. pisau/ cutter, 6. Erlenmeyer 250 mL, beker glass 250 mL, 7. Petridish dengan kertas saring, skalpel, mata pisau, dan pinset steril, lampu spiritus, 8. Plastic seal, Alumunium foil steril, kertas label, 9. Hand sprayer berisi spiritus, Tisu, dan 10. Laminar Air Flow

22

Cara Kerja : 1. Persiapan Medium Kultur Pembuatan medium MS padat dengan penambahan zat pengatur tumbuh NAA dan BA yang dikombinasi sebagai berikut : Tabel 2. Kombinasi zat pengatur tumbuh yang digunakan KOMBINASI NAA (M) BA (M) I 0 0 II 1 5 III 3 3 IV 5 1

2. Persiapan Eksplan, Sterilisasi, dan Inokulasi. a. Umbi Bawang Putih Pisahkan umbi bawang putih satu persatu, kemudian kulitnya dikupas dengan pisau atau cutter. Masukkan umbi yang telah dikupas ke dalam beker glass, kemudian dibawa ke dalam LAF. Rendamlah umbi di dalam alkohol 70% selama beberapa saat. Ambil umbi dengan pinset, lalukan di atas nyala api, biarkan sampai api padam. Diulangi tiga kali. Letakkan umbi yang telah steril di atas petridish yang sudah dialasi kertas saring. Dengan skalpel tajam, pisahkan bagian embrio dari umbinya. Buatlah potongan melintang pada embrio, sehingga terbagi menjadi tiga bagian, yaitu bagian pangkal, tengah dan ujung. Tanamlah potongan umbi pada medium yang telah disiapkan. Tutuplah botol kultur, beri label dan inkubasikan dengan pencahayaan. b. Kecambah Tembakau Kecambah tembakau yang digunakan berasal dari percobaan perkecambahan in vitro, sehingga inokulan yang digunakan sudah steril (Tidak perlu melalui proses sterilisasi).

23

Letakkan kecambah di atas petridish yang sudah dialasi kertas saring steril. Dengan menggunakan skalpel yang tajam, diambil bagian hipokotil, epikotil dan helaian daunnya. Untuk hipokotil dan epikotil dipotong dengan ukuran kira-kira 0,5 cm, sedangkan untuk helaian daun dipotong melewati pertulangan daun dengan ukuran (0,5 x 0,5) cm2. Dengan pinset steril masukkan masinh-masing eksplan ke dalam botol kultur. Dijaga jarak satu eksplan dengan yang lainnya agar jangan saling berdempetan. Botol kultur yang telah berisi eksplan segera ditutup dan dibawa ke ruang inkubator, inkubasi dilakukan di tempat terang. 3. Pengamatan Selama empat minggu (atau sesuai yang ditentukan saat praktikum), amati kapan dan didaerah mana tunas atau akar terbentuk; pada perlakuan variasi hormon apa akar atau tunas terbentuk; dan berapa tanaman regenerasi (tunas atau akar) yang terbentuk pada setiap eksplan. Perhatikan juga keberadaan (ada tidaknya), macam, dan letak kontaminasi serta terjadinya browning.

24

Prosedur Kerja Organogenesis pada Umbi Bawang Putih (Allium sativum L.)

Dikupas kulitnyaDicelupkan dalam alkohol 70%

Alkohol 70 %

Dilewatkan di atas api, diulangi 3 kali

25

Prosedur Kerja Organogenesis pada Kecambah in vitro Tembakau (Nicotiana tabacum)

26

ACARA V EMBRIOGENESIS IN VITROPengantar Embriogenesis somatik adalah suatu proses induksi embrio dari sel-sel somatik baik yang bersifat haploid maupun diploid, untuk berkembang dan berdifferensiasi membentu tanaman utuh. Embrio akan tumbuh dan berkembang melalui proses yang identik dengan proses embriogenesis zigotik tapi tanpa melalui fusi gamet jantan dan betina. Embrio somatik secara morfologi maupun fisiologi memiliki kemiripan dengan embrio zigotik, yaitu terbentuknya struktur bipolar melalui tahapan bulat (globuler), jantung (heart), torpedo, dan akhirnya berkecambah menjadi plantlet. Struktur bipolar tersebut menyebabkan perbanyakan melalui embrio somatik lebih menguntungkan dari pada pembentukan tunas adventif yang unipolar. Embrio somatik dapat terbentuk melalui dua jalur, yaitu secara langsung dan secara tidak langsung (melewati fase kalus). Sel-sel pada eksplan dapat diinduksi langsung menjadi embriogenik dengan menanam eksplan pada medium dengan kombinasi zat pengatur tumbuh dari kelompok auksin dan sitokinin secara simultan (Gamborg & Shylik, 1981). Umumnya digunakan auksin yang mempunyai daya aktivitas kuat atau pada konsentrasi tinggi. 2,4-D merupakan auksin sintetik yang efektif untuk induksi kalus embriogenik karena cukup kuat dan tahan terhadap degradasi reaksi enzimatik dan fotooksidasi. Respon awal eksplan terhadap 2,4-D adalah pembentukan kalus sebagai wujud dediferensiasi. Sebagian sel-sel kalus yang terbentuk bersifat embriogenik dan dapat berkembang menjadi embrio somatik setelah kalus tersebut ditransfer ke dalam medium yang sesuai seperti benzyladenin (BA) atau kinetin secara bersamaan. Embriogenesis dapat dibagi menjadi beberapa tahap, yaitu: 1. Induksi kalus embriogenik.27

Induksi embriogenik dilakukan dengan melakukan dedifernsiasi pada sel somatik. Sel soatik ditransfer ke dalam medium dengan kandungan auksin tinggi dan jika proses induksi embriogenesisnya benar, maka gen-gen yang bertanggung jawab terhadap totipotensi akan berfungsi, pembelahan sel-selnya menjadi terkendali, dan akhirnya terbentuk embrio. selain itu, induksi proses dediferensiasi juga dapat dilakukan debgan stress somatik. Keberhasilan akan tercapai apabila kalus dan sel yang digunakan bersifat embriogenik, yang bercirikan oleh sel yang berukuran kecil, sitoplasma padat, inti besar, vakuola kecil-kecil dan mengandung butir pati. Sel-sel yang telah mengalami proses dedifensiasi akan berubah menjadi embriogenik dan selanjutnya berkembang menjadi embrio. 2. Pendewasaan (maturation) Pra pendewasaan embrio somatik dilakukan dengan pemindahan embrio pada medium dengan pengurangan atau tanpa zat pengatur tumbuh sehingga menghambat proliferasi dan merangsang pembentukan serta perkembangan awal embrio somatik. Pendewasaan embrio somatik dilakukan dnegan mengkultur embrio pada merium yang mengandung ABA dan atau mengurangi potensial osmotik. Tahap pendewasaan meliputi tahap perkemabnagn embrio menjadi berbentuk globuler, jantung, torpedo, kotiledon, dan primordia akar. Proses pendewasaan embrio menggambarkan tiga proses penting, yaitu: a. zigot mengalami pembelahan asimetri, menyebabkan sel apikal lebih kecil dari sel basal. b. pembentukan pola spesifik sehingga embrio berbentuk globuler c. transisi dari tahap globuler sampaimenuju kotiledon di mana terjadi inisiasi primordia akar dan pucuk. 3. Perkecambahan Tahap perkecambahan adalah tahap pembentukan akar dan tunas. Pada media perkecambahan, konsentrasi zat pengatur tumbuh28

yang ditambahkan sangat rendah atau bahkan tidak diberikan sama sekali 4. Hardening Tahap hardening yaitu tahap aklimatisasi bibit embrio somatik dari kondisi in vitro ke lingkungan baru di rumah kaca dengan penurunan kelembaban dan peningkatan intensitas cahaya. Tujuan 1. Mempelajari teknik dasar mikropopagasi tanaman wortel (Daucus carota L. ) melalui induksi embrigenesis somatik in vitro. 2. Mengalami fase-fase embriogenesis somatik secara in vitro Alat dan Bahan 1. Kalus wortel (Daucus carota L.) dalam medium MS + 2,4 D 2 mg/L 2. Medium MS padat dengan penambahan 2,4 D (1 dan 0,5) mg/L dalam petridish 3. Alkohol 70% 4. Petridish dengan kertas saring, skalpel, mata pisau, dan pinset lampu spiritus 5. Plastic seal, kertas label 6. Hand sprayer berisi spiritus, tisu, dan 7. Laminar Air Flow 8. Mikroskop stereo Cara Kerja: 1. Pembuatan medium dalam petridish Medium MS steril padat dalam erlenmeyer dipanaskan di atas hotplate hingga mencair. Tunggu hingga suhu turun, sekitar 40-50C. Bawa masuk kedalam ruang steril (Laminar Air Flow atau entkas). Didalam ruang steril, tambahkan hormon steril sesuai kebutuhan. Goyang hingga homogen. Tuang ke dalam petridish steril.29

Tunggu hingga menjendal. Segel petridish dengan seal plastik. Medium siap digunakan. 2. Induksi dan pemeliharaan kalus Kecambah wortel in vitro umur 9 hari diletakkan di atas petridish. Hipokotil kecambah dipotong menggunakan skalpel sepanjang satu cm dari pangkal kotiledon. Ditanam dalam medium MS+2,4 D 2mg/L untuk induksi kalus. Setiap petridish diisi empat eksplan. Kultur diinkubasi pada suhu 22-25oC dan cahaya 1000 flux secara terus-menerus selama lima minggu. 3. Induksi embrio somatik Kalus wortel berumur 5 minggu dari perlakuan diatas, diletakkan di atas petridish. Kalus dibagi menjadi dua bagian menggunakan skalpel. Setiap potongan disubkultur dalam medium MS+BAP 0,5 mg/L, MS+BAP 1 mg/L dan MS0 (sebagai kontrol) untuk induksi embrio somatik. Setiap petridish diisi empat irisan kalus. Kultur diinkubasi pada suhu 22-25oC dan cahaya 1000 flux secara terusmenerus selama tiga minggu 4. Pendewasaan embrio somatik Embrio somatik umur tiga minggu dari perlakuan BAP terbaik di atas di subkultur dalam medium MS+PEG 4000 7% + ABA 9 M, dan MS0 (sebagai kontrol) untuk pendewasaan embrio. Kultur diinkubasi pada pencahayaan 1000 flux secara terus-menerus selama 5 minggu. 5. Perkecambahan embrio somatik Embrio dewasa (fase torpedo) yang dihasilkan dari medium pendewasaan embrio somatik selanjutnya ditransfer ke medium perkecambahan berupa medium dasar tanpa zat pengatur tumbuh (MS0) 6. Pengamatan Embrio somatik yang terbentuk pada masing-masing perlakuan dihitung di bawah mikroskop stero pada perbesaran 40 kali. Diamati

30

terbentuknya embrio dari tiap fase baik globuler, jantung, maupun torpedo dan dihitung jumlahnya.

31

DAFTAR PUSTAKADodds, J. H. and L. W. Roberts. 1983. Experiment in Plant Tissue Culture. Cambridge university Press. Sydney. Gamborg, O and J. P. Shylik. 1981. Nutrition Media and Characteristic of Plant Cell and Tissue Culture. In: Thorps T. A. (ed). Plant Tissue Culture Methods an Applications in Agriculture. Academic Press. San Fransisco. George, E.F. and P.D. Sherington, 1954. Plant Propagation by Tissue Culture: Handbook and Directory of Comercial Laboratories. Exegetics Ltd. Eversly, Basingstoke, Hants. England. Indrianto, A, 2002. Bahan Ajar Kultur Jaringan Tumbuhan. Laboratorium Kultur Jaringan. Fakultas Biologi UGM. Yogyakarta.

32