12 Dwi Wahyuni Ardiana: Isolasi DNA genom pepaya dan jeruk menggunakan bufer CTAB

TEKNIK ISOLASI DNA GENOM TANAMAN PEPAYA DAN JERUKDENGAN MENGGUNAKAN MODIFIKASI BUFER CTAB

Dwi Wahyuni Ardiana

Teknisi Litkayasa Nonkelas pada Balai Penelitian Tanaman Buah Tropika, Jalan Raya Solok-Aripan km 8Kotak Pos 5 Solok 27301, Sumatera Barat, Telp. (0755) 20137, Faks. (0755) 20592, E-mail: balitbu@litbang.deptan.go.id

Penelitian keragaman genetik tanaman buah merupakansalah satu kegiatan penting untuk mendukung pemuliaan

tanaman. Perbedaan tanaman dapat dideteksi melalui be-berapa penanda, antara lain dengan pola pita DNA (Lamadji1998), yang sering disebut sebagai penanda molekuler.Penanda molekuler berperan penting dalam konservasi danpengelolaan sumber daya genetik tanaman (Karp et al. 1997).

Teknik molekuler bervariasi dalam cara pelaksanaanuntuk mendapatkan data, baik tekniknya maupun tingkatantarget data yang diinginkan sesuai kemudahan pelaksanaan,ketersediaan sumber daya manusia, fasilitas, dan dana (Karpet al. 1997). Ekstraksi untuk mendapatkan DNA berkualitastinggi merupakan satu kaidah dasar yang harus dipenuhidalam studi molekuler, terutama dalam pencandraan sidik jariDNA. Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) merupa-kan metode yang umum digunakan dalam ekstraksi DNAgenom tanaman yang banyak mengandung polisakarida dansenyawa polifenol (Lumaret et al. 1998; Jose dan Usha 2000).Ada tiga langkah utama dalam ekstraksi DNA, yaitu pe-rusakan dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari bahan padatseperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Nicholl1993; Surzycki 2000).

Tanaman pepaya dan jeruk mengandung banyak karbo-hidrat, protein, dan polifenol. Untuk memudahkan peng-hancuran sampel dari bahan seperti ini, umumnya ekstraksiDNA menggunakan nitrogen cair. Namun, masalah akanmuncul bila lokasi penelitian jauh dari pusat industri se-hingga sulit mendapatkan nitrogen cair. Oleh karena itu, perlumetode isolasi DNA yang mudah dan tidak memerlukannitrogen cair, tetapi dapat menghasilkan DNA yang ber-kualitas tinggi untuk proses amplifikasi.

Percobaan bertujuan untuk mendapatkan teknik isolasiDNA berkualitas tinggi dari daun pepaya dan jeruk tanpamenggunakan nitrogen cair.

BAHAN DAN METODE

Percobaan dilaksanakan di Laboratorium Pemuliaan BalaiPenelitian Tanaman Buah Tropika (Balitbu Tropika), Solok

Buletin Teknik Pertanian Vol. 14 No. 1, 2009: 12-16

pada bulan September-Desember 2006. Bahan yang diguna-kan adalah contoh daun muda tanaman pepaya dan jerukyang diperoleh dari Kebun Percobaan Sumani, BalitbuTropika. Bahan lain yang digunakan adalah PuRe TaqTM

Ready To-GoTM berbentuk butiran (Kit) (GE Healthcare), pri-mer RAPD 1-6 yang mempunyai untaian nukleotida RAPD1,RAPD2, RAPD3, RAPD4, RAPD5, RAPD6, lambda (λ) DNA,dan 1 kb DNA ladder. Alat yang digunakan adalah timbangananalitik, microwave oven, lemari es dan freezer, perangkatelektroforesis, vortex mixer, mesin PCR (Mastercycler),waterbath, sentrifus (Prymo R), gelas ukur 100 ml, botol bufer(Scaatt Duran), mortar dan pestel, spatula, gunting, pipetukur, pipet mikro, tips, pH meter, tabung mikrosentrifus, dansarung tangan karet.

Persiapan Sampel

Contoh daun muda tanaman pepaya dan jeruk disiapkanmengikuti kaidah Santoso et al. (2003). Contoh daun dipetiklalu dimasukkan ke dalam plastik berklip ukuran 10 cm x 7 cmyang berisi 2-3 ml bufer CTAB ditambah 1% ß-mercaptoetanol.Plastik berisi contoh lalu ditekan menggunakan keduatelapak tangan untuk mengeluarkan udara sehingga seluruhcontoh terlindungi oleh bufer dan menempel pada plastik.Plastik berisi contoh lalu diberi label dan disimpan dalamfreezer bersuhu -20°C dan siap untuk digunakan.

Tahapan isolasi DNA disajikan pada Gambar 1. Teknikisolasi DNA genom dilakukan secara berurutan sebagaiberikut.

Ekstraksi DNA Genom

Protokol yang digunakan merupakan prosedur ekstraksiberbasis CTAB yang dikembangkan oleh Doyle dan Doyle(1987) dan dimodifikasi oleh Santoso (2005), serta dilaksa-nakan secara preparasi mini. Contoh daun dikeluarkan darifreezer dan ditimbang 100 mg tanpa tulang daun lalu diletak-kan dalam mortar pestel dan ditambah 0,5 ml bufer ekstraksiCTAB (CTAB: 4,1 g NaCl, 10 g CTAB, 0,5 M EDTA pH 8,0,

Dwi Wahyuni Ardiana: Isolasi DNA genom pepaya dan jeruk menggunakan bufer CTAB 13

18,61 g disodium etilendiamin tetra asetat 2H2O, 1M Tris-HClpH 8,0, 12,11 g Trisma Base, 1,40 M NaCl, 29,22 g sodiumkhlorida, 2% PVP dan 0,20% ß-mercaptoetanol). Lima belasmenit sebelum proses ekstraksi, bufer dipanaskan dalamwaterbath dengan suhu 65°C, lalu contoh daun yang telahditambah bufer ekstraksi CTAB dan PVP 0,01 g digerushingga menjadi bubur halus sambil ditambah bufer lagisampai 1 ml. Selanjutnya bubur halus dipindahkan ke dalamtabung sentrifus ukuran 1,5 ml.

Proses lisis dinding sel dilakukan dengan menginkubasitabung berisi contoh ke dalam waterbath suhu 65°C selama30-90 menit atau sampai fase padat terpisah dari fase cair.

Selanjutnya, tabung diangkat dari waterbath dan dibiarkanbeberapa menit sampai suhu contoh menurun.

Tabung berisi contoh yang telah diinkubasi lalu di-tambah khloroform: isoamil-alkohol (CIA 24:1) 500 µl. Tabunglalu dikocok menggunakan vortex mixer sampai contoh danCIA 24:1 tercampur, kemudian disentrifus pada kecepatan12.000 rpm selama 10 menit. Bagian atas contoh yang berupacairan jernih (supernatan) dipindahkan ke dalam tabung barudan ditambahkan 600-800 µl CIA 24:1, lalu disentrifus lagipada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Langkah inidiulang sampai tidak ada lapisan putih antara supernatan danCIA 24:1.

Dimasukkan dalam plastik klip berisi bufer CTAB 2-3 ml,simpan pada suhu -20oC

Proses ekstraksi dengan bufer CTAB

Inkubasi dengan waterbath suhu 65oC

Inkubasi suhu -20°C ± 30 menit

Vortex mixer

Sentrifus 12.000 rpm 10 menit

Sentrifus 12.000 rpm 10 menit

Sentrifus 12.000 rpm 10 menit

Dikeringanginkan

Gambar 1. Skema proses isolasi DNA genom daun pepaya dan jeruk dengan menggunakan bufer CTAB,Balitbu Tropika, Solok, 2006

Dicuci dengan alkohol 70% Dikeringanginkan

Proses ini diulang ± limakali sampai tidak terdapat

lapisan putih antarasupernatan dan CIA

Supernatan + 500 µl isopropanol

Bufer TE 200 µl + sodium asetat 3MPH +etanol absolut 500 µl

Pelet + bufer TE 50 µl

Pengambilan contoh daun

Hasil ekstraksi bubur halus

CIA 24:1

Pelet

CIA 24:1

Proses lisis

Pelet

Supernatan

Pelet

Contoh daun

Pelet Supernatan

t

t

t

t

t

t t

t t

t

t

t

t t

tt

14 Dwi Wahyuni Ardiana: Isolasi DNA genom pepaya dan jeruk menggunakan bufer CTAB

Supernatan yang sudah bersih dipindahkan ke tabungbaru, kemudian ditambah 500 µl isopropanol dingin. Selanjut-nya tabung dibolak-balik secara hati-hati untuk melarutkansupernatan dan isopropanol. Tabung contoh lalu disimpanpada suhu -20°C minimal 30 menit kemudian disentrifus padakecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Fase cair lalu di-tumpahkan dengan cara meletakkan tabung dengan posisiterbalik di atas kertas tisu sampai pelet DNA mengering.Proses ini dilakukan dengan hati-hati dan dipastikan peletDNA masih melekat pada dasar tabung.

Setelah cukup kering, pelet DNA dilarutkan dengan me-nambahkan 200 µl bufer TE (1M Tris-HCl pH 8,0, 12,11 gTrisma Base, 0,50 M EDTA pH 8,0, 18,61 g disodium etilendiamin tetra asetat 2H2O). Larutan DNA lalu ditambah 20 µlsodium asetat 3 M pH 5,2 dan 500 µl etanol absolut, kemudiandilarutkan dengan cara membolak-balik tabung secaraperlahan-lahan. Larutan contoh kemudian disimpan padasuhu -20°C minimal 30 menit, lalu disentrifus pada kecepatan12.000 rpm selama 10 menit. Fase cair ditumpahkan dengancara meletakkan tabung secara terbalik di atas kertas tisusampai pelet DNA pada dasar tabung mengering. Setelahcukup kering, DNA dicuci dengan alkohol 70% dengan caramenuangkan 200 µl alkohol ke dalam tabung lalu ditumpahkandengan hati-hati. DNA dikeringkan kembali dengan meletak-kan tabung terbalik di atas kertas tisu. Setelah cukup kering,DNA dilarutkan dengan 50 µl bufer TE. Jika tidak langsungdigunakan, DNA disimpan pada suhu -20°C.

Kuantifikasi DNA Menggunakan Elektroforesis

DNA dikuantifikasi menggunakan elektroforesis padaagarose gel 0,8%. Prosesnya, 2µl stok DNA dicampur dengan8 µl air suling dan 2µl loading dye. Campuran contoh laludimasukkan ke dalam sumuran gel dalam kamar elektroforesisyang telah diisi bufer TBE 0,5x (Trisma Base, boric acid, dan0,5 M EDTA pH 8,0). Sebagai pembanding digunakan λ DNAladder yang diletakkan pada sumur pertama kemudianelektroforesis dijalankan pada tegangan 50 volts sampai DNAbermigrasi/bergerak lebih kurang 1 cm di atas batas bawah.

Pewarnaan dan Visualisasi Hasil

Setelah elektroforesis, gel direndam dalam larutan stainingetidium bromida (0,5 µl/ml) selama 10 menit, lalu direndamdalam air suling selama 20 menit. Setelah itu gel siap untukdiambil fotonya dengan menggunakan gel doc. KuantitasDNA ditentukan dengan membandingkan ketebalan pitaDNA contoh dengan pita standar λ DNA ladder.

Prosedur RAPD-PCR

Amplifikasi DNA Genom

Tabung PCR berisi PuRe TaqTM Ready To-GoTM berbentukbutiran (Kit) (GE Healthcare) dilarutkan dengan ddH2O laluditambahkan 2,5 µl RAPD primer dan 1 µl DNA contohsehingga total larutan untuk tiap reaksi menjadi 25 µl.Masing-masing tabung berisi contoh diamplifikasi denganpemanasan pendahuluan pada 95°C selama 5 menit sebanyaksatu siklus diikuti 45 siklus yang terdiri atas pemanasanuntuk denaturasi pada 95°C selama 1 menit, anealing padasuhu 36°C selama 1 menit, pemanjangan pada suhu 72°Cselama 2 menit, dan pada siklus terakhir ditambah waktupemanjangan pada suhu 72 °C selama 10 menit.

Gel Elektroforesis

Setelah proses PCR, campuran contoh dan loading dyedengan perbandingan 3:1 dimasukkan dalam sumuran gel1,2% dalam kamar elektroforesis yang sudah diisi bufer TBE0,5x, diisikan satu sumuran pertama dengan 1 Kb DNA ladder.Setelah itu elektroforesis dijalankan dengan daya 50 voltssampai penanda loading dye berada sekitar 1 cm di atas batasgel bagian bawah.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Ekstraksi DNA menggunakan nitrogen cair untuk melisisdinding sel dapat mengeluarkan semua isi sel yang kemudianditampung dalam larutan penyangga yang berisi Tris HCl danEDTA. Dinding sel juga dapat dipecahkan dengan peng-gerusan menggunakan bufer ekstraksi diikuti dengan peng-hangatan pada suhu 65°C. Detergen seperti sodium dodecilsulfat (SDS), sarkosil, dan CTAB dapat digunakan untukproses lisis (Subandiyah 2006).

Penggunaan bufer CTAB sebagai pengganti nitrogencair untuk ekstraksi dapat menghasilkan produk DNA yangberkualitas yang ditunjukkan oleh pita DNA genom (Gambar2). Dengan demikian, bufer CTAB dapat digunakan untukmengisolasi DNA pada tanaman jeruk dan pepaya. Produkekstraksi DNA yang berkualitas baik ditunjukkan dengan pitaDNA yang terlihat tebal dan bersih bila divisualisasi meng-gunakan image gel elektroforesis.

Setelah proses elektroforesis DNA genom dan dihasil-kan pita DNA yang berkualitas dilanjutkan proses PCR, yaitumetode in vitro yang secara cepat dapat melipatgandakansekuen-sekuen DNA target yang ada di dalam DNA sumber.

Dwi Wahyuni Ardiana: Isolasi DNA genom pepaya dan jeruk menggunakan bufer CTAB 15

Produk-produk PCR akan menjadi DNA awal. Sekitar 105 kopidari sekuen DNA target dengan mudah dapat divisualisasikansebagai pita diskret dengan ukuran spesifik ketika diseparasipada elektroforesis gel agarose (Tridjatmiko 2006).

Teknik Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)yaitu teknik pengujian polimorfisme DNA berdasarkan padaamplifikasi dari segmen-segmen DNA acak yang mengguna-kan primer tunggal yang sekuen nukleotidanya ditentukansecara acak. Primer tunggal ini biasanya berukuran 10 basa.PCR dilakukan pada suhu anealing yang rendah yang me-mungkinkan primer menempel pada beberapa lokus padaDNA. Aturan sederhana untuk primer adalah terdiri atas 18-28 susunan basa dengan persentase G+C 50-60% (Tabel 1,Subandiyah 2006).

Penggunaan primer RAPD1 dan RAPD6 dengan kan-dungan G+C 70% menghasilkan pita DNA yang baik. Hal ini

karena suhu pada saat denaturasi sudah sesuai, yaitu 95°Cselama 1 menit. Menurut Subandiyah (2006), PCR seringgagal karena proses denaturasi yang tidak sempurna. Suhuyang diprogramkan biasanya 95°C selama 30 detik atau 97°Cselama 15 detik. Namun untuk DNA yang mengandung G+Ctinggi, suhu perlu dinaikkan atau waktu denaturasi diper-panjang tetapi tidak terlalu lama dan suhunya tidak terlalutinggi karena akan merusak enzim Taq D-pol yang umumnyamempunyai waktu paruh 40 menit pada 95°C.

Pola pita DNA tanaman jeruk yang dihasilkan dariekstraksi menggunakan nitrogen cair disajikan pada Gambar3, sedangkan hasil ekstraksi DNA tanaman jeruk dan pepayadengan menggunakan bufer yang berisi 2% CTAB, 1 M NaCl,1% β-mercaptoetanol, dan 1% PVP 10 masing-masing di-sajikan pada Gambar 4 dan 5. Bila ketiga gambar tersebutdibandingkan maka pola pita DNA yang dihasilkan memilikiketebalan yang sama. Dengan demikian, bufer CTAB cukupmemenuhi syarat untuk digunakan dalam ekstraksi DNA dariGambar 2. Contoh DNA genom daun jeruk dan pepaya hasil isolasi

tanpa nitrogen cair; 1 = jeruk jemari taji, 2 = jeruk krifta,3 = pepaya dampit, dan 4 = pepaya eksotika; L = λλλλλ DNAladder

Gambar 4 . Pola pita DNA tanaman jeruk hasil isolasi tanpa meng-gunakan nitrogen cair; lajur no (1) jeruk jemari taji, (2)jeruk krifta dengan primer (1) RAPD 1, (2) RAPD 2, (3) RAPD3, (4) RAPD 4, (5) RAPD 5, dan (6) RAPD 6; Balitbu Tropika,Solok, 2006

Gambar 3 . Pola pita produk DNA tanaman jeruk hasil ekstraksi meng-gunakan nitrogen cair; (1) keprok kacang, (2) keprokbatu 55, (3) keprok singkarak, (4) keprok tawangmangu,Balitbu Tropika, Solok, 2006

Tabel 1. Kode primer, susunan basa, dan kandungan GC pada primer

Kode primer Susunan basa primerG + C(%)

RAPD1 GGTGCGGGAA 70RAPD2 GTTTCGCTCC 60RAPD3 GTAGACCCGT 60RAPD4 AAGAGCCCGT 60RAPD5 AACGCGCAAC 60RAPD6 CCCGTCAGCA 70OPW19 CAAAGCGCTC 60

16 Dwi Wahyuni Ardiana: Isolasi DNA genom pepaya dan jeruk menggunakan bufer CTAB

tanaman yang mengandung karbohidrat dan fenol tinggikarena tidak merusak DNA. Bufer CTAB dengan kandungangaram yang tinggi dapat memisahkan polisakarida daridinding sel (Porebski et al. 1997; Surzycki 2000), sedangkanPVP dapat mengurangi broning akibat kandungan fenol padadaun muda (Porebski et al. 1997).

KESIMPULAN DAN SARAN

Pemisahan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dankarbohidrat dilakukan melalui ekstraksi. Penggunaan nitro-gen cair lebih memudahkan proses ekstraksi, namun ekstrak-si dengan bufer CTAB ditambah 0,2% β-mercaptoetanol danPVP mampu mengurangi broning. Ekstraksi dengan bufer initidak memerlukan nitrogen cair dan menghasilkan DNAgenom yang cukup baik. Ekstraksi tanpa nitrogen cair lebihefisien, terutama bagi laboratorium yang sulit mendapatkannitrogen cair.

UCAPAN TERIMA KASIH

Penulis menyampaikan terima kasih kepada Bapak JarotSantoso, SP, MSc., Bapak Makful, SP, MSi., dan Ibu Ir. ElinaMansyah, MP, yang telah membimbing penulis dalamkegiatan molekuler, juga pengurus Laboratorium PengujianMutu Fisik Benih Tanaman Buah, Balai Penelitian Tanaman

Gambar 5. Pola pita DNA tanaman pepaya hasil isolasi tanpamenggunakan nitrogen cair; lajur no (1) pepaya dampit,(2) pepaya eksotika dengan primer (1) RAPD 1, (2) RAPD 2,(3) RAPD 3, (4) RAPD 4, (5) RAPD 5, dan (6) RAPD 6; BalitbuTropika, Solok, 2006

Buah Tropika yang telah memberikan kesempatan untukmelaksanakan kegiatan ini.

DAFTAR PUSTAKA

Doyle, J.J. and J.L. Doyle. 1987. A rapid DNA isolation procedurefor small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem. Bull. 19:11-15.

Jose, J. and R. Usha. 2000. Extraction of geminiviral DNA from ahighly mucilaginous plant (Abelmoschus esculentus). PlantMol. Biol. Rep. 18: 349-355.

Karp, A., S. Kresovich, K.V. Bhat, W.G. Ayad, and T. Hodgkin. 1997.Molecular Tool in Plant Genetic Resources Conservation: Aguide to the technologies. IPGRI Technical Bulletin no. 2.

Lamadji, S. 1998. Pemberdayaan sifat morfologi untuk analisiskekerabatan plasma nutfah tebu. Bulletin P3GI 148: 17-31.

Lumaret, R., H. Michaud, J.P. Ripoll, and L. Toumi. 1998.Chloroplast DNA extraction procedure for species high inphenolics and polysaccharides. p. 15-17. In A. Karp, P.G.Isaac, and D.S. Ingram (Eds.). Molecular Tool for ScreeningBiodiversity. Chapman and Hall, London.

Nicholl, D.S.T. 1993. An Introduction to Genetic Engineering.Department of Biological Science, University of Praisly.

Porebski, S., L.G. Baily, and B.R. Baum. 1997. Modification of aCTAB DNA extraction protocol for plants containing highpolysaccharide and polyphenol components. Plant Mol. Biol.Rep. 15: 8-15.

Santoso, P.J., G.B. Saleh, N.M. Saleh, and S. Napis. 2003.Preservation of fresh leaf samples from long distance fieldcollection for DNA extraction. p. 97-99. In M.K. Thong, M.Y.Fong, M.E. Phipps, U.R. Kuppusamy, M. Ameen, M.Zulqarnain, K.A.R. Suzainur, and M.N. Suzita (Eds.).Proceedings of the 5th National Coggress on Genetics. FromPeas to Chips: The Globalisation of Genetics, Kuala Lumpur,Malaysia, 25-27 March 2003.

Santoso, P.J. 2005. Modified CTAB-based DNA isolationprocedure for fruit crops. Jurnal Stigma XIV(1): 1-4.

Subandiyah, S. 2006. Polymerase Chain Reaction untuk Deteksiatau Identifikasi Patogen Tumbuhan. Beberapa MetodeEkstraksi DNA. Pelatihan dan Workshop Identifikasi DNAdengan Aplikasi PCR. Malang. hlm. 43-50.

Surzycki, S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology.Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York.

Tridjatmiko, K.R. 2006. Penggunaan Metode PCR untuk DeteksiCepat Keragaman DNA. Pelatihan dan Workshop IdentifikasiDNA dengan Aplikasi PCR. Malang. hlm. 22-25.