BEYİN VE OMURİLİK SIVISI(BOS)

MİKROSKOBİK OLARAK İNCELENMESİ Menenjitlerin ve menengoansefalitlerin tanısı

ancak tanısı ancak beyin omurilik sıvısının (BOS) incelenmesi ile olanaklıdır. Bu incelemede makroskobik inceleme, hücre sayısı, hücrelerin nitelikleri ve biyokimyasal incelemeler söz konusudur. Bu nedenle bir mikrobiyoloji laboratuvarında biyokimyasal incelemelerin dışındaki tüm incelemelerin yapılabilmesi gereklidir. Hatta biyokimya laboratuvarına santrifüjlenerek de gönderilse BOS enfektif bir materyal olduğundan biyokimyasal incelemelerin basit yöntemlerle klinik mikrobiyoloji laboratuvarında yapılması daha uygun olur.

BOS un makroskobik görünümü ve mm3 deki hücre sayısına göre menenjitler iki gruba ayrılır. Birinci grupta irinli menenjitler yer alır. Burada ivegen bakteryel menenjitlerin tümüne yakın bir grubu bulunur. İkinci grupta irinsiz menenjitler bulunur. Burada da kronik menenjitler diye tanımlanabilen bir kısım mantar ve bakteri menenjitleri, birkaç ivegen bakteri menenjitleri ve ivegen viral menenjitler yer alır.

BEYİN OMURİLİK SIVISININ ELDE EDİLMESİ

BOS bel ponksiyonu ya da özel durumlarda oksipital ponksiyon ile elde edilir.

Bel ponksiyonu önemli ve dikkatle yapılması gereken bir girişim olup ancak yetkili hekimlerce yapılır. En önemli nokta girişimin en üst düzeyde asepsi ve sterilizasyona uyularak yapılmasıdır. BOS içerisine kaçırılarak az sayıdaki flora bakterileri bile menenjit oluşturmaya ya da mevcut menenjite yeni enfeksiyon etkenlerinin katılmasına neden olur.

Gerekli şeyler:

1) Kuru sıcak havada, yoksa 30–40 dakikada kaynatmak ve hemen kullanmak koşulu ile sterilize edilmiş bel ponksiyonu iğnesi,

2) Birkaç adet steri deney tüpü

3) %70 lik alkol

4) % 2 lik iyot tentürü

5) Yeteri kadar steril tampon (gazlı bez ya da pamuktan yapılmış).

Yapılacak şey:

1) Hastanın duruş biçimi: Bel ponksiyonu hastaya oturtarak ya da yatırarak verilen uygun duruşta yapılır. Oturtma duruşunda hastanın ayakları karyoladan sarkıtılarak oturtulur. Hasta ajite olabileceği ya da bilinci yerinde olmayabileceği için bir kişi hastanın önüne geçerek başını fleksiyon durumunda koltuğunun altına alır ve kolları ile birlikte bu şekilde tutarak vertebranın hiper fleksiyon durumunda bulunmasını sağlar. Bu şekilde vertebra aralıkları açılır. Oturtarak ponksiyon daha kolaydır. Ancak fazla sıvı çekilince beyinciğin aniden pons üzerine düşerek nadiren de olsa ölüme yol açabilme tehlikesi vardır.

Yatma duruşunda hasta sağ ya da sol yanına doğru yatırılır. Uylukları karnına çenesi de göğsüne dayanacak biçimde aşırı fleksiyon durumuna getirilir. Hastanın sırtı, karyolanın kenarına kadar yanaştırılır. Bir yardımcı bir eliyle ensesinden, diğer eli ile diz altından tutarak hastanın bu duruşunu bozmaması sağlanır.

2)Derinin temizliği: hastanın derisi çok kirli ise önce deri, deterjanlı su ile silinir. Kurulandıktan sonra % 70 lik alkole bandırılmış bir gazlı bez tamponu ile genişçe bir alan iyice silinerek temizlenir. Arkasından %2 lik iyot tentürü ile dezenfekte edilir ve kuruması beklenir.

3)Doktorun el temizliği: Bel ponksiyonu yapacak kimse ellerini cerrahi girişimlerde yapıldığı gibi temizlemek ve antisepsi yapmak zorundadır. Eller önce sabun ile fırçalanarak yıkanır. % 70lik alkol ile ıslatılır ve üç dakika bekletilir. Hastanın derisine temas edecek olan parmak uçları %2 lik iyot tentürü ile silinir ve kuruması beklenir. Bundan sonra steril lastik eldiven kullanmak hasta ve hekim için daha güvencelidir.

4) Ponksiyon işlemi: Bel ponksiyonu en sık 4–5 nci veya 3–4 ncü vertebra aralıklarından yapılır. Eğer blokaj (tıkanıklık) var ve bu aralıklardan sıvı alınamıyorsa daha dikkatli davranarak daha yukarı aralıklarda da yapılabilir. İğne orta çizgi üzerinde, spinal çıkıntılar arasında deri yüzeyine tam dik olarak tutulur. Ani bir dürtme ile deri delinir. Bir an durularak iğneye yön verilir. İğne, hafifçe ucu hastanın başına, doğru yönelecek biçimde ve deri ile bir açı oluşturacak biçimde yavaşça eğdirilir. Yavaş yavaş ileri itilir. Eğer iğnenin ucu kemiğe rastlarsa biraz geri çekilir ve biraz daha eğim verilerek ileri itilir. Girişimi yapan kimse duramater in delindiğini hisseder. Bu durumda iğnenin iç teli çıkarılıp altına bir tüp tutularak çocuklarda 5 ml yetişkinlerde 8- 10 ml BOS alınır. Eğer BOS gelmezse iğne geri çekilerek tekrar aynı işlemler denenir.

5)BOS un basıncı ve görünümü: Menenjitlerde BOS basıncı yükselir. Normalde lomber ponksiyonun mandreni çekildiğinde saniyede 2–3 damla olarak damlayan BOS, menenjitlerde çok sık hatta fışkırarak akar.

BOS normalde duru ve kaya suyu görünümündedir. Menenjitlerde hastalığın tipine göre çeşitli derecelerde bulanık, buzlu ya da duru görünümünde olabilir. Ancak BOS un kanlı görünümünün önemi vardır. Kanlı görünüm iki nedene bağlı olabilir. Birincisi; iğnenin travmatizasyonu sonucunda oluşan kanama ikincisi kafa içi travmasına bağlı olarak BOS kanlı görülebilir. Bunları ayırt etmek için BOS her birisine 2–3 er ml olmak üzere arka arkaya üç tüpe alınır. İlk tüp kanlı görünümde olup diğer tüplerde renk gittikçe açılıyorsa olay travmatiktir. Her üç tüpte aynı derecede kanlı görünüm varsa olay kafa içi kanamasına bağlıdır.

Tek tüpe alınmış olan kanlı görünümdeki BOS bir kenarda dik durumda bırakıldığında şekilli elementler dibe çökerken pıhtılaşır ve üstteki sıvının rengi açılıyorsa kanama travmatiktir. Dibe çöken şekilli elemanlar pıhtılaşmaz ve üstteki renk de açılmıyorsa kafa içi kanamasına bağlıdır.

BOS un görünümü berrak ancak ksantokromik (sarımsı görünümde) olabilir. Bu durum eski bir kafa içi kanamasından olabileceği gibi daha yukarı ki bölgelerde BOS un sirkülâsyonunu (dolaşım) engelleyen bir tıkanıklık ve bunun sonucunda alttaki bölmeye plazma transüdasyonu söz konusu olabilir. Bu nitelikteki BOS un içerdiği protein miktarı çok artar ve durmakla kendiliğinden koagülasyon görülür.

6)Alınacak miktar: Erişkinlerde basınç derecesine göre 5- 15 ml BOS alınmalıdır. BOS 2- 3 tüpe bölünerek alınmalıdır. Bunlarda ilk tüpler mikrobiyolojik ve biyokimyasal deneyler için kullanılır. Hücre sayımı 2 veya 3 ncü tüplerden sayılmalıdır. Bu tüplerde travma sonucu olabilecek hücre karışması yoktur. Bazı durumlarda, örneğin tüberküloz ve kriptokok menenjitlerinde etkenlerin elde edilmesi için en az 10 ml BOS un santrifüj edilmesi gerektiğinden BOS bu miktarlarda alınmalıdır. Çocuklardan 4- 5 ml BOS alınabilir.

7)Laboratuvara gönderme: BOS alınır alınmaz hemen elden laboratuvara gönderilmelidir. Virolojik incelemelerin dışında BOS kesinlikle buzdolabına konmaz. Bekletilecekse kısa bir süre için oda derecesinde veya etüvde tutulur ya da -70ºC de dondurularak saklanır.

BOS UN İNCELENMESİ

▪Makroskobik Görünüm

Normalde berrak kaya suyu görünümünde olan BOS, menenjitlerde değişik görünümler gösterebilir. İrinsiz menenjitlerde görünüm normaldeki gibi veya hafif buzlu bir görünümde olur. Tüberküloz menenjitinde duru olan BOS, bir süre bekletilecek olursa tüp dibinde örümcek ağı görünümünde bir fibrin ağı oluşur. İrinli menenjitlerde BOS, içerdiği hücre sayısı ile orantılı olarak çeşitli derecelerde bulanık görünümdedir.

▪Hücre Sayım ve Türlerin Saptanması

Normalde 1 mm3 BOS da erişkinlerde 0- 10, bebeklerde 0- 20 hücre bulunur. Bunların hepsi mononükleer hücrelerdir. Menenjitlerde hücre sayısı artar. İrinsiz menenjitlerde 500- 1000/mm3 lenfositik koriyomenenjitte 1000 bazen 2000/mm3 ve daha çok, irinli menenjitlerde 1000/mm3 den fazla fakat bazen 500/mm3 e kadar az, tüberküloz menenjitinde 25- 100/mm3 nadiren daha çok sayıda hücre bulunabilir.

—Hücre Sayımı

BOS da hücre sayımı, alınan 3 veya 4 ncü tüpten yapılmalıdır. Eğer BOS bir süre beklemiş ise eller arasında yuvarlanarak ve hafifçe eğip doğrularak karıştırılmalıdır. En iyi hücre sayımı Nageotte sayma kamarası veya benzerleri ile yapılır. Nageotte sayma kamarası, 10*10 mm lik bir alanın 40 adet dikdörtgen bölmelere bölünmesi ve üzerine lamel kapatıldığında arada 0,5 mm lik bir yükseklik kalacak şekilde hazırlanmış bir kamaradır. Her bölüntüye isabet eden hacim miktarı 1,25 mm3 dür.

Sayarken 4 bölüntüye düşen hücreler sayılır ve toplamı 5 e bölünürse 1 mm3 BOS daki hücre sayısı bulunur. Hücre sayımı için sayma kamarasının üzerine bir lamel kapatılıp bastırılarak kenarlarının setlere yapışması sağlanır. İnce bir pipet ile alınan BOS yavaşça lam lamel arasından sayma kamarasına bırakılır. Birkaç dakika hücrelerin dibe çökmesi beklenir

Sonra 300- 400 kez büyüten mikroskop ile 4 bölmedeki hücreler sayılır. Sayarken çizgilerin üzerine düşen hücrelerden yalnız bir yandaki ve yalnız üstteki ya da yalnız alttaki çizgilere düşenler sayılır. BOS da bulunabilecek az sayıdaki eritrositlerin erimesi için kamaraya konulmadan önce bir saat camına 10 damla BOS, metil viyole ile renklendirilmiş bir damla %5 lik asetik asit eriyiği ile karıştırılabilir. Bu durumda sayımla bulunan sayı 1,1 ile çarpılmalıdır.

Daha pratik ve ancak daha az duyarlı bir hücre sayım yöntemi de kan hücreleri sayma kamarası ile yapılan sayımdır. BOS taki eritrositlerin de ortadan kaldırılması amacı ile bir lökosit sayma pipetinin 1 bölüntüsüne kadar lökosit sayma eriyiği (L–6), 11 bölüntüsüne kadar da BOS çekilir. Kan sayma kamarasına kandaki lökositlerin sayıldığı biçimde sayılır. Sonuç 11 ile çarpılırsa 1 mm3 BOS taki hücre sayısı bulunur.

—Hücrelerin cinsleri

Normal BOS taki hücreler Mononükleer ( lenfosit) hücrelerdir. İvegen irinli menenjitlerde hücrelerin büyük çoğunluğu parçalı çekirdekli lökositlerdir. İrinsiz menenjitlerde ve lenfositik koriyomenenjitte hücrelerin çoğunluğunu lenfositler oluşturur. Bir irinsiz menenjit olan tüberküloz menenjitinde ilk günlerde polimorf nüveli lökositler fakat hemen sonra lenfositler sahneye hakim olur. Hücrelerin incelenmesi, varsa bakterilerin morfolojilerinin incelenmesi ile birlikte yapılır.

▪BOS un Bakteriyolojik İncelenmesi

—Mikroskobik inceleme

1)Steril bir santrifüj tüpüne bir miktar BOS konur ve sterilliğinin bozulmamasına dikkat edilerek 1500*g de (1,52) 15 dakika santrifüjlenir. (M. tuberculosis ve Cryptococcus için uygulanmaz).

2)Üstteki sıvı biyokimyasal ve Serolojik araştırmalar için ayrı steril bir tüpe aktarılır. Tüp dibine 0,5 ml BOS bırakılır. Tüpteki çökelti tüpün, bir elin iki parmağı arasında tutulması ve diğer elin işaret parmağı ile tüp dibine vurulması ile ya da varsa vorteks aletinde resüspanse edilir.

3)İnce bir pastör pipeti ile steril veya alkol ile silinmiş ve kurutulmuş iki üç lamın üzerine küçük birer damla damlatılır. Damla havada kuruduktan sonra üzerine bir damla daha damlatılır ve oda kurutulur.

4)Preparatlardan birisi alkol ile iki dakika tespit edilip Giemsa ile (4.81) boyanır. Bu preparatta özellikle hücreler incelenerek polimorf nüveli (parçalı çekirdekli) lökositler ile mononükleerlerin durumu ortaya çıkartılacaktır.

5)Preparatlardan biri diğeri gram boyanarak bakterilerin görünüm ve boyanma özellikleri incelenir.

6)İstenirse bir üçüncü preparat akridin oranj (A–1) ile boyanıp bir floresan mikroskopta 400 büyültme ile incelenir. Bu preparatta az sayıda olabilecek olan bakteriler floresans verdiklerinden görünür hale gelirler. İstenirse aynı preparat gram ya da başka bir boya ile boyanarak immersiyonla incelenebilir.

— Tüberküloz menenjiti söz konusu olduğunda;

10 ml BOS, 30 dakika, 2000*g de (1,52) santrifüjlenir. M. tuberculosis in yoğunluğu düşük olduğundan ancak bu denli yüksek santrifüjleme ile çöktürülebilir. Tüp dibindeki çözeltiden yöntemine uygun olarak yapılan preparatlar asidorezistan boyalardan birisi (4,51) ile boyanarak bakılır. Preparatların auramin rhodamin (4,543) yöntemleri ile boyanarak floresans mikroskobunda incelemeleri ile daha başarılı sonuçlar alınabilir.

Bu son boyama ile incelenen preparatların üzerindeki immersiyon yağı ksilol ile silindikten sonra tekrar asidorezistan boyama yöntemleri ile boyanabilirler.

Bazı araştırmacılar BOS un yoğunluğunu düşünerek Mycobacteriumların daha kolay çökmelerini sağlamak için onu yarı yarıya steril saf su ile sulandırıp santrifüjlerler. Bekletilen BOS da örümcek ağı oluşturmuş ise bu ağın alınıp yapılan preparatların boyanması ile M. tuberculosis in görülmesi olasıdır.

— Cryptococcus kuşkusunda;

Çini mürekkebi ile bir vital boyama yapılıp incelenir. Santrifüj çökeltisinden bir damla, temiz bir lam üzerine konur. Üzerine küçük bir damla iyi cins çini mürekkebi damlatılır ve küçük bir lamel örtülür. Preparat 400* büyültme ile incelenir. C. neoformans, geniş kapsül içinde, yuvarlak veya oval, maya hücreleri olarak görünürler. Blastospor yapmış bir hücrenin görülmesi tanıtıcı değer taşır. Kullanılan çini mürekkebinin kontamine olmamış olmasına dikkat etmek gerekir. Bunu önlemek için laboratuvarda kullanılacak olan bu tür mürekkepler ilk açıldıklarında içlerine 0,05 ml mertiolat damlatmak uygun olur.

—Kapsül şişme reaksiyonu

S. pneumoniae, H. İnfluenzae, N. meningitidis ve K. pneumoniae söz konusu olduğunda BOS un santrifüj çökeltisinden kapsül şişme reaksiyonu yapılarak bu bakteriler saptanabilir.