Borang

Penghitungan dan Enumerasi Bakteri pada Suatu Bahan

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Dalam suatu media, mikrobia dapat melakukan pertumbuhan. Pertumbuhan mikrobia

dibagi menjadi dua, yaitu : pertumbuhan sel dan pertumbuhan kelompok. Pertumbuhan sel

adalah penambahan volume sel serta bagian-bagian sel lainnya, dapat juga diartikan

penambahan kuantitas isi dan kandungan dalam sel (Waluyo, 2004). Sedangkan

pertumbuhan populasi merupakan akibat pertumbuhan individu.

Jumlah pertumbuhan mikrobia merupakan indikasi bahwa media tersebut memiliki

nutrisi yang cukup dan dapat ditentukan dengan berbagai cara, tergantung pada bahan dan

jenis mikrobia yang ditentukan. Jumlah perhitungan juga dapat diestimasi dari jumlah

bakteri yang terdapat dalam medium biakan murni suatu bakteri (Wistreich and Lechtman,

1988). Penghitungan jumlah bakteri dalam suatu bahan dapat dilakukan dengan dua cara

yaitu secara langsung dan tidak langsung (Prescott et al, 1999).

1.Perhitungan secara langsung

Perhitungan secara langsung dipakai untuk menentukan jumlah mikrobia keseluruhan

baik bakteri yang mati maupun yang hidup. Pada perhitungan secara langsung mikrobia

dapat di hitung menggunakan counting chamber, menggunakan filter membran, dan di

lakukan pengecatan dan pengamatan di bawah mikroskop. Keuntungannya menggunakan

metode penghitungan langsung di bawah mikroskop adalah kita dapat menentukan dan

menghitung langsung jumlah bakteri yang terdapat pada kaca preparat (Atlas and Bartha,

1998). Tetapi metode ini juga memiliki beberapa kelemahan antara lain :

1. Sel-sel yang telah mati tidak dapat dibedakan dari sel-sel hidup sehingga keduanya

akan terhitung.

2. Sel-sel yang berukuran sangat kecil sukar dilihat sehingga kadang tidak terhitung.

3. Dalam setiap bidang pandang tidak selalu ada sel yang dapat dihitung sehingga jumlah

sel di dalam suspensi harus cukup tinggi.

4. Tidak dapat digunakan untuk menghitung sel jasad renik di dalam bahan pangan yang

mengandung debris atau ekstrak makanan (Fardiaz, 1992).

1

BORANGNo. Dokumen FO-UGM-BI-07-

13Berlaku sejak 05 april 2013

LAPORAN PRAKTIKUM Revisi 01LABORATORIUM MIKROBIOLOGI Halaman 1 dari 11

Pengamatan secara langsung dengan mikroskop membutuhkan pengecatan dengan cat

yang sesuai lalu dihitung jumlah rata-rata sel mikrobia tiap bidang pandang pada mikrioskop

dan menggunakan hand counter untuk membantu perhitungan mikrobia (Pelczar, 1957). Cat

yang digunakan adalah safranin, yaitu pengecatan sederhana yang hanya menggunakan satu

macam cat. Safranin digunakan untuk mengecat bakteri agar tampak kontras morfologinya,

sehingga bakteri dapat diukur satu persatu.

Proses perhitungan ini dilakukan dengan mengukur garis tengah bidang pandang yang

ditentukan dengan nonius pada mikroskop terlebih dahulu. Setelah itu baru menghitung

jumlah sel rata-rata pada tiap bidang pandang mikroskop. Pada praktikum ini, ditentukan

luas bidang pandang dengan menghitung diameternya terlebih dahulu. Kemudian jumlah sel

bakteri per ml bahan dihitung dengan rumus:

Jumlah bakteri /0,1 ml = 0,1 x faktor pengencer x 400/ luas bidang pandang x (Σ rata-

rata bakteri/bid.pandang)

Jumlah bakteri/ ml bahan = (Σ bakteri/0,1 ml) x 10

Penghitungan secara filter membrane dilakukan dengan menyaring susupensi bahan

mikrobia. Kemudian dilakuan penghitungan terhadap jumlah sel rata-rata tiap kesatuan luas

pada filter membrane. Dengan melakukan perhitungan tersebut dapat diketahui jumlah sel

per milliliter (Soetarto, dkk., 2008).

Penghitungan dengan metode counting chamber dilakukan dengan cara menempatkan

cairan yang mengandung bakteri yang akan dihitung pada bilik tabung dan sebuah gelas

penutup digunakan untuk menutup dan menyegel cairan tersebut. Bakteri pada setiap persegi

kemudian dihitung dengan menggunakan mikroskop berdasarkan bidang pandangnya.

Dengan cara ini diperoleh nilai rata-rata sel per persegi. Metode ini mempunyai kelebihan

yaitu dapat memberikan total jumlah bakteri yang hadir namun karena bakteri yang hidup

ataupun yang mati tampak serupa maka jumlah sel hidup tidak dapat di lihat jumlahnya.

Metode ini tidak cocok untuk menghitung bakteri pada padatan (misalnya tanah ) atau cairan

yang mengandung padatan dengan menggunakan mikroskop dalam pengukurannnya (sarles

et al, 1956). Penghitungan secara counting chamber memerlukan alat yaitu : Hemositometer

dan Petroff House Chamber. Prinsip dari kedua alat tersebut adalah sama, yaitu dilakukan

penghitungan terhadap jumlah sel pada kotak-kotak besar. Kemudian jumlah sel tersebut

2




dikalikan dengan faktor pengenceran, lalu dikalikan volume sel terkecil. Hasil yang

didapatkan merupakan jumlah sel per milliliter (Frobisher, 1962).

2. Perhitungan secara tidak langsung

Perhitungan ini dipakai untuk menentukan jumlah bakteri keseluruhan baik yang hidup

maupun yang mati atau hanya untuk menentukan jumlah bakteri yang hidup saja tergantung

pada cara yang digunakan. Untuk menentukan jumlah mikrobia yang hidup dapat dilakukan

setelah suspensi bahan atau biakan diencerkan beberapa kali dan ditumbuhkan pada medium

dengan cara tertentu tergantung macam bahan dan sifat mikrobia (Atlas dan Bartha, 1988).

Perhitungan jumlah mikrobia secara tidak langsung dapat dilakukan dengan

sentrifugasi, berdasarkan kekeruhan, dengan electronic counter, berdasarkan analisis kimia,

berdasarkan berat kering, berdasarkan jumlah koloni dan Most Probable Number (MPN)

(Carpenters, 1977).

Pada percobaan ini, perhitungan secara tidak langsung dilakukan dengan perhitungan

jumlah koloni baik yang sudah mati maupun yang masih hidup. Dasar teori perhitungan ini

adalah membuat suatu seri pengenceran kelipatan 10 dengan mengambil 1 ml suspensi

bakteri kemudian dimasukkan dalam 9 ml larutan dan dibuat taburan (pour plate) pada

cawan Petri. Pada praktikum ini digunakan tanah, yang diencerkan dalam air sampai

kelipatan 105, setiap kelipatan dibuat taburan, kecuali kelipatan 10 dan 100, karena

diperkirakan bakteri masih padat, sehingga koloni yang tumbuh menjadi tidak tersebar.

Menurut Hauster (1972), perhitungan bakteri dengan cara ini memerlukan beberapa syarat

antara lain:

1. Jumlah koloni tiap cawan Petri antara 30-300 koloni. Jika ada yang tidak memenuhi

syarat maka dipilih yang mendekati 300

2. Tidak ada koloni yang menutup lebih besar dari setengah luas cawan Petri. Koloni

tersebut dikenal sebagai spreader, maka spreader tersebut tidak diperhitungkan.

3. Perbandingan jumlah bakteri dari hasil pengeceran yang berturut-turut antara

pengenceran sebelumnya jika sama dengan atau kurang dari 2, maka hasilnya dirata-

rata. Jika lebih besar dari 2 maka yang dipakai adalah jumlah mikrobia dari pengenceran

sebelumnya.

4. Setelah memenuhi syarat maka hasil jumlah perhitungan dikali faktor pengencer.

3




II. Tujuan

Pengamatan pada praktikum ini bertujuan untuk mempelajari tehnik perhitungan secara

langsung dan tidak langsung sehingga akan terlihat perbedaan antara keduanya dari jumlah sel yang

dihitung.

III. Metode

A. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam praktikum ini antara lain kertas steril, spatel, pipet steril,

kertas milimeter, kaca preparat, objektif mikrometri, okuler mikrometri, mikroskop, jarum

inokulasi Ose, cawan petri,dan hand counter. Sedangkan bahan yang digunakan dalam

praktikum ini adalah larutan eritrosin, akuades steril 99 ml, larutan cat methylen blue, xylol,

alkohol 95 %, tissue, medium nutrien.

B. Cara Kerja

Pengenceran dan pengecatan preparat

Gelas benda dicuci dengan alkohol dan dipanaskan pada spirtus, kemudian suspensi

diletakkan pada gelas benda dan difiksasi pada spirtu, selanjutnya gelas benda ditetesi

methylen blue dan gela benda ditutup.

Penghitungan secara langsung

Preparat mikrobia yang sudah tersedia diletakkan dibawah mikroskop. Kemudian

setelah terlihat bentuk sel (mikroskop sudah focus) dilakukan penghitungan dengan

menggerakkan dalam beberapa luas bidang pandang (5),dan dihitung tiap luas bidang

pandang menggunakan hand counter.

Penghitungan secara tidak langsung

Cawan petri yang sudah berisi bakteri diamati langsung dengan Coloni Counter

(menggunakan milimeter block), kemudian bakteri yang tertera dalam garis dihitung

jumlahnya.

4




IV. Hasil

Enumerasi Jumlah sel bakteri secara langsung (mikroskopi)

1 Luas bidang pandang mikroskop .................1,13.......................

2 Pewarnaan yang dipakai ...............................................

3 Jumlah sel bakteri

1. ..........

2. ..........

3. .........

4. .........

5. ..........

Jumlah sel bakteri perbidang pandang=

...... sel/ Luas bidang pandang

Jumlah sel bakteri per mL bahan=

........ CFU/ mL.

Perhitungan Jumlah Koloni (Plate count)

No. Pengenceran Jumlah Koloni / Cawan Petri

Jumlah koloni/ ml

1 10-4 37 145,3545 x 104

2 10-5 240 942,84 x 105

3 10-6 97 381,0645x 106

V. Pembahasan

Pada praktikum ini, dilakukan penghitungan jumlah bakteri dalam suatu kultur yang ditentukan

dengan menghitung jumlah sel-sel. Penghitungan ini dilakukan dengan metode langsung dan tidak

langsung,penghitungan dengan menggunakan metode langsung dilakukan dengan menghitung

5




banyaknya sel per luas bidang bandang menggunakan mikroskop, Penghitungan ini digunakan untuk

menentukan jumlah bakteri secara langsung per sel. Metode ini dilakukan dengan menyebar atau

mengkulturkan sampel bakteri pada volume tertentu di atas kaca obyek, kemudian dikeringkan,

difiksasi, diwarnai, dan diperiksa di bawah lensa obyektif dengan minyak emersi agar lebih jelas.

Dalam metode ini, luas bidang pandang (field) mikroskop yang akan digunakan harus dihitung

terlebih dahulu. Hal ini dilakukan dengan cara mengukur diameter bidang pandang menggunakan

mikrometer. Mikrometer yang digunakan adalah mikrometer gelas obyek yang mempunyai skala

terkecil 0,01 mm. Dilakukan peneraan mikrometer okuler dengan standar ukuran yang tertera pada

skala mikrometer obyektif. Mikrometer obyektif diletakkan di atas meja benda mikroskop kemudian

skala mikrometer okuler dan skala mikrometer obyektif dengan cara menghimpitkan skala di sisi

kiri. Diperoleh 15 skala okuler mikrometer untuk 1 skala obyek mikrometer atau 0,01 mm. Sehingga

dapat dihitung 1 skala okuler mikrometer = 1,33.10-3 mikronmeter. Penghitungan dilakukan dalam 2

bidang pandang. Luas bidang pandang dihitung dengan rumus luas lingkaran. Diperoleh luas bidang

pandang 3,14.10-4 mm2, dan rata-rata jumlah sel per bidang pandang adalah 54.dengan jumlah bakteri

perbidang pandang sebanyak 4778,761062 sel, Sedangkan jumlah sel per ml bahan adalah

477876,1062 sel/ml.

Keuntungan dari penggunaan metode ini adalah dapat menentukan dan menghitung langsung

jumlah bakteri baik hidup dan mati yang terdapat pada kaca preparat (Atlas and Bartha, 1998).

namun metode ini juga memiliki beberapa kelemahan antara lain :

1. Sel-sel yang telah mati tidak dapat dibedakan dari sel-sel hidup sehingga keduanya akan

terhitung.

2. Sel-sel yang berukuran sangat kecil sukar dilihat sehingga kadang tidak terhitung.

3. Dalam setiap bidang pandang tidak selalu ada sel yang dapat dihitung sehingga jumlah sel di

dalam suspensi harus cukup tinggi.

4. Tidak dapat digunakan untuk menghitung sel jasad renik di dalam bahan pangan yang

mengandung debris atau ekstrak makanan (Fardiaz, 1992).

Hasil perhitungan ini dimungkinkan tidak terlalu akurat. Hal ini disebabkan oleh berbagai

kendala seperti ulangan yang dilakukan hanya dua kali, sel bakteri hidup masih bergerak aktif

sehingga pada saat dilakukan penggeseran di bidang pandang 2 bakteri yang sama dapat muncul lagi.

Selain itu, kesamaan di tiap ulangan rendah, dan nilai tiap ulangan tidak mendekati nilai rata-ratanya.

Untuk penghitungan dengan metode tidak langsung dilakukan pada konsentrasi substansi

bakteri 104, 105, dan 106 dengan tanpa ulangan. Untuk bakteri dengan pengenceran 104 didapat

jumlah bakteri/ cawan petri sebanyak 37,dengan dengan jumlah koloni sebanyak 145,3545 CFU,

untuk bakteri dengan pengenceran 105 didapat jumlah bakteri/cawan petri sebanyak 240 dan jumlah

6




koloni sebanyak 942,84 CFU sedangkan untuk pengenceran 106 didapat jumlah bakteri/cawan petri

sebanyak 97 dan jumlah koloni 381,0645 CFU. Hasil jumlah koloni/ 20cm3 memenuhi syarat jumlah

koloni karna berada diantara kisaran 30-300. Pada penghitungan ini hanya perbandingan A/C, dan

AB/C, untuk perbandina A/B tidak digunakan karna hasil yang didapat nilainya <2, sehingga yang

pengenceran yang digunakan adalah pengenceran untuk 104.pengenceran AB di ambil dari rata-rata

A/B. Hal ini didasarkan pada syarat-syarat yang terdapat pada teori penghitungan menggunakan

metode tidak langsung menurut Hauster (1972) bahwa :

1. Jumlah koloni tiap cawan Petri antara 30-300 koloni. Jika ada yang tidak memenuhi syarat

maka dipilih yang mendekati 300

2. Tidak ada koloni yang menutup lebih besar dari setengah luas cawan Petri. Koloni tersebut

dikenal sebagai spreader, maka spreader tersebut tidak diperhitungkan.

3. Perbandingan jumlah bakteri dari hasil pengeceran yang berturut-turut antara pengenceran

sebelumnya jika sama dengan atau kurang dari 2, maka hasilnya dirata-rata. Jika lebih besar dari

2 maka yang dipakai adalah jumlah mikrobia dari pengenceran sebelumnya.

4. Setelah memenuhi syarat maka hasil jumlah perhitungan dikali faktor pengencer.

Penggunaan metode ini dapat memberikan estimasi terbaik dari jumlah bakteri pada substansi

tertentu. Namun banyak juga menemukan kendala seperti bila koloni tumbuh mengumpul, sulit

menganggap koloni mana yang dihitung sebagai single sel. Sehingga sangat mungkin terjadi salah

pandang saat perhitungan, koloni kecil tidak terhitung. Jadi ada banyak faktor yang mempengaruhi

keakuratan penghitungan dengan metode ini. Tetapi metode ini merupakan metode yang luas

digunakan untuk menentukan jumlah bakteri hidup dalam suatu substansi (Sarles, 1956).

VI. KESIMPULAN

Dari penghtiungan jumlah bakteri pada percobaan kali ini didapat kesimpulan bahwa

Perhitungan bakteri dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu secara langsung dan tidak langsung.

Penghitungan bakteri secara langsung dapat dihitung menggunakan mikroskop dan didapat jumlah

bakteri sebanyak sel/ml.sedangkan penghitungan bakteri dengan metode tidak langsung

dilakukan dengan menggunakan colony counter atau penghitungan jumlah koloni, dari perhitungan

dengan metode tidak langsung ini didapat jumlah bakteri sebanyak sel/ml.

7




DAFTAR PUSTAKA

Atlas, R. M. 1988. Microbiology Fundamental and Applications. 2nd ed. Mc Millan Publishing

Company. New York, pp. 101-103.

Bourdon, K.L. 1956. Textbook of Microbiology. 3th edition. The MacMillan Company. New

York,pp. 172-173.

Carpenter, P. L. 1977. Microbiolgy. 4th ed. W. B. Saunders Company. Philadephia, pp. 217-221.

Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta, hal. 119-123.

Frobisher, Martin. 1957. Microbiology. Sixth edition. W. B. Saunders Company. Philadelphia and

London, pp. 210-211.

Hauster, W. J. 1972. Standart Method for The Examination of Diary Product. America Publish

Health Association. New York.

Pelczar, J. R. 1957. Manual of Microbiology Method.McGraw Hill Book Company Inc. New York,

p. 245-249.

Prescott, L. M., J. P. Harley, D. A. Klein. 1999. Microbiology. McGraw Hill Book Company. USA,

pp. 117-118, 177.

Sarles, W.B, W.C Frazier, J.B. Wilson and S.G. Knight. 1956. Microbiology General and Applied.

2nd ed.

Soetarto, E.S., Suharni, T.T., Nastiti, S.Y., dan Sembiring, L. 2008. Petunjuk Praktikum

Mikrobiologi. Fakultas Biologi UGM. Yogyakarta, hal.61-66.

Waluyo, L. 224. Mikrobiologi Umum. UMM Press. Malang, hal 95,104-105.

Wistreich, G. A and M. D. Lechtman. 1988. Microbiology. 5th ed. Mac Millan Publishing

Company. New York, pp. 105-111.

8




Tanggal :

Nama :.NIM : Gol/Nomor : Asisten :

Topik Praktikum: 5. Perhitungan dan Enumerasi Bakteri pada Suatu Bahan

Acara Praktikum: a. Enumerasi jumlah sel bakteri secara langsung (mikroskopi) b. Perhitungan jumlah koloni (Plate count)

Tujuan praktikum: Menentukan jumlah bakteri yang terdapat dalam suatu bahan dengan menggunakan metode secara langsung dan perhitungan secara plate count.

Hasil Pengamatan:

Bahan yang dipakai: ......................................

Enumerasi Jumlah sel bakteri secara langsung (mikroskopi)

1 Luas bidang pandang mikroskop ...........................................2 Pewarnaan yang dipakai ...............................................3 Jumlah sel bakteri

6. ..........7. ..........8. .........9. .........10. ..........

Jumlah sel bakteri perbidang pandang=...... sel/ Luas bidang pandang

Jumlah sel bakteri per mL bahan=........ CFU/ mL.

Perhitungan

9




Perhitungan Jumlah Koloni (Plate count)No. Pengenceran Jumlah Koloni /

Cawan PetriJumlah koloni/ ml

1 10-4

2 10-5

3 10-6

Perhitungan :

10




Telah diperiksa , Yogyakarta, April 2013Asisten Praktikan

………………… ………………………………………….

11




Borang

Documents

Transcript of Borang