ESTADO PLURINACIONAL DE BOLIVIA MINISTERIO DE SALUD Y DEPORTES

Gua Prctica del Diagnstico de la Malaria

154

Movilizados por el Derecho a la Salud y la Vida Serie: Documentos Tcnico NormativosLA PAZ- BOLIVIA 2010

ESTADO PLURINACIONAL DE BOLIVIA MINISTERIO DE SALUD Y DEPORTES

Gua Prctica del Diagnstico de la Malaria

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Movilizados por el Derecho a la Salud y la VidaSerie: Documentos Tcnico NormativosLA PAZ- BOLIVIA 2010

GUA

PRCTICA DEL DIAGNSTICO DE LA MALARIA

R.M. : N Depsito legal: ISBN: Elaborado por: Equipo tcnico:

Dra. A. Magdalena Jimnez L. (Consultora Nacional MSH/SPS) Dra. Arletta Aez (Consultora Nacional OPS/OMS) Dr. Jorge Aruni (Responsable Laboratorio Nacional de Referencia de Diagnstico de Malaria INLASA) Dr. Juan Carlos Arraya (Responsable Estrategia de Vigilancia y Control de la Malaria y Dengue Ministerio de Salud y Deportes)

Edicin: La Paz: Control E.T.V.s Malaria - Dengue Unidad de Epidemiologa Direccin General de Servicios de Salud Comit de Identidad Institucional y Publicaciones Ministerio de Salud y Deportes 2010. Ministerio de Salud y Deportes 2010 Apoyo tcnico y edicin de este documento brindado por la Iniciativa Amaznica contra la Malaria, IAM, Management Science for Health/Strategic Pharmaceutival System (MSH/SPS) y a la Organizacin Panamericana y Mundial de la Salud (OPS/OMS). Esta publicacin es propiedad del Ministerio de Salud y Deportes de Bolivia, se autoriza su reproduccin, total o parcial, a condicin de citar la fuente y propiedad Impreso en Bolivia

AUTORIDADES DE SALUD NACIONALES

Dra. Sonia Polo Andrade MINISTRA DE SALUD Y DEPORTES Dra. Nila Heredia Miranda VICEMINISTRO DE SALUD Y PROMOCIN Dr. Roberto Suarez Ojopi VICEMINISTRO DE MEDICINA TRADICIONAL E INTERCULTURALIDAD Sr. Miguel Angel Rimba VICEMINISTRO DE DEPORTES Dr. Jaime Choque Cortes DIRECTOR GENERAL DE SERVICIOS DE SALUD Dr. Sergio Mollinedo Prez JEFE UNIDAD DE EPIDEMIOLOGA Dr. Juan Carlos Arraya Tejada RESPONSABLE NACIONAL ESTRATEGIA DE VIGILANCIA Y CONTROL DE LA MALARIA Y DENGUE MINISTERIO DE SALUD Y DEPORTES

PRESENTACINEl Plan Estratgico del Programa Nacional de Vigilancia y Control de la Malaria para el perodo 2008-2012 establece como meta disminuir la morbimortalidad relacionada a la malaria en por lo menos 50% respecto a la situacin 2007 y as cumplir con los objetivos del milenio antes del 2015. Bajo este contexto se ha identificado una necesidad muy sentida referida al mejoramiento de la calidad del diagnstico microscpico de la malaria a nivel nacional. Para este fin, se ha actualizado el documento Gua Prctica del Diagnstico de la Malaria. Este documento tiene mucho valor en esta etapa del control de la malaria en Bolivia, ya que permitir mejorar la calidad del diagnstico de la malaria realizado por los tcnicos de vectores y microscopistas que trabajan en condiciones precarias en rea rural de zonas endmicas de todo el pas. Este documento ha sido revisado por los actores claves de los laboratorios de II y III nivel de las zonas endmicas de malaria bajo el liderazgo del laboratorio de nivel IV-Laboratorio Nacional de Referencia de Diagnstico de Malaria de el INLASA, con el fin de estandarizar los procedimientos operativos normados por el Ministerio de Salud y Deportes. La actualizacin de esta gua constituye un hecho muy pertinente para la Estrategia de Vigilancia y Control de la Malaria a nivel central como a nivel regional y local por que su implementacin va ha permitir realizar control de calidad por el personal del nivel inmediatamente superior. Estamos seguros que la Gua Prctica del Diagnstico de la Malaria permitir brindar a todos los usuarios del sistema de salud un mejor servicio.

Dra. Sonia Polo Andrade MINISTRA DE SALUD Y DEPORTES

RESOLUCIN MINISTERIAL

ndiceCaptulo 1. Mtodo de Diagnstico Parasitolgico Directo ........................................................................... 11 1.1 Procedimiento de la toma de muestra ...................................................................................................... 1.2 Procedimiento Tcnico de muestra hemtica ........................................................................................... 1 a) Tcnica de Tincin Romanowsky ............................................................................................................... 1 b) Tcnica de Tincin Giemsa ........................................................................................................................ 1 1.3 Calidad de la Gota Gruesa ....................................................................................................................... 1 1.4 Calidad del Frotis ...................................................................................................................................... 1 1.5 Criterios del Diagnstico Microscpico de Malaria ................................................................................... 1 1.6 Identificacin Microscpica del Parsito ................................................................................................... 1 1.7 Caractersticas Microscpicas del Plasmodium falciparum ...................................................................... 1 1.8 Caractersticas Microscpicas del Plasmodium vivax............................................................................... 1 Captulo 2. Determinacin de la densidad parasitaria ................................................................................... 2 2.1 Mtodo semicuantitativo por cruces o mtodo simple .............................................................................. 2 2.2 Clculo del nmero de parsitos por microlitro de sangre en gota gruesa ............................................... 2 Captulo 3. Descripcin del Microscopio ptico ............................................................................................. 2 3.1 Aspectos Generales.................................................................................................................................. 2 3.2 Gua del manejo del microscopio ptico ................................................................................................... 2 3.3 Mantenimiento y cuidado del microscopio ptico ..................................................................................... 2 Captulo 4. Pruebas de Diagnstico Rpido de la Malaria............................................................................. 2 4.1 Fundamento de las Pruebas Rpidas para el Diagnstico de la Malaria.................................................. 2 Captulo 5. Control de Calidad ....................................................................................................................... 3 5.1 Metodologa de la Evaluacin Externa del Desempeo (EED .................................................................. 3 5.2 Metodologa del Control de Calidad Indirecto (CCI) ................................................................................. 3 5.3 Anlisis de los resultados ......................................................................................................................... 3 5.3.1 Anlisis de los resultados de la calidad diagnstica .............................................................................. 3 5.3.2 Anlisis de los resultados de la calidad tcnica ..................................................................................... 3 Anexos Form.1 Formulario EED .................................................................................................................................. 37 Form. 2 Formulario CCI .................................................................................................................................. 40 Bibliografa

Abreviaciones

AMI C CC CCI DP ENVCM EED GG INLASA LNRDM MS y D MSH Mx OPS OMS P Pv Pf SPS PDRs SGCDM

Iniciativa Amaznica de Lucha contra la Malaria Control Control de Calidad Control de Calidad Indirecto Densidad Parasitaria Estrategia Nacional de Vigilancia y Control de la Malaria Evaluacin Externa del Desempeo Gota Gruesa Instituto Nacional de Laboratorios de Salud Laboratorio Nacional de Referencia de Diagnstico de Malaria Ministerio de Salud y Deportes Management Sciences for Health Infeccin Mixta Organizacin Panamericana de la Salud Organizacin Mundial de la Salud Plasmodium Plasmodium vivax Plasmodium falciparum Strengthening Pharmaceutical Systems Pruebas de Diagnstico Rpido Sistema de Gestin de Calidad del Diagnstico de Malaria

Captulo N1 Mtodo de Diagnstico Parasitolgico Directo Gota gruesa/frotis sanguneoEl diagnstico parasitolgico de malaria, clsico, directo y especfico es el mtodo de la gota gruesa y extendido sanguneo (frotis) con una sensibilidad del 92-98% y especificidad del 85-99%. Este mtodo se basa en la demostracin de la presencia y definicin de la especie del Plasmodium spp . a) Gota Gruesa. Es un procedimiento tcnico de concentracin, relacionado con la sensibilidad del diagnstico microscpico y que facilita la deteccin de parsitos en un volumen determinado de sangre. La gota gruesa est conformada por numerosas capas de clulas sanguneas, en la que mientras ms clulas concentradas exista, existir una mayor probabilidad de detectar al parsito. Este procedimiento, comprende la eliminacin de la hemoglobina (que retiene el colorante) a travs de la deshemoglobinizacin que facilitara la deteccin de los parsitos que pudieran estar presentes en el interior de algunas clulas sanguneas, principalmente cuando se tratan de densidades parasitarias bajas. La gota gruesa, es tambin un procedimiento que sirve para la cuantificacin de la densidad parasitaria. b) Frotis o extendido sanguneo. Es un procedimiento tcnico con el que se separan los elementos formes de la sangre en una capa delgada de clulas separadas entre s, las cuales una vez coloreadas facilitaran la observacin de las caractersticas morfolgicas de los parsitos presentes en el interior de los glbulos rojos, sobre todo permitir identificar la especie del parsito y otras caractersticas relacionadas con los estadios y especie de los mismos.

1.1 Procedimientos de la toma de muestra.Materiales: Laminas porta-objetos limpios. Torundas de algodn Alcohol medicinal Lancetas de puncin descartables Formulario de Registro Individual para malaria Lpiz negro blando.GUA PRCTICA DEL DIAGNSTICO DE LA MALARIA

Foto N 1: Material para la toma de muestra

Despus que los datos del paciente han sido registrados en forma apropiada en el formulario de registro individual para malaria, se deber proceder de la siguiente manera: Preparar previamente los insumos y materiales necesarios para la toma de la muestra hemtica, 2 muestras por paciente, torundas de algodn secas y embebidas en alcohol, portaobjetos desengrasados, lanceta estril y guantes. Explicar al paciente a cerca de los procedimientos que se van a realizar para la obtencin de la muestra hemtica. Sostener firmemente la mano menos hbil del paciente, elegir el dedo anular o medio parte lateral externa con la palma dispuesta frente al examinador y solicitar la flexin del resto de los dedos de la mano. En el caso de pacientes peditricos se puede tomar la muestra del pie: borde lateral externo o la parte angular del taln.

Foto N 2: Limpieza del dedo anular con algodn empapado en alcohol

Limpiar la zona de eleccin con una torunda de algodn embebida en alcohol, utilizando golpes firmes para eliminar la grasa, la suciedad y al mismo tiempo estimular la circulacin de la sangre. Secar la zona con una torunda de algodn seca y limpia Puncionar la zona de eleccin con una lanceta estril a travs de un movimiento rpido y presionar suavemente el dedo para extraer las primeras gotas de sangre. Eliminar las dos primeras gotas de sangre limpindolas con una torunda de algodn seca y asegurar que ninguna hilacha de algodn pueda mezclarse posteriormente con la sangre.

Foto N 3: Puncin de la zona de eleccin

Colocar el portaobjetos abajo y la zona de toma de la muestra arriba de este, colecte rpidamente la sangre apretando suavemente el dedo cuidando que el pulpejo no toque la lmina portaobjetos, depositar 1 gota de sangre en el centro de uno de los extremos de la lmina para la gota gruesa y otra gota en el centro de la mitad de la lmina portaobjetos para realizar el frotis.

Foto N 4 y 5: Colecta de la muestra de sangre

Limpiar la zona con una torunda de algodn humedecida en alcohol y solicitar al paciente que presione el lugar de la puncin para que la compresin impida el sangrado. Realizar inmediatamente el extendido sanguneo en capa fina (frotis) en una superficie plana y firme, sujetando el portaobjetos del extremo que contiene la muestra para la gota gruesa ejercer presin con un dedo. Utilizando otro portaobjeto como extensor (el cual tenga un borde liso y sin deformaciones) tocar el borde de la gota de sangre y esperar que discurra la sangre a lo largo del borde biselado, deslizar el portaobjetos con firmeza hacia un extremo sobre el primero manteniendo un ngulo de 45 haciendo que los dos portaobjetos estn siempre en contacto. En caso de tener mucha sangre se puede levantar el portaobjetos extensor luego de que discurra la sangre a travs del borde biselado, llevar unos milmetros hacia delante y proceder de la misma forma.

Foto N 5

Foto N 6

Fotos N 5-7: Ejecucin del frotis en ngulo de 45

Utilizar un ngulo del portaobjetos extensor y mezclar rpidamente la gota de sangre a travs de movimientos giratorios y suaves, se debe proceder a la desfibrinizacin por 30 segundos para obtener una pelcula homognea, de 1 cm. de dimetro. De preferencia, realizar la homogenizacin de la muestra en una sola direccin, en forma concntrica (de adentro hacia afuera). Identificar la muestra con lpiz negro en el sector inicial o grueso del extendido colocando el Nmero de Clave de la Muestra correspondiente al nmero del Formulario de Registro Individual para Malaria que se registro.

Foto N 8 y 9: Ejecucin de la gota gruesa

Foto N 10: Identificacin de la gota gruesa con el N de clave de muestra

Dejar secar las muestras a temperatura ambiente, en posicin horizontal, cuidando de no dejar expuestas al sol, al polvo y protegida de los insectos.

1.2 Procesamiento Tcnico de la muestra hemtica.Deshemoglobinizacin. Introducir la mitad del portaobjetos que contiene la muestra de gota gruesa en un recipiente que contenga agua corriente limpia cuidando de que la parte que contiene la muestra no entre en contacto con la pared del recipiente. La muestra debe permanecer en el agua hasta tornarse totalmente transparente, en caso de una mala desfibrinizacin o de muestras guardadas por mucho tiempo pueden encontrarse restos de hemoglobina. Secar. Sacar la muestra del recipiente y dejar secar a temperatura ambiente en posicin vertical, la gota gruesa siempre debe estar en la parte inferior. Fijacin. Una vez seca, colocar el portaobjeto en posicin horizontal y utilizando una pipeta cubrir toda la muestra con alcohol al 96% por espacio de 3 a 5 minutos (alcohol Caimn, Guabir, etc.). Otra opcin para efectuar este procedimiento consiste en sumergir la muestra en metanol por espacio de 30 segundos.

Foto N 11: Fijacin con alcohol comercial al 96%

Secado. Dejar secar la muestra a temperatura ambiente. Antes de la coloracin asegrese que la gota gruesa y el frotis estn secos. Coloracin. Dos tcnicas son las habituales y sirven para la coloracin de las muestras hemticas las cuales se describen a continuacin: a) Tcnica de Tincin ROMANOWSKY.

Foto N12 y 13: reactivos y materiales para la coloracin

Preparacin del colorante: 1. Agua amortiguada o tamponada con pH de 7,2 a 7,4 ml (ver preparacin de agua tamponada o recurrir a opciones comerciales de agua tamponada disponibles en el mercado como el Naturagua cuyo pH es de 7,3) 2. Solucin A 3. Solucin B 8 gts 5 gts ( ver preparacin de la solucin A y B)

Colocar primeramente 10 ml de agua amortiguadora o Naturagua en un recipiente, luego agregar la Solucin A y B y homogeneizar los ingredientes cuidadosamente. La cantidad indicada sirve para colorear 3 lminas. Colocar la lmina portaobjeto en posicin horizontal sobre la parrilla de tincin cuidando de que el lado del portaobjetos que contiene la muestra sea el correcto. Cubrir completamente la muestra hemtica con la preparacin utilizando una pipeta Dejar actuar el colorante por 30 minutos. Descartar el colorante y lavar la lmina con agua corriente bajo un chorro suave cuidando de que el agua no desprenda la muestra. Dejar secar las placas en un soporte a temperatura ambiente. Observar al Microscopio ptico Preparacin de la solucin amortiguadora: Pese y mezcle las siguientes sales amortiguadoras: Ortofosfato disdico Ortofosfato monopotsico 4g 5g

Se mezclan las sales de forma que se tenga un polvo homogneo, se toma 1 gr. de la mezcla y se disuelve en un litro de agua destilada, agitar y medir con un peachimetro y ajustar a un pH de 7,2 a 7,4. Preparacin de la solucin A Pese los siguientes reactivos Cloruro de azul de metileno Azur I o azur B 3,2 g 2g

Mezcle las cantidades indicadas en 1 litro de solucin amortiguadora y filtre

Preparacin de la solucin B Pese el reactivo: Eosina amarilla hidrosoluble 4g

Disuelva el reactivo en 1 litro de solucin amortiguadora y filtre

b) Tcnica de Tincin GIEMSA Preparacin del colorante. El colorante se prepara en una proporcin 1/9 (10%), con esta proporcin, el tiempo adecuado de tincin suele ser de 30 minutos. 1. Agua tamponada con pH 7,2 a 7,4 9 ml (ver preparacin de agua tamponada o recurrir a opciones comerciales de agua tamponada disponibles en el mercado como el Naturagua cuyo pH es de 7,3) 2. Solucin madre Giemsa 1 ml

Foto N 14: Tcnica de tincin Giemsa

Preparar una dilucin 1:10 mezclando la solucin madre de Giemsa y el agua tamponada. Homogeneizar los ingredientes cuidadosamente. Colocar la lmina portaobjetos en posicin horizontal sobre la parrilla de tincin. Cubrir completamente la muestra hemtica con el colorante preparado utilizando una pipeta Dejar actuar el colorante por 30 minutos Descartar el colorante y lavar la lmina con agua corriente bajo un chorro suave cuidando de que el agua no desprenda la muestra.

Dejar secar las placas en una gradilla a temperatura ambiente. Observar al Microscopio ptico

1.3 Calidad de la gota gruesa.Una buena gota gruesa macroscpicamente debe tener las siguientes caractersticas: a simple observacin, debe ubicarse en el centro de una de las mitades del portaobjetos, estar completa, medir 1 cm. de dimetro. Microscpicamente no se deben observar glbulos rojos ni restos de hemoglobina, debe tener fondo claro y una concentracin adecuada de 10 a 20 leucocitos por campo.

Foto N15: Muestras gotas gruesa/frotis coloreadas

1.4 Calidad del frotis.El frotis, macroscpicamente debe ocupar la otra mitad de la lmina portaobjeto, debe ser delgado y tener tres partes: cabeza, cuerpo y cola, no deben existir cogulos, restos de grasa o partculas. Microscpicamente se debe visualizar una sola capa de elementos formes separados entre s. Para fines prcticos, es de rutina examinar 100 campos microscpicos deslizando la lmina en un trayecto de zigzagueante, de derecha a izquierda y de izquierda a derecha, antes de desechar la lmina como negativa.

1.5 Criterios de Diagnstico Microscpico de Malaria.En el diagnstico microscpico de la malaria es indispensable conocer e identificar inicialmente los elementos formes de la sangre que se pueden observar en un examen de gota gruesa y frotis.

Grfico N 1

La sangre est constituida por una fase lquida, el plasma en el que se encuentran en suspensin los siguientes elementos formes: 1. Glbulos rojos o eritrocitos. Los eritrocitos son redondeados, bicncavos, carecen de ncleo, tienen un dimetro promedio de 7,5 m, estn llenos de hemoglobina lo que le confiere a la sangre su caracterstico color rojo y estn encargados del transporte de O2 a los tejidos. Estas clulas son muy elsticas lo que les confiere una gran capacidad de soportar deformaciones. De acuerdo a la tincin pueden verse de color naranja o azul plido. 2. Glbulos blancos o leucocitos. Existen 5 tipos de leucocitos en la sangre y se clasifican de acuerdo con su contenido de grnulos citoplasmticos especficos en leucocitos granulares y agranulares. Neutrfilos. Granulocito, en general todos los leucocitos granulares tienen un dimetro aproximado de 12 a 15 m, con un ncleo caracterstico, dividido en 3 a 5 lbulos lo que le confiere el nombre particular de polimorfonuclear, contienen en su citoplasma numerosos grnulos finos que apenas pueden observarse. Eosinfilos. Granulocito, contienen un ncleo con dos grandes lbulos unidos por un filamento de cromatina. El citoplasma est prcticamente cubierto por grnulos eosinfilos grandes, fuertemente coloreado de color rosado o anaranjado. Basfilos. Granulocito, menos frecuentes de observar, tienen un ncleo bilobular o trilobulado, eventualmente con ncleo en forma de S. Los grnulos se encuentran agrupados y se colorean de color rojo violceo. Linfocitos. Agranulocito, tienen un dimetro entre 8 y 15 m. El ncleo es redondeado y presenta una leve hendidura, ocupa la mayor parte de la clula y est rodeado por un fino borde de citoplasma. Monocitos. Agranulocito, son clulas grandes, de 12 a 18 m de dimetro y presentan un ncleo de forma arrionada o de herradura. En los extendidos con frecuencia se encuentra un doblez caracterstico en el borde del citoplasma.

3. Plaquetas o trombocitos. Miden 3 m de largo. A menudo se agrupan formando pequeos grumos, se observan estas clulas de color rosado o naranja.

1.6 Identificacin microscpica del parsitoEl Plasmodium spp. adquiere un aspecto determinado en la gota gruesa y el frotis que permite el reconocimiento del tamao, el estadio, la especie parasitaria y las caractersticas dentro del glbulos rojo propias de cada especie.Grfico N 2: Plasmodium spp. dentro del glbulo rojo

Partes constitutivas del parsito. El parsito consta de un ncleo compuesto de cromatina, el cual es generalmente redondo y se colorea de un rojo intenso (rojo grosella). El citoplasma es de color azul variando ligeramente de tonalidad y puede tomar diferentes formas, desde una forma de anillo a una totalmente irregular. Consta de una vacuola donde se realizan las funciones metablicas del parasito, en la cual se absorbe la hemoglobina, que posteriormente es eliminada producto de la digestin, en forma de un pigmento llamado Hemozoina o pigmento malrico, este pigmento se encuentra almacenado en el parsito en forma de grnulos, los cuales sern ms evidentes en estadios maduros del parsito.

1.7 Caractersticas microscpicas del Plasmodium falciparum.En Bolivia, es la menos difundida y representa entre el 8% a 9 % de la malaria total aproximadamente, la especie P. falciparum est circunscrita a la Amazona boliviana principalmente en las zonas limtrofes con Brasil y Per y coexiste con P. vivax produciendo infecciones mixtas (ver cuadro N1). En el glbulo rojo y en sangre perifrica: Invade glbulos de cualquier edad, el poliparasitismo es frecuente en esta especie pero no exclusivo. Los glbulos rojos infectados no sufren agrandamiento. Por lo general solamente se identifican trofozoitos jvenes y gametocitos, los estadios de esquizonte y trofozoitos adultos se encuentran en tejidos profundos sin embargo pueden observarse en cuadros graves de la enfermedad. El trofozoito ocupa, generalmente menos de la mitad del espacio del glbulo rojo. Trofozoitos: Son formas anulares pequeas, las cuales pueden presentar un punto de cromatina anillo en engarce de rub o dos puntos de cromatina, en forma de sonrisa feliz y formas semejando una coma o signo de interrogacin con un punto de cromatina, pueden encontrarse en el borde del eritrocito en forma de appliques, en algunos casos llegan a rebasar la membrana celular y adoptan la forma de palillo de tambor. Las manchas de Maurer aparecen en estadios maduros y generalmente cuando las parasitemias son altas.

Esquizontes: Los que muy raras veces salen a la sangre perifrica y pueden generar entre 18 - 32 merozoitos. Aparecen en pacientes con parasitemias altas, en cuadros severos, pueden ser incontables y son indicadores de mal pronstico. Gametocitos: Formas sexuadas que asemejan a una salchicha o una banana y pueden ser pequeas o grandes, en algunas ocasiones se encuentran redondas, es frecuente observar la membrana del glbulo rojo durante la maduracin del gametocito.Grfico N 3

Por lo general solo se observan trofozoitos jvenes y gametocitos en sangre perifrica de Plasmodium falciparum.

1.8 Caractersticas microscpicas del Plasmodium vivax.La infeccin predominante en Bolivia es la infeccin por P. vivax y ms del 90% de la malaria anual corresponde a esta especie, siendo la especie ms dispersa en el territorio nacional (ver cuadro N1). En el glbulo rojo y en sangre perifrica: Esta especie tiene cierta preferencia por los glbulos rojos ms jvenes los cuales se agrandan con facilidad y su forma puede variar de redonda, oval a ligeramente ameboide en estadios maduros. Todos los estadios de P.vivax pueden ser identificados en sangre perifrica. Los trofozoitos son las formas jvenes de P. vivax, se mueven libremente al interior del glbulo rojo, lo que da origen a prolongaciones del citoplasma, por lo cual se pueden observar numerosas y variables formas de trofozotos que van desde formas anulares, pequeos, medianos y grandes, ameboides, a manera de mapas hasta formas muy irregulares principalmente en la formas maduras. Los trofozoitos jvenes habitualmente miden alrededor de un tercio del dimetro de los glbulos rojos, Los grnulos de Schuffner se hacen visibles en el parasito desde estadios jvenes hasta los estadios maduros. En cambio, los trofozoitos adultos adquieren un gran tamao ocupando totalmente el glbulo rojo, presentan una vacuola de gran tamao y los granos de pigmento se encuentran dispersos en todo el citoplasma

Grfico N 4: Caractersticas microscpicas de los trofozoitos de Plasmodium vivax

Los esquizontes se presentan como una masa de citoplasma condensado que contiene varios grnulos de cromatina y pigmento malrico, pueden presentar de 12 a 24 merozoitos, lo que le da el aspecto de racimo de uva y que al romperse dar origen a merozoitos eritrocticos que invadirn a otros glbulos rojos. El esquizonte maduro esta constituido por merozotos bien diferenciados compuestos de una mancha de cromatina rodeada de una pequea masa de citoplasma con gran cantidad de granulaciones de Schffner.Grfico N 5: Esquizontes de Plasmodium vivax

Los gametocitos, son formas sexuadas, ovaladas, irregulares, con citoplasma denso y compacto, poseen adems pigmento malrico muy visible, de color amarillo metlico y su cromatina puede ser central o perifrica, los grnulos de Schffner tambin son manifiestos en este estadio. Los macrogametocitos son por lo general grandes y azules y tienen una pequea masa compacta de cromatina excntrica a diferencia de este los microgametocitos tienen una masa difusa de cromatina que se tie de rosado.

A continuacin un cuadro comparativo de las cuatro especies parasitarias.

Cuadro N1 Caractersticas diferenciales del Plasmodium spp.Criterios

P. falciparum (Terciana maligno)12 das( De 9 a 14)

P. vivax (Terciana benigno)15 das (De 12 a 17)

P. ovale (Terciana benigno)17 das(De 16 a 18)

P. malariae (Cuartana)

Perodo normal de incubacin Ciclo eritroctico

28 das(De 18 a 40)

48 horas

50 horas

72 horas

48 horas Invade preferentemente las clulas viejas Glbulos rojos de tamao normal o menor. Frecuentemente se tien con mayor intensidad. Ocupan a 2/3 del dimetro, aunque por lo general se observan como formas en banda El poliparasitismo es frecuente. Nivel mx. de parasitemia habitual menos de 10.000/ul.

Glbulo rojo

Parasita eritrocitos de todas las edades Se conserva el tamao normal del glbulo rojo. Ocupan 1/5 a 1/3 del dimetro.

Primariamente invade los reticulocitos y hemates jvenes. Aumentan el tamao de los glbulos rojos. Frecuentemente teido con palidez. Ocupan a 2/3 del dimetro.

Invade preferentemente las clulas jvenes. Glbulos rojos de mayor tamao, bordes desflecados o astillados. Ocupan a 2/3 del dimetro.

Aspectos generales de la parasitacin de eritrocitos

El poliparasitismo es frecuente, pero no exclusivo. Pueden exceder de 200.000/ul; comnmente 50.000/ul Por lo general abundante Jvenes: Muy anulares, pequeos, en engarce de rub , una o doble cromatina, en forma de sonrisa feliz, con citoplasma fino, uniforme. A menudo se observan formas perifricas en coma, gaviota, palillo de tambor, apliquees. Maduros: Presentes solo en cuadros graves. Algunos glbulos rojos infectados con trofozoitos adultos pueden presentar grnulos rosceos, voluminosos denominados hendiduras de Maurer

El poliparasitismo es raro, no frecuente. Nivel mximo de parasitemia habitual hasta 30.000/ul

El poliparasitismo no es frecuente es muy raro. Nivel max. de parasitemia habitual hasta los 20.000/ ul. Moderada

Cantidad en sangre perifrica1

Moderada

Escasa a moderada

P.falciparum Trofozoitos

Jvenes: Anulares pequeos a medianos. Citoplasma irregular, mas o menos grueso formas en mapa. Generalmente con una cromatina, a veces doble. Maduros: ocupan todo el citoplasma, grandes, ameboideos e irregulares con pigmento denso, castao anaranjado

Jvenes: Anulares pequeos a medianos. Citoplasma en anillo, uniforme, denso. Generalmente una cromatina, prominente, a veces doble. Maduros: redondo, compacto, ameboide e irregular. Las granulaciones de Shffner tambin estn presentes

P.vivax

Jvenes: Anulares, pequeos a medianos, compactos. Citoplasma regular y grueso (denso). Maduros: 1. las vacuolas desaparecen pronto; citoplasma azul, compacto, con aspecto en banda, ms o menos redondo llenando casi la clula; la cromatina en banda o redonda Cromatina nica, grande crecen a lo largo del ecuador del hemati formas en banda, como uma sola extensin sangunea. 2. Pueden presentarse tambin como formas redondas, compactas, de color azul oscuro, con muchas particular de pigmento negro.

1

Los individuos adultos en especial suelen desarrollar inmunidad en las regiones endmicas y, en consecuencia, se reduce la densidad de los parsitos

Criterios

P. falciparum (Terciana maligno)Generalmente no visibles. Ocasionalmente presentan granulaciones de Maurer.

P. vivax (Terciana benigno)Finas, abundantes y distribuidas en el citoplasma del eritrocito. Granulaciones de Schffner.

P. ovale (Terciana benigno)Presentes en todos los estadios, incluso cerca de los anillos, las manchas pueden ser ms grandes y oscuras que en P.vivax, manchas o puntos de James en P.ovale

P. malariae (Cuartana)Ausente ; muy raramente se manifiestan puntos o grnulos de Ziemman

Granulaciones

P.vivax

Esquizontes

En estadios maduros presentan 18 a 32 merozoitos aglomerados y compactos. Pigmento malrico visible Son pequeos, compactos, oscuros, negro pardusco. Generalmente ausentes en sangre perifrica. Presente solo en casos muy graves

En estadios maduros con 12 a 24 merozoitos aglomerados irregularmente. Pigmento malrico visible Son grandes. Escasa a moderada cantidad.

En las formas maduras de 8 a 14 merozoitos, dispuestos en racimo poco compacto. Forman una roseta que rodea un conflomerado central de partculas de pigmento castao. Grandes. Escasa a moderada cantidad.

En las formas maduras de 6 a 12 merozoitos agrupados en forma de roseta con el pigmento paldico en el centro. Son pequeos y escasos. Citoplasma compacto abarca todo el glbulo rojo, tambin pueden haber formas en banda.

P.falciparum

P.falciparum Gametocitos

P.vivax

Jvenes: esfricos, compacto. Los estadios maduros: en forma de banana o salchicha medias lunas o semilunas. La cromatina de color rojo, en el macrogametocito est ms concentrada que en el microgametocito, en el cual la cromatina adquiere la forma de bastoncillos en el centro. Generalmente los microgametocitos son menos numerosos y ms pequeos que los macrogametocitos. Los gametocitos aparecen despus de 7 a 10 das.

Jvenes: pequeos y redondeados difciles de distinguir de los trofozoitos maduros. Maduros: redondeados y grandes, ocupan todo el hemate. Cromatina bien definida, con frecuencia lateral. Granulaciones dispersas evidentes. El macrogametocito tiene una pequea cromatina, compacta, excntrica. El microgametocito tiene una cromatina dispuesta difusamente. Los gametocitos aparecen pronto al 3er da.

Jvenes: voluminosos, ovales o redondeados Maduros: grandes, redondeados o con bordes irregulares y desflecados. Cromatina bien definida, con frecuencia lateral. Granulaciones dispersas evidentes. Estos aparecen despus de pocas semanas.

Jvenes: voluminosa, oval o redondeada. Maduros: redondeados ovales y compactos, abarcan todo el eritrocito. La cromatina se presenta como una mancha redonda situada en uno de los bordes Granulaciones gruesas evidentes. Los gametocitos aparecen entre los 4 y los 18 das.

Fotos: extractadas de Cartillas de Diagnstico Microscpico de la Malaria OPS/OMS

Grfico N 6: Comparativo de las distintas especies del Plasmodium spp. en frotis

Grfico N 7: en Gota Gruesa

Captulo N 2. Determinacin de la Densidad Parasitaria

La observacin de cualquier estadio evolutivo de Plasmodium spp. es suficiente prueba diagnstica, no obstante, es tambin rutinario examinar los cien campos indicados para evaluar la magnitud de la infeccin, la evolucin de la enfermedad y para evaluar la eficacia del tratamiento, monitoreando la densidad parasitaria durante el tratamiento. Los mtodos de determinacin de la densidad parasitaria ms usados para establecer la densidad parasitaria son dos:

2.1 Mtodo semicuantitativo por cruces o mtodo simpleEs un mtodo simplificado de recuento de parsitos en la gota gruesa, el cual se realiza mediante una clave de uno a cuatro cruces para indicar el nmero de formas asexuadas por campos microscpicos. En la tabla No 1 se expresan los resultados de la lectura en cruces y la interpretacin parasitolgica. Tabla No 1 Resultados de laboratorio expresado en crucesResultado en cruces Una cruz (+) Dos cruces (++) Tres cruces (+++) Cuatro cruces (++++) Interpretacin De 1 a 10 parsitos en 100 campos microscpicos examinados. De 11 a 100 parsitos en 100 campos. De 1 a 10 parsitos en 1 campo. Ms de 10 parsitos en un campo.

2.2 Clculo del nmero de parsitos por microlitro de sangre en gota gruesa.Es un mtodo prctico y ms preciso de conteo de parsitos por microlitro de sangre (l), se mide cotejando el nmero de parsitos asexuados (trofozoitos y esquizontes) con relacin a un promedio de leucocitos y al nmero estndar de leucocitos de 6.000 leucocitos por l de sangre. Para poner en prctica este mtodo se necesitan dos contadores manuales, uno para contar los parsitos y otro para contar los leucocitos. Frmula para el clculo de la densidad parasitaria:Nmero de Parsitos asexuados X 6.000 = Parsitos por l de sangre Numero de leucocitos

Para determinar la densidad parasitaria se debe aplicar los siguientes criterios, segn se presente el caso: En el caso de contar hasta 200 leucocitos y contar igualmente 10 parsitos o ms, aplicar la formula de acuerdo al siguiente ejemplo:

Ejemplo1: Si se cuentan 35 parsitos y 200 leucocitos DP= 35 x 6.000 = 1.050 parsitos por microlitro de sangre 200 Si despus de contar 200 leucocitos y menos de 10 parsitos han sido identificados y contados,

continuar con el recuento de leucocitos hasta llegar a 500 leucocitos. Ejemplo 2: Si se llega a contar 15 parsitos y 503 leucocitos, se aplicar la siguiente frmula: DP=15 x 6.000 = 179 parsitos por microlitro de sangre 503 En caso de una parasitemia alta, realizar el recuento en funcin del nmero de parsitos, registrando su recuento hasta 500 y aplicar la frmula con la cantidad de leucocitos encontrados.

Ejemplo 3: Si se cuentan 508 parsitos y slo 50 leucocitos DP=508 x 6.000 = 60.960 parsitos por microlitro de sangre 50 En caso de obtener cifras decimales redondear a nmeros enteros

Ejemplo 4: Si se cuentan 501 parsitos y slo 50 leucocitos DP=68 x 6.000 205 = 2.048,78 redondeando a: 2.048 parsitos por microlitro de sangre,

Captulo N 3. Descripcin del Microscopio ptico

Grfico N 1: Partes del Microscopio ptico

3.1 Aspectos Generales.El microscopio ptico consta de una parte mecnica y otra parte ptica: la parte mecnica est formada por: columna, brazo, tornillo macromtrico, tornillo micromtrico, tubo principal, revolver porta-objetivo, platina y carro mecnico. La parte ptica est formada por espejo plano, condensador, objetivos (10X-40X100X) y oculares (5X-7.5X-10X). Los objetivos son 10X, 40X, 100X, se encuentran colocados en el revlver porta objetivos. Los objetivos, 100X, el que se utiliza para el diagnstico de malaria, necesitan aceite de inmersin para aumentar la luminosidad del campo microscpico. El objetivo 10X se utiliza para enfocar e inspeccionar la coloracin y la distribucin de los leucocitos en el campo. El aumento total que se obtiene en un microscopio con objetivos de inmersin en aceite es de 1.000 aumentos, empleando oculares 10X esto resulta de una multiplicacin de 10X del ocular por 100X del objetivo, lo que es igual a 1.000.

Grfico N 2: Distancia entre lente y preparacin segn objetivos empleados

El condensador tiene como funcin reunir los rayos de luz reflejados por el espejo o emitidos por la fuente de luz (lmpara). Al lado izquierdo del condensador se encuentra un tomillo cremallera con el cual se acerca o se aleja el condensador de la platina del microscopio. En la parte inferior existe una pequea palanca para abrir o cerrar el diafragma que sirve para regular la cantidad de luz que pasa al condensador.

3.2 Gua de manejo del microscopio ptico.El examinador debe encontrarse sentado y cmodo. En el caso de que utilice lentes el observador, debe quitar las conchas oculares (si es que los tuviera).

Colocar el microscopio en un lugar slido donde no haya vibraciones y revisar que todos los componentes de la estructura del aparato estn dispuestos adecuadamente. Ubicar el condensador correctamente, abra usted el diafragma de apertura. El condensador debe estar casi al ras del orificio de la platina Cerrar el diafragma, la apertura solamente debe dejar pasar la cantidad de luz requerida para el aumento de contraste y la mejora de la profundidad de foco. Ajustar el tubo a la distancia interpupilar empleando ambas manos, esto se debe realizar mientras observa la preparacin, desplazando ambos tubos portaoculares, hasta que se aprecie solamente una imagen. Sujetar la lmina portaobjetos, sobre la platina con las dos pinzas o con la palanca del gua portaobjetos (una de agarre). Seleccionar la iluminacin correcta. En el equipo con lmpara, la bombilla est precentreada quedando garantizada la ptima iluminacin de todo el campo microscpico. Usar los objetivos 40x, para la primera observacin, se trata de los objetivos panormicos, con la mayor distancia entre la lente frontal y el objeto. Utilizar el ocular 10x para lograr mejor resolucin y definicin cuando se trate del microscopio ptico elctrico. En el caso del microscopio solar utilizar el ocular 5x. Revisar que el aceite de inmersin no tenga burbujas ya que influyen en la calidad de la imagen. Se debe colocar una gota de aceite de inmersin en el portaobjetos para que luego haga contacto con la lente frontal del objetivo. Cambiar al siguiente objetivo (l00x) o de inmersin, nunca se debe presionar hasta el tope del resorte de seguridad Es bueno recordar que el enfoque se debe realizar observando lateralmente la preparacin, hasta que el aceite haga contacto con el objetivo Realizar el enfoque de la imagen, girando el mando de acomodacin con el tornillo macromtrico luego buscar o ajustar la nitidez, con el tomillo micromtrico. Examinar la lmina comenzando por la gota gruesa y seguidamente continuar por el frotis para verificar la especie parasitaria y la positividad de la muestra, la revisin de la lmina podr hacerse desplazando el carro en zig zag. Una vez terminado el trabajo retirar el objetivo de 100x y dejar cualquiera de los objetivos panormicos en posicin centrada.

3.3 Mantenimiento y cuidados del Microscopio ptico.Realizar la limpieza superficial diariamente, quitando todo tipo de suciedad que pueda prenderse al equipo. Deber limpiarse tambin la parte mecnica con un pao de hilo o franela, sin emplear nunca alcohol para tal efecto, pues este ataca al esmalte; la gasolina en cambio resulta muy apropiada para limpiar las piezas esmaltadas pero no as las de goma La parte mecnica se deber lubricar solamente cuando sea necesario. Emplese vaselina, en todas las superficies mviles. El microscopio debe ser cubierto con forro de tela (nunca de plstico sobre todo en medio tropical) en un sitio fresco poco hmedo para evitar la aparicin de hongos. No tocar con los dedos las partes internas de los oculares, objetivos ni del condensador. Si quedan pelusas en el exterior o interior de los oculares y objetivos, quitar estas con un pincel de cerda fina o con pinza. El aceite de inmersin se limpia del objetivo con ayuda de gasa humedecida en alcohol o gasolina. No dejar demasiado tiempo con gasolina el objetivo de inmersin. Se recomienda el cambio de los objetivos de inmersin idealmente cada 2 aos y como tiempo mximo cada 10 aos Tiempo promedio de servicio del foco halgeno (fuente de luz) de 100 hrs. Si se trata de cambiar bombillas halgenas, nunca agarre con las manos directamente o en caso contrario lmpielas con alcohol.

Una vez concluido el trabajo habr de limpiarse bien todas las partes del microscopio. Nunca deber desarmarse la parte ptica si no es necesario y si no tienen el suficiente entrenamiento.

Captulo N 4. Pruebas de Diagnstico Rpido de MalariaLas pruebas rpidas para el diagnstico de la malaria denominadas tambin pruebas inmunocromatogrficas (ICT) o pruebas de diagnstico rpido (PDRs), se basan en la deteccin de antgenos presentes en los parsitos del gnero Plasmodium spp. mediante reacciones antgeno-anticuerpo que se traducen sobre tiras de nitrocelulosa (inmunocromatografa). Estas pruebas alcanzan de forma general niveles de sensibilidad y especificidad ptimos mayores al 90% con relacin a la gota gruesa. Son pruebas muy fciles de realizar, rpidas, sensibles y no precisan microscopio. Estas pruebas de ninguna forma sustituyen al frotis y la gota gruesa, ya que tienen limitaciones, puede presentar resultados falsos negativos o falsos positivos y no son cuantitativos. El uso de las PDRs puede ser efectivo en las siguientes circunstancias: i) ii) iii) En zonas donde el servicio de laboratorio existente no garantiza un diagnstico oportuno y de calidad. En zonas donde no existen servicios de diagnstico. Regiones donde no se tiene personal capacitado en el diagnstico microscpico de la malaria.

4.1 Fundamento de las pruebas rpidas para el diagnstico de la malaria.

Las PDRs contienen una tira de papel revestida por una membrana de nitrocelulosa, en la cual se han impregnado anticuerpos monoclonales o policlonales especficos para ciertos antgenos de las cuatro especies del gnero Plasmodium spp. que parasitan al hombre. Constan de una banda que se encuentra impregnada con anticuerpos anti-P. falciparum (protena 2 rica en histidina, HRP2) y se basan en la deteccin de HRP2 del plasmodium. Estas PDRs son de uso comercial y entre ellas tenemos: Parasight test, MalarCheck Pf Paracheck, ICT AMRAD Pf/Pv, etc. Otras PDRs se encuentran impregnadas con anticuerpos anti - isoenzima Lactato deshidrogenada (LDH) que permite diferenciar la especie del parsito, P. falciparum del P.vivax, entre ellas tenemos: prueba OptiMAL- IT, CareStare, ect. En nuestro pas, la utilizacin de PDRs en el diagnstico de la malaria en reas endmicas por P. vivax ha demostrado que la prueba OptiMAL-IT tienen una alta sensibilidad y especificad para el diagnstico de esta especie2. La enzima pLDH expresa altos niveles durante el estadio eritroctico del parsito, por tanto revela la presencia del parasito vivo. En cambio la HRP2, es un antgeno parasitario que puede seguir circulando en la sangre hasta por 72 horas despus de negativizarse la gota gruesa, de manera que no revela la presencia del parasito vivo, fenmeno conocido como perodo de antigenemia. Existen otros antgenos que estn presentes en las cuatros especies del Plasmodium spp., que son utilizados en combinacin con la deteccin de la HRP2. Estos se denominan antgenos panmalricos. Los anticuerpos monoclonales pueden ser inmunoglobulinas de tipo Ig G e Ig M. La reaccin antgeno anticuerpo utiliza un conjugado que contiene sulfonamidas y oro coloidal (ICT), ligadas a un colorante para fijar la reaccin. La sensibilidad de OptiMAL IT disminuye cuando la parasitemia es menor a 50 100 parsitos /l. Limitaciones. No es posible diferenciar infecciones mixtas No permite cuantificar la densidad parasitaria No detecta parasitemias bajas, principalmente en los casos asintomticos de la infeccin. No permite realizar el seguimiento y conocer la evolucin de la enfermedad con la instauracin del tratamiento

Informe IAM Prosin Evaluacin del Efectividad de las Pruebas Rpidas para el Diagnstico y Tratamiento de la Malaria, usadas por Colaboradores Voluntario de Salud, en Poblacin Recolectora de Castaa de la Regin Amaznica Boliviana, 2004 20052

Captulo N 5. Control de CalidadSistema de Gestin de Calidad del Diagnstico de Malaria (SGCDM). Es un conjunto de actividades relacionadas entre s, que permiten establecer metodologas, responsabilidades, los recursos humanos y materiales necesarios para lograr los objetivos, siguiendo una poltica de calidad de la Red Nacional de laboratorios de Diagnstico Microscpico de Malaria. Por tanto, el SGCDM a travs de programas de Control de Calidad pretende certificar las competencias y el desempeo de los microscopistas en malaria. El SGCDM est dirigido tambin a orientar, reducir los errores, garantizar la reproductividad de los procesos, estandarizar los mecanismos operacionales de sus componentes, los cuales citamos a continuacin: 1. Supervisin 2. Capacitacin 3. Monitoreo 4. Evaluacin y certificacin de rendimiento y de competencias a travs de los programas de Control de Calidad: Programa de Evaluacin Externa del Desempeo Programa de Control de Calidad Indirecto Como se cit anteriormente el SGCDM comprende dos programas de evaluacin, de los cuales el primero, la Evaluacin Externa de Desempeo, tiene la finalidad de evaluar a los funcionarios con relacin a las competencias y destrezas en el diagnstico microscpico de malaria, mediante paneles de lminas estandarizados. El segundo componente, el Control de Calidad Indirecto, est dirigido a evaluar la calidad tcnica del procesamiento de las muestras hemticas obtenidas por los funcionarios en forma rutinaria en los distintos niveles de la red. A continuacin se describen los aspectos metodolgicos ms importantes de los programas de Control de Calidad:

5.1 Metodologa de la Evaluacin Externa del Desempeo (EED).La EED es un programa sistematizado de comparacin interlaboratorios, el cual es objetivo y peridico, basado en el cotejo de los resultados de paneles de lminas organizadas y elaboradas por una instancia superior dentro de la Red Nacional de Laboratorios de Diagnstico de Malaria o por un ente independiente. El fundamento de la EED es la evaluacin semestral (2 veces al ao) de la capacidad diagnstica de los microscopistas de malaria, mediante la elaboracin de paneles, los cuales estn compuestos por muestras hemticas con determinadas caractersticas, las cuales se citan a continuacin: Los grupos de paneles deben ser uniformes entre s respecto a las caractersticas de las lminas de forma que la evaluacin sea comparable, esto podr conseguirse utilizando sangre de un mismo paciente para elaborar varias lminas Laminas con diferentes densidades parasitarias Lminas con infecciones mixtas Lminas negativas El nmero de lminas por panel no deber ser menor a cinco lminas, pudiendo ser ms. Por ejemplo, un panel de cinco lminas estar compuesto por las siguientes muestras: a. 1 lmina negativa b. 1 lmina de Plasmodium falciparum con una densidad parasitaria 100p/mm3

e. 1 lmina con infeccin mixta por P. vivax y P. falciparum El patrn anteriormente citado, podr variar de acuerdo al perfil epidemiolgico de cada regin. Todas las lminas deben ser de calidades ptimas y procesadas de acuerdo a los procedimientos estandarizados. Cada caso deber contar con informacin clnico-epidemiolgica y antecedentes del paciente (descripcin breve) Las lminas en los paneles debern ser identificadas segn sistema de codificacin diferenciado por laboratorio. Tal informacin debe ser manejada en forma confidencial y ser de conocimiento exclusivo del nivel inmediatamente superior. Adjuntar una carta en la que se especifique el plazo del lmite para presentacin de resultados y devolucin de material de evaluacin, el envo de los paneles es responsabilidad del Laboratorio Nacional de Referencia de Diagnstico de malaria(LNRDM)-Laboratorio de Parasitologa del Instituto Nacional de Laboratorios de Salud (INLASA)en coordinacin con la Estrategia Nacional de Vigilancia y Control de la Malaria, debiendo los niveles evaluados, notificar inmediatamente al LNRDM la recepcin de los mismos. El plazo de respuesta no ser mayor a un mes despus de recibido el material para la EED. El envo de los paneles, en todo momento debe ser realizado cumpliendo las normas de bioseguridad vigentes en el pas. En caso de extravi de los paneles de evaluacin se deber notificar inmediatamente al nivel superior correspondiente y en caso necesario deber repetirse la evaluacin al laboratorio respectivo. Los niveles evaluados debern llenar los formularios de registros de resultados segn instructivo, los cuales debern ser remitidos a nivel central junto al material respectivo. La EED podr ser realizada de forma directa in situ durante las actividades de visita o supervisin de los laboratorios de la red, cumpliendo los criterios metodolgicos anteriormente sealados.

5.2 Metodologa del Control de Calidad Indirecto (CCI)La nueva metodologa del CCI tiene criterios simples y comprende la revisin de un nmero mnimo de lminas y garantiza la disminucin de la carga de trabajo de los evaluadores. El fin de este programa es evaluar la capacitad individual de los microscopistas, en la toma y procesamiento de la gota gruesa/ frotis que realizan rutinariamente. La metodologa se basa en la proporcin de acuerdos o desacuerdos existentes entre los resultados de la primera lectura del laboratorio evaluado y los resultados de la segunda lectura efectuada por el laboratorio evaluador. La seleccin de muestras tiene las siguientes caractersticas: El CCI se realizar en toda la red de laboratorios de diagnstico de malaria y debe ser efectuada desde el nivel superior al nivel inferior correspondiente (Nivel IV a nivel III, ste al nivel Il y nivel II a nivel I). La evaluacin se llevar a cabo trimestralmente por lo que el laboratorio evaluado deber enviar al laboratorio evaluador, el 100% de las muestras obtenidas en los tres meses correspondientes al periodo de evaluacin. Los laboratorios evaluados enviarn junto al 100% de muestras hemticas procesadas durante un trimestre, los Formularios de Registro Individual para Malaria correspondientes. Adems de lo citado, los microscopistas debern informar la tcnica utilizada en el procesamiento de las muestras reportadas. Las muestras enviadas, no deben ser marcadas como positivas o negativas ni indicar la especie parasitaria encontrada. Se seleccionarn 10 muestras por cada mes del trimestre evaluado. En el laboratorio evaluador, una persona que no participe del CCI seleccionar del 100% de lminas producidas mensualmente y en forma aleatoria, 5 muestras positivas de baja densidad parasitaria (1 o 2 cruces). En las regiones donde corresponda, de las 5 muestras positivas seleccionadas tres debern ser infecciones por P. vivax, una por P falciparum y una infeccin mixta. En las regiones donde exista prevalencia de una sola especie parasitaria, las 5 muestras positivas seleccionadas correspondern a sta.

Tambin se seleccionarn 5 muestras provenientes del total de muestras negativas. En el caso de laboratorios con produccin mensual menor a 5 muestras positivas, se deber realizar el control del 100% de stas y la evaluacin del 10% del total de las muestras negativas obtenidas. Metodolgicamente se recomienda ser ms riguroso en la revisin de muestras en el caso de laboratorios donde se tenga menor produccin de muestras hemticas. Los resultados del CCI deben ser registrados en el formulario respectivo.

Adems de la evaluacin de la capacidad diagnstica de los microscopistas, el CCI valora la Calidad Tcnica del Procesamiento de las Muestras Hemticas, de acuerdo a los siguientes criterios: 1. Calidad de la Gota Gruesa: Ubicacin Concentracin Desfibrinacin Deshemoglobinizacin Una buena gota gruesa tiene las siguientes caractersticas: a simple observacin, debe ubicarse en el centro de una de las mitades del portaobjetos, estar completa, medir mnimamente 1 cm. de dimetro, y al microscopio, no se deben observar glbulos rojos ni restos de hemoglobina, debe tener fondo claro y una concentracin adecuada de 10 a 20 leucocitos por campo. 2. Calidad del Frotis: Ubicacin Extendido Fijacin El frotis debe ocupar la otra mitad del porta objetos. Un buen frotis debe ser delgado y constar de 3 partes: cabeza, cuerpo y cola sin que existan cogulos, restos de grasa o partculas. Microscpicamente se deber visualizar una sola capa de elementos formes separados entre s. 3. Calidad de la Coloracin: ptima: La calidad de la coloracin debe ser uniforme, los eritrocitos deben tener una tonalidad entre rosado naranja (Giemsa) o azul plido (Romanowsky), y leucocitos evidenciarn un ncleo violeta oscuro y citoplasma azul. Tanto en el frotis como en la gota gruesa es importante que se puedan distinguir los parsitos con su cromatina (ncleo) de color rosa intenso (Giemsa) o violeta (Romanowsky), su citoplasma deber ser de color azul. En el caso de P. vivax presentar granulaciones oscuras y el pigmento malrico se ver de color amarillo oscuro o ligeramente caf. Tanto la gota gruesa como el frotis no deben tener residuo de colorante ni precipitados. Regular: En el caso de coloraciones regulares se pueden encontrar deficiencias en las caractersticas citadas en el prrafo anterior, las cuales podrn dificultar la identificacin tanto de formas celulares como de parsitos. Deficiente: Una coloracin deficiente no permite la identificacin de los componentes celulares de una muestra hemtica y por sobretodo, dificulta la distincin de las caractersticas morfo

5.3 Anlisis de los ResultadosTodos los criterios descritos anteriormente sern calificados segn las caractersticas que presenten las muestras evaluadas. La calificacin asignada en el proceso ser de 2 puntos cuando la calidad sea ptima, de 1 punto cuando se considere regular y de 0 cuando sta sea deficiente.

5.3.1 Anlisis de los Resultados de la Calidad Diagnstica.En la primeramente del anlisis de los resultados cotejar los resultados de las lecturas del laboratorio evaluado versus los del laboratorio evaluador y clasificarlos de acuerdo a las siguientes criterios: a = N total de placas Verdadero Positivas: Muestras positivas reportadas en los registros como positivas b = N total placas Falso Positivas: Muestras negativas reportadas en los registros como positivas c = N total placas Falso Negativas: Muestras positivas reportadas en los registros como negativas d = N total de placas Verdadero Negativas: Muestras negativas reportadas en los registros como negativas Calcular y registrar los resultados de la sensibilidad y de especificidad aplicando las siguientes formulas: Sensibilidad: (Verdadero Positivas / Verdadero Positivas + Falso Negativas) x 100 = Especificidad:(Verdadero negativas / Verdadero Negativas + Falso Positivas) x 100 = Concordancia en especie:(Puntaje total obtenido / Puntaje ideal) x 100 = Concordancia en estadio: (Puntaje total obtenido/ Puntaje ideal) x 100 =

5.3.2 Anlisis de los Resultados de la Calidad Tcnica.El anlisis de los resultados de los criterios evaluados sobre la Calidad tcnica del procesamiento de las muestras gota gruesa / frotis se realizarn de acuerdo al siguiente clculo Calificacin obtenida: Sumatoria total de la calificacin obtenida en cada casilla = Calificacin esperada: Nmero de casillas llenadas o calificadas x 2 = Porcentaje: (Calificacin Obtenida/Calificacin Esperada) x 100 =

ANEXOS

FORM.1

INSTRUCTIVO DEL FORMULARIO DE EVALUACIN EXTERNA DEL DESEMPEO

El formulario de EED consta de las siguientes partes: 1era Parte: Datos de Identificacin. Registrar los datos de identificacin del microscopista evaluado y del evaluador, niveles de los mismos, n de muestras que contiene el panel, fecha de recepcin y fecha de remisin colocando el da/mes/ao. 2da Parte: Diagnstico Microscpico. Columna N 1: Anotar el cdigo alfanumrico del laboratorio que identifica la lmina Columnas N 2 5: Corresponden al llenado de resultados del Laboratorio Evaluador. Columna N 2: Colocar el resultado de la lectura (+) cuando el resultado sea Positivo de acuerdo a la infeccin parasitaria identificada: monoinfeccin o infeccin mixta y (-) cuando el resultado sea Negativo. Columna N 3: Registrar la especie parasitaria identificada Pv si se trata de una infeccin por P. vivax, Pf si es por P. falciparum, Mx si se trata de una infeccin por dos especies parasitarias y (-) en caso de resultado negativo. Columna N 4: Marcar con una X en las casillas correspondientes de acuerdo a los estadios parasitarios que se identifiquen: Trofozoitos, Esquizontes y Gametocitos y (-) en la caso de no estar presentes.En las infecciones mixtas NO se evalan los estadios ni la densidad parasitaria

Columna N 5: Anotar la Densidad Parasitaria en P/ul de sangre de acuerdo a normas. Columnas N 6 19: Corresponden al llenado de resultados del Laboratorio Evaluado. Columna N 6: Registrar el resultado de la lectura (+) cuando el resultado sea Positivo y (-) cuando el resultado sea Negativo. Columna N 7: Se asigna el valor de 1 punto como puntaje ideal para cada una de las casillas. Columna N 8: Anotar el puntaje obtenido de (1) cuando el resultado sea correcto y (0) cuando sea incorrecto. Columna N 9: Registrar la especie parasitaria identificada Pv si se trata de una infeccin por P. vivax, Pf si es por P. falciparum, Mx si la infeccin es por 2 especies y (-) en caso de resultado negativo. Columna N 10: Se asigna el valor de 3 puntos como puntaje ideal para cada una de las casillas.En las infecciones mixtas la NO identificacin de P. falciparum resta 2 puntos a la calificacin

Columna N 11: Anotar el puntaje obtenido asignando 3 puntos cuando el resultado sea correcto o se trate de una monoinfeccin y cuando se identifiquen las 2 especies parasitarias en una infeccin mixta; (2) cuando en una infeccin mixta se identifique solamente P. falciparum y NO P. vivax; (1) en el caso contrario, cuando se identifique solamente P.vivax y NO P. falciparum (0) cuando el resultado sea incorrecto. Columna N 12-14: Marcar con una X en las casillas correspondientes de acuerdo a los estadios parasitarios que se identifiquen: Trofozoitos, Esquizontes y Gametocitos y (-) en la caso de no estar presentes. Columna N 12- 15: Se asigna el valor de 1 punto para cada casilla y 3 puntos como puntaje ideal total. Columna N 16: Se anotara un punto para cada casilla con resultado correcto y que se trate de una monoinfeccin y (0) cuando el resultado sea incorrecto Columna N 17: Registrar la Densidad Parasitaria en p/ul de sangre de acuerdo a normas. Columna N 18: El puntaje ideal asignado ser de 1 punto para cada una de las casillas.

Columna N 19: Se asigna el valor de 1 punto considerando que la concordancia de la densidad parasitaria sea menor o igual a un 10% y 0 puntos si la concordancia es mayor al 10% 3ra Parte. Anlisis de los Resultados. Seccin correspondiente al laboratorio evaluador. Cotejar los resultados de las lecturas del laboratorio evaluado versus los del laboratorio evaluador: En la parte correspondiente a Calificacin Final determinar: (Puntaje Obtenida / Puntaje ideal) x 100 = ( ) y registrar los resultados en los espacios correspondientes a las columnas de resultado, especie, estadio y de la densidad parasitaria Clasificar los resultados de las lecturas considerando los siguientes criterios: a = N total de placas Verdadero Positivas: Muestras positivas reportadas en los registros como positivas b = N total placas Falso Positivas: Muestras negativas reportadas en los registros como positivas c = N total placas Falso Negativas: Muestras positivas reportadas en los registros como negativas d = N total de placas Verdadero Negativas: Muestras negativas reportadas en los registros como negativas Calcular y registrar los resultados de la sensibilidad, especificidad, concordancia en especie y en estadio aplicando las siguientes formulas: Sensibilidad: (Verdadero Positivas / Verdadero Positivas + Falso Negativas) x 100 = Especificidad:(Verdadero negativas / Verdadero Negativas + Falso Positivas) x 100 = Concordancia en especie:(Puntaje total obtenido / Puntaje ideal) x 100 = Concordancia en estadio: (Puntaje total obtenido/ Puntaje ideal) x 100 =

En la ltima parte de esta seccin anotar los datos que identifican al laboratorio evaluado y al evaluador

FORM .2

INSTRUCTIVO DEL FORMULARIO DE CONTROL DE CALIDAD INDIRECTO

El formulario CCI consta de las siguientes partes: 1era Parte. Datos de Identificacin. Registrar los datos de identificacin del microscopista evaluado y del evaluador, niveles de los mismos, total de muestras enviadas, fecha de ingreso y fecha de remisin colocando el da/mes/ao y anotar el perodo correspondiente que se evaluara de acuerdo con el material enviado. 2da Parte. Resultados del Diagnstico Microscpico. Columna N 1: Registrar el nmero o el cdigo que identifica la muestra Columna N 2: Este espacio est destinado para anotar los resultados del laboratorio evaluado, los cuales debern ser registrados una vez concluida la revisin de las muestras por el laboratorio evaluador. Colocar el resultado de la lectura (+) cuando el resultado sea Positivo de acuerdo a la infeccin parasitaria identificada: monoinfeccin o infeccin mixta y (-) cuando el resultado sea Negativo. Columna N 3: Anotar la densidad parasitaria de acuerdo con el registro de resultados del laboratorio evaluado. El mismo que puede estar expresado de forma semicuantitativa por cruces (+, ++, +++, ++++) o cuantitativamente en parsitos por microlitro de sangre.Es muy importante que el personal encargado de la evaluacin desconozca los resultados de la lectura antes de concluir la revisin. Registrar las columnas 2 y 3 al final de la evaluacin

Columnas N 4-8: Estos espacios estn destinados para anotar los resultados del laboratorio evaluador. Columna N 4: Marcar con una X en la casilla que corresponda de acuerdo a la infeccin parasitaria identificada, monoinfeccin, infeccin mixta o Negativo. Columnas N 5-7: Estas casillas estn orientadas a evaluar el procesamiento tcnico de la muestra. Cada uno de los criterios debern ser evaluados de acuerdo a la siguiente escala de calificacin: anotar 0 en caso de ser Deficiente, 1 que ser = a Regular y 2 que ser = a ptimo Columna N 8: Anotar la densidad parasitaria registrada por el laboratorio evaluador expresada en p/ul de sangre. Observaciones. En esta parte se debe anotar cualquier aspecto que usted considere relevante durante la evaluacin y con relacin a la calidad diagnstica o tcnica de la muestra hemtica 3ra Parte. Anlisis de los resultados. A. Calidad Diagnstica. Cotejar los resultados de las lecturas del laboratorio evaluado versus los del laboratorio evaluador y clasificarlos de acuerdo con los siguientes criterios: a = N total de placas Verdadero Positivas: Muestras positivas reportadas en los registros como positivas b = N total placas Falso Positivas: Muestras negativas reportadas en los registros como positivas c = N total placas Falso Negativas: Muestras positivas reportadas en los registros como negativas d = N total de placas Verdadero Negativas: Muestras negativas reportadas en los registros como negativas Calcular y registrar los resultados de la sensibilidad y de especificidad aplicando las siguientes formulas: Sensibilidad: (Verdadero Positivas / Verdadero Positivas + Falso Negativas) x 100 = Especificidad:(Verdadero negativas / Verdadero Negativas + Falso Positivas) x 100 = B. Calidad Tcnica.Los resultados de los criterios evaluados sobre la Calidad tcnica del procesamiento de las muestras gota gruesa / frotis se realizarn de acuerdo al siguiente clculo

Calificacin obtenida: Sumatoria total de la calificacin obtenida en cada casilla = Calificacin esperada: Nmero de casillas llenadas o calificadas x 2 = Porcentaje: (Calificacin Obtenida/Calificacin Esperada) x 100 = Finalmente, en la ltima parte de esta seccin anotar los datos que identifican a la persona encargada de la evaluacin.

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ANEXO EDITORIAL PERSONAL TCNICO QUE PARTICIP EN LA VALIDACIN DEL DOCUMENTO: RESPONSABLES DE LABORATORIO DE II Y III NIVEL Tec. Mara Maldonado Vila Responsable de Laboratorio de Malaria Departamento de Santa Cruz Dra. Roxana Herrera Chvez Responsable de Laboratorio de Malaria Departamento de Pando Dra. Jacqueline Mndez Guzmn Responsable de Laboratorio de Malaria Departamento de Cochabamba Dra. Isabel Torrez Rueda Responsable de Laboratorio de Malaria Departamento de Chuquisaca Tec. Martha Mamani Vargas Responsable de Laboratorio de Malaria Departamento de Potos Dra. Lidia de la Cruz Rivero Responsable de Laboratorio de Malaria Departamento de Tarija Tec. Lynn N. Orellana Aguayo Responsable de Laboratorio de Malaria Departamento del Beni Tec. Octavio Paco Ramos Responsable de Laboratorio de Malaria Departamento de La Paz Tec. Gladys Nakao Cspedes Responsable de Laboratorio de Malaria Gerencia de Salud Riberalta Beni Tec. Hugo Duran Moreno Responsable de Laboratorio de Malaria Gerencia de Salud Guayaramern Beni Lic. Ruth Wilma Figueroa Castro Responsable de Laboratorio de Malaria Gerencia de Salud Yacuiba Tarija Dr. Amrico J. Maldonado Alanoca Laboratorio INLASA Agradecimientos:

A la Iniciativa Amaznica contra la Malaria (IAM); a la Organizacin Panamericana y Mundial de la Salud (OPS/OMS) y a Management Sciences for Health/Strengthening Pharmaceutical Systems (MSH/SPS) por el apoyo tcnico brindado en la elaboracin y edicin de este documento.

Bolivia Digna, Soberana, Democrtica y Productiva

PARA VIVIR BIEN