BMO8

การศกษาการยอยโปรตนของเชอ Vibrio parahaemolyticus และโปรตนในอาหารกง ดวยเอนไซมโปรตเอสทนรอน

Digestion of Vibrio parahaemolyticus proteins and formulation of shrimp feed By thermostable protease enzyme

จราพร ออนศรทอง (Jiraporn Oonsrithong)* ดร.นจรน จงรจา (Dr. Nujarin Jongruja)**

บทคดยอ แบคทเรย Vibrio parahaemolyticusเปนสาเหตของการเกดโรคกงตายดวนในกงทมผลตอการเจรญเตบโตของกง ท าใหกงตายไดโดยมอตราการตายถง 90 เปอรเซนตภายใน 30 วน ปจจบนผเลยงกงเลอกใชยาปฏชวนะในการยบย งโรค แตอาจสงผลกระทบตอไปยงผบรโภคไดในงานวจยนจงสนใจทจะใชเอนไซมโปรตเอสทนรอนในการยอยโปรตนเชอ V. parahaemolyticus และ โปรตนอาหารกง จากการทดลองเมอน าโปรตเอสทนรอนมาทดสอบความสามารถในการยอยโปรตนเชอ V. parahaemolyticus ดวยเทคนค SDS-PAGE พบวาแถบโปรตนหายไปเมอวเคราะหดวยเทคนค MALDI-TOF พบวาเปนโปรตน OmpU จาก Vibrio sp. และการทดสอบความสามารถในการยอยโปรตนอาหารกงทอยในรปกรดอะมโนดวยเทคนคนนไฮดรน พบวาการใสโปรตเอสทนรอนทผสมลงไปในอาหารกงท าใหโปรตนอาหารกงถกยอยเปนกรดอะมโนไดดกวาเมอเทยบกบอาหารกงทไมมโปรตเอสทนรอน

ABSTRACT Vibrio parahaemolyticus causes an acute mortal disease in shrimp or early mortality syndrome (EMS). It affects the growth of shrimp and causes the shrimp to die, with a mortality rate of 90% within 30 days. Shrimp farmers usually use antibiotics to inhibit the disease which may negatively affect consumers. This research aims to use thermostable protease enzyme to digest proteins from V. parahaemolyticus and from shrimp feed. From the experiment, when we used V. parahaemolyticus protein digested by thermostable protease and test the ability of protein degradation by SDS-PAGE. The digested protein bands were analyzed by MALDI-TOF. The OmpU protein was identified. When the shrimp feed was treated by thermostable protease, free amino acid and soluble peptides were detected. Suggesting that protein in the shrimp feed was hydrolyzed by the protease.

ค าส าคญ: โปรตเอสทนรอน วบรโอ พาราฮโมไลตคส อาหารกง Keywords: Thermostable protease, Vibrio parahaemolyticus, Shrimp feed *นกศกษา หลกสตรวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาจลชววทยาประยกต คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยพระจอมเกลาธนบร **อาจารย ภาควชาจลชววทยา คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยพระจอมเกลาธนบร

516

BMO8-2

บทน า อตสาหกรรมการเพาะเลยงกงถอเปนอตสาหกรรมทมขนาดใหญโดยหนงในนนคอประเทศไทย ทถอวาเปน

ประเทศทมการสงออกกงทสงเปนอนดบตนๆของเอเชย ทมการสงออกกงไปยงประเทศสหรฐอเมรกาเปนจ านวนมากและหลากชนดไมวาจะเปนกงสด กงแชแขง หรอ กงแปรรป ซงมมากถง 40 เปอรเซนตดวยกนซงมมลคารวมถง 75 ลานบาท ซงถอวามมลคาทสงมากเมอเทยบกบตลาดคแขง (กรมสงเสรมการคาระหวางประเทศ, 2560)

แตในป 2556 อตราการสงออกกงไทยกลบลดลงมาจากหลายสาเหต แตสาเหตทส าคญคอการเกดโรคจากเชอแบคทเรย โดยในป 2556 คณะนกวจยจาก University of Arizona สามารถระบถงเชอสาเหตทท าใหเกดโรคทสรางความเสยหายแกฟารมกงมากมายในเอเชย คอ Vibrio parahaemolyticus

V. parahaemolyticus เปนเชอแบคทเรยทมผลกระทบตออตสาหกรรมการเลยงกงเปนอยางมากเนองจากเปนแบคทเรยทเปนสาเหตของการลดลงของจ านวนกง ถาหากท าการยบย งหรอก าจดความรนแรงนไดจะชวยลดอตราความเสยหายจากการตายของกงจากเชอแบคทเรย V. parahaemolyticusโดยทลกษณะอาการของโรค คอ เนอเยอบรเวณตบและตบออนมความผดปกต โดยเรมจากเซลลเยอบ (epithelial cell) ของตบและตบออนถกท าลายอยางรนแรงคลายกบถกสารพษ ตบออนมการสะสมไขมนลดต าลง ประสทธภาพลดลงดวย จนในระยะทายของโรคมการตดเชอซ า (secondary infection) อยางรนแรงซงเกดขนโดยการฉวยโอกาสของเชอ V. parahaemolyticus และในทสดกงทตดเชอจะตาย เปนผลมาจากการทตบและตบออนลมเหลวซงโรคนสงผลกระทบใหกงมอตราการตาย 90 เปอรเซนตภายในระยะเวลาเพยง 30 วน (FAO, 2013)

ในหลายปทผานมากลมเกษตรกรผเพาะเลยงกงบางรายเลอกทจะใชยาปฏชวนะเพอใชในการลดปญหาดงทกลาวมาในขางตนเพอหวงใหกงแขงแรง โดยยาปฏชวนะเปนยาตานจลชพทออกฤทธเฉพาะกบแบคทเรยไมออกฤทธกบไวรส ยาปฏชวนะทมกใชในอตสาหกรรมการเพาะเลยงกงมตวอยางดงน Sarafloxacin, Sulfadimethoxine sodium และ Ormethoprim โดยทยาปฏชวนะแตละชนดกจะมระยะเวลาบงคบในการใชงานทแตกตางกนไปขนกบชนดของยาปฏชวนะ เชน Sarafloxacin ก าหนดระยะเวลาหยดยาท 5 วน (กรมประมง, 2550)

แตอยางไรกตามการใชยาปฏชวนะในปรมาณทมากเกนอาจสงผลใหมสารตกคางทอาจสงตอไปถงผบรโภคกงได เชน หากใชยาปฏชวนะในการรกษาแบคทเรยในกง หากแบคทเรยมการกลายพนธจะท าใหแบคทเรยมการทนตอยาปฏชวนะและจะปะปนอยในเนอสตวเมอคนกนเนอสตวเขาไปหากเกดอาการปวย เมอไดรบยาปฏชวนะชนดเดยวกนเขาไปจะไมมผลกระทบตอเชอททนตอยาปฏชวนะ หรอ เกดการดอยานนเอง ท าใหมนษยไมหายจากการตดเชอ นนจงเปนขอเสยของการใชยาปฏชวนะทมากเกนไปจนสงผลกระทบตอผบรโภค นอกจากนยงอาจท าใหเกดผลกระทบตอการสงออกกงของประเทศไทยไปยงประเทศตางๆทเปนตลาดรบซอกงหลกจากประเทศไทยได เชน ประเทศสหรฐอเมรกา โดยในป 2560 องคกรอาหารและยาแหงสหรฐอเมรกาหรอThe U.S. Food and Drug Administration’s (FDA) ไดมการตรวจพบการปนเปอนของยาปฏชวนะในกงทมการน าเขาและพบวามาจากประเทศไทยทงหมด 5 รายการดวยกนซงถอวาเปนจ านวนทสงมากเมอเทยบกบปทผานมาทมการตรวจพบการปนเปอนของยาปฏชวนะ (Shrimpalliance, 2017)

อาหารของกงขาวจะม 2 ประเภท คอ อาหารธรรมชาต ซงเปนอาหารทเกดขนตามธรรมชาตในบอหรอสรางขนมาโดยจะประกอบไปดวยจลนทรยและสงมชวตขนาดเลก อกประเภทคออาหารเมด เปนอาหารทผลตขนมาโดยผประกอบการผลตอาหารเมดเพอการเพาะเลยงสตวน าโดยตรงโดยความตองการสารอาหารของกงขาวไวนาไมจะมความตองการปรมาณโปรตนท 35-50 เปอรเซนต (กรมประมง, 2558) และถงแมวาผประกอบการผลตอาหารเมดจะใสโปรตนลงไปในอาหารกง 30 เปอรเซนตหรอมากกวา กงอาจไมสามารถรบปรมาณโปรตนททางผประกอบการใสเตม

517

BMO8-3

ลงไปไดจนหมด เนองจากโปรตนทใสลงไปมขนาดของโปรตนทใหญหรออยในรปแบบโพลเปปไทดท าใหยากตอการน าไปใชไดในครงเดยว ท าใหปรมาณโปรตนทเตมลงไปอาจะเกดการสญเปลาหากโปรตนในอาหารกงมขนาดทเลกลงทอยในรปของเปปไทดสายสนหรอกรดอะมโนอาจท าใหกงไดรบโปรตนไดครบถวนตามเกณฑทเหมาะสม

อยางไรกตามปจจบนยงไมมการรายงานเกยวกบการใชโปรตนโปรตเอสเขามาใชการยอยโปรตนของเชอ V. parahaemolyticus และน ามาใชในการปรบปรงสตรอาหารทเหมาะสมส าหรบกงขาว งานวจยนจงสนใจในการน าโปรตเอสมาใชในการยอยโปรตนจากเชอ V. parahaemolyticus โปรตเอสทใชในการวจยมคณสมบตคอ มอณหภมทเหมาะสมตอการท างานของเอนไซมอยท 70 องศาเซลเซยส และเมอทดสอบกบอณหภม 100 องศาเซลเซยสเปนเวลา 1 ชวโมง พบวายงมกจกรรมเอนไซมสงถง 70 เปอรเซนต, ทนความเคมสงถง 2 โมลารซงมากกวาระดบความเคมของน าทะเลทมความเคมท 0.51 โมลาร (Duangjai et al., in press)โดยผวจยมความคาดหวงวาการใชโปรตเอสทนรอนจะสามารถลดความรนแรงของเชอ V. parahaemolyticus ตอกงขาวลงได

วตถประสงค

- เพอยอยโปรตนทผลตจาก V. parahaemolyticus ดวยโปรตเอสทนรอน - เพอยอยโปรตนในอาหารกงดวยโปรตเอสทนรอน - เพอท าใหโปรตนในอาหารกงถกยอยออกมาเปนกรดอะมโนหรอเปปไทดสายสนทละลายน าไดมากขน

วธการวจย

การ Transformation น า recombinant plasmid ของเอนไซมโปรตเอสทนรอนจาก Thermomonospora curvata ทไดท าการสกด พลาสมดไวดวยชด Kit (PrestoTM Mini Plasmid Kit) ปรมาตร 2 ไมโครลตรใสลงใน competent cell ปรมาตร 100 ไมโครลตรแลวน าไปแชในน าแขง 30 นาท จากนนน าไปท า Heat shock ท 42 องศาเซลเซยสเปนเวลา 90 วนาท และน าไปแชน าแขง 15 – 30 นาท หลงครบเวลาจะท าการคน cell โดยการใสอาหารเลยงเชอ LB broth ทไมผสมยาปฏชวนะ 900 ไมโครลตร และบมท 37 องศาเซลเซยส ทความเรวรอบ 200 rpm เปนเวลา 1 ชวโมง เมอครบน าไปปนเหวยงท 12,000 rpm, 5 นาทน าอาหารสวนใสออก 900 ไมโครลตร และท าการละลายตะกอนเซลลใหเขากน น าไป spread plate ลงบน LB agar ทมยาปฏชวนะ ampicillin และ chloramphenicol บมท 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 16-24 ชวโมง จะไดโคโลนของเชอ E. coli สายพนธ BL21 (DE3) ทมยนของเอนไซมโปรตเอสทนรอน

การผลตโปรตเอสในระบบเซลล E. coli น าโคโลนจากจานอาหารเลยงเชอใสลงใน flask อาหาร LB broth 50 มลลลตร ทมยาปฏชวนะ ampicillin และ chloramphenicol อยางละ 0.01% (w/v) ของปรมาตรอาหาร บมเปนเวลา 24 ชวโมง, 200 rpm ท 37 องศาเซลเซยส เพอใชเปนหวเชอ และท าการถายเชอไปส Flask อาหาร LB broth 1,000 มลลลตร ทมยาปฏชวนะอยางละ 0.01% (w/v) โดยถายเชอลงไป 2% (v/v) บมท 37 องศาเซลเซยส ความเรวรอบ 200 rpm เปนเวลา 3 – 4 ชวโมง ใหไดคา OD (optical density) อยในชวง 0.4 – 0.6 เมอไดถงคาทตองการท าการเตม 1 mM IPTG และบมตอท 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ชวโมง ท าการเกบตะกอนโปรตนโดยการปนเหวยงท 5,000 rpm เปนเวลา 30 นาท ท 4 องศาเซลเซยส เกบสวนตะกอนเซลล (pellet) และเกบไวท -20 องศาเซลเซยส

518

BMO8-4

การท าใหเซลลแตก น า Pellet ทเตรยมไวมาละลายดวย 100 mM Tris buffer pH 7 ดวยปรมาตร 10 ml ตอ Pellet ทไดจากการผลต โปรตเอส 1,000 มลลลตร เมอละลายจนเปนเนอเดยวกนน าไปแตกเซลลดวย sonicatorในขณะแตกเซลลในน าแขงตลอดเวลาและระวงไมใหตวอยางรอนจนเกนไป เมอเซลลทตองการแตกเซลลเรยบรอย น าไปปนเหวยงท 10,000 rpm ท 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 – 20 นาท และท าเกบสวนใส (supernatant) ไวใชในขนตอนตอไป

การท าบรสทธเอนไซมโปรตเอสทนรอนดวย Fast protein liquid chromatography น าตวอยางทไมมตะกอนปนเปอนฉดเขาสเครอง FPLC โดยทมบฟเฟอรทใชอย 2 ชนดคอ 100 mM Tris pH 6 (Buffer A,+) และ 100 mM Tris pH 6 + 1M NaCl (Buffer B,+,-) ใช column ion exchange ทเปนการแยกโปรตนตามความเปนขวโดยจะตองใหทงระบบภายในเครองเปน Buffer A เนองจากโปรตเอสมขวเปน (-)ท าให buffer A ทมขวเปน (+) ผลกโปรตนอนๆทมขวเปน (+) ใหออกไปและยดโปรตเอสไว และเมอเปลยนเปน Buffer B ทมขว (+,-) ท าใหโปรตนทไมตองการทเปนขว (-) ถกผลกออกไปและท าใหขวบวกจาก Na ยดขว (-) ของโปรตเอสเอาไวใหออกมาพรอมกนท Buffer B 50 -70% และมความบรสทธ จากนนน าไป concentrate ดวย protein concentrator ขนาด 10,000 MWCO ท 5,000 rpm, 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาทเพอใหมความเขมขนเพมมากขน

การเตรยม secreted proteins จากแบคทเรย V. parahaemolyticus เตรยม secreted proteins จากแบคทเรย V. parahaemolyticus โดยการเลยงในอาหาร nutrient broth ทมการเตม 3% NaCl เปนเวลา 24 ชวโมง ให OD อยในชวง 0.4 – 0.6 เมอไดคาทตองการใหน าไปปนเหวยงทความเรว 5,000 rpm ท 4องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาทเกบสวนใสมาทดลองตอโดยการเตม ammonium sulfate ทความเขมขน 20-80 % จากนนน าไปปนเหวยงทความเรว 5,000 rpm ท 4 องศาเซลเซยสเปนเวลา 30 นาท เกบสวนใส มาใสลงในถง เยอเลอกผาน (dialysis bag) และแชใน PBS buffer ท 50 mM ใส Magnetic stirring bar เพอท าการกวน จะท าการเปลยน PBS buffer ทก 2 ชวโมง จนครบ 6 รอบ เมอครบเกบสารทอยในถงเยอเลอกผานเพอน าไปใชในการทดลองตอไป

การทดสอบความสามารถในการยบยงโปรตนของ V. parahaemolyticus โดยเอนไซมโปรตเอสทนรอนดวยเทคนค SDS-PAGE น าเอนไซมโปรตเอสทนรอน และ secreted proteins ทเตรยมไวน ามาใชในการทดสอบความสามารถในการยบย ง โดยผสมตวอยางทงสองชนดทมปรมาณโปรตนทเทากนท 400 ไมโครกรม (100:100) โดยใช Tris buffer pH7 100 mM และน ากลนในการปรบปรมาตรใหเทากนและน าไปบมท 70 องศาเซลเซยสเปนเวลา 2 ชวโมง เมอครบท าการเตม Loading dye 6X ปรมาตร 5 ไมโครลตรตอตวอยาง 25 ไมโครลตรน าไปใหความรอนท 100 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท จากนนน าตวอยางไปโหลดลงใน SDS-PAGE โดยโหลดปรมาตรชองละ 25 ไมโครลตรเมอเสรจแลวใหน าแผนเจลทไดมายอมสดวย coomassie brilliant blue stain และลางดวย destaining solution จากนนท าซ าโดยการลดปรมาณโปรตเอสลงเปน 100:5, 100:10, 100:20 และ 100:40 แตปรมาณของ Secreted protein ยงคงเปน 100% เมอไดแผนเจลทมแถบโปรตนใหเลอกตดแถบโปรตนทไมถกยบย งวเคราะหวาเปนโปรตนชนดใดของ Vibrio spp. ดวยเทคนค Matrix assisted laser desorptiontime-of-flight-mass spectrometry (MALDITOF MS) การทดสอบความสามารถในการยอยโปรตนอาหารกงโดยเอนไซมโปรตเอสทนรอน ชงอาหารกงบดละเอยด 0.1 กรมใสลงในหลอด microcentrifuge tube เตมเอนไซมโปรตเอสทนรอน และปรบปรมาตรใหได 1 มลลลตรดวย 100 mM Tris buffer pH 7 โดยทชดควบคม เปนเอนไซมโปรตเอสทนรอนทผสมกบ 100 mM Tris pH 7 ในอตราสวนทเทากน ท าเปรยบเทยบกบการใสอาหารกงบด 0.1 กรมทเตม 100 mM Tris pH 7 จากนน

519

BMO8-5

เขยาใหเขากน ปนเหวยงท 10,000 rpm เปนเวลา 1 นาท เกบสวนใส 50 ไมโครลตร เพอน าไปทดสอบปรมาณกรดอะมโนทถกปลดปลอยออกมาดวยเทคนคนนไฮดรน (The University of Sydney, n.d.) สวนหลอดตวอยางใหน าไปบมท 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 4 ชวโมง โดยทจะเกบตวอยางทก 30 นาท จนครบ 4 ชวโมงโดยเกบตวอยางจากหลอดตวอยางเพยงหลอดเดยวตลอดทงการทดลอง น าตวอยางมาท าการเจอจาง 10 เทา โดยใชตวอยาง 100 ไมโครลตร เตมรเอเจนตนนไฮดรน 75 ไมโครลตร น าไปบมท 80 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท ตงไวใหเยนลงและเตม 50% ethanol 100 ไมโครลตร น าไปวดคาการดดกลนแสง (absorbance) ท 570 nm

ผลการวจย

การผลตเอนไซมโปรตเอสทนรอนในระบบเซลล E. coli ผลการผลตเอนไซมโปรตเอสทนรอนโดยการเตม 1 mM IPTG เขาไปเพอเหนยวน าใหเกดผลผลตทตองการ

โดยทการศกษากอนหนาน (การศกษารวมกบนางสาวดวงใจ สทธพล) พบวาท 3 ชวโมงในการเตม IPTG จะท าใหมการผลตเอนไซมโปรตเอสทนรอน ออกมาไดคาทดทสด (ภาพท 1) จงไดมการเตม 1 mM IPTG และใชเวลาบม 3 ชวโมงและพบวา เอนไซมโปรตเอสทนรอนทผลตไดมขนาดโปรตนอยท 37 kDa

ภาพท 1 SDS-PAGE แสดงการผลตเอนไซมโปรตเอสทนรอน ใน E. coli สายพนธ BL21 (DE3)

การทดสอบความสามารถในการยบยงโปรตนของ V. parahaemolyticus โดยเอนไซมโปรตเอสทนรอนดวยเทคนค SDS-PAGE ผลการทดสอบความสามารถในการยบย งโปรตนของ V. parahaemolyticusโดยใชปรมาณโปรตนทเทากนคอ ปรมาณโปรตนของ V. parahaemolyticus ท 400 ไมโครกรม (100%) และ ปรมาณโปรตนของโปรตเอสท 400 ไมโครกรม (100%) เทากน พบวาแบนของโปรตน V. parahaemolyticus ทมโปรตเอสผสมจะไมเหนแถบโปรตนเมอเทยบกบแถวทเปน V. parahaemolyticus ทไมไดมการผสมโปรตเอสลงไป (ภาพท 2)

kDa 95

72 52 42 34 26

17 10

520

BMO8-6

จากภาพท 3 และ 4 เปนการทดสอบเชนเดยวกนแตมการปรบปรมาณโปรตเอส ใหลดลงเหลอเพยง100:5, 100:10, 100:20 และ 100:40 แตยงคงใหปรมาณโปรตนของเชอคงอยท 100 เมอทดสอบกพบวาโปรตเอสยงสามารถทจะยบย งโปรตนของเชอไดแมจะมปรมาณโปรตเอสอยเพยง 100:5 ดงนนผวจยจงลดปรมาณของเอนไซมโปรตเอสทนรอนลงเหลอเพยง 100:0.1, 100:0.5, 100:1 และ 100:2.5 พบวาเอนไซมโปรตเอสทนรอนยงมความสามารถทจะยบย งโปรตนของเชอไดแมจะมปรมาณโปรตนเพยง 100:0.1 จากการวเคราะหแถบโปรตนของ V. parahaemolyticus แตจ านวน 2 แบน คอ แถบท 1 ขนาด 40 kDa และแถบท 2 ขนาด 170 kDa ดวยวธ MALDI TOF MS ซงใชหลกการของการท าใหสารตวอยางแตกตวเปนไอออนกอนการวเคราะหโดยผสมสารตวอยางกบสารแมทรกซ (matrix) ทจะท าใหตวอยางมประจ ซงจะท าใหสวนผสมระเหยกลายเปนผลกเมอสารแมทรกซถกกระตนดวยแสงเลเซอรจะท าหนาทเปนตวกลางในการถายทอดพลงงานจากแสงเลเซอรสงไปยงโปรตนหรอเปปไทดทมประจและแตกตวเปนไอออนท าใหโปรตนหรอเปปไทดสามารถเคลอนทไดและวเคราะหมวลสารดวย mass analyzer ชนด time-of-flight (TOF) ซงโปรตนหรอเปปไทดทมมวลนอยจะสามารถเคลอนทไดเรวกวาสารทมมวลมากจงเดนทางไปยงตวรบ (detector) ไดเรวกวาท าใหสามารถค านวณระยะเวลาทตวอยางเคลอนทและบอกขนาดมวลสารได และพบวาผลการตรวจแถบโปรตนทง 2 แถบไดผลการวเคราะหวาแถบโปรตน หมายเลข 1 เปน Unknown protein แต หมายเลข 2 เปนแถบโปรตนทถกยบย งดวยโปรตเอส ซงผลการตรวจสอบพบวาเปนโปรตน OmpU (Outer membrane protein) ทไดจาก Vibrio sp.

ภาพท 2 SDS-PAGE การยอยโปรตน V. p arahaemolyticus ของโปรตเอสทนรอนท 100:100

250

130

75 65

45

36

29

22 20 17

kDa

521

BMO8-7

ภาพท 3 SDS-PAGE การยอยโปรตน Vibrio parahaemolyticus ของ โปรตเอส ท 100:5, 100:10, 100:20และ 100:40 ตามล าดบ

ภาพท 4 SDS-PAGE การยอยโปรตน V. parahaemolyticus ของโปรตเอสท 100:0.1, 100:0.5, 100:1, 100:2.5 และ 100:5

ตามล าดบ

250 130 75 65

45 36

29

22 20

17

kDa 1

2

250

130

75 65

45 36 29 22 20 17

kDa 1

2

522

BMO8-8

ภาพท 5 การวเคราะหโปรตนดวย MALDI TOF ของแบนหมายเลข 2 ซงบงชวาเปน Outer membrane protein U (OmpU)

ของ Vibrio sp. JCM 19052

ภาพท 6 ปรมาณกรดอะมโนและเปปไทดทละลายน าไดทถกปลดปลอยออกมาจากการยอยโปรตนอาหารกงดวยโปรตเอส ทนรอนทวเคราะหดวยเทคนคนนไฮดรนท 0 – 4 ชวโมง อภปรายและสรปผลการวจย

เอนไซมโปรต เอสทนรอนทไดจากด เอน เอลกผสม มความสามารถในการยอยโปรตนเ ชอ V. parahaemolyticus โดยโปรตนจากเชอทถกยอยดวยโปรตเอสทนรอน คอโปรตน OmpU (ภาพท 7) (Huanyu Li et al., 2017) ซงถาหากวา OmpU ซงเปนโปรตนทผลตโดยกลมของ Vibrio sp. ถกยอยไดกนาจะมผลกระทบตอกงคอกงจะแขงแรงหรอเกดโรคไดยากขนเนองจาก OmpU จะมหนาทในการเปนตวคดเลอกสารเขาสเซลลของ Vibrio sp. ทชวยในการปองกนสารอนตรายทจะเขามาภายในและยงเพมความรนแรงใหเชอ Vibrio sp. (Soni Priya Valeru et al., 2014) จากงานวจยนจงเปนสวนหนงทบอกไดวาหากยบย งโปรตน OmpU จากเชอ Vibrio sp. ไดจะท าใหกงแขงแรงและเสยงตอการตดโรคไดยากขนเนองจากระบบภมคมกนไมโดนท าลายดวยความรนแรงของเชอ Vibrio sp.

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5

Co

nc

(uM

)

Time (hr.)

Protein shrimp feed with protease (Ninhydrin test)

With protease Without protease

523

BMO8-9

ภาพท 7 โครงสรางสามมตของ Outer membrane protein U

เอนไซมโปรตเอสทนรอนสามารถยอยโปรตนของอาหารกงใหมขนาดเลกลงใหอยในรปของกรดอะมโนหรอเปปไทดสายสนไดดกวาอาหารกงทไมมการเตมโปรตเอสทนรอน โดยทโปรตเอสทนรอนยงคงกจกรรมของเอนไซมไดในสภาวะทใชอณหภมสง ซงการทโปรตนในอาหารกงโดนยอยใหมขนาดทเลกลงท าใหกงสามารถทจะน ากรดอะมโนทเลกนไปใชไดดและมากขน ซงการทโปรตนในอาหารกงมขนาดใหญท าใหยากตอการทกงน าไปใชและท าใหการเตมโปรตนทเยอะจนเกนไปในอาหารกงอาจไมคมคาแกการเตม เนองจากกงไมสามารถน าไปใชไดหมดและโปรตนทหลงเหลออยอาจเปนผลกระทบทท าใหคณภาพน าในบอเลยงกงมคาทไมเหมาะสมตอการเลยงกง

กตตกรรมประกาศ ผวจยขอขอบพระคณ ดร.นจรน จงรจา อาจารยทปรกษาปรญญานพนธทไดใหค าแนะน า ค าปรกษาแนะน าแนวทางการวจย จนส าเรจลลวงเปนอยางดตลอดมา ขอขอบพระคณ บรษท โภคา ฟด จ ากด อยางสง ทใหความอนเคราะหในการสนบสนนทนการศกษาของงานวจยและวตถดบอาหารกงในการท าวจยในครงน ตลอดจนหองปฏบตการวเคราะหทางดานจลนทรยภาควชาจลชววทยา คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยพระจอมเกลาธนบร เอกสารอางอง กรมประมง. การจดการความร การเลยงกงขาวแวนนาไม ตามมาตรฐาน จเอพ [ออนไลน] 2558 [อางเมอ 15 พฤษภาคม 2560]. จาก https://www.fisheries.go.th/train-gr/coastal/002/GuidelineFGAP.pdf กรมประมง. ยาตานจลชพ (Antimicrobial agents) [ออนไลน] 2550 [อางเมอ 17 สงหาคม 2561]. จาก http://www.fisheries.go.th/quality/ยาตานจลชพ.pdf กรมสงเสรมการคาระหวางประเทศ. กงสด แชเยน แชแขง และแปรรป (ไมรวมกงกระปอง) [ออนไลน] 2560 [อางเมอ 23 พฤศจกายน 2560]. จาก http://www.ditp.go.th/contents_attach/166006/166006.pdf Duangjai et al. Cloning, expression, purification and characterization of a thermo- and surfactant-stable 1 protease from Thermomonospora curvata. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology; 2019. [in press] FAO. 2013. Report of the FAO/MARD Technical Workshop on Early Mortality Syndrome (EMS) or Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome (AHPNS) of Cultured Shrimp (under TCP/VIE/3304). Hanoi, Viet Nam, on

25–27 June 2013. FAO Fisheries and Aquaculture Report No. 1053. Rome. 54 pp.

524

BMO8-10

Shrimpalliance, 2017 Begins With A Large Number of Thai Shrimp Refusals for Banned Antibiotics [Online] 2017 [cited 2017 Nov 19] Available from: http://www.shrimpalliance.com/2017-begins-with-a-large-number-of-thai-shrimp-refusals-for- banned-antibiotics/

Soni Priya Valeru et al. Lack of Outer Membrane Protein A Enhances the Release of Outer Membrane Vesicles and Survival of Vibrio cholera and Suppresses Viability of Acanthamoeba castellanii. Hindawi Publishing Corporation International Journal of Microbiology Volume 2014, 2014 The University of Sydney. Microplate measurement of amino acids by ninhydrin [online] n.d. [cited 2018 Aug 13]. Available from https://sydney.edu.au/science/biology/warren/docs/microplate_aminoacids_ninhydrin.pdf

525