Biotehniška fakulteta - Univerza v Ljubljani

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJA

BIOTEHNOLOGIJA MIKROORGANIZMOV

Delovno gradivo za vaje

Marko BLAŽIČ, Neža ČADEŽ, Polona JAMNIK, Maja PAŠ, Hrvoje PETKOVIĆ

Ljubljana, 2014

Blažič, M., Čadež, N., Jamnik, P., Paš, M., Petković, H. BIOTEHNOLOGIJA MIKROORGANIZMOV, Delovno gradivo za vaje, Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Univerza v Ljubljani, 2014.

VSEBINA

Vaja Stran

Izolacija mikroorganizma iz naravnega okolja – celulolitični mikroorganizmi v zemlji (Neža Čadež) 3

Proizvodnja amilaz s plesnijo Aspergillus oryzae (Maja Paš) 6

Fermentacija mošta (Neža Čadež) 14

Izboljšanje mikroorganizma z mutacijo (Marko Blažič, Polona Jamnik, Hrvoje Petković) 27

Produkcija antibiotika oksitetraciklina z bakterijo Streptomyces rimosus (Marko Blažič, Polona Jamnik, Hrvoje Petković) 33

Bioproces z mešano biokulturo: fermentacija mleka (Neža Čadež, Maja Paš) 40

Računske naloge 44

2


IZOLACIJA MIKROORGANIZMA IZ NARAVNEGA OKOLJA – CELULOLITIČNI MIKROORGANIZMI V ZEMLJI

Neža Čadež 1 TEORETIČNE OSNOVE Učinkovita encimatska konverzija strukturnih polisaharidov v rastlinski biomasi je glavni ključ za proizvodnjo bioetanola druge generacije oz. lignoceluloznega bioetanola. Učinkovitost tega procesa temelji na učinkovitosti razgradnje kristaliničnih polisaharidov na enostavne sladkorje. Lignocelulozna biomasa, kot sta les in odpadki kmetijske proizvodnje, je zanimiv vir za proizvodnjo bioetanola zaradi visoke stopnje fermentabilnih sladkorjev. Lignocelulozna biomasa je sestavljena iz celuloze, hemiceluloze in lignina, ter v manjšem deležu tudi drugih mineralov (pepel) in drugih snovi. Celuloza predstavlja 35-50% skupne suhe biomase in je sestavljena iz dolgih verig ß-glukoznih enot povezanih z ß-1,4-glukozidno vezjo. Okoli 50-90% celuloze v lignoceluloznem materialu je povezanih lateralno z vodikovo vezjo in tvori kristalinično obliko. Glavna načina razgradnje biomase sta kislinski (240°C, redčena kislina oz. 100-200°C, koncentrirana kislina) in encimatski način. Prvi način razgradnje je predvsem neekonomičen (velika poraba energije, nizka učinkovitost: 50-60%, nujnost recikliranja kisline). Encimatska razgradnja poteka s celulazami gliv in bakterij na vnaprej pripravljenem rastlinskem materialu (mletje, obdelava s kislinami). Celuloza rastlinskega materiala je namreč zaradi kristalinične strukture, ter prisotnosti hemiceluloze in lignina nedostopna celulazam. Celulaze predstavljajo skupino encimov, ki so sestavljeni iz: endo- ß-glukanaza, ekso- ß-glukanaza in ß-glukozidaza.

Slika 1: Razgradnja celuloze s celulolitičnimi encimi (Xie s sod., 2007)

3

http://aem.asm.org/content/73/11/3536/F3.expansion.html

http://aem.asm.org/content/73/11/3536/F3.expansion.html�


Čeprav številni mikroorganizmi razgrajujejo celulozo, imajo le nekateri izmed njih sposobnost ekstracelularne razgradnje hidrolize celuloze v kristalinični obliki. Glive so glavni producenti celulaz (Trichoderma reseii, Penicillium sp.), ter le redke bakterije iz skupine aktinomicet, rodovi Cellulomonas in Thermobifida, ter Streptomyces). 2 NALOGA Izolacija in pregled kolonij bakterij in nitastih gliv iz zemlje, ki imajo celulolitično aktivnost, ter primerjava števila celulolitičnih mikroorganizmih iz različnih tipov prsti. 3 MATERIAL 3.1 VZORCI ZEMLJE - vrtna zemlja - kompost - gozdna zemlja 3.2 GOJIŠČA Celulozni-Kongo rdeči agar 0,5 g K2HPO4

0,25 g MgSO4 0,2 g Kongo rdeče 1,88 g celuloze “Sigma-cell"(20 µm

15 g agarja 2 g želatina

100 ml zemljinega ekstrakta 900 ml vodovodne vode 100 mg/ml cikloheksimida

Celulozni agar 0,5 g K2HPO4 0,25 g MgSO4 20 g celuloze “Sigma-cell"(20 µm) 15 g agarja 100 ml zemljinega ekstrakta 900 ml vodovodne vode.

3.3 APARATURE IN OPREMA - centrifuga 3.4 KEMIKALIJE - fosfatna voda (0,1 M KH2PO4, pH 7,2)

4


4 POTEK VAJE 1. V vsako plastično centrifugirko, ki vsebuje 15 ml fiziološke raztopine (PBS) aseptično zatehtajte po 5 g dveh različnih tipov zemlje. 2. Dodajte manjšo količino kroglic. 3. Vzorce vorteksirajte na vrtinčniku vsaj 1 minuto. 4. Centrifugirajte pri najnižjih obratih 5 min. 5. Vsakega vzorca nacepite po 0,1 ml na eno ploščo Celulozni-Kongo rdečega agarja in eno ploščo Celuloznega agarja. 6. Vsak vzorec redčite 10 x v 9 ml fiziološke raztopine in nanesite 0,1 ml na vsako gojišče. Razmažite z razmazovalno palčko. 7. Plošče bomo inkubirali od 7 do 21 dni pri sobni temperaturi. 8. Nastale kolonije preštejte, ocenite njihovo celulazno aktivnost (čista cona okoli kolonije) in jih poskusite uvrstiti v taksonomsko skupino (bakterije, aktinomicete, nitaste glive). 5 MERITVE, IZRAČUNI IN PREDSTAVITEV REZULTATOV Opišite rezultat, kot je navedeno v poglavju 4, točka 8. 6 LITERATURA Charles Wyman. 1996. Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Taylor &

Francis, 424 str.

Hendricks, C.W., Doyle, J.D., Hugley, B. 1995. A new solid medium for enumerating cellulose-utilizing bacteria in soil. Applied and Environmental Microbiology 61, 2016-2019.

Gusakov, A.V. 2011. Alternatives to Trichoderma reesei in biofuel production. Trends in Biotechnology 29, 419-425.

5

http://www.google.si/search?tbo=p&tbm=bks&q=inauthor:%22Charles+Wyman%22


PROIZVODNJA AMILAZ S PLESNIJO Aspergillus oryzae

Maja Paš 1 TEORETIČNE OSNOVE Škrob je shranjen v mnogih rastlinah (npr. v koruzi, krompirju, rižu, pšenici, ržu, kasavi) v obliki mikroskopsko majhnih škrobnih zrnc. Škrobna molekula je homopolimer, zgrajen le iz D-glukoznih enot, ki so med seboj povezane z α-1,4 in α-1,6 glikozidnimi vezmi. Nerazvejan enoverižni polimer, sestavljen iz 500 do 2000 glukoznih podenot, povezanih z α-1,4 glikozidnimi vezmi, je amiloza. Prisotnost α-1,6 glikozidnih vezi vodi do nastanka razvejanega polimera glukoze, amilopektina (približno 1 razvejanje na 25 glukoznih enot). Razmerje med amilozo in amilopektinom je odvisno od vrste rastline, večina škrobov pa vsebuje 15-30% amiloze. Da lahko izkoristimo škrob kot vir ogljika in energije, se mora ta polimer v človeškem prebavnem traktu najprej razgraditi do manjših izkoristljivih sladkorjev. Prav to pa morajo narediti tudi mikroorganizmi, ki se “prehranjujejo” s škrobom. Z izločanjem ekstracelularnih encimov v okolico celica razgradi substrat na komponente, ki lahko vstopajo skozi celično membrano v citosol in s tem v metabolizem (katabolizem) celice. Biosinteza amilolitičnih encimov je torej neposredno povezana z rastjo mikroorganizmov, zato pravimo, da so ti encimi primarni metaboliti. Ta način prehranjevanja mikroorganizmov (predvsem plesni in bakterij) lahko izkoristimo za proizvodnjo encimov (npr. amilaz, proteaz, celulaz) v industrijskem merilu. Vrsta in količina sintetiziranih ekstracelularnih encimov je odvisna od vrste mikroorganizma, substrata ter načina kultivacije. Mnogi mikroorganizmi sintetizirajo ekstracelularne hidrolaze (amilaze), ki omogočajo razgradnjo škroba. Glede na vez, ki jo cepijo, delimo amilaze na α-1,4-glukanaze in α-1,6-glukanaze. Endoglukanaze cepijo vezi v notranjosti škrobne molekule, eksoglukanaze pa z nereducirajočega konca verige. Produkti razgradnje škroba z amilazami so tako dekstrini, maltoza in glukoza. Med najpogostejše ekstracelularne mikrobne amilaze sodijo α-amilaze in glukoamilaze (amiloglukozidaze). α-amilaze so α-1,4 endoglukanaze, ki bodisi zmanjšajo viskoznost škroba (utekočinjanje), pri čemer nastanejo oligosaharidi (dekstrini), ali pa povzročijo nastanek večjih koncentracij mono- in disaharidov (saharifikacija). Bakterijske α-amilaze sodijo v prvo skupino, α-amilaze gliv pa cepijo 2. glikozidno vez z nereducirajočega konca ravne verige in sprostijo maltozo. Glukoamilaze (amiloglukozidaze) sproščajo glukozne ostanke z nereducirajočega konca škroba, dekstrinov ali maltoze s hidrolizo α-1,4 vezi. Imajo tudi šibko α-1,6 hidrolizno aktivnost (predvsem glukoamilaze plesni iz rodu Rhizopus), zato odcepljajo stranske verige. Slika 1 prikazuje delovanje različnih amilaz na molekulo škroba.

6


Slika 1: Delovanje amilaz na molekulo škroba (Ravi-Kumar in Umesh-Kumar, 2006)

AA - α-amilaze oz. endo 1,4-α-D-glukan glukanohidrolaze; GA – glukoamilaze oz. ekso 1,4-α-D-glukan glukanohidrolaze; BA - β-amilaze oz. ekso 1,4-α-D-glukan maltohidrolaze; PA – pululanaze oz. endo α-dekstrin 6-glukanohidrolaze; RE – reducirajoči knec; NRE – nereducirajoči konec; F – α-1,6 glikozidna vez; G – α-1,4-glikozidna vez

Med plesnimi so najpomembnejši proizvajalci ekstracelularnih encimov predstavniki rodov Aspergillus, Rhizopus, Mucor in Trichoderma. Ob prisotnosti hrane v izobilju glive intenzivno vegetativno rastejo. Do sporulacije pa pride zaradi spremenjenih pogojev v okolju, npr. pomanjkanja hranil. V primerjavi z vegetativnim razvojem gliv, ki je precej enostaven, je sporulacija zapletena in se pojavlja v različnih oblikah. Razvoj gliv in spor je najbolj kompleksen pri spolnem razmnoževanju. Spore imajo v življenju gliv dve glavni nalogi: razširitev na novo okolje ali preživetje dokler ne nastopijo ugodnejši pogoji. V okolje se sprostijo na različne načine z lizo hif ali plodišč, kjer se nahajajo. Značilne nespolne spore za višje glive (kamor sodi tudi Aspergillus oryzae) so konidiji, ki so lahko zelo različnih oblik. Na sliki 2e so prikazani konidiji glive A. oryzae.

7


Slika 2: Aspergillus oryzae; a, b-kolonije; c, d-konidiofori; e-konidiji (Samson s sod.,

2000) Bioproces proizvodnje amilolitičnih encimov lahko poteka v tekočih substratih (submerzno) ali na/v trdnih substratih. Rast plesni in ostalih mikroorganizmov na/v trdnih substratih v odsotnosti proste, sorpcijsko nevezane vode imenujemo s tujko solid state kultivacija. Kljub nizki aw vrednosti omogoča substrat mikroorganizmu nemoteno rast. “Solid state” kultivacija ima nekatere prednosti v primerjavi s submerznim načinom kultivacije: manjša možnost kontaminacije substrata zaradi nižje vsebnosti vode, majhen delavni volumen za transformacijo enake količine substrata, velika proizvodnja encima na enoto volumna bioreaktorja, enostavnejša priprava gojišča, itd. Njene slabosti pa so predvsem: slab prenos mase (kisika), neučinkovito odvajanje generirane toplote, velika poraba energije, težavno spremljanje in reguliranje bioprocesnih parametrov. Za “solid state” kultivacijo lahko uporabimo zelo enostavne bioreaktorje, brez možnosti uravnavanja bioprocesnih parametrov, npr. pladenjski in stolpni bioreaktor. V računalniško vodenih bioreaktorjih pa lahko bioproces spremljamo in deloma tudi vodimo. Uporabljajo se različni mešalni bioreaktorji, npr. horizontalni rotirajoči ali mešalni bioreaktor, vertikalni mešalni bioreaktor, bioreaktor z lebdečim slojem, tračni bioreaktor, cevni bioreaktor. S stališča masne bilance so to navadno bioreaktorji z enkratnim polnjenjem, redkeje z neprestanim polnjenjem ali z dohranjevanjem. 2 NALOGA Prireditev laboratorijskega cevnega bioreaktorja za aerobni tip kultivacije v “solid state” sistemu. Priprava trdnega gojišča in inokuluma čiste kulture Aspergillus oryzae. Proizvodnja ekstracelularnih amilaz s “solid state” kultivacijo plesni A. oryzae na/v pšeničnih otrobih. Spremljanje bioprocesa z makroskopsko kontrolo rasti plesni in z merjenjem amilolitične aktivnosti ter vrednosti pH.

8


3 MATERIAL 3.1 KULTURA Čisto kulturo plesni A. oryzae inkubiramo 7-10 dni pri 28 °C na agarju SAŠ (poševnik v demetrijevi steklenički) do zadostne sporulacije. 3.2 GOJIŠČA Sladni agar z dodatkom škroba (SAŠ) (sestava gojišča je podana v prilogi 1) služi za vzdrževanje kulture plesni A. oryzae, za indukcijo sinteze amilolitičnih encimov in za oblikovanje spor. Sterilizacija gojišča je potekala 20 min v avtoklavu pri 121 °C in tlaku 1,2 bar. Gojišče iz pšeničnih otrobov se uporablja za “solid state” kultivacijo. V čašo zatehtamo 200 g navlaženih pšeničnih otrobov (1 kg pšeničnih otrobov, ki vsebujejo okrog 10 % vode, navlažimo z 1,4 l destilirane vode). Sterilizacija gojišča je potekala 20 min v avtoklavu pri 121 °C in tlaku 1,2 bar. 3.3 APARATURE IN OPREMA Bioreaktorski sistem Laboratorijski statični kolonski bioreaktorski sistem je prikazan na sliki 3. Posamezni sestavni deli so bili sterilizirani v avtoklavu (121 °C, 20 min).

Slika 3: Laboratorijski statični kolonski bioreaktor (prirejeno po Raspor in Smole-

Možina, 1993) Ostala oprema - homogenizator Ultra-turrax - centrifuga - vodna kopel - ledena voda - spektrofotometer - pH meter

9


- mikroskop - Bürker-Türkova števna ploščica - rotameter - laboratorijska steklovina 3.4 KEMIKALIJE (REAGENTI) - fiziološka raztopina (0,01 M Na-fosfatni pufer, pH = 5) - škrobovica (0,5 % raztopina škroba v 0,04 M fosfatnem pufru, pH = 6) - jodovica (8·10-4 M J2 + KJ) 4 POTEK VAJE 4.1 PRIPRAVA INOKULUMA Namnoženo kulturo A. oryzae aseptično prelijemo s 30 mL fiziološke raztopine, ki mu je bilo dodanih nekaj kapljic Tweena za lažje dispergiranje hidrofobnih spor. S cepilno zanko sprostimo spore v sterilno tekočino v demetrijevi steklenički. Z direktnim štetjem pod mikroskopom s pomočjo Bürker-Türkovih števnih ploščic (slika 4) določimo koncentracijo spor v suspenziji (inokulumu). Pred nanosom na števno ploščico inokulum po potrebi razredčimo po Kochu.

Slika 4: Bürker-Türkova števna ploščica (Brand on line catalogue, 2008) Na Bürker-Türkovi števni ploščici je vgravirana mreža, sestavljena iz 9 velikih kvadratov – površina vsakega izmed njih je 1 mm2. Veliki kvadrati so razdeljeni na 16 manjših, katerih stranice so dolge 0,2 mm. V sredini števne ploščice je vsak takšen kvadrat (s stranico 0,2 mm) razdeljen še na 16 manjših kvadratov – stranice teh najmanjših kvadratov merijo 0,05 mm (njihova površina je 0,0025 mm2). 4.2 PRIPRAVA BIOREAKTORSKEGA SISTEMA IN ZAGON BIOPROCESA (INOKULACIJA) Iz koncentracije spor v inokulumu izračunamo potreben volumen inokuluma, da bo začetna koncentracija spor v gojišču takoj po inokulaciji 1·106 spor·g-1. Izračunani volumen inokuluma aseptično prenesemo v 200 g pšeničnih otrobov in dobro premešamo, da se spore čim enakomerneje razporedijo po gojišču.

10


Na dno bioreaktorske posode (steklena kolona) prenesemo frito in kolono napolnimo do 2/3 z inokuliranim gojiščem. Pazimo, da se vsebina bioreaktorja ne posede (ne tlačimo, stresamo, ipd.). Sestavimo posamezne sestavne dele laboratorijskega statičnega kolonskega bioreaktorskega sistema, kot prikazuje slika 3. Delamo aseptično. Sestavljen in napolnjen bioreaktorski sistem prenesemo v komoro, kjer bo potekal bioproces. Temperaturo termostata uravnamo na 28°C. Z rotametrom uravnamo pretok zraka za aeracijo na 60 l·h-1 ter ga povežemo z bioreaktorskim sistemom. 4.3 NADZOR (SPREMLJANJE) BIOPROCESA Dogajanje v bioreaktorju med bioprocesom spremljamo na več načinov: - vizualno

Opisno vrednotimo preraščenost gojišča s plesnijo, prisotnost spor. - z vzorčenjem in merjenjem vrednosti pH ter amilolitične aktivnosti vzorcev

Med potekom bioprocesa trikrat vzorčimo: ob času 0 (takoj po inokulaciji), med bioprocesom in na koncu bioprocesa. Vzorce shranimo v zmrzovalniku (pri -18 °C) do analiz.

4.4 ANALIZE VZORCEV Merjenje vrednosti pH Vzorce odmrznemo in iz njih ekstrahiramo amilaze po spodaj prikazanem analitičnem postopku (A). V nerazredčenem supernatantu izmerimo vrednost pH s predhodno umerjenim pH metrom. Analiziramo 2 paralelki istega vzorca. Spektrofotometrično določanje amilolitične aktivnosti (modificirana metoda po Fuwi) Amilolitično aktivnost (AA) posredno vrednotimo s spektrofotometričnim določanjem preostalega škroba po inkubaciji z vzorci, ki so amilolitično aktivni. Enota amilolitične aktivnosti pomeni razgradnjo 0,1 mg topnega škroba v minuti.

11


Analitični postopek za določanje amilolitične aktivnosti vzorcev: A)

0,5 g vzorca + 5 ml dest. H2O ↓

homogenizacija (1 min) ↓

centrifugiranje (4000 min-1, 5 min) ↓

odlitje supernatanta ↓

redčenje supernatanta po Kochu ↓

--------------------------------------------------------------------------------- B)

1 ml razredčenega supernatanta + 1 ml škrobovice ↓

inkubacija 10 min, 40 °C ↓

hitro hlajenje v ledeni vodi ↓

0,2 ml inkubata + 5 ml jodovice ↓

razvitje barve (10 min na sobni temperaturi) ↓

merjenje A (λ = 600 nm)*

* A600 mora biti v linearnem območju umeritvene krivulje A600 v odvisnosti od koncentracije topnega škroba. Če je A600 prenizka, vzorec (supernatant) dodatno razredčimo, če je previsoka, vzamemo manj razredčen vzorec oz. podaljšamo čas inkubacije pri 40 °C.

Slepi vzorec Po postopku B), le da 1 ml supernatanta dodamo škrobovici po 10-min inkubaciji pri 40 °C. Umeritvena krivulja Pripravimo raztopine topnega škroba v koncentracijskem območju od 0 do 5 mg·ml-1. Odpipetiramo po 0,1 ml vsake raztopine, dodamo 0,1 ml dest. vode in 5 ml jodovice. Po razvitju barve (10 min na sobni temperaturi) izmerimo A600. Narišemo graf odvisnosti A600 od koncentracije topnega škroba. Izračun amilolitične aktivnosti vzorcev (AA·g-1) vzorec: A600 → konc. nerazgrajenega škroba (cvz.) slepi vzorec: A600 → konc. celokupnega škroba (csl. vz.) konc. razgrajenega škroba (Δc): Δc = csl. vz. - cvz.

gAA =

tc

·1-mg·min 0,1 ml 1 · 10 ·R · ∆ (1)

R … razredčitev vzorca t … čas inkubacije pri 40 °C (min)

12


5 MERITVE, IZRAČUNI IN PREDSTAVITEV REZULTATOV 5.1 MERITVE - umeritvena krivulja (cškroba, A600) - vrednost pH (vzorci), A600 (vzorci in slepi vzorci), amilolitična aktivnost - opis rasti plesni med bioprocesom (rezultati vizualnega spremljanja bioprocesa) 5.2 IZRAČUNI - koncentracija spor v inokulumu (spor·ml-1) - volumen inokuluma (ml) - amilolitična aktivnost vzorcev (AA·g-1) 5.3 PREDSTAVITEV REZULTATOV (GRAFIČNO) - umeritvena krivulja odvisnosti A600 od cškroba (graf) - vrednost pH in amilolitična aktivnost vzorcev v odvisnosti od časa trajanja bioprocesa

(graf) 6 LITERATURA

Brand on line catalogue, 2008, http://catalog.brand.de/, julij, 2008.

Prosser, J. I. 1995. Kinetics of filamentous growth and branching. V: The growing fungus. Gow, N. A. R., Gadd, G. M. (ur.). London, Chapman & Hall: 301-318.

Raspor, P., Smole-Možina, S. 1993. Praktikum iz biotehnologije. Ljubljana, BIA: 109-115.

Raspor, P., Kovač, B. 1996. Bioreaktorji s trdnimi gojišči. V: Biotehnologija, osnovna znanja. Raspor, P. (ur.). Ljubljana, BIA: 459-473.

Ravi-Kumar, K., Umesh-Kumar, S. 2006. Bioprocessing of starch using enzyme technology. V: Food biotechnology. Shetty, K., Paliyath, G., Pometto, A., Levin, R. E. (ur.). Boca Raton, CRC Press, Taylor & Francis Group: 709-722.

Samson, R. A., Hoekstra, E. S., Frisvad, J. C., Filtenborg, O. 2000. Introduction of food- and airborn fungi, Sixth edition. Utrecht, Centraalbureau voor Schimmelcultures: 81.

7 PRILOGE Priloga 1. Sladni agar z dodatkom škroba (SAŠ)

kvasni ekstrakt 4 g glukoza 4 g sladni ekstrakt 30 g škrob 5 g agar 20 g destilirana voda do 1000 ml

13


FERMENTACIJA MOŠTA

Neža Čadež 1 TEORETIČNE OSNOVE Fermentacija grozdnega soka v vino je kompleksen mikrobiološki proces, ki obsega postopno rast in/ali prevlado različnih mikroorganizmov, kot so kvasovke in bakterije. Med mikroorganizmi imajo kvasovke daleč največji pomen, saj imajo sposobnost pretvorbe sladkorjev grozdja v etanol, ogljikov dioksid ter v ostale pomembne metabolite, ki oblikujejo senzorične lastnosti vina. V tradicionalni tehnologiji je fermentacija grozdnega soka spontan bioproces – za pretvorbo grozdnega soka v mošt / vino so odgovorne kvasovke, ki so prisotne na grozdnih jagodah ter na kletarski opremi. V grozdnem soku so najpogosteje prisotne vrste z nizko fermentativno sposobnostjo Hanseniaspora uvarum, Candida stellata, Metschnikowia pulcherrima, ter nefermentativne bazidiomicetne kvasovke rodov Cryptococcus in Rhodotorula. Na začetku spontane fermentacije v moštu prevladajo hitro rastoče kvasovke Hanseniaspora uvarum in Candida stellata, ki s produkcijo višjih alkoholov, acetaldehida, etil acetata in acetoina pripomorejo k polnejšem okusu in aromi vina. Naraščajoče koncentracije etanola, ki nastaja kot glavni produkt fermentacije, zavrejo rast tako imenovanih »ne-Saccharomyces« kvasovk in omogočijo prevlado vrsti Saccharomyces cerevisiae, glavni kvasovki fermentacije mošta. Sodobna proizvodnja vin temelji na uporabi selekcioniranih kultur vrste S. cerevisiae kot starter kulture, ki jo dodajo po žveplanju mošta. Namen je zavrtje rasti naravne mikrobne združbe mošta. Dodana starter kultura skrajša pretvorbo sladkorjev v etanol v primerjavi s spontanimi alkoholnimi fermentacijami. Pri vzpodbujenih fermentacijah so manjše razlike med vini v zaporednih letnikih in večja skladnost v senzoričnih lastnostih določenega vina v okviru geografskega področja. Kljub temu pa uporaba starter kulture S. cerevisiae ne prepreči rasti in metabolne aktivnosti endogeno prisotnih kvasovk in bakterij, med katerimi so lahko prisotni tudi kvarljivci vina. Med fermentacijo mošta se koncentracija kvasovk poveča z začetnih 104–106 cfu/ml na 108–109 cfu/ml. Rast opišemo z rastno krivuljo, ki je značilna za rast mikroorganizmov v bioprocesu z enkratnim polnjenjem. Na rastno kinetiko vplivajo številni dejavniki kot so žveplanje, temperatura fermentacije, sestava mošta in vrstna sestava kvasovk. Rast kvasovk in njihovo metabolno aktivnost spremljamo s štetjem kvasovk, produkcijo etanola in porabo fermentabilnih sladkorjev. Biokemijsko je pretvorba grozdnega soka v mošt/vino alkoholna fermentacija, pri kateri se glukoza in fruktoza pretvorita po anaerobni poti v etanol in ogljikov dioksid, pri čemer pridobi kvasovka energijo v obliki dveh molekul ATP: C6H12O6 + 2ADP + 2Pi → 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP Med fermentacijo poleg etanola nastajajo tudi sekundarni metaboliti kot so višji alkoholi (najpomembnejši je glicerol), organske kisline (piruvična, ocetna, jantarna in jabolčna) ter estri, aldehidi, ketoni in hlapne žveplove spojine. Različne vrste in sevi mikroorganizmov, ki sodelujejo pri fermentaciji mošta, prispevajo k pestrejši aromi vina. To je razlog, da je raziskovanje populacij mikroorganizmov v vinih in vplivov nanje zelo pomembno.

14


2 NALOGA Cilji vaje so ovrednotiti vpliv različnih vrst in sevov kvasovk na kinetiko bioprocesa - fermentacijo mošta. Primerjali bomo potek (1) spontane fermentacije mošta, (2) vzpodbujene fermentacije mošta s tremi različnimi starter kulturami in (3) potek fermentacije mošta, ki mu bo dodan kvarljivec vina (kvasovka Dekkera bruxellensis). Fermentacijo mošta bomo spremljali z mikrobiološkimi in kemijskimi analizami. 3 MATERIAL 3.1 KULTURA (SEVI) - sev iz Zbirke industrijskih mikroorganizmov ZIM 1927, Saccharomyces cerevisiae izoliran iz spontane fermentacije mošta - komercialni starter Lalvin EC 1118 (Lallemand, Kanada), Saccharomyces cerevisiae/bayanus - komercialni starter VIN 13 (Anchor Bio-Technologies, Južna Afrika), Saccharomyces cerevisiae - sev iz Zbirke industrijskih mikroorganizmov ZIM 701, kvarljivec vrste Dekkera bruxellensis izoliran iz spontane fermentacije mošta 3.2 GOJIŠČA - gojišče YPD (Yeast Mold Agar, Difco) - fermentacijska gojišča z Durhamovimi cevkami (2 % sladkorja, 1 % pepton) 3.3 APARATURE IN OPREMA - anaerobni bioreaktorji (1 l erlenmajerice z vrelnimi vehami) - mikroskopi - HPLC - računalniški program za identifikacijo kvasovk »Yeast identification PC program«, ver. 4, 1996 3.4 KEMIKALIJE - fosfatna voda (0,1 M KH2PO4, pH 7,2) - stripi API ID32C (bioMérieux) - metilensko modrilo 4 POTEK VAJE 4.1 ZAČETEK FERMENTACIJE Priprava inokuluma

Skupina 1: Sev iz Zbirke industrijskih mikroorganizmov ZIM 1927, Saccharomyces cerevisiae izoliran iz spontane fermentacije mošta Polno cepilno zanko kulture prenesemo s plošče v 10 ml fiziološke raztopine (fosfatna voda) v bakteriološki epruveti. Koncentracijo celic v suspenziji določimo z neposrednim štetjem celic pod mikroskopom (navodilo na naslednji strani). Izračunamo volumen

15


suspenzije kvasovk, s katerim moramo inokulirati 1 l mošta, da bo začetna koncentracija kvasovk v moštu 1 x 106 celic/ml. Skupina 2: Komercialni starter Lalvin EC 1118 (Lallemand, Kanada), Saccharomyces cerevisiae/bayanus Priprava inokuluma bo potekala po navodilih proizvajalca (Priloga 1). Zatehtamo tolikšno količino starter kulture, ki bo zadostovala za inokulacijo 1 l mošta. Skupina 3: Komercialni starter VIN 13 (Anchor Bio-Technologies, Južna Afrika), Saccharomyces cerevisiae Priprava inokuluma bo potekala po navodilih proizvajalca (Priloga 1). Zatehtamo tolikšno količino starter kulture, ki bo zadostovala za inokulacijo 1 l mošta. Skupina 4: Komercialni starter Lalvin EC 1118 (Lallemand, Kanada) z dodatkom kvarljivca vrste Dekkera bruxellensis ZIM 701 Priprava inokuluma bo potekala po navodilih proizvajalca (Priloga 1). Zatehtamo tolikšno količino starter kulture, ki bo zadostovala za inokulacijo 1 l mošta. V mošt bomo dodali tudi sev ZIM 701 vrste Dekkera bruxellensis, tako da bo njegova začetna koncentracija 1 x 107 celic/ml. Polno cepilno zanko kulture prenesemo s plošče v 10 ml fiziološke raztopine (fosfatna voda) v bakteriološki epruveti. Koncentracijo celic v suspenziji določimo z neposrednim štetjem celic pod mikroskopom. Skupina 5: Ni dodatka kvasovk Nastavitev fermentacije mošta Fermentacije bodo potekale v 1 l Erlenmayerjevih steklenicah, na katere bomo namestili vrelne vehe, pri sobni temperaturi. Bioproces bomo spremljali z vzorčenjem (s steklenimi pipetami bomo aseptično odpipetirali 5 ml bioprocesne brozge in jo prenesli v bakteriološke epruvete) in analiziranjem vzorcev. Določanje koncentracije mikroorganizmov na začetku fermentacije

a) Neposredno štetje celic pod mikroskopom z Bürker-Türkovo ploščico

Na Bürker-Türkovo ploščico s kapalko nanesemo kapljico vzorca in pokrijemo s krovnim steklom. Rahlo pritisnemo, da odvečna tekočina izteče. Pod mikroskopom (400 X povečava) poiščemo prikazani vzorec in preštejemo celice v enem od izbranih pravokotnikov/kvadratov. Število celic določimo v najmanj petih enakih pravokotnikih/kvadratih in izračunamo povprečje. Iz povprečnega števila celic in podatkov o velikosti komor (Slika 1) določimo koncentracijo celic v mikrolitru vzorca:

Št. celic / µl · = V kvadrata (mm3)

Redčitev Št. celic v kvadratu

16


Globina komore je 0,1 mm.

Slika 1: Mreža Bürker-Türkove ploščice s podatki o velikosti komor Za oceno razmerja živih/mrtvih celic že pripravljenemu preparatu na Bürker-Türkovi ploščici dodamo kapljico metilenskega modrila in ocenimo razmerje živih (neobarvanih) in neživih (modrih), tako da najprej preštejemo vse celice v vidnem polju in nato preštejemo le modre celice.

b) Posredna določitev koncentracije celic z redčenjem in nacepitvijo na gojišče YPD Z redčenjem po Kochu iz 1 ml mošta pripravimo redčitveno vrsto do redčitve 10-4. Po 0,1 ml vsake redčitve nanesemo na plošče s hranilnim agarjem YPD (Yeast-Peptone-Dextrose agar, Sigma, ZDA). Vzorec razmažemo s sterilnimi steklenimi kroglicami (približno 30 kroglic). Razmazovanje poteka v različnih smereh in v krogu. Delamo v dveh paralelkah. Priprava vzorca za kemijske analize S tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC) določimo koncentracije glukoze, fruktoze in etanola v vzorcih. 2 ml vzorca z brizgalko prefiltriramo skozi membranske filtre s premerom por 0,45 µm v steklene viale in jih zamrznemo do analize. 4.2 PO 4 DNEH FERMENTACIJE Določitev koncentracije kvasovk v moštu na začetku fermentacije (posredna določitev) Preštejemo kolonije kvasovk na števnih ploščah in izračunamo koncentracijo celic na začetku fermentacije (cfu/ml). Opis morfologije kolonij na ploščah in ocenitev števila prevladujočih tipov kolonij

Glede na opise kolonij v Prilogi 2 določimo prevladujoče kolonije na števnih ploščah in ocenimo njihov delež. Pregled morfologije prevladujočih tipov kolonij pod mikroskopom Glede na opise morfologije celic v Prilogi 3 opišemo morfologijo prevladujočih kvasovk. Na objektno stekelce kanemo kapljico vode in v njej z ezo suspendiramo kolonijo kvasovk. Pokrijemo s krovnim steklom. Mikroskopiramo pod 1000x povečavo z imerzijskim oljem.

0.2 mm

0,05 mm

17


Izolacija čiste kulture za identifikacijo Vsaka skupina izolira po eno reprezentativno kolonijo za nadaljnjo identifikacijo. Na agar ploščo (YPD) razmažemo kolonijo za izolacijo čiste kulture. Določanje koncentracije mikroorganizmov po treh dneh fermentacije

Določimo skupno število mikroorganizmov v moštu po treh dneh fermentacije z neposredno in posredno metodo štetja mikroorganizmov v vzorcu. Ocenimo tudi razmerje med živimi in mrtvimi celicami. Priprava vzorca za kemijske analize

Vzorec pripravimo po enakem postopku kot je opisano v točki 4.1. 4.3 PO 7 DNEH FERMENTACIJE Določitev koncentracije kvasovk v moštu po 3 dneh fermentacije

Preštejemo kolonije kvasovk na števnih ploščah in izračunamo koncentracijo celic po treh dneh fermentacije (cfu/ml). Opis morfologije kolonij na ploščah in ocenitev števila prevladujočih tipov kolonij

Po enakem postopku kot v točki 4.2. Identifikacija izbranega izolata kvasovke s fermentacijskimi testi in komercialnimi testi API strip 32C Preverjali bomo sposobnost fermentacije treh različnih sladkorjev (glukoza, maltoza in saharoza). V fermentacijska gojišča s cepilno zanko prenesemo čisto kulturo izbrane kolonije kvasovke (točka 4.2). Po treh dneh inkubacije pri 28 °C odčitamo sposobnost tvorbe plina. V ampulo z gojiščem API (7 ml) dodamo kulturo do rahle motnosti. V luknjice na stripih z različnimi sladkorji nanesemo po 135 µL suspenzije in inkubiramo 3 dni pri 28 °C. Določanje koncentracije mikroorganizmov po enem tednu fermentacije Po enakem postopku kot je opisan v točki 4.1. Priprava vzorca za kemijske analize Po enakem postopku kot je opisan v točki 4.1. 4.4 ZAKLJUČEK FERMENTACIJE Določitev koncentracije kvasovk v moštu po 7 dneh fermentacije Preštejemo kolonije kvasovk na števnih ploščah in izračunamo koncentracijo celic po sedmih dneh fermentacije (cfu/ml).

18


Opis morfologije kolonij na ploščah in ocenitev števila prevladujočih tipov kolonij

Po enakem postopku kot v točki 4.2. Identifikacija izolata kvasovke z računalniškim programom »Yeast identification PC program: version 4«. Odčitamo rezultate fermentacijskih testov in testov API strip 32C ter izpolnimo obrazce v prilogah 5 in 7. Podatke vnesemo v računalniški program »Yeast identification PC program: version 4«, s katerim identificiramo izbrani izolat. Obdelava rezultatov kemijskih analiz Pregled kromatogramov (HPLC) in prikaz izračuna koncentracije enega izmed sladkorjev v vzorcu.

5 MERITVE, IZRAČUNI IN PREDSTAVITEV REZULTATOV 5.1 MERITVE - Tabelarični prikaz rezultatov neposrednega in posrednega štetja celic v različnih

stopnjah fermentacije. - Tabelarični prikaz rezultatov kemijskih analiz mošta. 5.2 IZRAČUNI Maksimalna specifična hitrost rasti:

µmax1t2t

1lnX2lnX

−

−=

Izkoristek substrata za tvorbo produkta:

kSzSP - PΥ zK

P/S−

=

5.3 PREDSTAVITEV REZULTATOV - Grafični prikaz rastne krivulje kvasovk, porabe sladkorjev in tvorbe produktov (etanol, glicerol, ocetna kislina) v odvisnosti od časa - Identifikacija izbranega izolata s komentarjem 6 LITERATURA

Boulton, R.B., Singleton, V.L., Bisson, L.F., Kunkee, R.E. 1996. Principles and practices of winemaking. New York, ZDA, Chapman & Hall, 604 str.

19


Egli, C.M., Edinger, W.D., Mitrakul, C.M., Henick-Kling, T. 1998. Dynamics of indigenous and inoculated yeast populations and their effect on the sensory character of Riesling and Chardonnay wines. Journal of Applied Microbiology, 85: 779-789.

Fleet, G.H., Heard, G.M. 1993. Yeasts: growth during fermentation. V: Wine microbiology and biotechnology. Fleet G.H. (ed.). Philadelphia, PA, Harwood Academic Publishers: 27-54.

Mills, D.A., Johannsen, E.A., Cocolin, L. 2002. Yeast diversity and persistence in botrytis-affected wine fermentations. Applied and Environmental Microbiology, 68: 4884-4893.

Raspor, P. 2002. Pomen mikrobiologije in biotehnologije v proizvodnji vina. Ljubljana, Slovenija: Biotehniška fakulteta, Odd. za živilstvo. 184 str.

7 PRILOGE Priloga 1: Navodila za uporabo komercialnih starterjev Lalvin EC-1118 in VIN 13

20


Priloga 2: Opis kolonij vrst kvasovk, ki jih pričakujemo med fermentacijo Vrsta Barva Površina Rob Profil

Hanseniaspora uvarum

Temno zelena, svetlo zelenkast prstan

Gladka Gladek Ploščat, vzpetina v sredini

Candida stellata Temno zelena Gladka Gladek Izbokel

Metschnikowia pulcherrima

Rdeča Gladka Gladek

Izbokel, vzpetina v sredini

Saccharomyces cerevisiae

Bela Gladka Gladek Izbokel

Dekkera bruxellensis Bela, drobna Gladka Gladek Izbokel

21


Priloga 3: Opis morfologije celic vrst kvasovk, ki jih pričakujemo med fermentacijo

VRSTA KVASOVK

MORFOLOŠKE LASTNOSTI CELIC

BRSTENJE OBLIKA CELIC

Hanseniaspora uvarum

Bipolarno Apikulatne (limonaste), posamezne, pari

Candida stellata Multilateralno Okrogle-ovalne,

posamezne, v parih, v skupkih

Metschnikowia pulcherrima

Multilateralno Ovalne, posamezne, v parih

Saccharomyces cerevisiae

Multilateralno Okrogle-ovalne, posamezne, skupki

Dekkera bruxellensis

Multilateralno, večinoma na polih

Ovalne-podolgovate, posamezne, pari, verižice, skupki

22


Priloga 4: Obrazec za vpis rezultatov testov API strip 32C

23


Priloga 5: Oznake testov za prepis rezultatov iz testa API strip 32C v standardni obrazec

D-GALaktose C2 cycloheximide (ACTidione) O1 D-SACharose (sukroza) C10 N-Acetyl-Glucosamine LAcTic acid C38 L-ARAbinose C7 D-CELlobiose C14 D-RAFfinose C19 D-MALtose C11 D-TREhalose C12 K-2-KetoGluconate C33 Methyl-aD-Glucopyranoside D-SORbitol C28 D-XYLose C6 D-RIBose C5 GLYcerol C23 L-RHAmnose C9 PaLatinosE ERYthritol C24 D-MELibiose C17 Na-GlucuRonaTe C36 D-MeLeZitose C20 K-GlucoNaTe C35 levulinic acid (LeVulinaTe) D-MANitol C29 D-LACtose (bovine origin) C18 INOsitol C31 D-GLUcose C1 L-SorBosE C3 GLucosamiNe C4 ESCulin ferric citrate

24


Priloga 6: Standardni obrazec za vpis rezultatov identifikacije kvasovk

F1 D-Glucose F2 D-Galactose F3 Maltose

F5 Sucrose F8 Lactose

Cl D-Glucose C2 D-Galactose C3 L-Sorbose C4 D-Glucosamine C5 D-Ribose C6 D-Xylose C7 L-Arabinose C8 D-Arabinose C9 L-Rhamnose Cl0 Sucrose C11 Maltose * Cl2 α, α -Trehalose Cl3 Me α-D- glucoside Cl4 Cellobiose Cl5 Salicin Cl6 Arbutin Cl7 Melibiose Cl8 Lactose C19 Raffinose C20 Melezitose C21 Inulin C22 Starch C23 Glycerol C24 Erythritol C25 Ribitol

C26 Xylitol C27 L-Arabinitol C28 D-Glucitol C29 D-Mannitol C30 Galactitol C31 myo-Inositol C32 D-Glucono-1,5-lactone C33 2-Keto-D-gluconate** C34 5-Keto-D-gluconate C35 D- Gluconate C36 D- Glucuronate C37 D-Galacturonate C38 DL-Lactate *** C39 Succinate *** C40 Citrate *** C41 Methanol C42 Ethanol C43 Propane 1,2 diol C44 Butane 2,3 diol

Nl Nitrate N2 Nitrite N3 Ethylamine N4 L-Lysine N5 Cadaverine N6 Creatine N7 Creatinine N8 Glucosamine N9 Imidazole

T1 at 25°C T2 at 30 °C T3 at 35°C T4 at 37°C T5 at 40°C O1 0.01% Cyclohex. O2 0.1% Cyclohex. O3 1% Acetic acid O4 50% D-Glucose O5 60% D-Glucose

Ml Starch production M2 Acetic acid production M3 Urea hydrolysis M4 Diazonium Blue B reaction

Oznaka izolata Datum

25


1. MORFOLOGIJA KOLONIJ Rdeč pigment v gojišču DA NE ? Rob kolonije GLADEK NAGUBAN ? Barva kolonije BELA KREMAST ORANŽNA ROZA-RDEČA RJAVO-RUMENA TEMNO RJAVA DO ČRNA Površina kolonij GLADKA HRAPAVA BRADAVIČASTA NAKODRANA GLADKA Z MICELIJEM V GOJIŠČE Tekstura kolonij SLUZASTA MAZLJIVA TRDA

2. MORFOLOGIJA CELIC IN NAČIN REPRODUKCIJE Filamenti BREZ PSEUDOHIFE HIFE Vegetativna reprodukcija CEPITEV BRSTENJE Oblika celic LIMONASTE TRIKOTNE LUNASTE OKROGLE OVALNE PODOLGOVATE VRETENASTE ?

Oznaka izolata Datum

26


IZBOLJŠANJE MIKROORGANIZMA Z MUTACIJO

Marko Blažič, Polona Jamnik, Hrvoje Petković 1 TEORETIČNE OSNOVE Variabilnost “genskega materiala” (npr. DNA, Slika 1), oziroma njegovo vzdrževanje in zaščita je za vsako celico ključnega pomena, saj se nanaša na procese delovanje kot tudi preživetja, tako kratkoročno, kot tudi dolgoročno v smislu prilagajanja na novo okolje oziroma spremenjene pogoje življenja. Poškodbe genskega material (dednine) ima lahko za posledico velike spremembe v delovanju mikro(organizma), tako v pozitivnem, kot tudi v negativnem smislu. Pogosto pa so lahko spremembe nevtralne, torej ne vplivajo na delovanje celice oziroma organizma. Pomanjkanje ali pa zmanjšanje učinkovitosti celičnih procesov, ki zagotavljajo stabilnost genske informacije, kot so npr. aktivnost DNA-polimeraze, sistemov za korekcijo napak v DNA (npr. “mismatch repair”), lahko posledično privede do povečanja genske variabilnosti. Veliko je vzrokov za spreminjane dednine. Lahko jih razdelimo v dve skupini:

1) Spontane spremembe, ki se lahko zgodijo v času procesa replikacije DNA in tudi pri nastanku nepravilnih kemijskih vezi med nukleotidi v DNA in drugih znotrajceličnih procesih.

2) DNA vseh živih organizmov pa podleže tudi spremembam, ki so posledica delovanja zunajceličnih vplivov, kot so delovanje različnih kemijskih mutagenov in različnih vrst fizičnih mutagenov, kot so UV-sevanje, rentgensko in ostale oblike sevanja, ki lahko povzročajo »inducirane mutacije«.

Pod pojmom »mutacije« najbolj pogosto razumemo majhne spremembe v strukturi DNA, kot so npr. zamenjave baznih parov/nukleotidov, manjše »delecije« in »insercije« (izguba ali pa pridobitev dodatnih baznih parov/nukleotidov). Včasih, pa so te spremembe lahko tudi velike in obsegajo prerazporeditve DNA, kot so translokacija, amplifikacija in velike delecije. Možne so tudi velike spremembe v DNA oziroma celih kromosomih, ki so lahko posledica rekombinacije in segregacije celih kromosomov. Mutacije lahko povzročijo spremembo fenotipa celice oziroma organizma, pogosto pa tudi povzročajo smrt celice. Variabilnost genskega materiala ima s stališča vsakodnevnega življenja seveda negativni prizvok. Vendar ima variabilnost genskega materiala v evolucijskem smislu pomembno in »pozitivno« vlogo. Tudi pri razvoju novih tehnologij (razvoju industrijskih bioprocesov) nenehno izboljšujemo industrijske mikroorganizme. Prav s pomočjo prikladnih mutagenih sredstev spodbujamo tvorbo mutacij. Z intenzivnimi postopki selekcije pa nato poskušamo iz velike števila mutant selekcionirati prav tiste, ki imajo izboljšane oziroma želene lastnosti.

1.1 SPONTANE SPREMEMBE DNA Spontane spremembe v strukturi DNA se lahko zgodijo v času replikacije DNA, procesa t.i. »semikonzervativnega« procesa podvojitve DNA (Slika 2), v času, ko se zgodi največje število napak.

27


Slika 1: Purinske in pirimidinske baze, sestavni del DNA in RNA (1A) in

nukleotidi, ki sestavljajo dvojno vijačnico DNA

Slika 2: Shematski prikaz replikacije DNA

(www.bio.miami.edu/dana/104/104F02_10.html) Nepravilno združevanje nukleotidov je še dodatno izraženo v primeru nepravilnega oziroma ne-optimalnega delovanje encimov, ki sodelujejo pri replikaciji DNA (npr. DNA polimeraza z različnimi podenotami) ali pa encimov, oziroma procesov za popravljanje napak pri sintezi DNA (Slika 2).

Purini

Pirimidini

A B

Adenin Gvanin

Timin Citozin Uracil

28


Vsaka baza v strukturi DNA lahko preide v t.i. tavtomerno obliko ali pa lahko pride tudi do spontane deaminacije, ki povzroči nepravilno združevanje nukleotidov (Slika 3).

Slika 3: Spontana deaminacija adenina in citozina. Spontana deaminacija

adenina povzroči tvorbo hipoksantina, ki pa lahko tvori par nepravilni par s citozinom, kar povzroči posledično tranzicijo AT para v CG.

1.2 INDUCIRANE MUTACIJE Inducirane poškodbe DNA pa nastanejo kot posledica posrednih ali pa neposrednih interakcij zunajceličnih vplivov, kot so npr. kemijski in fizični mutageni. Poškodbe DNA so lahko strukturno zelo raznolike in jih povzročajo lahko najrazličnejše spojine, ki reagirajo z DNA. V postopkih selekcije in izboljševanja industrijskih mikroorganizmov pogosto uporabljamo n-metil-n'-nitro-n-nitrozogvanidin (MNNG), ki lahko modificira (metilira) gvanin na poziciji kisika O6. Tako modificiran O6-metil-gvanin lahko tvori di-nukleotidni par s timinom, namesto s citozinom (Slika 4). Drugi primer inducirane mutacije, s katerim se srečujemo vsi, pa je delovanje ultravijolične (UV) svetlobe. UV svetloba povzroča tvorbo reaktivnih zvrsti, kot so vodikov peroksid in radikali, ki reagirajo z DNA in na ta način vnašajo poškodbe. Ultravijolična svetloba povzroča tudi tvorbo dimerov pirimidina, ki posledično lahko razen same mutacije povzročijo tudi smrt celice (Slika 5). Tudi obsevanje z UV svetlobo se rutinsko izvaja pri klasičnih metodah izboljševanja delovnih mikroorganizmov v industrijskih okoljih.

Tranzicija: GC v AT Tranzicija: AT v GC

Adenin Hipoksantin

Citozin Uracil

29


N

N

O

NH2

N

N

O

OCH3

N

N

O

O

N

N

O

NH2CH3

+ UV

PR

T C TC

Za izboljšavo industrijskih kultur mikroorganizmov se uporabljajo različni postopki t.i. inducirane mutageneze z uporabo različnih mutagenih sredstev z namenom povečevanja variabilnosti, ki se nanašajo na ciljne lastnosti delovnega mikro(organizma). Želene lastnosti industrijskih mikroorganizmov obsegajo tako dvig donosa ciljnega produkta, kot tudi druge morfološke in fiziološke lastnosti, kot so stabilnost, robustnost, zmanjšana poraba komponent gojišča in potrebi po kisiku, odpornost na različne topila ali kemikalije, ki se nahajajo v gojišču. Postopek mutageneze je zato zelo natančno optimiziran na način, da povzroča kar največje število pozitivnih oziroma želenih mutacij, kar dosežemo z optimalno dozo mutagena in z razvojem postopkov selekcije, ki imajo razen samega postopka mutageneze ključno vlogo glede uspešnosti. Da bi zagotovili uspešnost postopka selekcije, je potrebno v kratkem času testirati veliko število klonov (kolonij), zato so danes v industriji ti procesi vedno bolj avtomatiziran in robotizirani. Temu pa seveda sledijo tudi analitske metode.

Gvanin Timin O6-metilGvanin

A B

Slika 4: Metilacija gvanina na poziciji kisika na 6 ogljikovem atomu lahko povzroči nepravilno vezavo gvanina s timinom in s tem lahko povzroči tranzicijo CG para v AT (A). Struktura n-metil-n'-nitro-n-nitrozogvanidin (MNNG) (B).

Slika 5: Tvorba pirimidinskih dimerov kot posledica UV sevanja

30


2 NALOGA Naloga vaje »Izboljšanje mikroorganizma z mutacijo« obsega naslednje naloge:

- priprava, serijsko redčenje osnovne suspenzije spor bakterije Streptomyces rimosus in nacepitev razredčitev na trdno gojišče (petrijevke), - izpostavitev nacepljenih plošč UV sevanju različen čas, - izolacija morfoloških različic (mutant) seva Streptomyces rimosus in opis morfoloških značilnosti.

Izbrane izolate S. rimosus nato testiramo z merjenjem protibakterijske aktivnosti in v produkcijskem gojišču v laboratorijskem merilu v nadaljevanju vaje. 3 MATERIAL 3.1 KULTURA Suspenzija spor bakterije Streptomyces rimosus 4018, ki proizvaja oksitetraciklin. 3.2 GOJIŠČA Soja manitol gojišče (SM) (trdno gojišče za sporulacijo) Sojina moka 20 g D-manitol 20 g Bakteriološki agar 20 g Pitna voda do 1000 mL

pH = 7,0. Sterilizacija: 121 °C, 30 min. Razlijemo po 25 do 30 mL v petrijeve plošče. 3.3 APARATURE IN OPREMA Redčenje in nacepitev spor:

∼ pipeta s sterilnimi nastavki ∼ petrijevke s trdnim gojiščem SM ∼ brezprašna komora oz. laminar ∼ mikrocentrifugirke (1,5 mL) s sterilno vodo (900 μL) ∼ drigalska spatula ∼ vrtičnik

Obsevanje spor z UV žarki:

∼ brezprašna komora oz. laminar ∼ UV luč (valovna dolžina 254 nm) ∼ škatla za shranjevanje petrijevih plošč ∼ rokavice in očala za zaščito pred UV svetlobo

Prenos izbranih kolonij (za nadaljevanje vaje):

∼ petrijevke s trdnim gojiščem SM ∼ sterilni zobotrebci ∼ brezprašna komora oz. laminar

31


4 POTEK VAJE 4.1 REDČENJE IN NACEPITEV REDČITEV SPOR Iz osnovne suspenzije spor pripravimo redčitveno vrsto po Kochu do razredčitve 10-7. Med vsakim korakom redčitve spor dobro premešamo na vrtičniku. Nato iz vsake redčitve prenesemo 100 µL na sredino petrijeve plošče z SM gojiščem in razmažemo z uporabo drigalske spatule. 4.2 OBSEVANJE SPOR Z UV ŽARKI V brezprašni komori bo nameščena UV luč (ki se prej ogreje vsaj 5 minut) in nastavljena na valovno dolžino sevanja 254 nm. V ta laminarij nato prenesemo petrijevke z razmazi spor, jih odpremo in obsevamo toliko časa, kolikor bo predvideno za posamezno skupino. Po zaključenem obsevanju petrijevke pokrijemo s pokrovom in jih prenesemo v inkubator. Časi obsevanja spor za posamezne skupine so določeni: 0, 30 s, 1, 3, 5 in 7 minut, pri čemer je čas 0 minut kot kontrola ostalim skupinam. OPOZORILO: Za delo v bližini UV luči je obvezna uporaba zaščitnih rokavic in očal! 4.3 INKUBACIJA Obsevane spore inkubiramo pet dni v temnem prostoru – inkubatorju pri 28 °C. 4.4 ŠTETJE KOLONIJ IN PREGLED MORFOLOGIJE INKUBACIJE IN PRENOS

IZBRANIH KOLONIJ Po petih dneh inkubacije v temi preštejemo kolonije, ki so zrasle iz obsevanih spor. Kot števne plošče obravnavamo le tiste, ki bodo imele do 200 kolonij. Za nadaljevanje vaje si vsak izbere eno kolonijo in jo s sterilnim zobotrebcem prenese na novo ploščo z SM gojiščem. Pred prenosom opišemo tudi morfološke lastnosti kolonij, izberemo pa tiste, ki po morfoloških lastnostih še posebej izstopajo. 5 MERITVE, IZRAČUNI IN PREDSTAVITEV REZULTATOV 5.1 DELOVNI LIST 6 LITERATURA

Kieser T., Bibb M. J., Buttner M. J., Chater K. F., Hopwood D. A. 2000. Practical

Streptomyces genetics. Norwich, John Innes Foundation: 613 str.

Patnaik R. 2008. Engineering complex phenotypes in industrial strains. Biotechnology Progress, 24, 1: 38-47

32


PRODUKCIJA ANTIBIOTIKA OKSITETRACIKLINA Z BAKTERIJO Streptomyces rimosus

Marko Blažič, Polona Jamnik, Hrvoje Petković 1 TEORETIČNE OSNOVE 1.1 BIOLOGIJA BAKTERIJ Actinomycetales Aktinomicete so po Gramu pozitivne bakterije, ki spadajo v razred Actinobacteria in red Actinomycetales. Posamezne vrste so morfološko zelo različne, pogosto pa tvorijo razvejano mrežo filamentov oziroma t.i. micelij, ki spominja na nitaste glive, po čemer so dobile tudi ime (Actinomycetes oz. »žarkaste glive«). Večina aktinomicet tvori spore, vendar se proces nastanka spor med skupinami razlikuje. Najbolj enostavne aktinomicete so paličaste, med katere spadajo korinebakterije, bolj zapleten življenjski cikel pa imajo bakterije iz rodu Streptomyces. Streptomicete rastejo v obliki filamentov – na substratnem miceliju požene zračni micelij, na katerem nastanejo spore (Slika 1).

Slika 1: Prikaz življenjskega cikla streptomicet na primeru modelnega organizma

Streptomyces coelicolor. Življenjski cikel se začne s kalitvijo posamezne spore (a), pri čemer nastane eden ali več večjedrnih flamentov (b). Ti se podaljšajo in razvejajo v t.i. substratni micelij (c), ki se razraste po površini rastne podlage in v njo. Pri ustreznih signalih, ki zajemajo tudi izrabo hranil v rastnem mediju, na substratnem miceliju zrastejo zračne hife, ki tvorijo t.i. zračni micelij (d). Ko se podaljševanje multigenomskih zračnih hif ustavi, nastopi sinhrona septacija, med

33


katero nastanejo verige enogenomskih spor (e), ki se razpršijo in začnejo cikel nove generacije

Morfološki razvoj je tesno koordiniran s produkcijo številnih hidrolitičnih zunajceličnih encimov, kot so proteaze, hitinaze, ligninaze in celulaze in s produkcijo antibiotikov. Filmentozne aktinomicete proizvajajo več kot 10000 do danes odkritih bioaktivnih snovi, kar predstavlja kar 45 % vseh približno 22500 poznanih bioaktivnih mikrobnih metabolitov. Od tega jih okrog 7600 proizvajajo streptomicete, 2500 pa t.i. redkejše aktinomicetne vrste, kot so vrste rodov Saccharopolyspora, Amycolatopsis in Nocardia. Aktinomicete ne izstopajo le po številu metabolitov, ampak tudi po strukturni in funkcionalni raznolikosti bioaktivnih spojin. Poleg streptomicetnih vrst so tudi vrste rodu Amycolatopsis industrijsko pomembne zaradi pestrega repertoarja antibiotikov. Med najpomembnejše spada ansamicinski antibiotik rifampicin, polsintezni derivat rifamicina, ki ga proizvaja A. mediterranei, in je ena glavnih učinkovin za zdravljenje tuberkuloze. Poleg tega je industrijsko pomemben tudi glikopeptidni antibiotik vankomicin, ki ga proizvaja A. orientalis, in je eden izmed zadnjih možnosti za zdravljenje okužb z večkratno odpornimi bakterijami Staphylococcus aureus. 1.2 SEKUNDARNI METABOLITI Sekundarni metaboliti so snovi, ki “nimajo poznane vloge v notranji ekonomiji organizma, ki jih proizvaja”. Obstajajo v obliki številnih kemijskih struktur, vsaka pa nastane iz primarnih metabolitov po specifični, kompleksni in energetsko zahtevni biosintezni poti. Njihovo sintezo usmerjajo organizirane skupine genov, stopnjo in čas izražanja teh genov pa regulirajo posebni regulatorni mehanizmi. O razlogih za obstoj sekundarnih metabolitov obstaja več predpostavk. Najstarejše trdijo, da so to odvečni produkti, ki kanalizirajo presežke slabo reguliranega primarnega metabolizma. Druga teorija pravi, da so ostanki iz časov začetka nastanka življenja, kjer so delovali kot kataliti in kofaktorji, še preden so nastali encimi. Cena, ki jo plača producentski organizem za ohranjanje genetskega materiala, proteinov in gradnikov, ki so potrebni za sintezo sekundarnih metabolitov, zagotovo kaže na to, da morajo sekundarni metaboliti igrati bolj pomembno vlogo in za producentski organizem predstavljati določeno selektivno prednost. Kot možne funkcije sekundarnih metabolitov navajajo medcelično signaliziranje, zaplembo ionov in zmanjševanje kompetitivnosti drugih organizmov. Verjetno so se sekundarne metabolne poti razvile s podvojitvijo in modifikacijo genov za primarni metabolizem. Podobnost aminokislinskih zaporedij proteinov, ki so vpleteni v sintezo maščobnih kislin in poliketidov, je eden od primerov, ki podpira to. Ne glede na izvor in funkcijo sekundarnih metabolitov pa je jasno, da je njihova izjemna medicinska pomembnost gonilna sila za študije njihove biogeneze. Sekundarne metabolite, ki jih izoliramo iz mikroorganizmov in imajo bodisi protimikrobno (protibakterijsko, protiglivno, protitiparazitično), protitumorsko in/ali protivirusno aktivnost, v klasičnem smislu imenujemo antibiotiki. Vse bolj pa se kot medicinsko in industrijsko pomembni uveljavljajo tudi sekundarni metaboliti, ki regulirajo več kot tisoč t.i. bioloških aktivnosti. Poleg antibiotičnih aktivnosti lahko delujejo tudi kot encimski inhibitorji, modulatorji imunskega odziva, rastni faktorji, zniževalci holesterola, površinsko aktivne snovi, itd. 1.2.1 Tetraciklini Termin »tetraciklin« zajema številne antibiotike naravnega ali polsinteznega izvora, katerih osnovno strukturo predstavljajo štirje linearno povezani obroči iz 6 C-atomov in karakteristično ureditvijo dvojnih vezi. Glavna producenta tetraciklina sta Streptomyces rimosus (oksitetraciklin in malo tetraciklina) in S.

34


aureofaciens (klortetraciklin in tetraciklin). So antibiotiki širokega spektra, ki delujejo proti številnim po Gramu pozitivnim in po Gramu negativnim bakterijam, netipičnim mikroorganizmom kot so klamidije, mikoplazme, spirohete in rikecije, ter nekaterim virusom in protozojskim parazitom. Uporabljamo jih tudi kot profilaktike v boju proti malariji ali kot prehranske aditive z vlogo rastnih promotorjev. Ker hkrati povzročajo zelo malo neželenih stranskih učinkov, jih obravnavamo kot »varne« antibiotike, ki so v široki uporabi v humani in animalni medicini že več kot 50. Zaradi vedno širšega pojava rezistence jih ne izbiramo več pri zdravljenju stafilokoknih, streptokoknih ali pneumokoknih infekcij. Zaradi rezistence je danes v klinični uporabi poleg osnovnih tetraciklinskih analogov, npr. tetraciklina (TC), oksitetraciklina (OTC) in klortetraciklina (CTC), še veliko polsinteznih derivatov, npr. demetilklortetraciklin, metaciklin, doksiciklin in minociklin, rolitetraciklin in limeciklin, ki se med seboj razlikujejo predvsem po farmakokinetičnih lastnostih, kot so resorbcija, difuzija v tkivo in odstranjevanje iz tkiva.

Slika 2: Strukturna formula oksitetraciklina Zaradi vedno širšega pojava rezistence je danes v klinični uporabi poleg osnovnih tetraciklinskih analogov, npr. tetraciklina (TC), oksitetraciklina (OTC) in klortetraciklina (CTC), še veliko omenjenih polsinteznih derivatov iz druge generacije. Ti se med seboj sicer razlikujejo po farmakokinetičnih lastnostih, še vedno pa si delijo mehanizem delovanja. Klasični in omenjeni polsintetski tetraciklini z vezavo na 30S podenoto ribosomov preprečujejo vezavo aminoacil tRNA na sprejemno mesto na ribosomu. Takšna inhibicija proteinske sinteze je podlaga za reverzibilno bakteriostatično delovanje. Po strukturi uvrščamo tetraciklinske antibiotike med poliketide. Biosinteza poliketidov poteka s pomočjo multi-encimskih kompleksov, imenovanih poliketid sintaze (PKS), in je zelo podobna biosintezi maščobnih kislin. Poliketidna veriga nastane z repetitivno dekarboksilativno kondenzacijo enostavnih organskih kislin (navadno acetila, propionila, malonila ali metilmalonila) v obliki CoA-tioestrov. Po vsakem kondenzacijskem ciklu nastane na naraščajoči verigi nova ß-keto skupina, PKS pa skrbijo za dolžino verige, tako da nastali linearni β-ketonski intermediat sprostijo s kompleksa, ko doseže definirano število kondenzacijskih ciklov in definirano redukcijsko stopnjo ß-keto skupin. Kompleksnost končne strukture je odvisna tudi od uporabe različnih starterjev in enot za podaljševanje verige, od različnih načinov ciklizacije naraščajoče verige in mnogih posttranslacijskih modifikacij, kot so glikozilacija, metilacija, oksidacija, adenililacija in druge.

35


2 NALOGA Naloga vaje »Produkcija antibiotika oksitetraciklina z bakterijo Streptomyces rimosus » obsega naslednje naloge:

- izolacija morfoloških različic (mutant) seva Streptomyces rimosus na trdnem gojišču in opis morfoloških značilnosti,

- vrednotenje protimikrobnega delovanja izoliranih kolonij z difuzno metodo in uporabo testnega mikroorganizma Micrococcus luteus,

- inokulacija vegetativnega/produkcijskega tekočega gojišča z izbranimi kolonijami Streptomyce rimosus in vodenje bioprocesa,

- uporaba spektrofotometrične metode za določanje koncentracije oksitetraciklina v bioprocesni brozgi.

3 MATERIAL 3.1 KULTURA Suspenzija spor Streptomyces rimosus 4018, ki proizvaja oksitetraciklin. Za vrednotenje protimikrobnega delovanja se uporabi difuzna metoda s pomočjo testnega mikroorganizma Micrococcus luteus, ki se goji v 2TY gojišču. 3.2 GOJIŠČA Soja manitol gojišče (SM) (trdno gojišče za sporulacijo) Sojina moka 20 g D-manitol 20 g Bakteriološki agar 20 g Destilirana voda do 1000 mL

pH=7,0. Sterilizacija: 121 °C, 30 min. Razlijemo po 25 do 30 mL v petrijeve plošče Trdno gojišče 2TY (za kultivacijo testnega organizma Micrococcus luteus) Tripton 16 g Kvasni ekstrakt 10 g NaCl 5 g Bakteriološki agar 20 g Destilirana voda do 1000 mL

pH=7,0. Sterilizacija: 121 °C, 30 min. Razlijemo po 25 do 30 mL v petrijeve plošče Vegetativno gojišče (GOTC veg.) Trypton 15 g Glukoza 10 g Kalcijev karbonat 1,0 g Kvasni ekstrakt 5,0 g Pitna voda do 1000 mL

Razlijemo po 5 mL v 50 mL falkone. Sterilizacija: 121 °C, 30 min.

36


Produkcijsko gojišče (GOTC prod.) MOPS 10,5 g Sojina moka 63 g Amonijev sulfat 9 g Magnezijev klorid 3 g Natrijev klorid 2,25 g Kalcijev karbonat 10,95 g Škrob 42 g 1% Cinkov sulfat razopina 15 mL 1% Manganov sulfat. 5,625 mL Pitna voda do 1000 mL

Kuhamo do 80 °C z mešanjem. Ohladimo in korekcija pH na 6,25 z 10 % NaOH ali HCl Razlijemo po 5 mL v 50 mL falkonke. V vsako falkonko dodamo še po 100 µL sojinega olja. Sterilizacija: 121 °C, 30 min 3.3 MATERIALI IN OPREMA Določanje protimikrobnega delovanja oksitetraciklina z difuzno metodo:

∼ petrijevke s trdim gojiščem 2TY, v katerem je testni organizem Micrococcus luteus

∼ petrijevke s kolonijami mutantov Streptomyces rimosus (na trdnem gojišču SM)

∼ brezprašna komora oz. laminar ∼ slamica za odvzem čepka gojišča ∼ hladilnik ∼ inkubator (37 °C)

Priprava inokuluma:

∼ tekoče gojišče (GOTC veg.) za vegetativno fazo rasti mikroorganizma

∼ brezprašna komora oz. laminar ∼ slamica za odvzem čepka gojišča ∼ 50-mL falkonke s penastimi zamaški

Inokulacija in vodenje bioprocesa:

∼ tekoče gojišče za produkcijsko fazo mikroorganizma ∼ 50-mL falkonke s penastimi zamaški ∼ pasteurjeve pipete ∼ brezprašna komora ∼ stresalnik (28 °C; 220 obratov/min)

Spektofotometrično določanje koncentracije oksitetraciklina v produkcijski brozgi:

∼ 1,5 g produkcijske brozge ∼ 0,01 M raztopina HCl ∼ 0,5 % raztopina FeCl3 (FeCl3 v 0,01 M HCl) ∼ 50 % H2SO4 ∼ standardna raztopina oksitetraciklina ∼ čitalec mikrotiterskih plošč ∼ centrifuga ∼ kivete ∼ lakmus papir ∼ pipeta s tipsi ∼ pasteurjeve pipete

37


4 POTEK VAJE 4.1 DOLOČANJE PROTIMIKROBNEGA DELOVANJA OKSITETRACIKLINA Z

DIFUZNO METODO Na petrijevih ploščah, kjer so že nacepljeni mutirani sevi Streptomyces rimosus, opišemo morfologijo kolonij. Nato s pomočjo sterilne plastične slamice prenesemo del gojišča preraščenega z micelijem na petrijevo ploščo, na kateri se nahaja testni organizem Micrococcus luteus, nacepljen v gojišče 2TY. Plošče z 2TY gojiščem shranimo za 1-2 uri v hladilnik. V tem času bo oksitetraciklin in prvotnega gojišča (SM) difundiral v novo gojišče (2TY), kjer bo inhibiral rast testnega organizma in tako ustvaril cono inhibicije. Nato petrijeve plošče prestavimo v inkubator na temperaturo 37 °C, da je testnemu organizmu Micrococcus luteus omogočena rast. Čez 2 dni izmerimo premer nastale cone inhibicije okoli čepka. 4.2 PRIPRAVA INOKULUMA, INOKULACIJA IN PRODUKCIJA ANTIBIOTIKA V

TEKOČEM GOJIŠČU V brezprašni komori oz. laminarju s plošč, na katerih so že nacepljene kolonije Streptomyces rimosus (stare 6-10 dni), s pomočjo sterilne plastične slamice izrežemo del preraslega gojišča. Tako dobljeni košček (s površino 1 cm2) inokuliramo v falkonko, v kateri se nahaja 5 mL vegetativnega gojišča (GOTC). Inokulirano gojišče po dveh dneh stresanja na stresalniku (28 °C, 220 obratov/min) uporabimo za inokulacijo produkcijskega gojišča. Za inokulacijo produkcijskega gojišča uporabimo sterilne pasteurjeve pipete in prenesemo 0,5 mL (10 % inokulum) iz falkonke z vegetativnim gojiščem v sveže produkcijsko gojišče. Produkcijo antibiotika ustavimo po 6 dneh in shranimo 1,5 mL brozge v Eppendorf centrifugirko za nadaljnje analize. 4.3 SPEKTROFOTOMETRIČNA METODA ZA DOLOČANJE KONCENTRACIJE

OKSITETRACIKLINA Oksitetraciklin, klortetraciklin in tetraciklin vsebujejo iste fenolno-hidroksilne skupine, ki v reakciji s feri kloridom v kislem dajejo oranžno barvo. Razvita barva je stabilna skoraj dve uri. Metoda lahko služi za dokazovanje kateregakoli izmed naštetih antibiotikov, bolj natančno pa je opisana za detekcijo oksitetraciklina. Če želimo določati koncentracije klortetraciklina ali tetraciklina, moramo zamenjati standard oksitetraciklina z odgovarjajočim klortetraciklinom ali tetraciklinom. 1.) Reagenti:

- 0,01 M HCl - 0,5 % raztopina FeCl3 (FeCl3 v 0,01 M HCl) - 50 % H2SO4

2.) Priprava standarda:

- Založna raztopina oksitetraciklina je v koncentraciji 10 mg/mL v 0,01 M HCl.

- Za umeritveno krivuljo pripravimo redčitve založne raztopine oksitetraciklina v 0,01 M HCl do koncentracij: 1 mg/mL, 0,75 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,375 mg/mL, 0,25 mg/mL, 0,1875 mg/mL in 0,125 mg/mL

3.) Priprava vzorca:

- 1,5 mL produkcijske brozge odpipetiramo v Eppendorf centrifugirko. - Zakisamo s 50 % H2SO4, da je pH ~ 2,0 (pri tem vam pomaga asistent!).

pH preverimo z lakmus papirjem.

38


- Na sobni temperaturi inkubiramo pol ure, vmes večkrat premešamo. - Centrifugiramo 10 min / 14000 obr./min. - Supernatant, ki vsebuje oksitetraciklin, prenesemo v novo centrifugirko.

Nato pripravimo razredčitve vzorca 2X, 4X in 8X, redčimo z 0,01 M raztopino HCl.

4.) Slep vzorec: Za slepi vzorec uporabimo 0,01 M raztopino HCl. 5.) Merjenje:

- V mikrotitersko ploščico odpipetiramo po 100 µL vseh redčitev standarda in slepi vzorec.

- Dodamo 100 µL 0,5 % raztopino FeCl3. - Inkubiramo 10 min pri sobni temperaturi. - Izmerimo absorbanco pri 400 nm.

5 MERITVE, IZRAČUNI IN PREDSTAVITEV REZULTATOV 5.1 DELOVNI LIST 6 LITERATURA Demain A. L. 2006. From natural products discovery to commercialization: a

success story. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 33, 7: 486-495

Petković H., Cullum J., Hranueli D., Hunter I. S., Perić-Concha N., Pigac J.,

Thamchaipenet A., Vujaklija D., Long P. F. 2006. Genetics of Streptomyces rimosus, the oxytetracycline producer. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 70, 3: 704-728

39


BIOPROCES Z MEŠANO BIOKULTURO: FERMENTACIJA MLEKA

Neža Čadež in Maja Paš 1 TEORETIČNE OSNOVE

Večina bioprocesov fermentirane hrane poteka z mešanimi biokulturami, ki morajo delovati usklajeno, če želimo proizvesti živilo z določenimi lastnostmi. Na splošno lahko trdimo, da imajo sestavljene mikrobne združbe bolj kompleksno aktivnost, in s tem učinkovitost, ter so hkrati bolj odporne na spremembe v okolju v primerjavi s čistimi kulturami (robustnost). Učinkovitost in robustnost sta posledica komunikacije združbe v smislu izmenjave metabolitov ali molekulskih signalov. Poleg tega, da bakterije komunicirajo druga z drugo, si mikroorganizmi v mikrobni združbi delijo tudi delo - vsaka posamezna celica je odgovorna za določeno stvar, kar poveča produktivnost mikrobne združbe. Robustnost mešanih biokultur med fermentacijami pa se kaže predvsem v smislu konstantne kakovosti fermentiranega izdelka. Zato je ključnega pomena poznavanje sestave mikrobne združbe, katere vrste prevladujejo in kako ti mikroorganizmi sodelujejo med sabo.

Med fermentiranimi živili so močno zastopani fermentirani mlečni izdelki.

Tehnološko je jogurt gel kislega mleka, ki je zaradi ugodnih prehranskih lastnosti in preprostosti uživanja zelo zaželen med potrošniki. Osnova proizvodnje jogurta je kisla destabilizacija proteinov mleka s termofilnimi mlečno-kislinskimi bakterijami ter optimizirane toplotne obdelave mleka, s katero induciramo denaturacijo proteinov, kar vodi v nastanek tridimenzionalne mreže, ki »nosi« preostali, tekoči del jogurta.

Vloga mlečno-kislinskih bakterij pri proizvodnji jogurta je preprosta – s

fermentacijo laktoze v mlečno kislino povzročijo padec pH vrednosti mleka, s čimer spremenijo izoelektrično točko glavnega mlečnega proteina, kazeina. Izoelektrična točka kazeina je 4,6 in ko bakterije proizvedejo dovolj kisline, da presežejo naravno pufersko kapaciteto mleka, kazein precipitira in tvori se koagulum. Poleg tega mlečno-kislinske bakterije tvorijo organske molekule, kot so acetaldehid, diacetil, ocetna kislina in etanol. S tem prispevajo k aromi jogurta.

Slika 1: Elektronski mikroskopski sliki gram-pozitivnih bakterij vrst

Streptococcus thermophilus in Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

Združena starter kultura za jogurt je sestavljena iz dveh vrst mlečno-kislinskih

bakterij, Streptococcus thermophilus in Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, v razmerju 1:1. Prisotnost obeh vrst je nujna, ker vrsti rasteta hitreje

40


in naredita boljši proizvod v primerjavi s čistimi kulturami. Ta sinergizem je pogojen s tem, da je S. thermophilus bolje prilagojen na mleko kot substrat in zato hitreje raste in s tem zniža pH do vrednosti, ki jo preferira L. delbrueckii subsp. bulgaricus. Vendar pa ima S. thermophilus slabo proteolitično aktivnost in za svojo rast lahko porablja le proste aminokisline, ki so v mleku v nizkih koncentracijah. Ko S. thermophilus porabi aminokisline, izkoristi proteolitično aktivnost L. delbrueckii subsp. bulgaricus, ki s proteinazami naredi peptide in aminokisline za vse mikroorganizme v mleku. Vendar se med ko-fermentacijo okolje preveč zakisa, tako da se populacija S. thermophilus zmanjša. Na koncu prevlada L. delbrueckii subsp. bulgaricus, ki bolje raste v anaerobnih razmerah in v prisotnosti določenih rastnih faktorjev (npr. mravljinčna kislina).

Slika 2: Sinergistična rast Streptococcus thermophilus in Lactobacillus

delbrueckii subsp. bulgaricus

Razmerje med obema vrstama je mogoče uravnavati s temperaturo fermentacije, s čimer vplivamo na okus in kislost jogurta – L. delbrueckii subsp. bulgaricus ima višji temperaturni optimum v primerjavi s S. thermophilus. Če fermentiramo jogurt pri višji temperaturi, s tem favoriziramo rast L. delbrueckii subsp. bulgaricus, ki producira več mlečne kisline in acetaldehida kot S. thermophilus. S tem je končni proizvod bolj kisel in bolj polnega okusa. 2 NALOGA Proučiti vpliv sinergističnega delovanja dveh vrst mlečno-kislinskih bakterij na kinetiko bioprocesa (fermentacija mleka), populacijsko dinamiko in na kakovost končnega proizvoda (jogurta).

mravljinčna kislina

aminokisline proteini mleka

peptidi +

CO2

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Streptococcus thermophilus

proste aminokisline

41


3 MATERIAL Kulture: - Lactobacillus delbrueckii var. bulgaricus - Streptococcus thermophilus - navadni čvrsti jogurt - komercialni starter (L. delbrueckii var. bulgaricus in S. thermophilus) Gojišča: - pasterizirano polnomastno mleko (3,5 % mlečne maščobe) - agar MRS za selektivno rast laktobacilov (sestava in opis v prilogi) - agar M17 za selektivno rast streptokokov (sestava in opis v prilogi) Aparature in oprema: - anaerobni lonec - vodna kopel (T = 43 °C) - pH-meter - mikroskop - inkubator (T = 37 °C; T = 42 °C) - laboratorijska steklovina Kemikalije, raztopine, reagenti: - reagenti za barvanje po Gramu - fiziološka raztopina 4 POTEK VAJE Vaja poteka v 5 skupinah. Delo je aseptično. Nastavitev bioprocesa: V 250 ml sterilne steklenice z modrim zamaškom odmerimo 200 ml pasteriziranega mleka s 3,5 % mlečne maščobe, ogretega na 43 °C. V steklenice z mlekom prenesemo startersko kulturo (inokulum): 1. skupina: 0,02 % komercialnega starterja 2. skupina: 0,02 % komercialnega starterja, pred tem mleku dodamo 2 % mleka

v prahu 3. skupina: Lactobacillus delbrueckii var. bulgaricus (polna cepilna zanka) 4. skupina: Streptococcus thermophilus (polna cepilna zanka) 5. skupina: 2 % jogurta Steklenice z inokuliranim mlekom prenesemo v vodno kopel s temperaturo 43 °C. Vzorčenje: Vzorčimo 3-krat: takoj po inokulaciji (ob času 0), po 2 urah inkubacije ter naslednji dan (okrog 24 ur inkubacije). Potek: v 50 ml centrifugirko („falkonko”) s sterilno žlico prenesemo približno 10 ml vzorca (jogurta).

42


Analize vzorcev: Vrednost pH: Najprej s predhodno umerjenim pH-metrom izmerimo vrednost pH v vzorcih tako, da elektrodo potopimo v vzorec in odčitamo vrednost pH. Določanje koncentracije mikroorganizmov: Z redčenjem po Kochu iz 1 ml jogurta pripravimo redčitveno vrsto: 1. vzorčenje: do redčitve 10-2

2. vzorčenje: do redčitve 10-4

3. vzorčenje: do redčitve 10-5

Po 0,1 ml najvišje in ene nižje redčitve nanesemo na plošče s hranilnima agarjema MRS in M17. Delamo v dveh paralelkah (porabimo 4 plošče vsakega gojišča/vzorčenje). Razmažemo s stekleno palčko, ki smo jo predhodno potopili v etanol in ožgali nad plamenom. Inokulirane plošče agarja MRS inkubiramo pod anaerobnimi pogoji pri temperaturi 42 °C, plošče z inokuliranim gojiščem M17 pa v inkubatorju pri temperaturi 37 °C. Na zadnjem delu vaje preštejemo kolonije bakterij in izračunamo koncentracijo celic v vzorcu jogurta (cfu/ml). Izberemo kolonije, ki so različno velike, jih pobarvamo po Gramu in preparat mikroskopiramo. Barvanje po Gramu: Na objektno stekelce kanemo kapljico destilirane vode, v kateri s cepilno zanko suspendiramo bakterijsko kolonijo. Preparat posušimo nad plamenom (»fiksiramo«) in ga pobarvamo po Gramu. Protokol za barvanje po Gramu visi nad koritom za barvanje. Preparat posušimo na papirnati brisački in nanj nanesemo kapljico imerzijskega olja ter mikroskopiramo pri 1000X povečavi. 5 MERITVE, IZRAČUNI IN PREDSTAVITEV REZULTATOV - Grafični prikaz rastnih krivulj bakterij in spreminjanja pH vrednosti v odvisnosti od časa - Skica mikroskopskega preparata - Opis vpliva uporabljene starterske kulture na teksturo in aromo jogurta 6 LITERATURA

Courtin P., Rul F. 2004. Interactions between microorganisms in a simple ecosystem: yogurt bacteria as a study model. Lait, 84, 1-2: 125-134.

Hutkins, R.W. 2006. Microbiology and technology of fermented foods. Blackwell Publishing, Oxford, VB. 473 str.

43


RAČUNSKE NALOGE 1. Mililiter grozdnega soka vsebuje 5·103 avtohtonih kvasovk, katerih povprečni

generacijski čas v danih pogojih je 10 ur. Ker je njihova sposobnost fermentacije slaba, izvedemo inokulacijo s selekcioniranimi kvasovkami S. cerevisiae, ki imajo generacijski čas 8 ur, namnožili pa smo jih do koncentracije 1·105 ml-1.

Določite volumen inokuluma selekcioniranih kvasovk, če bo fermentacija potekala v bioreaktorju z volumnom 20 m3. Upoštevajte, da želimo po 4 dneh fermentacije 90% dominacijo selekcioniranih kvasovk.

2. Melaso, ki je stranski produkt pri proizvodnji sladkorja, želimo uporabiti kot

surovino za biotehnološko proizvodnjo tehničnega etanola s kvasovkami.

Izračunajte potrebno količino melase, ki vsebuje 40% saharoze, za dnevno proizvodnjo 10 m3 96 vol% etanola, če znaša dejanski izkoristek bioprocesa 90%.

3. Načrtujete postavitev industrijske proizvodnje oksitetraciklina s Streptomyces

rimosus z dvostopenjskim bioprocesom. V prvi stopnji v manjšem bioreaktorju pripravite vcepek, kjer v gojišču z enostavnim virom C namnožite biomaso, s katero boste inokulirali velik industrijski bioreaktor. V drugi stopnji pa v industrijskem bioreaktorju v produkcijskem gojišču s kompleksnim virom C (škrob) vodite bioproces za proizvodnjo oksitetraciklina.

a) Kolikšna je maksimalna specifična hitrost rasti kulture v prvi stopnji

bioprocesa, če je čas podvojevanja Streptomyces rimosus 4 ure. b) Kolikšna bo koncentracija biomase v manjšem bioreaktorju za proizvodnjo

vcepka po 24 urah, če ste ga inokulirali z 0,1 g l-1spor. c) Velik industrijski bioreaktor želite inokulirati z 10 vol.% vcepka, ki ste ga

pripravili v manjšem bioreaktorju. Kolikšen mora biti minimalen volumen majhnega bioreaktorja, če je delovni volumen velikega industrijskega bioreaktorja 60 m3?

d) Po koncu bioprocesa, ki je trajal 6 dni, ste določili, da je vsebnost oksitetraciklina v brozgi 20 g l-1, koncentracija neporabljenega škroba pa 20 g l-1. Izračunajte izkoristek proizvodnje oksitetraciklina, če je bila začetna koncentracija škroba v produkcijskem gojišču 100 g l-1.

e) Kolikšna je bila produktivnost bioprocesa? f) Kolikšna je bila specifična hitrost nastanka oksitetraciklina, če ste na

koncu bioprocesa določili, da je koncentracija biomase 10 g l-1?

44

Biotehniška fakulteta - Univerza v Ljubljani

Documents

Transcript of Biotehniška fakulteta - Univerza v Ljubljani