Universidade de Évora

2002

Biotecnologia Vegetal

BIOTECNOLOGIA VEGETAL I

Prof. Amely Zavattieri

MicropropagaçãoMicropropagação

!Introdução !Multiplicação conforme !Etapas !Automatização

!Dupla fase !Robotização !Bioreactores

A Micropropagation é a propagação fiel de um genótiposeleccionado por meio das técnicas da cultura in vitro.Geralmente a micropropagação é também associada com a produção em grande escala a preços competitivos. O Prof. Murashige (Univ. de California, Riverside) definiu 3 fases principais na multiplicação in vitro de plantas, tanto para os laboratórios comerciais como para os de investigação.Estas fases descrevem passos a seguir no processo, como assim também momentos na cultura nos quais as necessidades do ambiente da cultura devem ser modificados. A figura seguinte representa um esquema das diferentes fases do processo de micropropagação como proposto por Deberg e Maene (1981).

Fase 4: aclimataçãoin vivo

Fase 3b: Indução radicular e pre-aclimatação

Fase 3a: Alongamento

Fase 2: multiplicação

Fase 1: Iniciação assépticain vitro

Fase 0: preparação da planta mãe in vivo

Com o aumento do número de sub-culturas o meio que originalmente tinha sido preparado para dar rebentos axilares pode ser mudado para a produção de rebentos adventícios. Como consequência o número de variação somaclonal se incrementa.

Teoricamente as plantas que não são quimereas podem ser propagadas usando diferentes técnicas: rebentos axilares; rebentos adventícios; embriogénese,...Para efeitos da micropropagação a técnica de multiplicação via rebentos axilares é a preferida para a maioria das plantas. Isto em princípio produz plantas conformes. É a única técnica que pode ser aplicada á propagação de quimeras.

Rebentos axilares obtidos de uma

Dracaena(quimera).

Desenvolvimento de gomos adventícios

em Dracaena(quimera).

Fases da Fases da MicropropagaçãoMicropropagação

"Fase 0 "Fase 1 "Fase 2 "Fase 3 "Fase 4

1. Plantas saudáveis

2. Evitar rega excessiva das plantas mães

3. Induzir crescimento vigoroso nas plantas

mães

Fase 0. Preparação das plantas mãeFase 0. Preparação das plantas mãe

Fase 0. Foi originalmente concebido para melhorar as condições higiénicas das plantas mãe.. Prévio ao inicio da cultura deverá prestar-se uma atenção especial da planta da qual serão retirado/s o/s explants. As plantas mães poderão ser previamente tratadas com hormonas, desinfectantes, fazer testes de viroses, etc. todo em vista ao êxito da cultura invitro.A desinfecção do material vegetal é essencial nesta fase. O crescimento, a morfogénese e as taxas de crescimento e propagação da cultura dependerão do tratamento prévio da planta mãe.

Fase O Fase O

Rega gota -a gota das plantas mães.

Injecção de citocininas

EtiolamentoSoluções forçadas contendo GA3; citocininas; hidroxiquinoleina

Poda; perda da dominância apical

Enxertia em cascada

Possíveis pre-tatamentos

Condições ambientais a considerarTemperatura

1. Afecta o crescimento das culturas2. Efeito sobre a morfogénese

Humidade relativaLuz

1. Qualidade2. Quantidade3. Efeito sobre a morfogénese

1. Selecção do explant

2. Desinfecção superficial

3. Meio de cultura

4. Acastanhamento do meio

5. Consistência do meio

6. Condições ambientais

Fase1: Estabelecimento da culturaFase1: Estabelecimento da cultura

Fase 1Fase 1Estabelecimento da culturaEstabelecimento da cultura

Objectivos#Dar início á cultura #Em princípio o método usado deve ser reproduzível Deve existir um compromisso entre uma adequada desinfecção do material vegetal e uma boa taxa de sobrevivência dos explants �não contaminados�.

ProcedimentoFrequentemente para o início da cultura são usados gomos axilares ou meristemas. Em certos casos são usados outras partes da planta. Ex. Sendo difícil obter gomos axilares não contaminados em Ficuslyrata e Anthurium spp. Gomos adventícios são primeiramente obtidos sobre folhas, os rebentos assim obtidos são então seccionados para ser os explants iniciais da fase 2.É recomendável não iniciar a propagação durante a fase de iniciação.

Exemplo: início da cultura em Roseira

Exemplo: Fase de iniciação em roseirasExemplo: Fase de iniciação em roseiras

São retiradas as folhas ficando os pecíolos nas secções cortadas.

Lavar com 80% etanol, desinfectar em lexivia comercial 10% (NaOCl) por 15 minutos

São retirados ramos jovens. Cortar os ápices e as bases dos ramos

Colocação de um nó em um tubo de ensaio.

Plantas mãe com rega gota -a gota

Entre nós cortados. Cada nó contêm um meristema axilar.

Transladar os tubos para a sala de cultura

Lavar 3x com água estéril

Cortar os extremos o mais próximo possível do nó.

1. Produção de rebentos adventícios

2. Produção de rebentos axilares

3. Embriogénese somática

Fase 2. MultiplicaçãoFase 2. MultiplicaçãoO objectivo desta fase é a multiplicação propriamente dita dos órgãos e estruturas que são capazes de dar origem a plantas completas. De acordo com os métodos de propagação que sejam empregues estas estruturas poderão ser: rebentos axilares ou adventícios, embriões o órgãos em miniatura como microtubérculos, cormos, etc. Em alguns programas de micropropagação este estado inclui uma indução prévia de centros ou zonas meristemáticas a partir da qual se desenvolverão os órgãos adventícios.Os rebentos produzidos na fase 2 são considerados como propágulos pois podem ser propagados ou multiplicados para aumentar o seu número em sucessivas subculturas.

Multiplicação Vegetativa por Gomos Multiplicação Vegetativa por Gomos (rebentos) Adventícios(rebentos) Adventícios.

A- O explant é constituído de um fragmento de órgão, de uma porção de tecido ou mesmo de células isoladas (grãos de pólen, protoplastos, etc.

B- Os rebentos são neo-formados (formados de novo) a partir de células do explant inicial.

C- Estes rebentos desenvolvem-se em caules, geralmente sobre um meio de alongamento

D- As células do explant inicial dividem-se rapidamente e formam, de maneira desorganizada, um calo primário ligado ao explant de partidaE- O calo primário pode ser subcultivado

em meio sólido para crescimento do calo

F- O calo forma rebentos sob um meio de indução apropriado

G- Todos os ramos obtidos são transferidos para um meio neutro ou

enriquecido em auxinas que provocam o posterior enraizamento.

A conformidade do material das plantas obtidas por este método, não pode ser garantida.

Multiplicação Vegetativa por gomos (rebentos) Axilares.

A- O explant pode conter um meristema isolado, um gomo terminal ou axilar, uma extremidade de um ramo, um fragmento de ramo que possua pelo menos 1 gomo axilar

B- Num meio com citocininas o meristema cresce, o gomo desenvolve-se em um ramo folhoso

C- Este ramo pode ser cortado em fragmentos (nós que permanecem sobre o mesmo meio dando novos ramos folhosos

D- Se o explant inicial é depositado num meio rico em citocininas, os gomos desenvolvem-se dando um ramo folhoso que se ramifica ele próprio dando ramos secundários e posteriormente terciários, e assim sucessivamente

E- Os tufos de rebentos são fragmentados e a multiplicação realiza-se nesta fase

F- Os rebentos são transferidos para meio de alongamento para preparar os mesmos para a fase de enraizamento

G- Os ramos podem ser agora transferidos par um meio neutro (S/hormonas) ou com auxinas para enraizarem.

A taxa de multiplicação pode variar entre 2 a mais de 20 por mês.

Fig. 1. Teoricamente o numero de plantas que podem ser produzidas em 1 ano quando a taxa de multiplicação é de 2 (A) ou 4 (B) por mes.

Para a maioria dos sistemas de micropropagação os sistemas de ramificação axilar são os mais favoráveis. Em outros sistemas mais avançados podem ser usados embriões, gomos adventícios, nós, conjuntos meristemáticos.

Fase 2 Fase 2 MultiplicaçãoMultiplicação

A

B

Taxa de Multiplicação

Multiplicação porEmbrigéneseSomática.

A embriogénese somática aparece a maior parte das vezes em suspensões celulares, ocasional-mente sobre calos, e mais raramente directamente sobre órgãosA- O explant de partida pode ser um fragmento de órgão, de tecido, ou células isoladas.

B- Forma-se um calo primário (em órgãos) ou um micro calo (em células isoladas).

C- Subcultura de calo primário ou de micro-calos

D- O calo pode dissociar-se e multiplicar-se sob a forma de suspensão celularE- Em certas condições, as culturas celulares em meio líquido ou sólido organizam-se em pequenos maciços de estruturas bipolares chamados embrióides, ou embriões somáticosF- Os embriões somáticos se desenvolvem directamente em plântulas com raiz como as derivadas de uma semente.

Exemplo: multiplicação de roseiras.Exemplo: multiplicação de roseiras.

Fase 3: EnraizamentoFase 3: Enraizamento

B

Fase 3 Fase 3 EnraizamentoEnraizamento

Os rebentos ou plântulas derivadas da fase 2, são muito pequenas e incompletas, não sendo possível a sua transferência directa para o solo ou outro substrato, pelo que nesta fase, são seguidos certos procedimentos para que estas pequenas plantas desenvolvam a sua capacidade fotossintética e sejam capazes de sobreviver em condições naturais sem a adição artificial de carbohidratos.

É recomendável dividir esta fase em fase de alongamento (3a) e fase de indução radicular e pre-aclimatação (3b).

Frequentemente são as auxinas os reguladores de crescimentos usados para induzir enraizamento. No entanto, há que ter em conta que as auxinas inibem o posterior crescimento das raízes. Melhor enraizamento é geralmente obtido em meios com baixa concentração de sais (ex. Knop 1/2).$As raízes que se desenvolvem em condições in vitro, não são frequentemente aptas para as condições de estufa e podem ocasionar problemas no momento do transplante (stress hídrico).$A indução pode ser feita em caules simples ou em caules em rosetas $Para além do enraizamento esta fase deve favorecer a aclimatação posterior das plantas. Para isto pode-se: favorecer as condições autotróficas; suplementar as plantas com carbohidratos, diminuir a humidade relativa dos recipientes da cultura, micorrização, utilização de substratos inertes (e.g. rockwool, tacos de celulose, espuma de poliuretano.

Fase 3b: indução radicular e pre-aclimatação

Em certos casos o alongamento dos caules é um pre-requisimopara a fase de enraizamento $Os meios de cultura desta fase geralmente não contêm citicininas como as usadas na fase 2$Nesta fase pode ser necessário adicionar carvão activado para neutralizar os efeitos das citicininas da fase 2$Dependendo do tipo de planta, o alongamento pode pode ser feito em caules singulares ou em caules agrupados (roseta).

Fase 3a: alongamento

Enraizamento (Enraizamento (contcont.).)

Fase 4: AclimataçãoFase 4: Aclimatação

Factores ambientaisHumidade relativaLuzEnfermidades patogénicas

Factores da PlantaMorfologia estomáticaFuncionamento estomáticoDormênciaFormação da cera epi-cuticularCapacidade fotossintética

Fase 4 Fase 4 AclimataçãoAclimatação

Fase 4: aclimatação Fase 4: aclimatação ((contcont.) .)

O objectivo desta fase é a de optimizar a transferência das plantas da condição in vitro as condições de campo ou de estufa.A maior preocupação deverá ser a de minimizar as perdas e acelerar os procedimentos.

Exemplo: aclimatação em roseirasVer também: aclimatação

Fases da micropropagação

(esquema geral)

Técnica da Técnica da dupladupla--fasefase

Os ingredientes clássicos usados na técnica de dupla fase são: macro nutrientes de Knop ½ concentração;

"carvão activado; "açúcares; "auxinas

Sistema de dupla fase aplicado á multiplicação in vitro de Cordyline terminalis.

Adicionar 20 ml de meio líquido sobre o meio da fase final (sólido) (inicialmente 100 ml), de maneira a evitar as subculturas. Isto reduz os custos do processo. O sistema é usado :

�Durante a fase 2 para plantas que requerem um longo período de subculturas (e.g. orquídeas, uma subcultura leva aproximadamente 6 meses, meio fresco é adicionado aos 3 meses em cultura); �Na fase final para induzir alongamento e/ou enraizamento.

Rosas em contendor de plástico

Enchimento com meio para dupla-fase

Desenvolvimento posterior

0.2690.191 ± 0.022

51.4 ± 6.928.0 ± 1.6

Fase 2 cultura na qual foi adicionado meio fresco na Fase 3

0.1740.139 ± 0.013

22.4 ± 5.5

23.3 ± 5.5

Fase 2 cultura transferidas para meio fresco no início da Fase 3

Peso médio dos rebentos

(g) 4 semanas depois do

transplante (g)

Peso médio dos rebentos

no transplant

e (g)

Nº médio de

rebentos com > 2.5 cm

Peso meio por

contenedor

(g)

Tratamento

Efeito do sistema de dupla fase no crescimentoin vitro de Cordyline terminalis.

Vantagens da Vantagens da MicropropagaçãoMicropropagação

! As plantas são frequentemente mais uniformes

! Pode ser a única forma de as propagar vegetativamente

! As plantas tem geralmente um crescimento mas rápido

! Maduram mais rápido que as propagadas por sementes

! Pode ser usada para produzir linhas parentais para produzir sementes. Para manter as linhas parentais. Para prevenir depressão por consanguinidade

Desvantagens da Micropropagação

! A propagação massiva não pode ser aplicada actualmente em todas as espécies vegetais

! A regeneração pode não ser possível. Especialmente para árvores lenhosos adultos. Existem mais problemas para obter raízes que rebentos

! Podem não ter um crescimento uniforme e em lugar disso ter diferentes taxas de crescimento e maduração in vitro

Aplicações da Aplicações da MicropropagaçãoMicropropagação

%%1. Propagação clonal1. Propagação clonal

%%2. Propagação de plantas difíceis de 2. Propagação de plantas difíceis de propagar por outra via ou plantas muito propagar por outra via ou plantas muito valiosasvaliosas

%%3. Introdução de novos cultivares3. Introdução de novos cultivares

%%4. Propagação vegetativa de plantas mães 4. Propagação vegetativa de plantas mães ou parentaisou parentais

%%5. Eliminação de patogenias5. Eliminação de patogenias

%%6. Armazenamento de 6. Armazenamento de germoplasmasgermoplasmas

Alguns exemplosAlguns exemplos

Robotização Robotização

A mão de obra representa aproximadamente 70% do custo de uma planta micropropagada. Por este motivo muitos laboratórios de micropropagação estão instalando-se em países onde a mão de obra é mais barata. Uma alternativa é a utilização de robots. Existem no entanto, alguns problemas específicos com a robotização da cultura de tecidos, alguns destes são:

!Os tecidos vegetais são frágeis !Não estão presentes tecidos vegetais idênticos !È necessária uma manipulação asséptica

A figura seguinte representa a configuração de um sistema robótico totalmente automatizado para a multiplicação de Chrysanthemum. Neste sistema o braço do robot efectua as operações de corte e transplante.

Bio reactores a pequena escalaBio reactores a pequena escala

Bio reactores em grande escala não são favoráveis á micropropagação pois são demasiado caros e representam um sistema com alto risco em perdas de grande número de plantas simultaneamente. Pequenos bio reactores dão maior flexibilidade e permitem um controlo individual dos componentes. São exemplos: Nalgene TM unidades de filtração, o RITA TM (Cirad, Montpellier) e LifeReactor TM da Osmotek.

Lifereactor TM

RITA TM

NalgeneTM filterunits