Biosynthese kutikulärer Triterpenoide: Klonierung und ... · aus Ricinus communis und Lycopersicon...

Biosynthese kutikulärer Triterpenoide:

Klonierung und Charakterisierung von Epoxysqualenzyklasen aus Ricinus communis und Lycopersicon esculentum

Dissertation zur Erlangung des

naturwissenschaftlichen Doktorgrades

der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg

vorgelegt von

Ortwin Guhling aus Münnerstadt

Würzburg 2006

OH

Biosynthese kutikulärer Triterpenoide: Klonierung und Charakterisierung von Epoxysqualenzyklasen

aus Ricinus communis und Lycopersicon esculentum

Dissertation zur Erlangung des

naturwissenschaftlichen Doktorgrades

der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg

vorgelegt von

Ortwin Guhling aus Münnerstadt

Würzburg 2006

Eingereicht am: 22. November 2006

Mitglieder der Promotionskommission:

Vorsitzender: Prof. Dr. M. J. Müller

Gutachter: Prof. Dr. M. Riederer

Gutachter: Prof. Dr. R. Jetter

Tag des Promotionskolloquiums: ……………………………………..

Doktorurkunde ausgehändigt am: ……………………………………..

Inhalt III

Inhaltsverzeichnis 1 Einführung ...................................................................................................1

1.1 Biosynthese pentazyklischer Triterpene in Pflanzen..........................................1 1.2 Die pflanzliche Kutikula .........................................................................................7 1.3 Triterpene als kutikuläre Wachskomponenten..................................................10 1.4 Aufgabenstellung .................................................................................................14

2 Material und Methoden .............................................................................16 2.1 Pflanzenmaterial ...................................................................................................16 2.1.1 Ricinus communis ................................................................................................................ 16 2.1.2 Lycopersicon esculentum..................................................................................................... 20 2.2 Präparation kutikulärer Wachse von Ricinus communis .................................21 2.2.1 Extraktion kutikulärer Wachse.............................................................................................. 21 2.2.2 Gewinnung epikutikulärer Wachse....................................................................................... 21 2.3 Qualitative und quantitative Analysetechniken.................................................22 2.3.1 Derivatisierung ..................................................................................................................... 22 2.3.1.1 Silylierung............................................................................................................................. 22 2.3.1.2 Acetylierung.......................................................................................................................... 23 2.3.2 Gaschromatographie und Massenspektrometrie ................................................................. 23 2.3.3 Dünnschichtchromatographie (TLC) .................................................................................... 24 2.4 Molekulargenetische Methoden ..........................................................................25 2.4.1 RNA-Isolierung und cDNA-Synthese ................................................................................... 25 2.4.2 DNA-Isolierung..................................................................................................................... 26 2.4.3 cDNA-Amplifizierung über Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ............................................ 27 2.4.4 Gelelektrophoretische Untersuchung und Aufreinigung von PCR-Produkten ..................... 27 2.4.5 Klonierung von PCR-Produkten in Eschericha coli.............................................................. 28 2.4.6 Sequenzierung von PCR-Fragmenten................................................................................. 31 2.4.7 RACE-Technik...................................................................................................................... 32 2.4.7.1 3’RACE................................................................................................................................. 32 2.4.7.2 5’RACE................................................................................................................................. 32 2.4.8 Northern-Blot-Analysen........................................................................................................ 34 2.4.8.1 Präparation der RNA............................................................................................................ 34 2.4.8.2 Präparation der Sonden ....................................................................................................... 34 2.4.8.3 Hybridisierung ...................................................................................................................... 35 2.4.9 Semiquantitative RT-PCR .................................................................................................... 36 2.4.10 Sequenzanalytische Verfahren ............................................................................................ 36 2.5 Charakterisierung klonierter cDNAs – heterologe Expression in Saccharomyces cerevisae ...................................................................................37 2.5.1 Amplifizierung der 2,3-Oxidosqualenzyklase-cDNAs mittels PCR ...................................... 37 2.5.2 Ligation der cDNAs in den Hefe-Expressionsvektor pYES2................................................ 38 2.5.3 Die Hefemutante GIL 77 und die Transformation von GIL 77 mit dem Expressionsvektor pYES2.................................................................................................... 40 2.5.4 Geninduktion und Extraktion transformierter Hefezellen ..................................................... 41 2.5.5 Analyse der Hefe-Extrakte ................................................................................................... 42 2.5.6 In vitro-Enzymtest................................................................................................................. 42 2.6 Zielgerichtete Mutagenese (Site-directed mutagenesis) von RcLUS1 ............43 2.7 Rasterelektronenmikroskopie .............................................................................44

Inhalt IV

3 Ergebnisse.................................................................................................45 3.1 Charakterisierung zweier Stammkutikulaphänotypen von Ricinus communis ........................................................................................45 3.1.1 Rasterelektronenmikroskopische Untersuchung nativer Oberflächen beider Sprossachsenphänotypen.................................................................................................... 45 3.1.2 Chemische Charakterisierung der kutikulären Wachse beider Stammkutikula-Phänotypen ................................................................................................. 47 3.1.2.1 Zusammensetzung des kutikulären Gesamtwachses.......................................................... 47 3.1.2.2 Epi- und intrakutikuläre Wachszusammensetzungen.......................................................... 54 3.2 Kutikula-Ontogenese: Kutikuläre Wachszusammensetzung während der frühen Sprossachsenentwicklung................................................................60 3.2.1 Rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen von Hypokotyloberflächen während der frühen Entwicklungsphase .............................................................................. 60 3.2.2 Chemische Charakterisierung der Wachszusammensetzung im Laufe der Hypokotylentwicklung........................................................................................................... 62 3.3 Klonierung von Epoxysqualenzyklasen aus Ricinus communis und Lycopersicon esculentum............................................................................68 3.3.1 Primerdesign zur spezifischen homologiebasierten Klonierung von Gensequenzen pflanzlicher Triterpen- und Cycloartenolsynthasen .................................... 68 3.3.2 Klonierung der Ricinus communis Lupeolsynthase RcLUS1............................................... 72 3.3.3 Klonierung eines Genfragmentes einer weiteren potenziellen Triterpensynthase von Ricinus communis ......................................................................................................... 76 3.3.4 Klonierung der Ricinus communis Cycloartenolsynthase RcCAS1..................................... 78 3.3.5 Klonierung genomischer Sequenzen von RcLUS1 und RcCAS1........................................ 80 3.3.5.1 Genomische Sequenz der Lupeolsynthase RcLUS1........................................................... 80 3.3.5.2 Genomische Sequenz der Cycloartenolsynthase RcCAS1 ................................................. 81 3.3.6 Klonierung zweier Triterpensynthase-cDNAs aus Lycopersicon esculentum...................... 81 3.3.6.1 Lycopersicon esculentum β-Amyrinsynthase LeTTS1......................................................... 81 3.3.6.2 Lycopersicon esculentum Triterpensynthase LeTTS2......................................................... 84 3.4 Charakterisierung der klonierten 2,3-Oxidosqualenzyklasen mittels heterologer Expression in der Hefemutante GIL 77 .............................86 3.4.1 Charakterisierung der Ricinus communis Lupeolsynthase RcLUS1 ................................... 86 3.4.2 Charakterisierung der Ricinus communis Cycloartenolsynthase RcCAS1.......................... 90 3.4.3 Charakterisierung der Lycopersicon esculentum β-Amyrinsynthase LeTTS1..................... 95 3.5 Expressionsmuster der Oxidosqualenzyklasen RcLUS1 und RcCAS1 ..........97 3.5.1 Expression in verschiedenen Pflanzengeweben ................................................................. 97 3.5.2 Expression während der frühen Sprossachsenentwicklung ................................................ 98 3.6 Site-directed mutagenesis-Versuche an RcLUS1............................................100 3.6.1 Die Wahl der zu mutierenden Aminosäurereste ................................................................ 100 3.6.2 Charakterisierung der RcLUS1-Mutante F257W ............................................................... 102

4 Diskussion ...............................................................................................103

4.1 Ausbildung des Glaucous-Phänotyps von Ricinus communis .....................103 4.1.1 Chemische und mikromorphologische Charakteristika der beiden Sprossachsen- Phänotypen: Wachskristalle als Verursacher des Glaucous-Phänotyps ........................... 103 4.1.2 Die Schichtung der Kutikula bei Ricinus communis........................................................... 105 4.1.3 Dynamik der kutikulären Wachszusammensetzung während früher Stadien der Hypokotyl-Entwicklung................................................................................................. 110 4.1.4 Die Biosynthese von kutikulärem Lupeol bei Ricinus communis im ökologischen Kontext – das „Greasy pole Syndrom“.................................................... 116

Inhalt V

4.2 Die Bedeutung pflanzlicher Triterpensynthasen für die Biosynthese kutikulärer pentazyklischer Triterpene.............................................................120 4.2.1 Biosynthese kutikulärer Triterpene bei Ricinus communis - die Kutikularelevanz der Lupeolsynthase RcLUS1 ............................................................................................. 121 4.2.2.1 Das Expressionsverhalten der klonierten Epoxysqualenzyklasen in verschiedenen Pflanzenorganen.................................................................................... 121 4.2.2.2 Vergleich der RcLUS1-Expression mit der kutikulären Triterpen-Akkumulation im Laufe der frühen Hypokotylentwicklung ........................................................................ 122 4.2.2.3 Die Ausbildung der Kutikula-Phänotypen als Folge der differenziellen Regulation der Biosynthese von kutikulärem Lupeol durch RcLUS1................................................... 125 4.2.2.4 RcTTS2 – eine weitere Triterpensynthase aus Ricinus communis ................................... 129 4.2.2 Die Biosynthese kutikulärer Triterpene in Lycopersicon esculentum ................................ 130 4.3 Die klonierten und charakterisierten Triterpensynthasen als Mitglieder der Epoxysqualenzyklasen-Genfamilie ............................................................135 4.3.1 Klonierung pflanzlicher Epoxysqualenzyklasen durch die Einbeziehung von Sequenz-Unterschieden in den Gen-Unterfamilien..................................................... 135 4.3.2 Die klonierten und charakterisierten 2,3-Oxidosqualenzyklasen im Kontext pflanzlicher Epoxysqualenzyklasen ................................................................................... 136 4.3.2.1 Phylogenetische Untersuchungen ..................................................................................... 136 4.3.2.2 RcLUS1 im Vergleich zu anderen Lupeolsynthasen – Gerichtete Mutagenese-Versuche141 4.3.2.3 Genomische Sequenzen von RcLUS1 und RcCAS1......................................................... 144 5 Ausblick ...................................................................................................145 6 Zusammenfassung .................................................................................148 7 Summary..................................................................................................151 8 Literaturverzeichnis ................................................................................154 Anhang A Verwendete Medien und Puffer ............................................................................165 B Klonierte und charakterisierte pflanzliche 2,3-Oxidosqualenzyklasen..................168 C Primerdesign zur homologiebasierten Klonierung pflanzlicher Epoxysqualenzyklasen .........................................................................................169 D Verwendete Primer ...............................................................................................174 E Klonierte Sequenzdaten .......................................................................................178 F Abbildungsverzeichnis..........................................................................................185 G Tabellenverzeichnis..............................................................................................189 H Verwendete Abkürzungen ....................................................................................191 Danksagung ........................................................................................................................192 Publikationsliste...................................................................................................................193 Lebenslauf...........................................................................................................................194 Erklärung .............................................................................................................................195

1 Einführung 1

1 Einführung

1.1 Biosynthese pentazyklischer Triterpene in Pflanzen

Pentazyklische Triterpene gehören der großen Stoffgruppe der Terpenoide an, eine der

umfangreichsten Klassen sekundärer Pflanzenstoffe. Als Terpenoide bezeichnet man

Verbindungen, die sich formal in Isopren-Bausteine zerlegen lassen und sich biosynthetisch

vom Isopentenylpyrophosphat (IPP) ableiten, einer C5-Einheit, die bei höheren Pflanzen

ausgehend von Acetyl-CoA über Mevalonsäure als Intermediat gebildet wird. Der erst vor

wenigen Jahren beschriebene alternative plastidäre Desoxy-D-D-xylulose-5-phosphat-Weg

zur Biosynthese von IPP (Lichtenthaler et al. 1997) spielt bei der Triterpen-Bildung höherer

Pflanzen vermutlich keine Rolle.

Triterpene entstehen durch die Schwanz/Schwanz-Dimerisierung von zwei C15-

Grundeinheiten auf der Stufe von Farnesyldiphosphat unter Mitwirkung der Squalen-

Synthase. Dabei entsteht Squalen, ein ungesättigter C30-Kohlenwasserstoff, der in

prokaryotischen Organismen direkt über sogenannte Squalen-Hopen-Zyklasen (SHC) zu

Hopen zyklisiert wird (Abb. 1-1) (Wendt et al. 2000). In eukaryotischen Organismen wird das

Squalen durch die Squalen-Monooxygenase mit Hilfe von molekularem Sauerstoff zunächst

in das entsprechende 2,3-Epoxid überführt. Erst das 2,3-Oxidosqualen ist der

Ausgangspunkt für die nachfolgenden Zyklisierungsreaktionen, die in die Ausbildung der

enormen strukturellen Vielfalt von Triterpenen münden und von so genannten 2,3-Oxido-

squalenzyklasen oder Epoxysqualenzyklasen (OSC) katalysiert werden (Xu et al. 2004).

Oxidosqualenzyklasen kontrollieren an einer zentralen Verzweigungsstelle im

Biosyntheseweg von Sterolen und „echten“ pentazyklischen Triterpenen den biosyntheti-

schen Fluss des Substrats in den Primär- bzw. Sekundärmetabolismus der Pflanze (Henry et

al. 1992). Die Zyklisierung von 2,3-Oxidosqualen vollzieht sich in einer einzigen

enzymkatalysierten, extrem exothermen Reaktion und stellt einen der komplexesten

Reaktionsmechanismen dar (Abe et al. 1993). Der Mechanismus beinhaltet a) die

Protonierung und damit die Öffnung des Epoxidringes, b) eine Reihe von

Zyklisierungsschritten über intramolekulare Kation-Olefin-Reaktionen, c) die Umstruktu-

rierung der intermediär gebildeten instabilen Karbokationen durch Hydrid- und Methyl-

gruppenwanderungen entlang einer thermodynamisch und kinetisch günstigen Kaskade und

d) die Deprotonierung, die schließlich zur Bildung des Endproduktes führt (Poralla 1999). In

Pflanzen zyklisiert die Cycloartenolsynthase (CAS) die Sessel-Boot-Sessel-Konformation

des 2,3-Oxidosqualens über das Protosteryl-Kation zum tetrazyklischen Cycloartenol (Brown

1998). Diese Reaktion entspricht der Zyklisierung von 2,3-Oxidosqualen zu Lanosterol durch

Lanosterolsynthasen (LS) in tierischen Organismen und Pilzen (Abb. 1-1).

1 Einführung 2

Abbildung 1-1: Biosynthesewege von Steroiden und Triterpenen. Bei prokaryotischen Organismen erfolgt die Biosynthese über die Zyklisierung von Squalen durch Squalen-Hopen-Zyklasen (SHC), während bei Eukaryoten die Zyklisierung von 2,3-Oxidosqualen von sogenannten Oxidosqualen-zyklasen (OSC) katalysiert wird.

O

OHOH

C+

OH OH

C+

OH

C+

OH

Tiere/Pilze Pflanzen

Protosteryl-Kation

Protosteryl-Kation

Dammarenyl-Kation

Lanosterol Cycloartenol

Triterpene (z.B. β-Amyrin)

Lano

ster

olsy

ntha

se (L

S)

Cyc

loar

teno

lsyn

thas

e (C

AS)

Trite

rpen

synt

hase

(TTS

) z.

B. β

-Am

yrin

synt

hase

(bA

S)

Sessel- Boot-

Sessel

Sessel-Boot- Sessel

Sessel- Sessel- Sessel

2,3-Oxidosqualen

Steroide Phytosterole z.B. Brassinosteroide

Squalen

Squalen- Monooxygenase

C+

Hopenyl- Kation

Hopen

Bakterien

Squalen-Hopen-Zyklase (SHC)

weitere kationische Zwischenstufen

Hopanoide

OO

1 Einführung 3

Cycloartenol ist der Ausgangspunkt der Phytosterol-Biosynthese, die zur Bildung von

wichtigen Membranbestandteilen wie Stigmasterol oder β-Sitosterol, aber auch zur Synthese

wichtiger Pflanzenhormone wie Brassinosteroiden führt (Benveniste 2004). In allerjüngster

Vergangenheit wurden Lanosterolsynthasen auch aus pflanzlichen Organismen wie

Arabidopsis thaliana und Lotus japonicus charakterisiert (Kolesnikova et al. 2006; Suzuki et

al. 2006; Sawai et al. 2006). Vor dem Hintergrund dieser Arbeiten ist davon auszugehen,

dass sich in Pflanzenorganismen neben dem „klassischen“ Biosyntheseweg von Sterolen

über Cycloartenol ein weiterer Weg über Lanosterol als Zwischenprodukt evolvierte.

Im Gegensatz dazu zyklisieren Triterpensynthasen (TTS) die Sessel-Sessel-Sessel-

Konformation des 2,3-Oxidosqualens über das Dammarenyl-Kation zu verschiedenen

Triterpen-Alkoholen (Abb. 1-1). Die bemerkenswerte strukturelle Diversität pflanzlicher

pentazyklischer Triterpene wird also durch die strikte enzymatische Kontrolle des

Zyklisierungsprozesses und des terminierenden Deprotonierungsschrittes generiert. Abbil-

dung 1-2 gibt eine Übersicht über die Bildung kationischer Zwischenstufen und der jeweiligen

aus Deprotonierungsschritten resultierenden Endprodukte. Durch eine D-Ring-Erweiterung

des Dammarenyl-Kations über C16-Migration und der 18β-E-Ring-Zyklisierung des

Baccharenyl-Kations ensteht das Lupenyl-Kation, das ohne weitere Umlagerungen zum

Lupeol deprotoniert wird. Kommt es jedoch zu einer E-Ring-Expansion über C21-Migration

am Lupenyl-Kation, ensteht das Germanicyl-Kation, das wiederum entweder durch

Protonenverlust an C18 zu Germanicol oder über eine Kaskade von 1,2 Hydrid- und 1,2-

Methylgruppenwanderungen zur Bildung weiterer Kationen führt, die ihrerseits zu

entsprechenden Endprodukten deprotoniert werden.

In den letzten Jahren wurden eine Reihe pflanzlicher Oxidosqualenzyklasen kloniert und

auf ihre Produktspezifität hin funktionell charakterisiert, darunter Cycloartenolsynthasen, β-

Amyrinsynthasen (bAS), Lupeolsynthasen (LUS), eine Isomultiflorenolsynthase (IMS) und

mehrere multifunktionale Triterpensynthasen (MFS) (Phillips et al. 2006; Übersicht siehe

Anhang B). Vor dem Hintergrund dieser Informationen und weiterer Sequenzierungen aus

tierischen und mykotischen Systemen war es möglich, mit Hilfe von Inhibitor-

Untersuchungen und gerichteten Mutageneseansätzen, für die Enzymfunktionen essentielle

Sequenzmotive zu definieren, die allen OSCs zueigen sind (Haralampidis et al. 2002). An

erster Stelle ist hier das hochkonservierte Aminosäuremotiv DCTAE zu nennen, das für die

Substratbindung verantwortlich ist (Abb. 1-3). Das elektrophile Aspartat in diesem

Substratbindungsmotiv spielt eine wichtige Rolle bei der Protonierung der Epoxidgruppe des

Substrates und ist damit für die Initiation der Zyklisierungsreaktion von entscheidender

Bedeutung. Zusätzlich finden sich in allen OSCs vier bis acht repetitive, an aromatischen

Resten reiche Aminosäuresequenzmotive, die wegen ihres konservierten Sequenzmotives

Q---G-W „QW-Motive“ genannt werden (Abb. 1-3) (Poralla et al. 1994). Sie tragen zur

1 Einführung 4

Abbildung 1-2: Mechanismus der Zyklisierung von 2,3-Oxidosqualen zu pentazyklischen Triterpenen über die Bildung instabiler kationischer Zwischenstufen (grau), vermittelt durch 1,2-Hydrid- und Methylgruppenwanderungen und einen terminalen Deprotonierungsschritt. RB = Ringbildung, RE = Ringerweiterung.

C+

OHC+

OH OH

C+

OH

C+

OH OH

C+

OH

OHO

C+

OHC

+

OH OH

C+

OHOH

C+

OH OHOHOH

C+

OHC

+

OH OHOHO

Lupeol

Germanicol

β-Amyrin

δ-Amyrin

Taraxerol

MultiflorenolGlutinol

Friedelin ψ-Taraxasterol

Taraxasterolα-Amyrin

2,3-Oxidosqualen Dammarenyl-Kation Baccharenyl-Kation Lupenyl-Kation

Friedelyl-Kation

Taraxastyl-Kation Isoursyl-Kation

Ursanyl-Kation Germanicyl-Kation

RB RE RB -H+

-H+

-H+

-H+

-H+

-H+

-H+

-H+

-H+

-H+

-H+

H 1,2(2x)

RE

Me 1,2Me 1,2

Me 1,2 (2x)

Me 1,2

Me 1,2

H 1,2

Me 1,2H 1,2

Me 1,2

H 1,2

Taraxeryl-Kation

C+

OH

18

16

13

15

17

C+

OH3 5 7

1

12

9 25 26

20

16

17 18

19 21 29

30

22

23 24

21 C+

OH

19

20 29 30

OH

C+

3 5 7

19 18

14

16

20 25 21

13 12

9

17

1 15

28 29

30

26

27

8

Stabilisierung der Enzymfaltung während der hoch exergonischen Zyklisierungsreaktion bei

(Wendt et al. 1997).

1 Einführung 5

Abbildung 1-3: Schematische Darstellung der Sekundärstruktur einer 2,3-Oxidosqualenzyklase. Die konservierten QW-Motive (rot) und das Substratbindungsmotiv SB (grün) sind farblich hervorgehoben.

In Untersuchungen zur subzellulären Lokalisierung von OSCs konnte zudem gezeigt

werden, dass die Aktivität der Zyklasen mit Mikrosomen/Lipidpartikeln assoziiert ist, ein

Hinweis auf die membrangebundene Natur der Zyklasen (Milla et al. 2002b; Milla et al.

2002a).

Die vor kurzem veröffentlichte dreidimensionale Struktur der menschlichen Lanosterol-

synthase (Thoma et al. 2004) stellt zweifellos einen Meilenstein in der Erforschung der

enzymatisch regulierten Umwandlung von Olefinen in komplexe und biologisch bedeutsame

polyzyklische Produkte dar. Die Kenntnis der Proteinstruktur dieser Zyklase erlaubt

einerseits die Überprüfung und Bestätigung des bisherigen Forschungsstandes bezüglich

Struktur-Funktions-Beziehungen in der Enzymfamilie und ermöglicht darüber hinaus ein

tieferes Verständnis für den Aufbau und die Funktionsweise von Oxidosqualenzyklasen im

Allgemeinen und soll deshalb kurz vorgestellt werden. Die menschliche OSC kristallisiert als

Monomer und besteht aus zwei (α/α)-Barrel-Domänen, die über Schleifen und drei kleinere

β-Faltblatt-Strukturen miteinander verbunden sind (Abb. 1-4). Das aktive Zentrum des

Moleküls ist zwischen Domäne 1 und 2 lokalisiert. Die N-terminale Region des Enzyms füllt

den Raum zwischen beiden Domänen und trägt zur Stabilisierung der relativen Lage beider

Domänen zueinander bei. Bei der menschlichen OSC handelt es sich um ein monotopes

Membranprotein, d.h., es insertiert in die Membran, durchspannt jedoch nicht die gesamte

Bilayerstruktur. Die membraninsertierende Oberfläche besteht aus einem unpolaren Plateau

und einem Kanal, der in die Höhlung des aktiven Zentrums führt und dem Substrat über

diese Kontaktregion den Eintritt aus dem Membraninneren in das hydrophobe aktive

Zentrum der Zyklase ermöglicht.

Neben den oben genannten Gemeinsamkeiten von Epoxysqualenzyklasen unter-

scheiden sich Triterpensynthasen klar von Lanosterol- und Cycloartenolsynthasen in ihrer

Aminosäuresequenz und bilden eine eigene Untergruppe innerhalb der OSC-Superfamilie

(Haralampidis et al. 2002). Während viele Triterpensynthasen eine hohe Spezifität in der

Synthese ihres Produkts aufweisen und im Wesentlichen nur ein einziges Triterpen

zyklisieren, zeigen andere Enzyme multifunktionale Eigenschaften und produzieren eine

ganze Reihe verschiedener Zyklisierungsprodukte. Untersuchungen zur Produktspezifität

von Chimären aus der Lupeolsynthase von Arabidopsis thaliana (AtLUP1) und der β-

Amyrinsynthase von Panax ginseng (PNY), gewonnen durch heterologe Expression in Hefe-

Mutanten zeigten, dass der Austausch bereits kurzer Aminosäurebereiche ausreicht, um das

N C~760 Aminosäuren

QW QW QW QW SB

1 Einführung 6

N-terminale Sequenzregion

Membran- insertionsregion

Domäne 1

Domäne 2

QW-Motive

SB-Motiv

Produkt

Produktmuster der entsprechenden Enzym-Chimären in Richtung Lupeol bzw. β-Amyrin zu

verschieben (Kushiro et al. 1999; Kushiro et al. 2000a). Mehr noch: Durch gerichtete

Mutagenisierungen (site-directed mutagenesis) wurde gezeigt, dass der Austausch bereits

einer einzelnen Aminosäure ausreicht, um die Produktspezifität pflanzlicher

Triterpensynthasen zu verändern (Kushiro et al. 2000b).

Abbildung 1-4: Bandmodell der dreidimensionalen Struktur der menschlichen Lanosterolsynthase. Das Modell wurde mit Hilfe des Programms UCSF Chimera (Version1) erstellt. PDB ID: 1W6K. Triterpene sind häufig auftretende Sekundärmetabolite und das von Pflanzen produzierte

Spektrum ist jeweils artspezifisch. Sie zeigen potenziell nützliche pharmakologische

Eigenschaften (Mahato und Sen 1997) wie z. B. entzündungshemmende (Fernandez et al.

2001; Akihisa et al. 1996) oder krebshemmende (Haridas et al. 2001) Wirkungen und haben

wirtschaftliche Bedeutung als kosmetische Stoffe, Detergentien und Süßstoffe (Hostettmann

und Marston 1995). Triterpene finden sich in den organischen Rückständen antiker Gefäße

und dienen so Archäologen als Marker für die Untersuchung von Nahrungsgewohnheiten in

vorgeschichtlicher Zeit (Evershed et al. 1997). Trotz ihres ubiquitären Vorkommens im

Pflanzenreich ist über die Funktion der Triterpene in der Pflanze selbst nur relativ wenig

1 Einführung 7

bekannt. Einige Arten akkumulieren größere Mengen von Triterpen-Glycosiden, sogenannte

Triterpen-Saponine (Osbourn 2003). Saponine sind mit ihrer antimikrobiellen Wirkung

Bestandteil des pflanzlichen Abwehrsystems gegen Pathogenbefall (Osbourn 1996; Nagata

et al. 1985), wie am Beispiel des Avenacins in Hafer gezeigt werden konnte (Papadopoulou

et al. 1999). Daneben werden für Saponine Funktionen als Abwehrstoffe gegen Insekten-

befall (Agerbirk et al. 2003; Svoboda et al. 1995), als allelopathische Stoffe (Waller et al.

1993) und als Regulatoren von Gravitropismus (Rahman et al. 2001), Zellulosesynthese

(Ohana et al. 1998) und Wurzelwachstum (Tsurumi und Wada 1995) diskutiert.

Welche physiologischen und ökologischen Funktionen übernehmen jedoch Triterpen-

Aglycone in planta? In der Literatur wurde über eine Funktion pentazyklischer Triterpene als

Strukturkomponenten von Biomembranen in manchen Pflanzengeweben spekuliert (Baisted

1971; Nes und Heftmann 1981). Daneben akkumulieren bestimmte Pflanzenarten größere

Mengen pentazyklischer Triterpene im primären Abschlussgewebe ihrer oberirdischen

Organe wie Blätter, Früchte, Blüten und Sprossachsen. Als Bestandteile der pflanzlichen

Kutikula übernehmen Triterpene hier wichtige physiologische und ökologische Aufgaben.

1.2 Die pflanzliche Kutikula

Die Kutikula bildet die großflächige Grenzschicht zwischen den oberirdischen

Pflanzenorganen mit primärem Abschlussgewebe und der Atmosphäre. Dabei handelt es

sich um eine lückenlose, 1-15 µm dicke, extrazelluläre Membran, die den Außenwänden der

äußersten Zellschicht, der Epidermis, aufgelagert ist (Riederer 1991). Der Hauptbestandteil

der Kutikula ist Kutin, ein Lipidbiopolymer aus langkettigen Hydroxy-16:0- und -18:1-

Fettsäuren, die über Esterbrücken miteinander verbunden sind und so ein dreidimensionales

Netzwerk bilden, das der Kutikula mechanische Stabilität verleiht (Holloway 1982). In diese

hydrophobe Polymermatrix ein- und ihrer Außenseite aufgelagert sind lösliche Lipide, die in

ihrer Gesamtheit als kutikuläre Wachse bezeichnet werden (Post-Beittenmiller 1996). Sie

bestehen aus einem Gemisch aliphatischer, meist unverzweigter Verbindungen wie n-

Alkanen, Karbonsäuren, primären und sekundären Alkoholen, Aldehyden und Ketonen mit

Kettenlängen zwischen 20 und 36 Kohlenstoffatomen (Baker 1982; Walton 1990;

Kolattukudy et al. 1976; Kunst und Samuels 2003), sowie Alkyl-Estern mit Kettenlängen

zwischen C40 und C60 (Riederer und Markstädter 1996). Daneben kommen in kutikulären

Pflanzenwachsen aber auch nicht selten zyklische Verbindungen wie Phenole oder

Triterpene vor (Baker 1982; Wollenweber und Dietz 1981a; Wollenweber und Dietz 1981b).

Die pflanzliche Kutikula ist keine einfache, homogene Struktur, sondern aus

verschiedenen Schichten mit unterschiedlichen physikalischen und chemischen Eigen-

1 Einführung 8

schaften aufgebaut (Jeffree 1986) (Abb. 1-5). Sie besteht aus einer tiefer gelegenen Zone,

der sogenannten Kutikularschicht (cuticular layer) und einer darauf aufgelagerten Schicht,

die als eigentliche Kutikula (cuticle proper) bezeichnet wird (Jeffree 2006). Die eigentliche

Kutikula setzt sich aus intrakutikulären Wachsen und Kutin zusammen, während in die

Kutikularschicht zusätzlich Zellwandkomponenten wie Pektin, Zellulose und andere

Kohlenhydrate eingelagert sind. Zwischen der Kutikularmembran (cuticle proper + cuticular

layer) und den Periklinalwänden der Epidermiszellen liegt eine pektinreiche Schicht, die der

Mittellamelle äquivalent ist. Zur Atmosphäre hin ist der eigentlichen Kutikula ein dünner, nur

aus wenigen Moleküllagen bestehender, amorpher Film aus epikutikulärem Wachs

aufgelagert. Zusätzlich können an der Oberfläche der Kutikula epikutikuläre Wachskristalle

charakteristischer Formen, die aus dem Film herausragen, ausgebildet sein (Abb. 1-5B). Auf

der Grundlage von intensiven rasterelektronenmikroskopischen Untersuchungen pflanzlicher

Oberflächen in den letzten Jahrzehnten wurden zahlreiche Formen solcher Wachskristalle

beschrieben und klassifiziert (z. B. Barthlott et al. 1998; Jeffree 2006). Dabei wird im Wesent-

lichen zwischen Körnchen, Plättchen, Stäbchen, Fäden und Röhrchen unterschieden, wobei

die einzelnen Formen oft art- oder sogar organspezifisch auftreten. Durch in vitro-

Rekristallisierungsversuche konnte für ausgewählte Pflanzenarten gezeigt werden, dass

jeweils charakteristische Komponenten bzw. Komponentenklassen für die Bildung der

Kristalle und ihrer charakteristischen Formen verantwortlich sind (Jetter und Riederer 1994;

Jetter und Riederer 1995; Meusel et al. 1999).

Abbildung 1-5: Schematischer Aufbau der Kutikula. A: Kutikula ohne epikutikuläre Wachskristalle. B: Kutikula mit epikutikulären Wachskristallen. CL = cuticular layer (Kutikularschicht); CP = cuticle proper(eigentliche Kutikula); EWF = epikutikulärer Wachsfilm; EWK = epikutikuläre Wachskristalle; IW = Intrakutikuläre Wachse; P = Pektinschicht/Mittellamelle; PL = Plasmalemma. (verändert nach Jeffree, 1986).

IW +

Kutin

Zellwand

EWF

EWK

PL PL

P

CL

CP

CL

CP

A B

1 Einführung 9

In den letzten Jahren wurden Methoden zur präparativen Fraktionierung epi- und

intrakutikulärer Wachskomponenten entwickelt (Ensikat et al. 2000; Jetter et al. 2000b; Jetter

und Schäffer 2001). Zur selektiven Gewinnung epikutikulärer Wachsbestandteile werden

dabei oberflächennahe Substanzen mechanisch mit Hilfe eines Adhäsivs von den

Pflanzenoberflächen abgehoben und so von intrakutikulären Wachskomponenten präparativ

isoliert. Entsprechende Untersuchungen an Prunus laurocerasus (Jetter et al. 2000b),

Nepenthes alata (Riedel et al. 2003) und Macaranga tanarius (Guhling et al. 2005) zeigten,

dass sich die quantitativen wie auch die qualitativen Zusammensetzungen epi- und

intrakutikulärer Wachsmischungen innerhalb einer Art eklatant voneinander unterscheiden

können, so dass es zu einer auffälligen Differenzierung innerhalb der Kutikula bezüglich ihrer

Wachskomponenten, gewissermaßen also zu einer chemischen Schichtung kommen kann.

Die Ausbildung einer Kutikula wird allgemein als evolutive Anpassung an das in

terrestrischen Lebensräumen herrschende Gefälle des Wasserpotenzials zwischen dem

Inneren des Pflanzengewebes und der Umgebung interpretiert. Sie stellt eine effektive

Schutzvorrichtung gegen das Austrocknen dar (Burghardt und Riederer 2006). Durch das

extraktive Entfernen der gesamten kutikulären Wachse aus Kutikularmembranen konnte

deren Durchlässigkeit um mehrere Größenordnungen erhöht werden (Riederer 1991). Die

Gesamtheit der kutikulären Wachse bildet also die wesentliche Barriere für den Transport

von Wasser und anderen Stoffen durch die Kutikula (Riederer und Schreiber 1995). Die

primäre physiologische Funktion sowohl der epi-, als auch der intrakutikulären Wachse

besteht demnach in der Gewährleistung des Transpirationsschutzes der Pflanze. Im

Gegensatz dazu können auf Grund der chemischen Eigenschaften kutikulärer Wachse

zahlreiche lipophile Substanzen aus der Umgebung in Form gasförmiger, fester oder

gelöster Stoffe absorbiert und in die Pflanze transportiert werden (Riederer und Schönherr

1986; Schönherr und Riederer 1989; Schreiber und Schönherr 1992).

Dagegen bestimmen insbesondere die epikutikulären Wachse bzw. Wachskristalle als

äußerste Grenzschicht des Gewebes mit der Umwelt die Eigenschaften der unmittelbaren

Pflanzenoberfläche. Epikutikuläre Wachskristalle reduzieren die Strahlungsintensität

insbesondere ultravioletter Strahlung durch Teilreflexion (Clark und Lister 1975) und

schützen das darunter liegende Gewebe auf diese Weise vor Strahlungsschäden (Caldwell

et al. 1983). Wachskristalle können daneben die Verdunstung durch Bildung bewegungs-

freier Luftschichten über Stomata verringern und somit zum Transpirationsschutz der Pflanze

beitragen (Jeffree et al. 1971). Die lipophilen Eigenschaften des Wachses und die

Entstehung mikroskopischer Rauigkeit durch Kristallbildung verringern die Benetzbarkeit von

Pflanzenoberflächen durch Wasser (Holloway 1969; Holloway 1970), so dass die Bildung

eines geschlossenen Wasserfilms verhindert wird. Diese reduzierte Benetzbarkeit bewirkt,

dass Schmutzpartikel und Verbreitungseinheiten phytopathogener Mikroorganismen von der

1 Einführung 10

Pflanzenoberfläche im Zuge eines Selbstreinigungsmechanismus durch Wasser entfernt

werden (Lotus-Effekt) (Barthlott und Neinhuis 1997) und dass die Pflanze vor Pathogenen,

die Feuchtigkeit zur Auskeimung benötigen, geschützt ist (Schwab et al. 1995).

Gerade die Wechselwirkungen mit anderen Organismen sind in vielfältiger Weise durch

epikutikuläre Wachse bestimmt (Müller und Riederer 2005). So beeinflussen sie z. B. die

Infektion der Pflanze durch phytopathogene Pilze in Phasen der Orientierung (Wilkinson und

Roberts 1996) sowie der Adhäsion des Pilzes auf der Oberfläche (Deising et al. 1992;

Nicholson et al. 1993; Mercure et al. 1994) und liefern chemische Signale im Zuge der

Wirtserkennung durch den Pilz (Carver et al. 1990; Podila et al. 1993; Carver und Gurr

2006). Wachskristallbereifte Oberflächen spielen auf Grund ihrer biomechanischen

Eigenschaften eine wichtige Rolle bei Pflanzen-Insekten-Interaktionen (Müller 2006).

Generell können Insekten auf wachsbereiften pflanzlichen Oberflächen nur schlecht haften

und laufen, die Oberflächen sind also rutschig und bilden eine Barriere für Insekten. Jedoch

konnte bisher nur für drei Pflanzensysteme nachgewiesen werden, dass die epikutikulären

Wachskristalle auf Grund dieser Eigenschaft eine definierte ökologische Funktion erfüllen

und dahingehend evolutionär optimiert sind: a) Epikutikuläre Wachskristalle (z.B. bei Hypenia

vitifolia) dienen mit ihrer Barriereeigenschaft für Schadinsekten dem Schutz wichtiger

hochgelegener Organe wie Blüten oder Fruchtständen, ein Phänomen, das als „greasy pole

syndrome“ bezeichnet wurde (Harley 1991; Juniper 1995; Eigenbrode 1996). b) Seit langem

ist bekannt, dass bei fleischfressenden Pflanzen der Gattung Nepenthes epikutikuläre

Wachskristalle in der Gleitzone der Kannen das Ausrutschen von Beuteinsekten bewirken

(Knoll 1914) und damit ein zentrales Element für den Beutefang darstellen. c) Vor einigen

Jahren konnte ein weiteres Beispiel für eine wichtige ökologische Funktion epikutikulärer

Wachskristalle beschrieben werden, und zwar innerhalb der Ameisenpflanzen-Gattung

Macaranga (Federle et al. 1997). Wachskristallbereifte Oberflächen fungieren hier als

mechanische Barriere für aggressive, generalistische Ameisen, während sich spezifische

Partnerameisen der Pflanzen frei auf der Kristallschicht bewegen, so dass Kristalle hier eine

wesentliche ökologische Filterfunktion übernehmen.

1.3 Triterpene als kutikuläre Wachskomponenten

Zahlreiche Pflanzenarten akkumulieren pentazyklische Triterpen-Verbindungen in

charakteristischen und artspezifischen Mischungen als Wachsbestandteile in ihrer Kutikula.

Aus der großen Menge triterpenoider Kohlenstoffstrukturen mit mehr als 200 bekannten C-

Grundgerüsten (Xu et al. 2004) findet sich im Kutikulawachs höherer Pflanzen jedoch nur

eine relativ geringe Anzahl verschiedener Vertreter dieser Verbindungsklasse. Es handelt

sich dabei meist um pentazyklische Triterpene vom Lupan-, Oleanan- oder Ursantyp,

1 Einführung 11

gekennzeichnet durch das Vorhandensein von fünf kondensierten Kohlenstoffringen. Relativ

weit verbreitete Verbindungen stellen die Triterpenole Lupeol, β-Amyrin, α-Amyrin oder

Germanicol dar (Walton 1990). Immer wieder erweitern Untersuchungen der Wachs-

zusammensetzung verschiedener Pflanzenarten jedoch die Palette der kutikularelevanten

Triterpenoide, wie z. B. bei Lycopersicon esculentum mit δ-Amyrin als eine der Wachshaupt-

komponenten der Fruchtkutikula (Vogg et al. 2004). Daneben lassen sich aber auch

Verbindungen vom Taraxeran-Typ (bei Macaranga (Markstädter et al. 2000)) oder vom

Glutinan-Typ (bei Euphorbia (Hemmers et al. 1989a)) nachweisen.

Neben diesen Triterpenolen, die allesamt durch die Hydroxyl-Funktion in 3β-Position

gekennzeichnet sind, finden sich Vertreter entsprechender Ketone im kutikulären

Wachsgemisch, z. B. Friedelin bei Citrus paradisi (Nordby und McDonald 1994) oder

Germanicon bei Xerosicyos danguyi (Wollenweber et al. 1999). Daneben konnten außerdem

C28-Oxidationsprodukte wie Betulin (Wollenweber et al. 1999) oder Erythrodiol (Griffiths et

al. 2000) im pflanzlichen Oberflächenwachs identifiziert werden, sowie die entsprechenden

Hydroxysäuren Oleanol- und Ursolsäuren, z.B. bei Oliven-Früchten (Bianchi et al. 1992) oder

bei Prunus laurocerasus (Jetter et al. 2000). Schließlich wurden verschiedene Derivate

pentazyklischer Triterpene als Kutikulabestandteile beschrieben, darunter Acetate (z. B. β-

Amyrinacetat bei Tilia tomentosa (Gülz et al. 1988)), mit langkettigen Fettsäuren von C16 bis

C30 veresterte Triterpene (z. B. β-Amyrin-Ester bei Euphorbia lathyris (Hemmers et al.

1989b)) oder Triterpenmethylether (z. B. Lupeolmethylether bei Palmengewächsen wie Butia

capitata (Garcia et al. 1995) oder bei Arten der Gattung Cortaderia aus der Familie der

Gramineae (Martin-Smith et al. 1967)). Eine Auswahl von Strukturbeispielen verschiedener

Triterpen-Wachskomponenten bietet Abbildung 1-6.

Bei manchen Pflanzenarten, wie der Modellpflanze Arabidopsis thaliana, treten

Triterpene nur in Spuren oder geringen Mengen in Erscheinung, während sie bei anderen

Arten die kutikulären Wachsmischungen als Hauptkomponenten dominieren (Jetter et al.

2006). Viele Arten der Ameisenpflanzen-Gattung Macaranga aus der Familie der

Euphorbiaceae beispielsweise weisen hohe Konzentrationen der Triterpene Taraxeron und

Epi-Taraxerol im kutikulären Wachs ihrer Sprossachsen auf (Markstädter et al. 2000). Auch

bei anderen Arten der Wolfsmilchgewächse lassen sich große Mengen Triterpene im

kutikulären Wachs nachweisen, wie bei Arten der Gattung Euphorbia (Hemmers et al. 1988)

oder bei der Nutzpflanze Manihot esculenta (Markstädter et al. 2000). Darüber hinaus finden

sich hohe Triterpenanteile bei Vertretern aus vielen anderen Pflanzenfamilien, wie den

Crassulaceae (z. B. in den Gattungen Kalanchoe (R. Jetter, unveröffentlichte Daten),

Echeveria und Dudleya (Manheim und Mulroy 1978)), den Bignoniaceae (im Blattwachs von

Newbouldie laevis und Markhamia acuminata dominieren die Triterpene Ursol- und

Oleanolsäure mit bis zu 60% des Gesamtwachses (Gormann et al. 2004)), oder den Loran-

1 Einführung 12

Acetate Säuren

O OO O

Ketone

OH

O

OH

OH

OH

O

OO

OHOH

OH OH

OH OH

OH

OH

OH

OH OH

CH2OH

Alkohole Lupeol

Multiflorenol Taraxerol Germanicol

Fernen

Glutinol

β-Amyrin α-Amyrin δ-Amyrin

Taraxasterol ψ-Taraxasterol Erythrodiol Betulin

Friedelin α-Amyrinon Taraxeron Lupeolmethylether

Oleanolsäure Ursolsäure Lupeolacetat OO

β-Amyrinacetat

Abbildung 1-6: Pentazyklische Triterpene als typische Wachskomponenten der pflanzlichen Kutikula. Während sich Triterpen-Alkohole, -Ketone, -Säuren und -Acetate biosynthetisch von Oxidosqualen als dessen Zyklisierungs-produkte ableiten, handelt es sich bei Fernen im Gegensatz dazu vermutlich um ein Squalen-Zyklisierungsprodukt; solche Triterpene finden sich im Wachs niederer Pflanzen wie Farne.

Methylether

OH

CH2OH

1 Einführung 13

thaceae (bei Viscum album und V. crutiatum besteht der größte Anteil des kutikulären

Wachses aus Triterpensäuren (Haas et al. 2003)). Diese wenigen Beispiele verdeutlichen

bereits, dass das Vorkommen pentazyklischer Triterpene im kutikulären Wachs höherer

Pflanzen taxonomisch weit verbreitet ist (Übersicht in Bianchi 1995; Jetter et al. 2006)), und

ein, wenn auch nicht dem Regelfall entsprechendes, so doch nicht seltenes Phänomen

darstellt.

Nicht nur bei Angiospermen, auch bei Farngewächsen treten pentazyklische Triterpene

als Hauptbestandteile des Kutikulawachses in Erscheinung. Adiantum pedatum weist hohe

Mengen an Adiantan-22-on auf, während bei Belvisia platyrhynchos und Polypodium aureum

Fern-8-en die Hauptkomponente stellt (R. Jetter, unveröffentlichte Daten). Im Blattwachs von

Lophosoria quadripinnata wurden u. a. die Triterpenoide Fern-9(11)-en sowie Dryocrassol

identifiziert (Tanaka et al. 1992). Interessanterweise zeigen diese Terpenoide keine

funktionelle Gruppe am C3-Atom. Vermutlich handelt es sich bei diesen Substanzen um

Zyklisierungsprodukte von Squalen; der Biosyntheseweg dieser Verbindungen würde

demnach nicht über eine Oxidosqualenzyklase vermittelte Zyklisierung des Squalen-Epoxids

verlaufen, sondern dem in Bakterien verbreiteten Syntheseweg der Hopanoide entsprechen.

Hohe Triterpenanteile im kutikulären Wachs korrelieren oftmals mit dem Vorhandensein

epikutikulärer Wachskristalle. Dies ist z. B. bei kristallbereiften Individuen von Dudleya

farinosa und D. brittonii der Fall, wohingegen bei Dudleya-Individuen ohne Wachskristalle

langkettige aliphatische Komponenten dominieren (Manheim und Mulroy 1978). Eine

ähnliche Korrelation lässt sich auch bei der Felsen-Fetthenne Sedum rupestre beobachten

(Stevens et al. 1994). Die Ausbildung von Wachskristallen auf Blattwedeln des Farns

Polypodium aureum lässt sich durch die hohen Fernen-Konzentrationen im Wachs erklären

(Barthlott und Wollenweber 1981). Für Macaranga tanarius konnte gezeigt werden, dass die

fadenförmigen Wachskristalle auf Sprossachsen und Blattstielen aus β-Amyrin bestehen

(Guhling 2002). Mit Blick auf diese Beobachtungen erscheint es deshalb plausibel, dass

hohe relative und absolute Mengen von Triterpenen im kutikulären Wachs generell zur

Ausbildung von Kristallstrukturen auf der Oberfläche führen. Als Wachskristallbildner

übernehmen Triterpene damit wichtige Funktionen bei der Gestaltung und Beeinflussung von

Oberflächen- bzw. Grenzflächeneigenschaften von Pflanzen (siehe 1.2).

Ein interessanter Effekt im Zusammenhang mit der ökologischen Bedeutung von

kutikulären Triterpenen bei Herbivoren konnte an der afrikanischen Blattkäferart Platyphora

kollari beobachtet werden. Diese Tiere nehmen β-Amyrin auf, das als kutikuläre Wachs-

komponente in Blättern ihrer Futterpflanze Ipomoea batatas vorkommt. Fütterungs-

experimente zeigten, dass die Triterpenkomponente von den Käfern für die Biosynthese von

Triterpensaponinen verwendet wird, die in Abwehrdrüsen eingelagert zur Verteidigung gegen

Fraßfeinde dienen (Laurent et al. 2003).

1 Einführung 14

1.4 Aufgabenstellung

In der jüngsten Vergangenheit konnte ein tieferes Verständnis für die enzymatisch

gesteuerte Biosynthese pflanzlicher Triterpene durch die Klonierung und Charakterisierung

entsprechender pflanzlicher Triterpensynthasen entwickelt werden. Die Biosynthese

kutikulärer pentazyklischer Triterpene unter Berücksichtigung des/der in diesen Prozess

involvierten Gens/Gene war bislang jedoch nicht Gegenstand eingehender wissen-

schaftlicher Forschungsarbeit gewesen. Für einen Nachweis einer solchen Kutikularelevanz

müssen Triterpensynthase-Gene aus geeigneten Modellpflanzen kloniert und charakterisiert,

und die produktspezifischen Eigenschaften und Expressionsmuster dieser Enzyme mit den

Ergebnissen eingehender analytischer Untersuchungen zur kutikulären Wachsbildung an

diesen Pflanzen in Beziehung gesetzt werden. Um dies zu verwirklichen, wurde in der

vorliegenden Arbeit die Rizinuspflanze aus der Familie der Euphorbiaceae verwendet.

Ricinus communis schien ein viel versprechendes Modellsystem für die Untersuchung der

Biosynthese kutikulärer Wachse zu sein, da in Vorversuchen gezeigt wurde, dass die

Wachsmischung der Sprossachsen-Kutikula von Triterpen-Verbindungen dominiert wird.

Außerdem treten Individuen dieser Art sowohl mit als auch ohne wachsbereiften

Stammoberflächen in Erscheinung, also in der Ausprägung zweier unterschiedlicher

Stammkutikula-Phänotypen. Dies ermöglichte eine vergleichende Untersuchung der

Kutikulaphänotypen sowohl auf analytischer, als auch auf molekularbiologischer Ebene.

Ziele der Arbeiten an Ricinus communis waren daher

(a) die mikromorphologische und chemische Charakterisierung beider Stammkutikula-

Phänotypen;

(b) die Untersuchung der Akkumulation kutikulärer Triterpene im Laufe der Stamm-

entwicklung beider Phänotypen sowie der Beteiligung von Triterpen-Verbindung(en)

an der Ausbildung epikutikulärer Wachskristalle;

(c) die sequenzhomologie-basierte Klonierung der Gensequenzen von 2,3-Oxido-

squalenzyklasen bzw. Triterpensynthasen mit Hilfe eines geeigneten Primerdesigns;

(d) die Charakterisierung der Produktspezifität dieser Enzyme mittels heterologer

Expression in Hefezellen;

(e) die Untersuchung der Expressionsmuster der klonierten Ricinus-Gene in verschie-

denen Organen und im Laufe der Ontogenese des Hypokotyls der Pflanze, um so

korrelative Evidenz für die Kutikula-Spezifität der Zyklasen zu erhalten.

1 Einführung 15

Darüber hinaus sollte das entwickelte Primerdesign zur Klonierung und das etablierte

Hefe-System zur Charakterisierung von weiteren kutikularelevanten Triterpensynthasen aus

anderen Pflanzensystemen verwendet werden. Hierfür wurde mit Lycopersicon esculentum

zunächst eine Art ausgewählt, die aufgrund ihres Kutikula-Triterpenspektrums die Klonierung

von Triterpensynthasen mit bislang nicht charakterisierter Produktspezifität versprach: L.

esculentum akkumuliert im kutikulären Wachs der Früchte neben β- und α-Amyrin vor allem

δ-Amyrin. Für ein tieferes Verständnis der Beteiligung einzelner Aminosäurereste am

Zyklisierungsmechanismus und damit an der Produktspezifität von Triterpensynthasen sollte

eine Triterpensynthase schließlich exemplarisch gerichtet mutagenisiert werden (Site-

directed mutagenesis).

2 Material und Methoden 16

2 Material und Methoden

2.1 Pflanzenmaterial

2.1.1 Ricinus communis L.

Die monotypische Gattung Ricinus gehört zur Familie der Euphorbiaceae

(Wolfsmilchgewächse), einer schwerpunktmäßig tropischen Familie, die mit ihren ca. 7500

Arten in 300 Gattungen eine beträchtliche Diversität aufweist: von breitblättrigen Bäumen

des tropischen Regenwaldes über Vertreter gemäßigter Klimazonen bis hin zu

Stammsukkulenten arider Klimate.

Die auch als Wunder-, Hunds-, Kreuz- und Läusebaum oder Christuspalme bezeichnete

Rizinuspflanze Ricinus communis (lat. ricinus = Zecke, griech. rikinos = Wunderbaum) war

vermutlich ursprünglich in Asien und Afrika beheimatet. Ihre Samen fanden sich in

ägyptischen Gräbern aus der Zeit um 4000 v. Chr. - sie zählt damit zu den ältesten

bekannten Arzneipflanzen (Simpson und Ogorzaly 2001). Heute ist die Pflanze weltweit

verbreitet und wird, obwohl bevorzugt in den Tropen und Subtropen, auch in gemäßigten

Klimaten zur Gewinnung des Rizinusöls angebaut. Ricinus communis wird in unseren

Breiten, einjährig kultiviert, zwei bis drei Meter hoch, in den tropischen Heimatgefilden

entwickelt sich die Pflanze dagegen zu einem bis zu 13 m hohen Baum. Die Pflanzen tragen

große, gezähnte, lang gestielte und handförmig gelappte Blätter und entwickeln sich

sympodial, d. h., jede Achse endet in einer terminalen ährigen Infloreszenz, die von einer

unterhalb austreibenden Seitenachse übergipfelt wird. Der Blütenstand der einhäusigen,

aber zweigeschlechtlichen und vorzugsweise windbestäubten Rizinuspflanze bildet im

unteren Teil büschelig gehäufte und bäumchenartig verzweigte männliche Blüten aus,

darüber endständige weibliche Blüten, die dreifächrige Fruchtknoten mit drei zweispaltigen

roten Narbenästen aufweisen (Abb. 2-1). Die Frucht besteht aus einer walnussgroßen, mit

weichen Stacheln besetzten Kapsel mit je drei bohnengroßen Samen. Die Samen sind von

einer bräunlich marmorierten Schale umgeben und tragen an der Mikropyle einen warzigen

Anhang, die sog. Caruncula (Abb. 2-1).

Rizinussamen enthalten das hochtoxische Polypeptid Ricin (Toxalbumin), eines der

giftigsten Eiweißkörper überhaupt. Das ausgepresste Rizinusöl ist dagegen praktisch

ungiftig, da das Ricin bei der Herstellung in den eiweißreichen Pressrückständen verbleibt.

Rizinusöl dient unter anderem als antiresorptiv und sekretagog wirkendes Abführmittel

(durch die Hydroxyfettsäure Ricinolsäure). Zudem werden daraus hochwertige technische

Öle hergestellt, die für Weichmacher, Polyamide, Lösungsmittel, Lacke, Farben,

Schmiermittel, Hydraulikflüssigkeiten und Kosmetika verwendet werden.


A B

DC

Abbildung 2-1: Ricinus communis. A: Samen. B: Blattstruktur. C: Blütenstand. D: Fruchtstand. ca = Caruncula; mb = männliche Blüte; na = Narbenast; sk = Samenkapsel; wb = weibliche Blüte.

ca

mb

wb

na

sk


Blatt- und Sprossoberflächen von Rizinuspflanzen weisen eine jeweils einheitlich

grünliche oder rötliche Färbung auf. Daneben kann man jedoch Individuen beobachten, die

zwar ähnliche Blattoberflächen aufweisen, sich jedoch im Aussehen ihrer Sprossachsen und

Blattstiele unterscheiden. Neben dem normalen Spross-Phänotyp mit glänzend-grünen oder

roten Sprossen (Glossy-Phänotyp), treten Individuen mit weißlich matten Sprossen auf

(Glaucous-Phänotyp), hervorgerufen durch die Auflagerung eines kutikulären Wachsbelages

auf der Sprossoberfläche (Abb. 2-2).

Abbildung 2-2: Sprossachsen-Phänotypen von R. communis. A und B: Glossy-Phänotyp. C und D: Glaucous-Phänptyp mit wachsbereiften Stamm-oberflächen.

5 mm

DC

5 mm

BA


Der jeweilige Stamm-Phänotyp blieb während der Individual-Entwicklung stabil, war

spätestens sechs Tage nach dem ersten Erscheinen des Keimlings an der Oberfläche

erkennbar und entwickelte sich unabhängig von den Anzuchtbedingungen. Die

Versuchspflanzen wurden im Gewächshaus des Lehrstuhls für Botanik II der Universität

Würzburg aus homogenem Samenmaterial unter gleichen Bedingungen gezogen und

segregierten in einem Verhältnis von 3:1 (Glossy : Glaucous) bezüglich ihres Stamm-

Phänotyps. Um Pflanzen in verschiedenen Altersstadien (Abb. 1-3) beider Phänotypen zur

Verfügung zu haben, wurden über mehrere Wochen hinweg wöchentlich sechs bis zwölf

Samen von Ricinus communis einzeln in Töpfen 1 cm unter die Oberfläche ausgesät,

nachdem sie zuvor mehrere Stunden in Wasser gequellt wurden. Der Tag, an dem der

Keimling erstmals an der Erdoberfläche erkennbar war, wurde für das Pflanzenalter als Tag

1 definiert. In den Gewächshäusern des Botany Department der University of British

Columbia, Vancouver, Kanada, wurde unter den gleichen Anzuchtbedingungen wie in

Würzburg ebenfalls Rizinuspflanzen angezogen, wobei hier die Kultivare Sanguineus

(Glossy-Phänotyp) und Baker (Glaucous-Phänotyp) ausgesät wurden.

A B C

D EAbbildung 2-3: Verschiedene Altersstadien (Tage nach Keimung) von Ricinus communis. A: 2 Tage. B: 4 Tage. C: 9 Tage. D: 17 Tage. E: 42 Tage. kb = Keimblatt; pb = Primärblatt.

kb

pb

kb

pb


2.1.2 Lycopersicon esculentum MILL. Cv. Micro-Tom

Tomatenpflanzen des Kultivars Micro-Tom (Abb. 2-4) wurden in einer

Wachstumskammer (14/10 h Tag/Nacht Rhythmus mit 22/18°C Temperaturunterschied und

konstanten 75% rel. Luftfeuchte) des Instituts für Botanik II an der Universität Würzburg bzw.

in den Gewächshäusern des Botany Department der University of British Columbia,

Vancouver, Kanada gezogen.

B

C

A

Abbildung 2-4: Lycopersicon esculentum cv. Micro-Tom. A: Gesamt-Habitus. B: Blüte. C: Frucht.


2.2 Präparation kutikulärer Wachse von Ricinus communis

Um dem geschichteten Aufbau der Kutikula bei der qualitativen und quantitativen

Analyse ihrer Wachskomponenten Rechnung zu tragen, müssen epi- und intrakutikuläre

Wachse getrennt untersucht werden (siehe 1.2). Für solch eine getrennte Analyse bietet sich

folgendes Versuchs-Design an: Die epikutikulären Wachse werden zunächst von der

Oberfläche mechanisch abgehoben, wobei mehrere Abhebeschritte garantieren, dass

sämtliche epikutikulären Wachse gewonnen werden. Anschließend werden die

intrakutikulären Wachskomponenten der abgehobenen Oberflächen extraktiv gewonnen. Die

Analysen aus diesen Proben können mit Untersuchungen verglichen werden, bei denen mit

Hilfe einer Gesamtextraktion alle kutikulären Wachse präpariert werden.

2.2.1 Extraktion kutikulärer Wachse

Für die Extraktion der Hypokotyloberflächen von Ricinus communis wurden mit Hilfe

einer Rasierklinge mehrere Zentimeter lange Stücke aus dem oberen Teil direkt unter den

Keimblättern herausgeschnitten und auf eine Präpariernadel gesteckt. Auf diese Weise

konnte das gesamte Hypokotylstück in einem mit Chloroform gefüllten 16 ml-Gläschen für

60 s extrahiert werden. Dabei wurden die Schnittkanten mit blasenfreiem Gummi arabicum

(1 mg/ml-Lösung; Roth, Karlsruhe, Deutschland) verschlossen, das aufgrund seines Wasser-

gehaltes ein Eindringen des Chloroforms in das Hypokotylinnere verhinderte. Die Ober-

flächen der extrahierten Hypokotylstücke wurden anschließend bestimmt, indem die Länge h

und der Durchmesser der Fragmente mit einer digitalen Schieblehre vermessen wurden.

Indem die Fragmente näherungsweise als zylindrische Körper angesehen wurden, konnte

die beprobte Fläche ermittelt werden:

hrFläche ⋅⋅⋅= π2

Nach Zugabe von n-Tetracosan als internem Standard (ISTD) wurde die Lösung in einem

Reactitherm-Heizgerät (Pierce, Rockford, USA) mit aufgesetzter Reactivap-Ausblase-

vorrichtung bei 60°C mittels eines leichten Stickstoffstroms auf ein Volumen unter 1 ml

eingeengt und in ein Reaktionsgefäß mit konischer Bohrung (Reactival, Altmann

Analysetechnik, Deutschland) überführt. In diesem Gefäß wurde die Probe vollständig unter

einem leichten Stickstoffstrom bei 60°C getrocknet.

2.2.2 Gewinnung epikutikulärer Wachse

Für die selektive Gewinnung epikutikulärer Wachskomponenten müssen diese von

Oberflächen mit einem Adhäsiv wie einer wässrigen Lösung von Gummi arabicum

mechanisch abgehoben werden. Gummi arabicum ist ein an der Luft erhärtendes


gummiartiges, pflanzliches Exsudat, das aus der Rinde verschiedener Acacia-Arten

gewonnen wird und als Strukturpolysaccharid überwiegend aus Galactose- und

Glucuronsäure-Resten, daneben auch aus Arabinose und Rhamnose aufgebaut ist (Bickel-

Sandkötter 2001). Ein entscheidender Vorteil bei der Verwendung von Gummi arabicum für

das Abheben epikutikulärer Wachse liegt in der Tatsache, dass es auch bei nicht planen

Oberflächen wie Sprossachsen verwendet werden kann. Der Abhebevorgang kann an

derselben Stelle grundsätzlich mehrfach durchgeführt werden, so dass mit jeder

Wiederholung ein weiterer Teil der epikutikulären Wachsschicht gewonnen wird, bis idealer-

weise alle epikutikulären Wachse abgehoben sind. Zur Herstellung der Gummi arabicum-

Lösung wurde 0,8 g Gummi arabicum, das zuvor mit heißem Chloroform extrahiert wurde, in

1 ml deionisiertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde jeweils direkt nach der Herstellung für

die Versuche eingesetzt. Für die Abhebeversuche wurden wie für die Totalextraktion

mehrere Zentimeter lange Rizinus-Hypokotylstücke herausgeschnitten und auf Stecknadeln,

die in Styropor fixiert waren, aufgesteckt. Die Hypokotylstücke wurden mit einem Pinsel mit

Gummi arabicum-Lösung bestrichen. Nach 60 min Lufttrocknung wurde die erhärtete Gummi

arabicum-Haut mit einer Federstahlpinzette abgeblättert. Dieser Abhebevorgang wurde

insgesamt dreimal durchgeführt. Die in der Kutikula verbliebenen Wachse wurden

anschließend durch eine Extraktion wie oben beschrieben gewonnen (Nachextraktion). Die

getrockneten Gummi arabicum-Fragmente aus den einzelnen Präparationsschritten wurden

in ein 16 ml-Gläschen überführt, das ein Zweiphasengemisch aus jeweils 6 ml deionisiertem

Wasser und 4 ml Chloroform enthielt. In die Chloroform-Phase wurde zuvor eine definierte

Menge ISTD zugegeben. Nach kräftigem Ausschütteln, Entnahme der organischen Phase,

ihrer Überführung in ein 15 ml-Gläschen und einer zweimaligen Wiederholung des Vorgangs

wurden die vereinigten Chloroform-Phasen mit einer Spatelspitze Natriumsulfat getrocknet.

Im Anschluss an die Filtration durch einen Faltenfilter wurde die Lösung in einem

Reactitherm-Heizgerät bei 60°C unter einem leichten Stickstoffstrom auf ein Volumen unter 1

ml eingeengt und in ein Reactivial überführt. In diesem Gefäß wurde die Probe vollständig

mit Stickstoff getrocknet.

2.3 Qualitative und quantitative Analysetechniken

2.3.1 Derivatisierung

2.3.1.1 Silylierung

Die Extrakte wurden vor der gaschromatographischen und massenspektrometrischen

Analyse chemisch modifiziert. Zwischen polaren, organischen Verbindungen, die aktive

Wasserstoffatome in Hydroxyl- bzw. Carboxylfunktionen enthalten, und der stationären


Phase der Kapillarsäule können starke Wechselwirkungen auftreten. Deshalb ist eine

Derivatisierung nötig, um die gaschromatographische Auftrennung zu verbessern. In der

vorliegenden Arbeit wurden sämtliche Proben einheitlich für die Gaschromatographie

vorbereitet, indem relativ leichtflüchtige und thermisch stabile Silylderivate hergestellt

wurden. Die entstehenden Derivate haben zudem den Vorteil, dass ihre Massenspektren in

der Regel strukturanalytisch wesentlich ergiebiger sind als die Ausgangsverbindungen. Bei

der Silylierung werden alle Verbindungen, die OH-Funktionen enthalten, wie z.B. Alkohole

und Säuren, in ihre Trimethylsilyl-Derivate überführt. Typisch für alle Trimethylsilyl-

Verbindungen sind die leichte Abspaltung einer Methylgruppe (M+-15), der Verlust von

Si(CH3)3 (M+-72) und das Auftreten der Bruchstücke m/z 75 und 73 (Seibl 1970).

Für die Silylierungsreaktion wurden die in den Reactivials vollständig getrockneten

Wachsextrakt-Proben (siehe 2.2.1 und 2.2.2) mit je 10 µl N,N-bis(trimethylsilyl)-

trifluoracetamid (BSTFA; Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) und getrocknetem Pyridin

(>99,5%, Wassergehalt <0,01%, Merck, Darmstadt, Deutschland) versetzt und für 30 min bei

70°C im Heizblock zur Reaktion gebracht. Nach dem Abkühlen wurden die Proben mit

Chloroform auf ein definiertes Volumen aufgefüllt.

2.3.1.2 Acetylierung

Für die Interpretation massenspektrometrischer Daten kann es sehr hilfreich sein,

Massenspektren von verschiedenen Derivaten derselben Substanz miteinander zu

vergleichen. Aus diesem Grund wurde ein Zyklisierungsprodukt von RcCAS1 acetyliert. Bei

dieser chemischen Modifizierung werden im Idealfall alle Hydroxylgruppen in

Essigsäureester überführt.

Für die Reaktion wurde die Dünnschichtbande, die die zu derivatisierende Substanz

enthielt, von der Platte entnommen und mit Chloroform extrahiert. Der Extrakt wurde unter

einem leichten Stickstoffstrom im Heizblock bei 60°C getrocknet und die Probe anschließend

mit jeweils 10 µl Essigsäureanhydrid (Alltech, Deerfield, USA) und 10 µl getrocknetem

Pyridin versetzt. Der Ansatz wurde für 5 min bei 70°C im Heizblock zur Reaktion gebracht

und über Nacht bei Raumtemparatur inkubiert. Anschließend wurde die Probe silyliert (siehe

2.3.2) und massenspektrometrisch analysiert (siehe 2.3.4).

2.3.2 Gaschromatographie und Massenspektrometrie

Die Trennung der einzelnen Komponenten der Wachsgemische von Ricinus communis

bzw. der Hefe-Gesamtextrakte erfolgte mit druck- und temperaturprogrammierten (Tab. 2-1)

Gaschromatographen (Hewlett Packard 5890 II, Avondale, Pennsylvania, USA) mit on-

column-Injektoren. Die einzelnen Verbindungen wurden mit Hilfe eines Flammenionisations-


detektors (FID) quantifiziert bzw. mittels eines Mass Selective Detectors (MSD; Hewlett

Packard 5971, m/z 50-650, Ionisationsenergie 70 eV) identifiziert. Als Trägergas diente

Wasserstoff (FID) bzw. Helium (MSD), das Injektionsvolumen betrug 1 µl. Bei einer Vielzahl

von Proben kam bei der Injektion ein automatischer Probengeber zum Einsatz. Der FID

wurde mit Wasserstoff und Luft als Brennergase betrieben. Die Trennung erfolgte auf einer

DB-1 fused-silica-Kapillarsäule (Länge: 30 m; Durchmesser: 320 µm; J&W Scientific,

Folsom, California, USA) mit einer vorgeschalteten 3 m langen Vorsäule.

Tabelle 2-1: Werte der Temperatur- und Druckprogrammierung der für die quantitative und qualitative Analyse verwendeten Gaschromatographen.

Analyse- methode

Temperatur- programmierung

Druck- programmierung

Temp. [°C]

Zeit [min]

Rate [°C/min]

Druck [kPa]

Zeit [min]

Rate [°C/min]

GC-FID 50 2 40 50 5 3 200 2 3 150 30 320 30

GC-MS 40 2 40 10 1 5,5 200 2 3 50 35 320 30

Die massenspektrometrische Identifikation der Verbindungen erfolgte anhand von

Vergleichen der gewonnenen Spektren mit authentischen Standards. Hierfür standen

mehrere Datenbanken mit massenspektrometrischen Daten zur Verfügung (Nist02,

Wachseei). Die quantitative Auswertung der FID-Chromatogramme wurde anhand der

Peakflächen der Einzelkomponenten vorgenommen. Für diese Quantifizierung war eine

interne Standardisierung der Proben notwendig. Hierzu wurde den einzelnen Wachsextrakt-

Proben eine genau definierte Masse an internem Standard (mISTD) zugegeben. Als ISTD

diente eine n-Tetracosan-Lösung, die in einer Stammlösungs-Konzentration von 1 µg/µl zur

Verfügung stand. Aus dem Verhältnis der Peakflächen in einem Chromatogramm konnte so

die Masse anderer Verbindungen (mProbe) berechnet werden:

ISTD

ISTDobeobe A

mAm ⋅= Pr

Pr

Für die Quantifizierung der einzelnen Wachsbestandteile wurden die Peakflächen mit der

Analyse-Software HP GC Chemstation A.06.01 integriert.

2.3.3 Dünnschichtchromatographie (TLC)

Die TLC (thin layer chromatography) stellt ein relativ simples chromatographisches

Verfahren dar, bei dem Komponenten nach ihrer Polarität aufgetrennt werden, und eignet


sich sehr gut, um relativ große Substanzmengen aufzureinigen. In der vorliegenden Arbeit

wurde die Dünnschichtchromatographie vor allem zur quantitativen Präparation der

Zyklisierungsprodukte der charakterisierten Oxidosqualenzyklasen verwendet. Hierfür

wurden Hefe-Gesamtextrakte auf eine TLC-Platte (20x20 cm, SilicaGel 60, Schichtdicke 0,5

mm; Merck, Darmstadt, Deutschland) aufgetragen. Zusätzlich wurden am Rand der Platte 5

µl eines Standard-Gemisches, bestehend aus Ergosterol, Lupeol und C27-Keton (10 mg/ml

pro Einzelkomponente), aufgetragen. Die Dünnschichtplatte wurde mittels Sandwichtechnik

entwickelt (mobile Phase: Benzol/Aceton 19:1; ca. 50 min, Laufstrecke ca. 10 cm), nach der

Trocknung mit Primulin-Lösung (Spatelspitze Primulin in 2 ml Wasser gelöst + 200 ml

Aceton) besprüht und unter UV-Licht bei 366 nm betrachtet. Die detektierten Banden wurden

mit einem Bleistift markiert, anschließend ausgekratzt, zweimal mit 5 ml Chloroform

extrahiert und durch einen Faltenfilter filtriert.

2.4 Molekulargenetische Methoden

2.4.1 RNA-Isolierung und cDNA-Synthese

Für die Isolierung von Gesamt-RNA wurde die Epidermis 25 Tage alter Hypokotyle von

Ricinus commins-Pflanzen des Glaucous-Phänotyps mit einer Rasierklinge mit möglichst

wenig tiefer liegendem Gewebematerial entnommen. Das Pflanzenmaterial wurde sofort

unter flüssigem Stickstoff in einem Mörser zu Pulver homogenisiert. 100 mg dieses

gemörserten Pflanzenmaterials wurden zur Isolierung von Gesamt-RNA eingesetzt. Für die

Isolierung wurde der RNeasy Plant MiniKit (Qiagen) verwendet. Bei diesem Kit werden die

selektiven Bindungseigenschaften einer Silicagel-Membran mit der Mikrozentrifugations-

technik kombiniert. Das biologische Ausgangsmaterial wurde zunächst in einem stark

denaturierenden Puffer lysiert und homogenisiert, durch den RNasen sofort effizient

inaktiviert wurden, um die Isolierung einer intakten RNA zu gewährleisten. Durch Zugabe von

Ethanol wurden optimale Bindungsbedingungen hergestellt, bevor die Probe dann auf die

Säule aufgetragen wurde. Die Gesamt-RNA band an die Membran, während übrige

Substanzen ausgewaschen und somit abgetrennt wurden. Schließlich wurde die Gesamt-

RNA in 30 - 50 µl RNase-freiem Wasser eluiert. Die mit dieser Methode gewonnene RNA

wurde bei -80°C aufbewahrt. Aliquots der Proben wurden für die spektrophotometrische

Konzentrationsbestimmung verwendet. Zusätzlich wurde die Intaktheit der RNA

gelelktrophotometrisch kontrolliert. Hierfür wurden 4 µl (ca. 500 ng) der Proben in einem

Agarosegel (1%; siehe 2.4.4) aufgetrennt. Bei nicht denaturierter RNA traten stets die 28S-

und 18S-rRNA als klare, distinkte Banden in Erscheinung (Abb. 2-5).


Für die Isolierung von RNA aus Lycopersicon

esculentum wurden die äußeren Zelllagen noch nicht

komplett gereifter Früchte mit einer Rasierklinge

entnommen. Die Gesamt-RNA wurde dann wie oben

beschrieben aufbereitet.

Für die cDNA-Synthese wurden 3-5 µg Gesamt-

RNA, 1 µl eines Oligo dT18 Primers (Fermentas) und

DEPC-Wasser in einem Gesamtansatzvolumen von

12 µl für 10 min bei 70°C inkubiert. Nach einer Minute

auf Eis wurde zum Ansatz 1 µl Reverse Transkriptase

(RevertAid H Minus M-MulV RT, Fermentas), 1 µl

RNase Inhibitor, 1 µl dNTP-Mix (10 mM) und 4 µl 5x

Firststrand buffer zugegeben. Nach einer 60 minüti-

gen Inkubation bei 42°C wurde die Reaktion bei 70°C

für 15 min terminiert. Auf Eis wurde RNase A (200 µg/ml) hinzugegeben und der Ansatz für

30 min bei 37°C inkubiert. Die cDNA wurde bei -20°C aufbewahrt.

2.4.2 DNA-Isolierung

Für die Isolierung genomischer DNA aus Ricinus communis wurde der DNeasy Plant

Mini Kit (Qiagen) verwendet. Dazu wurde Ricinus-Blattmaterial unter flüssigem Stickstoff

zermörsert und jeweils 100 mg des homogenisierten Zellmaterials für die Isolierung

verwendet. Alternativ kam eine Methode nach (Chen und Ronald 1999) zum Einsatz. Hierbei

wurde das zermörserte Blattmaterial in 700 µl 65°C warmem DNA-Extraktionspuffer (siehe

Anhang A) aufgenommen. Nach Zugabe von 7 µl RNase A und einer 5 minütigen

Inkubationszeit wurde zum Ansatz 500 µl einer Chloroform-Isoamylalkohol-Lösung (24:1)

zugegeben und gevortext. Der Ansatz wurde 10 min bei full speed und Raumtemperatur

zentrifugiert, die obere wässrige Phase durch eine einstündige Inkubationszeit auf Eis mit 0,7

Volumenprozent Isopropanol gefällt und erneut 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde

vorsichtig verworfen und das Pellet mit 70% EtOH gewaschen, anschließend 5 min

zentrifugiert und unter dem Abzug luftgetrocknet bzw. 20 min in der Speed-Vac getrocknet.

Schließlich wurde das Pellet in 30 µl H2O bidest. aufgenommen und bei -20°C aufbewahrt.

28S rRNA

18S rRNA

Abbildung 2-5: Isolierung von Ge-samt-RNA aus Ricinus communis-Zellmaterial.


2.4.3 cDNA-Amplifizierung über Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Die Polymerase-Ketten-Reaktion (polymerase chain reaction; PCR) war das zentrale

Hilfsmittel und die wichtigste Methode, um cDNA-Fragmente bzw. Gensequenzen von

Oxidosqualenzyklasen von Ricinus communis und Lycopersicon esculentum zu

amplifizieren. In der vorliegenden Arbeit wurden alle PCR-Versuche mit einem Thermocycler

(Mastercycler Gradient, Eppendorf) durchgeführt. Die Gesamtansatzvolumina der PCR-

Ansätze betrugen 20 bzw. 50 µl und enthielten in der Regel 1-3 µl cDNA bzw. 5 µl DNA als

Template, jeweils 2 µM des Sense- bzw. Antisense-Primers, 0,2 mM dNTP-Mix und 5 U Taq-

Polymerase in einem Puffer aus 20 mM Tris-HCL (pH 8,0), 100 mM KCL, 1 mM DTT, 0,1 mM

EDTA, 0,5 % Tween 20 und 0,5 % Nonidet P40. Der Erfolg der PCR-Ansätze war vor allem

von der Wahl der verwendeten Primersequenzen (Übersicht siehe Anhang D) sowie den

Temperaturprogrammen abhängig, die für die jeweiligen Ansätze optimiert wurden. Dabei

konnten die wichtigen Annealing-Temperatur-Bedingungen mit Hilfe einer Programmierung

von Gradientenprogrammen im Rahmen eines einzigen PCR-Laufes variiert werden (Abb. 2-

6). Als Positivkontrolle wurde zumeist eine Reaktion mit der Primerkombination CAB-S und

CAB-AS und der entsprechenden cDNA angesetzt. Bei CAB-S und CAB-AS handelt es sich

um für das hochkonservierte Chlorophyll A/B-Bindungs-Protein spezifische Oligonukleotide,

so dass bei dieser Primerkombination in allen photosynthetisch aktiven Pflanzengeweben ein

starkes Signal erwartet werden kann.

2.4.4 Gelelektrophoretische Untersuchung und Aufreinigung von PCR-Produkten

Für die Größen-Auftrennung der PCR-Fragmente kam die Technik der Gelelektrophorese

zum Einsatz. Die Auftrennung der Moleküle erfolgte dabei in einem Agarosegel (1%) mit 0,5x

TBE-Puffer (siehe Anhang A) als Laufpuffer. Für die Herstellung eines Gels wurde 450 mg

Agarose in 450 ml TBE-Puffer durch einminütiges Erhitzen in der Mikrowelle gelöst und die

Lösung in einer Gelform bei Raumtemperatur ausgehärtet. Zur Sichtbarmachung der DNA-

1 3 4 52 DNA- Leiter

Abbildung 2-6: Beispiel eines PCR-Ansatzes mit R. communis cDNA als Template unter der Verwendung eines Annealing-Temperaturgradienten. Temperaturpro-gramm: 2 min 94°C, (45 s 94°C, 60 s 50°C, 90 s 72°C) x 30, 10 min 72°C. 1: Positivkontrolle mit der Primerkombination CAB-S vs. CAB-AS, Annealingtemp.: 52°C, 2: Primerkombination PNB5II vs. PNB4II; Annealingtemp.: 48°C, 3: wie 2; Annealingtemp.: 53°C, 4: wie 2; Annealingtemp.: 56°C, 5: wie 2; Annealingtemp.: 60°C.

500 bp

1031 bp


Moleküle wurde in das noch nicht auspolymerisierte Gel eine Ethidiumbromid-Lösung in

einer Konzentration von 0,1 µg/ml gegeben. Die DNA-Proben wurden in einen Ladepuffer

(Fermentas) aufgenommen und in die Ladetaschen des Gels aufgetragen. Zur

Größenabschätzung wurde zusätzlich eine DNA-Leiter (1 kb bzw. 100 bp DNA ladder,

Fermentas) mit definierten Größenfragmenten in eine Geltasche gegeben. Die

Elektrophorese erfolgte in einer Gelelektrophoresekammer bei einer Spannung von ca. 90

mV für ca. 50 min. Nach Beendigung des Gellaufs wurde das Gel auf einen UV-

Transilluminator gegeben und mit Hilfe einer Digitalkamera dokumentiert.

Für die weitere Verarbeitung von DNA-Fragmenten wurden entsprechende Banden mit

Hilfe des Gel Purification Kit (Qiagen) aus dem Gel extrahiert, in 40 µl H2O bidest. eluiert und

die Konzentration der Proben spektrophotometrisch bestimmt.

2.4.5 Klonierung von PCR-Produkten in Eschericha coli

Um eine ausreichende Kopienzahl der über PCR amplifizierten cDNA-Moleküle für die

Sequenzierung zu erhalten, mussten die Fragmente in Eschericha coli über einen

Plasmidvektor kloniert werden. Für die Transformation von E. coli wurde der

Transformationsvektor pGEM-T (Promega) verwendet. pGEM-T (Abb. 2-7) verfügt über

Thymidinüberhänge an den Enden der Multi-cloning-site und ermöglicht so die direkte

Ligation von PCR-Produkten, die mit DNA Taq-Polymerase amplifiziert wurden, da dieses

Enzym 3’-Adenosin-Überhänge an die

Fragmentenden addiert. Die Multi-

cloning-site liegt innerhalb der kodieren-

den Region des ß-Galactosidase-

Enzyms. Durch die insertionale Inakti-

vierung dieses Peptids können rekombi-

nante Klone durch ein Farb-Screening

(Blue-white-screening) auf Indikator-

platten sofort erkannt werden. Darüber

hinaus weist pGEM-T ein Ampicillin-

resistenzgen zur Selektion transformier-

ter E. coli-Zellen auf.

Abbildung 2-7: Schematische Darstellung des Plas-midvektors pGEM-T zur Transformation kompetenter E. coli-Zellen (aus: pGEM-T and pGEM-T Easy Vector Systems, Technical Manual No. 042, Promega).


Für die Ligation musste zunächst die Menge an Insert-DNA, die in der Ligationsreaktion

eingesetzt wurde, nach folgender Formel berechnet werden:

13

300050

⋅⋅Vektorbp

InsertbpxVektorng

molares Verhältnis von Insert zu Vektor

Die Ligationsreaktion wurde wie folgt pipettiert und über Nacht bei 4°C inkubiert:

pGEM-T Vector (50 ng) 1 µl PCR-Produkt (Insert-DNA) x µl T4 DNA Ligase (3 Units) 1 µl Ligationspuffer (2x) 5 µl H2O bidest. x µl gesamt 10 µl

Für die Transformation wurden 50 µl kompetenter E. coli Zellen (JM 109; Genotyp:

recA1, endA1, gyrA96, thi, hsdR17 (rK-, mK+), relA1, supE44, ∆(lac-proAB), [F´, traD36,

proAB, lacIqZ∆M15]; Promega) langsam auf Eis aus -80°C aufgetaut und vorsichtig zum

Ligationsansatz zugegeben. Nach vorsichtigem Mischen wurde der Ansatz 20 min auf Eis

inkubiert. Die eigentliche Transformation der Zellen mit dem Vektor wurde durch eine kurze

Temperaturerhöhung (47 s bei 42°C im Wasserbad) bewerkstelligt. Nach dem Hitzeschock

wurde zum Ansatz 950 µl LB-Medium (siehe Anhang A) zugegeben und die Zellen 90 min

bei 37°C und 150 rpm geschüttelt. Unter der Sterilbank wurden 300 µl bzw. 650 µl des

Ansatzes auf LB-Amp-Indikatorplatten (IPTG/X-Gal; siehe Anhang A) ausgestrichen und die

Agarplatten über Nacht bei 37°C inkubiert (Abb. 2-8). Weiße Kolonien transformierter Zellen

wurden mit einer Impföse unter der Sterilbank entnommen und in 5 ml LB-Amp-Medium

überführt. Der Ansatz wurde in einem 16 ml

Falcon-Tube über Nacht bei 37°C und 270 rpm

inkubiert. 700 µl der ÜN-Kultur wurden für die

Präparation von Glycerol-Dauerkulturen verwendet

(1:1). Für die Plasmidisolierung wurden 4 ml der

ÜN-Kultur schrittweise in 2 ml Eppendorf-Tubes

überführt und die Zellen durch zweiminütige

Zentrifugation bei 10000 rpm geerntet. Die

Isolierung der Plasmid-DNA erfolgte mit Hilfe des

Plasmid Isolation Kit (Qiagen). Die isolierte DNA

wurde schließlich in 30 µl Elutionspuffer eluiert und

die Konzentration der Probe spektrophotometrisch

bestimmt.

Abbildung 2-8: Agarplatte mit Kolonien transformierter E. coli-Zellen nach 14 h Inkubation bei 37°C.


Um das Vorhandensein des korrekten PCR-Produkts in der Multi-cloning-site des Vektors

zu testen, wurde eine PCR mit den Proben der isolierten Plasmide als Templates (1 µl) und

der Primerkombination SP6 vs. T7 (jeweils 2 µM) durchgeführt, die in einer Amplifizierung

eines Produktes mit entsprechender Länge der klonierten DNA resultieren sollte (Abb. 2-9A).

Als zusätzliche Kontrolle wurde Plasmid-DNA mit Restriktionsenzymen verdaut, um die

Präsenz der korrekten PCR-Produkte zu kontrollieren (Abb. 2-9B).

Abbildung 2-9: Kontrollversuche nach der Klonierung von PCR-Fragmenten in den Expressionsvektor pGEM-T A: Test-PCR nach Plasmidisolierung. In diesem Beispiel wurden zwei Klonierungen getestet (5 und 6, jeweils drei Parallelen; Insert der Klonierung 5: 660 bp, Insert der Klonierung 6: 900 bp). B: Restriktionsverdau von Plasmid-DNA mit SpeI.

BA


2.4.6 Sequenzierung von PCR-Fragmenten

Die Sequenzierung der klonierten cDNAs erfolgte im Sequenzierungslabor am Lehrstuhl für

Botanik I, Universität Würzburg, beziehungsweise an der NAPS-Unit der University of British

Columbia, Vancouver, Kanada (zu Einsatz kam hier Biosystems PRISM 377 automated

sequencer slab gel technology). Für die Sequenzierungsreaktion wurde die aufgereinigte

Plasmid-DNA verwendet. Bei der Sequenzierung von Insert-DNA in pGEM-T kamen stets die

die Multi-cloning-site flankierenden Primer T7 und SP6 zum Einsatz, bei Insert-DNA aus

pYES2 die Primer T7 bzw. PY2A (siehe Anhang D).

Die Ergebnisse der Sequenzierungen wurden digital zur Verfügung gestellt. Daneben

konnten Chromatogramme der Sequenzierungsreaktionen eingesehen werden, um die

Ergebnisse manuell zu überprüfen (Abb. 2-10).

Abbildung 2-10: Ausschnitt aus einem Sequenzierungs-Chromatogramm einer Sequenzierungsreaktion der NAPS-Unit.


2.4.7 RACE-Technik

Die RACE-Technik (rapid amplification of cDNA ends) ist eine Methode zur

Amplifizierung von Nukleinsäuresequenzen auf PCR-Basis zwischen dem bekannten inneren

Bereich einer mRNA und deren 3’- bzw. 5’-Ende. Bei der 3’RACE macht man sich den

poly(A)-Schwanz am 3’-Ende der mRNA als Zielsequenz eines Antisense-Primers zunutze.

Bei der 5’RACE muss dagegen zunächst eine Adaptersequenz an das unbekannte 5’-Ende

der Sequenz synthetisiert werden, bevor die Amplifizierung über PCR erfolgen kann.

2.4.7.1 3’RACE

Für die cDNA-Erststrangsynthese wurden 1-5 µg Gesamt-RNA, 2 µM des AP-Primers

(siehe Anhang D) und DEPC-Wasser in einem Gesamtansatzvolumen von 11 µl 10 min bei

70°C, dann 5 min auf Eis inkubiert. Zum Ansatz wurden daraufhin 1 µl Reverse

Transkriptase (RevertAid H Minus M-MulV RT, Fermentas), 1 µl RNase Inhibitor, 1 µl dNTP-

Mix (10 mM), 2 µl DTT (0,1 M) und 4 µl 5x Firststrand buffer zugegeben. Nach 50 min

Inkubation bei 42°C wurde die Reaktion mit einer fünfminütigen Inkubation bei 70°C beendet

und der Ansatz auf Eis gegeben. Nach Zugabe von 5 µl RNase A (200 µg/ml) und Mischen

wurde der Ansatz 20 min bei 37°C inkubiert, um das RNA-Template zu zerstören. Der

Ansatz wurde bei 4°C aufbewahrt.

Für die cDNA-Amplifikation wurden 2 µl des Erststrangsynthese-Ansatzes bzw. 2 µl einer

1:10 Verdünnung als Template in einem PCR-Ansatz verwendet (Gesamtansatzvolumen: 50

µl). Als Sense-Primer diente hierbei ein genspezifischer Primer, sowie der Adapterprimer

AUAP Antisense-Primer (siehe Anhang D). Die Zyklisierungsbedingungen waren: 2 min

94°C, (30 s 94°C, 60 s 55°C, 120 s 72°C) x 30; 10 min 70°C. Der PCR-Ansatz wurde

gelelektrophoretisch aufgetrennt, die cDNA-Bande mit der zu erwartenden Länge aus dem

Gel isoliert, kloniert und sequenziert. Gegebenenfalls wurde eine Nested-PCR mit 1:10

verdünntem cDNA-Material aus der vorangegangenen PCR als Template durchgeführt, um

die Menge an zu sequenzierender cDNA zu erhöhen. Als Sense-Primer diente dabei jeweils

ein genspezifischer Primer, der für eine weiter in 3’-Richtung gelegene Region spezifisch

war.

2.4.7.2 5’RACE

Für alle 5’RACE-Versuche wurde ein Kit der Firma Invitrogen verwendet (5’RACE

System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version 2.0, Katalog# 18374-058, Version C).

Für die cDNA-Erststrangsynthese wurden 1-5 µg Gesamt-RNA, 0,5 µM eines

genspezifischen Antisense-Primers und DEPC-Wasser in einem Gesamtansatzvolumen von

15,5 µl 10 min bei 70°C, dann 1 min auf Eis inkubiert. Zum Ansatz wurden daraufhin 2,5 µl

MgCl2 (25 mM), 1 µl dNTP-Mix (10 mM), 2,5 µl DTT (0,1 M) und 2,5 µl 10x Firststrand buffer

zugegeben. Nach einer einminütigen Inkubationszeit bei 42°C wurde 1 µl SuperScriptTM II


Reverse Transcriptase zugegeben und der Ansatz weitere 50 min bei 42°C inkubiert. Nach

Termination der Reaktion (15 min bei 70°C) wurde dem Ansatz 1 µl RNase Mix zugeführt

und 30 min bei 37°C inkubiert. Die cDNA wurde anschließend mit Hilfe von S.N.A.P.

Säulchen aufgereinigt und in 50 µl sterilem Wasser eluiert. Um einen Oligo dC-Schwanz an

das 5’-Ende der cDNA zu synthetisieren (TdT tailing), wurden zunächst 10 bzw. 15 µl der

aufgereinigten cDNA, 2,5 µl dCTP (2 mM), 5 µl 5x Tailing buffer und DEPC-Wasser in einem

Gesamtvolumen von 24 µl für 3 min bei 94°C inkubiert. Nach 1 min auf Eis wurde 1 µl

Terminal Deoxynucleotidyl Transferase zum Ansatz zugegeben und bei 37°C für 10 min

inkubiert. Die Reaktion wurde schließlich mit einer zehnminütigen Inkubation bei 65°C

beendet.

Für die Amplifikation der dC tailed cDNA wurden 5 bzw. 10 µl des Erststrangsynthese-

Ansatzes als Template in einem PCR-Ansatz verwendet (Gesamtansatzvolumen: 50 µl). Als

Sense-Primer diente hierbei der Primer AAP, ein genspezifischer Primer als Antisense-

Primer. Die Zyklisierungsbedingungen waren: 2 min 94°C, (30 s 94°C, 60 s 55°C, 120 s

72°C) x 30; 10 min 70°C. 5 µl der 5’RACE-Produkte wurden gelelektrophoretisch analysiert.

Eine anschließende Nested-PCR mit 1:10 bzw. 1:100 verdünntem cDNA-Material aus der

vorangegangenen PCR als Template diente zur spezifischen Amplifizierung des zu

charakterisierenden 5’-Endes (Abb. 2-11A). Als Sense-Primer diente dabei der Adapterpri-

BA

C

Abbildung 2-11: 5’RACE zur Klonierung des 5’-Endes von RcCAS1. A: Nested PCR mit verschiedenen Primern und unterschied-lichen Template-Verdünnungen. B: Frag-mente nach der Gelisolierung. C: Test-PCR-Versuche nach der Klonierung der Frag-mente in E. coli.


mer UAP, als Antisense-Primer jeweils ein für eine weiter in 5’-Richtung gelegene Region

spezifischer Primer. Die Bande mit der zu erwartenden Fragmentlänge wurde gelisoliert

(Abb. 2-11B) und das Fragment kloniert und sequenziert (Abb. 2-11C).

2.4.8 Northern-Blot Analysen

2.4.8.1 Präparation der RNA

Für die Analyse des Expressionsverhaltens von RcLUS1 und RcCAS1 mit Hilfe von

Northern-Blot Analysen wurde zunächst Gesamt-RNA von Blättern, Stämmen und Wurzeln

50 Tage alter Pflanzen, sowie von Hypokotylen verschieden alter Pflanzen (6, 12, 18, 25 und

50 Tage) jeweils beider Phänotypen mit Hilfe des RNeasy Kits (Qiagen) isloliert (siehe 2.4.1).

Die Konzentration der einzelnen Proben wurde spektrophotometrisch bestimmt. Für eine

optische Kontrolle wurde von jeder Probe 500 ng RNA gelelektrophoretisch aufgetrennt und

dokumentiert (Abb. 2-12).

Abbildung 2-12: Gelelektrophorese von RNA-Proben (jeweils 500 ng), die aus verschiedenen Geweben und von verschieden alten Pflanzen isoliert wurde.

Jeweils 10 µg Gesamt-RNA jeder Probe wurden in einer Speed-Vac getrocknet und in 15

µl RNA-Ladepuffer (siehe Anhang A) aufgenommen. Um die RNA zu denaturieren, wurden

die Proben für 15 min in einem Wasserbad auf 65°C erhitzt und danach auf Eis gegeben.

Anschließend wurden die Proben in einem 1% (w/v) MOPS-Agarose-Formaldehyd-Gel

(siehe Anhang A) elektrophoretisch im Abzug aufgetrennt (120 V für 90 min; 1x MOPS-Puffer

als Laufpuffer) und das Gel nach Beendigung des Laufs unter dem UV-Transilluminator

dokumentiert. Die aufgetrennte RNA wurde mit Hilfe eines Kapillarblots über Nacht aus dem

Gel auf eine Nylonmembran (Hybond XL Membran, Amersham Pharmacia Biotech,

Piscataway, NJ, USA) übertragen und 2h im Ofen bei 80°C auf der Membran fixiert.

2.4.8.2 Präparation der Sonden

Für die Herstellung spezifischer Sonden für RcLUS1 und RcCAS1 wurden zunächst

Fragmente der Gensequenzen über PCR-Ansätze (50 µl Gesamtvolumen, cDNA aus

Hypokotyl-RNA als Template, Taq-DNA-Polymerase) amplifiziert. Für RcLUS1 wurden dabei

der Senseprimer 5’ ACAAGTCTAGCTCTTCAGGC 3’ (OGLS1S) und der Antisenseprimer 5’

1 2 3 4 5 6a 6b 7a 7b 8a 8b 9a 9b 10a 11 12 13 10b 14a 14b 15 16


GCTTGGATTGCTGATGAAG 3’ (OGLS17A) verwendet, wodurch ein 454 bp langes Fragment

amplifiziert wurde. Bei der Synthetisierung der RcCAS1-Sonde dienten die Primer 5’

GACACAGCATTCGCAGTTCA 3’ (OGCS1S) sowie 5’ CTCAACGTACGGGTAGTCAATA 3’

(TYCS4A) zur Amplifizierung eines 433 bp langen Fragmentes. Beide PCR Produkte wurden

kloniert und sequenziert, um die jeweilige Spezifität der Sequenzen zu überprüfen. In einer

weiteren PCR mit der jeweiligen Plasmid-DNA als Template (20 µl Gesamtvolumen, Taq-

DNA-Polymerase) wurden die klonierten Sequenzen erneut amplifiziert. Die DNA wurde mit

Hilfe des PCR Purification Kit (Qiagen) aufgereinigt, in 30 µl H2O bidest. eluiert und die

Konzentration der Proben wurde spektrophotometrisch bestimmt. Jeweils 50 ng DNA wurde

für die Radioaktivmarkierung (Random Primers DNA Labeling System, GIBCO Life

Technologies, Katalog# 18187-013) zu folgendem Ansatz gegeben:

dATP (0,5 mM in 1 mM Tris-HCl (pH 7,5) 2 µl dGTP (0,5 mM in 1 mM Tris-HCl (pH 7,5) 2 µl dTTP (0,5 mM in 1 mM Tris-HCl (pH 7,5) 2 µl Random Primers Buffer Mixture 15 µl [α32P]dCTP, 3000 Ci/mmol 5 µl (ca. 50 µCi) H2O bidest x µl Klenow Fragment (3 U/µl in 50 mM KOH-Puffer 1 µl Gesamtvolumen 50 µl

Die Markierungsreaktion erfolgte für 2 h bei Raumtemperatur. Um die Ansätze von

überschüssiger Radioaktivität durch nicht inkorporierte [α32P]dCTPs zu befreien, wurden die

Proben mit Hilfe von Bio-Spin 6 Säulchen (Bio-Rad, Hercules, CA) aufgereinigt.

2.4.8.3 Hybridisierung Für die Hybridisierung wurde der jeweilige Blot blasenfrei in Hybridisierungsröhren mit

der Oberseite nach innen eingerollt und im Hybridisierungsofen 2 h bei 65°C in 20 ml

temperiertem Church-Puffer (siehe Anhang A) vorhybridisiert. Danach wurden 20 µl der

radioaktiv markierten Sonde, die unmittelbar vorher 5 min auf 95°C erhitzt wurde, zugegeben

und über Nacht hybridisiert. Die Blots wurden am nächsten Tag unter hoch-stringenten

Bedingungen bei 65°C gewaschen (2 x 5 min 2x SSC, 15 min 1x SSC, 15 min 0,2x SSC; alle

in 0,1% (w/v) SDS). Nach den Waschschritten wurden die Membranen in Plastikfolie

eingewickelt, über Nacht auf eine Imager-Platte aufgelegt und schließlich mit Hilfe eines

Phosphor-Imagers gescannt. Um den gleichen Blot für mehrere Hybridisierungen nutzen zu

können, wurde die Membran gestrippt. Hierfür wurde die feuchte Membran in eine

Plastikwanne gegeben und mit einer kochenden 0,1 % (w/v) SDS-Lösung übergossen. Nach

20 min wurde der Blot kurz mit 2x SSC gespült.


2.4.9 Semiquantitative RT-PCR

Für die RT-PCR-Versuche wurden jeweils 0,5 µg Gesamt-RNA der verschiedenen

Proben (siehe 2.4.8) in eine cDNA-Synthese eingesetzt (siehe 2.4.1; 25 µl

Gesamtansatzvolumen; Verwendung von SuperScript IITM Reverse Transcriptase

(Invitrogen)). Genspezifische Primerkombinationen für RcLUS1 und RcCAS1 (siehe 2.4.8)

wurden verwendet, um Fragmente der beiden Gene mittels PCR zu amplifizieren. Zusätzlich

wurde eine Positivkontrolle in Form des Actin-Gens von Ricinus communis, RcACT (nach

(Eastmond 2004), mit der Primerkombination 5’ CGTTCTCTCCTTGTATGCCAGTGGTC 3’

(RCACTS) und 5’ GAGCTGCTCTTGGCAGTCTCA AGTTC 3’ (RCACTA) amplifiziert. Für die

PCR wurden jeweils 25 ng cDNA als Template eingesetzt. Die Zyklisierungsbedingungen

wurden für die Untersuchung optimiert: 2 min 94°C, (30 s 94°C, 45 s 55°C, 60 s 72°C) x 23,

10 min 72°C. Die PCR-Produkte wurden anschließend mittels Elektrophorese in einem 1%

(w/v) Agarose-Tris-Borat-EDTA-Gel aufgetrennt.

2.4.10 Sequenzanalytische Verfahren

Vergleiche klonierter Sequenzen mit Sequenzen aus Datenbanken wurden mittels

BLAST-Search in der NCBI-Datenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) angestellt. Die

Übersetzung von Nukleotid- in Aminosäuresequenzen und ähnliche sequenzanalytische

Verfahren erfolgten mit Hilfe des Programms DNAStar EditSeqTM (Version 5.00). Sequenz-

Alignments und phylogenetische Analysen, basierend auf Neighbour-joining-Methoden,

wurden mit dem Programm ClustalX (Version 1.81) durchgeführt (Thompson et al. 1997). Für

die Analysen wurden neben den neu klonierten Sequenzen von Ricinus communis und

Lycopersicon esculentum Nukleotid- und Aminosäuresequenzen bereits klonierter und

charakterisierter Oxidosqualensynthasen aus der GenBank-Datenbank verwendet (Übersicht

siehe Anhang B). Die phylogenetischen Stammbäume wurden mit dem Programm TreeView

(Version 1.6.6) erstellt. Die Analyse von Primersequenzen bezüglich ihrer physikalischen und

chemischen Eigenschaften erfolgte mit dem Programm OligoAnalyzer (Version 1.0.2).


2.5 Charakterisierung klonierter cDNAs – heterologe Expression in Saccharomyces cerevisae

2.5.1 Amplifizierung der 2,3-Oxidosqualenzyklase-cDNAs mittels PCR

Für die Amplifizierung der cDNAs der Gensequenzen aus Rizinus und Tomate wurden

jeweils spezifische Sense- und Antisense-Primer konstruiert, die das Start- bzw. Stop-Codon

der ORFs flankierten. Zusätzlich wurden upstream des Start-Codons und downstream des

Stop-Codons Restriktionsschnittstellen angefügt, um die cDNA-Fragmente später in den

Hefe-Expressionsvektor ligieren zu können. Um eine optimale Expression der cDNAs in Hefe

zu garantieren, musste am 5’-Ende der cDNAs zusätzlich eine Translations-Initiations-

Sequenz, ein sog. Kozak-Fragment, in der Form „ANNATG“ (Start-Codon unterstrichen)

kreiert werden. Die Sequenzen der verwendeten Primer zur Amplifizierung der OSC-

Gensequenzen aus Rizinus und Tomate waren (Restriktionsschnittstellen unterstrichen,

Start- bzw. Stop-Codon fettgedruckt):

Ricinus communis Lupeolsynthase (RcLUS1):

sense (RCTS1C1S): 5’ TTGGAGCTCAGGATGTGGCGAATTAAAATAG 3’

Restriktionsschnittstelle: SacI

antisense (RCTS1C1A): 5’ ATTGCGGCCGCTCATAAATTATTGGTGAATC 3’

Restriktionsschnittstelle: NotI

Ricinus communis Cycloartenolsynthase (RcCAS1):

sense (RCCS1C2S): 5’ TTGGAATTCAAAATGTGGAAGCTAAGGATTGC 3’

Restriktionsschnittstelle: EcoRI

antisense (RCCS1C1A): 5’ ATTGCGGCCGCTTATGAAGCCTTGAGAACCCG 3’

Restriktionsschnittstelle: NotI

Lycopersicon esculentum β-Amyrinsynthase (LeTTS1):

sense (LETS1C4S): 5’ TTGGAGCTCAGGATGTGGAAATTGAAAATTGCTG 3’

Restriktiosnschnittstelle: SacI

antisense (LETS1C5A): 5’ CCCGAATTCTTAGTTGTTTTCTAATGGTAATAATAC 3’


Lycopersicon esculentum Triterpensynthase (LeTTS2):

Sense (LETS1C5S): 5’ TTGGAGCTCAAGATGTGGAAGTTGAAGATTGCAA 3’

Restriktionsschnittstelle: SacI

Antisense (LETS1C6A): 5’ CCCGAATTCCTATATGTAGTTGTGTTTTAATGGT 3’



Die PCR wurde mit Rizinus Hypocotyl cDNA bzw. Tomaten-Frucht cDNA (siehe 2.4.1)

und PhusionTM High Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) in einem Gesamtreaktions-

volumen von 50 µl gemäß den Herstellerangaben durchgeführt (1 µM pro Primer, 1 µl

cDNA). Die Zyklisierungsbedingungen waren: 10 s 98°C, (10 s 98°C, 30 s 55°C, 75 s 72°C) x

28, 10 min 72. Drei solcher PCR-Ansätze wurden vereinigt, aufgereinigt (PCR-Purification

Kit, Qiagen) und in 40 µl Elutionspuffer eluiert. Dieser Ansatz wurde gelelektrophoretisch

aufgetrennt und das erwartete Längenfragment aus dem Gel isoliert, aufgereinigt (Gel

Isolation Kit, Qiagen) und in 40 µl H2O bidest. eluiert.

2.5.2 Ligation der cDNAs in den Hefe-Expressionsvektor pYES2

Um die cDNAs der klonierten Gene in

Hefezellen heterolog exprimieren zu können,

mussten die entsprechenden Sequenzen

vorher in einen geeigneten Expressionsvektor

ligiert werden. Für die Transformation von

Hefe wurde der Expressionsvektor pYES2

(Invitrogen) verwendet. pYES2 verfügt über

einen GAL1 Promotor für eine Galactose-

induzierbare Protein-Expression in S. cerevi-

siae, eine Multi-cloning-site mit variablen

Restriktionsschnittstellen, ein Ampicillin-Resis-

tenz-Gen für die Selektion in E. coli und das

URA3-Gen für die Selektion transformierter

Hefezellen mit einem ura3 Genotyp (Abb. 2-

13).

Die aufgereinigten PCR-Produkte sowie 2 µg des Expressionsvektors wurden zunächst

mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut (1 h bei 37°C; Konzentrationen der Enzyme

und Pufferbedingungen nach Angaben des Herstellers; Gesamtansatzvolumen: 50 µl). Die

Reaktion wurde mit einer 20 minütigen Inkubationszeit bei 65°C bzw. 80°C terminiert.

Anschließend wurden die Ansätze gelelektrophoretisch aufgetrennt, mit Hilfe des Gel

Purifikation Kit (Qiagen) aufgereinigt und die Konzentrationen spektrophotometrisch

bestimmt (Konzentration betrug stets ca. 50 ng/µl).

Für die Ligation wurden die verdauten cDNA-Fragmente und der Vektor in einem

molaren Verhältnis von 1:3 mit 1 µl Ligase (Gesamtansatzvolumen 10 µl) für 3 h bei Raum-

temperatur inkubiert. Anschließend wurden kompetente E-coli Zellen (JM109, Promega) mit

Abbildung 2-13: Schematische Darstellung des Hefe-Expressionsvektors pYES2 (aus pYES2, Catalog no. V825-20, Version I, Manual, Invitrogen).


Hilfe der Hitzeschock-Methode (siehe 2.4.5) mit den Konstrukten transformiert, auf LB-Amp-

Platten ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Von allen Kolonien wurden mit Hilfe

einer Pipettenspitze Zellmaterial entnommen und direkt als Template für eine Test-PCR

(Gesamtansatzvolumen: 10 µl) mit der Primerkombination T7 und PYES2A eingesetzt (Abb.

2-14). Von geeigneten Kolonien, also von Zellen, die mit dem Expressionsvektor mit der

entsprechenden cDNA erfolgreich transformiert worden waren, wurden ÜN-Kulturen ange-

setzt und Plasmidisolierungen (Plasmid Isolation Kit, Qiagen) vorgenommen. Als zusätzliche

Kontrolle wurde ein Restriktionsverdau der isolierten Plasmide vorgenommen (jeweils 1 µg

Plasmid; Abb. 2-15). Die Inserts ausgesuchter Plasmide wurden sequenziert und die

entsprechenden Plasmid-Konstrukte wurden als Glycerol-Stocks bei -80°C eingefroren.

Abbildung 2-15: Restriktionsverdau der isolierten Plasmid-DNA als Positiv-Kontrolle. In diesem Beispiel wurden die Plasmide pYES2-RcCAS1 mit SacI und EcoRI verdaut.

11 10 2 13 17 20

2000 bp

3000 bp

1 kb DNA

Leiter

Plasmidvektor DNA

Insert DNA: RcCAS1

1 2 7 3 6 4 5 8 9 10 11 16 15141312 17 18 19 20

2000 bp 2000 bp

Abbildung 2-14: Test-PCR mit E. coli-Zellmaterial als Template nach der Transformation mit dem Expressionsvektor pYES2 + Insert und der Primerkombination T7 und PYES2A. In diesem Beispiel wurden 20 Kolonien getestet, die mit dem Konstrukt pYES2-RcCAS1 transformiert worden waren. Kolonie 2, 10, 11, 13, 17 und 20 zeigen das zu erwartende PCR-Fragment mit einer Länge von 2,3 kb.

DNA Leiter

DNA Leiter


2.5.3 Die Hefemutante GIL 77 und die Transformation von GIL 77 mit dem Express-ionsvektor pYES2

Für die heterologe Expression der klonierten Oxidosqualenzyklase-Gene wurde der

Hefestamm GIL 77 verwendet, der freundlicherweise von Herrn Prof. Y. Ebizuka, Tokyo, zur

Verfügung gestellt wurde. GIL 77 (gal2 hem3-5 erg7 ura3-167) zeigt keine Lanosterol-

Synthase-Aktivität, so dass in den Zellen dieser Hefemutante das Substrat 2,3-Oxidosqualen

akkumuliert wird. Dieser Umstand favorisiert die Bildung neuer Oxidosqualen-Zyklisierungs-

produkte durch die heterologe Expression von Oxidosqualenzyklasen (Haralampidis et al.

2002) (Abb. 2-16).

Da die Lanosterolsynthase-Mutation in GIL 77 eine Hemmung der Steroid-Biosynthese

zur Folge hat, mussten die Hefezellen in Nährmedien mit exogen zugegebenem Ergosterol

gehalten werden. Für die Transformation von GIL 77 mit den entsprechenden pYES2-

Konstrukten wurde die Lithiumacetat/PEG-Methode nach Gietz und Woods 2002

angewendet. Hierfür wurde zunächst eine ÜN-Kultur (Hefe-Kolonie in 5 ml YPD; 200 rpm;

30°C) angesetzt. Die ÜN-Kultur wurde in 45 ml YPD (siehe Anhang A) überführt und bei

30°C und 200 rpm in einem autoklavierten Kulturbecher für 4-6 h geschüttelt. Die Kultur

wurde anschließend in ein 50 ml Falcon-Röhrchen überführt und die Zellen durch

Zentrifugation bei 4000 rpm und Raumtemperatur geerntet. Nach zweimaligem Waschen der

Zellen in 25 bzw. 1 ml H2O bidest. und der Überführung der Zellen in ein 1,5 ml

Eppendorftube wurden die Zellen in 300-1000 µl H2O bidest. resuspendiert, in 100 µl-

Ansätze aliquotiert, bei 14000 rpm für 30 s zentrifugiert und der Überstand verworfen. Zu den

Hefezellen wurde folgender Mastermix pro Transformation zupippetiert:

Abbildung 2-16: Prinzip der funktionellen Charakterisierung klonierter Oxido-squalenzyklasen: die Zyklisierung von 2,3-Oxidosqualen im transformierten Hefestamm GIL 77.

O

OH

2,3-Oxidosqualen

Lanosterol

Lanosterol- synthase

heterolog exprimierte

OSC ?


PEG (Polyethylenglycol) 50% (w/v) 240 µl Lithium Acetat 1 M 36 µl SS Carrier-DNA (10 mg/ml) 10 µl Plasmid-DNA (ca. 500 ng/µl) 1 µl H2O bidest. 73 µl gesamt 360 µl

Als Negativ-Kontrolle wurde statt der Plasmid-DNA H2O bidest. dazugegeben. Die

Hefezellen wurden durch vorsichtiges Vortexen resuspendiert und die Ansätze in einem

42°C-Wasserbad für 40 min inkubiert. Die Ansätze wurden anschließend bei 14000 rpm für

30 s zentrifugiert, der Überstand vorsichtig abpippetiert und die Zellen in 1 ml H20 bidest.

vorsichtig mit der Pipette resuspendiert. 300 µl und 500 µl Aliquots der Ansätze wurden auf

SC-Minimal-Platten (siehe Anhang A) übertragen; die Platten wurden bei 30°C für 3-4 Tage

inkubiert.

2.5.4 Geninduktion und Extraktion transformierter Hefezellen

Für die Geninduktion transformierter GIL 77 Zellen wurde jeweils eine Zellkolonie mit

einer Impföse in 20 ml SC-Minimal Medium (siehe Anhang A) überführt und bei 250 rpm und

30°C inkubiert. Nach 48 h wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 4000 rpm und

Raumtemperatur geerntet und in 20 ml SC-U Medium (Induktionsmedium; siehe Anhang A)

vorsichtig resuspendiert. Nach einer zwölfstündigen Inkubationszeit bei 250 rpm und 30°C

wurden die Zellen erneut durch Zentrifugation geerntet, in 20 ml Resting Medium (siehe

Anhang A) resuspendiert und erneut bei 250 rpm und 30°C für 24 h inkubiert.

Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 4000 rpm und Raumtemperatur geerntet, mit

10 ml H2O bidest. gewaschen, anschließend in 5 ml 50% EtOH resuspendiert und in ein 24

ml Glasvial überführt. Nach Zugabe von 1 g KOH und vorsichtigem Vortexen wurde der

Ansatz für 5 min bei 70°C im Heizblock inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz in einen

Extraktions-Zylinder überführt und 5 ml Hexan zugegeben. Nach Ausschütteln wurde die

untere Extraktionsphase in ein neues Glasvial überführt. Nach erneuter Extraktion der

wässrigen Phase, Vereinigung der beiden Extraktionsphasen und Trocknung mit Na2SO4

wurde der Extrakt unter leichtem Stickstoffstrom und bei 50°C im Heizblock getrocknet und

schließlich in 300 ml Hexan aufgenommen.


2.5.5 Analyse der Hefe-Extrakte

Ein Aliquot (ca. 2 µl) des jeweiligen Hefe-Gesamtextraktes wurde zunächst mit einem

Glasröhrchen auf einen TLC Streifen aufgetragen. Zusätzlich wurden am Rand des Streifens

1 µl eines Standard-Gemisches, bestehend aus Ergosterol, Lupeol und C27-Keton (10 mg/ml

pro Einzelkomponente) gegeben. Der Extrakt und die Standardlösung wurden dünnschicht-

chromatographisch für 5 min aufgetrennt (mobile Phase: Benzol/Aceton 19:1); nach der

Trocknung des TLC-Streifens wurde dieser mit Primulin-Lösung besprüht und unter UV-Licht

bei 366 nm betrachtet.

Für eine quantitative Untersuchung wurden die Extrakte mittels Dünnschicht-

chromatographie präpariert (siehe 2.3.3). Aliquots von den Extrakten der einzelnen

Dünnschicht-Fraktionen wurden jeweils in ein Reactivial überführt, mit Stickstoff im Heizblock

ausgeblasen und silyliert. Anschließend wurden die Fraktionen auf ihre Zusammensetzung

hin mittels GC-FID und GC-MS untersucht. Daneben wurden Hefegesamtextrakte direkt

silyliert und mittels FID und MS gaschromatographisch analysiert.

2.5.6 In vitro-Enzymtest

Im Falle von RcCAS1 wurde neben der oben beschriebenen Methode der

Charakterisierung in intakten Hefezellen eine zusätzliche Methode zur Analyse der

Produktspezifität des Enzyms angewendet. Hierbei handelte es sich um einen Enzymtest in

Anlehnung an Morita et al. 1997, bei dem mit einem zellfreien Hefeextrakt gearbeitet wird.

Nach der zwölfstündigen Galaktose-Induktion (siehe 2.5.4) wurden die Zellen mit einer 0,1 M

Kaliumphosphatpuffer (p.H. 7,4; 0,45 M Succrose, 1 mM EDTA und 1 mM Dithiothreitol)

gewaschen und in 500 µl desselben Puffers resuspendiert. Durch zehnmaliges Vortexen für

jeweils 30 s mit Glaskügelchen (Sigma) wurden die Zellen homogenisiert. Die Ansätze

wurden bei 18000 rpm für 20 min zentrifugiert, der Überstand diente anschließend als

Enzymfraktion. 250 µl der zellfreien Enzymfraktion wurde mit 1 mg 2,3-Oxidosqualen

(präpariert über Dünnschichtchromatographie aus GIL 77-Gesamtextrakt; siehe 2.5.5) in 750

µl Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4; 0,1% (w/v) TritonX-100) für 5 h bei 30°C inkubiert.

Anschließend wurden die Proben zweimal mit 2 ml Chloroform extrahiert und die Extrakte

gaschromatographisch analysiert.


2.6 Zielgerichtete Mutagenese (Site-directed mutagenesis) von RcLUS1

Für die gerichtete Mutagenese, also den Austausch bestimmter Aminosäure-Reste, der

Lupeolsynthase RcLUS1 aus Ricinus communis wurde im Wesentlichen ein Verfahren

angewendet, wie es für den QickChange Site-directed mutagenesis Kit der Firma Stratagene

beschrieben wird (Abb. 2-17).

Die Sequenzen der Oligonukleotid-Primer mit den entsprechenden Punktmutationen

wurden nach den Vorschlägen der Stratagene-Website (http://www.stratagene.com/)

ermittelt. Für die Mutanten wurden folgende Primer verwendet (mutierte Nukleotide

unterstrichen):

RcLUS1 T416H

RCLST416HS: 5’ATGCAGAGTTTCGGAAGTCAACATTGGGACACAAGTCTAGCTCTTC3’

RCLST416HA: 5’GAAGAGCTAGACTTGTGTCCCAATGTTGACTTCCGAAACTCTGCAT3’

RcLUS1 F257W

RCLSF257WS: 5’CTTACACCCAGCAAAAATGTGGTGTTACTGTCGGATCACTT3’

RCLSF257WA: 5’AAGTGATCCGACAGTAACACCACATTTTTGCTGGGTGTAAG3’

50 ng des pYES2-RcLUS1-Konstruktes als Template, jeweils 2 µM der Sense- und

Antisenseprimer, 0.2 mM dNTPs, 10 µl 5X Phusion HF Reaction buffer (Finnzymes) sowie 2

U of PhusionTM High Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) wurden in einer PCR-Reaktion

eingesetzt (Gesamtansatzvolumen: 50 µl). Die Zyklisierungsbedingungen waren: 30 s 98°C,

(30 s 98°C, 60 s 55°C, 4 min 72°C) x 17, 10 min 72°C. Den Ansätzen wurden anschließend

10 U des Restriktionsenzyms Dpn1 (Fermentas) zugegeben und für eine Stunde bei 37°C

Schritt 1: Plasmidpräparation RcLUS1-ORF in Plasmid pYES2

Schritt 2: Primeranlagerung Denaturierung des Plasmids, Anla-gerung der Primer mit der gewünschten Punktmutation

Schritt 4: Verdau Verdau der nicht methylierten, parentalen DNA mit dem Restriktionsenzym DpnI

Schritt 3: PCR Primerverlängerung mit Phusion High Fidelity DNA Polymerase, resultierend in Zirku-larstränge mit Einzel-strangbrüchen

Schritt 5: Transformation Transformation der Plasmide in E. coli (JM109). Reparieren der Einzelstrang-brüche in E. coli

parentale Plasmid DNA Primer mit Mutation mutierte Plasmid DNA

Legende:

Abbildung 2-17: Schematische Darstellung des verwendeten Site-directed Mutagenese-Verfahrens (verändert nach: QuickChange-Manual, Stratagene)


inkubiert. Jeweils 5 µl der Ansätze wurden für eine Transformation kompetenter E. coli-Zellen

(JM109 High Efficiency Competent Cells, Promega) eingesetzt. Eine anschließende

Sequenzierung der pYES2-RcLUS1 Mutanten-Konstrukte stellte sicher, dass nur die jeweils

erwünschte Mutation vorlag. Anschließend wurden die Konstrukte in Hefe transformiert und

charakterisiert (siehe 2.5.3 - 2.5.5). Für die Herstellung der Doppelmutante RcLUS T416H

F257W wurden in der PCR-Reaktion 50 ng des pYES2-RcLUS1 T416H-Konstruktes als

Template sowie die Primer RCLSF257WS und RCLSF257WSA eingesetzt.

2.7 Rasterelektronenmikroskopie

Kleine Sprossachsen- sowie Blattspreitenfragmente von Ricinus communis wurden mit

Hilfe einer Rasierklinge aus frischem Pflanzenmaterial entnommen. Beim Ausschneiden der

Sprossachsen-Proben wurde besonders darauf geachtet, möglichst wenig Zellmaterial aus

dem Gewebe mit auszuschneiden, um Trocknungsartefakte so gering wie möglich zu halten.

Alle Proben wurden mit doppelseitigen Klebeplättchen auf Probenhalter aus Aluminium

fixiert. Nach Lufttrocknung für mehrere Stunden wurden die Probenhalter 300 s unter

verringertem Druck in Argonatmosphäre mit Gold bei 25 mA bedampft (Balzers Union

Sputtering Device). Die Proben wurden direkt im Anschluss am REM untersucht (Zeiss DSM

962; Beschleunigungsspannung: 15 kV). Von den Proben wurden Sw-Negativ-Fotos mit

einer eingebauten Spiegelreflexkamera angefertigt, die Negative wurden mit einem Dia-

Scanner digitalisiert.

3.1 Charakterisierung zweier Stammkutikula-Phänotypen…

45

3 Ergebnisse 3.1 Charakterisierung zweier Stammkutikula-Phänotypen von Ricinus

communis

Die primäre Sprossachsenoberfläche von Rizinuspflanzen tritt in zwei verschiedenen

Ausprägungen in der Natur in Erscheinung, die bereits nach wenigen Tagen nach der

Keimung der Pflanzen mit bloßem Auge voneinander unterschieden werden können.

Einerseits weisen Rizinus-Sprossachsen eine grünlich bis rötlich glänzende Oberfläche auf

(Glossy-Phänotyp). Individuen des anderen Typs sind dagegen durch das Vorhandensein

einer weißlich matten Sprossoberfläche gekennzeichnet (Glaucous-Phänotyp). Seit langem

ist bekannt, dass die graublaue Bereifung von Pflanzenoberflächen - auffällig zum Beispiel

bei Pflaumenfrüchten oder bei „glauken“ Kohlsorten - durch das Vorhandensein von

Oberflächenüberzügen aus epikutikulären Wachskristallen zustande kommt.

Bei der Aufzucht von Ricinus communis unter kontrollierten Anzuchtbedingungen im

Gewächshaus des Botanischen Institutes der Universität Würzburg segregierte der

Sprossachsen-Phänotyp in einem Verhältnis von 3:1 (Glossy:Glaucous). Die Ausbildung des

jeweiligen Sprossachsen-Phänotyps blieb dabei über die Individualentwicklung der Pflanzen

hindurch stabil. Es kann also davon ausgegangen werden, dass es sich bei der Ausprägung

der Spross-Phänotypen um ein genetisch gesteuertes Merkmal handelt, das unabhängig von

individuellen Wachstumsbedingungen ausgebildet wird. In den Gewächshäusern der

University of British Columbia, Vancouver, zeigten Individuen des Kultivars Sanguineus stets

den Glossy-Phänotyp, Individuen des Kultivars Baker den Glaucous-Phänotyp.

3.1.1 Rasterelektronenmikroskopische Untersuchung nativer Oberflächen beider

Sprossachsenphänotypen

Um potenzielle Unterschiede in der Oberflächengestaltung ihrer Sprossachsen und

Blattoberflächen und damit die räumliche Struktur ihrer epikutikulären Wachse zu

charakterisieren, wurden die nativen Oberflächen mehrere Monate alter Individuen beider

Sprossachsen-Phänotypen von Ricinus communis rasterelektronenmikroskopisch erfasst.

Diese Untersuchungen ergaben, dass die Sprossachsen von Individuen des Glossy-

Phänotyps von einem glatten, epikutikulären Wachsfilm bedeckt waren, aus dem wenige

kleine Plättchen hervortraten (Abb. 3-1A). Im Gegensatz dazu waren Sprossachsen-

oberflächen des Glaucous-Phänotyps mit epikutikulären Wachskristallen besetzt, die eine

fädige Struktur mit Längen von jeweils 10 – 20 µm und einen Durchmesser von wenigen nm

aufwiesen. Die Anordnung dieser Aggregate ließen in der Aufsicht ein dichtes,

dreidimensionales Netzwerk auf der Oberfläche erkennen (Abb. 3-1B). Solch ein


46

epikutikulärer Wachskristallbesatz fand sich über die Länge der gesamten Sprossachsen-

oberfläche mit primärem Abschlussgewebe vom Hypokotyl bis hin zu den jüngsten Inter-

nodien, sowie auf den Oberflächen der Petiolen. Die Blattoberflächen beider Phänotypen

waren dagegen einheitlich mit einem glatten epikutikulären Wachsfilm bedeckt (Abb. 3-1C),

die drastischen Unterschiede in der mikroskopischen Struktur der Oberfläche beider

Phänotypen also auf Sprossachsen und Blattstiele beschränkt.

Abbildung 3-1: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von R. communis Sprossachsen-internodien- und Blattoberflächen. A: Spross-achse eines Individuums des Glossy-Phänotyps. B: Sprossachse eines Individuums des Glaucous-Phänotyps. C: Oberfläche der Blattunterseite eines Individuums des Glaucous-Phänotyps.

BA

20 µm

C


47

3.1.2 Chemische Charakterisierung der kutikulären Wachse beider Stammkutikula-Phänotypen

Für die Gewinnung des kutikulären Gesamtwachses und dessen qualitative und

quantitative Analyse wurden jeweils vier Hypoktylabschnitte von 67 Tage alten Rizinus-

pflanzen beider Phänotypen extrahiert. Um darüber hinaus die epi- und intrakutikulären

Wachsbestandteile getrennt zu untersuchen, wurden die oberflächennahen Wachskompo-

nenten von vier Hypokotylen mit Hilfe der Gummi arabicum-Methode jeweils dreimal

mechanisch abgehoben und anschließend einer Nachextraktion unterzogen.

3.1.2.1 Zusammensetzung des kutikulären Gesamtwachses

Um potenzielle chemische Unterschiede und damit die mögliche Ursache für die oben

beschriebenen mikromorphologischen Unterschiede zwischen beiden Sprossachsen-

phänotypen von Ricinus communis zu verifizieren, wurden die kutikulären Wachse von

Hypokotyloberflächen 67 Tage alter Pflanzen beider Phänotypen extrahiert (n=4) und die

Extrakte anschließend gaschromatographisch sowie massenspektroskopisch analysiert. In

den Chromatogrammen der Wachsextrakte konnten bei beiden Phänotypen rund 50 bis 60

verschiedene Verbindungen identifiziert werden (Abb. 3-2). Unter diesen Substanzen

befanden sich einerseits die für kutikuläre Wachse typischen homologen Reihen langkettiger,

aliphatischer Verbindungen wie Aldehyde, n-Alkane, Fettsäuren und primäre Alkohole.

Daneben waren zyklische Verbindungen in Form von Triterpenen (Tab. 3-1) vertreten.

Anhand der silylierten Massenspektren wurden im kutikulären Wachs des Glossy-

Phänotyps neben den weit verbreiteten VLC-aliphatischen Verbindungen auch Substanz-

vertreter der 1,3-Alkandiole identifiziert, einer in kutikulären Wachsgemischen eher selten

auftretenden Verbindungsklasse. Dabei zeigten die Fragmente m/z 73, 103 und 147 in den

Massenspektren dieser Verbindungen die Anwesenheit von zwei OTMS-Gruppen und damit

die Diol-Struktur der Moleküle an. Die Anordnung der funktionellen Gruppen ergab sich aus

Anwesenheit des α-Fragmentes 219 [TMS-O-CH-CH2-CH2-O-TMS]+. Die jeweilige

Kettenlänge der Substanzen ergab sich aus dem Fragment M+-15 sowie aus dem

Vorhandensein weiterer α–Fragmente (Abb. 3-3). Die Tatsache, dass die jeweiligen

Alkandiole mit Cn-Kettenlängen bei der gaschromatographischen Auftrennung direkt vor den

jeweiligen primären Alkoholen mit Kettenlängen von Cn+2 eluierten, bestätigte die

massenspektrometrischen Befunde. Insgesamt machten die 1,3-Alkandiole allerdings

weniger als 0,5% der gesamten Wachsmenge der Glossy-Individuen aus und waren im

Wachs der Glaucous-Individuen nur in Spuren nachweisbar; sie werden deshalb in den

nachfolgenden Betrachtungen nicht weiter berücksichtigt.


48

Abbildung 3-2: Gaschromatogramm des kutikulären Gesamtwachses von 67 Tage alten Ricinus communis-Hypokotylen. Identifizierte Verbindungen wurden gemäß ihrer Retentionsfolge nummeriert (Bezeichnungen der Verbindungen siehe Tabelle 3-1). A: Glossy-Phänotyp. B: Glaucous-Phänotyp.

Glaucous

Retentionszeit [min]10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

0

5

10

15

20

2580

90

100

1

2 6 89

10

11

12 15 18

19

2021

2325

26

2730 31

32

33

34

3536

3739

40

4445

4647

48

49

50 51

5354

5556

57

58 5960

Glossy

Retentionszeit [min]10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

0

5

10

15

20

25

30

60

70

80

90

100

1

3 4 5 6 7 8

10

11

1314

1516

17

20

5952

50

47

46

42

4038

3736

35

31

30

2928

2122

23 3419

26

24 33

41

43

A

B


49

Tabelle 3-1: Identifizierte Kutikulawachs-Komponenten von Ricinus communis-Hypokotylen des Glossy-, sowie des Glaucous-Phänotyps. Die Nummerierung ergibt sich aus der Retentionsfolge in den GC-Läufen (vgl. Abb. 3-2).

Glossy-Phänotyp Glaucous-Phänotyp

Num- mer Verbindung Num-

mer Verbindung

1 n-Tetracosan (ISTD) 1 n-Tetracosan (ISTD) 3 Docosanol 2 n-Pentacosan 4 n-Hexacosan 6 n-Heptacosan 5 Docosansäure 8 n-Octacosan 6 n-Heptacosan 9 Hexacosanal 7 Tricosansäure 10 Tetracosansäure 8 n-Octacosan 11 n-Nonacosan 10 Tetracosansäure 12 Heptacosanal 11 n-Nonacosan 15 Hexacosanol 13 Pentacosansäure 18 n-Triacontan 14 Tetracosan-1,3-diol 19 Octacosanal 15 Hexacosanol 20 Hexacosansäure 16 γ-Tocopherol 21 Heptacosanol 17 n-Triacontan 23 n-Hentriacontan 19 Octacosanal 25 nicht identif. Triterpen 20 Hexacosansäure 26 Nonacosanal 21 Heptacosanol 27 Octacosanal (Enol) 22 Cholesterin 30 Octacosanol 23 n-Hentriacontan 31 Octacosanal (Enol) 24 α-Tocopherol 32 Lupenon 26 Nonacosanal 33 Triacontanal 28 Heptacosansäure 34 Taraxerol 29 Hexacosan-1,3-diol 35 Octacosansäure 30 Octacosanol 36 Nonacosanol 31 Octacosanal (Enol) 37 β-Amyrin 33 Triacontanal 39 α-Amyrin 34 Taraxerol 40 Lupeol 35 Octacosansäure 44 Triacontanal (Enol) 36 Nonacosanol 45 nicht identif. Triterpen 37 β-Amyrin 46 Triacontanol 38 β-Sitosterol 47 Triacontanal (Enol) 40 Lupeol 48 Dotriacontanal 41 Hentriacontanal 49 nicht identif. Triterpen 42 Nonacosansäure 50 Triacontansäure 43 Octacosan-1,3-diol 51 nicht identif. Triterpen 46 Triacontanol 53 nicht identif. Triterpen 47 Triacontanal (Enol) 54 Dotriacontanal (Enol) 50 Triacontansäure 55 nicht identif. Triterpen 52 Hentriacontansäure 56 Dotriacontanol 59 Dotriacontansäure 57 Dotriacontanal (Enol)

58 nicht identif. Triterpen 59 Dotriacontansäure 60 nicht identif. Triterpen


50

Abbildung 3-3: Massenspektrum des silylierten Derivats von Hexacosan-1,3-diol.

Die Hypokotyl-Kutikula des Glossy-Phänotypes enthielt 12,5 ± 1,9 µg cm-2 Wachs-

komponenten, wohingegen Hypokotyle des Glaucous-Phänotypes mit durchschnittlich 51,9 ±

21,1 µg cm-2 kutikulärem Wachs bedeckt waren. Im kutikulären Wachs des Glossy-

Phänotyps wurden mit 11,2 ± 1,0 µg cm-2 ähnlich große und statistisch nicht signifikant

unterschiedliche Mengen (Mann Whitney U-Test: U = 2, P = 0,11) an VLC-aliphatischen

Verbindungen identifiziert wie im Wachs des Glaucous-Phänotypes mit 9,6 ± 1,0 µg cm-2

(Abb. 3-4). Dagegen war die Menge an zyklischen Triterpen-Verbindungen in beiden

Phänotypen deutlich unterschiedlich: Während bei Glossy-Individuen mit 0,3 ± 0,5 µg cm-2

bzw. 2,3 ± 3,3% des Gesamtwachses nur sehr geringe absolute und relative Mengen

vorhanden waren, dominierte die Stoffklasse der Triterpene mit 66,5 ± 15,0% das kutikuläre

Wachs des Glaucous-Phänotypes und war mit 36,7 ± 20,6 µg cm-2 in signifikant höheren

absoluten Mengen vertreten (Mann Whitney U-test: U = 0, P = 0,029).

Auch wenn die Gesamtmenge an langkettigen Aliphaten pro Fläche in beiden

Phänotypen nicht signifikant unterschiedlich war, zeigte die eingehende gaschromato-

graphische Analyse, dass die quantitative Zusammensetzung der einzelnen aliphatischen

Substanzklassen stark differierte (Tab. 3-2). Die häufigste aliphatische Substanzklasse im

kutikulären Wachs der Glossy-Hypokotyle war die Klasse der Fettsäuren mit 79,3 ± 13,6%

des Gesamtwachses (9,7 ± 1,0 µg cm-2), gefolgt von primären Alkoholen mit 5,8 ± 1,8% (0,7

± 0,2 µg cm-2), Aldehyden mit 3,7 ± 5,7% (0,5 ± 0,9 µg cm-2) und n-Alkanen mit 1,7 ± 0,6%

(0.2 ± 0.1 µg cm-2). Die Gruppe der VLC-aliphatischen Verbindungen im kutikulären Wachs

von Glaucous-Hypokotylen wurde von Aldehyden mit 12,1 ± 5,8% (5,5 ± 1,0 µg cm-2)

dominiert, gefolgt von Fettsäuren mit 5,7 ± 4,5% (2,2 ± 1,5 µg cm-2), n-Alkanen mit 2,6 ±

1,0% (1,2 ± 0,1 µg cm-2) und primären Alkoholen mit 1,6 ± 1,2% (0,7 ± 0,2 µg cm-2 ).

m/z

100 200 300 400 500 600

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

0

20

40

60

80

100

21973

103

400 450 500 550 6000

1M+-15527

10x439

425

147

129

C21H43

OTMSOTMS

219 103

425


51

Die jeweilige Kettenlängenverteilung in den entsprechenden langkettigen aliphatischen

Substanzklassen war in beiden Phänotypen sehr ähnlich ausgeprägt (Abb. 3-5). Bei den

Fettsäuren waren Kettenlängen zwischen 24 und 32 Kohlenstoffatomen mit einem Maximum

bei C30 nachweisbar, wobei geradzahlige Kohlenstoffverbindungen vorherrschten. Die

homologen Reihen von Aldehyden und primären Alkoholen wurden ebenfalls von

geradzahligen Verbindungen dominiert, zeigten Maxima bei C30 und waren durch

Substanzen mit Längen zwischen 26 bis 32 Kohlenstoffatomen gekennzeichnet. Die

Kettenlängenverteilung der n-Alkane reichte von C25 bis C31, zeigte ein Maximum bei C29 und

war durch die für Alkane, aufgrund des postulierten Biosyntheseweges über eine

Decarbonylierung der entsprechenden Aldehyde, typische Dominanz ungerader

Kohlenstoffverbindungen charakterisiert. Im Wachs der Individuen vom Glossy-Phänotyp

waren die Alkandiole mit den Verbindungen Tetracosan-1,3-diol, Hexacosan-1,3-diol sowie

Octacosan-1,3-diol vertreten.

Wac

hsbe

legu

ng [µ

g cm

-2]

0

10

20

30

40

50

60

GlossyGlaucous

Triterpenoide nicht identifiziert

VLC-aliphatischeVerbindungen

Abbildung 3-4: Wachsbelegung und chemische Zusammensetzung kutikulärer Wachse von 67 Tage alten Hypokotylen beider Phänotypen von R. communis. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen.


52

Tabelle 3-2: Absolute und relative Zusammensetzung des kutikulären Wachses von Hypokotyl-Oberflächen 67 Tage alter R. communis Pflanzen beider Sprossachsen-Phänotypen. Angegeben sind Mittelwerte (n = 4) und Standardabweichung in µg cm-2 bzw. Prozent des Gesamtwachses.

Verbindungsklasse Glossy-Phänotyp Glaucous-Phänotyp

Verbindung/ Kettenlänge

absolut [µg/cm2]

relativ [%]

absolut [µg/cm2]

relativ [%]

Aldehyde 26 <0,1 <0,1 <0,1 0,1 ± 0,1

28 0,1 ± 0,1 0,7 ± 0,8 0,6 ± 0,3 1,3 ± 0,9 30 0,4 ± 0,6 2,5 ± 3,8 3,5 ± 1,1 8,0 ± 5,2 32 <0,1 0,2 ± 0,5 0,9 ± 0,6 1,8 ± 0,9

n-Alkane 27 <0,1 0,2 ± 0,1 0,1 ± 0,0 0,2 ± 0,1

29 0,2 ± 0,1 1,2 ± 0,5 0,7 ± 0,1 1,5 ± 0,8 31 <0,1 0,2 ± 0,0 0,3 ± 0,1 0,7 ± 0,2

Fettsäuren 24 0,1 ± 0,0 0,5 ± 0,2 <0,1 0,1 ± 0,1

25 <0,1 0,2 ± 0,1 <0,1 <0,1 26 0,3 ± 0,1 2,3 ± 0,6 0,1 ± 0,1 0,3 ± 0,3 27 0,1 ± 0,0 0,6 ± 0,1 <0,1 <0,1 28 2,7 ± 0,5 21,3 ± 2,1 0,3 ± 0,3 0,8 ± 0,9 29 0,6 ± 0,2 5,2 ± 1,7 0,1 ± 0,1 0,2 ± 0,2 30 5,8 ± 1,1 48,0 ± 12,0 1,4 ± 1,0 3,5 ± 2,7 31 0,1 ± 0,0 0,7 ± 0,1 0,1 ± 0,1 0,2 ± 0,2 32 0,1 ± 0,0 0,3 ± 0,3 0,2 ± 0,2 0,5 ± 0,4

primäre Alkohole 26 <0,1 0,2 ± 0,3 <0,1 <0,1 28 0,3 ± 0,1 2,2 ± 1,1 0,1 ± 0,0 0,2 ± 0,2 30 0,3 ± 0,1 2,7 ± 0,5 0,3 ± 0,1 0,7 ± 0,5 32 <0,1 <0,1 0,1 ± 0,1 0,3 ± 0,2

Triterpene α-Amyrin <0,1 0,1 ± 0,1 0,1 ± 0,1 0,2 ± 0,1 β-Amyrin <0,1 0,1 ± 0,1 0,1 ± 0,0 0,2 ± 0,1

Lupeol 0,2 ± 0,3 1,0 ± 1,9 31,3 ± 19,4 56,1 ± 14,5 Taraxerol 0,1 ± 0,2 0,6 ± 1,2 0,8 ± 0,6 1,5 ± 1,0 Lupenon -- -- 0,7 ± 0,6 1,2 ± 1,2

nicht identifiziert 0,9 ± 1,0 6,7 ± 6,5 5,5 ± 1,6 18,7 ± 7,9

gesamt 12,5 ± 1,9 51,9 ± 21,1


53

Die Stoffklasse der Triterpene war im kutikulären Wachs des Glossy-Phänotypes durch

die pentazyklischen Triterpenole Lupeol, α-Amyrin, β-Amyrin und Taraxerol vertreten, alle in

sehr kleinen absoluten und relativen Mengen (Tab. 3-2). Die Gruppe der Triterpene im

kutikulären Wachs von Glaucous-Hypokotylen wurde vom Triterpenol Lupeol dominiert (31,3

± 19,4 µg cm-2), gleichzeitig die Hauptkomponente des kutikulären Gesamtwachses mit 56,1

± 14,5%. Taraxerol, α-Amyrin und β-Amyrin sowie das Triterpen-Keton Lupenon waren nur in

geringen Mengen nachweisbar. Die Triterpenzusammensetzung beider Phänotypen

differierte also im Wesentlichen in der absoluten und relativen Menge des Lupeols.

Glaucous

Kettenlänge [C-Atome]

23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

Rel

ativ

e A

ntei

le [%

]

0

10

20

30

40

50

60

70

80Aldehyden-AlkaneFettsäurenprimäre Alkohole

B

Abbildung 3-5: Relative Homologenzusammensetzung [% der jeweiligen Verbindungsklasse] aliphatischer Substanzklassen in kutikulären Wachsen 67 Tage alter Hypokotyle von Ricinus communis. Gezeigt sind Mittelwerte und Standard-abweichungen. A: Glossy-Phänotyp. B: Glaucous-Phänotyp.

Glossy


23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

Rel

ativ

e A

ntei

le [%

]

0

10

20

30

40

50

60

70

80 Aldehyden-AlkaneFettsäurenprimäre Alkohole

A


54

3.1.2.2 Epi- und intrakutikuläre Wachszusammensetzungen

In der jüngeren Vergangenheit wurden Methoden entwickelt, mit der epi- und

intrakutikuläre Wachse von planen Oberflächen selektiv beprobt und chemisch analysiert

werden können (Jetter et al. 2000; Jetter und Schäffer 2001; Riedel et al. 2003; Ensikat et al.

2000). Das Verfahren, in dem mit Hilfe eines Klebstoffs oberflächennahe Stoffe mechanisch

abgehoben werden, musste zunächst auch für konvexe pflanzliche Oberflächen wie

Sprossachsen angepasst und optimiert werden (Guhling 2002). Für die Untersuchung der

Hypokotyl-Oberflächen von R. communis erwies sich Gummi arabicum, ein in wässriger

Lösung applizierbares und an der Luft aushärtendes Polysaccharid, als geeignet. Durch die

mehrfache Wiederholung des Abhebevorgangs an derselben Oberfläche muss dabei

sichergestellt werden, dass das epikutikuläre Wachs quantitativ abgetragen wird. Erst

dadurch lassen sich anschließend die verbleibenden intrakutikulären Wachskomponenten

extraktiv gewinnen. Die Hypokotyle von R. communis erwiesen sich als mechanisch

ausreichend stabil, um diese Abfolge von Beprobungen ohne mechanische Verletzungen,

und damit ohne Kontamination, aus dem Gewebeinneren durchzuführen. Die Analysen der

entsprechenden Abhebe- und Extraktionsproben konnten zu Kontrollzwecken mit

Gesamtwachs-Extraktionen verglichen werden, bei denen mit Hilfe einer Gesamtextraktion

alle kutikulären Wachse gewonnen wurden. Alle Analysen wurden für vier unabhängige

Parallelen durchgeführt, im Folgenden werden Mittelwerte und Standardabweichungen

angegeben.

67 Tage alte Hypokotyle von beiden Spross-Phänotypen wurden mit Hilfe dieses

Verfahrens auf ihre epi- bzw. intrakutikuläre Wachszusammensetzung hin untersucht. Bei

beiden Phänotypen wurde der Abhebevorgang dreimal wiederholt. Dabei wurde eine starke

Abnahme der Wachsausbeuten mit jedem Abhebeschritt beobachtet (Abb. 3-6), so dass

davon ausgegangen werden kann, dass nach dem letzten Abhebeschritt nahezu der

gesamte epikutikuläre Wachsanteil selektiv abgehoben und präparativ gewonnen wurde. Die

nachfolgende Extraktion der verbliebenen intrakutikulären Wachsanteile erbrachte jeweils

höhere Wachsausbeuten als der letzte Abhebeschritt. In beiden Phänotypen wurden bei der

selektiven Beprobung der epikutikulären Wachse weitaus höhere Ausbeuten erzielt als bei

der Nachextraktion (Tab. 3-3): 16,9 µg cm-2 gegenüber 0,9 µg cm-2 bei Hypokotylen des

Glossy- und 54,6 µg cm-2 gegenüber 8,0 µg cm-2 bei Hypokotylen des Glaucous-Phänotyps.

In beiden Phänotypen war der Großteil des Wachses demnach epikutikulär lokalisiert. Die

Quantitative Analyse des Gesamtwachses, gewonnen durch Extraktion der Sprossoberfläche

ohne vorherige Gummi arabicum-Behandlung (3.1.2.1), stimmte mit der Summe der

Ausbeuten aus Abhebe- und Nachextraktionsversuchen weitgehend überein (Abb. 3-6).


55

Während bei den Individuen des Glaucous-Phänotyps Triterpene sowohl in der epi- (30,0

µg cm-2), als auch in der intrakutikulären Wachsfraktion (8,6 µg/cm2) gegenüber VLC-

Aliphaten (5,6 µg cm-2 epi- bzw. 1,2 µg cm-2 intrakutikulär) deutlich dominierten, zeichnete

sich bei den Glossy-Individuen ein anderes Bild ab: Im epikutikulären Wachsgemisch wiesen

VLC-Aliphaten mit 15,0 µg cm-2 weit größere Mengen in der Wachsbelegung auf als

Triterpene mit 0,3 µg cm-2; im intrakutikulären Wachs dagegen waren Triterpenverbindungen

mit 0,3 µg cm-2 in größerer Menge vertreten als VLC-Aliphaten mit 0,2 µg cm-2.

Glossy

Wac

hsbe

legu

ng [µ

g/cm

2 ]

0

5

10

15

20

25

1. Abheben 2. Abheben 3. Abheben Nach-extraktion

Gesamt-extraktion

Glaucous

Wac

hsbe

legu

ng [µ

g/cm

2 ]

0

20

40

60

80

100

1. Abheben 2. Abheben 3. Abheben Nach-extraktion

Gesamt-extraktion

Abbildung 3-6: Vergleich der kutikulären Wachsausbeuten bei 67 Tage alten Ricinus communis-Hypokotylen bei drei aufeinander-folgenden Abhebeschritten und Nachextraktion einerseits und Gesamtextraktion andererseits. Angegeben sind Mittelwerte und Standardabweichungen. A: Glossy-Phänotyp. B: Glaucous-Phänotyp.

B

A


56

Tabelle 3-3: Absolute Ausbeuten der durch Abhebemethode (drei Wiederholungen) und Nachextraktion 67 Tage alter Hypokotyle beider Phänotypen von Ricinus communis gewonnenen Wachsschichten. Angaben in µg cm-2 mit Mittelwerten (n=4) und Standardabweichung.



abgehoben (epikutikulär)

nachextrahiert (intrakutikulär)



Aldehyde 26 <0,1 -- 0,1 ± 0,1 --

28 0,2 ± 0,4 <0,1 1,1 ± 0,9 <0,1 30 1,7 ± 3,2 <0,1 5,7 ± 2,9 0,4 ± 0,3 32 0,1 ± 0,3 -- 1,0 ± 0,4 <0,1

n-Alkane 27 <0,1 <0,1 0,1 ± 0,1 <0,1

29 0,2 ± 0,1 <0,1 1,0 ± 0,7 <0,1 31 <0,1 -- 0,5 ± 0,5 <0,1

Fettsäuren 24 0,1 ± 0,0 <0,1 0,1 ± 0,1 <0,1

25 <0,1 -- <0,1 -- 26 0,3 ± 0,1 <0,1 0,3 ± 0,2 <0,1 27 0,1 ± 0,0 -- <0,1 -- 28 2,4 ± 0,2 -- 0,5 ± 0,4 <0,1 29 0,7 ± 0,0 <0,1 0,2 ± 0,2 <0,1 30 7,3 ± 3,8 0,1 ± 0,1 2,2 ± 2,0 <0,1 31 0,1 ± 0,1 -- 0,1 ± 0,1 -- 32 0,2 ± 0,4 <0,1 0,7 ± 0,5 <0,1

primäre Alkohole 26 <0,1 -- <0,1 -- 28 0,3 ± 0,2 <0,1 0,3 ± 0,1 <0,1 30 0,6 ± 0,8 <0,1 1,2 ± 0,5 0,1 ± 0,0 32 0,1 ± 0,2 -- 0,4 ± 0,3 <0,1

Triterpene α-Amyrin -- <0,1 0,1 ± 0,1 <0,1 β-Amyrin <0,1 <0,1 0,1 ± 0,1 0,1 ± 0,1

Lupeol 0,2 ± 0,2 0,1 ± 0,2. 23,1 ± 18,5 4,6 ± 2,8 Taraxerol <0,1 0,1 ± 0,0 0,7 ± 0,9 0,2 ± 0,1 Lupenon -- <0,1 1,0 ± 1,4 0,2 ± 0,1


gesamt 16,9 ± 12,4 0,9 ± 0,7 54,6 ± 36,4 8,0 ± 3,2

Die qualitative Analyse zeigte deutliche Unterschiede in der Zusammensetzung von epi-

und intrakutikulären Wachsanteilen bei Hypokotylen des Glossy-Phänotyps und offenbarte

damit auffällige Gradienten in der Konzentration verschiedener Komponenten zwischen den

Kutikula-Kompartimenten (Tab. 3-4; Abb. 3-7). Das epikutikuläre Wachs war von

aliphatischen Komponenten stark dominiert (Alkane 2,6%, Aldehyde 6,6%, Säuren 75,0%,

primäre Alkohole 6,5%, Diole 0,4%), Triterpene traten nur mit 1,6% Wachsanteil in


57

Erscheinung. Im intrakutikulären Wachs war der Triterpenanteil mit 40,0% demgegenüber

stark erhöht (darunter Taraxerol mit 16,0%, β-Amyrin mit 4,7% und nicht identifizierte

Triterpene mit 8,6%). Es ist von besonderem Interesse, dass Lupeol mit 6,0% nur in

geringen Mengen detektiert wurde, obwohl dieses Triterpenol im Sprosswachs des

Glaucous-Phänotyps besonders prominent war. Mit 23% war der Anteil an VLC-Aliphaten im

Vergleich zur epikutikulären Wachsfraktion sehr gering.

An Hypokotylen von Pflanzen des Glaucous-Phänotyps konnte keine besonders

ausgeprägte chemische Schichtung bezüglich der kutikulären Wachse festgestellt werden.

Hier dominierten Triterpene sowohl im epi- (49,2%) wie auch im intrakutikulären Wachs

(68,0%) gegenüber aliphatischen Verbindungen. Die Hauptkomponente stellte dabei Lupeol

Glaucous

rela

tive

Wac

hszu

sam

men

setz

ung

[%]

0

20

40

60

80

100

Aldehyde Alkane Fettsäuren Alkohole Triterpene nichtidentifiziert

Glossy

rela

tive

Wac

hszu

sam

men

setz

ung

[%]

0

20

40

60

80

100

Aldehyde Alkane Fettsäuren Alkohole Triterpene nichtidentifiziert

A

B

epikutikulär intrakutikulär

epikutikulär intrakutikulär

Abbildung 3-7: Vergleich der jeweiligen relativen Anteile einzelner Substanzklassen an den epi- bzw. intrakutikulären Wachsschichten 67 Tage alter R. communis-Hypokotyle. Angegeben sind Median mit 1. und 3. Quartile. A: Glossy-Phänotyp. B: Glaucous-Phänotyp.


58

dar, das mit 39,1% im epikutikulären und 54,5% im intrakutikulären Wachs vertreten war. Der

hohe Anteil von Lupeol in den mechanisch abgehobenen Oberflächenpräparationen zeigte,

dass dieses Triterpen als Kristallbildner der fadenförmigen Wachskristalle auf Ricinus-

Hypokotylen der Glaucous-Individuen angesehen werden muss. Daneben wurden 24,0%

weiterer Triterpene (darunter Lupenon mit 1,2%, Taraxerol mit 0,9% und β- und α-Amyrin mit

je 0,2%) und 36,2% aliphatischer Komponenten im epikutikulären Wachs nachgewiesen.

Tabelle 3-4: Relative Zusammensetzung der Wachsschichten, die durch die Abhebemethode (drei Wiederholungen) und die Nachextraktion 67 Tage alter Hypokotyle beider Phänotypen von Ricinus communis gewonnen wurden. Angegeben in Prozent der jeweiligen Wachsschicht mit Mittelwerten (n=4) und Standardabweichung.







Aldehyde 26 <0,1 -- 0,1 ± 0,1 <0,1

28 0,7 ± 0,9 0,8 ± 0,1 1,8 ± 0,6 0,6 ± 0,3 30 5,2 ± 8,7 0,8 ± 1,7 11,1 ± 1,5 5,3 ± 1,8 32 0,4 ± 0,8 -- 2,2 ± 0,8 0,6 ± 0,3

n-Alkane 27 0,2 ± 0,1 0,8 ± 0,4 0,2 ± 0,0 0,5 ± 0,8

29 1,6 ± 0,9 2,7 ± 1,8 1,7 ± 0,2 0,9 ± 0,9 31 0,2 ± 0,1 0,5 ± 0,2 0,9 ± 0,3 0,5 ± 0,7

Fettsäuren 24 0,4 ± 0,1 0,1 ± 0,2 0,2 ± 0,1 0,1 ± 0,1

25 0,1 ± 0,1 -- <0,1 <0,1 26 2,1 ± 0,6 0,2 ± 0,3 0,5 ± 0,3 0,1 ± 0,1 27 0,6 ± 0,3 <0,1 0,1 ± 0,0 <0,1 28 18,3 ± 8,3 -- 1,5 ± 1,0 0,1 ± 0,3 29 5,2 ± 2,4 1,1 ± 2,2 0,6 ± 0,4 0,1 ± 0,2 30 46,5 ± 6,8 3,4 ± 6,8 6,8 ± 6,1 0,5 ± 0,6 31 0,6 ± 0,3 -- 0,2 ± 0,2 -- 32 0,6 ± 1,0 0,1 ± 0,3 1,3 ± 0,5 0,2 ± 0,3

primäre Alkohole 26 0,2 ± 0,1 0,4 ± 0,3 0,1 ± 0,0 <0,1 28 2,0 ± 0,9 3,6 ± 2,5 0,6 ± 0,2 0,2 ± 0,1 30 2,9 ± 1,7 4,9 ± 2,5 2,4 ± 0,8 1,4 ± 0,8 32 0,2 ± 0,5 -- 0,8 ± 0,6 0,2 ± 0,2

Triterpene α-Amyrin -- 0,5 ± 1,0 0,2 ± 0,1 0,3 ± 0,1 β-Amyrin <0,1 4,7 ± 2,4 0,2 ± 0,2 1,3 ± 1,8

Lupeol 0,7 ± 0,7 6,1 ± 7,6 39,1 ± 8,3 54,5 ± 15,3 Taraxerol <0,1 16,0 ± 9,9 0,9 ± 0,7 2,2 ± 0,8 Lupenon -- 0,2 ± 0,5 1,2 ± 1,1 2,2 ± 0,7



59

Die Effizienz der Abhebetechnik wurde mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie

überprüft und dokumentiert. Bereiche, auf denen die epikutikulären Wachse durch

einmaliges Abheben beprobt worden waren, zeigten, dass große Bereiche der Kristalle

abgetragen waren und teilweise angedrückt wurden. Nach dem dritten Abhebeschritt waren

auf den beprobten Flächen nur noch vereinzelt fädige Wachskristalle rasterelektronen-

mikroskopisch nachweisbar, so dass auf Übergangszonen zwischen behandelten und

unbehandelten Flächen eine scharfe Kante zu erkennen war (Abb. 3-8A und B). Der

Innenseite von Gummi arabicum-Präparaten hafteten die mechanisch abgerissenen fädigen

epikutikulären Wachskristalle an, die in Struktur und Dimension denen auf den nativen

Oberflächen entsprachen (Abb. 3-8C und D). Diese mikromorphologischen Ergebnisse

bestätigen damit die oben geschilderten chemischen Befunde. Die Behandlung der R.

communis-Sprossachsen mit Gummi arabicum ermöglichte es, die epikutikulären Kristalle

der Glaucous-Versuchspflanzen zu einem großen Teil abzutragen und damit die

epikutikuläre und die intrakutikuläre Wachsschicht getrennt zu beproben. Die mechanische

Wachsgewinnung ist hochgradig selektiv für die Kristalle und erlaubt damit eine spezifische

Analyse der Kristallzusammensetzung.

Abbildung 3-8: Rasterelektronenmikroskopische Bilder zur Abhebemethode für die selektive Beprobung epikutikulärer Wachse. A und B: Oberfläche eines Übergangsbereichs von nativer (oben) zu mehrfach abgehobener Fläche (unten) bei einem Hypokotyl vom Glaucous-Phänotyp; die Pfeile markieren die Abhebekante. C und D: Aufsicht auf die Innenseite eines getrockneten Gummi arabicum-Präparates mit daran anhaftenden Wachskristallen nach dem Abhebevorgang.

A B

DC

3.2 Kutikula-Ontogenese… 60

3.2 Kutikula-Ontogenese: Kutikuläre Wachszusammensetzung während der frühen Sprossachsenentwicklung

3.2.1 Rasterelektronenmikroskopische Untersuchung von Hypokotyloberflächen

während der frühen Entwicklungsphase Um die Bildung der epikutikulären Wachskristalle während der frühen Entwicklung der

Individuen mit Glaucous-Phänotyp von Ricinus communis zu dokumentieren, wurden

Hypokotyl-Oberflächen unterschiedlich alter Pflanzen rasterelektronenmikroskopisch

untersucht (Abb. 3-9). Diese Arbeiten wurden von Frau Barbara Hobl im Rahmen ihre

Diplomarbeit (Hobl 2005) erhoben, die in enger Zusammenarbeit mit meinen

Untersuchungen am Lehrstuhl für Botanik II, Universität Würzburg, erstellt wurde. Bereits

drei Tage nach dem Durchbrechen der Keimlinge aus dem Bodensubstrat waren erste

vereinzelte Wachskristalle auf den Hypokotyloberflächen erkennbar, die mit ihrer Länge von

10-30 µm und ihrer fadenförmigen Struktur denen auf Sprossoberflächen mehrerer Monate

alter Pflanzen entsprachen. Ab Tag 6 stieg die Dichte der Wachskristalle auf den

Hypokotyloberflächen kontinuierlich an, so dass an Tag 25 die gesamte Oberfläche mit

fadenförmigen Wachskristallen überzogen war. Bei 67 Tage alten Pflanzen schließlich

formten die epikutikulären Kristalle ein dreidimensionales Netzwerk auf den Hypokotyl-

oberflächen entsprechend den Oberflächen alter Rizinus-Pflanzen (s. Abb 3-1B). Im

Gegensatz zu Individuen des Glaucous-Phänotyps waren während der frühen Entwicklung

auf den Hypokotylen von Glossy-Individuen keine fadenförmigen Wachskristalle

auszumachen. Ein Querschnitt durch die Hypokotyl-Epidermis eines 18 Tage alten

Individuums ließ erkennen, dass das Netzwerk aus epikutikulären Wachskristallen in dieser

Entwicklungsphase bereits eine Dicke von bis zu 5 µm erreicht hatte (Abb. 3-10).

Abbildung 3-10: Rasterelektro-nenmikroskopische Aufnahme eines Querschnitts durch die Hypokotyl-Epidermis einer 18 Tage alten Ricinus communis-Pflanze. EZ = Epidermiszelle. EWK = Epikutikuläre Wachs-kristalle.

3 µm

EZ

EWK


Abbildung 3-9: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen unterschiedlich alter Hypokotyl-oberflächen von Individuen des Glaucous-Phänotyps von Ricinus communis: 3 Tage (A), 5 Tage (B), 6 Tage (C), 11 Tage (D), 18 Tage (E), 25 Tage (F), 45 Tage (G) und 67 Tage (H) nach Erscheinen an der Oberfläche.

10 µm 10 µm

10 µm 10 µm

10 µm10 µm

10 µm10 µm

C

HG

FE

D

BA


3.2.2 Chemische Charakterisierung der Wachszusammensetzung im Laufe der Hypokotylentwicklung

Um die zeitabhängige Akkumulation von einzelnen Substanzklassen und von

Einzelkomponenten in der Kutikula und damit die Dynamik der chemischen Zusammen-

setzung des kutikulären Wachses im Laufe der frühen Stammentwicklung zu eruieren,

wurden Hypokotyl-Oberflächen von Ricinus communis-Pflanzen beider Phänotypen in

verschiedenen Entwicklungsstadien extrahiert und analytisch untersucht. Auch hier wurden

die praktischen Arbeiten von Frau Barbara Hobl im Rahmen ihrer Diplomarbeit durchgeführt.

Die beiden Sprossachsen-Phänotypen konnten in der Regel am sechsten Tag nach der

Keimung durch die weißliche Oberfläche auf den Hypokotylen der Individuen des Glaucous-

Phänotyps - verursacht durch die Kristallbildung - mit bloßem Auge voneinander unter-

schieden werden. Dies ermöglichte eine getrennte Wachsbeprobung beider Phänotypen 6,

11, 18, 25, 45 und 67 Tage nach der Keimung (n=2 bzw. n=4 für verschiedene

Beprobungszeitpunkte). Für diese Untersuchung wurden nur Hypokotyl-Fragmente verwen-

det, die sich unmittelbar unterhalb des ersten Nodiums befanden, um die Vergleichbarkeit

der Daten im Laufe der Entwicklung zu gewährleisten.

In der Entwicklung der Hypokotyl-Kutikula von Individuen des Glossy-Phänotyps ließen

sich zwei Phasen bezüglich der Gesamtwachsbelegung beobachten. In einem ersten

Zeitabschnitt von Tag 6 bis Tag 18 nahm die absolute Menge des Wachses von 3,4 auf 2,9

µg cm-2 stetig ab, zeigte also eine Nettoabnahme der Wachsbelegung pro Flächeneinheit. In

einem zweiten Zeitintervall, beginnend mit Tag 25, reicherten sich dagegen die absoluten

Wachsmengen stetig an bis auf 11,4 µg cm-2 an Tag 67 (Abb. 3-11A). Zu jedem Zeitpunkt

wurde die Wachszusammensetzung von langkettigen aliphatischen Komponenten dominiert

(von 60 ± 14% des Gesamtwachses an Tag 6 bis zu 96 ± 1% an Tag 67), während Triterpen-

Verbindungen nur mit sehr geringen absoluten Mengen und relativen Anteilen vertreten

waren.

Im ersten Zeitintervall wurden die Wachsmischungen von primären Alkoholen, Alkan-1,3-

diolen und einer weiteren aliphatischen Stoffklasse, den 3-Hydroxyaldehyden, dominiert.

Diese für kutikuläre Wachse ungewöhnliche Substanzklasse wies in den Massenspektren

der einzelnen Verbindungen die Alkoholfragmente m/z 73 und 103 auf. Das Vorhandensein

nur einer Hydroxyl-Funktion ergab sich aus dem Fehlen des für Diole typischen Fragments

m/z 147. Ein prominentes α-Fragment m/z 145 in allen homologen Verbindungen verwies auf

die zusätzliche Carbonyl-Funktion und die 1,3-Stellung der funktionellen Gruppen. Die

Kettenlänge der jeweiligen Substanz ergab sich aus den Fragmenten [M]+, [M-CH3]+ sowie

[M-HOTMSi]+. Innerhalb der Hydroxyaldehyde waren Kettenlängen von C22 bis C28

nachweisbar, ebenso wie bei den 1,3-Alkandiolen.


Abbildung 3-11: Kutikuläre Gesamtwachsbelegung und Wachsbelegung mit VLC-aliphatischen Verbindungen sowie Triterpenen im Laufe der Hypokotylentwicklung von Ricinus communis. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen. A: Glossy-Phänotyp. B: Glaucous-Phänotyp.

Glossy

Alter [Tage]

0 10 20 30 40 50 60

Wac

hsbe

legu

ng [µ

g/cm

2 ]

0

2

4

6

8

10

12

14 GesamtwachsVLC-aliphatische Verbindungennicht identifiziertTriterpene

Glaucous

Alter [Tage]

0 10 20 30 40 50 60

Wac

hsbe

legu

ng [µ

g/cm

2 ]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

GesamtwachsTriterpeneVLC-aliphatische Verbindungennicht identifiziert

A

B


Während Alkandiole und Hydroxyaldehyde lediglich an den ersten beiden Beprobungs-

zeitpunkten in nennenswerten Mengen zu detektieren waren, erreichten die absoluten

Mengen an primären Alkoholen im Laufe der Hypokotylentwicklung ein Maximum an Tag 11

mit 1,2 µg cm-2 (Abb. 3-12A) und blieben im weiteren Verlauf der Entwicklung relativ

konstant. Fettsäuren blieben im ersten Zeitintervall auf niedrigem Niveau bei ca. 0,2 µg cm-2.

Mit Tag 25 konnte ein starker Anstieg dieser Verbindungsklasse bis zu Tag 67 auf 9,8 µg

cm-2 (86 ± 1% des Gesamtwachses) beobachtet werden (Abb. 3-12B). Aldehyde und n-

Alkane trugen nur geringe Anteile zur absoluten Gesamtwachsmenge während der ersten 67

Tage bei (Abb. 3-12C und D).

Ein völlig anderes Bild der kutikulären Wachszusammensetzung in der Hypoko-

tylentwicklung zeichnete sich dagegen bei Individuen des Glaucous-Phänotypes ab. Hier

setzte die Zunahme der Wachsbelegung von 10 µg cm-2 an Tag 6 auf 64 µg cm-2 an Tag 67

auch und gerade in einer frühen Phase der Hypokotylentwicklung ein (Abb. 3-11B). Im

Gegensatz zu Glossy-Individuen wurde die Zusammensetzung des kutikulären Wachses der

Glaucous-Hypokotyle von Beginn an nicht von den klassischen langkettigen aliphatischen

Substanzklassen sondern von Triterpen-Verbindungen dominiert. Der Anteil an VLC-

Komponenten am Gesamtwachs betrug im untersuchten Zeitraum nie mehr als 16%, wobei

ein Minimum des prozentualen Wachsanteils mit 9% bzw. 8% an den Tagen 11 und 18 zu

beobachten war. Im Gegensatz dazu war der Anteil von Triterpen-Verbindungen zwischen

68% und 79% im Beprobungszeitraum durchgängig hoch. Langkettige aliphatische

Wachskomponenten waren bis einschließlich Tag 18 mit 2,6 µg cm-2 nur in verhältnismäßig

geringen Mengen vertreten, im Zeitintervall zwischen Tag 25 und 67 stieg die Menge an

aliphatischen Komponenten jedoch auf ca. 9 µg cm-2 an. Diese zunehmende Akkumulation

wurde vor allem durch den Anstieg an Aldehyden, aber auch an n-Alkanen und Fettsäuren

verursacht (Abb. 3-9), während primäre Alkohole konstante absolute Wachsbelegungen

aufwiesen (ca. 0,6 µg cm-2). Weder Alkan-1,3-diole, noch Hydroxyaldehyde konnten im Laufe

der Hypokotylentwicklung in nennenswerten Mengen aus dem kutikulären Wachs der

Glaucous-Hypokotyle extrahiert werden.

Die Verbindungsklasse der kutikulären Triterpene war über den gesamten untersuchten

Zeitraum der Hypokotylentwicklung durch die Dominanz des Triterpenols Lupeol

charakterisiert (Abb. 3-10). Diese Verbindung verzeichnete einen starken Anstieg von 4,8 ±

1,9 µg cm-2 (47 ± 6% des Gesamtwachses) an Tag 6 über 27,0 ± 5,8 µg cm-2 an Tag 25 (66

± 6%) bis hin zu 42,2 ± 21,1 µg cm-2 (64 ± 12%) an Tag 67. Der dramatische Anstieg der

Wachsbelegung auf Hypokotylen von Individuen des Glaucous-Phänotyps ließ sich demnach

im Wesentlichen auf die Akkumulation des Triterpenols Lupeol zurückführen. Andere

Triterpene wie α-Amyrin, β-Amyrin, Taraxerol und Lupenon trugen nur unwesentlich zur

Gesamtwachsbelegung der Kutikula während der Hypokotylentwicklung bei.


n-Alkane

0 10 20 30 40 50 60 700

2

4

6

8

10

12

Fettsäuren

0 10 20 30 40 50 60 700

2

4

6

8

10

12primäre Alkohole

0 10 20 30 40 50 60 700

2

4

6

8

10

12

Aldehyde

0 10 20 30 40 50 60 700

2

4

6

8

10

12

GlossyGlaucous

Alter [Tage]

Wac

hsbe

legu

ng [µ

g/cm

2 ]

A C

B D

Abbildung 3-12: Kutikuläre Wachsbelegung VLC-aliphatischer Substanzklassen im Laufe der Hypokotylentwicklung beider Sprossachsen-Phänotypen von Ricinus communis. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen. A: Aldehyde. B: Fettsäuren. C: n-Alkane. D: primäreAlkohole.


Abbildung 3-13: Akkumulation des Triterpenols Lupeol als Wachskomponente in der Kutikula im Laufe der Hypokotyl-entwicklung beider Sprossachsenphänotypen von Ricinus communis. Dargestellt sind Mittelwerte und Standard-abweichungen.

In beiden Phänotypen ließ sich ein ähnliches Bild der Kettenlängenverteilung innerhalb

der einzelnen aliphatischen Substanzklassen im Laufe der Hypokotylentwicklung

beobachten. In den einzelnen homologen Reihen waren Verbindungen mit Kettenlängen

zwischen C22 und C34 vertreten. Fettsäuren, Aldehyde und primäre Alkohole wiesen dabei

eine Dominanz geradkettiger Verbindungen auf, während die Klasse der n-Alkane von

Verbindungen mit ungeraden Kettenlängen dominiert wurde. Im Laufe der

Hypokotylentwicklung zeigte sich bei den einzelnen aliphatischen Substanzklassen eine

Tendenz zur Akkumulation hin zu Substanzen mit längeren Kettenlängen ab. So war das

Homologenmuster der Fettsäuren an Tag 6 und 18 durch ein Maximum bei C28

gekennzeichnet, während sich zu späteren Zeitpunkten ein Maximum bei C30 abzeichnete

(Abb. 3-14A). Ein ähnliches Bild ergab sich bei Aldehyden und primären Alkoholen (Daten

nicht gezeigt). Auch n-Alkane zeigten eine Verschiebung von kürzeren zu längeren

Verbindungen, was zu einer graduellen Ausbildung eines Maximums bei C29 an Tag 67

führte (Abb. 3-14B).

Lupeol

Alter [Tage]

0 10 20 30 40 50 60 70

Lupe

olbe

legu

ng [µ

g Lu

peol

/cm

2 ]

0

10

20

30

40

50

60 GlossyGlaucous


Abbildung 3-14: Relative Homologenzusammensetzung [% der jeweiligen Verbindungsklasse] aliphatischer Substanzsklassen im kutikulären Wachs von Glaucous-Individuen der Rizinuspflanze im Laufe der Hypokotylentwicklung. Dargestellt sind Mittelwerte mit Standardabweichungen. A: Fettsäuren. B: n-Alkane.

n-Alkane


24 25 26 27 28 29 30 31 32 33

Rel

ativ

e A

ntei

le [%

]

0

20

40

60

806 Tage11 Tage18 Tage25 Tage45 Tage67 Tage

Fettsäuren


20 22 24 26 28 30 32 34

Rel

ativ

e A

ntei

le [%

]

0

20

40

60

806 Tage11 Tage18 Tage25 Tage45 Tage67 Tage

B

A

3.3 Klonierung von Epoxysqualenzyklasen…

68

3.3 Klonierung von Epoxysqualenzyklasen aus Ricinus communis und Lycopersicon esculentum

3.3.1 Primerdesign zur homologiebasierten Klonierung von Gensequenzen pflanzli-

cher Triterpen- und Cycloartenolsynthasen Für die sequenzhomologiebasierte Klonierung von 2,3-Oxidosqualenzyklasen aus

Ricinus communis bzw. Lycopersicon esculentum war es zunächst erforderlich, ein geeig-

netes Primerdesign zu entwickeln, das die PCR-vermittelte Amplifizierung entsprechender

Gensequenzen aus dem cDNA-Pool der Pflanzen ermöglichte. Für das Auffinden geeigneter

Target-Sequenzen für Oligonukleotidprimer wurden Alignments bereits klonierter und

charakterisierter 2,3-Oxidosqualenzyklasen dikotyler Pflanzen sowohl auf Aminosäure-, als

auch auf Nukleotidsequenzebene durchgeführt (Übersicht der Datenbank-Sequenzen siehe

Anhang B). Bei der Auswahl der Sequenzbereiche für das Primerdesign sollten neben den

in der gesamten Genfamilie hoch konservierten QW-Motiven und dem Substrat-

bindungsmotiv DCTAE besonders potenzielle Sequenzunterschiede zwischen Cycloartenol-

und Triterpensynthasen berücksichtigt werden, um die Spezifität der jeweiligen Primer für

die entsprechenden Synthasen zu erhöhen und eine Diskriminierung „unerwünschter“ PCR-

Amplifizierungen zu gewährleisten.

Insgesamt wurden 29 unterschiedlich degenerierte Sequenzen für Oligonukleotidprimer

auf der Grundlage der über die Alignments ermittelten Konsensus-Sequenzen kreiert (22

Sense- und 7 Antisenseprimer). Als Targetsequenzen dienten dabei sechs verschiedene

Sequenzabschnitte (Abb. 3-15; Einzelheiten siehe Anhang D):

(a) AS 1-7*:

Hierbei handelte es sich um den N-terminalen Bereich der Aminosäuresequenzen,

auf Nukleotidebene beginnend mit dem Start-Codon. Die Sense-Primer OGN3S,

OGN4S, OGN5S, OGN6S waren für die gesamte Genfamilie spezifisch.

(b) AS 157-165:

Dieser Bereich umfasste das QW2-Motiv. Während die Sense-Primer OGT4S,

OGT5S, OGT6S, OGT7S, OGT8S, OGT9S, OGT10S und OGT11S Triterpen-

synthase-spezifisch angelegt waren, berücksichtigten die Sense-Primer OGC5S und

OGC6S Besonderheiten in den Sequenzen von Cycloartenolsynthasen.

(c) AS 399-417:

Dieser Sequenzbereich nimmt eine zentrale Stellung innerhalb des gesamten

Primerdesigns ein. Auf ihn wird im Folgenden gesondert eingegangen.

*Als Referenz diente jeweils die Aminosäuresequenz der Cycloartenolsynthase AtCAS1 aus Arabidopsis thaliana (Corey et al. 1993)


69

A

bbild

ung

3-15

: Übe

rsic

ht ü

ber d

ie P

ositi

on u

nd S

pezi

fität

deg

ener

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r Pr

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ung

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her

2,3-

Oxi

dosq

uale

nzyk

lase

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ie L

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der

hoch

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nd S

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Cod

ons

inne

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b ei

nes

Tran

skrip

ts e

iner

typi

sche

n pf

lanz

liche

n O

xido

squa

lenz

ykla

se

sind

sch

emat

isch

dar

gest

ellt.

Ska

la in

bp.

QW

= Q

W-M

otiv

. SB

= S

ubst

ratb

indu

ngsm

otiv

.


70

(d) AS 648-659: Der Bereich umfasst das hochkonservierte QW4-Motiv, die drei degenerierten Antisense-

Primer OGN1A, OGN2A und OGN3A sind dementsprechend für die gesamte Genfamilie

spezifisch.

(e) AS 716-722:

Dieser Sequenzabschnitt führte zur Ermittlung der degenerierten Sequenz des Antisense-

Primers OGN7A, spezifisch für die gesamte Genfamilie der Oxidosqualenzyklasen.

(f) AS 744-750:

Die Antisense-Primer OGN4A, OGN5A und OGN6A sind für die gesamte Genfamilie

spezifisch.

Ein Sequenzabschnitt erwies sich besonders geeignet als Template für Primersequenzen zur

Klonierung pflanzlicher Oxidosqualenzyklasen, da hier die ansonsten sehr ähnlichen Sequenzen

von Triterpensynthasen und Cycloartenolsynthasen auf drei aufeinander folgenden Positionen

voneinander abwichen. Im Einzelnen handelte es sich dabei um die bei Cycloartenolsynthasen

konservierten Aminosäurereste Glycin (bei Triterpensynthasen Serin), Tyrosin (bei Triterpen-

synthasen Phenylalanin) sowie Asparagin, das bei Triterpensynthasen durch eine Indel-Position

ersetzt war (Abb. 3-16). Daneben fanden sich in unmittelbarer Nachbarschaft die nur in

Lupeolsynthasen konservierte Aminosäure Cystein (bei allen anderen Epoxysqualenzyklasen

Serin), sowie die für β-Amyrinsynthasen spezifische Glutaminsäure.

AtCAS1 WLAEDGMKMQGYNGSQLWD 417 CASBPX1 WIAEDGMKMQGYNGSQLWD 427 CASBPX2 WIAEDGMKMQGYNGSQLWD 417 GglCAS WIAEDGMKMQGYNGSQLWD 417 LcCAS1 WIAEDGMKMQGYNGSQLWD 425 PNX WLAEDGMKMQGYNGSQLWD 417 PsCAS1 WVAEDGMKMQGYNGSQLWD 417

BPY WVAEDGIKMQSF-GSQEWD 419 GgbAS1 WVSEDGMTMQSF-GSQEWD 419 MtbAS WMSEDGMTMQSF-GSQEWD 419 PNY WVAEDGMKMQSF-GSQEWD 420 PNY2 WVAEDGMKMQSF-GSQEWD 418 PSY WISEDGMTMQSF-GSQEWD 419

BPW WVAEDGLKIQSF-GCQMWD 416 GgLUS1 WLAEDGLKIQSF-GCQMWD 416 OEW WVAEDGLKMQSF-GCQMWD 417 TRW WVAEDGMKMQSF-GCQMWD 417

AtLUP1 WVAEDGMKMQSF-GCQLWD 417 AtLUP2 WIGEDGLKIQSF-GSQLWD 422 LJAMY2 WLAEDGMCMQSF-GSQEWD 419 PSM WVSEDGMTLHSF-GSQTWD 419 LcIMS1 WMAEDGMKMQSF-GSQSWD 416

Abbildung 3-16: Aminosäuresequenz-Alignment des Indel-Bereichs. Im Alignment sind die Positionsnummern der jeweils letzten Aminosäure angegeben. Charakteristische Aminosäurereste sind gelb hervorgehoben.

Cycloartenol- synthasen

β-Amyrin- synthasen

Lupeol- synthasen

multifunktionale Triterpensynthasen


71

Da dieses Phänomen folgerichtig im Nukleotidsequenz-Alignment dieses Bereiches seinen

Niederschlag fand, war es möglich, spezifische Sense-Primer sowohl für Cycloartenolsynthasen

(OGC1S), wie auch für Triterpensynthasen (OGT1S, OGT2S, OGT3S) - hier war zusätzlich eine

Unterscheidung zwischen Lupeol- (OGL1S) und β-Amyrinsynthase-Sequenzen (OGA1S) möglich

- zu kreieren (Abb. 3-17). Zusätzlich diente der unmittelbar in 5’-Richtung gelegene Bereich als

Target für zwei Oxidosqualenzyklase-spezifische Sense-Primer OGN1S und OGN2S).

AtCAS1 tggttagctgaagatggaatgaagatgcagggttataacggaagccagctatgggat 1259 CASBPX1 tggattgccgaagatggcatgaaaatgcagggatataatggaagtcaattatgggat 1216 CASBPX2 tggattgctgaagatggaatgaaaatgcagggttataatggaagtcaattatgggat 1259 GglCAS tggattgctgaagatggcatgaaaatgcagggctacaatggaagtcaactatgggat 1259 LcCAS1 tggattgctgaagatggcatgaaaatgcagggttataatggaagtcaattatgggat 1283 PNX tggcttgctgaggatggtatgaaaatgcaggggtataatggaagtcaattgtgggac 1259 PsCAS1 tgggttgctgaagatggcatgaaaatgcagggctacaatggaagtcaactatgggat 1259

BPY tgggttgctgaagatggaatcaagatgcagagtttt---ggaagtcaagagtgggat 1265 GgbAS1 tgggtttcggaagatggaatgaccatgcagagtttt---ggtagccaagaatgggat 1265 MtbAS tggatgtcagaagatggaatgaccatgcagagtttt---ggtagccaagaatgggat 1265 PNY tgggttgctgaagatggaatgaagatgcagagtttt---ggtagtcaggaatgggat 1268 PNY2 tgggttgctgaagatggaatgaaaatgcagagtttt---ggcagtcaagagtgggat 1262 PSY tggatttctgaagatggaatgaccatgcagagtttc---ggtagtcaagagtgggat 1265

BPW tgggtttcagaagatggattaaaaattcagagtttc---ggctgtcagatgtgggat 1256 GgLUS1 tggatggccgaagatgggttgaaaatccagagcttt---gggtgccagatgtgggat 1256 OEW tggattggcgaggatggcctgaaaatgcagagtttt---gggtgtcaaatgtgggat 1259 TRW tggcttgcagaagatggaatgaaaatgcagagtttt---ggatgtcaaatgtgggat 1265

AtLUP1 tgggtcgctgaagatggaatgaaaatgcagagcttt---ggatgtcaactgtgggat 1259 AtLUP2 tgggtcgccgaagatggcctcaaaattcagtctttt---ggcagccaattgtgggat 1280 LJAMY2 tgggttgctgaggatgggatgtgcatgcagagtttt---ggtagccaagaatgggat 1265 PSM tgggttgctgaagatggcatgaccttgcatagtttt---ggtagccaaacatgggat 1265 LcIMS1 tggctcgctgaagatggcatgaaaatgcaaagtttt---ggtagccagtcatgggat 1256 ********* *** *** Primerdesign: OGN1S TGGRTYKSNGARGATGGVHTVA OGN2S TGGGTYKCNGARGATGGVHTVA OGT1S CAKWSYTTY GGNWGYCARNHR OGT2S CAGAGTTTY GGNWGYCARNHR OGT3S TTY GGNWGYCARNHRTGGGAT OGL1S TTT GGVTGYCARHTGTGGGAT OGA1S TTY GGHAGYCAAGARTGGGAT OGC1S TAYAATGGMAGYCARYTVTGG

Abbildung 3-17: Nukleotidsequenz-Alignment des Indel-Bereichs und das daraus resultierende Primerdesign zur Klonierung von Lupeol-, β-Amyrin- bzw. Cycloartenolsynthasen. Im Alignment sind die Positionsnummern des jeweils letzten Nukleotids angegeben. Die Sternchen markieren für die jeweiligen Synthasen charakteristische Nekleotide.


72

3.3.2 Klonierung der Ricinus communis Lupeolsynthase RcLUS1

Für die Klonierung der Ricinus communis-Lupeolsynthase musste zunächst geeignetes

Pflanzenmaterial für eine RNA-Extraktion ausgewählt werden, bei der eine entsprechend hohe

Expressionsaktivität und damit eine große Transkript-Menge der Triterpensynthase zu erwarten

war. Auf der Grundlage der wachsanalytischen und rasterelektronenmikroskopischen Unter-

suchungen wurden hierfür Hypokotyle 20 Tage alter Rizinuspflanzen verwendet. Auf der

Grundlage isolierter Gesamt-RNA aus Hypokotyloberflächengewebe und mittels reverser Trans-

kriptase wurde ein cDNA-Pool synthetisiert, der schließlich als Template für PCR-Experimente

diente.

In diesen PCR-Versuchen wurden verschiedene Kombinationen unterschiedlich dege-

nerierter, Triterpensynthase-spezifischer Primer getestet. Die Kombination des Sense-Primers

OGT3S (s. Abb. 3-17) und des für das QW4-Motiv spezifischen Antisense-Primers OGN1A (s.

Abb. C-3) resultierte in der Amplifikation des PCR-Fragmentes RcLUS1a mit der erwarteten

Länge von etwa 750 bp. Dieses Fragment wurde gelelektrophoretisch aufgereinigt und in E. coli

kloniert. Durch die Sequenzierung sechs verschiedener Klone dieses Ansatzes konnte schließlich

die Konsensussequenz von RcLUS1a ermittelt werden (Abb. 3-18). Das Fragment wies das für

die Genfamilie typische Substratbindungsmotiv sowie die Sequenz eines QW-Motifs auf.

1 acaagtctag ctcttcaggc cctgatagct agcgacctct ctcatgaaat aggacctaca 60 61 ctaaaacaag gacacgtctt cacgaagaat tctcaggcaa ctgagaaccc ttcgggcgac 120 121 ttcagaaaaa tgtttcgtca tatctccaaa ggagcttgga cattctctga taaagatcaa 180 181 ggatggcaag tttctgattg tacagcagaa agcttgaagt gctgcctact tttctcaatg 240 241 atgcctcccg aaattgttgg tgagaaaatg gaacctgaaa aggtctatga ttcagtcaat 300 301 gtcatacttt ctcttcagag ccaaaatggt ggtttcacag cttgggagcc agcaagagca 360 361 ggatcatgga tggagtggct caaccctgta gagttcatgg aggatcttgt cgttgagcac 420 421 gagtatgtgg agtgcacttc atcagcaatc caagcactag ttctttttaa aaaattatat 480 481 ccccgacaca ggaacaaaga gattgaaaat tgtatcataa atgctgcgca gttcattgaa 540 541 aatatacaag aacctgatgg ttcatggtat ggaaattggg ggatatgctt ctcttatggt 600 601 acctggtttg cactgaaagg attagctgct gctggaagga catatgaaaa ttgttctgct 660 661 attcgtaaag gtgttgattt tctactaaaa tcacaaagag atg 703 Abbildung 3-18: Konsensussequenz des klonierten Genfragments RcLUS1a. Die Sequenzbereiche, die dem DCTAE-Substratbindungsmotiv (grün) sowie dem QW3-Motiv (rot) entsprechen, sind farblich hervorgehoben.

Ein Sequenzvergleich der Nukleotidsequenz mittels BLAST-Search in der NCBI-Datenbank

ergab eine große Übereinstimmung mit pflanzlichen Triterpensynthasen, vor allem mit β-

Amyrinsynthasen, während zu Cycloartenolsynthasen nur relativ geringe Sequenz-Ähnlichkeiten

festzustellen waren (Tab. 3-5).

Mit Hilfe einer Kombination aus einem spezifischen Antisense-Primer (OGLS4A), der 60 bp

vor dem 5’-Ende des klonierten Fragments lag, und dem degenerierten, für das QW2-Motiv

spezifischen Sense-Primer OGT4S (s. Abb. C-2), wurde ein weiteres PCR-Produkt, RcLUS1b, mit

einer Länge von 825 Basenpaaren synthetisiert. Dieses Produkt wurde ebenfalls kloniert und


73

sequenziert. Das 3’-Ende von RcLUS1b zeigte im Überlappungsbereich eine identische Sequenz

mit RcLUS1a. Auf diese Weise konnte die klonierte Sequenz in 5’-Richtung um 750 Nukleotide

verlängert werden.

Tabelle 3-5: Ergebnisse des Datenbankvergleichs des klonierten Genfragmentes RcLUS1a von R. communis auf Nukleotid-Ebene. Die Ergebnisse wurden mit Hilfe des Programms Blast Search (blastn) des National Center for Biotechnology Information (NCBI) ermittelt.

Akzessions-Nummer Pflanzenart Gen-

Produkt Score* (bits)

E Value*

AB055512 Betula platyphylla bAS 151 3*e-33 AB037203 Glycyrrhiza glabra bAS 147 5*e-32 AB034803 Pisum sativum MFS 131 3*e-27 AB009030 Panax ginseng bAS 113 7*e-22 AJ430607 Medicago truncatula bAS 105 2*e-19 AB014057 Panax ginseng bAS 101 3*e-18 AB034802 Pisum sativum bAS 99,6 1*e-17 AF478455 Lotus japonicus MFS 93,7 6*e-16 U49919 Arabidopsis thaliana MFS 69,9 9*e-09

AB055511 Betula platyphylla LUS 58 4*e-05 AB055510 Betula platyphylla CAS 48,1 0.034

* In dieser Aufstellung steht 'Score' für einen Gütefaktor des Einzelergebnisses (höherer Wert steht für bessere Übereinstimmung). Der 'E value' gibt die Wahrscheinlichkeit an, mit der eine Übereinstimmung der gefundenen Art rein zufällig auftreten würde (niedrigerer Wert steht für höhere Signifikanz).

In einem nächsten Schritt wurde die Nukleotidsequenz des 3’-Endes des Gens bis zum Poly-

A-Schwanz mit Hilfe der RACE-Technik ermittelt. Für die 3’-RACE (nach 3’RACE-Kit, Invitrogen)

wurden der spezifische Sense-Primer OGLS4S, synthetisiert auf der Grundlage des bereits

klonierten Sequenzbereiches, und der Ankerprimer AUAP verwendet. Dieser Ansatz führte zur

Amplifizierung des 560 bp langen Fragmentes RcLUS1c, das neben dem Stop-Codon noch etwa

80 bp des nicht kodierenden Bereiches am 3’-Ende des Gens beinhaltete. Durch die Verwendung

eines 5`RACE-Systems (Invitrogen) konnte schließlich der noch fehlende Bereich des

Transkriptes am 5’-Ende ermittelt werden. Bei der 5’-RACE kamen der Ankerprimer UAP sowie

die spezifischen Antisense-Primer OGLS13A und OGLS14A zum Einsatz. Dieser Ansatz führte

zur Amplifikation des Fragementes RcLUS1d mit einer Länge von 670 bp. Die Sequenzierung von

RcLUS1d zeigte die erwartete Überlappungsregion mit RcLUS1b, ein potentielles Start-Codon

und 27 Basenpaare des nicht kodierenden Bereiches am 5’-Ende.

PCR-Versuche mit verschiedenen Kombinationen spezifischer Primer (Tab. 3-6) für die

klonierte Gesamtsequenz dienten als Kontrolle für die gewonnenen Ergebnisse. Dabei wurden

stets die zu erwartenden Fragmentlängen synthetisiert (Abb. 3-19). Die zusammengesetzte

Nukleotidsequenz der klonierten Fragmente ergab eine Konsensussequenz von 2426 Nukleotiden

(s. Abb. E-1) und zeigte bei Alignments mit bekannten Oxidosqualenzyklasen den für

Triterpensynthasen typischen Indel-Bereich (vgl. Abb. 3-17).


74

Tabelle 3-6: Kombinationen spezifischer Primer, die für PCR-Ansätze zur Kontrolle der klonierten Gensequenz verwendet wurden. Die Positionen der Primer ergeben sich aus der Entfernung der jeweiligen Primeranfänge vom Startcodon.

Sense-Primer Antisense-Primer Name Position Name Position

erwartete Fragmentlänge

OGLS1S 1254 OGLS7A 1483 229 bp OGLS1S 1254 OGLS1A 1964 710 bp OGLS2S 1256 AUAP 2420 1145 bp OGLS2S 1256 OGLS1A 1964 708 bp OGLS3S 1943 AUAP 2420 477 bp OGLS4S 1839 AUAP 2420 581 bp OGLS9S 501 OGLS3A 1274 773 bp OGLS9S 501 OGLS4A 1301 800 bp

Um den RcLUS1-Full-Length-Klon amplifizieren zu können, wurden Oligonukleotidprimer

synthetisiert, die neben der spezifischen Sequenz Restriktionsschnittstellen unmittelbar vor dem

ATG-Start-Codon (RCTS1C1S) bzw. hinter dem Stop-Codon (RCTS1C1A) aufwiesen. Ein PCR-

Ansatz mit Ricinus communis-Hypokotyl-cDNA als Template führte zur Amplifikation von RcLUS1

mit der erwarteten Länge von 2,31 kb. Abbildung 3-20 gibt eine Übersicht über die

Klonierungsstrategie von RcLUS1. Die Klonierung und Sequenzierung von RcLUS1 zeigte, dass

es sich dabei erwartungsgemäß um ein offenes Leseraster handelte, das für ein 770 Aminosäure-

langes Protein kodierte. Die übersetzte Aminosäuresequenz (Abb. 3-21) beinhaltete neben dem

Substratbindungsmotiv vier QW-Motive und wies höhere Ähnlichkeiten zu anderen pflanzlichen

Triterpensynthasen als zu Cycloartenolsynthasen auf (Tab. 3-7).

DNA- Leiter

Abbildung 3-19: PCR-Fragmente unterschiedlicher Sequenzbereiche der RcLUS1-cDNAs, die mit Hilfe verschiedener Kombinationen spezifischer PCR-Primer mit Hypokotyl-cDNA als Template synthetisiert wurden. Primerkombination: OGLS1S-OGLS7A; OGLS1S-OGLS1A; OGLS2S-AUAP; OGLS2S -OGLS1A; OGLS3S-AUAP; OGLS4S-AUAP; OGLS9S-OGLS3A; OGLS9S-OGLS4A. DNA-Leiter: Fermentas GeneRuler 100 bp.

DNA- Leiter


75

Abbildung 3-20: Schematische Darstellung der Strategie zur homologiebasierten Klonierung von RcLUS1. Im oberen Bereich sind die Positionen des Start- bzw Stop-Codons sowie der in der Genfamilie der Oxidosqualenzyklasen konservierten Sequenzmotive QW und DCTAE angegeben. Die Pfeile geben die relative Position sowie die Richtung der verwendeten Primer wieder. Die Linien repräsentieren die jeweiligen, über PCR-Ansätze amplifizierten cDNA-Fragmente.

MWRIKIAEGGNNPYIYSTNNFQGRQIWVFDPNAGTPEEQAEVEEARQNFW 50 KNRFQVKPNSDLLWQLQFLREKNFKQKIPKVKVEDGEEITSEIAAAALRR 100 SVHLFSALQASDGHWCAENGGLLFFLPPLVFAVYITGHLNTVFSPEHRKE 150 ILRYIYCHQNEDGGWGIHIEGHSTMFCTVLNYICMRILGEARDGGIENAC 200 ERGRKWILDHGGATGISSWGKTWLSILGVYEWDGTNPMPPEFWAFPSSFP 250 LHPAKMFCYCRITYMPMSYLYGKRFVGPITPLILQIREEIYNEPYNKIKW 300 NSVRHLCAKEDNYFPHPTIQKLLWDALYTFSEPLFSRWPFNKLREKALKI 350 TMDHIHYEDHNSRYITIGCVEKPLCMLACWIEDPHGEAFKKHLARIADYI 400 WVGEDGIKMQSFGSQTWDTSLALQALIASDLSHEIGPTLKQGHVFTKNSQ 450 ATENPSGDFRKMFRHISKGAWTFSDKDQGWQVSDCTAESLKCCLLFSMMP 500 PEIVGEKMEPEKVYDSVNVILSLQSQNGGFTAWEPARAGSWMEWLNPVEF 550 MEDLVVEHEYVECTSSAIQALVLFKKLYPRHRNKEIENCIINAAQFIENI 600 QEPDGSWYGNWGICFSYGTWFALKGLAAAGRTYENCSAIRKGVDFLLKSQ 650 RDDGGWAESYLSCPKKVYVPFEGNRSNLVQTAWAMMGLIYGGQAKRDPMP 700 LHRAAKLLINSQTDLGDFPQQELTGAFMRNCMLHYALFRNTFPIWALAEY 750 RRHVLFPSAGFGFGFTNNL* 770 Abbildung 3-21: Aminosäuresequenz der Ricinus communis Lupeolsynthase RcLUS1. Das Substratbindungsmotiv DCTAE (grün) sowie die QW-Motive (rot) sind farblich hervorgehoben.

Start QW1 QW2 QW3 QW4 StopSB

OGLS4A OGT4S

RcLUS1b (800 bp)

OGN1A OGT3S

RcLUS1a (700 bp)

UAP OGLS14a OGLS4S AUAP

RcLUS1c (560 bp) RcLUS1d (670 bp)

RcLUS1 (2,31 kb)

RCTS1C1S RCTS1C1A


76

Tabelle 3-7: Ergebnisse des Datenbankvergleichs der Ricinus communis Lupeolsynthase RcLUS1 auf Aminosäuresequenz-Ebene. Die Ergebnisse wurden mit Hilfe des Programms Blast Search (blastp) des National Center for Biotechnology Information (NCBI) ermittelt.

Akzessions-nummer Pflanzenart Gen-

Produkt Score (bits)

E Value

BAB83088 Betula platyphylla bAS 1259 0 BAA33461 Panax ginseng bAS 1237 0 BAA33722 Panax ginseng bAS 1227 0 BAA89815 Glycyrrhiza glabra bAS 1205 0 AAO33578 Medicago truncatula bAS 1197 0 BAA97558 Pisum sativum bAS 1187 0 AAO33580 Lotus japonicus MFS 1180 0 BAA97559 Pisum sativum MFS 1154 0 BAB68529 Luffa cylindrica IMS 1082 0 AAD05032 Arabidopsis thaliana MFS 1053 0 AAB94341 Arabidopsis thaliana OSC 1052 0 BAA86930 Olea europaea LUS 1030 0 BAB83087 Betula platyphylla LUS 1012 0 BAA86932 Taraxacum officinalis LUS 1004 0

JC5590 Pisum sativum CAS 942 0

3.3.3 Klonierung eines Genfragmentes einer weiteren potenziellen Triterpensynthase von

Ricinus communis

Die Sequenzierung verschiedener PCR-Produkt-Klone, die mit der Kombination des Sense-

Primers OGT3S und des Antisense-Primers OGN1A unter Verwendung der Hypokotyl-cDNA als

Template im oben beschriebenen PCR-Ansatz gewonnen worden waren, zeigte, dass diese

Primerkombination nicht nur zur Amplifikation von RcLUS1a, sondern auch zur Synthese eines

Fragmentes mit ähnlicher, aber dennoch eindeutig davon abweichender Sequenz von gleicher

Nukleotidlänge führte (Abb. 3-22). Auch diese zweite mit unspezifischen Primern klonierte

Nukleotidsequenz RcTTS2a zeigte bei einem Sequenzvergleich mittels BLAST-Search in der

NCBI-Datenbank große Homologien zu anderen pflanzlichen Triterpensynthasen (Tab. 3-8).

Versuche, den Full-length-Klon dieser zweiten potenziellen Triterpensynthase RcTTS2 analog zur

Klonierung von RcLUS1 zu gewinnen, scheiterten: Weder bei PCR-Ansätzen zur Verlängerung

von RcTTS2a in 5’-Richtung, noch bei 3’RACE-Versuchen konnten entsprechende Fragmente in

ausreichenden Mengen für eine Klonierung amplifiziert werden. Der Grund hierfür lag vermutlich

im mangelnden Transkript-Level von RcTTS2 im verwendeten cDNA-Pool von Ricinus communis

Hypokotyl-Gewebe.


77

1 gctaatttca cctttcaagc tttatatctc agcaatctgg gcgacgaaat catgccagca 60 61 ctggccaaag catatgattt catcaagcaa actcggatga aggacaatcc tgcaggcgac 120 121 tttagaacaa tgtttcgcca tatttcaaaa gggggatggc ctttctctga tcaagatcat 180 181 ggctggcaag tttctgattg cacagcagaa ggcttgaagt gtcttctata tgccacgcag 240 241 ttgcctacag aaaagatcgg cgagaaagca gagcctgaac gtttgtatga tgctgtcaat 300 301 gtcatacttt ccctacaggg taaaaacggt ggtttatcag cctgggagcc ggtgcgaggt 360 361 tcaatgtggt tagaaaaact gaatcccatg gagtttttgg agaacatcgt gattgaacat 420 421 caatacgtgg aatgcacatc atctggaata gaaacattag caatgtttaa aaagatgtac 480 481 ccgggccaca gaagcaaaga aatagacaac ttcattaaga atggtgccgg atatattgaa 540 541 gaaattcagg aagaggacgg ttcttggtac ggaaactggg ggatttgctt catttacggg 600 601 acatggtttg cgcttgttgg actttcagct gctggaagaa gttacagtga atgtccggct 660 661 gtgcggaagg gggttgattt tctacttaag aatcagtgcg atg 703

Abbildung 3-22: Sequenz des klonierten Genfragments RcTTS2a. Die Sequenzbereiche, die dem DCTAE-Substratbindungsmotiv (grün) sowie dem QW3-Motiv (rot) entsprechen, sind farblich hervorgehoben.

Tabelle 3-8: Ergebnisse des Datenbankvergleichs des klonierten Genfragmentes RcTTS2a von R. communis auf Nukleotid-Ebene. Die Ergebnisse wurden mit Hilfe des Programms Blast Search (blastn) des National Center for Biotechnology Information (NCBI) ermittelt.

Akzessions-nummer Pflanzenart Gen-


E Value

AB037203 Glycyrrhiza glabra bAS 95,6 2*e-16 AB055512 Betula platyphylla bAS 95,6 2*e-16 AF478455 Lotus japonicus MFS 87,7 4*e-14 AB034803 Pisum sativum MFS 81,8 2*e-12 AJ430607 Medicago truncatula bAS 71,9 2*e-09 AB034802 Pisum sativum bAS 71,9 2*e-09 AB009030 Panax ginseng bAS 63,9 6*e-07 AB014057 Panax ginseng bAS 60 9*e-06

U49919 Arabidopsis thaliana MFS 58,0 4*e-05 AB025345 Taraxacum officinale LUS 48,1 0,034 AB058643 Luffa cylindrica IMF 48,1 0,034


78

3.3.4 Klonierung der Ricinus communis Cycloartenolsynthase RcCAS1 Für die Klonierung der Ricinus communis Cycloartenolsynthase RcCAS1 wurde die gleiche

Klonierungsstrategie verfolgt wie bei der Klonierung von RcLUS1 (Abb. 3-23). In einem ersten

PCR-Ansatz wurde der degenerierte, für Cycloartenolsynthasen spezifische Oligonukleotidprimer

OGC1S (vgl. Abb. 3-17) mit dem Antisenseprimer OGN3A kombiniert. Als Template diente dabei

erneut cDNA, die aus Gesamt-RNA 20 Tage alter Rizinus-Hypokotylen synthetisiert worden war.

Das über diesen Ansatz amplifizierte cDNA-Fragment RcCAS1a hatte eine Länge von 700 bp,

wurde aufgereinigt, kloniert und sequenziert. RcCAS1a zeigte in einem Datenbankvergleich hohe

Sequenzähnlichkeiten mit anderen Cycloartenolsynthasen. Für die Verlängerung des bekannten

Sequenzbereiches in 5’-Richtung wurde der degenerierte Sense-Primer OGC5S mit dem

spezifischen Antisenseprimer OGCS3A in einem nächsten PCR-Ansatz eingesetzt. Auf diese

Weise konnte das cDNA-Fragment RcCAS1b mit einer Länge von 800 bp gewonnen werden. Um

das gesamte offene Leseraster der Cycloartenolsynthase abdecken zu können, wurden mit Hilfe

der RACE-Technik die cDNA-Fragmente RcCAS1c und RcCAS1d synthetisiert (Abb. 3-23).

Die zusammengesetzte Nukleotid-Sequenz der klonierten Fragmente ergab eine Konsensus-

sequenz von 2529 Nukleotiden (s. Abb. E-2). Für die Amplifizierung des RcCAS1-Full-Length-

Klons mit einer Länge von 2,28 kb dienten Oligonukleotidprimer, die Restriktionsschnittstellen

unmittelbar vor dem ATG-Start-Codon (RCCS1C2S) bzw. hinter dem Stop-Codon (RCCS1C1A)

aufwiesen. Die Sequenzierung von RcCAS1 zeigte, dass es sich dabei um ein offenes Leseraster

handelte, das für ein Protein mit 760 Aminosäuren kodierte (Abb. 3-24). Der Sequenzvergleich

zeigte die großen Ähnlichkeiten von RcCAS1 zu anderen pflanzlichen Triterpensynthasen (Tab.

3-9).

Abbildung 3-23: Schematische Darstellung der Strategie zur homologiebasierten Klonierung von RcCAS1 (analog zu Abbildung 3-20).


OGCS3A OGC5S

RcCAS1b (800 bp)

OGN3A OGC1S

RcCAS1a (700 bp)

UAP OGCS8A OGCS3S AUAP

RcCAS1c (500 bp) RcCAS1d (650 bp)

RcCAS1 (2,28 kb)

RCCS1C2S RCCS1C1A


79

MWKLRIAEGSGNPWLRTTNDHIGRQVWEFDSSKIGSPEELSQIENARQNF 50 TKNRFIHKHSSDLLMRIQFSKENPICEVLPQVKVKESEQVTEEKVKITLR 100 RALNYYSSIQADDGHWPGDYGGPMFLMPGLIIALSITGALNAILSEEHKR 150 EMCRYLYNHQNRDGGWGLHIEGPSTMFGSVLCYVSLRLLGEGPNEGEGAV 200 ERGRNWILKHGGATAITSWGKMWLSVLGAYEWSGNNPLPPEMWLLPYILP 250 VHPGRMWCHCRMVYLPMSYLYGKRFVGPITPTVLSLRKELYTVPYHEIDW 300 NQARNQCAKEDLYYPHPMLQDVLWATLHKFVEPILMHWPGKRLREKAIQT 350 AIEHIHYEDENTRYICIGPVNKVLNMLCCWVEDPNSEAFKLHLPRLYDYL 400 WLAEDGMKMQGYNGSQLWDTAFAVQAIVSTNLIEEYGPTLKKAHSFIKKM 450 QVLENCPGDLNFWYRHISKGAWPFSTADHGWPISDCTAEGIKALMLLSKI 500 PSEIVGEGLNANRLYDAVNVVLSLQNGDGGFPTYELSRSYSWLEFINPAE 550 TFGDIVIDYPYVECTSAAIQALTSFRKSYPEHQREEIECCIKKAAKFMEK 600 IQISDGSWYGSWGVCFTYGTWFGIKGLVAAGKSFGNCSSIRKACDFLLSK 650 QCPSGGWGESYLSCQKKVYSNLEGDRSHVVNTAWAMLSLIDAGQAERDPT 700 PLHRAARYLINAQMENGDFPQQEIMGVFNRNCMITYAAYRDIFPIWALGE 750 YRCRVLKAS* 760 Abbildung 3-24: Aminosäuresequenz der Ricinus communis Cycloartenolsynthase RcCAS1. Das Substratbindungsmotiv DCTAE (grün) sowie die QW-Motive (rot) sind farblich hervorgehoben.

Tabelle 3-9: Ergebnisse des Datenbankvergleichs der Ricinus communis Cycloartenolsynthase RcCAS1 auf Aminosäuresequenz-Ebene. Die Ergebnisse wurden mit Hilfe des Programms Blast Search (blastp) des National Center for Biotechnology Information (NCBI) ermittelt.

Akzessions- nummer Pflanzenart Gen-


E Value

BAA76902 Glycyrrhiza glabra CAS 1380 0 BAB83086 Betula platyphylla CAS 1360 0

JC5590 Pisum sativum CAS 1353 0 BAA33460 Panax ginseng CAS 1339 0

A49398 Arabidopsis thaliana CAS 1330 0 BAB83085 Betula platyphylla CAS 1285 0 BAB83253 Costus speciosus CAS 1276 0 BAA85266 Luffa cylindrica CAS 1270 0 AAT38891 Avena strigosa CAS 1248 0 AAF03375 Oryza sativa CAS 1233 0 AAG44096 Abies magnifica CAS 1218 0 BAB83254 Costus speciosus MFS 1140 0 BAA86931 Olea europaea CAS 1072 0 BAA86930 Olea europaea LUS 1045 0


80

3.3.5 Klonierung genomischer Sequenzen von RcLUS1 und RcCAS1 3.3.5.1 Genomische Sequenz der Lupeolsynthase RcLUS1

Um die genomische Sequenz der klonierten Lupeolsynthase von Ricinus communis zu

erhalten, wurden PCR-Versuche mit isolierter DNA aus Rizinus-Blattmaterial als Template

durchgeführt. Dabei deckten fünf verschiedene Ansätze mit Kombinationen spezifischer

Oligonukleotidprimer den gesamten Sequenzbereich ab (Abb. 3-25). Die amplifizierten PCR-

Fragmente wurden anschließend kloniert und sequenziert.

Abbildung 3-25: Strategie zur Klonierung der genomischen Sequenz von RcLUS1. Der obere Balken repräsentiert das RcLUS1-Transkript, wobei der dicke Balken den codierenden Bereich widerspiegelt. Die Pfeile geben die relative Position sowie die Richtung der verwendeten spezifischen Primer wieder. Die gestrichelten Linien repräsentieren die jeweiligen, über PCR-Ansätze amplifizierten Fragmente. Insgesamt wies die genomische Sequenz der Ricinus communis Lupeolsynthase eine Länge

von 4189 Basenpaaren auf (s. Abb. E-5). Durch den Abgleich der genomischen Sequenz mit den

vorhandenen Sequenzdaten des RcLUS1-Transkripts konnte schließlich das Exon-Intron-Muster

gemäß der GTX XAG-Regel (Hanley und Schuler 1988) konstruiert werden. Diese Analyse ergab,

dass 14 Introns die 15 Exonbereiche voneinander trennen (Abb. 3-26). Die Länge der Exon-

Bereiche variierte dabei zwischen 47 bp (Exon 10) und 675 bp (Exon 1), die Intron-Bereiche

hatten Längen zwischen 93 bp (Intron 14) und 325 bp (Intron 9).

Abbildung 3-26: Exon-Intron-Muster der genomischen Sequenz von RcLUS1. Die dicken Balken geben die Länge und Position der einzelnen Exon-Bereiche an, die Linien repräsentieren Intron-Bereiche. Die Zahlen unter den Balken geben die Längen der Exon-Bereiche in bp an.

OGLS12S

OGLS9S

OGLS1S

OGLS15S

OGLS4S OGLS14A

OGLS3A

OGLS17A

OGLS1A

OGLS18A

675 85 167 189 114 120 124 99 57 47 144 178 81 84 147


81

3.3.5.2 Genomische Sequenz der Cycloartenolsynthase RcCAS1

Um die genomische Sequenz der Ricinus communis Cycloartenolsynthase RcCAS1 in

Erfahrung zu bringen, wurden auch hier Kombinationen spezifischer Oligonukleotidprimer in PCR-

Ansätzen mit genomischer DNA als Template eingesetzt. Trotz verschiedener Ansätze mit

mehreren Primerkombinationen im Bereich um Basenpaar 6500 führten die entsprechenden

PCR-Ansätze hier zu keiner Fragment-Amplifikation, so dass keine vollständige genomische

RcCAS1-Sequenz rekonstruiert werden konnte. Die Sequenzanalyse der amplifizierten

Fragmente ergab jedoch, dass die genomische Sequenz eine Länge von mindestens 8,67 kb

aufweist (s. Abb. E-6) und die Anzahl der Exon-Bereiche bei 18 liegen dürfte. Die Länge der

Exons variiert zwischen 46 Basenpaaren (Exon 13) und 204 Basenpaaren (Exon 1). Anders als

bei RcLUS1 schwankt die Länge der einzelnen Intron-Bereiche ganz erheblich zwischen 58

Basenpaaren (Intron 10) und 1341 Basenpaaren (Intron 11).

Abbildung 3-27: Exon-Intron-Muster der genomischen Sequenz von RcCAS1. Die dicken Balken geben die Länge und Position der einzelnen Exon-Bereiche an, die Linien repräsentieren Intron-Bereiche. Die Zahlen unter den Balken geben die Längen der Exon-Bereiche in bp an. Der Pfeil markiert den Bereich, der in mehreren PCR-Ansätzen zu keiner Fragment-Amplifikation führte. 3.3.6 Klonierung zweier Triterpensynthase-cDNAs aus Lycopersicon esculentum 3.3.6.1 Lycopersicon esculentum β-Amyrinsynthase LeTTS1

Für die Klonierung einer Triterpensynthase aus Lycopersicon esculentum wurde zunächst

nach Sequenzen in Datenbanken gesucht, die aufgrund ihrer Ähnlichkeiten zu anderen

Triterpensynthase-Sequenzen als Fragmente potentieller Triterpensynthasen angesprochen

werden und damit als Grundlage für Klonierungsarbeiten dienen konnten. In der TIGR-Datenbank

des Institute for Genomic Research (The TIGR Tomato Gene Index (LeGI)) fand sich dabei der

EST-Klon TC160438, annotiert als Fragment einer β-Amyrinsynthase. Dieser EST-Klon wurde am

Clamson University Genomics Institute bestellt und von der Arbeitsgruppe Vogg, Universität

Würzburg, über seine vollständige Länge von 768 Basenpaaren sequenziert.

Für die PCR-basierte Klonierung der vollständigen L. esculentum Triterpensynthase diente

cDNA als Template, die aus Gesamt-RNA - isoliert aus Tomatenfrüchten - synthetisiert worden

war. Mit Hilfe des für die TC160438-Sequenz spezifischen Rückwärtsprimers AMYT und dem

degenerierten, für β-Amyrinsynthasen spezifischen Antisense-Primer OGA1S (s. Abb. 3-17)

85 204 186 90 195 167 189 114 123 123 99 57 47 144 84 114Σ: 259


82

wurde das PCR-Produkt LeTTS1a mit einer Länge von 1 kb synthetisiert (Abb. 3-28) und

anschließend sequenziert, so dass der bekannte Sequenzbereich des Transkripts um ca. 300 bp

in 5’-Richtung verlängert werden konnte. Eine zusätzliche Erweiterung erbrachte die

Sequenzierung des PCR-Produktes LeTTS1b, das mit Hilfe eines weiteren PCR-Ansatzes

amplifiziert wurde, bei dem der spezifische Rückwärtsprimer OGAS1A mit dem degenerierten

Antisense-Primer OGT4S kombiniert worden war. Eine 5’-RACE erbrachte die Amplifikation des

Fragmentes LeTTS1c und damit die noch fehlende Sequenzinformation am 5’-Ende des

Triterpensynthase-Transkripts.


sequenz von 2535 Nukleotiden (s. Abb. E-3). Für die Amplifizierung des Full-Length-Klons

LeTTS1 mit einer Länge von 2,29 kb dienten die Oligonukleotidprimer LETS1C4S bzw.

LETS1C5A. Der Full-Length-Klon wurde anschließend kloniert und sequenziert. Die Übersetzung

der Nukleotidsequenz ergab eine durchgehende Aminosäuresequenz von 762 Aminosäuren

(Abb. 3-29). Ein Sequenzvergleich offenbarte die großen Ähnlichkeiten von LeTTS1 zu anderen

pflanzlichen Triterpen-, vornehmlich β-Amyrinsynthasen (Tab. 3-10).

Abbildung 3-28: Schematische Darstellung der Strategie zur Klonierung von LeTTS1. Im oberen Bereich sind die Positionen des Start- bzw Stop-Codons sowie der in der Genfamilie der Oxidosqualenzyklasen konservierten Sequenzmotive QW und DCTAE angegeben. Die Lage der Sequenz des EST-Klons wird durch den dicken Balken repräsentiert. Die Pfeile geben die relative Position sowie die Richtung der verwendeten Primer wieder. Die Linien repräsentieren die jeweiligen, über PCR-Ansätze amplifizierten cDNA-Fragmente.


EST-Klon TC160438 (768 bp)

LeTTS1 (2,29 kb)

LETS1C5A LETS1C4S

LeTTS1a (1018 bp) OGA1S AMYT

LeTTS1b (792 bp)

OGT4S OGAS1A LeTTS1c (280 bp)

LEASA3A AUAP


83

MWKLKIAEGQNGPYLYSTNNYVGRQTWEFDPNGGTIEERAKIEEARQQFW 50 NNRYKVKPSSDLLWRIQFLGEKNFKQKIPAVKVEEGEEISHEVATIALHR 100 AVNFFSALQATDGHWPAENAGPLFFLPPLVMCMYITGHLNTVFPAEHRKE 150 ILRYIYCHQNEDGGWGLHIEGHSTMFCTALSYICMRILGEGPDGGVNNAC 200 ARARKWILDHGSVTAIPSWGKTWLSILGVFEWIGTNPMPPEFWILPSFLP 250 VHPAKMWCYCRMVYMPMSYLYGKRFVGPITPLILQLREELYDRPYDEINW 300 KKVRHVCAKEDLYYPHPLVQDLMWDSLYICTEPLLTRWPFNKLRNKALEV 350 TMKHIHYEDENSRYITIGCVEKVLCMLACWVEDPNGDYFKKHLARIPDYL 400 WVAEDGMKMQSFGSQEWDTGFAIQALLASEMNDEIADTLRKGHDFIKQSQ 450 VTNNPSGDFKGMYRHISKGSWTFSDQDHGWQVSDCTAEALKCCLLLSTMP 500 RELVGQAMEPGRLYDSVNVVLSLQSKNGGLAAWEPAGASEYLELLNPTEF 550 FADIVIEHEYVECTASSIQALVLFKKLYPGHRTKEINIFIDNAVKYLEDV 600 QMPDGSWYGNWGVCFTYGSWFALGGLVAAGKSYNNSAAVRKGVEFLLRTQ 650 RSDGGWGESYRSCPDKVYRELETNDSNLVQTAWALMGLIHSGQADRDPKP 700 LHRAAKLLINSQMEDGDFPQQEITGVFMKNCMLHYAAYRNIYPLWGLAEY 750 RKNVLLPLENN* 762 Abbildung 3-29: Aminosäuresequenz der Lycopersicon esculentum β-Amyrinsynthase LeTTS1. Das Substratbindungsmotiv DCTAE (grün) sowie die QW-Motive (rot) sind farblich hervorgehoben.

Tabelle 3-10: Ergebnisse des Datenbankvergleichs der Lycopersicon esculentum β-Amyrinsynthase LeTTS1 auf Aminosäuresequenz-Ebene. Die Ergebnisse wurden mit Hilfe des Programms Blast Search (blastp) des National Center for Biotechnology Information (NCBI) ermittelt.



E Value

BAB83088 Betula platyphylla bAS 1373 0 BAA33722 Panax ginseng bAS 1373 0 BAA33461 Panax ginseng bAS 1371 0 BAA89815 Glycyrrhiza glabra bAS 1310 0 AAO33578 Medicago truncatula bAS 1309 0 BAA97558 Pisum sativum bAS 1305 0 AAO33580 Lotus japonicus MFS 1233 0 BAA97559 Pisum sativum MFS 1154 0 AAD05032 Arabidopsis thaliana MFS 1128 0 BAB68529 Luffa cylindrica IMS 1115 0 BAA86930 Olea europaea LUS 1070 0 BAB83087 Betula platyphylla LUS 1042 0 BAA86932 Taraxacum officinalis LUS 1027 0 BAD08587 Glycyrrhiza glabra LUS 1024 0 BAB83253 Costus speciosus CAS 974 0


84

3.3.6.2 Lycopersicon esculentum Triterpensynthase LeTTS2

Die Sequenzierung mehrerer Klone des PCR-Fragmentes LeTTS1b zeigte, dass neben dem

eindeutig zu LeTTS1 zuzuordnenden Fragment ein weiteres Fragment LeTTS2b amplifiziert

worden war, das zwar eine ähnliche, aber dennoch eindeutig abweichende Sequenz aufwies;

diese Unterschiede waren nicht allein auf Sequenzierungs- oder Synthese-Artefakte zurückzu-

führen. Das PCR-Produkt wurde als Fragment einer zweiten Lycopersicon Triterpensynthase

LeTTS2 interpretiert. Mit Hilfe der Kombination des unspezifischen Antisense-Primers OGN2A

und des für LeTTS2 spezifischen Sense-Primers LEASB1S wurde eine PCR-Fragment-

Amplifikation des in 3’-Richtung anschließenden Bereiches bewerkstelligt. Eine anschließende

Sequenzierung ermöglichte die eindeutige Zuordnung zu LeTTS2 aufgrund des vorhandenen

Überlappungsbereiches mit LeTTS2b. Um das gesamte offene Leseraster von LeTTS2 abdecken

zu können, wurden mit Hilfe der RACE-Technik die entsprechenden cDNA-Fragmente

synthetisiert. Neben den Ankerprimern kamen bei der 3’-RACE dabei wiederum der spezifische

Sense-Primer LEASB1S zum Einsatz, bei der 5’RACE die Antisenseprimer OGAS6A und

OGAS7A.


sequenz für das LeTTS2-Transkript von 2641 Nukleotiden (s. Abb. E-4), die für ein Protein mit

einer Länge von 764 Aminosäuren kodierte (Abb. 3-30). Auch hier zeigte der Sequenzvergleich in

der NCBI-Datenbank, dass LeTTS2 große Ähnlichkeiten zu anderen pflanzlichen β-Amyrin-

synthasen aufwies (Tab. 3-11).

MWKLKIAKGLDDRYLYSTNNYIGRQIWEFDPNAGTIEEQAKIEEARQHYW 50 NNRYKGKPNSDLLWRMQFLREENFKQRIRAVKVEEGEEISHEIATVALHR 100 AVHFFSALQATDGHWPAESAGPLFFLPPLVMCMYITGHLNTVYPAEHRKE 150 ILRYIYCHQNEDGGWGLHIEGHSTMFCTAMSYICMRILGEGPEGGVNNAC 200 ARARKWILDHGSVIAIPSWGKTWLSILGAFEWIGTNPMPPEFWILPSFLP 250 VHPAKMWCYCRTVYMPMSYLYGKRFVGPITPLILKLREELYDQTYDEINW 300 KKVRHVCAKEDLYYPHPFVQDLMWDSLYICTEPLLTRWPFNKLRNKALEV 350 TMKHIHYEDENSRYITMGCVEKVLSMLACWVEDPNGDHFKKHLARIPDFL 400 WVAEDGMKMQGCGSQSWDASLAIQALLASEMYDEISDTLKNGHDFIKQSQ 450 VKDNPSGDFKVMYRHISKGSWAFADQDLGWQVSDCTAEALKCCLLFSTMP 500 PEIVGEAMDPVRLYDSVNVILSLQSKNGGLSAWEPAGAPEYLELLNPTEF 550 FEDIVIEHEHVECTSSAIQALVRFKKLYPGHRTTEVDNFINNGVKYIEDV 600 QEPDGSWYGNWGVCFIYASWFALGGLAAVGLSYSNCAAVRKSVEFLLRTQ 650 RSDGGWGESYRSCPDKVYRELETEHSNLVQTAWALMGLIHSGQVERDPRP 700 LHRAAKLLINFQMEDGDFPQQEITGVFLRNCMMHYALYRNIFPLWGLAEY 750 RRNVLVPLKHNYI* 764

Abbildung 3-30: Aminosäuresequenz der Lycopersicon esculentum Triterpensynthase LeTTS2. Das Substratbindungsmotiv DCTAE (grün) sowie die QW-Motive (rot) sind farblich hervorgehoben.


85

Tabelle 3-11: Ergebnisse des Datenbankvergleichs der Lycopersicon esculentum LeTTS2 auf Aminosäure-sequenz-Ebene. Die Ergebnisse wurden mit Hilfe des Programms Blast Search (blastp) des National Center for Biotechnology Information (NCBI) ermittelt.



E Value

BAB83088 Betula platyphylla bAS 1300 0 BAA33722 Panax ginseng bAS 1300 0 BAA33461 Panax ginseng bAS 1298 0 BAA89815 Glycyrrhiza glabra bAS 1258 0 AAO33578 Medicago truncatula bAS 1244 0 BAA97558 Pisum sativum bAS 1241 0 AAO33580 Lotus japonicus MFS 1183 0 BAA97559 Pisum sativum MFS 1178 0 BAB68529 Luffa cylindrica IMS 1082 0 AAD05032 Arabidopsis thaliana MFS 1080 0 BAA86930 Olea europaea LUS 1016 0 BAB83087 Betula platyphylla LUS 1013 0 BAA86932 Taraxacum officinalis LUS 1000 0 BAD08587 Glycyrrhiza glabra LUS 976 0 BAB83253 Costus speciosus CAS 937 0

3.4 Charakterisierung der klonierten 2,3-Oxidosqualenzyklasen… 86

3.4 Charakterisierung der klonierten 2,3-Oxidosqualenzyklasen mittels hete-rologer Expression in der Hefemutante GIL 77

3.4.1 Charakterisierung der Ricinus communis Lupeolsynthase RcLUS1 Für die funktionelle Charakterisierung der Triterpensynthase RcLUS1 wurde im Wesent-

lichen eine Methode angewendet, die im Labor von Y. Ebizuka, Tokyo, Ende der 90er Jahre

etabliert wurde (Kushiro et al. 1998). Diese Methode basiert auf einer heterologen

Expression der zu charakterisierenden Oxidosqualenzyklase in GIL 77, einer Lanosterol-

synthase-defizienten Hefestamm-Mutante (siehe 2.5.3).

Zunächst wurde die RcLUS1-Full-length-cDNA in den Hefe-Expressionsvektor pYES2

kloniert und anschließend in die Hefestamm-Mutante transformiert. Nach der Galactose-

induzierten Expression von RcLUS1 in GIL 77 wurden die Zellen geerntet und Hexan-

Zellextrakte hergestellt (siehe 2.5.4). Als Negativkontrolle wurden Hefezellen extrahiert, die

zuvor mit dem leeren Hefe-Expressionsvektor pYES2 transformiert worden waren. Für eine

erste qualitative Analyse wurden Aliquots der Extrakte auf einen Dünnschichtstreifen

aufgetragen und mit einer Benzol/Aceton-Mischung als mobile Phase chromatographisch

aufgetrennt. Hierbei zeigte sich, dass im Extrakt der pYES2-RcLUS1-Transformanden eine

Substanz prominent angereichert vorlag, die im Kontroll-Extrakt nicht nachweisbar war.

Diese Substanz zeigte denselben Rf-Wert wie ein authentischer Lupeol-Standard, der

ebenfalls auf den Dünnschichtstreifen aufgetragen worden war (Abb. 3-31). Daneben fand

sich in der Negativkontrolle eine Substanz, die in den Extrakten der RcLUS1-Transfor-

manden in weit geringerer Menge vorhanden war.

Abbildung 3-31: Dünnschichtchromatographie der Hefe-Gesamtextrakte. Neben einem Standard, bestehend aus Ergosterol, Lupeol und einem C27-Keton, wurden jeweils 2 µl der Extrakte der Kontrolle (mit leerem Expressionsvektor pYES2 transformierter Hefestamm GIL 77) sowie der pYES2-RcLUS1-Transformanden aufgetragen. Der obere Pfeil markiert die in der Kontrolle prominent vorhandene Substanz 2,3-Oxidosqualen (wie die anschließende massenspektro-skopische Analyse zeigte). Der untere Pfeil markiert das Zyklisierungsprodukt der pYES2-RcLUS1-Transformanden.

Ergosterol

Lupeol

Keton

Stan

dard

Kon

trol

le

RcL

US1

- Tr

ansf

orm

ande

n


16 18 20 22 24 26 28 30 320

20

40

60

80

100 Transformierter Hefestamm GIL77 mit leerem Vektor pYES2

16 18 20 22 24 26 28 30 32

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

0

20

40

60

80

100 Transformierter Hefestamm GIL77 mit pYES2-RcLUS1-Konstrukt

Retentionszeit [min]

16 18 20 22 24 26 28 30 320

20

40

60

80

100 Lupeol-Standard

(2)

(3)

(1)

(1)

(3) (2) (A)

Abbildung 3-32: Gaschromatographische Analyse TMS-derivatisierter Extrakte der mit RcLUS1 transformierten Hefezellen. (1) Squalen, (2) 2,3-Oxidosqualen, (3) Ergosterol und (A) Zyklisierungsprodukt der pYES2-RcLUS1-Transformanden.


0

20

40

60

80

100

M+

498

218

203

189

73

m/z

100 200 300 400 500 600

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

0

20

40

60

80

100

M+

498

218

203

189

73

Für eine eingehende analytische Untersuchung wurden die Extrakte anschließend

silyliert, gaschromatographisch aufgetrennt und massenspektrometrisch analysiert. Sowohl

im Extrakt der Negativkontrolle, wie auch im Extrakt der Hefezellen, in denen RcLUS1

heterolog exprimiert worden war, ließen sich durch Vergleiche mit authentischen Standards

bzw. durch Vergleiche mit Massenspektren in Datenbanken (Nist02, Wachseei) Ergosterol,

Squalen sowie 2,3-Oxidosqualen identifizieren (Abb. 3-32). 2,3-Oxidosqualen war in den

pYES2-RcLUS1-Transformanden in weit geringeren Mengen vertreten als in der

Negativkontrolle, entsprechend den Ergebnissen der Dünnschichtchromatographie (vgl. Abb.

3-31). Die mit RcLUS1 transformierten Hefezellen akkumulierten eine Substanz, die in der

Retentionszeit und in ihrem silylierten Massenspektrum (Basispeak m/z 189 und Molpeak

m/z 498) exakt denen von authentischem Lupeol entsprach (Abb. 3-33).

Abbildung 3-33: Massenspektrum des silylierten Zyklisierungsproduktes des mit dem pYES2-RcLUS1-Konstrukt transformierten Hefestammes GIL 77 im Vergleich zu silyliertem authentischen Lupeol-Standard.

Lupeol-Standard

Zyklisierungsprodukt der pYES2-RcLUS1-Transformanden

TMS-O


Um zu untersuchen, ob - und wenn welche - Substanzen neben Lupeol als Haupt-

Zyklisierungsprodukt als Folge der heterologen Expression von RcLUS1 in GIL 77 zusätzlich

entstanden, wurde der Hefe-Gesamtextrakt eines Transformationsansatzes auf eine

Dünnschichtplatte aufgetragen und chromatographisch getrennt. Die Bande, die den

Zyklisierungsprodukten zuzuordnen war, wurde ausgekratzt, extrahiert und gaschromato-

graphisch sowie massenspektrometrisch untersucht (Abb. 3-34). Die Analyse zeigte, dass in

der Dünnschichtfraktion neben Lupeol noch die Triterpenole β-Amyrin und α-Amyrin

nachweisbar waren, allerdings in sehr geringen Mengen (jeweils 0,9% beziehungsweise

0,1% der Gesamtmenge an Zyklisierungsprodukten).

Da das wesentliche Zyklisierungsprodukt von RcLUS1 eindeutig als Lupeol identifiziert

wurde, konnte durch die heterologe Expression gezeigt werden, dass die klonierte cDNA der

Ricinus communis-Triterpensynthase RcLUS1 für eine Lupeolsynthase kodierte. Zur

Bestätigung der Ergebnisse wurde GIL 77 mit drei unabhängig durchgeführten Klonierungen

von RcLUS1 transformiert. Die heterologe Expression in den Hefezellen führte dabei stets

zur Anreicherung von Lupeol in den transformierten Zellen.

Abbildung 3-34: Gaschromatogramm der über Dünnschichtchromatographie quantitativ gewonnenen Zyklisierungsprodukte Lupeol (A), β-Amyrin (B) und α-Amyrin (C).


16 18 20 22 24 26 28 30 32

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

0

20

40

60

80

100 (A)

(C) (B)


3.4.2 Charakterisierung der Ricinus communis Cycloartenolsynthase RcCAS1 Die klonierte RcCAS1-cDNA wurde für die Charakterisierung entsprechend der bereits

beschriebenen Methode in GIL 77 heterolog exprimiert und die transformierten Hefezellen

anschließend mit Hexan extrahiert. Eine Dünnschichtchromatographie der Gesamtextrakte

zeigte, dass in den transformierten Zellen im Gegensatz zur Negativkontrolle eine

Substanzfraktion angereichert wurde, die in ihrem Rf-Wert nicht dem von Lupeol entsprach

(Abb. 3-35).

Eine gaschromatographische und massenspektroskopische Analyse der Gesamtextrakte

zeigte, dass im Vergleich zur Negativkontrolle acht prominente Substanzen in den RcCAS1-

Transformanden angereichert vorlagen (Abb. 3-36), ein Befund, der sich in vier unabhängi-

gen GIL 77-Transformierungen mit RcCAS1-pYES2-Konstrukten reproduzieren ließ. Unter

diesen Verbindungen fand sich eine Substanz, die in ihrem Retensionsverhalten und ihrem

Massenspektrum dem eines silylierten Cycloartenol-Standards (Labor R. Jetter) entsprach,

wenngleich diese Substanz nur 24% der gesamten Produktmenge ausmachte. Die anderen

Verbindungen konnten aufgrund ihrer Massenspektren nicht identifiziert werden. Das

silylierte Massenspektrum des Hauptproduktes, im Retensionsverhalten sehr ähnlich zu dem

von Cycloartenol, zeigte einen Molpeak von m/z 498 und die charakteristischen

Massenfragmente m/z 408 (Basispeak) und m/z 393. Die Molmasse von m/z 468 des Acetyl-

Derivates dieser Substanz wies auf das Vorhandensein einer Hydroxylgruppe in der

underivatisierten Verbindung hin. Eine andere quantitative Zusammensetzung der

akkumulierten Substanzen ließ sich ausmachen, wenn die Galactose-Induktionsphase bei

den Transformanden auf die Hälfte (6 Stunden) reduziert wurde, jedoch konnte auch hier

Cycloartenol in den Extrakten identifiziert werden (Abb. 3-36).

Ergosterol

Lupeol

Stan

dard

Kon

trol

le

RcC

AS1

- Tr

ansf

orm

ande

n

Abbildung 3-35: Dünnschichtchromatographie der Hefe-Gesamtextrakte. Neben einem Standard wurden jeweils 2 µl der Extrakte der Kontrolle (mit leerem Expressionsvektor pYES2 transformierter Hefestamm GIL 77) sowie der mit dem pYES2-RcCAS1-Konstrukt transformierte GIL77-Stamm aufgetragen. Der obere Pfeil markiert das in der Kontrolle prominent vorhandene 2,3-Oxidosqualen, der untere Pfeil das Zyklisierungsprodukt der RcCAS1-Transformanden.


16 18 20 22 24 26 28 30 320

10

20

30

40

50

Retensionszeit [min]

16 18 20 22 24 26 28 30 32

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

0

10

20

30

40

50


16 18 20 22 24 26 28 30 320

10

20

30

40

50

(1)

(2)

(3)

(1) (2)

(3)

(3)

(2)

* * *

**

*

**

* *

*

***

Transformierter Hefestamm GIL77 mit pYES2-RcCAS1-Konstrukt

Transformierter Hefestamm GIL77 mit leerem pYES2-Vektor

Transformierter Hefestamm GIL77 mit pYES2-RcCAS1-Konstrukt;

verkürzte Induktionszeit

Abbildung 3-36: Gaschromatogramm TMS-derivatisierter Extrakte der transformierten Hefezellen. (1) Squalen, (2) 2,3-Oxidosqualen, (3) Ergosterol. Sternchen weisen Produkte der pYES2-RcCAS1-Transformanden aus. Die Pfeile kennzeichnen Cycloartenol.

*


Wiederholt wurde in der einschlägigen Literatur darauf hingewiesen, dass Cycloartenol

nicht in ausreichenden Mengen in mit Cycloartenolsynthase-cDNA transformierten

Hefezellen akkumuliert wird (Haralampidis et al. 2001; Kawano et al. 2002). Dieser Effekt

wird durch die metabolische Verarbeitung des Zyklisierungsproduktes in den Hefezellen

erklärt (Venkatramesh und Nes 1995). Um das Produktspektrum von RcCAS1 vor diesem

Hintergrund genauer untersuchen zu können, wurde ein in vitro-Enzymtest mit zellfreiem

Hefezellenextrakt durchgeführt. Hierfür wurden mit RcCAS1-cDNA transformierte GIL 77-

Zellen nach der Galaktose-Induktion homogenisiert. Der Zellextrakt diente dann für den Test,

bei dem der zellfreie Extrakt mit dem Substrat 2,3-Oxidosqualen inkubiert und anschließend

extrahiert wurde (s. 2.5.6). Die gaschromatographische Analyse zeigte, dass im Extrakt der

transformierten Zellen im Vergleich zur Negativkontrolle zwei Zyklisierungsprodukte (D und

E) von RcCAS1 akkumuliert vorlagen (Abb. 3-37).

Abbildung 3-37: Gaschromatogramm der TMS-derivatisierten Chloroform-Extrakte aus dem Enzym-Test mit zellfreiem Extrakt. Im Vergleich zur Negativkontrolle waren die Substanzen D und E in dem von mit RcCAS1 transformierten Zellen stammenden Extrakt prominent.

Durch den Vergleich des Retentionsverhaltens und dss silylierten Massenspektrums

(Abb. 3-38) mit dem bereits oben erwähnten Standard konnte die Substanz D eindeutig als

Cycloartenol identifiziert werden. Das silylierte Massenspektrum der zweiten Substanz E

wies eine Molmasse der Verbindung von m/z 514 aus; weitere charakteristische Fragmente

waren m/z 381, m/z 409 sowie m/z 424 (Basispeak). Durch eine dünnschichtchromato-

graphische Auftrennung des Gesamtextraktes der RcCAS1-Transformanden wurde die


24 25 26 27 28 29 30 31 32

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

0

2

4

6

8

10

pYES2-RcCAS1-TransformandenKontrolle mit leerem Vektor pYES2

(D)

(E)


m/z

100 200 300 400 5000

20

40

60

80

100

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

0

20

40

60

80

100

M+

498

483

408

393365

339

203

69

95135

147 175

73

55

109

M+

498483

408393

365

339

203

69

95

135

147 175

73

55 109

Fraktion, in der die Substanz E nachgewiesen werden konnte, einer Acetylierung

unterzogen. Das entsprechende Spektrum der Substanz E nach der Derivatisierung zeigte

folgerichtig einen Molpeak M+ von m/z 484 (Abb. 3-39). Eine Recherche in der

Massenspektren-Datenbank Nist02 ergab, dass dieses Spektrum dem des acetylierten

Derivates von Lagerenol (Talapatra et al. 1983) glich. Diese Verbindung unterscheidet sich

von Cycloartenol lediglich durch das Vorhandensein einer Carbonylgruppe am C-Atom 24

anstelle der C24-C25-Doppelbindung. Das Fehlen eines authentischen Standards machte eine

eindeutige Identifizierung des Zyklisierungsproduktes E jedoch nicht möglich.

Abbildung 3-38: Massenspektrum des silylierten Zyklisierungsproduktes D des mit dem pYES2-RcCAS1-Konstrukt transformierten Hefestammes GIL 77 im Vergleich zu silyliertem Cycloartenol-Standard.

TMS-O

Cycloartenol-Standard

Zyklisierungsprodukt D der RcCAS1-Transformanden


Abbildung 3-39: Massenspektrum des silylierten sowie acetylierten Zyklisierungsproduktes E des mit dem pYES2-RcCAS1-Konstrukt transformierten Hefestammes GIL 77. Die Spektren weisen die jeweiligen Verbindungen als Lagerenol-Derivate aus.

Die Carbonylgruppe des potenziellen Lagerenols an C24 könnte durch eine Hydration der

C24-C25-Doppelbindung des Cycloartenol erklärt werden. Es bleibt allerdings ungeklärt, ob

Verbindung E tatsächlich ein primäres Zyklisierungsprodukt der RcCAS1 darstellt, oder ob

diese Substanz als „Artefakt“ durch die Inkubationsbedingungen während des Essays

entsteht. Der in vitro-Enzymtest wurde in drei unabhängigen Ansätzen wiederholt, in denen

jeweils Cycloartenol nachgewiesen werden konnte. Dagegen war in einer der Wieder-

holungen Verbindung E in weit geringeren Mengen vertreten als Cycloartenol, im dritten

Ansatz sogar nur in Spuren nachzuweisen.

m/z

100 200 300 400 500

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

0

20

40

60

80

100

M+

484469

424409

381

355

297203

175

95

107

14769 81

121

0

20

40

60

80

100

M+

514499

424

409

381

355

302

73

95135

147

175

203

TMS-O

O

Ac-O

O


3.4.3 Charakterisierung der Lycopersicon esculentum β-Amyrinsynthase LeTTS1 Für die Charakterisierung der von der LeTTS1-cDNA codierten Triterpensynthase aus

Lycopersicon esculentum wurde das gleiche Verfahren wie bei RcLUS1 angewendet. Die

Transformation von GIL 77-Hefezellen mit dem den LeTTS1-Full-length-Klon tragenden

Expressionsvektor pYES2 und die anschließende Galaktose-Induktion der Zellen führte zu

einer heterologen Expression von LeTTS1. Die gaschromatographische und massenspektro-

skopische Analyse der Gesamtextrakte der transformierten Zellen zeigte, dass es sich beim

Zyklisierungsprodukt von LeTTS1 um das Triterpenol β-Amyrin handelte (Abb. 3-40 und 3-

41). Ähnlich wie RcLUS1 wies LeTTS1 eine Monofunktionalität auf, da neben β-Amyrin kein

weiteres Zyklisierungsprodukt in nennenswerten Mengen zu detektieren war.

Wie eine nachträgliche Sequenzierung des für die Charakterisierung eingesetzten Klons

zeigte, entsprachen drei Aminosäuren am 5’-Ende des Full-length-Klons nicht dem LeTTS1-

Wildtyp. Dies ist vermutlich auf eine „fehlerhafte“ Sequenz des für die Klonierung

verwendeten Primers LETS1C4S zurückzuführen. Zwar kann davon ausgegangen werden,

das diese Abweichung keinen Einfluss auf die Produktspezifität von LeTTS1 hatte; bei einer

Wiederholung des Versuches muss jedoch ein völlig korrekter Full-Length-Klon von LeTTS1

zur Transformation von GIL 77 eingesetzt werden, um eventuelle Sequenz-Artefakte

ausschließen zu können.

Abbildung 3-40: Gaschromatographische Analyse TMS-derivatisierter Extrakte der mit LeTTS1 transformierten Hefezellen. (1) Squalen, (2) 2,3-Oxidosqualen, (3) Ergosterol und (B) Zyklisierungsprodukt der pYES2-LeTTS1-Transformanden. (B*) kennzeichnet das underivatisierte Zykli-sierungsprodukt B.


16 18 20 22 24 26 28 30 32

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

0

20

40

60

80

100

(1)

(2)

(3)

(B)

(B*)


Abbildung 3-41: Massenspektrum des silylierten Zyklisierungsproduktes B des mit dem pYES2-LeTTS1-Konstrukt transformierten Hefestammes GIL77. Das Spektrum weist das LeTTS1-Zyklisierungsprodukt B als das Triterpenol β-Amyrin aus.

m/z

100 200 300 400 500

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

0

20

40

60

80

100

M+

498483

218

203

189

TMS-O

3.5 Expressionsmuster der Epoxysqualenzyklasen RcLUS1 und RcCAS1 97

3.5 Expressionsmuster der Epoxysqualenzyklasen RcLUS1 und RcCAS1 3.5.1 Expression in verschiedenen Pflanzengeweben Um die Expression der klonierten Lupeol- und Cycloartenolsynthase von R. communis in

verschiedenen Organen der Pflanze zu untersuchen, wurden entsprechende Northern-Blot-

Analysen durchgeführt. Eine für RcLUS1 spezifische radioaktiv markierte Sonde wurde

hierfür mit jeweils 10 µg Gesamt-RNA hybridisiert. Die RNA-Proben wurden zuvor aus

Stamm-, Wurzel- und Blattmaterial 50 Tage alter Ricinus communis Pflanzen beider

Phänotypen isoliert, gelelektrophoretisch aufgetrennt und auf eine Nylonmembran geblottet.

Als Kontrolle diente die Ethidiumbromidfärbung der rRNA-Banden der einzelnen Proben. Die

Untersuchung zeigte, dass RcLUS1 nur in Sprossachsen des Glaucous-Phänotyps

exprimiert war, wohingegen in allen anderen Proben kein Signal der Lupeolsynthase-

spezifischen Sonde detektierbar war (Abb. 3-42A). Um die geblotteten RNA-Proben für eine

weitere Analyse nutzen zu können, wurde die Membran gestrippt und die Proben danach mit

einer für RcCAS1 spezifischen, radioaktiv markierten Sonde hybridisiert. Auch nach einer

mehrtägigen Entwicklung des Blots auf einer Imager-Platte war kein Signal messbar. Ebenso

war auch nach einer weiteren Hybridisierung des Blots mit einer für das Actin-Gen (RcACT)

spezifischen Sonde als Positiv-Kontrolle keinerlei Signal zu detektieren.

Um zusätzliche Informationen zum Expressionsverhalten der R. communis Lupeol- und

Cycloartenolsynthase zu erhalten, wurden neben den Northern-Blot-Analysen semiquantita-

tive RT-PCR-Untersuchungen durchgeführt. Hierfür wurden jeweils 0,5 µg Gesamt-RNA der

Stamm-, Wurzel- und Blattproben beider Phänotypen für cDNA-Synthesen eingesetzt. In

anschließenden PCR-Versuchen wurden mit Hilfe genspezifischer Primer RcLUS1- und

RcCAS1-Transkripte entsprechend ihrem Expressionsmuster in den verschiedenen

Pflanzengewebe amplifiziert. Die Ergebnisse für RcLUS1 bestätigten im Wesentlichen die

Ergebnisse aus den Northern-Blot-Analysen (Abb. 3-42B): Während in den Proben des

Glossy-Phänotyps keine Fragmente von RcLUS1 amplifiziert wurden, zeigte die starke

Amplifikation des Transkriptfragmentes in der Sprossachsenmaterial-Probe des Glaucous-

Phänotypes die starke Expression der Lupeolsynthase in diesem Gewebe an. Darüber

hinaus wurde in der Blattmaterial-Probe des Glaucous-Phänotyps eine schwache

Amplifikation des RcLUS1-Fragmentes beobachtet. Im Gegensatz zu diesem differenzierten

Expressionsverhalten zeigte die Amplifikation der RcCAS1-Transkript-Fragmente, dass die

klonierte R. communis Cycloartenolsynthase in allen Geweben der Pflanze exprimiert war.

Als konstitutive Kontrolle in den RT-PCR-Versuchen fungierte die Amplifikation eines

Transkript-Fragmentes des in allen Proben erwartungsgemäß stark exprimierten Actin-Gens

(RcACT).


Abbildung 3-42: Expression der R. communis Lupeolsynthase und Cycloartenolsynthase in verschiedenen Organen. A: Northern-Blot-Analyse mit einer RcLUS1-spezifischen Sonde; 10 µg RNA pro Linie. Die untere Teilabbildung zeigt die Ethidiumbromid-Färbung des Gels vor dem Blotten auf die Nylonmembran als Kontrolle. B: RT-PCR-Analyse der Expression von RcLUS1 und RcCAS1. Als konstitutive Kontrolle diente RcACT.

3.5.2 Expression während der frühen Sprossachsenentwicklung

Das Expressionsverhalten der klonierten und charakterisierten Lupeolsynthase RcLUS1

während der frühen Hypokotylentwicklung wurde ebenfalls mit Hilfe von Northern-Blot-

Analysen untersucht, analog zur oben beschriebenen Vorgehensweise. Die RNA-Proben

wurden dabei aus Hypokotylen von 6, 12, 18, 25 und 50 Tage alten Rizinuspflanzen beider

Phänotypen gewonnen. Die Northern-Blot-Analyse zeigte, dass RcLUS1 im Glaucous-

Phänotyp zwischen Tag 6 und Tag 25 exprimiert war, wobei sich ein Maximum des

Expressionslevels am Tag 12 abzeichnete (Abb. 3-43A). Im Gegensatz dazu war während

dieses Zeitraums keinerlei RcLUS1-Expressionsaktivität im Glossy-Phänotyp detektierbar.

Auch hier wurden ergänzend semiquantitative RT-PCR-Versuche durchgeführt, die im

Wesentlichen die Ergebnisse der Northern-Blot-Analysen bestätigten (Abb. 3-43B): Beim

Glaucous-Phänotyp ließ sich eine Expression von RcLUS1 von Tag 6 bis Tag 50

nachweisen, wobei sich ein Peak an Tag 12 im Expressionsmuster, an Tag 50 nur eine

RcACT

Stamm Blatt Wurzel

Glaucous Glossy

rRNA

A

B Glaucous Glossy

287 bp

433 bp

454 bp

RcLUS1

RcLUS1

RcCAS1

Stamm Blatt Wurzel

Stamm Blatt Wurzel Stamm Blatt Wurzel


RcLUS1

RcCAS1

RcACT

Glaucous Glossy

6 6 12 18 25 50 12 18 25 50

Glaucous Glossy

6 6 12 18 25 50 12 18 25 50

RcLUS1

rRNA

A

B

schwache Amplifikation des RcLUS1-Fragments erkennen ließ. In den aus Glossy-Individuen

gewonnenen Proben ließ sich keinerlei Expressionsaktivität von RcLUS1 erkennen.

Im Gegensatz zur Lupeolsynthase war RcCAS1 während der gesamten untersuchten

Zeitspanne exprimiert, sowohl im Glaucous-, wie auch im Glossy-Phänotyp. Wie in den

vorangegangenen Expressions-Versuchen diente auch hier die Amplifizierung des RcACT-

Fragmentes jeweils als Positivkontrolle.

Abbildung 3-43: Expression der R. communis Lupeolsynthase und Cycloartenolsynthase während der frühen Hypokotylentwicklung. A: Northern-Blot-Analyse mit einer RcLUS1-spezifischen Sonde; 10 µg RNA pro Linie. Die untere Teilabbildung zeigt die Ethidiumbromid-Färbung des Gels vor dem Blotten auf die Nylonmembran als Kontrolle. B: RT-PCR-Analyse der Expression von RcLUS1 und RcCAS1. Als konstitutive Kontrolle diente RcACT.

287 bp

433 bp

454 bp

Tage nach Keimung

Tage nach Keimung

3.6 Site-directed mutagenesis-Versuche an RcLUS1 100

3.6 Site-directed mutagenesis-Versuche an RcLUS1 3.6.1 Die Wahl der zu mutierenden Aminosäurereste Die Bedeutung für den produktspezifischen Zyklisierungsmechanismus einzelner

Aminosäurereste der Lupeolsynthase aus Ricinus communis wurde untersucht, indem durch

gerichtete Mutagenisierungsversuche (site-directed mutagenesis) einzelne Aminosäuren

mutagenisiert wurden. Ebizuka und seine Mitarbeiter konnten mit dieser Methode zeigen,

dass der Austausch jeweils einzelner Aminosäuren bei der Lupeolsynthase aus Olea

europaea (OEW) und der β-Amyrinsynthase aus Panax ginseng (PNY) eine Veränderung

der Produktspezifität zur Folge hatte. Bei ihren Untersuchungen spielte das bei

Amyrinsynthasen konservierte Tryptophan im Motiv 258MWCYCR263 (PNY) sowie das in

Lupeolsynthasen konservierte Leucin im entsprechenden Motiv 255MLCYCR260 (OEW) eine

entscheidende Rolle: Der jeweilige gegenseitige Austausch von Tryptophan und Leucin in

OEW und PNY zog eine entsprechende Veränderung der Produktspezifität der

mutagenisierten Triterpensynthasen nach sich (Kushiro et al. 2000b). Wie sich in

Sequenzalignments herausstellte, zeigte RcLUS1 ebenfalls das entsprechende Motiv,

allerdings mit einem Phenylalanin anstatt des für Lupeolsynthasen charakteristischen

Leucins: 256MFCYCR261 (Abb. 3-44).

OEW PIHPGKMLCYCR 260 TRW PIHPGKMLCYCR 262 BPW PIHPGKMLCYCR 259 GgLUS1 PFHPGKMLCYCR 259

MtbAS PMHPAKMWCYCR 261 PSY PMHPAKMWCYCR 261 GgbAS1 PMHPAKMWCYCR 261 PNY2 PMHPAKMWCYCR 261 BPY PMHPAKMWCYCR 261 PNY PMHPAKMWCYCR 263

RcLUS1 PLHPAKMFCYCR 261

Abbildung 3-44: Aminosäuresequenz-Alignment von Lupe-ol- und β-Amyrinsynthasen im Bereich der jeweils konser-vierten Aminosäuren Leucin und Tryptophan. Eine Sonder-stellung von RcLUS1 innerhalb der Gruppe der Lupeol-synthasen ergibt sich durch die Aminosäure Phe257, die nicht das LUS-typische Leu aufweist.

Über die dreidimensionale Struktur der menschlichen Lanosterolsynthase und ein

Alignment der Aminosäuresequenz mit der von RcLUS1 ließ sich ermitteln, dass 257Phe von

RcLUS1 sehr nahe am bzw. im aktiven Zentrum des Enzyms positioniert sein dürfte und

damit die unmittelbare Beteiligung an der Zyklisierungsreaktion wahrscheinlich ist (Abb. 3-

45). Um zu testen, ob 257Phe tatsächlich für die Bildung von Lupeol mit verantwortlich ist,

wurde die RcLUS1-Mutante F257W kreiert (siehe 2.6).


Lupeol- synthasen


Abbildung 3-45: Dreidimensionale Darstellung der Aminosäurereste der menschlichen Lanosterol-synthase, die sich in einem Abstand von 5 Angström vom Substrat befinden. Die Positionen der einzelnen Aminosäuren in der AS-Kette (grau) sowie die über Sequenzalignments ermittelten entsprechenden Aminosäuren von RcLUS1 und deren Positionen (schwarz) sind angegeben. Der Rest des Trp230, das dem zu mutierenden Phe257 aus RcLUS1 entspricht, ist rot, das Produkt Lanosterol gelb eingefärbt. Die Darstellung wurde mit Hilfe des Programms UCSF Chimera (Version 1) erstellt (PDB ID: 1W6K). Neben diesem Ansatz wurde noch eine weitere Mutagenisierung an RcLUS1

durchgeführt, bei der der Thymidinrest der Aminosäure 416 durch ein Histidin ersetzt wurde.

Die Bildung dieser RcLUS1-Mutante T416H war durch Sequenzvergleiche von RcLUS1 mit

einer gerade im Labor klonierten und charakterisierten Kalanchoe-Triterpensynthase

motiviert gewesen. Der Vergleich mit der menschlichen Lanosterolsynthase machte jedoch

eine Beteiligung dieser Aminosäure aufgrund seiner relativ weiten Entfernung vom

katalytischen Zentrum des Enzyms unwahrscheinlich. Da die Charakterisierung der Mutante

keine Veränderungen in der Produktspezifität der Mutante erkennen ließ, wird dieser Ansatz

im Folgenden nicht weiter berücksichtigt.

Trp 192 ≈ Trp 219

Trp 230 ≈ Phe 257

Tyr 98 ≈ Asn 119

Tyr 704 ≈ Tyr 735

Tyr 503 ≈ Trp 533

Phe 521 ≈ Met 551

Trp 387 ≈ Trp 417

Pro 337 ≈ Cys 369

His 232 ≈ Tyr 259

Gly 380 ≈Ser 411

Thr 381 ≈ Phe 412

°


3.6.2 Charakterisierung der RcLUS1-Mutante F257W

Die Charakterisierung der RcLUS1-Mutante F257W erfolgte analog zur oben beschrie-

benen Methode über die heterologe Expression des Gens in der Hefemutante GIL 77. Die

Extraktion der Transformanden und die anschließende gaschromatographische Analyse

offenbarte ein verändertes Produktspektrum der Mutante F257W gegenüber dem Wildtyp

(Abb. 3-46): Als Hauptzyklisierungsprodukt wurde hier β-Amyrin identifiziert, während andere

Verbindungen, darunter auch Lupeol, nur in geringen Mengen detektiert wurden. Das relative

Mengenverhältnis von β-Amyrin : Lupeol : nicht identifizierte Produkte betrug 64 : 13 : 23.

Auch wenn die Triterpenproduktion insgesamt bei RcLUS1 F257W gegenüber dem Wildtyp

stark reduziert war (etwa 15% im Vergleich zur Produktionsmenge des nativen Enzyms),

konnte durch diesen Ansatz gezeigt werden, dass die Veränderung einer einzigen

Aminosäure das Produktspektrum der Zyklase beeinflusst, so dass es möglich war, aus einer

Lupeolsynthase eine multifunktionale Triterpensynthase mit überwiegender β-Amyrin-

Produktion zu kreieren.

Abbildung 3-46: Gaschromatogramm TMS-derivatisierter Gesamtextrakte mit RcLUS1-Wildtyp und RcLUS1-Mutante F257W transformierter Hefe-zellen. (3) Ergosterol, (A) Lupeol, (B) β-Amyrin und (B*) underivatisiertes β-Amyrin.


23 24 25 26 27 28 29 30

Rel

ativ

e In

tens

ität [

%]

0

2

4

6

8

10

pYES2-RcLUS1-Transformanden pYES2-RcLUS1 F257W-Transformanden

(B)

(B*)

(A) (3)

4.1 Ausbildung des Glaucous-Phänotyps von Ricinus communis 103

4 Diskussion

4.1 Ausbildung des Glaucous-Phänotyps von Ricinus communis

4.1.1 Chemische und mikromorphologische Charakteristika der beiden Spross-achsen-Phänotypen: Wachskristalle als Verursacher des Glaucous-Phänotyps

Die chemische Analyse der kutikulären Wachszusammensetzung 67 Tage alter

Hypokotyle von Ricinus communis ergab, dass der gravierendste Unterschied zwischen

beiden Sprossachsenkutikula-Phänotypen vor allem in der Akkumulation von zyklischen

Triterpenverbindungen bei Individuen des Glaucous-Phänotyps begründet liegt. Bei der

Hauptkomponente des kutikulären Wachses von Individuen des Glaucous-Phänotyps

handelt es sich um das Triterpenol Lupeol, das mehr als 50% der Wachsmenge stellt. Im

Gegensatz dazu sind im Wachsgemisch der Individuen des Glossy-Phänotyps nur sehr

geringe absolute und relative Mengen an Lupeol bzw. Triterpenen insgesamt zu detektieren.

So beträgt die Wachsbelegung auf Hypokotylen vom Glossy-Phänotyp nur 12,5 µg cm-2

gegenüber 51,9 µg cm-2 auf Hypokotylen von Individuen des Glaucous-Phänotyps. Aus den

rasterelektronenmikroskopischen Untersuchungen ging hervor, dass Sprossachsen und

Blattstiele des Glaucous-Phänotyps von einem dichten Netzwerk aus fadenförmigen

epikutikulären Wachskristallen, das die makroskopisch glauke Erscheinungsform dieser

Pflanzenorgane verursacht, bedeckt sind. Die Sprossoberflächen des Glossy-Phänotyps sind

dagegen lediglich von einem Wachsfilm überzogen, ihre Sprossachsen erscheinen deshalb

glänzend grün. Die Detektion der auffälligen Triterpen-Akkumulation, die auf das Wachs von

Individuen des Glaucous-Phänotyps beschränkt bleibt, liefert einen ersten Hinweis darauf,

dass die fadenförmigen epikutikulären Wachskristalle auf den Sprossen und den Blattstielen

dieser Erscheinungsform von Ricinus communis-Sprossachsen hauptsächlich aus Lupeol

bestehen.

Meist geht das Auftreten von Wachskristallen auf Pflanzenoberflächen mit dem

Vorhandensein großer Mengen einer Substanzklasse bzw. einer einzelnen Verbindung im

kutikulären Wachs einher (Jetter und Riederer 1994). Die Kristalle entstehen, sobald die

Konzentration einer Substanz im Wachsgemisch einen bestimmten Schwellenwert

überschreitet (Gülz et al. 1992). Dabei wird die Bildung von epikutikulären Wachskristallen

als ein spontaner Prozess interpretiert, der entscheidend durch die molekularen

Eigenschaften der im Wachsgemisch vorherrschenden Komponenten beeinflusst wird (Wen

et al. 2006). Mehrere Daten aus der Literatur zeigen eine auffällige Korrelation zwischen

hohen Triterpen-Anteilen im kutikulären Wachs und glauken Pflanzenoberflächen. Obwohl

diese Untersuchungen eine morphologische Vielfalt an Triterpen-Kristallstrukturen offen-


baren, zeigen doch mehrere Beispiele, dass Triterpene generell eine Tendenz zur Bildung

fadenförmiger Wachskristalle aufweisen, die in Form und Dimension denen auf Rizinus-

Sprossoberflächen gleichen:

(1) Die glauke Erscheinungsform von Dudleya brittonii (Crassulaceen), die durch

fadenförmige epikutikuläre Wachskristalle verursacht wird, zeigt hohe Konzentrationen

von β-Amyrinacetat im Wachsgemisch (Manheim und Mulroy 1978).

(2) Die fadenförmigen Wachskristalle auf den Wedeln von Farnen der epiphytischen

Gattung Belvisia werden durch das Triterpenoid Fernen gebildet (R. Jetter, unveröffent-

lichte Daten).

(3) Die Sprossachsen der Ameisenpflanzen aus der Gattung Macaranga sind mit

fadenförmigen Wachskristallen bedeckt. Bei allen

bereiften Macaranga-Arten machen Triterpene

mehr als 50% des Gesamtwachses aus

(Markstädter et al. 2000).

Abbildung 4-1: Fadenförmige Wachskristalle auf Spross-achsenoberflächen von Macaranga tanarius. Die Kristalle bestehen aus dem Triterpen β-Amyrin (Guhling 2002).

Wichtige Kontrollversuche bei der Erforschung der Beteiligung einzelner Verbindungen

an der Bildung von Wachskristallen stellen in vitro-Rekristallisationen von Lösungen

entsprechender Reinsubstanzen dar. Bei solchen Untersuchungen konnte die spontane

Ausbildung von Kristallen dokumentiert werden, die denen auf nativen Pflanzenoberflächen

in Form, Größe und Anordnung zueinander sehr ähnlich sind (Meusel et al. 1999). Im Falle

von Triterpenen (β-Amyrin, Taraxeron und Epitaraxerol) wurde bei in vitro-Rekristalli-

sierungen konsequenterweise die Bildung fadenförmiger Kristalle beobachtet (R. Jetter,

unveröffentlichte Daten). Dieser Befund untermauert die These, dass sich hohe Triterpen-

anteile im kutikulären Wachs in der Ausbildung epikutikulärer fadenförmiger Wachskristalle

an der Kutikulaoberfläche äußern, wie sie als Folge der Lupeolanreicherung auf den Rizinus-

Sprossoberflächen des Glaucous-Phänotyps entstehen.

Im Gegensatz zum deutlichen Unterschied im Triterpenprofil in beiden Sprossachsen-

Erscheinungsformen zeigen die Rizinus-Phänotypen in der qualitativen Zusammensetzung

ihres aliphatischen Wachsprofils durchaus Übereinstimmungen. VLC-Aliphaten sind jeweils

in Form homologer Reihen von n-Alkanen, Aldehyden, primären Alkoholen, Fettsäuren und

1,3-Alkandiolen mit jeweils ähnlichen Kettenlängenverteilungen vertreten und ähneln damit

dem aliphatischen Wachsprofil, das für Ricinus communis-Blattoberflächen beschrieben

wurde (Vermeer et al. 2003). Lediglich 3-Hydroxyaldehyde lassen sich im Wachs 67 Tage

alter Hypokotyle nicht nachweisen, im Gegensatz zu ihrem Vorkommen in der Blatt-Kutikula.


In der quantitativen Zusammensetzung ihrer aliphatischen Wachsbestandteile sind

jedoch deutliche Unterschiede zwischen den Phänotypen erkennbar: Während bei Individuen

des Glossy-Phänotyps Fettsäuren dominieren, stellen Aldehyde und n-Alkane die

aliphatischen Hauptklassen bei Individuen des Glaucous-Phänotyps. Der niedrigere Anteil an

freien VLC-Fettsäuren bei glauken Pflanzen könnte durch die Tatsache erklärt werden, dass

ein großer Teil der VLC-Fettsäuren als Triterpenol-Ester gebunden wird. Solche

Verbindungen konnten in entsprechenden Extraktionen zwar bei den massenspektro-

metrischen Untersuchungen detektiert, aufgrund ihres hohen Molekulargewichtes jedoch

nicht quantitativ ausgewertet werden. Die Substanzklasse der primären Alkohole schließlich

war in beiden Phänotypen in gleichen absoluten Mengen vertreten.

Die Unterschiede zwischen beiden Phänotypen bezüglich der VLC-aliphatischen

Verbindungen demonstrieren, dass die Phänotypen nicht alleine durch eine drastisch

unterschiedliche Triterpen-Biosynthese gekennzeichnet sind, sondern auch in ihrem

aliphatischen Wachsprofil differieren. Der zweitgenannte Effekt ist möglicherweise auf eine

differenzielle Regulation der verschiedenen aliphatischen Biosynthesewege zurückzuführen.

Eine alternative Erklärung wäre, dass die quantitativen Unterschiede in den VLC-Aliphaten

lediglich auf einer jeweils unterschiedlichen passiven Selbstorganisation der entsprechenden

Substanzen in der Kutikula basieren. Welche der beiden Möglichkeiten zutrifft, kann auf der

Grundlage der Daten nicht entschieden werden.

Die Rizinus-Phänotypen differieren in ihrer Wachszusammensetzung, wie in der

vergleichenden chemischen Analyse gezeigt, sehr eklatant. Mit ihrer unterschiedlichen

chemischen Zusammensetzung besonders in der Lupeolakkumulation stellen die Hypokotyle

der beiden Phänotypen von Ricinus communis ein ideales Modellsystem zur Untersuchung

der Biosyntheseregulation kutikulärer Triterpene auf molekularer Ebene dar.

4.1.2 Die Schichtung der Kutikula bei Ricinus communis

Die Abhebeversuche an 67 Tage alten Rizinus-Hypokotylen zeigten, dass der größte

Mengenanteil an kutikulärem Wachs bei beiden Sprossachsen-Phänotypen von Ricinus

communis epikutikulär exponiert wird: ca. 95% des Gesamtwachses bei Individuen des

Glossy-Phänotyps bzw. ca. 85% beim Glaucous-Phänotyp lassen sich als Ergebnis der

mechanischen Abhebeversuche als epikutikuläres Wachs ansprechen. In der qualitativen

Zusammensetzung ergeben sich beim Glaucous-Phänotyp kaum gravierende Unterschiede.

Triterpene und im Besonderen Lupeol dominieren sowohl das intra- wie auch das

epikutikuläre Wachsgemisch, wobei der relative Anteil an Lupeol im epikutikulären Wachs

mit ca. 40% geringer ist als im intrakutikulären Wachs mit 55%. Dabei könnte es sich


allerdings um einen Artefakt-Effekt handeln: Bei den Abhebeversuchen wurden die

Hypokotyle teilweise auch im untersten Bereich beprobt. Gerade hier war die Wachskristall-

schicht allerdings nicht mehr vollständig intakt, teils durch mechanischen Abrieb. Geht man

davon aus, dass die Kristalle mehr Lupeol als die anderen Wachskompartimente

(epikutikulärer Wachsfilm und intrakutikuläre Wachse) aufweisen, dürfte der Anteil an Lupeol

am epikutikulären Wachsgemisch in oberen Sprossachsenbereichen, an denen der

epikutikuläre Wachskristall-Überzug unbeschädigt bleibt, deutlich höher liegen.

Hohe relative Anteile von Triterpenen im intrakutikulären Wachs des Glaucous-

Phänotyps führen dazu, dass in diesem bereits weitgehend mit zyklischen Verbindungen

gesättigten Kompartiment VLC-aliphatische Verbindungen nur noch begrenzt eingelagert

werden. Die größeren Quantitäten an Aliphaten akkumulieren demzufolge im epikutikulären

Wachskompartiment.

Die epikutikuläre Akkumulation von Lupeol beim Glaucous-Phänotyp legt den Schluss

nahe, dass die fadenförmigen epikutikulären Wachskristalle auf Sprossachsen und

Blattstielen hauptsächlich aus Lupeol bestehen, und erhärtet somit die Schlussfolgerung, die

bereits aus der chemischen Analyse des Gesamtwachses gezogen wurde. Neben Lupeol

sind jedoch auch eine ganze Reihe anderer Verbindungen, darunter die VLC-Aliphaten, im

epikutikulären Wachskompartiment vertreten. Nicht die gesamte Masse der epikutikulären

Wachskomponenten ist den Kristallen zuzuordnen, da ein Teil der Substanzen im

epikutikulären Wachsfilm lokalisiert ist, bzw. diesen Film bildet. Ein Teil der Stoffe, die

zusäztlich zu Lupeol in der epikutikulären Wachsfraktion der Individuen des Glaucous-

Phänotyps angereichert sind, ist wohl im amorphen Film unmittelbar an der Außenseite der

Kutinmatrix lokalisiert. Der andere Teil dieser Komponenten könnte neben dem

dominierenden Bestandteil Lupeol ebenfalls in den epikutikulären Kristallen zu finden sein,

da diese das wesentliche Volumen der epikutikulären Wachse ausmachen. Die vorliegende

Analyse für die mechanisch präparierten Wachse stellt in jedem Fall eine direkte Evidenz für

die Kristallzusammensetzung dar.

Eine ausgeprägte chemische Schichtung weist die Kutikula der Sprossachsen des

Glossy-Phänotyps auf. Während die Zusammensetzung des epikutikulären Wachses hier

durch die Dominanz von VLC-aliphatischen Verbindungen, allen voran von Fettsäuren mit

75%, bestimmt wird, können in der intrakutikulären Wachsmischung keine langkettigen

Fettsäuren detektiert werden. Vielmehr wird das in die Kutinmatrix eingelagerte Wachs von

hohen relativen Triterpen-Anteilen (40% des intrakutikulären Wachses) geprägt, daneben

sind homologe Reihen von Aldehyden, n-Alkanen und primären Alkoholen vertreten.


In den vergangenen Jahren wurde durch die Entwicklung entsprechender Methoden, die

allesamt auf einer Kombination von extraktiven Verfahren mit Techniken zur selektiven

mechanischen Beprobung der epikutikulären Wachsbestandteile beruhen, für einige

Pflanzenarten die quantitative Verteilung der kutikulären Wachse auf das epi- bzw.

intrakutikuläre Kompartiment untersucht (Tab. 4-1). Dabei zeigte sich eine große Bandbreite

an Verteilungen der Wachskomponenten auf die jeweiligen Kutikula-Kompartimente:

Während bei Lorbeerkirsche und Tomate der überwiegende Teil der Wachse intrakutikulär

eingelagert ist, wird bei Erbse und der Kannenpflanze Nepenthes der größte Teil der

Wachse epikutikulär an der unmittelbaren Oberfläche exponiert. Auch die Zusammensetzung

der jeweiligen Wachsgemische ist teilweise sehr unterschiedlich. So liegt beispielsweise das

C30-Aldehyd Triacontanal im epikutikulären Wachs von Nepenthes alata in weit größeren

relativen Mengen vor als im intrakutikulären Wachs, was letztlich zur Identifizierung dieser

Komponente als Hauptkristallbildner in den Kannen führte.

Tabelle 4-1: Bisherige Untersuchungen zur chemischen Schichtung der pflanzlichen Kutikula unter besonderer Berücksichtigung kutikulärer Triterpene.

Pfla

nzen

art

unte

rsuc

hte

Obe

rfläc

he

Epi

kutik

ulär

er

Wac

hsan

teil

[% G

esam

twac

hs]

Trite

rpen

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il [%

Ges

amtw

achs

]

Trite

rpen

e nu

r in

traku

tikul

är

ange

reic

hert

Ref

eren

z

Pisum sativum

Blatt- oberseite 75 --

Gniwotta et al. 2005

Taxus baccata

Nadel- unterseite 55 -- Wen et al. 2006

Prunus laurocerasus

Blatt- oberseite 45 20 X Jetter et al. 2000

Nepenthes alata

Kannen- innenseite 65 1 X Riedel et al. 2003

Lycopersicon esculentum Frucht 30 20 X Vogg et al. 2004

Macaranga tanarius

Blatt- oberseite 85 15 X Guhling et al. 2005

Macaranga tanarius Blattstiel 85 85 Guhling 2002

Ricinus communis Glossy-Phänotyp

Spross- achse 95 2 X

Ricinus communis Glaucous-Phänotyp

Spross- achse 85 70

Bei Ricinus communis korreliert das epikutikuläre Vorkommen von Lupeol auf

Sprossachsen des Glaucous-Phänotyps mit großen Mengenanteilen dieser Substanzen im

Gesamt- wie auch im intrakutikulären Wachs. Ist Lupeol dagegen nur mit geringeren Mengen

im Gesamtwachs vertreten, wie dies beim Glossy-Phänotyp der Fall ist, wird diese


Verbindung nicht epikutikulär exponiert, sondern fast ausschließlich als intrakutikuläre

Wachskomponente in die Kutin-Matrix eingelagert. Hier bestimmen große Mengen an

unpolaren Fettsäuren die epikutikuläre Wachsmischung.

Das Phänomen, dass Triterpene im intrakutikulären Kompartiment angereichert werden

und nur dann in größeren Mengen epikutikulär in Erscheinung treten, wenn sie die

dominierende Substanzklasse im Gesamtwachs stellen, lässt sich auch bei anderen

Pflanzenarten beobachten. Eine ausgeprägte intrakutikuläre Anreicherung von Triterpenen

wurde für Blattoberflächen von Prunus laurocerasus und Macaranga tanarius sowie für

Früchte von Lycopersicon esculentum ermittelt (Tab. 4-1). In allen drei Fällen überschreitet

der Mengenanteil der Triterpene am Gesamtwachs dabei nicht 20%. Im Falle von

Macaranga tanarius-Blattstielen dagegen ist das Triterpenol β-Amyrin in großen Mengen im

Gesamtwachs vertreten und findet sich dementsprechend in hohen relativen Anteilen im

intra-, aber auch im epikutikulären Wachs.

Es stellt sich die Frage, ob die unterschiedliche Zusammensetzung epi- und intra-

kutikulärer Wachse, also die Differenzierung innerhalb der Kutikula bezüglich der Zu-

sammensetzung ihrer Wachskomponenten, aktiv von der Pflanze gesteuert wird oder rein

passiv zustande kommt. Grundsätzlich wäre denkbar, dass die unterschiedliche chemische

Zusammensetzung der Kutikula-Kompartimente, durch eine Bildung der verschiedenen

Schichten vermittelt, über die zeitlich gestaffelte Einlagerung der einzelnen Verbindungen im

Laufe der Ontogenese zustande kommt. Im Falle von Prunus laurocerasus-Blättern, bei

denen epikutikulär ausschließlich VLC-aliphatische Verbindungen exponiert werden,

während intrakutikulär Triterpene angereichert vorliegen, würde dieser Erklärungsansatz

bedingen, dass im Laufe der Blattentwicklung zuerst die aliphatischen Komponenten zum

epikutikulären Wachsfilm akkumulieren und danach erst die Triterpene in der tiefer liegenden

intrakutikulären Schicht eingelagert werden. In entsprechenden Untersuchungen wurde

jedoch gezeigt, dass die epikutikuläre Wachszusammensetzung im Laufe der Blattent-

wicklung ständigen Veränderungen unterliegt, während die intrakutikuläre Wachszusammen-

setzung mit den hohen Triterpenanteilen bereits sehr früh ausgeprägt wird und konstant

bleibt (Jetter und Schäffer 2001). Bei P. laurocerasus-Blättern ist die chemische Schichtung

in der Kutikula demnach nicht eine Folge der zeitlich hintereinander gereihten Ablagerung

einzelner Verbindungen/Verbindungsklassen im Laufe der Entwicklung, sondern vielmehr als

Folge der Diffusion und der spontanen räumlichen Trennung der Stoffe zu interpretieren.

Möglicherweise zeigen Triterpene auf Grund ihrer besonderen Molekülgeometrie und vor

allem ihrer Polarität eine höhere Affinität zu Kutin als die weniger polaren VLC-aliphatischen

Verbindungen und bleiben deshalb in der Kutikularmembran gebunden, während die

aliphatischen Wachsbestandteile vermehrt epikutikulär angereichert werden. Erst wenn eine

bestimmte Menge an Triterpenen in Form eines Schwellenwertes überschritten wird und in


das intrakutikuläre Kompartiment keine weiteren Mengen mehr eingelagert werden können,

gelangen diese Substanzen an die Kutikulaoberfläche. Aus den bisher veröffentlichten Daten

kann als Anhaltspunkt für eine quantitative Bestimmung dieses Schwellenwertes abgeleitet

werden: Zu einer nennenswerten epikutikulären Anreicherung von Triterpenen kommt es nur

dann, wenn der Triterpenanteil am Gesamtwachs die Menge der intrakutikulär lokalisierten

Wachsmenge überschreitet. Entsprechend finden sich im epikutikulären Wachs von Früchten

der transgenen lecer6-Transposon-Mutante von Lycopersicon esculentum keine Triterpen-

Verbindungen, obwohl der Triterpenanteil am Gesamtwachs mit 40% beträchtlich ist (Vogg

et al. 2004); bei Tomatenfrüchten sind nämlich 70% der Wachskomponenten intrakutikulär

verortet (s. Tab. 4-1), so dass die Triterpenmenge in diesem Fall also nicht ausreicht, um das

intrakutikuläre Kompartiment zu sättigen und damit den Schwellenwert für eine epikutikuläre

Anreicherung zu erreichen.

Zur spontanen Bildung von Triterpen-Wachskristallen an der Oberfläche dürfte es

vermutlich erst dann kommen, wenn der Anteil der kristallbildenden Triterpen-Kompo-

nente(n) im epikutikulären Wachsgemisch einen weiteren Schwellenwert überschreitet, wie

im Falle von Lupeol bei glauken Ricinus-Sprossachsen. Dabei bleibt unklar, ob bei diesem

zweiten Schwellenwert die absolute Menge der kristallbildenden Substanz oder ihr relativer

Anteil am epikutikulären Wachs die entscheidende Größe darstellt, oder ob eine Kombination

beider Faktoren Voraussetzung für die spontane Kristallbildung ist. Entsprechende Daten

von R. communis und M. tanarius liegen jeweils zwischen 40% und 64% bzw. 23 und 11 µg

cm-2.

Eine weitere Fragestellung bezieht sich auf die Bedeutung einer unterschiedlichen

Zusammensetzung epi- und intrakutikulärer Wachse für mögliche physiologische oder

ökologische Funktionen einer solchen Schichtung. Kutikuläre Wachse bilden die

Hauptbarriere für den Transport von Wasser durch die Kutikula (Riederer und Schreiber

1995). Obwohl sich zahlreiche Untersuchungen in der Vergangenheit zum Ziel gesetzt

haben, Zusammenhänge zwischen der Struktur der Kutikula und ihren Eigenschaften

bezüglich des Transpirationsschutzes herzustellen, konnten entsprechende allgemeingültige

Regelhaftigkeiten nicht hinreichend abgeleitet werden. Eine Korrelation zwischen der

quantitativen und qualitativen Wachszusammensetzung oder der Dicke der Kutikula mit ihrer

Durchlässigkeit für Wasser konnte beispielsweise bislang nicht experimentell nachgewiesen

werden (Riederer und Schreiber 2001). Die selektive Entfernung epikutikulärer Wachse bei

Früchten von Prunus avium zeigte, dass die epikutikulären Wachse 72% zum Widerstand für

die Permeabilität von Wasser durch die Kutikula hindurch beitragen (Knoche et al. 2000). Im

Gegensatz dazu wurden jedoch an Tomatenfrüchten Daten ermittelt, die darauf hindeuten,

dass das intrakutikuläre Kompartiment deutlich mehr zur Transpirationsbarriere-Eigenschaft

beiträgt als die epikutikulären Wachse (Vogg et al. 2004). Aus der Reduzierung der Anteile


von VLC-aliphatischen Wachsverbindungen um 50% im Gesamtwachs bei der Tomaten-

Mutante lecer6 resultierte eine vierfach erhöhte Wasserpermeabilität der Kutikula (Vogg et

al. 2004).

Der momentane Forschungsstand führt zu der Hypothese, dass die kutikulären Barriere-

eigenschaften zum größten Teil den VLC-aliphatischen Wachskomponenten zuzusprechen

sind, die durch die Ausbildung kristalliner Strukturen - sei es in Form epikutikulärer

Wachskristalle oder kristalliner Bereiche im epikutikulären Wachsfilm bzw. im intrakutikulären

Kompartiment - eine Permeation von Wassermolekülen verhindern. Vermutlich könnte eine

reduzierte Einlagerung zyklischer Wachskomponenten wie Triterpene im epikutikulären

Wachskompartiment, die gleichzeitig eine Anreicherung von langkettigen aliphatischen

Verbindungen nach sich zieht, den Anteil hochgeordneter, kristalliner Bereiche langkettiger

Verbindungen in der oberflächennahen Kutikulaschicht erhöhen. Dies würde letztlich zu einer

Optimierung des Transpirationsschutzes durch die Kutikula beitragen.

Daneben könnte die chemische Schichtung ökologische Bedeutung im Zusammenhang

mit der Erkennung spezifischer Pflanzenoberflächen durch Insekten und phytotrope Pilze

(Jetter et al. 2000), oder aber in speziellen Fällen als Schutz vor Herbivoren durch die

Schaffung rutschiger Oberflächen haben (siehe 4.1.4).

4.1.3 Dynamik der kutikulären Wachszusammensetzung während früher Stadien der Hypokotyl-Entwicklung

Um ein tieferes Verständnis für die Dynamik der Wachsbiosynthese während der frühen

Entwicklungsphase der Sprossachsen zu erhalten, wurde neben den chemischen Analysen

zusätzlich das Wachstum und die Ausdehnung der Hypokotyloberflächen der Individuen

vermessen, indem Länge und Durchmesser der Hypokotyle während der ersten 70 Tage

aufgenommen wurden (n=28). Die entsprechenden Rohdaten wurden von Frau Barbara Hobl

im Rahmen ihrer Diplomarbeit, die in enger Kooperation mit der vorliegenden Arbeit ent-

stand, ermittelt (Hobl 2005) und werden im Folgenden zusammengefasst und interpretiert.

Zwischen beiden Kutikula-Phänotypen konnten keine Unterschiede im Wachstum der

Hypokotyle festgestellt werden; die Daten wurden deshalb einheitlich ausgewertet. Das

Längenwachstum der Hypokotyle ist bereits nach zwölf Tagen weitgehend abgeschlossen,

die Sprosslänge nimmt ab diesem Zeitpunkt nur noch sehr geringfügig zu und bleibt danach

konstant zwischen ca. 13 und 14 cm (Abb. 4-2A). Das Dickenwachstum der Hypokotyle

steigert sich dagegen von Beginn bis zum Ende des Messzeitraums linear mit

gleichbleibender Rate von 2 mm auf 9 mm. Durch die Kombination der beiden Größen lässt

sich die Zunahme der gesamten Hypokotyloberfläche während der frühen Entwicklungs-

phase ermitteln. Diese Zunahme wird in zwei Phasen untergliedert, repräsentiert durch

lineare Regressionsgeraden, von der jede die Wachstumsrate während der jeweiligen


Wachstumsphase wiedergeben soll (Abb. 4-2B). Daraus ergibt sich eine Flächenzunahme

von ca. 140 mm2 d-1 bis zum Tag 12, danach eine tägliche Zunahme von ca. 40 mm2.

Zusätzlich zu den Beobachtungen zur Flächenzunahme erfolgte durch Frau Hobl eine

mikroskopische Untersuchung der Zelldichte im Laufe der Hypokotylentwicklung mit Hilfe von

Nagellackabdrücken. Dadurch sollten Anhaltspunkte gewonnen werden, ob das Wachstum

durch Zellstreckung, Zellteilung, oder durch eine Kombination aus beiden Prozessen

erfolgte. Die epidermale Zelldichte des Hypokotyls liegt zu Beginn der Entwicklung am Tag 6

bei über 350 000 Zellen cm-2, nimmt jedoch sehr bald ab und pendelt sich nach wenigen

Tagen auf einen Wert zwischen 80 000 und 150 000 Zellen cm-2 ein. Auch bei der

Entwicklung der Zelldichte lässt sich also eine sehr frühe Entwicklungsphase von einer

zweiten Phase abgrenzen, graphisch wiederum durch zwei Regressionsgeraden angedeutet

(Abb. 4-2C). Diese Beobachtung wird hier dahingehend interpretiert, dass der Vorgang des

Hypokotyl-Längenwachstums im Wesentlichen durch ein longitudinales Streckenwachstum

der Zellen bewerkstelligt wird. Die Dickenzunahme der Hypokotyle dagegen resultiert aus

einer mehr oder minder kontinuierlichen Zellteilung. Leider wurden während des frühesten -

und damit für unsere Fragestellung interessantesten - Zeitraums zu wenige Daten zur

Zelldichte erhoben, so dass diese Interpretation durch weitere Untersuchungen stichhaltig

untermauert werden müsste.

Aus den ermittelten Daten der Hypokotyloberfläche bzw. der Zelldichte lassen sich nun

Werte für die Wachsbelegung pro Hypokotyl beziehungsweise Wachsbelegung pro

Epidermiszelle im Laufe der frühen Hypokotylentwicklung ableiten (Abb. 4-3). Beim Glossy-

Phänotyp setzt eine wesentliche Zunahme der Wachsbelegung erst nach Tag 25 ein; bis zu

diesem Zeitpunkt nimmt die Belegung pro Hypokotyl lediglich von 30 auf 90 µg zu. Zwischen

Tag 25 und Tag 67 verfünffacht sich die Menge an Wachskomponenten schließlich auf 460

µg/Hypokotyl. Ein ähnliches Bild ergibt sich bei der Kalkulation der Wachsbelegung pro

Epidermiszelle. Auch hier nimmt die Wachsbelegung zunächst nur mäßig zu (von ca. 0,01

ng/Zelle an Tag 6 auf ca. 0,03 ng/Zelle an Tag 25), bevor sie bis auf etwa 0,1 ng/Zelle an

Tag 67 ansteigt. Beim Glaucous-Phänotyp dagegen lässt sich bereits zwischen Tag 6 und 25

ein starker Anstieg der Wachsbelegung beobachten: sie steigt mit einer täglichen Rate von

45 µg pro Hypokotyl von 90 auf 960 µg/Hypokotyl. Mit 40 µg pro Hypokotyl und Tag lässt

sich zwischen Tag 25 und 67 eine ähnliche Zunahme des Gesamtwachses feststellen, bis

die Wachsbelegung auf 2,6 mg/Hypokotyl ansteigt. Die Wachsbelegung pro Epidermiszelle

verachtfacht sich im frühen Zeitintervall zwischen Tag 6 und 25 von 0,04 ng/Zelle auf 0,34

ng/Zelle, während sie sich zwischen Tag 25 und Tag 67 nicht einmal verdoppelt. Die

Biosyntheserate kutikulärer Wachsverbindungen dürfte demnach beim Glaucous-Phänotyp

in der frühen Phase der Hypokotylentwicklung gegenüber der späteren Entwicklungsphase

deutlich erhöht sein.


Abbildung 4-2: Wachstumsbeobachtungen an Hypokotylen von Ricinus communis in der frühen Entwicklungsphase. Die gestrichelte Linie markiert das Ende des Hypokotyl-Längenwachstums. A: Längen- und Dickenwachstum. B: Hypokotylober-fläche. Die Geraden (lineare Regression) repräsentieren die durchschnittliche Entwicklung der Hypokotyloberfläche vor und nach Beendigung des Längenwachs-tums. C: Zelldichte. Auch hier markieren lineare Regressionsgeraden die durchschnittliche Entwicklung der Zelldichte.

Alter [Tage]

0 10 20 30 40 50 60

Hyp

okot

yllä

nge

[cm

]

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Hyp

okot

yldu

rchm

esse

r [m

m]

0

5

10

15

20

Alter [Tage]

0 10 20 30 40 50 60

Hyp

okot

ylob

erflä

che

[cm

2 ]

0

10

20

30

40

Alter [Tage]

0 10 20 30 40 50 60

Zelld

icht

e [c

m-2

* 10

3 ]

0

100

200

300

400

y=0,41 x + 13,0

y=1,42 x + 0,6

y=-220,2 x + 126460

y=-20504 x + 371504

A

B

C


Abbildung 4-3: Akkumulation kutikulärer Wachse pro Hypokotyl bzw. pro Epidermiszelle in den ersten 67 Tagen der Hypokotylentwicklung.

In beiden Rizinus-Stammphänotypen lässt sich ein wesentlicher Anstieg der

Akkumulation von VLC-aliphatischen Verbindungen pro Flächeneinheit erst nach Tag 18

beobachten (Abb. 4-4). Dabei scheint die Einlagerung der Aliphaten bei Hypokotylen des

Glaucous-Phänotyps etwas früher einzusetzen als beim Glossy-Phänotyp. In dem

Zeitintervall, in dem die Oberflächenzunahme wesentlich auf das Längenwachstum der

Hypokotyle bzw. auf Zellstreckung zurückzuführen ist, bleibt die Wachsbelegung pro

Epidermiszelle weitgehend konstant. Erst danach wird durch eine erhöhte Biosyntheserate

aliphatischer Stoffe die Einlagerung dieser Verbindungen in die Kutikula der Zellen erhöht. In

der Akkumulation der aliphatischen Stoffe spiegelt sich der Effekt wieder, der oben bei der

Gesamtwachsbelegung beim Glossy-Phänotyp beschrieben wurde, da die chemische

Alter [Tage]

0 10 20 30 40 50 60 70

Wac

hsbe

legu

ng/Z

elle

[ng]

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8GlossyGlaucous

Alter [Tage]

0 10 20 30 40 50 60 700,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

Alter [Tage]

0 10 20 30 40 50 60 70

Wac

hsbe

legu

ng/H

ypok

otyl

[µg]

0

1000

2000

3000

4000GlossyGlaucous

Alter [Tage]

0 10 20 30 40 50 60 700

100

200

300

400

500

600


Zusammensetzung des kutikulären Wachses hier von VLC-aliphatischen Verbindungen

dominiert wird.

Abbildung 4-4: Akkumulation der VLC-aliphatischen Verbindungen im kutikulären Wachs pro Hypokotyl bzw. pro Epidermiszelle in den ersten 67 Tagen der Hypokotylentwicklung.

Während der frühen Sprossachsenentwicklung kann eine Veränderung im Homologen-

muster der einzelnen Verbindungsklassen beobachtet werden: Fettsäuren mit kürzeren

Kettenlängen akkumulieren nur bis zum Tag 6 (Glossy) bzw. Tag 18 (Glaucous), gefolgt von

der Ausbildung eines Maximums bei C30 in der darauffolgenden Entwicklungsphase. Bei

Aldehyden und primären Alkoholen zeichnet sich ein ähnliches Bild ab. Auch die

Substanzklasse der n-Alkane zeigt eine Verschiebung von kürzeren hin zu längeren

homologen Verbindungen im Laufe der frühen Sprossentwicklung, so dass sich ab Tag 67

ein klares Nonacosan-Maximum ausbildet. Ähnliche Verschiebungen in der

Kettenlängenverteilung aliphatischer Wachskomponenten während der Pflanzenentwicklung

wurden bei entsprechenden Untersuchungen an Prunus laurocerasus beobachtet (Jetter und

Schäffer 2001). Die auch bei Arabidopsis thaliana beobachtete generelle Tendenz zur

Akkumulation längerer Kettenlängenhomologe im kutikulären Wachs im Laufe der

Organentwicklung (Jenks et al. 1996) konnte also bei Ricinus communis-Sprossachsen

bestätigt werden.

Im Gegensatz zu den VLC-aliphatischen Verbindungen setzt die Triterpen-Akkumulation

pro Flächeneinheit bereits in einer sehr frühen Entwicklungsphase der Individuen des

Glaucous-Phänotyps ein. Während Triterpene im Glaucous-Phänotyp im Laufe von 67

Tagen nach der Keimung auf eine absolute Menge von ca. 2600 µg/Hypokotyl im kutikulären

Wachs akkumulieren, bleibt die Menge an Triterpenen im kutikulären Wachs des Glossy-

Phänotyps mit 450 µg/Hypokotyl weitaus geringer (Abb. 4-5). Beim Glaucous-Phänotyp

Alter [Tage]

0 10 20 30 40 50 60 70VL

C-A

lipha

ten/

Zelle

[ng]

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

GlossyGlaucous

Alter [Tage]

0 10 20 30 40 50 60 70

VLC

-Alip

hate

n/H

ypok

otyl

[µg]

0

100

200

300

400

500

600

GlossyGlaucous


Phänotyp nimmt die Triterpen-Wachsbelegung vor dem Tag 25 mit einer Rate von 1,3 µg

cm-2 d-1 zu, bevor die Zunahmerate im nachfolgenden Zeitraum auf 0,4 µg cm-2 d-1 abnimmt.

Zwischen Tag 6 und Tag 25 nimmt die Triterpeneinlagerung also um das 4,5-fache zu,

während sich im Zeitraum danach nur eine 1,5-fache Zunahme beobachten lässt. Bezogen

auf die Belegung pro Epidermiszelle lässt sich zwischen Tag 11 und 18 die höchste tägliche

Triterpen-Zunahme mit 0,019 ng pro Zelle beobachten (Abb. 4-5). Auf die Akkumulation der

Triterpen-Hauptkomponente Lupeol sowie anderer Triterpene wird in 4.2.2.2 gesondert

eingegangen.

Abbildung 4-5: Triterpen-Akkumulation im kutikulären Wachs pro Hypokotyl bzw. pro Epidermiszelle in den ersten 67 Tagen der Hypokotylentwicklung. Während die chemischen Analysen mit sechs Tage alten Pflanzen begonnen wurden, da

sich erst in diesem Alter eine sichere Zuordnung über das makroskopische Erscheinungsbild

der jeweiligen Versuchspflanzen zu einem bestimmten Sprossachsen-Phänotyp gewähr-

leisten ließ, konnten rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen auch mit jüngeren

Pflanzen durchgeführt werden. Es zeigte sich, dass bereits am ersten Tag, an dem Pflanzen

vom Glaucous-Phänotyp das Substrat durchbrechen, schon Bereiche mit Wachsauflagen

existieren, aus denen die ersten Anlagen von Kristallen herausragen (Hobl 2005). Nach drei

Tagen sind lange fadenförmige Kristalle auf der Hypokotyloberfläche des Glaucous-

Phänotyps auszumachen, die bereits teilweise miteinander verschlungen sind. Die Belegung

der Hypokotyloberflächen mit den epikutikulären Wachskristallen wird ab Tag 6 immer

dichter, an Tag 25 ist bereits ein dreidimensionales Netzwerk aus fädigen Kristallstrukturen

erkennbar. Die REM-Aufnahmen bestätigen damit die chemischen Untersuchungen

bezüglich einer sehr frühen Akkumulation des kristallbildenden Triterpens Lupeol.

Alter [Tage]

0 10 20 30 40 50 60 70

Trite

rpen

e/H

ypok

otyl

[µg]

0

1000

2000

3000GlossyGlaucous

Alter [Tage]

0 10 20 30 40 50 60 70

Trite

rpen

e/Ze

lle [n

g]

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

GlossyGlaucous


Übereinstimmend mit dem Befund bei Rizinus-Pflanzen finden sich im kutikulären Wachs

von Tomatenfrüchten in einem frühen Entwicklungsstadium hohe Triterpenanteile, während

im Laufe des Reifungsprozesses der Früchte die prozentualen Triterpenanteile sinken und

aliphatische Substanzklassen überwiegen (Bauer et al. 2004). Darüber hinaus ließen sich

bereits acht Tage nach dem Knospenbruch von Prunus laurocerasus-Blättern hohe

Triterpenkonzentrationen im intrakutikulären Wachs der Kutikula nachweisen (Jetter und

Schäffer 2001). Diese Beobachtungen könnten eine allgemeine Tendenz für eine erhöhte

Triterpen-Biosynthese verbunden mit einem raschen Transport dieser Verbindungen zur

Kutikula zu einem sehr frühen Zeitpunkt der Ontogenese widerspiegeln. Obwohl die

Biosynthese anderer kutikularelevanter Stoffklassen wie VLC-Aliphaten ebenfalls früh in der

Entwicklung starten muss, scheint dies kontinuierlicher und in niedrigeren Raten über den

gesamten Entwicklungszeitraum hin zu geschehen, als es bei der Triterpen-Biosynthese und

der Einlagerung zyklischer Verbindungen in die Kutikula der Fall ist.

4.1.4 Die Biosynthese von kutikulärem Lupeol bei Ricinus communis im ökologi-schen Kontext – das „Greasy-pole-Syndrom“

Die auffällige Ausprägung eines wachsbereiften Ricinus communis-Sprossachsen-

Phänotyps, der durch die verstärkte Biosynthese des Triterpenols Lupeol verursacht wird,

wirft zwangsläufig die Frage nach der Funktion einer solchen Wachsbereifung auf. Einen

möglichen Anknüpfungspunkt für eine entsprechende Interpretation in einem ökologischen

Kontext liefert ein Phänomen, das bei nah verwandten Pflanzen aus der gleichen

Unterfamilie (Acalyphoideae) beobachtet werden kann. An der myrmekophytischen Pflan-

zengattung Macaranga nämlich konnte gezeigt werden, dass epikutikuläre Wachskristalle

auf vertikalen Pflanzenorganen - ähnlich wie bei der Gattung Ricinus handelt es sich um

fadenförmige Kristalle, die aus Triterpenen bestehen (Markstädter et al. 2000) - durch ihre

Rutschigkeit als mechanische Barriere für generalistische Ameisen dienen (Federle et al.

1997).

Um zu überprüfen, ob die bereiften

Sprossoberflächen der Glaucous-Individuen

von Ricinus communis einen rutschigen Effekt

auf generalistische Ameisen bzw. Partner-

ameisen der Gattung Crematogaster haben,

die in der Natur mit Macaranga-Arten verge-

sellschaftet sind, wurden entsprechende Lauf-

tests von Frau Hobl im Rahmen eines Kurz-

praktikums am Institut für Zoologie II der Uni-

versität Würzburg durchgeführt. Die Ergeb-

Abbildung 4-6: Crematogaster (Decacrema)Msp. 4 auf der wachskristallfreien Fläche einer Rizinuspflanze des Glaucous-Phänotyps.


nisse dieser Versuche sollen im Folgenden dargestellt werden. Als Wachsläufer-Ameisen

wurde für die Versuche Crematogaster (Decacrema) Msp 2, als Nichtwachsläufer-Ameisen

Crematogaster Msp 4 verwendet. Auf der Sprossoberfläche von Glaucous- sowie Glossy-

Individuen wurden jeweils in der Mitte eines Internodiums die Wachskristalle bzw. der

Wachsfilm abgerieben und auf dieser wachsfreien Fläche die Ameisen abgesetzt (Abb. 4-6).

In den nun folgenden Lauftests wurden als „erfolgreiche“ Ameisen diejenigen Individuen

gezählt, die in der Lage waren, innerhalb eines Zeitraums von 10 min das nach oben oder

nach unten nächstgelegene Nodium (jeweils 3-4 cm) zu erreichen. Als „nicht erfolgreich“

wurden diejenigen Ameisen kategorisiert, die vor dem Erreichen des Nodiums von der

Sprossachse abgefallen waren oder den wachskristallfreien Bereich während der Messzeit

nicht verlassen hatten. Während sich auf den Oberflächen der Glossy-Individuen alle

Ameisen frei bewegen konnten, zeigten sich bei den Versuchen auf Glaucous-Individuen

deutliche Unterschiede zwischen den Ameisen der Morphospezies 2 und 4. Die meisten

Individuen der Nichtwachsläufer-Ameisen (Msp. 4) fanden bereits nach meist sehr kurzen

Strecken keinen Halt mehr an den Sprossachsen und stürzten ab. Dagegen war es den

Wachsläufer-Ameisen möglich, scheinbar ohne Probleme über die wachsbereifte Oberfläche

zu laufen (Abb. 4-7A). Wachsläufer konnten demnach hoch signifikant besser auf der

kristallbereiften Oberfläche von R. communis laufen als die Nichtwachsläufer-Ameisen

(Fishers exakter Test: p<0,001). Allerdings waren sie auf der wachsbereiften Oberfläche um

viele Sekunden langsamer als auf der Oberfläche der Glossy-Pflanzen (Abb. 4-7B).

Abbildung 4-7: Ergebnisse der Lauftests mit Wachsläufern sowie Nichtwachsläufern der Gattung Crematogaster auf beiden Sprossachsen-Phänotypen von Ricinus communis. A: erfolgreiche Ameisen beim Erreichen des nächsten Nodiums (jeweils n=15). B: Zeit bis zum Erreichen des Nodiums (angegeben sind Median mit 1. und 3. Quartile).

erfo

lgre

iche

Am

eise

n [%

]

0

20

40

60

80

100

Msp 2 auf Glaucous

Msp 2 auf Glossy

Msp 4 auf Glaucous

Msp 4 auf Glossy

Zeit

zum

Err

eich

en d

es N

odiu

ms

[s]

0

50

100

150

200

250

Msp 2 auf Glaucous

Msp 2 auf Glossy

Msp 4 auf Glossy

A B


Die Untersuchungen zeigen, dass die Ausbildung einer epikutikulären Wachs-

kristallschicht auf den Sprossachsen von glauken Rizinus-Pflanzen tatsächlich eine

Rutschigkeit für Insekten bewirkt. Darüber hinaus wird von diesen Sprossoberflächen eine

Umgebung kreiert, die der Situation an Sprossachsen von obligat myrmekophytischen

Macaranga-Arten entspricht, obwohl es sich bei dem kristallbildenden Triterpen um Lupeol

und nicht um Taraxeron oder Epitaraxerol handelt.

Einige der Versuchstiere wurden für rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen

direkt nach den Lauftests betäubt, fixiert, gefroren und getrocknet. An den Tarsen der

Wachsläufer-Arten waren bei den anschließenden mikroskopischen Untersuchungen keine

Kristallstrukturen erkennbar. An den Tarsen der Nichtwachsläufer-Ameisen fanden sich

dagegen Strukturen, die den epikutikulären Wachskristallen auf glauken Rizinusoberflächen

ähnlich sahen. Darüber hinaus waren vor allem an den Haftblasen sehr viele Kristalle

nachzuweisen, die hier den Anschein hatten, etwas angelöst zu sein (Abb. 4-8). Auch an den

Krallen des hinteren Beinpaares fanden sich Kristalle, die noch das Aussehen der nativen

Kristalle auf der Pflanzenoberfläche hatten, also vermutlich nicht abgelöst, sondern

abgerissen worden waren. Bei einer rasterlektronenmikroskopischen Betrachtung von

„begangenen“ Pflanzenoberflächen von Ricinus communis des Glaucous-Typs waren sehr

vereinzelt runde oder ovale Abdrücke zu erkennen, die als „Spuren“ der Ameisen interpretiert

wurden. Dabei schienen hier die Kristallfäden eher angedrückt als abgerissen zu sein.

20 µm 10 µm

A B

Abbildung 4-8: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen der Haftstrukturen einer Nichtwachsläufer-Ameise nach dem Lauftest auf einem Individuum des Glaucous-Phänotyps von Ricinus communis. A: Tarse mit verklebten Wachskristallen auf dem Haftlappen. B: Kralle mit anhaftenden Wachskristallen.


Ameisen verwenden zum Laufen auf rutschigen Oberflächen neben den stark skleroti-

sierten Krallen spezielle Haftorgane, die sich am Ende jedes Tarsus zwischen den beiden

Krallen befinden und den Kontakt zum Substrat durch oberflächenaktive Ausscheidungen

optimieren, indem diese Substanzen die Kräfte zwischen Insektenfuß und Substrat durch

molekulare Adhäsion und die Oberflächenspannung eines dünnen Flüssigkeitsfilms

vermitteln (Federle et al. 2001). Möglicherweise entscheidet die Zusammensetzung dieser

Haftflüssigkeit über die Fähigkeit einer Ameisenart, auf wachsbereiften Oberflächen laufen

zu können. Unklar ist allerdings, ob Ameisen aufgrund der hydrophoben Eigenschaft der

epikutikulären Wachse bei dem Versuch, mit Hilfe der Haftflüssigkeit an vertikalen

Pflanzenoberflächen zu haften, ausrutschen, oder ob die Kristalle abreißen und dabei die

Haftorgane der Ameisen verkleben.

Eventuell werden bei Crematogaster Msp 4 durch die von der Haftblase abgegebene

Haftflüssigkeit Wachskristalle von der Rizinus-Sprossachsenoberfläche abgelöst und

verkleben daraufhin das Haftorgan. Das Insekt verliert den Halt und stürzt ab. Die

Wachsläufer-Ameisen dagegen bewerkstelligen es scheinbar, ein Anlösen oder Abreißen der

Kristalle zu verhindern und können sich so relativ sicher auf den kristallbereiften Oberflächen

fortbewegen. Vielleicht liegt die Ursache dafür in einer unterschiedlichen Zusammensetzung

der Haftflüssigkeit. Möglicherweise fehlt den Ameisen der Msp 2 eine Komponente in der

Haftflüssigkeit, die bei den Ameisen der Msp 4 für das Ablösen der Kristalle verantwortlich

ist.

Das allgemeine Phänomen der Rutschigkeit vertikaler Pflanzenoberflächen, verursacht

durch die Ausbildung epikutikulärer Wachskristalle, wird als Schutz von hochgelegenen

Organen wie Blüten und Fruchtständen vor Schadinsekten interpretiert und hat als „Greasy-

pole-Syndrom“ Eingang in die Fachliteratur gefunden (Harley 1991). Im Falle von zahlreichen

Macaranga-Arten erfüllen die Triterpen-Wachskristalle auf den Sprossachsen, die nur von

spezifischen Partnerameisen im Gegensatz zu Generalisten begehbar sind, zusätzlich eine

ökologische Filterfunktion. Auch bei Ricinus communis wird eine mechanische Barriere für

generalistische, nicht aber für „angepasste“ Ameisenspezies aufgebaut. Inwieweit damit eine

tatsächliche biologische Funktion der Kristalle bezüglich eines Fraßschutzes im Sinne des

„Greasy-Pole-Syndroms“ verbunden ist und dem Glaucous-Phänotyp gegenüber dem

Glossy-Phänotyp auf diese Weise ein Vorteil erwachsen würde, kann allerdings nur mit

entsprechenden Kosten-Nutzen-Versuchen mit potenziellen Herbivoren von Ricinus

communis nachgewiesen werden.

4.2 Bedeutung pflanzlicher Triterpensynthasen für die Biosynthese kutikulärer Triterpene 120

4.2 Die Bedeutung pflanzlicher Triterpensynthasen für die Biosynthese kutikulärer pentazyklischer Triterpene

Trotz der relativ großen Zahl klonierter und charakterisierter Triterpensynthasen wurde

über die biologische Funktion dieser Enzyme im Pflanzenorganismus bislang recht wenig

publiziert. Im Wesentlichen beschränken sich entsprechende Veröffentlichungen auf zwei

Untersuchungen, bei denen über die Klonierung und Charakterisierung der Triterpen-

synthasen hinaus auch deren mögliche Funktion innerhalb der Saponinbiosynthese in planta

berücksichtigt wurde: Die β-Amyrinsynthase AsbAS1 aus Avena strigosa ist in die

Biosynthese von Avenacin A-1 (Osbourn et al. 2003), die β-Amyrinsynthase GgbAS1 aus

Glycyrrhiza glabra in die Biosynthese von Soyasaponin involviert (Hayashi et al. 2004;

Hayashi et al. 2001b). Darüber hinaus wurde in Luffa cylindrica-Zellkulturen eine Korrelation

des zeitlichen Expressionsmusters der Isomultiflorenolsynthase mit der entsprechenden

Akkumulation von Bryonolsäure festgestellt (Hayashi et al. 2001a).

Im Zusammenhang mit klonierten und charakterisierten Triterpensynthasen wurde jedoch

bisher nie eine eventuelle Bedeutung dieser Zyklasen für die Biosynthese kutikulärer

Wachskomponenten diskutiert. Für den Nachweis einer solchen Bedeutung müssen die

molekulargenetischen Untersuchungen mit Analysen zur chemischen Zusammensetzung der

kutikulären Wachse kombiniert werden. Von einigen Arten, von denen Triterpensynthasen

charakterisiert wurden, liegen detailierte Untersuchungen zur Chemie kutikulärer Wachse

vor, wie beispielsweise von Arabidopsis thaliana (Aharoni et al. 2004; Suh et al. 2005;

Rashotte et al. 1997) oder Pisum sativum (Gniwotta et al. 2005). Bei diesen Arten spielen

Triterpene als kutikuläre Wachsbestandteile keine Rolle, da sie - wenn überhaupt - nur in

Spuren in der Kutikula vorhanden sind. Bei Medicago truncatula läßt sich β-Amyrin im

kutikulären Wachs zwar nachweisen, doch auch hier nur in geringen relativen und absoluten

Mengen (Zhang et al. 2005). Eine Beteiligung der klonierten Triterpensynthasen aus

Arabidopsis, Erbse und Alfalfa an der Biosynthese kutikulärer Wachskomponenten wird also

kaum anzunehmen sein. Von vielen Pflanzenarten ist die Zusammensetzung der kutikulären

Wachse dagegen bisher nicht untersucht worden, so dass in diesen Fällen über eine

Bedeutung der charakterisierten OSCs für die Bildung kutikulärer Triterpene bei jetzigem

Kenntnisstand keine Aussage getroffen werden kann. Vielversprechende Pflanzenarten, bei

denen die bereits klonierten Triterpensynthasen in direktem Zusammenhang mit der

Biosynthese kutikulärer Wachse stehen könnten, sind Olea europaea (Bianchi et al. 1992),

da in den Früchten hohe Anteile an Triterpensäuren in der Kutikula nachweisbar sind, sowie

Euphorbia tirucalli, da sich die Gattung Euphorbia allgemein durch hohe Anteile kutikulärer

Triterpene auszeichnet (Hemmers et al. 1988).

Mit Ricinus communis und Lycopersicon esculentum wurden in dieser Arbeit erstmals

zwei Arten untersucht, bei denen sich die Produktspezifität und Expressionsdaten der


charakterisierten Triterpensynthasen mit Ergebnissen aus eingehenden chemischen

Wachsanalysen kombinieren lassen.

4.2.1 Biosynthese kutikulärer Triterpene bei Ricinus communis – die Kutikula-relevanz der Lupeolsynthase RcLUS1

4.2.2.1 Das Expressionsverhalten der klonierten Epoxysqualenzyklasen in verschiedenen

Pflanzenorganen

Um die Bedeutung der klonierten Lupeolsynthase RcLUS1 für die Biosynthese kutikulärer

Triterpene beurteilen zu können, war es entscheidend, das Expressionsverhalten von

RcLUS1 in verschiedenen Pflanzenorganen beider Sprossachsenphänotypen zu

untersuchen. Northern-Blot-Versuche zeigten, dass die Lupeolsynthase nur in den

Sprossachsen von Individuen des Glaucous-Phänotyps exprimiert war. Im Glossy-Phänotyp

blieb der Nachweis einer Expression von RcLUS1 dagegen gänzlich aus. Das Genprodukt,

das über die Charakterisierung via heterologe Expression in Hefe nachweislich für die

Biosynthese des Triterpens Lupeol verantwortlich gemacht werden kann, ist also nur in dem

Pflanzenorgan hochreguliert, in dem auch große Mengen an Lupeol im kutikulären Wachs

eingelagert werden. Die RcLUS1-Expression korreliert damit mit der Einlagerung bzw. der

Abwesenheit von Lupeol im kutikulären Wachs der beiden Sprossachsen-Phänotypen.

In den ergänzenden RT-PCR-Versuchen konnte neben diesem Befund zusätzlich ein

schwaches RcLUS1-Signal in Blättern von Individuen des Glaucous-Phänotyps nach-

gewiesen werden. Zwar wurden im Rahmen dieser Arbeit keine chemischen Analysen des

kutikulären Blattwachses von Ricinus communis durchgeführt; frühere Versuche hatten

jedoch gezeigt, dass Lupeol - wenn auch nur in weit geringeren absoluten und relativen

Mengen als in Sprossachsen - als kutikuläre Wachskomponente in Rizinus-Blättern

eingelagert wird (Vermeer et al. 2003). Der Lupeolanteil im Blattwachs des Glaucous-

Phänotyps ist dabei gegenüber dem Anteil des Triterpens am Blattwachs von Individuen des

Glossy-Phänotyps erhöht (P. Nastold und R. Jetter, unveröffentlichte Daten). Das schwache

Expressionssignal im Blattgewebe des Glaucous-Phänotyps korreliert demnach ebenfalls mit

chemischen Analysen zur Zusammensetzung der kutikulären Wachse in diesem Organ.

Aus der Literatur sind einige Expressionsdaten für pflanzliche Triterpensynthasen

greifbar, die zeigen, dass die unterschiedlich starke Expression dieser Enzyme in verschie-

denen Pflanzengeweben durchaus nicht ungewöhnlich ist. Die Expression der β-

Amyrinsynthase AsbAS1 aus Avena strigosa beispielsweise bleibt auf die Wurzeln der

Pflanze beschränkt (Haralampidis et al. 2001), gleiches gilt für die multifunktionale

Triterpensynthase LjAMY2 aus Lotus japonicus (Iturbe-Ormaetxe et al. 2003). Eine

annotierte Lupeolsynthase aus Medicago truncatula wird im Wurzel- und Blattgewebe, nicht

aber in Sprossachsen exprimiert (Iturbe-Ormaetxe et al. 2003). Die β-Amyrinsynthase PSY


aus Pisum sativum ist nur in Sprossachsen und Wurzeln stark exprimiert (Iturbe-Ormaetxe et

al. 2003) und für die β-Amyrinsynthase GgbAS1 lässt sich bei Glycyrrhiza-Keimlingen eine

weit stärkere Expression in Wurzeln und Hypokotylen als in den Kotyledonen nachweisen

(Hayashi et al. 2004).

Im Gegensatz zu RcLUS1 war die Cycloartenolsynthase RcCAS1 konstitutiv in allen

Organen sowohl des Glaucous-, wie auch des Glossy-Phänotyps exprimiert. Auch während

der frühen Hypokotylentwicklung war eine über den gesamten untersuchten Zeitraum relativ

konstante Expression von RcCAS1 in beiden Phänotypen zu beobachten. Diese Ergebnisse

decken sich mit entsprechenden Beobachtungen, die an der Lakritzpflanze gemacht wurden:

In den Glycyrrhiza glabra-Keimlingen wird die Cycloartenolsynthase während den ersten

Tagen nach der Keimung konstant exprimiert (Hayashi et al. 2004). Auch über den

Jahresverlauf hinweg bleibt die Expression der Cycloartenolsynthase in den Hauptwurzeln

der Pflanzen konstitutiv. Schließlich konnte bei Avena strigosa die Expression eines

Cyclartenolsynthase-homologen Gens in allen Pflanzengeweben nachgewiesen werden

(Haralampidis et al. 2001). Cycloartenolsynthasen katalysieren den ersten wichtigen Schritt

im Biosyntheseweg von Phytosterolen, die als Membranbestandteile ubiquitär in pflanzlichen

Geweben vorkommen. Sie sind deshalb als „housekeeping enzymes“ der Pflanzen anzu-

sprechen, im Gegensatz zu Triterpensynthasen, die eine äußerst organspezifische und

entwicklungsabhängige Regulation aufweisen können.

2,3-Oxidosqualenzyklasen spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Isoprenoid-Flusses in den Phytosterol-Biosyntheseweg einerseits und den Triterpen-

Biosyntheseweg andererseits und stehen damit am Scheideweg zwischen Primär- und

Sekundärstoffwechsel der Pflanze. Durch Inhibitor-Versuche mit Oxidosqualen-Analoga

konnte gezeigt werden, dass die spezifische Blockierung der Cycloartenol-Biosynthese zu

einer Akkumulation von Triterpenen auf Kosten von Cycloartenol führt (Taton et al. 1996;

Taton et al. 1992). Die Behandlung von Zellsuspensionen von Tabernaemontana divaricata

mit einem Elicitor bewirkt eine Inhibition der Cycloartenolsynthase, gefolgt von einer

Induktion der Aktivität von Triterpensynthasen (van der Heijden et al. 1989). Auch hier

mündet die Blockierung der CAS also in eine erhöhte Triterpen-Biosynthese.

4.2.2.2 Vergleich der RcLUS1-Expression mit der kutikulären Triterpen-Akkumulation im

Laufe der frühen Hypokotylentwicklung Wie bereits in 4.2.2.1 ausgeführt, korreliert das Expressionsmuster von RcLUS1 in

verschiedenen Pflanzenorganen mit der Akkumulation großer Mengen Lupeol bzw. der

Abwesenheit des Triterpenols im kutikulären Wachs dieser Organe. Ein eingehender

Vergleich der RcLUS1-Expression im Laufe der frühen Hypokotylentwicklung mit den


analytischen Daten zur Triterpen- bzw. Lupeolanreicherung in der Kutikula soll die Relevanz

von RcLUS1 für die Biosynthese kutikulärer Triterpene nun zusätzlich untermauern:

Die Genexpression von RcLUS1 während der frühen Hypokotylentwicklung wurde

sowohl mit Northern-Blot-Analysen, als auch RT-PCR-Versuchen untersucht. Während in

den Pflanzen vom Glossy-Phänotyp erwartungsgemäß keinerlei RcLUS1-Aktivität

detektierbar ist, kann eine Expression von RcLUS1 in Individuen des Glaucous-Phänotyps in

den ersten 50 Tagen der Hypokotyl-Entwicklung nachgewiesen werden, wobei sich ein

Expressionsmaximum an Tag 12 abzeichnet. Wie steht dieser Befund nun im Verhältnis zur

Lupeol-Akkumulation in der Kutikula? Die kutikuläre Anreicherung von Lupeol setzt bereits in

einer sehr frühen Entwicklungsphase der Individuen des Glaucous-Phänotyps ein. Während

Lupeol im Glaucous-Phänotyp im Laufe von 67 Tagen nach der Keimung auf eine absolute

Menge von ca. 1700 µg/Hypokotyl im gesamten kutikulären Wachs akkumuliert, bleibt die

Menge dieses Triterpens im kutikulären Wachs des Glossy-Phänotyps mit 0,8 µg/Hypokotyl

sehr gering (Abb. 4-9). Beim Glaucous-Phänotyp nimmt die Lupeol-Wachsbelegung vor dem

Tag 25 mit einer Rate von 1,2 µg cm-2 d-1 zu, bevor die Zunahmerate im nachfolgenden

Zeitraum auf 0,4 µg cm-2 d-1 abnimmt. Zwischen Tag 6 und Tag 25 steigt die

Lupeoleinlagerung also um das 5,6-fache, während sich im Zeitraum danach nur eine 1,6-

fache Zunahme beobachten lässt. Die kalkulierte Lupeolbelegung pro Epidermiszelle

verdeutlicht, dass die Biosyntheserate und Einlagerung des Triterpens in die Kutikula

zwischen Tag 11 und Tag 18 am intensivsten ist: in dieser Zeitspanne steigt die Lupeol-

Belegung von 0,075 auf 0,17 ng/Epidermiszelle; dies entspricht einer täglichen Lupeol-

Zunahme von 0,013 ng pro Zelle. Die Biosynthese und Einlagerung von kutikulärem Lupeol

korreliert also exakt mit dem Expressionsmuster der Lupeolsynthase RcLUS1.

Abbildung 4-9: Akkumulation des Triterpenols Lupeol im kutikulären Wachs pro Hypokotyl bzw. pro Epidermiszelle in den ersten 67 Tagen der Hypokotylentwicklung.

Alter [Tage]

0 10 20 30 40 50 60 70

Lupe

ol/H

ypok

otyl

[µg]

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

GlossyGlaucous

Alter [Tage]

0 10 20 30 40 50 60 70

Lupe

ol/Z

elle

[ng]

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6GlossyGlaucous


Neben Lupeol als Hauptkomponente wurden im kutikulären Wachs von Ricinus-

Hypokotylen - wenn auch nur in vergleichsweise sehr geringen Mengen - weitere Triterpen-

Verbindungen nachgewiesen, respektive α- und β-Amyrin, sowie Lupenon und Taraxerol.

Alle diese Substanzen finden sich in größeren absoluten Mengen bei Individuen des

Glaucous-Phänotyps als bei denen des Glossy-Phänotyps (Abb. 4-10). Betrachtet man die

Belegung pro Epidermiszelle in der frühen Phase der Hypokotylentwicklung, zeigt sich, dass

die relative Zunahme von Lupenon in der Kutikula der Individuen des Glaucous-Phänotyps in

etwa der des Triterpenols Lupeol entspricht. Es ist anzunehmen, dass die erhöhten

Lupenon-Werte in direktem Zusammenhang mit der hohen Lupeol-Biosynthese stehen.

Abbildung 4-10: Akkumulation verschiedener Triterpen-Verbindungen im kutikulären Wachs pro Epidermiszelle in den ersten 67 Tagen der Hypokotylentwicklung.

Alter [Tage]

0 10 20 30 40 50 60 700,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

0,012

GlossyGlaucous

0 10 20 30 40 50 60 700,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

0,012

GlossyGlaucous

0 10 20 30 40 50 60 700,0000

0,0005

0,0010

0,0015

0,0020

0,0025

0,0030

GlossyGlaucous

0 10 20 30 40 50 60 70

Verb

indu

ng/Z

elle

[ng]

0,0000

0,0005

0,0010

0,0015

0,0020

0,0025

0,0030

GlossyGlaucous

α-Amyrin β-Amyrin

Lupenon Taraxerol


Die Charakterisierung von RcLUS1 zeigte, dass neben Lupeol als Hauptzyklisierungs-

produkt α- und β-Amyrin in sehr geringen Mengen als Nebenprodukte der vermittelten

Zyklisierungsreaktion in Erscheinung traten. Infolge dessen dürfen die erhöhten Mengen

dieser beiden Triterpenole in den Individuen des Glaucous-Phänotyps gegenüber den

Individuen des Glossy-Phänotyps nicht verwundern, zumal die Zunahme der Einlagerung vor

allem in der frühen Entwicklungsphase ab Tag 12 einsetzt und damit mit dem

Expressionsmuster von RcLUS1 korreliert. Das Vorhandensein von Taraxerol in der

Hypokotyl-Kutikula von Ricinus communis kann allerdings nur schwerlich mit der Expression

von RcLUS1 in Verbindung gebracht werden, da dieses Triterpenol bei der Charakterisierung

von RcLUS1 nicht nachgewiesen wurde. Insofern dürfte eine weitere Triterpensynthase für

die Biosynthese von Taraxerol verantwortlich sein (vgl. dazu 4.2.2.4).

Anhand der Korrelation der organspezifischen und entwicklungsabhängigen Lupeol-

Akkumulation in der Kutikula mit dem Expressionsmuster der Ricinus communis Lupeol-

synthase RcLUS1 lässt sich zweifelsfrei die unmittelbare Bedeutung von RcLUS1 für die

Biosynthese des kutikulären Lupeols ableiten. Damit stellt RcLUS1 das zentrale Enzym für

die Bildung epikutikulärer Wachskristalle auf den Sprossachsenoberflächen des Glaucous-

Phänotyps von R. communis dar und repräsentiert die erste in der Literatur beschriebene

kutikularelevante Triterpensynthase (Guhling et al. 2006).

4.2.2.3 Die Ausbildung der Kutikula-Phänotypen als Folge der differenziellen Regulation der Biosynthese von kutikulärem Lupeol durch RcLUS1

Die RcLUS1-Expressionsergebnisse lassen den Schluss zu, dass die enzymatisch

vermittelte Zyklisierung von 2,3-Oxidosqualen durch RcLUS1 den entscheidenden Schritt bei

der Regulation der Biosynthese von kutikulärem Lupeol darstellt. Die unterschiedlich starke

Biosynthese von kutikulärem Lupeol wird durch eine differenzierte transkriptionelle

Regulation von RcLUS1 gesteuert, und nicht über eine differenzielle Regulation von im

Biosyntheseweg vorgeschalteten Enzymen wie etwa der Squalenepoxidase bewerkstelligt.

Daneben scheint der intrazelluläre Transport des Lupeols vom Syntheseort über die

Plasmamembran und Zellwand bis hin zur Einlagerung in die Kuikula der Epidermiszellen

ebenfalls kein limitierender Faktor für die Kutikulaakkumulation von Lupeol zu sein, wobei

völlig unklar ist, durch welche Carrier- bzw. Transportproteine diese Prozesse vermittelt

werden (vgl. dazu Kunst et al. 2006).

Eine Regulation auf transkriptioneller Ebene lässt sich auch bei den Genen CER2 und

CER6 von Arabidopsis thaliana beobachten. Diese Gene kodieren für Enzyme, die Einfluss

auf die Biosynthese und Einlagerung VLC-aliphatischer Verbindungen in die Kutikula haben.

(Xia et al. 1997; Hooker et al. 2002). Erste Anhaltspunkte für potenzielle Transkriptions-

faktoren, die diese durch Umwelteinflüsse induzierbare Expression von Wachsbiosynthese-


Genen vermitteln, geben Untersuchungen an WIN1/SHN1, einem Transkriptionsfaktor aus

der AP2/EREBP-Familie. Durch die Überexpression dieses Regulators wird die

Wachsbiosynthese dramatisch induziert (Aharoni et al. 2004).

Welche Transkriptionsfaktoren kommen jedoch für die Biosynthese pentazyklischer

Triterpene in Frage? In den letzten Jahren wurde verstärkt daran gearbeitet, die

Expressionsregulation von Triterpensynthasen in Zellkulturen der Modellpflanzen Medicago

truncatula und Glycyrrhiza glabra durch Zugabe von Elicitoren zu beeinflussen. Als

potenzielle Transkriptionsfaktoren von Triterpensynthasen sind dabei bisher die Pflanzen-

hormone Methyljasmonat (MeJA) und Gibberelinsäure (GA3) beschrieben worden: In M.

truncatula-Zellkulturen führte die Behandlung mit MeJA zu einer koordinierten Induktion von

Squalensynthase, Squalenepoxidase und β-Amyrinsynthase, wohingegen die Cycloartenol-

synthase nicht induziert wurde, die Sterol-Zusammensetzung in den Zellkulturen dement-

sprechend unverändert blieb (Suzuki et al. 2002; Hayashi et al. 2003). Durch die Exposition

der Zellen mit 500 µM MeJA konnte eine 50fache Steigerung der β-Amyrinsynthase-

Expression 24 h nach Zugabe bewirkt werden (Suzuki et al. 2005). Auch in Glycyrrhiza

glabra-Zellkulturen konnte durch Zugabe von 100 µM exogenem MeJA die Expression der β-

Amyrinsynthase GgbAS1 - zusammen mit einer Squalensynthase und einer Glucuronosyl-

transferase, einem Enzym, das in einem späteren Schritt im Biosyntheseweg von Sojasapo-

nin involviert ist - induziert werden, wohingegen die Expression der Cycloartenolsynthase

unverändert blieb (Hayashi et al. 2003) und die Expression der Lupeolsynthase GgLUS1

herunterreguliert wurde (Hayashi et al. 2004). Eine Zugabe von 10-100 µM GA3 hatte

dagegen einen hemmenden Effekt auf die Expression von GgbAS1 und keinen Effekt auf

GgCAS1 und GgLUS1 (Hayashi et al. 2004). Inwieweit MeJA auch bei Ricinus communis

tatsächlich eine entscheidende Rolle bei der Expressionsregulation von RcLUS1 spielt, bleibt

allerdings sehr fraglich, zumal die Ausbildung des Glaucous-Phänotyps nicht als Folge von

Umwelteinflüssen, sondern unabhängig von Wachstumsbedingungen ausgebildet wird.

Zukünftige eingehende Promotor-Untersuchungen des RcLUS1-Gens sollten die Kenntnis

über eventuelle Transkriptionsfaktoren und deren Einfluss auf die Biosynthese kutikulären

Lupeols jedoch entscheidend erweitern können.

Da für die Expressionsversuche oberflächennahes Hypokotylmaterial verwendet wurde,

ist von einer epidermalen RcLUS1-Expression auszugehen. Auf der Grundlage der

vorliegenden Daten wird es nun mit Hilfe von in situ-Hybridisierungs-Techniken möglich sein,

eine genaue Lokalisierung von RcLUS1-Transkripten im Sprossachsengewebe des

Glaucous-Phänotyps vorzunehmen und damit die wichtige Frage zu beantworten, ob die

Expression der Lupeolsynthase exklusiv auf die Epidermis beschränkt ist. Das Vorhanden-

bzw. Nichtvorhandensein einer Epidermis-spezifischen Expression von RcLUS1 wird es

ermöglichen zu verstehen, ob es sich bei der kutikulären Akkumulation von Lupeol an der


Sprossachsenoberfläche von Individuen des Glaucous-Phänotyps um einen spezifischen

Prozess handelt, oder ob dieses Phänomen als ein Nebeneffekt im Zusammenhang einer

allgemein erhöhten Lupeol-Biosynthese in der Sprossachse zu interpretieren ist.

Es bleibt die Frage zu klären, ob der Glossy-Phänotyp die ursprüngliche Ausprägungs-

form der Sprossachsen von Ricinus communis darstellt und der Glaucous-Phänotyp erst

durch eine epidermale Steigerung der RcLUS1-Expression das Merkmal der gesteigerten

kutikulären Lupeolakkumulation im Laufe der Evolution erlangt hat, oder ob der Glaucous-

Phänotyp die ursprüngliche Erscheinungsform repräsentiert. In letzterem Fall hätten die

Individuen des Glossy-Phänotyps die Fähigkeit zur Expression von RcLUS1 in

Sprossachsen durch eine wie auch immer geartete Mutation im RcLUS1-Gen selbst oder in

einem Gen, das die RcLUS1-Expression reguliert, verloren. Eine mögliche Erklärung für das

Ausbleiben der RcLUS1-Expression in den Sprossachsen der Individuen des Glossy-

Phänotyps könnte durch eine Punktmutation in der genomischen Sequenz verursacht sein,

die ein Nonsens-Codon innerhalb der kodierenden Sequenz produziert und so zu einem

vorzeitigen Translationsabbruch führt. Voraussetzung hierfür wäre allerdings, dass eine

solche Mutation homozygot im Glossy-Phänotyp vorliegt (Ricinus communis weist einen

diploiden Chromosomensatz mit n=20 auf). Eine derartige Mutation konnte für die

Ausbildung der Saponin-defizienten Hafermutante sad1 verantwortlich gemacht werden

(Haralampidis et al. 2001). Der Grund für einen extrem reduzierten Transkriptionslevel des

betroffenen Gens könnte in einem „Nonsens-vermittelten“ Abbau von mRNA zu suchen sein,

ein Effekt, der vor allem in Hefe untersucht, aber auch bei pflanzlichen Organismen

beschrieben wurde (Petracek et al. 2000; van Hoof und Green 1996). Für die Überprüfung

dieser Hypothese müsste die genomische Sequenz des RcLUS1-Gens in Individuen, die den

Glossy-Phänotyp aufweisen, ermittelt und auf entsprechende Punktmutationen hin

untersucht werden.

Abbildung 4-11 stellt die Ergebnisse aus den molekulargenetischen Untersuchungen zur

Biosynthese des Triterpenols Lupeol via RcLUS1 den Daten aus den Wachsanalysen (vor

allem in Bezug auf die jeweils charakteristische kutikuläre Lupeolakkumulation bei beiden

Sprossachsenphänotypen von Ricinus communis) gegenüber und versucht, aus der

Zusammenschau der Erkenntnisse die sich nun ergebenden Fragestellungen abzuleiten. Die

Biosynthese des kutikulären Lupeols konnte aufgrund der Expressionsuntersuchungen

unzweifelhaft der Enzymaktivität der Lupeolsynthase RcLUS1 zugeordnet und damit als

Ursache für die Ausbildung des Glaucous-Phänotyps ausgemacht werden. Die differenzielle

Genexpression von RcLUS1 in den verschiedenen Pflanzengeweben wirft nun die Frage

nach den Regulationsmechanismen der Expression und die mögliche Beteiligung von

Transkriptionsfaktoren auf.


Abb

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11:

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gen.


Darüber hinaus ist zu klären, ob die Expression von RcLUS1 im Glaucous-Phänotyp auf

die Epidermis beschränkt bleibt oder im gesamten Sprossachsengewebe erhöht ist. Trifft

ersteres zu, dürfte der größte Anteil an in der Pflanze synthetisiertem Lupeol in der Kutikula

eingelagert sein und die Synthese von Lupeol ein exklusives „Kutikula“-Phänomen

repräsentieren. Zu klären bleibt außerdem, ob der Grund für die ausbleibende Expression

von RcLUS1 im Glossy-Phänotyp in einer Mutation innerhalb des Gens selbst oder in einer

drastischen Veränderung der Regulation liegt, z. B. durch das Ausbleiben der benötigten

Transkriptionsfaktoren. Ein weiterer großer Themenkomplex, der bislang völlig ungeklärt ist,

betrifft den Transport des Lupeols über das Endomembransystem vom Syntheseort über die

Plasmamembran und Zellwand zur Kutikula und die potentielle Beteiligung von Transport-

und Lipidtransferproteinen. In Bezug auf die Bedeutung der Ausbildung unterschiedlicher

Phänotypen im ökologischen Kontext bleibt der Nachweis einer tatsächlichen Funktion der

Generierung rutschiger Oberflächen oder der möglichen Beeinflussung kutikulärer

Transpirationseigenschaften durch die Bildung epikutikulärer Wachskristalle bzw. die

Einlagerung großer Mengen von Lupeol in die Kutikula für die Pflanzen zukünftigen

Untersuchungen vorbehalten.

4.2.2.4 RcTTS2 – eine weitere Triterpensynthase aus Ricinus communis

Neben RcLUS1 wurde ein weiteres Fragment einer 2,3-Oxidosqualenzyklase (RcTTS2)

aus Ricinus communis kloniert. Eine Klonierung des gesamten kodierenden Bereiches

dieses Gens war jedoch nicht möglich. Vorausgesetzt, dieses Enzym ist nicht in

Sprossachsen, jedoch differenziell in anderen Organen der Pflanzen exprimiert, sollte die

Verwendung von Template-mRNA für die Klonierungsarbeiten aus anderen Pflanzen-

geweben wie Blättern oder Wurzeln zu einer erfolgreichen Klonierung des Full-length-Klons

führen. Entsprechende Versuche konnten aus Zeitmangel im Rahmen dieser Arbeit nicht

bewerkstelligt werden.

Aufgrund der Sequenzhomologien zu RcLUS1 (Abb. 4-12) und anderen TTSs kann

davon ausgegangen werden, dass es sich bei RcTTS2 um das Fragment einer weiteren

Triterpensynthase handelt. Aus der Literatur sind etliche Pflanzenarten bekannt, in denen

mehrere Triterpen-Cyclasen nachgewiesen werden konnten, darunter Arabidosis thaliana,

Panax ginseng, Pisum sativum, Betula platyphylla und Glycyrrhiza glabra.

Expressionsversuche zeigten, dass diese Synthasen auf Transkriptionsebene getrennt

voneinander reguliert werden (Iturbe-Ormaetxe et al. 2003; Hayashi et al. 2004). Eine

Beteiligung der zweiten Rizinus-Triterpensynthase an der Biosynthese von kutikulären

Wachsbestandteilen wäre denkbar, da das kutikuläre Triterpenspektrum, allen voran die

Akkumulation von Taraxerol, nicht mit der Expression der Lupeolsynthase RcLUS1 alleine


erklärt werden kann (vgl. 4.2.2.2). Eine Charakterisierung der Triterpensynthase RcTTS2 ist

vor diesem Hintergrund von großem Interesse. Ob RcTTS2 nun für die Biosynthese

kutikulärer Triterpene verantwortlich ist oder nicht – in jedem Fall würden Daten zur

Expression dieses Gens im Pflanzengewebe eine wichtige Ergänzung für das Verständnis

der Regulation der Triterpen-Biosynthese in der Rizinus-Pflanze darstellen.

RcTTS2 1 ------------------ANFTFQALYLSNLGDEIMPALAKAYDFIKQTRMKD 35 RcLUS1 401 WVGEDGIKMQSFGSQTWDTSLALQALIASDLSHEIGPTLKQGHVFTKNSQATE 453 RcTTS2 36 NPAGDFRTMFRHISKGGWPFSDQDHGWQVSDCTAEGLKCLLYATQLPTEKIGE 88 RcLUS1 454 NPSGDFRKMFRHISKGAWTFSDKDQGWQVSDCTAESLKCCLLFSMMPPEIVGE 506 RcTTS2 89 KAEPERLYDAVNVILSLQGKNGGLSAWEPVRGSMWLEKLNPMEFLENIVIEHQ 141 RcLUS1 507 KMEPEKVYDSVNVILSLQSQNGGFTAWEPARAGSWMEWLNPVEFMEDLVVEHE 559 RcTTS2 142 YVECTSSGIETLAMFKKMYPGHRSKEIDNFIKNGAGYIEEIQEEDGSWYGNWG 194 RcLUS1 560 YVECTSSAIQALVLFKKLYPRHRNKEIENCIINAAQFIENIQEPDGSWYGNWG 612 RcTTS2 195 ICFIYGTWFALVGLSAAGRSYSECPAVRKGVDFLLKNQCD------------- 232 RcLUS1 613 ICFSYGTWFALKGLAAAGRTYENCSAIRKGVDFLLKSQRDDGGWAESYLSCPK 665 Abbildung 4-12: Alignment der Aminosäuresequenzen von RcLUS1 und des klonierten Fragmentes RcTTS2a einer weiteren Triterpensynthase aus Ricinus communis. Das Substratbindungsmotiv (grün) und das QW3-Motiv (rot) sind farblich hervorgehoben.

4.2.2 Biosynthese kutikulärer Triterpene in Lycopersicon esculentum

Mit Hilfe der entwickelten Methode zur Klonierung pflanzlicher OSCs konnten die

Sequenzen der 2,3-Oxidosqualenzyklasen LeTTS1 und LeTTS2 aus Lycopersicon

esculentum ermittelt werden. Während LeTTS1 mit Hilfe heterologer Expression in Hefe als

β-Amyrinsynthase charakterisiert werden konnte, stellt die Charakterisierung von LeTTS2 ein

dringendes Desiderat für zukünftige Untersuchungen dar. Die Aminosäuresequenzen beider

Synthasen zeigen mit 87% Übereinstimmung ein hohes Maß an Ähnlichkeit (Abb. 4-13),

LeTTS2 kodiert also mit an Sicherheit grenzender Wahrscheinlichkeit für eine weitere

Triterpensynthase. Das Vorhandensein des für Triterpensynthasen charakteristischen Indels

im Vergleich zu Cycloartenolsynthasen (vgl. 3.3.1) untermauert diese Hypothese. Dennoch

muss es sich bei LeTTS2 durchaus nicht um eine weitere monofunktionale β-

Amyrinsynthase handeln. Ein Alignment mit der Aminosäuresequenz der menschlichen

Lanosterolsynthase zeigt nämlich, dass LeTTS1 und LeTTS2 mindestens in vier

Aminosäureresten voneinander abweichen (Abb. 4-13), die aufgrund ihrer Nähe zum aktiven

Zentrum eine unmittelbare Bedeutung für den Zyklisierungsprozess und damit für die

Produktspezifität der Enzyme haben dürften. Besonders bemerkenswert sind dabei die


Aminosäurereste 411Glycin und 412Cystein von LeTTS2, da diese Reste von den bei allen

bisher charakteriserten Triterpensynthasen ansonsten konservierten Aminosäuren Serin und

Phenylalanin abweichen (vgl. Abb. 3-16). Eine Charakterisierung der Produktspezifität von

LeTTS2 ist damit nicht nur für einen Erkenntnisgewinn zur Biosynthese pentazyklischer

Triterpene bei Lycopersicon esculentum wichtig, sondern wird darüber hinaus das

allgemeine Verständnis der Bedeutung und Funktion einzelner Aminosäurereste pflanzlicher

Oxidosqualenzyklasen am Zyklisierungsprozess erweitern.

Neben dem EST-Klon TC160438 (vgl. 3.3.6.1) fanden sich im TIGR Tomato Gene Index

weitere Gen-Fragmente, die aufgrund von Sequenzähnlichkeiten als Fragmente von OSCs

annotiert wurden (Annotation in Klammer): TC160907 (LUS), TC167994 (LUS), AW618579

(LUS), BE459106 (OSC), TC159227 (CAS), TC165541 (CAS). Keines dieser Fragmente

konnte einer der klonierten Triterpensynthasen zugeordnet werden. Es ist also durchaus

möglich, dass neben den Synthasen LeTTS1 und LeTTS2 noch weitere Triterpensynthasen

in Lycopersicon esculentum existieren.

Im Gegensatz zur Kutikula von Ricinus communis-Sprossachsen des Glaucous-

Phänotyps zeichnet sich Lycopersicon esculentum durch das Auftreten gleich mehrerer

pentazyklischer Triterpene in größeren Mengen im kutikulären Wachs der Früchte aus (Vogg

et al. 2004). Hierbei stellen α-Amyrin, β-Amyrin und δ-Amyrin die größten Mengenanteile,

daneben lassen sich jedoch auch eine ganze Reihe weiterer Triterpenole als kutikuläre

Wachsverbindungen nachweisen (Bauer et al. 2004). Interessanterweise verändern sich die

relativen Mengenverhältnisse der Triterpene im Laufe der Fruchtentwicklung kaum (Tab. 4-

2).

Tabelle 4-2: Prozentuale Verteilung der Triterpenalkohole in unterschiedlichen Reifestadien von Tomatenfrüchten, bezogen auf deren Summe (aus Bauer 2002).

grün grün-orange rot vollreif nachgereift

im Dunkel nachgereift

im Licht Mittel- wert

Standard- abweichung

Taraxerol 1,9 1,9 2,0 1,9 2,0 2,0 2,0 0,05

δ-Amyrin 41,2 41,2 40,7 40,6 39,6 40,6 40,7 0,59

β-Amyrin 22,2 20,7 21,5 22,3 23,9 22,6 22,2 1,08

α-Amyrin 22,3 22,2 21,7 21,6 21,3 21,4 21,8 0,41

Lupeol 0,7 0,7 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,05

Multiflorenol 4,3 4,4 4,5 4,3 4,2 4,1 4,3 0,14

ψ-Taraxasterol 2,8 2,9 3,0 3,0 2,9 2,9 2,9 0,08

Taraxasterol 3,4 3,3 3,4 3,3 3,2 3,3 3,3 0,08


LeTTS1 1 MWKLKIAEGQNGPYLYSTNNYVGRQTWEFDPNGGTIEERAKIEEARQQFW 50 LeTTS2 1 MWKLKIAKGLDDRYLYSTNNYIGRQIWEFDPNAGTIEEQAKIEEARQHYW 50 LeTTS1 51 NNRYKVKPSSDLLWRIQFLGEKNFKQKIPAVKVEEGEEISHEVATIALHR 100 LeTTS2 51 NNRYKGKPNSDLLWRMQFLREENFKQRIRAVKVEEGEEISHEIATVALHR 100 LeTTS1 101 AVNFFSALQATDGHWPAENAGPLFFLPPLVMCMYITGHLNTVFPAEHRKE 150 LeTTS2 101 AVHFFSALQATDGHWPAESAGPLFFLPPLVMCMYITGHLNTVYPAEHRKE 150 LeTTS1 151 ILRYIYCHQNEDGGWGLHIEGHSTMFCTALSYICMRILGEGPDGGVNNAC 200 LeTTS2 151 ILRYIYCHQNEDGGWGLHIEGHSTMFCTAMSYICMRILGEGPEGGVNNAC 200 LeTTS1 201 ARARKWILDHGSVTAIPSWGKTWLSILGVFEWIGTNPMPPEFWILPSFLP 250 LeTTS2 201 ARARKWILDHGSVIAIPSWGKTWLSILGAFEWIGTNPMPPEFWILPSFLP 250 LeTTS1 251 VHPAKMWCYCRMVYMPMSYLYGKRFVGPITPLILQLREELYDRPYDEINW 300 LeTTS2 251 VHPAKMWCYCRTVYMPMSYLYGKRFVGPITPLILKLREELYDQTYDEINW 300 LeTTS1 301 KKVRHVCAKEDLYYPHPLVQDLMWDSLYICTEPLLTRWPFNKLRNKALEV 350 LeTTS2 301 KKVRHVCAKEDLYYPHPFVQDLMWDSLYICTEPLLTRWPFNKLRNKALEV 350 LeTTS1 351 TMKHIHYEDENSRYITIGCVEKVLCMLACWVEDPNGDYFKKHLARIPDYL 400 LeTTS2 351 TMKHIHYEDENSRYITMGCVEKVLSMLACWVEDPNGDHFKKHLARIPDFL 400 LeTTS1 401 WVAEDGMKMQSFGSQEWDTGFAIQALLASEMNDEIADTLRKGHDFIKQSQ 450 LeTTS2 401 WVAEDGMKMQGCGSQSWDASLAIQALLASEMYDEISDTLKNGHDFIKQSQ 450 LeTTS1 451 VTNNPSGDFKGMYRHISKGSWTFSDQDHGWQVSDCTAEALKCCLLLSTMP 500 LeTTS2 451 VKDNPSGDFKVMYRHISKGSWAFADQDLGWQVSDCTAEALKCCLLFSTMP 500 LeTTS1 501 RELVGQAMEPGRLYDSVNVVLSLQSKNGGLAAWEPAGASEYLELLNPTEF 550 LeTTS2 501 PEIVGEAMDPVRLYDSVNVILSLQSKNGGLSAWEPAGAPEYLELLNPTEF 550 LeTTS1 551 FADIVIEHEYVECTASSIQALVLFKKLYPGHRTKEINIFIDNAVKYLEDV 600 LeTTS2 551 FEDIVIEHEHVECTSSAIQALVRFKKLYPGHRTTEVDNFINNGVKYIEDV 600 LeTTS1 601 QMPDGSWYGNWGVCFTYGSWFALGGLVAAGKSYNNSAAVRKGVEFLLRTQ 650 LeTTS2 601 QEPDGSWYGNWGVCFIYASWFALGGLAAVGLSYSNCAAVRKSVEFLLRTQ 650 LeTTS1 651 RSDGGWGESYRSCPDKVYRELETNDSNLVQTAWALMGLIHSGQADRDPKP 700 LeTTS2 651 RSDGGWGESYRSCPDKVYRELETEHSNLVQTAWALMGLIHSGQVERDPRP 700 LeTTS1 701 LHRAAKLLINSQMEDGDFPQQEITGVFMKNCMLHYAAYRNIYPLWGLAEY 750 LeTTS2 701 LHRAAKLLINFQMEDGDFPQQEITGVFLRNCMMHYALYRNIFPLWGLAEY 750 LeTTS1 751 RKNVLLPLENN-- 761 LeTTS2 751 RRNVLVPLKHNYI 763 Abbildung 4-13: Aminosäuresequenzalignment der klonierten Triterpensynthasen aus Lycopersicon esculentum. Das Substratbindungsmotiv (grün) und das QW3-Motiv (rot) sind farblich hervorgehoben. Gelb hinterlegt sind Aminosäuren, die aufgrund ihrer Nähe zum Substrat für die Produktspezifität der Enzyme von großer Bedeutung sein dürften und sich in beiden Synthasen unterscheiden.


Es stellt sich die Frage, auf welche Weise dieses charakteristische Triterpenspektrum im

Wachs der Tomatenfrüchte enzymatisch vermittelt wird. Einerseits könnte die spezifische

Triterpenakkumulation durch die Expression mehrerer monofunktionaler Triterpensynthasen

bewerkstelligt werden. Andererseits wäre das Vorkommen der kutikulären Triterpene auch

durch die Beteiligung einer multifunktionalen Triterpensynthase mit entsprechendem

Produktspektrum zu erklären. Aus der Literatur sind mehrere solcher multifunktionaler

Triterpensynthasen bekannt. So zyklisiert beispielsweise die Triterpensynthase PSM aus

Pisum sativum 2,3-Oxidosqualen zu den Triterpenen α-Amyrin, β-Amyrin, δ-Amyrin, ψ-

Taraxasterol, Butyrospermol, Lupeol, Germanicol und Taraxasterol (Morita et al. 2000). Die

Expression von LjAMY2 aus Lotus japonicus in Hefe resultiert in der Akkumulation von β-

Amyrin und Lupeol in ungefähr gleichen Mengen als Hauptprodukte, daneben können

weitere uncharakterisierte Nebenprodukte detektiert werden (Iturbe-Ormaetxe et al. 2003).

Die multifunktionale Triterpensynthase CSV aus Costus speciosus zeigt bei der

Charakterisierung ein Triterpenspektrum, bei dem Lupeol, Germanicol und β-Amyrin die

Hauptkomponenten darstellen (Kawano et al. 2002). Die Arabidopsis taliana OSC ATLUP1

synthetisiert bei Hefe-Expressionsversuchen neben dem Hauptprodukt Lupeol (Herrera et al.

1998) weitere Triterpennebenprodukte, darunter β-Amyrin, Germanicol, Taraxasterol, ψ-

Taraxasterol und 3β,20-Dihydroxilupan (Herrera et al. 1998; Shibuya et al. 1999; Segura et

al. 2000). Eine weitere multifunktionale Triterpensynthase aus A. thaliana katalysiert die

Zyklisierung zu β-Amyrin, α-Amyrin und Lupeol in einem Verhältnis von 55:30:15

(Husselstein-Muller et al. 2001). Darüber hinaus wurden Taraxasterol, Tirucalla-7,21-dien-

3β-ol, Baurenol, Butyrospermol, Multiflorenol und ψ-Taraxasterol als ATLUP2-

Zyklisierungsprodukte identifiziert (Kushiro et al. 2000). Bei der Charakterisierung weiterer

multifunktionaler Arabidopsis-Triterpensynthasen schließlich konnten Tirucalla-7,21-dienol

(ATLUP5) sowie Baurenol, Lupeol und α-Amyrin (ATPEN6) neben anderen nicht zu

bestimmenden Produkten identifiziert werden (Ebizuka et al. 2003).

Über die Bedeutung der klonierten Triterpensynthasen aus L. esculentum für die

Biosynthese kutikulärer Triterpene lässt sich zum gegenwärtigen Zeitpunkt leider keine

gesicherte Aussage treffen. Zwar handelt es sich bei β-Amyrin um eine der Wachs-

komponenten. Ob es sich dabei allerdings um das von LeTTS1 vermittelte Produkt handelt,

muss aufgrund mangelnder Expressionsergebnisse offen bleiben. Darüber hinaus muss

jedoch mindestens eine weitere Triterpensynthase in die Biosynthese der kutikulären

Triterpene involviert sein. Da das Triterpenspektrum in der Kutikula über die gesamte

Fruchtentwicklung hinweg gleich bleibt, scheint es naheliegend, dass dabei eine Synthase

mit einer multifunktionalen Produktspezifität beteiligt ist. Ergebnisse, die im Labor von R.

Jetter bei der Untersuchung einer weiteren Modellpflanze für die Biosynthese kutikulärer

Triterpene erzielt wurden, sollen an dieser Stelle nicht unerwähnt bleiben. Mit Methoden


analog zur Vorgehensweise bei Ricinus communis und Lycopersicon esculentum wurde aus

Kalanchoe daigremontiana eine 2,3-Oxidosqualenzyklase kloniert und mit Hilfe heterologer

Expression in Hefe als eine multifunktionale Triterpensynthase charakterisiert

(unveröffentlichte Daten). Dieses Kalanchoe-Enzym stellt das erste bekannte Enzym dar,

das eine Reihe von weniger verbreiteten Triterpenen produziert, darunter auch das

Triterpenketon Friedelin. Erstaunlicherweise deckt sich das charakteristische

Produktspektrum dieser Triterpensynthase mit dem Vorkommen der gleichen Triterpene und

in ungefähr den entsprechenden Verhältnissen im kutikulären Wachs von Kalanchoe-

Blättern. In diesem Fall scheint eine direkte Relevanz des Enzyms für die Biosynthese

kutikulärer Wachse gegeben zu sein. Dabei ist davon auszugehen, dass die Akkumulation

verschiedener Triterpene in der Kutikula durch die Expression einer einzigen

multifunktionalen Triterpensynthase bewerkstelligt wird, auch wenn entsprechende

Expressionsversuche diese Vermutung erst noch untermauern müssen.

Lycopersicon esculentum stellt in jedem Fall ein geeignetes Modellsystem für die

Erforschung der Biosynthese-Regulation kutikulärer Triterpene dar. Die Charakterisierung

weiterer Tomaten-Triterpensynthasen wird es in Zukunft ermöglichen, die differenzielle

Genexpression der verschiedenen Enzyme miteinander zu vergleichen und letztendlich

daraus die Bedeutung einzelner Enzyme für die Biosynthese kutikulärer Wachskomponenten

abzuleiten.

4.3 Klonierte Synthasen als Mitglieder der Epoxysqualenzyklasen-Genfamilie 135

4.3 Die klonierten und charakterisierten Triterpensynthasen als Mitglieder der Epoxysqualenzyklasen-Genfamilie

4.3.1 Klonierung pflanzlicher Epoxysqualenzyklasen durch die Einbeziehung von

Sequenz-Unterschieden in den Gen-Unterfamilien

Bei den bis dato in der Literatur beschriebenen Methoden zur sequenzhomologie-

basierten Klonierung pflanzlicher Epoxysqualenzyklasen war eine gezielte Amplifizierung von

Triterpensynthasen bei einer gleichzeitigen Diskriminierung von Cycloartenolsynthasen (und

umgekehrt) nicht möglich gewesen. Vielmehr wurden mit den bisherigen Primerdesigns

unspezifisch Fragmente von Epoxysqualenzyklasen amplifiziert. Im Rahmen der vorliegen-

den Arbeit sollte dagegen ein Primerdesign entwickelt werden, das eine spezifische cDNA-

Fragment-Amplifizierung von Cycloartenolsynthasen bzw. Triterpensynthasen und damit eine

spezifische Klonierung ermöglicht, indem durch unterschiedliche Funktionalitäten

vorauszusetzende Sequenzunterschiede in beiden Gen-Unterfamilien berücksichtigt werden

sollten. Tatsächlich war ein Sequenzbereich, der für die jeweilige OSCs-Unterfamilie der

Triterpensynthasen bzw. der Cycloartenolsynthasen charakterisitisch und hochkonserviert

ist, für die erfolgreiche spezifische Klonierung von entscheidender Bedeutung (vgl. Abb. 3-16

und 3-17). Mit Hilfe des entwickelten Primerdesigns konnte die zielgerichtete Klonierung

sowohl einer Triterpen-, als auch einer Cycloartenolsynthase aus Ricinus communis

erfolgreich durchgeführt werden. Darüber hinaus konnten mit Hilfe der Primer Triterpen-

synthasen aus Lycopersicon esculentum sowie eine multifunktionale Triterpensynthase aus

Kalanchoe daigremontiana kloniert werden (unveröffentlichte Daten).

Die Tatsache, dass das Motiv QGYNG in Cycloartenolsynthasen bzw. das entsprechende

Motiv QSF-G in Triterpensynthasen jeweils hochkonserviert ist, lässt vermuten, dass dieser

Bereich für die von Epoxysqualenzyklasen katalysierte Zyklisierungsreaktion und deren

Spezifität eine entscheidende Rolle spielt. Zwei Indizien sprechen zusätzlich für diese

Annahme: 1. Anhand der dreidimensionalen Struktur der menschlichen Lanosterolsynthase

und entsprechender Sequenzalignments kann davon ausgegangen werden, dass sich die

AS Glycin und Tyrosin (CASs) bzw. Serin und Phenylalanin (TTSs) in unmittelbarer Nähe

des katalytischen Zentrums der jeweiligen Enzyme befinden (vgl. Abb. 3-45). 2. In Site-

directed mutagenesis-Ansätzen wurde gezeigt, dass das 410Tyr der Cycloartenolsynthase

ATCAS1 von A. thaliana aus obigem Motiv auf die Produktspezifität des Enzyms

entscheidenden Einfluss hat: Die AtCAS1-Mutante Tyr410Thr zyklisiert 2,3-Oxidosqualen

nicht zu Cycloartenol, sondern zu Lanosterol, Parkeol und 9β-∆7-Lanosterol (Herrera et al.

2000). Analog zu diesem Befund weisen Lanosterolsynthasen tierischer Organismen ein

konserviertes Threonin an der korrespondierenden Tyr-Position der CASs auf. Tyr410 dürfte

in unmittelbarer Nachbarschaft des B/C-Ring-Übergangs lokalisiert sein und könnte die

Deprotonierung der C-8/C-9-Kation-Zwischenstufen im Laufe der Zyklisierungsreaktion


vermitteln. Protosteryl- und Dammarenyl-Kation zeigen jeweils eine umgekehrte Stereo-

chemie im Bereich des B/C-Ring-Übergangs; es ist denkbar, dass das SerPhe-Motiv der

Triterpensynthasen die Bildung des Dammarenyl-Kations ermöglicht.

4.3.2 Die klonierten und charakterisierten 2,3-Oxidosqualenzyklasen im Kontext pflanzlicher Epoxysqualenzyklasen

4.3.2.1 Phylogenetische Untersuchungen Für einen sequenzanalytischen Vergleich der klonierten Triterpen- bzw. Cycloartenol-

synthasen aus Ricinus communis und Lycopersicon esculentum wurde zunächst ein

Alignment der jeweiligen Aminosäuresequenzen mit den Sequnzen bereits charakterisierter

pflanzlicher Epoxisqualenzyklasen durchgeführt. Auf der Grundlage dieses Alignments

konnten die prozentualen Sequenzübereinstimmungen von RcLUS1, RcCAS1 und LeTTS1

mit Vertretern verschiedener Untergruppen aus der Familie der 2,3-Oxidosqualenzyklasen

ermittelt werden (Tab. 4-3).

RcCAS1 zeigt im Vergleich mit anderen pflanzlichen Cycloartenolsynthasen erwartungs-

gemäß eine hohe Übereinstimmung in ihrer Aminosäuresequenz von 76%-82%, die größte

Ähnlichkeit dabei mit den Cycloartenolsynthasen GglCAS1 von Glycyrrhiza glabra (82,7%)

und BPX2 von Betula platyphylla (82,6%). Eine weitaus geringere Sequenzübereinstimmung

war dagegen mit Triterpensynthasen zu erkennen; sie erreichte Werte von 50% bis zu 62%.

Die RcLUS1 Lupeolsynthase aus Ricinus communis wies eine nur relativ geringe

Sequenzübereinstimmung von 59-62% mit den bisher bekannten monofunktionalen

Lupeolsynthasen aus O. europaea (OEW), T. officinale (TRW), B. platyphylla (BPW) und G.

glabra (GgLUS1) auf. 66% Übereinstimmung zeigte RcLUS1 mit der multifunktionalen

Triterpensynthase aus A. thaliana (ATLUP1), 71-74% mit β-Amyrinsynthasen aus B.

platyphylla (BPY), P. ginseng (PNY und PNY2), P. sativum (PSY), M. truncatula (MtbAS) und

G. glabra (GgbAS1), 68-69% mit multifunktionalen Triterpensynthasen von L. japonicus

(LJAMY2) und P. sativum (PSM) und 66% mit der Isomultiflorenolsynthase von L. cylindrica

(LcIMS1). Mit Cycloartenolsynthasen war nur eine verhältnismäßig geringe Sequenz-

übereinstimmung festzustellen, die zwischen 54 und 58 % lag.

Die β-Amyrinsynthase LeTTS1 aus Lycopersicon esculentum zeigte mit bis zu 83% vor

allem hohe Sequenzübereinstimmungen mit anderen β-Amyrinsynthasen, der höchste Wert

wurde dabei für PNY aus P. ginseng festgestellt. Die Ähnlichkeiten in der Aminosäure-

sequenz im Vergleich zu multifunktionalen Triterpensynthasen (72-74%), zu Lupeol-

synthasen (62-64%) sowie zu Cycloartenolsynthasen (57-60%) waren dagegen geringer.


Tabelle 4-3: Übersicht der Sequenzübereinstimmungen der klonierten und charakterisierten Oxidosqualenzyklasen RcLUS1, RcCAS1 und LeTTS1 mit anderen charakterisierten pflanzlichen OSCs auf Aminosäuresequenzebene (Angaben in Prozent).

RcoLUS (RcLUS1)

RcoCAS (RcCAS1)

LesbAS (LeTTS1)

EtibAS (EtOSC) 71,3 58,1 80,6 PgibAS (PNY) 73,4 58,6 83,2

PgibAS (PNY2) 73,1 58,6 83,0 BplbAS (BPY) 74,1 57,6 82,7

MtrbAS (MtbAS) 71,1 56,9 78,3 PsabAS (PSY) 71,6 57,0 78,5

GglbAS (GgbAS1) 71,4 57,6 79,1 LjaMFS (LJAMY2) 68,6 56,8 73,7

PsaMFS (PSM) 67,7 56,4 71,7 LcyIMS (LcIMS1) 65,5 52,4 66,0

AthMFS (ATLUP1) 66,3 54,4 69,7 AthMFS (ATLUP5) 63,2 53,0 65,8 AthMFS (ATLUP2) 65,8 56,1 70,4 AthMFS (ATPEN6) 57,9 49,9 58,6

OeuLUS (OEW) 61,7 61,9 63,7 TofLUS (TRW) 60,0 59,9 62,5 BplLUS (BPW) 61,2 61,1 62,5

GglLUS (GgLUS1) 59,2 59,9 62,1 PgiCAS (PNX) 57,0 80,2 59,0

BplCAS (BPX2) 57,1 82,6 59,7 PsaCAS (PSX) 57,5 81,7 58,2

GglCAS (GgCAS1) 57,5 82,7 58,8 LcyCAS (LcCAS1) 54,4 75,6 56,6

BplCAS (BPX1) 55,5 77,5 58,5 AthCAS (AtCAS1) 55,5 79,4 59,2

CspMFS (CSV) 55,5 67,7 55,5 CspCAS (CSI) 56,3 75,6 57,6

AstbAS (AsbAS1) 48,0 54,6 48,3

Auf der Grundlage des AS-Sequenzalignments wurde ein ungewurzelter phylogene-

tischer Stammbaum erstellt, der die Verwandtschaftsbeziehungen der verschiedenen

pflanzlichen Epoxysqualenzyklasen darstellt (Abb. 4-14). Daneben wurde ein Stammbaum

anhand eines Alignments der cDNA-Sequenzen der Enzyme kreiert, wobei in dieser

Darstellung die menschliche Lanosterolsynthase als Outgroup diente (Abb. 4-15). Bei beiden

Stammbäumen zeigt sich, dass sich drei Unterfamilien der Epoxysqualenzyklasen-

Genfamilie beschreiben lassen, deren Mitglieder jeweils in separaten Gruppen clustern.

Hierbei handelt es sich um die Unterfamilien der Cycloartenolsynthasen, der β-

Amyrinsynthasen und der Lupeolsynthasen.

Bei der Gruppe der Cycloartenolsynthasen dürfte es sich um jeweils orthologe Gene

handeln. Das Auftreten der katalytisch gesteuerten Zyklisierung von 2,3-Oxidosqualen via

Cycloartenolsynthase als „Housekeeping-Enzym“ geht also der Entstehung der pflanzlichen


Artenvielfalt voraus. Erwartungsgemäß findet sich auch die klonierte und charakterisierte

Cycloartenolsynthase RcCAS1 aus R. communis in dieser Gruppe.

Die monofunktionalen β-Amyrinsynthasen der dikotylen Pflanzen clustern ebenfalls in

einer separaten Gruppe, in der sich auch die Lycopersicon esculentum LeTTS1 als

charakterisierte β-Amyrinsynthase wiederfindet (Abb. 4-14). Einen anderen Ursprung dürfte

dagegen AsbAS1 haben, da die Synthase aus Hafer trotz der gleichen Produktspezifität mit

48% bis 50% nur relativ geringe Ähnlichkeiten zu allen übrigen β-Amyrinsynthasen zeigt,

weshalb über eine unabhängige Evolution von β-Amyrinsynthasen in mono- und

dikotyledonen Pflanzen spekuliert wurde (Qi et al. 2004; Haralampidis et al. 2001). Die

phylogenetischen Untersuchungen zeigten außerdem, dass sich die orthologen multi-

funktionalen Triterpensynthasen aus den Hülsenfrüchtlern P. sativum (PSM) und L.

japonicus (LjAMY2) einen gemeinsamen Vorläufer mit den monofunktionalen β-Amyrin-

synthasen dikotyler Pflanzen teilen. In den Stammbaum auf cDNA-Basis wurde zusätzlich

die Sequenz der zweiten Triterpensynthase LeTTS2 der Tomate mit einbezogen (Abb. 4-15);

auch diese Triterpensynthase clustert in die Unterfamilie der Amyrinsynthasen.

Alle vier bisher charakterisierten monofunktionalen Lupeolsynthasen bilden einen

eigenen Stamm innerhalb der Epoxysqualenzyklasen (Abb. 4-14) und zeigen mit einer

Übereinstimmung zwischen 74% und 81% untereinander ein hohes Maß an Ähnlichkeit. Die

Anwesenheit von Genen im Lupeolsynthase-Cluster von Pflanzenvertretern sowohl der

Asteriden wie auch der Rosiden (Abb. 4-15) unterstützt die Annahme, dass die Enzyme

OEW, TRW, BPW und GgLUS1 allesamt Vertreter eines Lupeolsynthase-Typs sind, der sich

vor der Auftrennung der Unterklassen evolvierte. Um so erstaunlicher nimmt sich die

Tatsache aus, dass die charakterisierte monofunktionale Lupeolsynthase RcLUS1 aus R.

communis nicht dieser Gruppe zugeordnet werden kann, sondern im Gegenteil keiner der

beiden Triterpensynthase-Unterfamilien zuzuordnen ist. Die größte Ähnlichkeit zeigt die

RcLUS1-Sequenz zur cDNA-Sequenz eines orthologen Gens, einer mutmaßlichen Triterpen-

synthase (EtOSC) aus der nah verwandten Pflanze Euphorbia tirucalli (Abb. 4-15). Leider

liegen bis jetzt keine Informationen über die Produktspezifität dieses Enzyms vor, wenngleich

ein Vergleich des Produktspektrums beider Enzyme von großem Interesse wäre. Die

phylogenetischen Daten lassen den Schluss zu, dass RcLUS1 ein Vertreter einer nicht

beschriebenen Klasse von Lupeolsynthasen höherer Pflanzen angehört, die sich getrennt

und parallel zu den bislang charakterisierten Lupeolsynthasen in der Familie der

Euphorbiaceae evolvierte.

Die multifunktionalen Triterpensynthasen aus A. thaliana - von Philips et al. als paraloge

Enzyme angesprochen - lassen sich keinem der drei beschriebenen Untergruppen der

Epoxysqualenzyklasen zuordnen, ebenso wie die monofunktionale Isomultiflorenolsynthase

aus L. cylindrica. Eine Sonderstellung nimmt die multifunktionale Triterpensynthase CSV der


monokotylen Pflanze C. speciosus ein: Dieses Enzym weist mit 67% bis 71% ein relativ

hohes Maß an Sequenzähnlichkeit zu Cycloartenolsynthasen auf. Setzt man hier einen

unmittelbaren gemeinsamen Vorläufer voraus, würde CSV einen in der Entwicklung der

Pflanzen relativ jungen „Evolutionssprung“ repräsentieren, der eine dramatische Ver-

änderung der katalytischen Funktionsweise des Enzyms bei der Zyklisierung von 2,3-

Oxidosqualen über das Dammarenyl-, und nicht wie bei Cycloartenolsynthasen über das

Protosteryl-Kation, beinhaltet (Xiong et al. 2005).

Abbildung 4-14: Darstellung der phylogenetischen Verwandtschaftsbeziehungen pflanzlicher Epoxysqualenzyklasen auf der Grundlage eines Aminosäuresequenzalignments. Die angegebene Skala repräsentiert den Abstand von 0,1 Aminosäuresubstitution pro Site. Die Zahlen geben die Anzahl der Bootstrap-Wiederholungen an (von 1000), in denen die dargestellten Verzweigungen im Baum erzielt wurden.


Abbildung 4-15: Phylogenetischer Stammbaum pflanzlicher Epoxysqalenzyklasen, erstellt auf der Basis eines Sequenzalignments der cDNA-Sequenzen (Clustal-X). Angegeben sind die jeweilige Produktspezifität der Enzyme sowie die Ordnungs-Zugehörigkeit der Arten, aus denen die Zyklasen kloniert wurden. Rot umrandet sind die Rizinus Lupeolsynthase RcLUS1 und die uncharakterisierte Epoxysqualenzyklase der nah verwandten Pflanze Euphorbia tirucalli. Als Outgroup wurde die menschliche Lanosterolsynthase verwendet (GenBank- Akzessionsnummer: D63807).

MtrbAS (MtbAS) PsabAS (PSY) GglbAS (GgbAS1)

LjaMFS (LJAMY2) PsaMFS (PSM)

PgibAS (PNY2) PgibAS (PNY)

BplbAS (BPY)

LesbAS (LeTTS2) LesTTS (LeTTS1)

AthMFS (ATLUP5) AthMFS (ATLUP2)

AthMFS (ATLUP1)

AthMFS (ATPEN6)

LcyIMS (LcIMS1) RcoLUS (RcLUS)

OeuLUS (OEW) TofLUS (TRW) BplLUS (BPW) GglLUS (GgLUS1)

PsaCAS (PSX) GglCAS (GgCAS1)

RcoCAS (RcCAS)

PgiCAS (PNX) BplCAS (BPX2)

AthCAS (AtCAS1) LcyCAS (LcCAS1)

BplCAS (BPX1) CspMFS (CSV) CspCAS (CSI) AstbAS (AsbAS1)

Outgroup

EtiOSC (EtOSC)

Am

yrin

Produkt

Lupe

ol

Lupeol

Cyc

loar

teno

l

Amyrin

Isomultiflorenol

mul

ti-

funk

tiona

l

SolanalesSolanalesApialesApialesFagales

FabalesFabalesFabalesFabalesFabalesMalpighialesMalpighialesCucurbitalesBrassicalesBrassicalesBrassicalesBrassicalesLamialesAsteralesFagalesFabales

ZingiberalesZingiberalesPoales

ApialesFagalesMalpighialesFabales

BrassicalesFabales

CucurbitalesFagales

Cycloartenol multifunktional

RO

SID

AE

L

ILII

DA

E

multifunktional

EtibAS (EtbAS)

HsaLS

Malpighiales

?

?

Lanosterol


4.3.2.2 RcLUS1 im Vergleich zu anderen Lupeolsynthasen – Gerichtete Mutagenese-Versuche

Wie die phylogenetischen Untersuchungen verdeutlichen, nimmt RcLUS1 innerhalb der

Triterpensynthasen eine Sonderstellung ein, da die Rizinus-Lupeolsynthase nur relativ

geringe Ähnlichkeit zu den bisher charakterisierten Lupeolsynthasen anderer Pflanzen

aufzeigt. Diese besondere Stellung erweist sich auch in dem Vorhandensein des Amino-

säurerestes Phe257, da an der korrespondierenden Position in allen anderen Lupeol-

synthasen ein Leucin hochkonserviert ist (vgl. Abb. 3-44), auf den im Folgenden

eingegangen werden soll.

Durch die Technik der gerichteten Mutagenisierung und des gezielten Austausches

einzelner Aminosäuren können Informationen über die Bedeutung einzelner AS-Reste an der

katalytischen Funktionsweise des mutagenisierten Enzyms gewonnen werden. In den

vergangenen Jahren wurde mit Hilfe solcher Ansätze vor allem an Cycloartenolsynthasen

gezeigt, dass der Austausch bereits weniger Aminosäurereste ausreicht, um die

Produktspezifität pflanzlicher Epoxysqualenzyklasen zu verändern (Hart et al. 1999; Meyer et

al. 2002; Segura et al. 2002; Wu und Griffin 2002; Lodeiro et al. 2004). So konnte die

Cycloartenolsynthase ATCAS1 aus Arabidopsis thaliana durch den Austausch der

Aminosäuren His477 mit Asn und Ile481 mit Val in eine monofunktionale Lanosterolsynthase

konvertiert werden (Lodeiro et al. 2005).

Auch an Triterpensynthasen wurde beobachtet, dass eine geringfügige Änderung in der

Aminosäuresequenz der Enzyme ein verändertes Produktspektrum nach sich ziehen kann:

In Untersuchungen zur Produktspezifität von Chimären aus der multifunktionalen

Triterpensynthase von Arabidopsis thaliana (ATLUP1) und der β-Amyrinsynthase von Panax

ginseng (PNY) mittels heterologer Expression in Hefe-Mutanten wurde gezeigt, dass der

Austausch bereits kurzer Aminosäurebereiche ausreicht, um das Produktmuster der

entsprechenden Enzym-Chimären in Richtung Lupeol bzw. β-Amyrin zu verschieben

(Kushiro et al. 1999a). Kushiro et al. (2000b) konnten mit Hilfe von gerichteten

Evolutionsansätzen darüber hinaus den Nachweis erbringen, dass das Aminosäuremotiv 258MWCYCR263 in der β-Amyrinsynthase von Panax ginseng (PNY) bzw. das entsprechende

Motiv 255MLCYCR260 in der Lupeolsynthase von Olea europea (OEW) für die Produktspezifität

der jeweiligen Triterpensynthase essenziell ist. Die Tyrosin-Reste in beiden Motiven sind

dabei für die generelle Triterpensynthase-Eigenschaft beider Enzyme unabdingbar, da der

Austausch von Tyrosin gegen Histidin (diese Aminosäure findet sich im entsprechenden

Sequenzmotiv in allen bisher bekannten Cycloartenolsynthasen) zur Produktion

verschiedener tetracyclischer Verbindungen führt, was auf einen verfrühten Abbruch der

Zyklisierungsreaktion zurückgeführt werden kann. Demgegenüber kommt dem Tryptophan in

PNY bzw. dem Leucin in OEW der besagten Motive besondere Bedeutung für die jeweilige


Triterpen-Produktspezifität zu, da diese Aminosäurereste auch in anderen bekannten β-

Amyrin- bzw. Lupeolsynthasen jeweils konserviert sind. Wird Trp259 in PNY durch Leu

ersetzt, so zeigt das entsprechend mutierte Enzym eine eklatante Verschiebung seines

Produktspektrums von β-Amyrin hin zu Lupeol. Umgekehrt bewirkt der Austausch des

Leu256 in OEW mit Trp eine Produkt-Verschiebung von Lupeol zu β-Amyrin. Es wird

spekuliert, dass der aromatische Rest des Tryptophans zur Stabilisierung des instabilen

Lupenyl-Kations während des Zyklisierungsprozesses entscheidend beiträgt. Auf diese

Weise findet der abschließende Deprotonierungsschritt erst am Oleanyl-Kation statt, was

schließlich die Bildung von β-Amyrin bewirkt. Im Gegensatz zu OEW führte der Austausch

des Leucins mit Tryptophan im entsprechenden ATLUP1-Motiv 254ILCYSR259 der MTS aus A.

thaliana nicht zu einer eklatanten Veränderung der katalytischen Funktion des Enzyms; das

aktive Zentrum des nativen ATLUP1 besitzt allerdings bereits die Fähigkeit, sowohl die

Zyklisierung von Lupeol, als auch von β-Amyrin zu katalysieren.

Das entsprechende Sequenzmotiv findet sich auch in RcLUS1 wieder: 256MFCYCR261.

Erwartungsgemäß weist das Motiv das für Triterpensynthasen charakteristische Tyrosin auf.

Anstelle von Leu257 zeigt das Rizinus-Motiv jedoch das für Lupeolsynthasen bisher nicht

beschriebene und oben bereits erwähnte Phenylalanin. Um zu überprüfen, ob Phe257 auf

die Produktspezifität von RcLUS1 entscheidenden Einfluss hat, wurde die Mutante F257W

hergestellt und funktionell charakterisiert (vgl. 3.6.2). Auch wenn die Produktmenge bei der

Mutante im Vergleich zum Wildtyp stark reduziert ist, zeigt dieses Experiment, dass durch

die Veränderung einer einzelnen AS eine Lupeolsynthase in eine β-Amyrinsynthase

verwandelt werden kann, analog zu Versuchen an OEW. Der Versuch ergibt darüber hinaus,

dass der aromatische Phenylalanin-Rest im nativen RcLUS1-Enzym an der Terminierung der

Zyklisierungsreaktion auf der Lupenyl-Kation-Ebene beteiligt ist. Davon abgeleitet ist es

wahrscheinlich, dass weniger der elektrostatische Effekt als vielmehr die Sperrigkeit des

Tryptophan in β-Amyrinsynthasen zur Ringerweiterung vom Lupenyl- zum Oleanylkation im

Verlauf der Zyklisierungsreaktion beiträgt.

In der Literatur wurden zwei verschiedene Zyklisierungsmechanismen für die Synthese

von Lupeol beschrieben, die sich in ihrem Deprotonierungsmechanismus unterscheiden.

Durch Fütterungs-Experimente von Hefezellen, die zuvor mit den Lupeolsynthasen OEW

bzw. TRW transformiert worden waren, mit [1,2-13C2]Acetat wurde nachgewiesen, dass diese

Synthasen beim finalen Deprotonierungsschritt eine der beiden endständigen Methylgruppen

des Lupenyl-Kations diskriminieren und das Proton ausschließlich von der Methylgruppe

extrahieren, die sich vom C6-Atom des Mevalonats ableitet (C30-Atom; Abb. 4-16). Im

Gegensatz dazu konnte in einem gleichen Versuchsaufbau nachgewiesen werden, dass die

multifunktionale Triterpensynthase ATLUP1, deren Hauptzyklisierungsprodukt Lupeol

darstellt, keine derartige Regiospezifität bei der Deprotonierung aufweist, so dass die


Protonenabstraktion sowohl an C29 als auch an C30 in jeweils gleicher Rate stattfindet

(Kushiro et al. 1999b; Kushiro et al. 1999a). Diese Ergebnisse führen zu dem Schluss, dass

sich im Pflanzenreich zwei Arten von Lupeolsynthasen evolvierten, die sich sowohl in ihrer

Sequenz als auch im Deprotonierungsmechanismus unterscheiden. Welcher Deproto-

nierungsmechanismus bei RcLUS1 vorliegt, könnte nur mit Hilfe von entsprechenden

Markierungsexperimenten geklärt werden, da die Sequenzähnlichkeiten keine Zuordnung zu

einer der beiden Lupeolsynthase-Typen zulässt.

O •

••

•

• •

OH •

••

•

• •

•OH

•

•••

•

OH

• ••

••

•

OH

•

•

••

••

••

OH •

••

••

•

2,3-Oxidosqualen Dammarenyl-Kation Baccharenyl-Kation

Lupenyl-Kation Lupeol

Lupeol

+ 1 : 1

OEW

TRW

ATLUP1

+

+ +

RcLUS1? ?

Abbildung 4-16: Mechanismus der Zykli-sierung von 2,3-Oxidosqualen, vermittelt durch die Lupeolsynthasen OEW, TRW und ATLUP1. Die Punkte markieren C-Atome, die vom C2-Atom des Mevalonat herrühren (nach Kushiro et al., 1999b).

29

30

20


4.3.2.3 Genomische Sequenzen von RcLUS1 und RcCAS1 Auch wenn die Genstrukturen der beiden Epoxysqualenzyklasen RcLUS1 und RcCAS1

mit ihrer unterschiedlichen Exonanzahl und der großen Variabilität in der Länge der

Intronbereiche zunächst nicht viel gemeinsam zu haben scheinen, so zeigt sich bei genauer

Betrachtung, dass beide Gene in der Länge ihrer Exons und der Positionen der Exon-Intron-

Grenzen große Übereinstimmungen aufweisen. Die Größe des Exon 1 von RcLUS1 stellt mit

675 bp die Summe der Exonlängen 1 bis 4 von RcCAS1 dar, ist also als Fusion der vier

Exons am N-terminalen Ende interpretierbar. In allen übrigen Exongrößen stimmen beide

Gene miteinander überein (vgl. Abb. 3-26 und 3-27).

Vergleichsdaten zur Genstruktur pflanzlicher Epoxysqualenzyklasen stehen vor allem

von A. thaliana zur Verfügung. Beim Gen der Cycloartenolsynthase ATCYC liegt die Anzahl

der Exons wie bei RcCAS1 bei 18 (Husselstein-Müller et al. 2001). Die Länge der 18 Exons

stimmt dabei mit den entsprechenden Exongrößen aus RcCAS1 nahezu exakt überein. Die

Arabidopsis-Triterpensynthase-Gene sind durch das Vorhandensein von 13 und 17 Exons

gekennzeichnet. Wie bei RcLUS1 sind die Variationen in der Anzahl der Exons durch die

Fusion einzelner Exonbereiche zu erklären; wie bei den Rizinus-Genen variiert die

Intronlänge bei den einzelnen Arabidopsis-OSCs extrem.

Aus den genomischen Sequenzdaten von Rizinus-Epoxysqualenzyklasen und dem

Vergleich mit entsprechenden Daten von Arabidopsis thaliana läßt sich ableiten, dass der

Splicing-Mechanismus in der gesamten Genfamilie der Epoxysqualenzyklasen konserviert ist

und die Exon-Intron-Grenzen jeweils weitgehend identisch sind. In dieser Klasse von Genen

tritt also nicht das Phänomen des „Intron sliding“ auf, wie es beispielsweise für die Squalen-

Epoxidase-Genfamilie beschrieben wurde (Schäfer et al. 1999).

5 Ausblick 145

5 Ausblick

Der Nachweis der Bedeutung von RcLUS1 für die Biosynthese von kutikulärem Lupeol

bei Individuen des Glaucous-Phänotyps von Ricinus communis eröffnet Möglichkeiten, das

Verständnis für die Regulation und Steuerung der Biosynthese von Triterpenen, die als

Wachskomponenten die Eigenschaften der pflanzlichen Kutikula beeinflussen, in der

Rizinuspflanze nun weiter zu vertiefen. An erster Stelle ist hier der Mechanismus zur

Transkriptionsregulation von RcLUS1 zu nennen. Ein wichtiger Ansatzpunkt hierfür ist die

Untersuchung der Promotorregion von RcLUS1, die vermutlich die Sprossachsen-

Gewebespezifität von RcLUS1 vermittelt. Für die Klonierung der RcLUS1-Promotorregion

können Sequenzdaten herangezogen werden, die im Rahmen des „Ricinus communis whole

genome shotgun sequencing project“ gewonnen wurden, das am Microbial Sequencing

Center (MSC) des National Institute of Allergy and Infections Diseases (NIAID), angesiedelt

am Institute for Genomic Research (TIGR), ins Leben gerufen wurde. Eine Sequenz aus

dieser seit kurzem online zugänglichen Datenbank stimmt nämlich mit der 5’-codierenden

Sequenz von RcLUS1 überein und enthält zusätzlich etwa 500 bp des stromaufwärts

gelegenen nicht codierenden Bereiches des Gens (WGS-Nummer: gnl|ti|1360811269).

Neben der Sprossachsen-Gewebespezifität wird die Frage nach der genauen Lokalisierung

der Aktivität von RcLUS1 im Sprossachsengewebe mit Hilfe von in situ-Hybridisierungs-

Techniken, sowie die Rolle, die der RcLUS1-Promotor dabei spielt, zu beantworten sein. Das

Vorhandensein bzw. Fehlen einer Epidermis-Spezifität von RcLUS1 wird es ermöglichen zu

verstehen, ob es sich bei der Ausbildung von Lupeol-Kristallen an der Sprossachsen-

oberfläche um einen eigenständigen, mit Kosten verbundenen Prozess handelt, oder ob

dieses Phänomen als ein Seiteneffekt im Zusammenhang einer allgemein erhöhten Lupeol-

Biosynthese in der Sprossachse zu interpretieren ist. In diesem Zusammenhang wird es

zusätzlich wichtig sein, die Gesamtmenge an biosynthetisiertem Lupeol im Pflanzengewebe

zu bestimmen und mit den quantitativen Daten aus der chemischen Analyse der kutikulären

Wachse zu vergleichen. Sollte sich tatsächlich eine auf die Epidermis beschränkte

Expression der Lupeolsynthase in Rizinus bestätigen, wäre es wünschenswert, den

RcLUS1-Promotor auf seine Spezifität hin mit Hilfe von Reportergenen in Arabidopsis zu

charakterisieren.

Um die Vorgänge der Akkumulation von Triterpenen in der pflanzlichen Kutikula ein-

gehend zu untersuchen, wäre es von Nutzen, das Spektrum der chemischen Wachs-

zusammensetzung in Pflanzen künstlich zu beeinflussen und zu Gunsten einer erhöhten

Triterpenbiosynthese zu verändern. Mit dem CER6-Gen aus Arabidopsis thaliana steht ein

Promotor zur Verfügung, der eine Epidermis-spezifische Expression eines unter seiner

Kontrolle stehenden Gens ermöglicht (Hooker et al. 2002). Da A. thaliana keine

5 Ausblick 146

nennenswerten Mengen an kutikulären Triterpenverbindungen aufweist, existieren hier beste

Voraussetzungen, um zu dokumentieren, ob und wie sich die Transformation von

Arabidopsispflanzen mit einem Konstrukt aus CER6-Promotor und dem RcLUS1-ORF auf

die kutikuläre Wachszusammensetzung in der Kutikula sowie ihre mikromorphologischen

Charakteristika bis hin zu einer möglichen Bildung epikutikulärer Triterpen-Wachskristalle

auswirkt.

Im Falle des Glossy-Phänotyps von Ricinus communis kommt es nicht zur Expression

des Lupeolsynthasegens RcLUS1. Eine mögliche Ursache hierfür könnte eine Mutation im

RcLUS1-Gen selbst sein. Für den Nachweis einer derartigen Mutation sollte die

Sequenzierung der genomischen Sequenz von RcLUS1 aus Individuen des Glossy-

Phänotyps (Kultivar Sanguineus) durchgeführt werden.

Wie in 4.3.2.2 ausgeführt, nimmt RcLUS1 innerhalb der bisher beschriebenen Lupeol-

synthasen aufgrund der relativ geringen Sequenzähnlichkeit zu beiden Untergruppen von

Triterpensynthasen mit vergleichbarer Produktspezifität eine Sonderstellung ein. Für eine

funktionale Zuordnung der Lupeolsynthase aus Ricinus communis zu einer der beiden LUS-

Untergruppen ist es notwendig, mit Markierungsversuchen analog zu Kushiro et al. 1999b

nachzuvollziehen, welchem Protonierungsmechanismus RcLUS1 folgt, um letztlich ein

besseres Verständnis für die evolutorischen Zusammenhänge von Lupeolsynthasen in

dikotylen Pflanzen zu erlangen.

Neben der Fortsetzung der Untersuchungen an Ricinus sollten vor allem die Arbeiten an

Lycopersicon esculentum forciert werden. Hier gilt es zunächst, die Triterpensynthase

LeTTS2 funktionell zu charakterisieren und die Bedeutung beider Triterpensynthasen für die

Synthese der kutikulären Triterpene durch Expressionsanalysen nachzuweisen. Micro-Tom

wird sich als Pflanzensystem gut eignen, die Biosynthese von Triterpenen durch Gene-

silencing der entsprechenden Synthasen über RNAi-Technik einerseits bzw. durch Über-

expression mit Hilfe der Transformation mit 35S-Promotor-TTS-Konstrukten andererseits

massiv zu beeinflussen, um so die Folgen solcher Manipulationen für die kutikuläre

Wachszusammensetzung zu dokumentieren. Vor allem das Zusammenspiel der

Triterpenkomponenten als zyklische kutikuläre Wachsbestandteile mit VLC-aliphatischen

Wachsverbindungen wird dabei gerade im Hinblick auf die Entstehung der Kutikula-

Schichtung und Bildung epikutikulärer Kristalle von großem Interesse sein.

Neben Rizinus und Tomate bieten sich in Zukunft weitere Pflanzensysteme an, die eine

eingehende molekulargenetische Untersuchung der Biosynthese kutikulärer Triterpene

lohnenswert erscheinen lassen und den Erkenntnisstand dieses Phänomens auf eine

breitere Basis stellen werden. Allen voran ist hier die Ameisenpflanzen-Gattung Macaranga

aus mehreren Gründen zu nennen: 1. Die chemische Analyse der Akkumulation von

5 Ausblick 147

Triterpenen in der Kutikula sowie die mikromorphologischen Charakteristika zahlreicher

Arten dieser Gattung wurden bereits hinreichend untersucht und dokumentiert (Markstädter

et al. 2000; Guhling 2002). Ein Vergleich der Expressionsmuster von charakterisierten OSCs

mit wachsanalytischen Daten wäre also mit wenig Aufwand zu bewerkstelligen. 2. Das

bereits entwickelte Primerdesign und die phylogenetische Verwandtschaft zu Rizinus sollte

eine Klonierung von Triterpensynthasen aus Macaranga-Pflanzen relativ problemlos

ermöglichen. 3. Die chemischen Analysen weisen darauf hin, dass in zahlreichen

Macaranga-Arten die Triterpene Taraxeron und Epitaraxerol angereichert werden. TTSs mit

entsprechenden Produktspektren wurden bislang nicht charakterisiert. 4. Im Falle von

Macaranga konnte den kutikulären Triterpenen als epikutikuläre Wachskristallbildner eine

konkrete ökologische Filterfunktion im Zusammenhang mit der Vergesellschaftung der

Pflanzen mit ihren Partnerameisen zugewiesen werden. Diese funktionale Zuweisung macht

eine weitere Erforschung der Biosynthese kutikulärer Triterpene besonders attraktiv.

6 Zusammenfassung 148

6 Zusammenfassung

Pentazyklische Triterpene finden sich in großer struktureller Vielfalt als Sekundär-

metabolite in Form von glycosylierten Verbindungen, aber auch als Aglykone, in zahlreichen

Pflanzen. In einigen Arten akkumulieren Triterpene in großen Mengen als kutikuläre Wachs-

bestandteile im primären Abschlussgewebe und beeinflussen auf diese Weise die

Grenzflächeneigenschaften der oberirdischen Pflanzenorgane. In der vorliegenden Arbeit

wurde die kutikulaspezifische Biosynthese von Triterpenen durch die Kombination molekular-

genetischer und analytischer Methoden exemplarisch an Ricinus communis eingehend

untersucht.

Die Rizinus-Pflanze tritt in zwei Sprossachsenphänotypen in Erscheinung. Der Glossy-

Phänotyp weist eine grünlich-glänzende Sprossachsenoberfläche auf und ist frei von

epikutikulären Wachskristallen. Die Sprossachsen von Individuen des Glaucous-Phänotyps,

charakterisiert durch das weißlich-matte Erscheinungsbild ihrer Oberflächen, sind dagegen

von einem dreidimensionalen Netzwerk fadenförmiger epikutikulärer Wachskristalle bedeckt.

Eine vergleichende chemische Analyse zeigte, dass 67 Tage alte Hypokotyle der Individuen

des Glossy-Phänotyps mit etwa 12,5 µg cm-2 kutikulärem Wachs bedeckt sind. Die

Zusammensetzung des kutikulären Wachsgemisches wird von VLC-aliphatischen

Verbindungen dominiert, Triterpene treten nur in sehr geringen Mengen in Erscheinung.

Hypokotyle der Individuen vom Glaucous-Phänotyp weisen mit 51,9 µg cm-2 dagegen eine

weit höhere Wachsbelegung auf, wobei das Wachsgemisch von Triterpen-Verbindungen, vor

allem durch die Hauptkomponente Lupeol mit 56% der Gesamtwachsmenge dominiert wird

(ca. 1500 µg Lupeol pro Hypokotyl). Durch eine selektive Beprobung ausschließlich der

epikutikulären Wachse konnte direkte Evidenz dafür gewonnen werden, dass die

fadenförmigen Wachskristalle hauptsächlich aus dem Triterpenol Lupeol bestehen, da diese

Komponente auch im epikutikulären Wachs stark angereichert vorlag. Um die Akkumulation

von Lupeol im Laufe der frühen Sprossachsenentwicklung des Glaucous-Phänotyps zu

dokumentieren, wurden entsprechende wachsanalytische Beprobungen an Hypokotylen in

den ersten zwei Monaten der Keimlingsentwicklung durchgeführt. Es zeigte sich, dass

Lupeol bereits in einer frühen Entwicklungsphase mit hohen Raten in die Kutikula eingelagert

wird: zwischen Tag 6 und Tag 25 nach der Keimung der Pflanzen nimmt die

Lupeolwachsbelegung mit einer Rate von 1,2 µg cm-2 d-1 zu. Bezogen auf die

Biosyntheseleistung einzelner Epidermiszellen ergab sich im Zeitraum zwischen Tag 11 und

Tag 18 nach der Keimung die höchste tägliche Lupeol-Zunahme mit 0,013 ng/Zelle.

Rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen belegten, dass die Lupeolakkumulation

von einer starken Zunahme der fadenförmigen Wachskristalle in der frühen

Hypokotylentwicklung begleitet wird.


Vor dem Hintergrund der wachsanalytischen und mikromorphologischen Daten zur

Charakterisierung beider Rizinus-Sprossachsenkutikula-Phänotypen war es nun von

zentraler Bedeutung, die für die Biosynthese des kutikulären Lupeols verantwortliche

Triterpensynthase zu klonieren. Mit Hilfe des entwickelten Primerdesigns zur homologie-

basierten Klonierung pflanzlicher 2,3-Oxidosqualenzyklasen wurden zwei Epoxysqualen-

zyklasen aus Ricinus communis kloniert und durch heterologe Expression in der Lanosterol-

synthase-defizienten Hefemutante GIL 77 jeweils als Cycloartenolsynthase (RcCAS1) und

monofunktionale Lupeolsynthase (RcLUS1) charakterisiert. Um die tatsächliche Relevanz

von RcLUS1 für die Biosynthese des kutikulären Lupeols nachzuweisen, wurde das

Expressionsmuster des Gens in verschiedenen Pflanzenorganen sowie im Laufe der frühen

Hypokotylentwicklung mit Northern-Blot-Analysen sowie semiquantitativen RT-PCR-

Ansätzen untersucht. Die auf den Glaucous-Phänotyp beschränkte sprossachsenspezifische

Expression und die hohe Expressionsrate von RcLUS1 in der frühen Entwicklungsphase mit

einem Peak an Tag 12 nach der Keimung stimmte exakt mit der zeitlichen Akkumulation von

Lupeol in der Sprossachsenkutikula bei Individuen des Glaucous-Phänotyps überein. Damit

handelt es sich bei RcLUS1 um die erste charakterisierte Triterpensynthase, die für die

Bildung kutikulärer Triterpene verantwortlich gemacht werden kann. Im Gegensatz zur

Lupeolsynthase zeigte die Cycloartenolsynthase aus Rizinus ein für „Housekeeping-Enzyme“

typisches konstitutives Expressionsmuster in allen Pflanzenorganen sowie während der

gesamten frühen Entwicklungsphase der Hypokotyle.

Mit dem Nachweis der Kutikularelevanz der Lupeolsynthase RcLUS1 konnte zum ersten

Mal ein tieferes Verständnis für den Mechanismus der Triterpenbiosynthese bzw. –akkumu-

lation in der pflanzlichen Kutikula gewonnen werden: Die Biosynthese von kutikulären

Triterpenen wird über die enzymatisch gesteuerte Zyklisierung von 2,3-Oxidosqualen

bewerkstelligt. Offensichtlich spielt eine Transkriptionsregulation auf der Ebene der

jeweiligen Triterpensynthase dabei eine zentrale Rolle. Zukünftige eingehende Promotor-

Untersuchungen sollten die Kenntnis über die Regulationsmechanismen der Triterpen-

Biosynthese entscheidend erweitern können.

Im Falle der Rizinuspflanze bewirkt die Hochregulierung von RcLUS1 und die damit

verbundene Ausbildung epikutikulärer Wachskristalle eine dramatische Veränderung der

chemischen und physikalischen Stamm-Oberflächenmerkmale des Glaucous-Phänotyps, wie

in ersten Lauftests mit Crematogaster-Ameisen gezeigt werden konnte. Inwieweit diese

Veränderungen der Kutikula-Eigenschaften im ökologischen Kontext der Pflanze von

entscheidender Bedeutung sind, muss in geeigneten Untersuchungen nachgewiesen

werden.

Phylogenetische Vergleiche zeigten, dass RcLUS1 erstaunlicherweise nur relativ geringe

Sequenzähnlichkeiten zu den bisher charakterisierten Lupeolsynthasen aufzeigt und somit


als Vertreter einer bisher nicht beschriebenen Klasse pflanzlicher Triterpensynthasen

angesprochen werden muss. Durch gerichtete Mutagenisierung wurde die RcLUS1-Mutante

F257W hergestellt und funktionell charakterisiert. Das Produktspektrum der mutagenisierten

Lupeolsynthase verschob sich von Lupeol nach β-Amyrin und bestätigte damit die

Bedeutung des dem Phenylalanin in bASs korrespondierenden Tryptophans für die

katalytische Funktionalität dieser Enzyme.

Mit der Klonierung der Triterpensynthasen LeTTS1 und LeTTS2 aus Lycopersicon

esculentum wurde der erste wichtige Schritt für ein tieferes Verständnis der Biosynthese

kutikulärer Triterpene in dieser Pflanze getan. LeTTS1 konnte als β-Amyrinsynthase

charakterisiert werden, die Charakterisierung der Produktspezifität von LeTTS2 bleibt als

dringendes Desiderat nachfolgenden Arbeiten vorbehalten. Im Gegensatz zur Stammkutikula

des Glaucous-Phänotyps von Ricinus communis werden in die Fruchtkutikula von Tomate

nicht nur ein, sondern mit α-, β- und δ-Amyrin gleich drei Triterpene in größeren Mengen

eingelagert. Der Nachweis einer tatsächlichen Relevanz der klonierten OSCs für die

Biosynthese dieser kutikulären Triterpene muss durch Untersuchungen zur Expression

dieser Gene erbracht werden. Für zukünftige Arbeiten zur Biosynthese kutikulärer Triterpene

dürfte Lycopersicon esculentum ein vielversprechendes Modellsystem abgeben. Zum einen

liegen durch die Arbeiten von Bauer und Vogg bereits detaillierte Daten zur chemischen

Zusammensetzung der Kutikulawachse vor. Zum anderen dürfte die Anwendung molekular-

genetischer Methoden wie beispielsweise das Herstellen von Knockout-Mutanten oder die

eingehende Untersuchung der Promotorregionen relevanter Gene in diesem Pflanzensystem

leichter zu bewerkstelligen sein als bei Arten wie Ricinus communis, die weniger im Fokus

der molekularphysiologischen Pflanzenforschung stehen.

7 Summary 151

7 Summary

Pentacyclic triterpenoids are a large group of secondary metabolites found in different

plant species, either as glycoside conjugates or as aglycones. The latter in many cases

accumulate to high amounts in the cuticular wax and hence the primary surface of above-

ground plant organs, influencing their surface properties. In the present work, the cuticle-

specific formation of triterpenoids was investigated in Ricinus communis stems, combining

analytical and molecular genetic methods.

Two phenotypes of castor bean could be distinguished based on the appearance of the

surface of all stem portions including the hypocotyls: The stems of the glossy phenotype

exhibit a green, glossy surface, and are devoid of wax crystals but instead covered by an

epicuticular wax film. In contrast, the stems of the glaucous phenotype are covered by a

layer of thread-like epicuticular wax crystals, forming a dense three dimensional network.

Comparative studies by GC-FID analysis revealed that the cuticles of 67-day old hypocotyls

of the glossy and the glaucous phenotypes contained 12.5 and 51.9 µg cm-2, respectively.

The wax mixture of the glossy phenotype was dominated by VLC aliphatic compounds,

whereas triterpenoids represented only small portions of the wax. In the cuticular wax of the

glaucous phenotype, VLC aliphatics were found in similar absolute amounts as in the glossy

phenotype, whereas the triterpene loads were significantly higher. Here, the wax mixture was

dominated by lupeol, making it the single most abundant component (56% of the total wax,

approx. 1500 µg lupeol per hypocotyl). Hence, the formation of epicuticular wax crystals on

stems and hypocotyls of glaucous individuals is correlated with the accumulation of large

amounts of lupeol in the corresponding stem wax. This correlation suggests that the thread-

like crystals are formed by this triterpenol. Additionally, selective sampling of the epicuticular

wax fraction gave direct evidence that the threads on glaucous hypocotyls are mainly formed

by lupeol, due to the fact that this compound was found to be enriched in the outermost

cuticle compartment. To monitor the accumulation of cuticular lupeol during ontogenesis, the

chemical composition of the wax mixture was studied at different stages of hypocotyl growth.

In these investigations, lupeol was found to accumulate rapidly during early development at

the surface of glaucous hypocotyls: between day 6 and day 25 the lupeol load increased by a

daily rate of 1.2 µg cm-2. During the period of highest lupeol increase from day 11 to day 18,

a daily rate of 0.013 ng/cell could be calculated. Within that early time period a sharp

increase in the number of epicuticular wax crystals on the surface of glaucous hypocotyls

was observed by SEM.

Based on the cuticular wax analyses of both stem phenotypes, it was hypothesized that a

triterpene synthase should exist in castor bean responsible for the biosynthesis of cuticular

lupeol in the glaucous phenotype. In a homology-based cloning approach two epoxy-

7 Summary 152

squalene cyclases were cloned from R. communis, functionally expressed in the yeast strain

GIL 77 and characterized as a cycloartenol synthase (RcCAS1) and a lupeol synthase

(RcLUS1). To prove the cuticle-relevance of RcLUS1, gel blot analyses and RT-PCR

analyses were carried out to determine the expression patterns of this gene in Ricinus

communis. Both the organ-specific expression of RcLUS1 (with an expression exclusively in

stems of the glaucous phenotype) and the expression pattern during hypocotyl development

(with a peak at day 12) exactly matched the accumulation of cuticular lupeol in the plant. In

contrast, RcCAS1 was constitutively expressed in all organs at various times, as it was

expected for a synthase involved in primary metabolism of the plant. From the strong

correlation of the organ specific and time dependent accumulation of lupeol in the cuticle of

glaucous hypocotyls on the one hand, and the expression patterns of the RcLUS1 gene on

the other, it can be concluded that the lupeol synthase RcLUS1 from castor bean is the

central enzyme responsible for the biosynthesis of cuticular lupeol. This is the first report on

a cuticle-relevant triterpene synthase.

In castor bean, the biosynthesis of cuticular triterpenoids is accomplished by enzymatic

cyclisation of the substrate 2,3-oxidosqualene and obviously controlled by a transcription

regulation of the corresponding epoxysqualene cyclase. It would by of high interest to

investigate the promoter region of the RcLUS1 gene to get a deeper understanding of the

regulation mechanisms leading to the formation of cuticular lupeol. The up-regulation of

RcLUS1 in the glaucous stems causes the formation of the epicuticular crystals on the

surface of the plants, i.e. the glaucous phenotype of castor bean, and hence leading to

dramatic changes in the chemical and physical properties of the stem surface (e.g. to

hamper insect adhesion on vertical plant structures, as it was shown in tests with

Crematogaster ants). It remains to be investigated whether these implications are of crucial

significance in the ecological context of the plant.

Phylogenetic analyses revealed that RcLUS1 surprisingly exhibits only weak sequence

similarities to the two clades of so far known lupeol synthases and was thus interpreted as a

first member of a new class of lupeol synthases in higher plants. The exceptional position of

RcLUS1 within the clade of dicot triterpene synthases is further underlined by a particular

amino acid involved in enzyme catalysis: instead of a Leu residue, highly conserved in lupeol

synthases, RcLUS1 contains a Phe at position 257. The RcLUS1 mutant F257W was

created by a site-directed mutagenesis approach and the mutated enzyme was functionally

characterized in yeast. The mutation resulted in an altered product pattern, switching from

lupeol to β-amyrin, thus confirming the importance of the corresponding Trp in bASs for the

catalytical function of these enzymes.

7 Summary 153

Besides Ricinus communis, Lycopersicon esculentum was chosen as a model plant to

study the biosynthesis of cuticular triterpenes. The implementation of the homology-based

primer design and cloning strategy developed for castor bean led to the successful cloning of

two triterpene synthases from L. esculentum. One of these enzymes, LeTTS1, was

characterized as a monofunctional β-amyrin synthase. The characterization of the second

triterpene synthase LeTTS2 has to be carried out in future investigations. In contrast to the

glaucous stems of R. communis, with α-, β- and δ-amyrin, more then one single triterpene

compound accumulates to high amounts in the tomato fruit cuticle. The evidence of the

cuticle-relevance of the cloned epoxysqualene cyclases LeTTS1 and LeTTS2 has to be

proven in accompanying experiments by determination of the expression patterns of these

genes. Two circumstances point to the fact that Lycopersicon esculentum will be a promising

model system for the examination of cuticular triterpene biosynthesis in future: First, there

are detailed analytical data available from the literature, describing the chemical composition

of the cuticular wax mixture. Second: The use of a broad range of molecular genetic

techniques as the fundament for extensive investigations of triterpene biosynthesis can be

established much more easily in tomato than in other plants like castor bean.

8 Literaturverzeichnis 154

8 Literaturverzeichnis

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Anhang A: Medien 165

Anhang A Verwendete Medien und Puffer 1% Agarosegel:

Agarose 0,38 g bzw. 0,8 g 0,5x TBE-Puffer 38 ml bzw. 80 ml Agarose durch Hitzezufuhr in Lösung bringen 1%-Ethidiumbromid-Gebrauchslösung 3 µl Church-Puffer (400 ml):

1 M NaPO4, pH 7,0 200 ml 25% SDS 112 ml 0,5 M EDTA 8 ml H2O bidest. 80 ml DNA-Extraktions-Puffer (200 ml):

2% w/v CTAB [=Hexadecyltrimethylammoniumbromid] 4 g 1,42 M NaCl 16,83 g 20 mM EDTA 32 ml aus 0,5 M Stammlsg. 100 mM Tris pH 8.0 20 ml aus 1 M Stammlsg. 2% w/v PVP 40 [Polyvinylpyrrolidin] 4 g 5 mM Ascorbat 0,176 g 4 mM Diethyldithiocarbamat 0,137 g

Autoklavieren Hefe-Medium YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose) (500 ml):

1% (Difco) Hefeextrakt (Puder) 5 g 2% Bacto Pepton 10 g nach Autoklavieren Zugabe von (steril filtriert): 2% Dextrose 10 g 20 µg/ml Ergosterol in EtOH/Tween80 (5mg/ml) (1:1) 10 mg in 5 ml 13 µg/ml Heminchlorid in 50% EtOH (Zugabe von NaOH, 6,5 mg bis Heminchlorid gelöst)

für Platten vor dem Autoklavieren Zugabe von: 2% Difco Agar 10 g Hefe-Resting-Medium:

0,1 M Kaliumphosphat; pH 7,0 nach Autoklavieren Zugabe von (steril filtriert): 3% Glucose 13 µg/ml Heminchlorid in 50% EtOH (Zugabe von NaOH, bis Heminchlorid gelöst)


Hefe-SC-Minimalmedium (1000 ml):

0,01% Adenin 100 mg 0,01% Arginin 100 mg 0,01% Cystein 100 mg 0,01% Leucin 100 mg 0,01% Lysin 100 mg 0,01% Threonin 100 mg 0,01% Tryptophan 100 mg 0,005% Aspartat 50 mg 0,005% Histidin 50 mg 0,005% Isoleucin 50 mg 0,005% Methionin 50 mg 0,005% Phenylalanin 50 mg 0,005% Prolin 50 mg 0,005% Serin 50 mg 0,005% Valin 50 mg 0,67% Yeast nitrogen base w/o aas 6,7 g nach Autoklavieren Zugabe von (steril filtriert): 20% Dextrose-Lösung 100 ml 20 µg/ml Ergosterol in EtOH/Tween80 (5mg/ml) (1:1) 20 mg in 5 ml 13 µg/ml Heminchlorid in 50% EtOH (Zugabe von NaOH, 13 mg bis Heminchlorid gelöst)

für Platten vor dem Autoklavieren Zugabe von: 2% Difco Agar 20 g Hefe-SC-U-Induktionsmedium (1000 ml):

s. SC-Minimalmedium, jedoch 2% Galaktose anstatt Dextrose LB-Medium (Lura-Bertani-Medium) (1000 ml):

Trypton 10 g Hefe 5 g NaCl 10 g mit H2O bidest. auf 1 l auffüllen und auf pH 7 einstellen und autoklavieren LB-Indikatorplatten (1000 ml):

Trypton 10 g Hefe 5 g NaCl 10 g Agar-Agar 10 g mit H2O bidest. auf 1 l auffüllen und auf pH 7 einstellen und autoklavieren nach dem Autoklavieren Zugabe von: Amp 50 (50 mg/ml); [Endkonz.: 100µg/ml] 2 ml IPTG (1 M) 8 µl pro Platte X-Gal (50 mg/ml) 20 µl pro Platte 10x MOPS-Puffer (500 ml):

MOPS 20,94 g 3 M NaOAc (pH 7,0) 8,4 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) 10,0 ml mit H2O bidest. auf 500 ml auffüllen


MOPS-Agarose-Formaldehyd-Gel (150 ml):

Agarose 2,25 g H2O bidest. 110 ml Agarose durch Hitzezufuhr in Lösung bringen 10x MOPS-Puffer 15 ml Formaldehyd (37%) 25,1 ml RNA-Ladepuffer (400 µl):

Formaldehyd (37%) 72 µl Formamid 200 µl Bromphenolblau-Lsg. 1,6 µl Glycerol 18,4 µl 0,5 mg/ml Ethidiumbromid 8 µl 10x MOPS-Puffer 100 µl 0,5x TBE-Puffer (1000 ml):

Tris-Base 54 g Borsäure 27,5 g 0,5 M EDTA, pH: 8,0 20 ml auf 1 l mit H2O auffüllen und autoklavieren

Anhang B: Pflanzliche Epoxysqualenzyklasen 168

Anhang B Klonierte und charakterisierte pflanzliche Epoxysqualenzyklasen Tabelle B-1: Genbank-Akzessionsnummern der NCBI-Datenbank und Referenzen pflanzlicher Epoxy-squalenzyklasen. In der Zusammenstellung berücksichtigt wurden ausschließlich auf ihre Funktion hin charakterisierte Zyklasen.

Enzym Pflanze Name Nukleotid-

Akzessions-Nummer

Protein- Akzessions-

Nummer Referenz

CAS Arabidopsis thaliana AtCAS1 U02555 AAC04931 Corey et al. 1993 MFS Arabidopsis thaliana ATLUP1 U49919 AAD05032 Herrera et al. 1998

MFS Arabidopsis thaliana ATLUP2 AC002986 AAC17070 Husselstein-Muller et al. 2001; Kushiro et al. 2000b

MFS Arabidopsis thaliana ATLUP5 AC007152 AAF98208 Ebizuka et al. 2003 MFS Arabidopsis thaliana ATPEN6 AC007260 AAD30585 Ebizuka et al. 2003 bAS Avena strigosa AsbAS1 AJ311789 CAC84558 Haralampidis et al. 2001 LUS Betula platyphylla BPW AB055511 BAB83087 Zhang et al. 2003 CAS Betula platyphylla BPX1 AB055509 BAB83085 Zhang et al. 2003 CAS Betula platyphylla BPX2 AB055510 BAB83086 Zhang et al. 2003 bAS Betula platyphylla BPY AB055512 BAB83088 Zhang et al. 2003 CAS Costus speciosus CSI AB058507 BAB83253 Kawano et al. 2002 MFS Costus speciosus CSV AB058508 BAB83254 Kawano et al. 2002 bAS Euphorbia tirucalli EtAS AB206469 BAE43642 Kajikawa et al. 2005 bAS Glycyrrhiza glabra GgbAS1 AB037203 BAA89815 Hayashi et al. 2001b CAS Glycyrrhiza glabra GgCAS1 AB025968 BAA76902 Hayashi et al. 2000 LUS Glycyrrhiza glabra GgLUS1 AB116228 BAD08587 Hayashi et al. 2004 MFS Lotus japonicus LJAMY2 AF478455 AAO33580 Iturbe-Ormaetxe et al. 2003 CAS Luffa cylindrica LcCAS1 AB033335 BAA85267 Hayashi et al. 2001a IMS Luffa cylindrica LcIMS1 AB058643 BAB68529 Hayashi et al. 2001a bAS Medicago truncatula MtbAS AJ430607 CAD23247 Suzuki et al. 2002 LUS Olea europaea OEW AB025343 BAA86930 Shibuya et al. 1999 CAS Panax ginseng PNX AB009029 BAA33460 Kushiro et al. 1998 bAS Panax ginseng PNY AB009030 BAA33461 Kushiro et al. 1998 bAS Panax ginseng PNY2 AB014057 BAA33722 Kushiro et al. 1998 MFS Pisum sativum PSM AB034803 BAA97559 Morita et al. 2000 CAS Pisum sativum PSX D89619 BAA23533 Morita et al. 1997 bAS Pisum sativum PSY AB034802 BAA97558 Morita et al. 2000 CAS Ricinus communis RcCAS DQ268870 ABB76767 Guhling et al. 2006 LUS Ricinus communis RcLUS DQ268869 ABB76766 Guhling et al. 2006 LUS Taraxacum officinale TRW AB025345 BAA86932 Shibuya et al. 1999

Anhang C: Primerdesign 169

Anhang C Primerdesign zur homologiebasierten Klonierung pflanzlicher Epoxysqualen-zyklasen

AtCAS1 MWKLKIA 7 atgtggaaactgaagatcgcg 21 CASBPX2 MWKLKIA 7 atgtggaagctgaagatcgcg 21 GglCAS MWKLKIA 7 atgtggaagctcaagattgcg 21 PsCAS1 MWKLKVA 7 atgtggaagcttaaaattgca 21 PNX MWKLKIE 7 atgtggaagctcaaggttgcg 21

BPY MWRLKIA 7 atgtggaggcttaagatcgca 21 GgbAS1 MWRLKIA 7 atgtggaggctgaagatagcg 21 MtbAS MWKLKIG 7 atgtggaagctgaagattgga 21 PNY MWKLKIA 7 atgtggaagcttaagatagcg 21 PNY2 MWRLMTA 7 atgtggaggctaatgacagcc 21 PSY MWRLKIA 7 atgtggaggttgaagatagca 21

BPW MWKLKIA 7 atgtggaagttgaagatagcg 21 GgLUS1 MWKLKIG 7 atgtggaagctgaagatagga 21 OEW MWKLKIA 7 atgtggaagttgaagattgct 21 TRW MWKLKIA 7 atgtggaagctgaaaatagca 21

AtLUP1 MWKLKIG 7 atgtggaagttgaagatagga 21 AtLUP2 MWRLRIG 7 atgtggagactaagaattgga 21 LJAMY2 MWKLKVA 7 atgtggaagctgaaggtagca 21 PSM MWKLKIG 7 atgtggaagctgaagatagga 21 LcIMS1 MWRLKVA 7 atgtggaggcttaaggtagca 21 Primerdesign: OGN3S ATGTGGARGYTRAHRAYWG OGN4S ATGTGGARGYTRAHRATWG OGN5S ATGTGGARGYTRAHRAYAG OGN6S ATGTGGARGYTRAHRATAG

Abbildung C-1: Aminosäuresequenz-Alignment (links) und Nukleotidsequenz-Alignment (rechts) für den N-terminalen Sequenzbereich von 2,3-Oxidosqualenzyklasen sowie das daraus resultierende Primerdesign. In den Alignments sind die Positionsnummern der jeweils letzten Aminosäure bzw. des letzten Nukleotids angegeben.



Lupeol- synthasen



AtCAS1 HQNEDGGWG 165 caccagaatgaggacggaggttggggt 495 CASBPX1 HQNEDGGWG 176 catcagaatgaagatgggggttggggt 528 CASBPX2 HQNKDGGWG 165 catcagaacaaagatggtgggtgggga 495 GglCAS HQNKDGGWG 165 catcagaacaaggatggtgggtggggt 495 LcCAS1 HQNKDGGWG 173 catcagaataaagatgggggttggggt 519 PNX HQNRDGGWG 165 catcagaacagagatggtgggtggggt 495 PsCAS1 HQNKDGGWG 165 catcagaacaaggatggtgggtggggt 495

BPY HQNEDGGWG 166 catcagaatgaagatggtgggtgggga 498 GgbAS1 HQNEDGGWG 166 caccagaatgaagatggagggtggggg 498 MtbAS HQNEDGGWG 166 caccaaaatgaagatggaggatggggg 498 PNY HQNEDGGWG 168 catcagaatgaagatggcgggtgggga 504 PNY2 HQNDDGGWG 166 catcagaacgatgatggtggctgggga 498 PSY HQNEDGGWG 166 caccagaacgaagatggagggtggggg 498

BPW HQNEDGGWG 164 catcagaacgaagatggaggctggggg 492 GgLUS1 HQNEDGGWG 167 catcagaatgaagatggtgggtgggga 501 OEW HQNEDGGWG 165 catcagaatgaagatggaggttggggg 495 TRW HQNEDGGWG 166 catcagaatgaagatggaggttgggga 498

AtLUP1 HQNEDGGWG 167 caccagaacgaagatggtggatgggga 501 AtLUP2 HQNEDGGWG 167 catcagaacgaagatggtgggtgggga 501 LJAMY2 HQNEDGGWG 166 catcagaatgaagatggagggtgggga 498 PSM HQNEDGGWG 166 catcagaatgaagatggagggtgggga 498 LcIMS1 HQNEDGGWG 166 catcagaatgaagatgggggatggggg 498 Primerdesign: OGT4S CAYCAGAAYGAAGATGGW OGT5S AYCAGAAYGAWGATGGHGG OGT6S AYCAGAAYGAAGATGGWGG OGT7S GAAYGAWGATGGHGGNTGGG OGT8S GAAYGAAGATGGWGGNTGGG OGT9S AAYGAWGATGGHGGNTGGGG OGT10S AAYGAWGATGGHGGNTGGG OGT11S CAGAAYGAWGATGGHGGNTGGG OGC5S CAGAAYRRRGAYGGDGGNTGGG OGC6S CAGAAYRARGATGGDGGNTGGG

Abbildung C-2: Aminosäuresequenz-Alignment (links) und Nukleotidsequenz-Alignment (rechts) für den das QW2-Motiv umfassenden Sequenzbereich (gelb hervorgehoben) und das daraus resultierende Primerdesign für die Klonierung von Triterpen- bzw. Cycloartenolsynthasen. In den Alignments sind die Positionsnummern der jeweils letzten Aminosäure bzw. des letzten Nukleotids angegeben.




QW2

Lupeol- synthasen


AtCAS1 QQPSGGWGESY 659 caacaaccttcgggcggctggggagaaagctat 1977 CASBPX1 ELASGGWGESY 669 gagctcgcttcaggtggttggggagaaagttac 2007 CASBPX2 QLPSGGWGESY 659 cagcttccttcaggtggctggggagagagttat 1977 GglCAS QLPSGGWGESY 659 cagctcccatctggtggctggggagagagctat 1977 LcCAS1 ELASGGWGESY 667 gagcttgcttccggtggctggggagaaagttat 2001 PNX QVASGGWGESY 659 caagttgcttctggtggttggggagagagttac 1977 PsCAS1 QLPSGGWAESY 659 cagctcccatctggtggttgggcagaaagttat 1977

BPY QRDNGGWGESY 661 caaagagataatggtggttggggagagagctat 1983 GgbAS1 QREDGGWGESY 661 cagagagaggatggtggatggggggagagctat 1983 MtbAS QREDGGWGESY 661 cagagagaggatggtgggtggggggagagctat 1983 PNY QMDDGGWGESY 662 cagatggatgatggcggttggggagaaagctac 1986 PNY2 QRSDGGWGESY 660 caacgcagtgatggtggttggggagaaagctat 1980 PSY QREDGGWGESY 661 cagagagaggacggcgggtggggggaaagctat 1983

BPW QLPNGGWGESY 658 cagctacctaatggtggatggggagaaagttac 1974 GgLUS1 QLPNAGWGESY 658 cagcttcctaatgcggggtggggagaaagttac 1974 OEW QLPDGGWSESY 659 caattaccggatggtggatggagtgaaagctac 1977 TRW QLPDGGWGESY 661 caacttccggatggtggatggggagagagttat 1983

AtLUP1 QRDDGGWGESY 659 caaagagatgatggaggttggggtgaaagctat 1977 AtLUP2 QNQEGGWGESY 667 caaaaccaggagggtggttggggagagagctat 2001 LJAMY2 QSKDGGWGESY 661 caatcaaaggatggtgggtggggagagagttat 1983 PSM QREDGGWGESH 661 caaagagaggatggtgggtggggggagagccat 1983 LcIMS1 QNPEGGFGESY 658 cagaatccagaaggagggtttggagagagctac 1974 Primerdesign: OGN1A ATGGHGGDTGGRGDGARAGYYA OGN2A ATGGTGGDTGGGGDGARAGYYA OGN3A GGTGGDTGGRGDGARAGYYA

Abbildung C-3: Aminosäuresequenz-Alignment (links) und Nukleotidsequenz-Alignment (rechts) für den das QW4-Motiv umfassenden Sequenzbereich (gelb hervorgehoben) und das daraus resultierende Primerdesign für die Klonierung von 2,3-Oxidosqualenzyklasen. In den Alignments sind die Positionsnummern der jeweils letzten Aminosäure bzw. des letzten Nukleotids angegeben.

multifunktionale Triterpen- synthasen

QW4

Cycloartenol-synthasen


Lupeol- synthasen


AtCAS1 DFPQQEI 722 gattttccacaacaggaaata 2166 CASBPX1 DFPQEEI 732 gattttcctcaagaggagatt 2196 CASBPX2 DFPQEEI 722 gattttcctcaagaggaaatc 2166 GglCAS DFPQQEI 722 gactttccgcaacaggaaata 2166 LcCAS1 DFPQEEI 730 gattttcctcaagaggagatc 2190 PNX DFPQEEI 722 gatttcccacaggaggagatc 2166 PsCAS1 DFPQEEI 722 gactttccgcaagaggaaata 2166

BPY DFPQQEI 724 gattttcctcaacaggaaatc 2172 GgbAS1 DWPQQEI 724 gattggccccaacaggaaatc 2172 MtbAS DWPQQEI 724 gattggccccaacaggaaatc 2172 PNY DFPQQEI 725 gattttccccaacaggaaata 2175 PNY2 DFPQQEI 723 gattttccccaacaggaaatc 2169 PSY DWPQQEI 724 gattggccacaacaggaaatc 2172

BPW DFPQQEI 721 gactttcctcaacaggaaatc 2163 GgLUS1 DFPQQEI 721 gacttcccacagcaggagatt 2163 OEW DFPQEEI 722 gactttcctcaagaggaaatt 2166 TRW DFPQQEI 724 gactttcctcaacaggaaatc 2172

AtLUP1 DFPQQEI 722 gattttcctcaacaggaaata 2166 AtLUP2 DFPQQEV 730 gatttcccgcaacaggaagta 2190 LJAMY2 DWPQQDI 724 gattggccccaacaggatatt 2172 PSM DWPQQEL 724 gattggccccaacaggaactt 2172 LcIMS1 DFPQEEI 721 gattttcctcaagaggaaatt 2163 Primerdesign: OGN7A GAYTTTCCTCAAWAGGAAAT Abbildung C-4: Aminosäuresequenz-Alignment (links) und Nukleotidsequenz-Alignment (rechts) und das daraus resultierende Design für den Antisense-Primer OGN7A. In den Alignments sind die Positionsnummern der jeweils letzten Aminosäure bzw. des letzten Nukleotids angegeben.



Lupeol- synthasen



AtCAS1 WALGEYR 750 tgggcgttgggggagtaccgt 2250 CASBPX1 WALGEYR 760 tgggcccttggagaatatcgt 2280 CASBPX2 WALGEYR 750 tgggcattgggagagtaccgc 2250 GglCAS WALGEYR 750 tgggcgttgggagaataccgt 2250 LcCAS1 WALGEYR 758 tgggcccttggagaatatcgc 2274 PNX WALGEYR 750 tgggctttgggagaatatcga 2250 PsCAS1 WALGEYR 750 tgggcgttaggagaataccgc 2250

BPY WALAEYR 752 tgggctctggcagaataccgc 2256 GgbAS1 WALAEYR 752 tgggctctagctgagtatcgt 2256 MtbAS WALAEYR 752 tgggctctagccgagtatcgt 2256 PNY WALAEYR 753 tgggctctagcagagtatcgg 2259 PNY2 WALAEYR 751 tgggctttagcagaatatcga 2253 PSY WALAEYR 752 tgggctctagctgagtatcgt 2256

BPW WALGEYR 749 tgggctcttggagaatatcgg 2247 GgLUS1 WAMGEYR 749 tgggctatgggagagtatcgt 2247 OEW WALGEYR 750 tgggctctcggtgagtatcgt 2250 TRW WALGEYR 752 tgggcacttggtgaatatcgt 2256

AtLUP1 WALAEYR 750 tgggcactcgcagaataccga 2250 AtLUP2 WALTLYT 758 tgggccctcacactatac--- 2271 LJAMY2 MALAEYR 752 atggccctagctgaatatcgt 2256 PSM WALAEYR 752 tgggctctagctgaatatcgt 2256 LcIMS1 MALGEYC 749 atggcgttgggagaatattgt 2247 Primerdesign: OGN4A TGGGCHYTNGWSGARTAYCG OGN5A TGGGCTCTYGWSGARTAYCG OGN6A TGGGCACTYGWSGARTAYCG

Abbildung C-5: Aminosäuresequenz-Alignment (links) und Nukleotidsequenz-Alignment (rechts) und das daraus resultierende Design für die Antisense-Primer OGN4A, OGN5A und OGN6A. In den Alignments sind die Positionsnummern der jeweils letzten Aminosäure bzw. des letzten Nukleotids angegeben.



Lupeol- synthasen


Anhang D: Verwendete Oligonukleotidprimer 174

Anhang D Verwendete Oligonukleotidprimer Tabelle D-1: Degenerierte Oligonukleotidprimer für die homologiebasierte Klonierung pflanzlicher Oxidosqualenzyklasen. Angegeben sind neben der Länge und der Schmelztemperatur Tm [°C] auch der Degenerierungsgrad DG sowie die Position der Primer (5’-Ende) bezogen auf die Nukleotidsequenz der Cycloartenolsynthase AtCAS1 aus Arabidopsis thaliana (Corey et al. 1993).

Name Sequenz (5’-3’) Position Länge Tm DG

OGA1S TTYGGHAGYCAARMRTGGGAT 1236 21 57,5 96 OGC1S TAYAATGGMAGYCARYTVTGGGA 1236 23 58,8 96 OGC5S CAGAAYRRRGAYGGDGGNTGGG 472 22 67,1 384 OGC6S CAGAAYRARGATGGDGGNTGGG 472 22 64,9 96 OGL1S TTTGGVTGYCARHTGTGGGAT 1236 21 63,8 36 OGN1A TRRCTYTCHCYCCAHCCDCCAT 1976 22 62,7 432 OGN1S TGGRTYKSNGARGATGGVHTVA 1203 22 60,5 3456 OGN2A TRRCTYTCHCCCCAHCCACCAT 1976 22 67,4 72 OGN2S TGGGTYKCNGARGATGGVHTVA 1203 22 61,5 864 OGN3A TRRCTYTCHCYCCAHCCACC 1976 20 60,6 144 OGN3S ATGTGGARGYTRAHRAYWG 1 19 52,0 192 OGN4A CGRTAYTCSWCNARDGCCCA 2249 20 59,2 384 OGN4S ATGTGGARGYTRAHRATWG 1 19 50,9 96 OGN5A CGRTAYTCSWCRAGAGCCCA 2249 20 58,5 32 OGN5S ATGTGGARGYTRAHRAYAG 1 19 52,0 96 OGN6A CGRTAYTCSWCRAGTGCCCA 2249 20 59,3 32 OGN6S ATGTGGARGYTRAHRATAG 1 19 50,9 48 OGN7A ATTTCCTWTTGAGGAAARTC 2165 20 50,1 4 OGT10S AAYGAWGATGGHGGNTGGG 475 19 57,4 48 OGT11S CAGAAYGAWGATGGHGGNTGGG 472 22 62,7 48 OGT1S CAKWSYTTYGGNWGYCARNHR 1230 21 57,9 12288 OGT2S CAGAGTTTYGGNWGYCARNHR 1230 21 58,2 1536 OGT3S TTYGGNWGYCARNHRTGGGAT 1236 21 62,8 1536 OGT4S CAYCAGAAYGAAGATGGW 469 19 57,3 8 OGT5S AYCAGAAYGAWGATGGHGG 470 19 55,2 24 OGT6S AYCAGAAYGAAGATGGWGG 470 19 54,5 8 OGT7S GAAYGAWGATGGHGGNTGGG 474 20 60,0 48 OGT8S GAAYGAAGATGGWGGNTGGG 474 20 59,4 16 OGT9S AAYGAWGATGGHGGNTGGGG 475 20 60,0 48

Symbolschlüssel der degenerierten Nukleotide: R = A + G, Y = C + T, M = A + C, K = G + T, S = G + C, W = A + T, H = A + T + C, D = G + A + T, V = G + A + C, N = A + C + G + T.


Tabelle D-2: Spezifische Oligonukleotidprimer für die Ricinus communis Lupeolsynthase RcLUS1. Angegeben sind neben der Länge und der Schmelztemperatur Tm [°C] auch die Position der Primer (5’-Ende) innerhalb der Transkript-Nukleotidsequenz von RcLUS1.

Name Sequenz (5’-3’) Position Länge Tm

OGLS10A CCCAAGAAGATATACCAGTT 682 20 54,7 OGLS11A ACCAGTTGCACCACCA 672 16 59,6 OGLS12A GATATACCAGTTGCACCACC 677 20 59,3 OGLS12S ATATACCACTAATCTCATGC 1 20 52,3 OGLS13A TCGCCCTCTTTCACAAGCA 639 19 67,1 OGLS13S GTCTACATTACAGGACACC 424 19 55,2 OGLS14A GTGCTGTGACCTTCAATGTG 548 20 61,9 OGLS14S ATCAAGTGGAATAGTGTGCG 919 20 56,4 OGLS15A GGTGTCCTGTAATGTAGAC 442 19 55,2 OGLS15S GAGCCAGCAAGAGCAGGA 1627 18 58,4 OGLS16A GACGCACACTATTCCACTTG 940 20 58,4 OGLS16S GCAAAGAGGATGTGGCGAAT 19 20 66,2 OGLS17A GCTTGGATTGCTGATGAAG 1736 19 55,2 OGLS18A CATAGACTGAGTTCATCAC 2356 19 53,0 OGLS19A ATACCGATTATTGGTAGTC 2398 19 50,9 OGLS1A CCACCATCATCTCTTTGTGATT 1991 22 56,5 OGLS1S ACAAGTCTAGCTCTTCAGGC 1282 20 57,3 OGLS2A TTTAGTAGAAAATCAACACC 1970 20 49,1 OGLS2S AAGTCTAGCTCTTCAGGCCC 1284 20 49,4 OGLS3A GCCTGAAGAGCTAGACTTG 1300 19 56,7 OGLS3S ATCACAAAGAGATGATGGTGG 1971 21 55,9 OGLS4A TCATGAGAGAGGTCGCTAG 1328 19 56,7 OGLS4S TGCTTCTCTTATGGTACCTG 1867 20 55,3 OGLS5A AGTGTAGGTCCTATTTC 1343 17 47,9 OGLS6A TTTCTGAAGTCGCCCGA 1409 17 52,8 OGLS7A GTAGGCAGCACTTCAAGC 1510 18 56,0 OGLS8A CACTCGTACACACCAAG 723 17 52,2 OGLS9A CAAGAAGATATACCAGTT 683 18 45,5 OGLS9S CACATTGAAGGTCACAGCAC 529 20 61,9

Tabelle D-3: Spezifische Oligonukleotidprimer für das Fragment der potenziellen Ricinus communis Triterpensynthase RcTTS2. Angegeben sind neben der Länge und der Schmelztemperatur Tm [°C] auch die Position der Primer (5’-Ende) innerhalb der Transkript-Nukleotidsequenz von RcTTS2.


OGLSB1A TTTCGTCGCCCAGATTGCTG 49 20 70,5 OGLSB1S CTCAGCAATCTGGGCGACGA 28 20 71,0 OGLSB2A TCAACCCCCTTCCGCACAG 677 19 70,7 OGLSB2S CTGTGCGGAAGGGGGTTGA 659 19 70,7 OGLSB3A CATTCACTGTAACTTCTTCCA 650 21 56,8 OGLSB3S CAAGCAAACTCGGATGAAGG 84 20 64,6 OGLSB4A CCTTCATCCGAGTTTGCTTG 103 20 64,6 OGLSB4S TGGAAGAAGTTACAGTGAATG 633 21 56,8 OGLSB5A CACATTGAACCTCGCACCG 668 19 67,8 OGLSB5S CGGTGCGAGGTTCAATGTG 350 19 67,8


Tabelle D-4: Spezifische Oligonukleotidprimer für die Ricinus communis Cycloartenolsynthase RcCAS1. Angegeben sind neben der Länge und der Schmelztemperatur Tm [°C] auch die Position der Primer (5’-Ende) innerhalb der Transkript-Nukleotidsequenz von RcCAS1.


OGCS1A TGAACTGCGAATGCTGTGTC 1359 20 65,2 OGCS1S GACACAGCATTCGCAGTTCA 1340 20 65,2 OGCS2A CCATTCTCCATTTGAGCGTT 2234 20 63,8 OGCS2S AACGCTCAAATGGAGAATGG 2216 20 63,8 OGCS3A TAATGAATGAATGTGCCTTTT 1427 21 58,5 OGCS3S AGTATCCGTAAAGCCTGTGA 2000 20 58,8 OGCS4A AAGCCACATCTCAGGG 817 16 56,8 OGCS4S CATAAAAGGTTTGGTGGCTG 1954 20 61,8 OGCS5A AGGGATTATTACCAGACCACT 797 21 57,9 OGCS6A GATTATTACCAGACCACT 797 18 47,9 OGCS7A GCCCCTTCTCCCTCATTGG 681 19 68,0 OGCS8A GGACCTTCACCAAGCAGCCT 663 20 67,7 TYCS1A CAATGCGCCAGTGATAGACA 504 20 64,8 TYCS1S AAAGAAGAAAAGAAATGTGGAAGC 72 24 62,5 TYCS2A TTGCGTGCTTGATTCCAGTCTATT 999 24 67,5 TYCS2S TGATTATGGCGGTCCTATGTTTCT 439 24 66,1 TYCS3A TCCCAGAGTTGACTTCCATTAT 1341 22 61,3 TYCS3S CAGGGAGGATGTGGTGTCA 843 19 64,9 TYCS4A CTCAACGTACGGGTAGTCAAATA 1773 22 60,4 TYCS4S TTGCTGAAGATGGGATGAA 1286 19 61,8 TYCS5A GCCCGGCATCAATCAGACTC 2165 20 69,1 TYCS5S ATGGTGATGGTGGCTTTCCTACTT 1662 24 67,4 TYCS6A AAGAGACCTAAAGAGACGAAATAA 2428 24 58,2

Tabelle D-5: Spezifische Oligonukleotidprimer für die Lycopersicon esculentum β-Amyrinsynthase LeTTS1. Angegeben sind neben der Länge und der Schmelztemperatur Tm [°C] auch die Position der Primer (5’-Ende) innerhalb der Transkript-Nukleotidsequenz von LeTTS1.


AMYT CGGTATTCAGCCAAACCCCA 2340 20 59,4 LEASA1A GCTCAGCTGGGAATACT 527 17 55,0 LEASA2A AAGGTGGAAGAAAAAACAAA 473 20 57,7 LEASA3A CTCCAAGAAACTGTATCCG 299 19 57,2 OGAS1A CATCATTCATCTCACTGGC 1388 19 54.5 OGAS2A GTCATGTCCTTTTCTAAGCG 1419 20 55.3 OGAS2S AAATGCCTGATGGTTCATGG 1890 20 55.3 OGAS3A CATTCCTTTGAAATCACCAG 1474 20 53.2 OGAS3S TGCTTCACATATGGTTCCTG 1928 20 55.3 OGAS4A GTTCCTATCCATTCAAAA 792 18 52,0 OGAS4S TCTTGGAGGGCTTGTTGC 1954 18 56.0 OGAS5A ATGTTTTTCCCCACGAAGG 755 19 63,6 OGAS6A AGAATCCATTTCCTTGCTCTA 711 21 59,3 OGAS7A CACGCATTATTTACACCGCC 683 20 64,9

OGASG1A ATTTAGTTGTTTTCTAATGGTAAT 2376 24 53,8


Tabelle D-6: Spezifische Oligonukleotidprimer für die potentielle Lycopersicon esculentum Triterpen-synthase LeTTS2. Angegeben sind neben der Länge und der Schmelztemperatur Tm [°C] auch die Position der Primer (5’-Ende) innerhalb der Transkript-Nukleotidsequenz von LeTTS2.


OGASG1S AGATGTGGAAGTTGAAGATTG 61 21 58,2 OGAS6A AGAATCCATTTCCTTGCTCTA 685 21 59,3 LEASB1S AGGGTTGTGGTAGTCAATC 1291 19 56,2

Tabelle D-7: Sonstige Oligonukleotidprimer, die zur cDNA-Erststrangsynthese, für Sequenzierungs-reaktionen, für die Klonierung der Full-length-Klone von RcLUS1, RcCAS1, LeTTS1 und LeTTS2, zur Synthese der Positivkontrolle für die RT-PCR bzw. Northern-Blot-Technik sowie für Site-directed mutagenesis-Versuche verwendet wurden.

Name Sequenz (5’-3’) Länge Tm

AP GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT 37 75,2 AUAP GGCCACGCGTCGACTAGTAC 20 66,9 PY2A GGGCGTGAATGTAAGCGTGACATAA 25 71,1

RCACTINA GAGCTGCTCTTGGCAGTCTCAAGTTC 26 71,1 RCACTINS CGTTCTCTCCTTGTATGCCAGTGGTC 26 71,3

RCLSF257WA AAGTGATCCGACAGTAACACCACATTTTTGCTGGGTGTAAG 41 76,9 RCLSF257WS CTTACACCCAGCAAAAATGTGGTGTTACTGTCGGATCACTT 41 76,9 RCLST416HA GAAGAGCTAGACTTGTGTCCCAATGTTGACTTCCGAAACTCTGCAT 46 79,8 RCLST416HS ATGCAGAGTTTCGGAAGTCAACATTGGGACACAAGTCTAGCTCTTC 46 79,8

SP6 ATTTAGGTGACACTATAG 18 42,6 T3 AATTAACCCTCACTAAAGGG 20 53,2 T7 TAATACGACTCACTATAGGG 20 50,8

LETS2C5S TTGGAGCTCAAGATGTGGAAGTTGAAGATTGCAA 34 71,7 LETS2C6A CCCGAATTCCTATATGTAGTTGTGTTTTAATGGT 34 69,3 LETS1C3A CCCGCGGCCGCTTAGTTGTTTTCTAATGGTAATAC 35 75,4 LETS1C4S TTGGAGCTCAGGATGTGGAAATTGAAAATTGCTG 34 71,7 LETS1C5A CCCGAATTCTTAGTTGTTTTCTAATGGTAATAC 33 67,7 RCCS1C1A ATTGCGGCCGCTTATGAAGCCTTGAGAACCCG 32 82,9 RCCS1C1S TTGAGGTACCATGTGGAAGCTAAGGATTGCA 31 75,2 RCCS1C2S TTGGAATTCAAAATGTGGAAGCTAAGGATTGC 32 74,1 RCTS1C1A ATTGCGGCCGCTCATAAATTATTGGTGAATC 31 75,8 RCTS1C1S TTGGAGCTCAGGATGTGGCGAATTAAAATAG 31 73,7

Anhang E: Klonierte Sequenzdaten 178

Anhang E Klonierte Sequenzdaten 1 atataccact aatctcatgc aaagaggatg tggcgaatta aaatagctga gggaggaaat 60 61 aacccttata tttatagcac aaacaatttt cagggaaggc aaatttgggt atttgatcct 120 121 aatgctggta ctcctgaaga acaagccgag gttgaagaag ctcgtcaaaa cttctggaaa 180 181 aatcgatttc aggtcaagcc taactctgat ctcctttggc aactccagtt tctaagggag 240 241 aaaaatttta agcaaaaaat tccaaaagta aaggttgaag atggcgagga gatcacaagt 300 301 gaaatagctg cagccgcttt gaggagaagc gtccacttgt tttcggcctt gcaggcaagc 360 361 gatggccatt ggtgtgcaga aaatggaggc ctgctgttct ttttgcctcc cttggttttt 420 421 gctgtctaca ttacaggaca ccttaatact gtattttctc cagagcatcg caaagaaatc 480 481 ctccgttaca tatactgtca tcagaatgaa gatggtggat ggggaataca cattgaaggt 540 541 cacagcacta tgttttgcac agttcttaat tatatatgta tgcgtatact tggtgaagca 600 601 cgtgatggtg gaatagaaaa tgcttgtgaa agagggcgaa aatggatact cgatcatggt 660 661 ggtgcaactg gtatatcttc ttggggaaag acatggcttt cgatacttgg tgtgtacgag 720 721 tgggatggga ccaatcccat gcccccagag ttttgggcct ttccatcttc ttttccctta 780 781 cacccagcaa aaatgttttg ttactgtcgg atcacttaca tgccaatgtc gtacttgtac 840 841 gggaagaggt ttgttggtcc aatcacacca ctcattctac aaataagaga agaaatctat 900 901 aatgaacctt acaacaaaat caagtggaat agtgtgcgtc atttatgtgc aaaggaagac 960 961 aactattttc cacatccaac gatacagaaa ctgttatggg atgctctgta tacatttagc 1020 1021 gagcctctat tctctcgttg gcccttcaac aaattgagag agaaggctct caagataaca 1080 1081 atggatcaca ttcattatga agatcacaac agtcggtaca tcactattgg atgcgttgag 1140 1141 aagccgttat gcatgcttgc ctgttggatt gaagatcctc atggggaagc gtttaagaag 1200 1201 caccttgcca gaattgcaga ttacatatgg gttggagaag atggaataaa gatgcagagt 1260 1261 ttcggaagtc aaacatggga cacaagtcta gctcttcagg ccctgatagc tagcgacctc 1320 1321 tctcatgaaa taggacctac actaaaacaa ggacacgtct tcacgaagaa ttctcaggca 1380 1381 actgagaacc cttcgggcga cttcagaaaa atgtttcgtc atatctccaa aggagcttgg 1440 1441 acattctctg ataaagatca aggatggcaa gtttctgatt gtacagcaga aagcttgaag 1500 1501 tgctgcctac ttttctcaat gatgcctccc gaaattgttg gtgagaaaat ggaacctgaa 1560 1561 aaggtctatg attcagtcaa tgtcatactt tctcttcaga gccaaaatgg tggtttcaca 1620 1621 gcttgggagc cagcaagagc aggatcatgg atggagtggc tcaaccctgt agagttcatg 1680 1681 gaggatcttg tcgttgagca cgagtatgtg gagtgcactt catcagcaat ccaagcacta 1740 1741 gttcttttta aaaaattata tccccgacac aggaacaaag agattgaaaa ttgtatcata 1800 1801 aatgctgcgc agttcattga aaatatacaa gaacctgatg gttcatggta tggaaattgg 1860 1861 gggatatgct tctcttatgg tacctggttt gcactgaaag gattagctgc tgctggaagg 1920 1921 acatatgaaa attgttctgc tattcgtaaa ggtgttgatt ttctactaaa atcacaaaga 1980 1981 gatgatggtg gatgggcaga gagttatctt tcatgtccaa agaaggtgta tgttcctttt 2040 2041 gagggtaatc gatcaaatct agttcaaact gcttgggcaa tgatgggttt gatttatgga 2100 2101 ggacaggcca aaagagaccc tatgcctctt catcgcgctg caaagttatt aattaattct 2160 2161 caaacagatc ttggtgattt tcctcaacag gaacttacag gagcattcat gaggaattgc 2220 2221 atgctgcact atgcactatt taggaatact tttcccattt gggctttggc agaatatcgg 2280 2281 cgacatgtct tattcccttc tgctggattt ggttttggat tcaccaataa tttatgagtg 2340 2341 atgaactcag tctatgtact taattaattt gttttaattg actaccaata atcggtattt 2400 2401 ctacaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 2426 Abbildung E-1: Nukleotidsequenz des Transkripts der Ricinus communis Lupeolsynthase RcLUS1. Start- und Stopcodon sind jeweils fett gedruckt; die Sequenzbereiche, die dem DCTAE-Substrat-bindungsmotiv (grün) sowie dem QW3-Motiv (rot) entsprechen, sowie die nicht codierenden Sequenz-bereiche (grau) sind farblich hervorgehoben.


1 actgcaacaa acagaacgaa ctgctatcat tttactcaaa caagttaaca tcaattaaag 60 61 aaattgaaaa aaaagaagaa aagaaatgtg gaagctaagg attgcagaag gaagtggaaa 120 121 tccatggctt agaactacaa acgatcacat tgggagacaa gtctgggaat ttgattcatc 180 181 taaaatcgga tctccagaag agctctcaca aatcgaaaat gctcgtcaaa atttcaccaa 240 241 aaaccgcttt attcacaagc atagttcaga tctactcatg cgcattcagt tttcgaagga 300 301 aaatccaata tgtgaagtgt taccgcaagt aaaagtgaaa gaatcagaac aagttaccga 360 361 ggagaaagtg aaaattacgt taagaagggc attgaattac tattcatcta ttcaagctga 420 421 tgatggacat tggcctggtg attatggcgg tcctatgttt ctaatgcctg gcttgattat 480 481 agctctgtct atcactggcg cattgaatgc aattttatct gaggaacata agcgcgaaat 540 541 gtgtcgatat ctatacaacc accagaatag agatggcggt tggggcttac acattgaggg 600 601 accaagcaca atgtttggga gtgtattgtg ttatgtttcg ttaaggctgc ttggtgaagg 660 661 tcccaatgag ggagaagggg cagtcgagag aggccgtaat tggattctca aacatggtgg 720 721 tgctactgca attacgtcct ggggaaaaat gtggctttca gtacttggag catatgagtg 780 781 gtctggtaat aatcccttac cccctgagat gtggcttctc ccttacattc tcccagtcca 840 841 tccagggagg atgtggtgtc actgccggat ggtatatctt cccatgtcat atttatatgg 900 901 gaaaaggttt gttggtccaa tcacaccaac agttttgtct ttgagaaagg agctgtatac 960 961 tgtcccatat catgaaatag actggaatca agcacgcaac caatgtgcaa aggaagattt 1020 1021 gtactatcca catcctatgt tgcaagatgt actttgggca actcttcata agtttgttga 1080 1081 acctattctt atgcattggc ctggaaaaag gttgagagaa aaggctattc aaactgcgat 1140 1141 tgaacacata cactatgaag atgaaaatac tcgttacata tgcatagggc ctgtaaacaa 1200 1201 ggtgttaaat atgctttgct gttgggtgga agacccaaac tcagaagctt ttaagttgca 1260 1261 tcttccaaga ttatatgact acctctggct tgctgaagat gggatgaaaa tgcagggtta 1320 1321 taatggaagt caactctggg acacagcatt cgcagttcaa gcaattgtgt caactaatct 1380 1381 tattgaggaa tatggtccga ctctaaaaaa ggcacattca ttcattaaaa aaatgcaggt 1440 1441 tttggaaaat tgtccaggag atcttaattt ttggtatcgc cacatttcaa aaggtgcatg 1500 1501 gccattttca actgctgatc atggatggcc catctcagac tgcacagcag agggaataaa 1560 1561 agctcttatg ttgttatcaa agattccttc agagattgtt ggggaaggat taaatgcaaa 1620 1621 ccggttatat gatgcagtga atgttgttct ctcattacag aatggtgatg gtggctttcc 1680 1681 tacttatgag ctctcaagat cttatagttg gttggagttt atcaaccctg ctgaaacttt 1740 1741 tggtgacatt gttattgact acccgtacgt tgagtgtact tcagctgcaa ttcaagcttt 1800 1801 gacatcattc cgtaaatcat atcctgaaca tcagcgagaa gagatagaat gttgtatcaa 1860 1861 aaaggcagct aagttcatgg aaaaaattca gatatcagat ggctcatggt atggctcatg 1920 1921 gggtgtttgc ttcacctatg gtacatggtt tggcataaaa ggtttggtgg ctgccggaaa 1980 1981 aagctttggt aattgttcca gtatccgtaa agcctgtgat tttctgttgt ctaaacagtg 2040 2041 tccttctggt ggctggggag agagttatct ttcatgtcaa aagaaggttt attccaatct 2100 2101 tgaaggtgac aggtctcatg tggtaaatac tgcttgggct atgttgagtc tgattgatgc 2160 2161 cgggcaggct gagagagacc caacaccatt gcatcgtgca gcaagatatt taataaacgc 2220 2221 tcaaatggag aatggagatt ttccacagca ggaaatcatg ggagtattca ataggaattg 2280 2281 catgataaca tatgcggcct acagagacat tttcccaatt tgggcattgg gagaataccg 2340 2341 ttgccgggtt ctcaaggctt cataaacaag tggaaaaaac gttagaaaat aatatcattt 2400 2401 ctggttattt cgtctcttta ggtctctttt caaaaaattg ctagaaatgc ttcacacact 2460 2461 cttagagtta ttttaacttt aggcctcacc agactttatt tgatgggact caaaaaaaaa 2520 2521 aaaaaaaaa 2529 Abbildung E-2: Nukleotidsequenz des Transkripts der Ricinus communis Cycloartenolsynthase RcCAS1. Start- und Stopcodon sind jeweils fett gedruckt; die Sequenzbereiche, die dem DCTAE-Substratbindungsmotiv (grün) sowie dem QW3-Motiv (rot) entsprechen, sowie die nicht codierenden Sequenzbereiche (grau) sind farblich hervorgehoben.


1 acgtaagggc aacatatatt tcaaatttca tatattttat tgttgaggtg gtagacgtta 60 61 agagttcatt cgaacattcg attaaaggat gtggaaattg aaaattgctg aagggcaaaa 120 121 tggtccatat ttgtatagta caaataacta tgttggacga caaacgtggg agttcgatcc 180 181 aaatggtgga acgatagaag aacgggctaa gatagaagag gctcgtcaac aattttggaa 240 241 taatcgttat aaagtcaagc ctagtagtga tcttctttgg cggatacagt ttcttggaga 300 301 gaaaaatttc aaacaaaaaa ttccagcagt aaaagttgaa gaaggtgaag aaattagcca 360 361 tgaagttgct acaattgcat tgcatagagc agttaatttc ttctcagctt tacaggcaac 420 421 tgatggtcat tggcctgctg aaaatgctgg tcctttgttt tttcttccac ctttggttat 480 481 gtgtatgtat atcactgggc atcttaatac agtattccca gctgagcatc gaaaggaaat 540 541 tcttcggtat atatactgtc atcagaacga agatggtgga tggggtttgc acatagaagg 600 601 tcacagtact atgttctgta cagctctgag ttacatttgc atgaggatcc ttggagaagg 660 661 accagatggc ggtgtaaata atgcgtgtgc tagagcaagg aaatggattc ttgatcatgg 720 721 tagtgtcacc gcaattcctt cgtggggaaa aacatggctc tcgattcttg gagtttttga 780 781 atggatagga accaatccaa tgccacctga gttttggatt cttccatctt ttcttcccgt 840 841 gcatccagca aaaatgtggt gttactgtcg aatggtctac atgccgatgt cttacctcta 900 901 tgggaagaga ttcgttggtc caatcacacc tctcattttg caactaaggg aagagttata 960 961 tgatcgacca tacgatgaaa ttaactggaa gaaagtgcgc catgtatgtg caaaggagga 1020 1021 tctttattac cctcatccat tggttcaaga tttgatgtgg gatagtctct acatatgtac 1080 1081 cgagcctttg ttgacccgtt ggcctttcaa caagctgaga aacaaagctc ttgaagttac 1140 1141 catgaaacac atacactatg aagacgagaa tagtcgatac atcaccatcg gatgtgtcga 1200 1201 aaaagtattg tgcatgcttg cttgttgggt cgaggatcct aacggcgatt atttcaaaaa 1260 1261 acatcttgct aggatccctg attatttatg ggtagctgaa gatggaatga aaatgcagag 1320 1321 tttcggtagt caagaatggg atactggttt tgctatccaa gcactattgg ccagtgagat 1380 1381 gaatgatgag atagcagata cgcttagaaa aggacatgac tttataaaac aatctcaggt 1440 1441 gacgaacaat ccgtctggtg atttcaaagg aatgtatcga catatctcaa aaggatcatg 1500 1501 gactttttca gatcaagatc atggatggca agtctctgat tgcactgctg aagcattaaa 1560 1561 gtgctgcctt ctgttgtcta caatgcctcg tgaattagtc ggtcaggcaa tggagccagg 1620 1621 gcgattgtat gactcggtga atgttgttct ttcattacag agcaaaaatg gcggtttagc 1680 1681 agcatgggaa cctgcaggag cctccgagta tttggagctg ctgaatccta ctgaattttt 1740 1741 cgcggacatt gtcattgagc acgagtacgt cgaatgcact gcctcatcaa ttcaagcact 1800 1801 tgttctgttt aagaagctgt atcccggaca cagaaccaag gagattaaca tattcattga 1860 1861 taatgctgtt aaatatcttg aagatgtaca aatgcctgat ggttcatggt atggtaactg 1920 1921 gggtgtttgc ttcacatatg gttcctggtt tgctcttgga gggcttgttg cagcaggcaa 1980 1981 gtcctacaac aactctgcag ctgttcgtaa aggcgttgaa tttctgctaa gaacacaaag 2040 2041 atccgatggt ggttggggcg aaagctaccg ttcttgccca gacaaggtat atagagaact 2100 2101 cgaaacaaat gactcaaatc ttgtacaaac tgcatgggca ttgatgggat tgattcactc 2160 2161 tggacaggct gatagagatc cgaaacccct tcaccgtgca gcaaagttgt tgatcaattc 2220 2221 tcagatggaa gatggtgact tcccacagca ggaaattact ggagttttta tgaagaattg 2280 2281 catgttgcat tatgcagcat acagaaatat atatccatta tggggtttgg ctgaataccg 2340 2341 caaaaatgta ttattaccat tagaaaacaa ctaaatatat ataatttttc gatatagagt 2400 2401 gcaatttggt cctttttttt tttggtgtta atgtgagtga tgtaacaaaa gtaaaaattc 2460 2461 atagcctaag ttaattttat tattttgtat tacataattt gtgaataaag aaagttacat 2520 2521 aaaaaaaata aaaaa 2535 Abbildung E-3: Nukleotidsequenz des Transkripts der Lycopersicon esculentum β-Amyrinsynthase LeTTS1. Start- und Stopcodon sind jeweils fett gedruckt; die Sequenzbereiche, die dem DCTAE-Substratbindungsmotiv (grün) sowie dem QW3-Motiv (rot) entsprechen, sowie die nicht codierenden Sequenzbereiche (grau) sind farblich hervorgehoben.


1 aaaaacatga tttataattt cttctctttc agcctactaa acttgaagaa gatattaaca 60 61 agatgtggaa gttgaagatt gcaaaaggac tagatgatcg atacttgtat agtacaaata 120 121 actatattgg acgacaaata tgggagttcg atccaaatgc tggaacaata gaagaacaag 180 181 ccaaaatcga agaggcacgt caacattatt ggaacaatcg ttacaaaggt aagcctaata 240 241 gtgatcttct ttggagaatg cagtttttga gagaggagaa tttcaaacag agaattagag 300 301 cagtaaaagt agaagaagga gaagaaatta gccatgaaat tgctacagtt gcattgcata 360 361 gagctgttca tttcttctca gccttacagg ctactgatgg acattggcct gctgaaagtg 420 421 ctggtcctct cttctttctt ccacctctcg ttatgtgtat gtatatcact gggcatctta 480 481 atactgtata tccagctgaa catcggaagg aaattcttcg ttatatatac tgtcaccaga 540 541 atgaagatgg tggatggggt ttgcacatag aaggtcacag tactatgttc tgtacagcta 600 601 tgagttacat ttgcatgagg atccttggag aaggaccaga aggcggtgtt aataatgcgt 660 661 gtgctagagc aaggaaatgg attcttgatc atggtagtgt catcgccatt ccttcttggg 720 721 gaaaaacatg gctctcgatt cttggagctt tcgaatggat aggaaccaat ccaatgccac 780 781 ctgagttttg gattcttcca tcttttcttc ccgtgcatcc agcaaaaatg tggtgttact 840 841 gccgaacggt ctacatgcca atgtcttatc tctatgggaa gagatttgtt ggtccaatca 900 901 cacctcttat tttgaaattg agggaagagc tgtatgatca gacatatgat gaaattaact 960 961 ggaaaaaagt gcgccatgta tgtgctaagg aggatcttta ttacccgcat ccttttgttc 1020 1021 aagatttgat gtgggatagt ctctacatat gtaccgagcc tctattgact cgttggcctt 1080 1081 tcaacaagtt gagaaataaa gctcttgaag ttaccatgaa acacatacac tatgaagacg 1140 1141 agaatagtcg atacatcacc atgggatgtg tggaaaaagt attgagtatg ctcgcttgtt 1200 1201 gggttgagga tcccaatggc gatcatttca aaaaacatct tgctaggatc ccagattttt 1260 1261 tatgggtagc tgaagacgga atgaaaatgc agggttgtgg tagtcaatca tgggatgcta 1320 1321 gtcttgctat tcaagcgcta ttggccagtg agatgtatga tgagatatca gatactctta 1380 1381 aaaatggaca cgactttata aaacaatctc aggtgaagga caatccttct ggtgatttta 1440 1441 aagtgatgta tcggcatatc tcaaaaggat catgggcttt tgcagatcaa gatctcggat 1500 1501 ggcaagtatc tgattgcact gccgaagcgt taaagtgctg ccttctcttc tctacaatgc 1560 1561 ctcctgaaat agttggtgag gcaatggatc cagtgcgact gtatgactcg gtgaatgtta 1620 1621 ttctttcatt acagagcaag aatgggggtt tatcagcgtg ggaacctgca ggggccccag 1680 1681 agtatttgga gttgttaaat cctactgaat ttttcgagga tattgtgatt gagcacgagc 1740 1741 atgttgagtg cactagctcg gcaatccaag cacttgttcg ttttaagaag ctataccctg 1800 1801 gacaccgaac cacggaggtt gacaatttta ttaataatgg tgttaaatat attgaagatg 1860 1861 tacaggagcc tgacggttca tggtatggta actggggcgt gtgcttcata tacgcttcct 1920 1921 ggtttgctct tggagggctt gctgctgtag gcttgtcgta cagcaactgt gcagctgttc 1980 1981 gtaaaagcgt agaatttctt ctaagaacac aaaggtctga tggtggttgg ggagaaagct 2040 2041 accgttcttg tcctgacaag gtatatcgag agcttgaaac agaacactcg aatcttgtac 2100 2101 aaactgcatg ggcattgatg ggattgattc actctggcca ggttgagaga gatccgaggc 2160 2161 ctctccaccg cgcagcaaag ctgttaatta attttcagat ggaagatggt gacttcccac 2220 2221 aacaggagat aactggtgtt ttcttgagga attgcatgat gcactatgca ttatatagga 2280 2281 atatatttcc attgtggggt ttggctgaat accgcaggaa tgttttagta ccattaaaac 2340 2341 acaactacat atagagaatg caatttgggc cttccgcgga ttccgtatat agcgggagct 2400 2401 tagtgaatcg agttgtccgt tgtttgtttt ttgtgttaat gtaagtgatc acccaagtag 2460 2461 tggttagata tgactatgat cgacctgtta ggttgtggag cctaattaat atttgttgta 2520 2521 ctgcaatatt tattctccat ttattctcta taacctaaaa tactttgaat tattaatata 2580 2581 tatacccacc gccgtggaag tttactcacg gggtgttacc acgaaaaaaa aaaaaaaaaa 2640 2641 aaaaaaa 2647 Abbildung E-4: Nukleotidsequenz des Transkripts der Lycopersicon esculentum Triterpensynthase LeTTS2. Start- und Stopcodon sind jeweils fett gedruckt; die Sequenzbereiche, die dem DCTAE-Substratbindungsmotiv (grün) sowie dem QW3-Motiv (rot) entsprechen, sowie die nicht codierenden Sequenzbereiche (grau) sind farblich hervorgehoben.


1 atataccact aatctcatgc aaagaggatg tggcgaatta aaatagctga gggaggaaat aacccttata 70 71 tttatagcac aaacaatttt cagggaaggc aaatttgggt atttgatcct aatgctggta ctcctgaaga 140 141 acaagccgag gttgaagaag ctcgtcaaaa cttctggaaa aatcgatttc aggtcaagcc taactctgat 210 211 ctcctttggc aactccagtt tctaagggaa aaaaatttta agcaaaaaat tccaaaagta aaggttgaag 280 281 atggcgagga gatcacaagt gaaatagctg cagccgcttt gaggagaagc gtccacttgt tttcggcctt 350 351 gcaggcaagc gatggccatt ggtgtgcaga aaatggaggc ctgctgttct ttttgcctcc cttggttttt 420 421 gctgtctaca ttacaggaca ccttaatact gtattttctc cagagcatcg caaagaaatc ctccgttaca 490 491 tatactgtca tcagaatgaa gatggtggat ggggaataca cattgaaggt cacagcacta tgttttgcac 560 561 agttcttaat tatatatgta tgcgtatact tggtgaagca cgtgatggtg gaatagaaaa tgcttgtgaa 630 631 agagggcgaa aatggatact cgatcatggt ggtgcaactg gtatatcttc ttggggaaag acatggcttt 700 701 cggtaagatc aatttgctgt gaatcttctg tgctagattc ttattacgtt gcttcaattt agttgatttg 770 771 agttgtaaaa aatttcaaaa tttcatccac tgtagatact tggtgtgtac gagtgggatg ggaccaatcc 840 841 catgccccca gagttttggg cctttccatc ttcttttccc ttacacccag gttcgtatat gtatctattt 910 911 tcactgttta attagggaga aaaattgatc ttactgttcg attaaaatgc acctcaggaa tttcattcta 980 981 gtctagtacc gaattcaggt tttttcatgt ttacctcttg cctgttttat tttctacacg aatatgatat 1050 1051 ccaattaatt atatacaatc tctgcagcaa aaatgttttg ttactgtcgg atcacttaca tgccaatgtc 1120 1121 gtacttgtac gggaagaggt ttgttggtcc aatcacacca ctcattctac aaataagaga agaaatctat 1190 1191 aatgaacctt acaacaaaat caagtggaat agtgtgcgtc atttatgtgc aaaggtataa gtcagtttca 1260 1261 tttccctttc aaggactaat ttacaatcat tttctgaaat ttgatttaga gtgtaaaact attaattttg 1330 1331 ccattacagg aagacaacta ttttccacat ccaacgatac agaaactgtt atgggatgct ctgtatacat 1400 1401 ttagcgagcc tctattctct cgttggccct tcaacaaatt gagagagaag gctcccaaga taacaatgga 1470 1471 tcacattcat tatgaagatc acaacagtcg gtacatcact attggatgcg ttgagaaggt aacatgattt 1540 1541 taaaactaag gaaaaaaaat agtgcatgca tatatatagt ggtaatgttt cttctgatct gagattcatt 1610 1611 ttttaattca aacgaaaaca gccgttatgc atgcttgcct gttggattga agatcctcat ggggaagcgt 1680 1681 ttaagaagca ccttgccaga attgcagatt acatatgggt tggagaagat ggaataaaga tgcaggtaac 1750 1751 tacacactcc catgaagctt actatgacaa aagagataca tgtttctttt tttattttat tattattatt 1820 1821 gaaattaatt aagttcaaat tgatatatga ggagaagcat aaatctaagc tcatttgcag agtttcggaa 1890 1891 gtcaaacatg ggacacaagt ctagctcttc aggccctgat agctagcgac ctctctcatg aaataggacc 1960 1961 tacactaaaa caaggacacg tcttcacgaa gaattctcag gtgtctgcat ttatatacta tgttgtttct 2030 2031 tcctttttaa ttaccatcca tagtacgaga tgaatgaata tttcttctat tttgggcttt tctttctgtt 2100 2101 tttcaaaggc aactgagaac ccttcgggcg acttcagaaa aatgtttcgt catatctcca aaggagcttg 2170 2171 gacattctct gataaagatc aaggatggca agtttctgat tgtacagcag aaagcttgaa ggtaattaag 2240 2241 ttttttgact acagcttaaa atcgcacaaa caattgagaa ttaaacatcg cttataaata atcatggttg 2310 2311 tcaatttctc ttatgttgca gtgctgccta cttttctcaa tgatgcctcc cgaaattgtt ggtgagaaaa 2380 2381 tggaacctga aaaggtctat gattcagtca atgtcatact ttctcttcag gtaagaatta 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Start- und Stopcodon sind jeweils fett gedruckt. Die Sequenzbereiche, die dem DCTAE-Substratbindungsmotiv (grün) sowie dem QW3-Motiv (rot) entsprechen, sind farblich hervorgehoben. Die nicht codierenden Intron-Bereiche sind grau unterlegt, nicht codierende Bereiche am 5’- und 3’-Ende sind kursiv gedruckt.


1 aaagaagaaa agaaatgtgg aagctaagga ttgcagaagg aagtggaaat ccatggctta gaactacaaa 70 71 cgatcacatt gggagacaag tctgggaatt tgattcatct aaaatcggat ctccagaaga gctctcacaa 140 141 atcgaaaatg ctcgtcaaaa tttcaccaaa aaccgcttta ttcacaagca tagttcagat ctactcatgc 210 211 gcattcaggt ttcttgcttt gattctctgt ttgttgacaa tgccgaacga actgagtcat agttagtatt 280 281 aatgtgctgt tactgttgtt ttgtagtttt cgaaggaaaa tccaatatgt gaagtgttac cgcaagtaaa 350 351 agtgaaagaa tcagaacaag ttaccgagga gaaagtgaaa attacgttaa gaagggcatt gaattactat 420 421 tcatctattc aagctgatga tggacattgg cctggtgatt atggcggtcc tatgtttcta atgcctggct 490 491 tggtaatttt ttcatttcat tgttagttta ttgttttaat tttaaatgtt tgtatggtga ttcttgttac 560 561 tcattcagat tatagctctg tctatcactg gcgcattgaa tgcaatttta tctgaggaac ataagcgcga 630 631 aatgtgtcga tatctataca accaccaggc atgtgtttca atagtttttc attttaccat tgctgctact 700 701 ttctctgtgt tatctataat gtcaaaatta tggaatttgc agaatagaga tggcggttgg ggcttacaca 770 771 ttgagggacc aagcacaatg tttgggagtg tattgtgtta tgtttcgtta aggctgcttg 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caagcttcct 2450 2451 aggaacattg gaatagaagc caatcactga tattgtgtta cttgatatgc atccatgcta gtatggtggc 2520 2521 tgtttctact ttgtgatatg catcaccaac tgagataata aaaaaaatat aatttgtggt ttcacagctt 2590 2591 attaccatgt gtatttcttc aattttcttg ggcactcaga gcaaactgtc atcaataaaa gatataataa 2660 2661 actggctgca gggttataat ggaagtcaac tctgggacac agcattcgca gttcaagcaa ttgtgtcaac 2730 2731 taatcttatt gaggaatatg gtccgactct aaaaaaggca cattcattca ttaaaaaaat gcaggtgcat 2800 2801 ttccccctct caagcccttg gtgtttctca ttgaggattt catattatag tcttttaact cttgaaatgt 2870 2871 ttactttgta attgtatctt tttggatttg aaggttttgg aaaattgtcc aggagatctt aatttttggt 2940 2941 atcgccacat ttcaaaaggt gcatggccat tttcaactgc tgatcatgga tggcccatct cagactgcac 3010 3011 agcagaggga ataaaaagat gtgctccctt tgcttaagtt tttcctgata acttgcactg attctgtttt 3080 3081 gtaggctctt atgttgttat caaagattcc ttcagagatt gttggggaag gattaaatgc aaaccggtta 3150 3151 tatgatgcag tgaatgttgt tctctcatta caggtaactc atgcttgggt attttgaact agacaaacca 3220 3221 taccgatttg ctaataaaac 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4691 catatgtaag attagtgtta ataattatgc atggcatagt taatgagctg ttctctgacc ctccttgtgt 4760 4761 gatagatatt gtagactgtt ttcagatttt tgacattagt gttgctaaac aagaaaccta ccatataatt 4830 4831 aattgatcta ttacctttat gtcaggggac ttgtttggtt atttcatata cttaggtgtt ttagtagtaa 4900 4901 acccatttga tgtagttgct atgcctcctc ccagcttgcg tccaaactgt aatccttgtc catcttcaga 4970 4971 gaaattatcc ataacgaaaa aaaagcaact caacaaatta atcaatgtcc cacagttaag gattttaaat 5040 5041 tttagctgtt atggtattct ctctcttttg aagtcaaaga ataaatcact tttgtaaaac atacagaaaa 5110 5111 aacatcacca aatgaagtta tagttcttgt actcctaaaa gtaacaactt tttttccttt ttctcatttg 5180 5181 actgtttatc tatttcaatt tgcaaaacaa ccttagaatc tagcaagaca cataaaagat aggatacttt 5250 5251 gaatcgacaa ctttacctgc aaatgaaaca ttttaatgat tgtcctctca agtagttttg tgagaaatta 5320 5321 taaattttac aaagatgatc taagcatgaa aattgaatta tttaagatat tacatatgtt tgatatttta 5390 5391 aacttatcat atttatgatt ataaagcaag ctgtaattat atttgaagaa ataaacaaaa atacagaatc 5460 5461 atttttctga ctgtaaattg aaatttaact 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Ricinus communis Cycloartenolsynthase RcCAS1. Start- und Stopcodon sind jeweils fett gedruckt. Die Sequenzbereiche, die dem DCTAE-Substratbindungs-motiv (grün) sowie dem QW3-Motiv (rot) entsprechen, sind farblich hervorgehoben. Die nicht codierenden Intron-Bereiche sind grau unterlegt, nicht codierende Bereiche am 5’- und 3’-Ende sind kursiv gedruckt.

Anhang F: Abbildungsverzeichnis 185

Anhang F Abbildungsverzeichnis Seite

1-1 Biosynthesewege von Steroiden und Triterpenen 2

1-2 Mechanismus der Zyklisierung von 2,3-Oxidosqualen zu pentazyklischen Triter-penen über die Bildung instabiler kationischer Zwischenstufen

4

1-3 Schematische Darstellung der Sekundärstruktur einer 2,3-Oxidosqualenzyklase 5

1-4 Bandmodell der dreidimensionalen Struktur der menschlichen Lanosterolsynthase 6

1-5 Schematischer Aufbau der pflanzlichen Kutikula 8

1-6 Pentazyklische Triterpene als typische Wachskomponenten der pflanzlichen Kutikula 12

2-1 Ricinus communis: Samen, Blattstruktur, Blütenstand und Fruchtstand 17

2-2 Sprossachsenphänotypen von Ricinus communis 18

2-3 Verschiedene Altersstadien von Ricinus commuins 19

2-4 Lycopersicon esculentum cv. Micro-Tom: Gesamt-Habitus, Blüte und Frucht 20

2-5 Isolierung von Gesamt-RNA aus Ricinus communis-Zellmaterial 26

2-6 Beispiel eines PCR-Ansatzes mit R. communis cDNA als Template unter der Verwendung eines Annealing-Temperaturgradienten

27

2-7 Schematische Darstellung des Plasmidvektors pGEM-T (Promega) zur Transforma-tion kompetenter E. coli-Zellen

28

2-8 Agarplatte mit Kolonien transformierter E. coli-Zellen nach 14 h Inkubation bei 37°C 29

2-9 Kontrollversuche nach der Klonierung von PCR-Fragmenten in den Expressions-vektor pGEM-T

30

2-10 Ausschnitt aus einem Sequenzierungs-Chromatogramm einer Sequenzierungs-reaktion der NAPS-Unit

31

2-11 5’RACE zur Klonierung des 5’-Endes von RcCAS1 33

2-12 Gelelektrophorese von RNA-Proben, die aus verschiedenen Geweben und von verschieden alten Pflanzen isoliert wurde

34

2-13 Schematische Darstellung des Hefe-Expressionsvektors pYES2 38

2-14 Test-PCR mit E. coli-Zellmaterial als Template nach der Transformation mit dem Expressionsvektor pYES2 + Insert und der Primerkombination T7 und PYES2A

39

2-15 Restriktionsverdau der isolierten Plasmid-DNA als Positiv-Kontrolle 39

2-16 Prinzip der funktionellen Charakterisierung klonierter Oxidosqualenzyklasen: die Zyklisierung von 2,3-Oxidosqualen im transformierten Hefestamm GIL77

40

2-17 Schematische Darstellung des verwendeten Site-directed Mutagenese-Verfahrens 43

3-1 Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von R. communis Sprossachsen-internodien- und Blattoberflächen

46

3-2 Gaschromatogramm des kutikulären Gesamtwachses von 67 Tage alten Ricinus communis-Hypokotylen

48

3-3 Massenspektrum des silylierten Derivats von Hexacosan-1,3-diol 50

3-4 Wachsbelegung und chemische Zusammensetzung kutikulärer Wachse von 67 Tage alten Hypokotylen beider Phänotypen von Ricinus communis

51

3-5 Relative Homologenzusammensetzung aliphatischer Substanzklassen in kutikulären Wachsen 67 Tage alter Hypokotyle von Ricinus communis

53


Seite

3-6 Vergleich der kutikulären Wachsausbeuten bei 67 Tage alten Ricinus communis-Hypokotylen

55

3-7 Vergleich der jeweiligen relativen Anteile einzelner Substanzklassen an den epi- bzw. intrakutikulären Wachsschichten 67 Tage alter R. communis-Hypokotyle

57

3-8 Rasterelektronenmikroskopische Bilder zur Abhebemethode für die selektive Bepro-bung epikutikulärer Wachse

59

3-9 Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen unterschiedlich alter Hypokotyl-oberflächen von Individuen des Glaucous-Phänotyps von Ricinus communis

61

3-10 Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines Querschnitts durch die Hypokotyl-Epidermis einer 18 Tage alten Ricinus communis-Pflanze

60

3-11 Kutikuläre Gesamtwachsbelegung und Wachsbelegung von VLC-aliphatischer Verbindungen sowie Triterpenen im Laufe der Hypokotylentwicklung von Ricinus communis

63

3-12 Kutikuläre Wachsbelegung VLC-aliphatischer Substanzklassen im Laufe der Hypokotylentwicklung beider Sprossachsen-Phänotypen von Ricinus communis

65

3-13 Akkumulation des Triterpenols Lupeol als Wachskomponente in der Kutikula im Laufe der Hypokotylentwicklung beider Sprossachsenphänotypen von Ricinus communis

66

3-14 Relative Homologenzusammensetzung aliphatischer Substanzsklassen im kutiku-lären Wachs von Glaucous-Individuen der Rizinuspflanze im Laufe der Hypokotyl-entwicklung

67

3-15 Übersicht über die Position und Spezifität degenerierter Primer zur Klonierung pflanzlicher Oxidosqualenzyklasen

69

3-16 Aminosäuresequenz-Alignment des Indel-Bereichs pflanzlicher OSCs 70

3-17 Nukleotidsequenz-Alignment des Indel-Bereichs und das daraus resultierende Primerdesign zur Klonierung von Lupeol-, β-Amyrin- bzw. Cycloartenolsynthasen

71

3-18 Konsensussequenz des klonierten Genfragments RcLUS1a 72

3-19 PCR-Fragmente unterschiedlicher Sequenzbereiche der RcLUS1-cDNAs 74

3-20 Schematische Darstellung der Strategie zur homologiebasierten Klonierung von RcLUS1

75

3-21 Aminosäuresequenz der Ricinus communis Lupeolsynthase RcLUS1 75

3-22 Sequenz des klonierten Genfragments RcTTS2a 77

3-23 Schematische Darstellung der Strategie zur homologiebasierten Klonierung von RcCAS1

78

3-24 Aminosäuresequenz der Ricinus communis Cycloartenolsynthase RcCAS1 79

3-25 Strategie zur Klonierung der genomischen Sequenz von RcLUS1 80

3-26 Exon-Intron-Muster der genomischen Sequenz von RcLUS1 80

3-27 Exon-Intron-Muster der genomischen Sequenz von RcCAS1 81

3-28 Schematische Darstellung der Strategie zur Klonierung von LeTTS1 82

3-29 Aminosäuresequenz der Lycopersicon esculentum β-Amyrinsynthase LeTTS1 83

3-30 Aminosäuresequenz der Lycopersicon esculentum Triterpensynthase LeTTS2 84

3-31 Dünnschichtchromatographie der Gesamtextrakte der mit dem pYES2-RcLUS1-Kostrukt transformierten GIL 77 Hefezellen

86

3-32 Gaschromatographische Analyse TMS-derivatisierter Extrakte der mit RcLUS1 transformierten Hefezellen

87


Seite

3-33 Massenspektrum des silylierten Zyklisierungsproduktes des mit dem pYES2-RcLUS1-Konstrukt transformierten Hefestammes GIL 77 im Vergleich zu silyliertem authentischem Lupeol-Standard

88

3-34 Gaschromatogramm der über Dünnschichtchromatographie quantitativ gewonnenen Zyklisierungsprodukte Lupeol, β-Amyrin und α-Amyrin

89

3-35 Dünnschichtchromatographie der Gesamtextrakte der mit dem pYES2-RcCAS1-Konstrukt transformierten GIL 77-Hefezellen

90

3-36 Gaschromatogramm TMS-derivatisierter Extrakte der mit RcCAS1 transformierten Hefezellen

91

3-37 Gaschromatogramm der TMS-derivatisierten Chloroform-Extrakte aus dem in vitro-Enzym-Test mit zellfreiem Extrakt

92

3-38 Massenspektrum des silylierten Zyklisierungsproduktes D des mit dem pYES2-RcCAS1-Konstrukt transformierten Hefestammes GIL 77 im Vergleich zu silyliertem Cycloartenol-Standard

93

3-39 Massenspektrum des silylierten sowie acetylierten Zyklisierungsproduktes E des mit dem pYES2-RcCAS1-Konstrukt transformierten Hefestammes GIL 77

94

3-40 Gaschromatographische Analyse TMS-derivatisierter Extrakte der mit LeTTS1 transformierten Hefezellen

95

3-41 Massenspektrum des silylierten Zyklisierungsproduktes des mit dem pYES2-LeTTS1-Konstrukt transformierten Hefestammes GIL77

96

3-42 Expression der Ricinus communis Lupeolsynthase und Cycloartenolsynthase in verschiedenen Organen

98

3-43 Expression der Ricinus communis Lupeolsynthase und Cycloartenolsynthase während der frühen Hypokotylentwicklung

99

3-44 Aminosäuresequenz-Alignment von Lupeol- und β-Amyrinsynthasen im Bereich der jeweils konservierten Aminosäuren Leucin und Tryptophan

100

3-45 Dreidimensionale Darstellung der Aminosäurereste der menschlichen Lanosterol-synthase, die sich in einem Abstand von 5 A vom Substrat befinden

101

3-46 Gaschromatogramm TMS-derivatisierter Gesamtextrakte mit RcLUS1-Wildtyp und RcLUS1-Mutante F257W transformierter Hefezellen

102

4-1 Fadenförmige Wachskristalle auf Sprossachsenoberflächen von Macaranga tanarius

104

4-2 Wachstumsbeobachtungen an Hypokotylen von Ricinus communis in der frühen Entwicklungsphase

112

4-3 Akkumulation kutikulärer Wachse pro Hypokotyl bzw. pro Epidermiszelle in den ersten 67 Tagen der Hypokotylentwicklung

113

4-4 Akkumulation der VLC-aliphatischen Verbindungen im kutikulären Wachs pro Hypokotyl bzw. pro Epidermiszelle in den ersten 67 Tagen der Hypokotylentwicklung

114

4-5 Triterpen-Akkumulation im kutikulären Wachs pro Hypokotyl bzw. pro Epidermiszelle in den ersten 67 Tagen der Hypokotylentwicklung

115

4-6 Crematogaster (Decacrema) Msp. 4 auf der wachskristallfreien Fläche einer Rizinuspflanze des Glaucous-Phänotyps

116

4-7 Ergebnisse der Lauftests mit Wachsläufer- sowie Nichtwachsläufer-Arten der Gattung Crematogaster auf beiden Sprossachsen-Phänotypen von Ricinus communis

117

4-8 Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen der Haftstrukturen einer Nichtwachs-läufer-Ameise nach dem Lauftest auf einem Individuum des Glaucous-Phänotyps von Ricinus communis

118


Seite

4-9 Akkumulation des Triterpenols Lupeol im kutikulären Wachs pro Hypokotyl bzw. pro Epidermiszelle in den ersten 67 Tagen der Hypokotylentwicklung

123

4-10 Akkumulation verschiedener Triterpen-Verbindungen im kutikulären Wachs pro Epidermiszelle in den ersten 67 Tagen der Hypokotylentwicklung

124

4-11 Zusammenfassende Darstellung der verschiedenen Prozesse, die zur Ausbildung des Glaucous- bzw. Glossy-Phänotypes von Ricinus communis führen

128

4-12 Alignment der Aminosäuresequenzen von RcLUS1 und des klonierten Fragmentes RcTTS2a einer weiteren Triterpensynthase aus Ricinus communis

130

4-13 Aminosäuresequenzalignment der klonierten Triterpensynthasen aus Lycopersicon esculentum

132

4-14 Darstellung der phylogenetischen Verwandtschaftsbeziehungen pflanzlicher Epoxy-squalenzyklasen auf der Grundlage eines Aminosäuresequenzalignments

139

4-15 Phylogenetischer Stammbaum pflanzlicher Epoxysqalenzyklasen, erstellt auf der Basis eines Sequenzalignments der cDNA-Sequenzen

140

4-16 Mechanismus der Zyklisierung von 2,3-Oxidosqualen, vermittelt durch die Lupeol-synthasen OEW, TRW und ATLUP1

143

C-1 Aminosäuresequenz- und Nukleotidsequenzalignment für den N-terminalen Sequenzbereich von 2,3-Oxidosqualenzyklasen sowie das daraus resultierende Primerdesign

169

C-2 Aminosäuresequenz- und Nukleotidsequenzalignment für den das QW2-Motiv umfassenden Sequenzbereich und das daraus resultierende Primerdesign

170

C-3 Aminosäuresequenz- und Nukleotidsequenzalignment für den das QW4-Motiv umfassenden Sequenzbereich und das daraus resultierende Primerdesign

171

C-4 Aminosäuresequenz- und Nukleotidsequenzalignment und das daraus resultierende Design für den Antisense-Primer OGN7A

172

C-5 Aminosäuresequenz- Nukleotidsequenzalignment und das daraus resultierende Design für die Antisense-Primer OGN4A, OGN5A und OGN6A

173

E-1 Nukleotidsequenz des Transkripts der Ricinus communis Lupeolsynthase RcLUS1 178

E-2 Nukleotidsequenz des Transkripts der Ricinus communis Cycloartenolsynthase RcCAS1

179

E-3 Nukleotidsequenz des Transkripts der Lycopersicon esculentum β-Amyrinsynthase LeTTS1

180

E-4 Nukleotidsequenz des Transkripts der Lycopersicon esculentum Triterpensynthase LeTTS2

181

E-5 Genomische Sequenz der Ricinus communis Lupeolsynthase RcLUS1 182

E-6 Genomische Sequenz der Ricinus communis Cycloartenolsynthase RcCAS1 183/ 184

Anhang G: Tabellenverzeichnis 189

Anhang G Tabellenverzeichnis Seite

2-1 Werte der Temperatur- und Druckprogrammierung der für die quantitative und qualitative Analyse verwendeten Gaschromatographen

24

3-1 Identifizierte Kutikulawachs-Komponenten von Ricinus communis-Hypokotylen des Glossy-, sowie des Glaucous-Phänotyps.

49

3-2 Absolute und relative Zusammensetzung des kutikulären Wachses von Hypokotyl-Oberflächen 67 Tage alter R. communis Pflanzen beider Sprossachsen-Phänotypen.

52

3-3 Absolute Ausbeuten der durch Abhebemethode und Nachextraktion 67 Tage alter Hypokotyle beider Phänotypen von Ricinus communis gewonnenen Wachsschichten

56

3-4 Relative Zusammensetzung der Wachsschichten, die durch Abhebemethode und Nachextraktion 67 Tage alter Hypokotyle beider Phänotypen von Ricinus communis gewonnen wurden

58

3-5 Ergebnisse des Datenbankvergleichs des klonierten Genfragmentes RcLUS1a von R. communis auf Nukleotid-Ebene

73

3-6 Kombinationen spezifischer Primer, die für PCR-Ansätze zur Kontrolle der klonierten Gensequenz verwendet wurden

74

3-7 Ergebnisse des Datenbankvergleichs der Ricinus communis Lupeolsynthase RcLUS1 auf Aminosäuresequenz-Ebene

76

3-8 Ergebnisse des Datenbankvergleichs des klonierten Genfragmentes RcTTS2a von R. communis auf Nukleotid-Ebene

77

3-9 Ergebnisse des Datenbankvergleichs der Ricinus communis Cycloartenolsynthase RcCAS1 auf Aminosäuresequenz-Ebene

79

3-10 Ergebnisse des Datenbankvergleichs der Lycopersicon esculentum β-Amyrin-synthase LeTTS1 auf Aminosäuresequenz-Ebene

83

3-11 Ergebnisse des Datenbankvergleichs der Lycopersicon esculentum LeTTS2 auf Aminosäuresequenz-Ebene

85

4-1 Bisherige Untersuchungen zur chemischen Schichtung der pflanzlichen Kutikula unter besonderer Berücksichtigung kutikulärer Triterpene

107

4-2 Prozentuale Verteilung der Triterpenalkohole in unterschiedlichen Reifestadien von Tomatenfrüchten

131

4-3 Übersicht der Sequenzübereinstimmungen der klonierten und charakterisierten Oxidosqualenzyklasen RcLUS1, RcCAS1 und LeTTS1 mit anderen charakterisierten pflanzlichen OSCs auf Aminosäuresequenzebene

136

B-1 Genbank-Akzessionsnummern der NCBI-Datenbank und Referenzen pflanzlicher Epoxysqualenzyklasen

168

D-1 Degenerierte Oligonukleotidprimer für die homologiebasierte Klonierung pflanzlicher Oxidosqualenzyklasen

174

D-2 Spezifische Oligonukleotidprimer für die Ricinus communis Lupeolsynthase RcLUS1 175

D-3 Spezifische Oligonukleotidprimer für das Fragment der potentiellen Ricinus communis Triterpensynthase RcTTS2

175

D-4 Spezifische Oligonukleotidprimer für die Ricinus communis Cycloartenolsynthase RcCAS1

176

Anhang G: Tabellenverzeichnis 190

Seite

D-5 Spezifische Oligonukleotidprimer für die Lycopersicon esculentum β-Amyrinsynthase LeTTS1

176

D-6 Spezifische Oligonukleotidprimer für die potentielle Lycopersicon esculentum Triter-pensynthase LeTTS2

177

D-7 Sonstige Oligonukleotidprimer, die zur cDNA-Erststrangsynthese, für Sequenzie-rungsreaktionen, für die Klonierung der Full-length-Klone von RcLUS1, RcCAS1, LeTTS1 und LeTTS2, zur Synthese der Positivkontrolle für die RT-PCR bzw. Northern-Blot-Technik sowie für Site-directed Mutagenese-Versuche verwendet wurden

177

Anhang H: Abkürzungen 191

Anhang H Verwendete Abkürzungen AS Aminosäure

bAS β-Amyrinsynthase

bp Basenpaare

BSTFA N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoracetamid

CAS Cycloartenolsynthase

EWF epikutikulärer Wachsfilm

EWK epikutikuläre Wachskristalle

EZ Epidermiszelle

FID Flammenionisationsdetektor

GC Gaschromatographie

IMS Isomultiflorenolsynthase

IPP Isopentenylpyrophosphat

ISTD Interner Standard

IW intrakutikuläre Wachse

LS Lanosterolsynthase

LUS Lupeolsynthase

M+ Molekülion

MS Massenspektrometrie

MSD mass selective detector

MTS multifunktionale Triterpensynthase

OSC 2,3-Oxidosqualenzyklase; Epoxysqualenzyklase

PCR polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion)

RACE rapid amplification of cDNA ends

REM Rasterelektronenmikroskop

RT Reverse Transkriptase

SB Substratbindung

SHC Squalen-Hopen-Zyklase

TLC thin layer chromatography (Dünnschichtchromatographie)

TMS Trimethylsilyl

TTS Triterpensynthase

VLC very-long-chain

Zu Abkürzungen verwendeter Primer und Bezeichnungen von pflanzlichen 2,3-Oxidosqualenzyklasen siehe Anhang D bzw. Anhang B.

Danksagung 192

Danksagung Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Markus Riederer sowie Herrn Prof. Reinhard

Jetter für die exzellente Betreuung und beständige und vielfältige Unterstützung in allen

Belangen meiner Arbeit. Am Julius-von-Sachs-Institut für Biowissenschaften fand ich stets

ausgezeichnete Arbeitsbedingungen vor. Mit seinem Wechsel von Würzburg nach

Vancouver gab mir Herr Prof. Jetter die Möglichkeit, ein neues Land zu entdecken und

meinen Erfahrungshorizont in vielerlei Hinsicht zu erweitern. Mit seiner Diskussions-

bereitschaft, seinem großen Engagement und seiner intensiven zeitlichen Zuwendung gab er

mir die entscheidenden Impulse in vielen Phasen meiner Untersuchungen.

Herrn Prof. Yutaka Ebizuka (University of Tokyo) danke ich für das freundliche Über-

lassen des Hefestammes GIL 77 für die heterologen Expressionsversuche. Bei Herrn Dr.

Gerd Vogg bedanke ich mich herzlich für seine Unterstützung in molekularbiologischen

Laborfragen, ebenso wie bei Herrn Dr. Jürgen Zeier. Dank gebührt außerdem Herrn Dr.

Owen Rowland (University of British Columbia, Kanada) für die Hilfe bei den Northern-Blot-

Analysen.

Besonderen Dank schulde ich Frau Barbara Hobl für ihren großen Fleiß bei der

Durchführung der praktischen Arbeiten der Wachsanalysen sowie der rasterelektronen-

mikroskopischen Untersuchungen und die gute Zusammenarbeit. Herrn Trevor Yeats danke

ich sehr herzlich für die praktische Hilfestellungen bei Klonierungsarbeiten in Vancouver.

Frau Jutta Winkler-Steinbeck (Würzburg) und Herrn Bob Kantymir (Vancouver) gebührt

Dank für die Anzucht und Pflege der Versuchspflanzen.

Meinen Freunden und Laborkollegen Dr. Michael Riedel und Christian Kinzler danke ich

sehr herzlich für ihre zahlreichen Ratschläge und ihre große Hilfsbereitschaft. Meinen Eltern

und meiner Frau Eva danke ich für ihre Unterstützung, Geduld und Liebe.

Publikationen 193

Publikationsliste Guhling O, Kinzler C, Dreyer M, Bringmann G, Jetter R (2005) Surface composition of

myrmecophilic plants: cuticular wax and glandular trichomes on leaves of Macaranga tanarius. Journal of Chemical Ecology 31, 2323-2341.

Guhling O, Hobl B, Yeats T, Jetter R (2006) Cloning and characterization of a lupeol synthase involved in the synthesis of epicuticular wax crystals on stem and hypocotyl surfaces of Ricinus communis. Archives of Biochemistry and Biophysics 448, 60-72.

Beiträge zu Tagungsbänden Guhling O, Jetter R (2002) Glandular trichomes on lower leaf surfaces of the ant-plant

Macaranga tanarius. Posterpräsentation, Tagung der Deutschen Botanischen Gesell-schaft, Vereinigung für Angewandte Botanik, Freiburg i. Br.

Kinzler K, Guhling O, Jetter R (2002) Chemical composition of Macaranga tanarius plant surfaces. Posterpräsentation, 19th Annual Meeting of the International Society of Chemical Ecology, Hamburg.

Lebenslauf 194

Lebenslauf Persönliche Angaben Name: Ortwin Guhling Adresse: Jörgentorgasse 6 97702 Münnerstadt Geburtsdatum: 19.10.1974 Geburtsort: Münnerstadt Familienstand: verheiratet, eine Tochter Staatsangehörigkeit: deutsch Ausbildung 1980 – 1985: Volksschule Burglauer 1985 – 1994: Johann-Philipp-von-Schönborn-Gymnasium Münnerstadt Abschluss: Allgemeine Hochschulreife 1994 – 1995: Studium der Klassischen Archäologie an der Bayerischen Julius-Maximi-

lians-Universität Würzburg 1995 – 2002: Studium der Biologie an der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. und

der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg Hauptfach: Ökophysiologie der Pflanzen Nebenfächer: Pflanzenphysiologie, Zell- und Entwicklungsbiologie

Diplomarbeitsthema: „Zusammensetzung und Bildung der Oberflächen-strukturen auf verschiedenen Organen von Macaranga tanarius.“

2002 – 2004: Promotionsstudium im Fach Biologie an der Bayerischen Julius-Maximilians Universität Würzburg, Lehrstuhl für Botanik II mit Forschungsaufenthalten an der University of British Columbia, Vancouver, Canada, in der Arbeits-gruppe von Prof. Reinhard Jetter

2005: Beginn des Referendariats zur Ausbildung für den höheren Bibliotheksdienst

an wissenschaftlichen Bibliotheken an der Universitätsbibliothek Stuttgart 2006: Fortsetzung des Referendariats an der Bayerischen Bibliotheksschule

(Bayerische Staatsbibliothek München)

Erklärung 195

Erklärung Ich versichere hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig angefertigt habe und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe. Die Dissertation wurde in gleicher oder ähnlicher Form noch zu keinem anderen Prüfungsverfahren vorgelegt. Ich erkläre, dass ich bisher keine akademischen Grade erworben oder zu erwerben versucht habe. Münnerstadt, den 17. November 2006

Biosynthese kutikulärer Triterpenoide: Klonierung und ... · aus Ricinus communis und Lycopersicon...

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