Chem. Listy 93, 563 - 569 (1999)

BIOSENZORY NA STANOVENIE SACHARIDOV

Referáty

JAN TKAC, JURAJ SVITEL a ERNEST STURDK

Katedra biochemické] technologie, Chemicko-technologickáfakulta, Slovenská technická univerzita, Radlinského 9, 812 37Bratislava, Slovenská republikae-mail: tkac@chelin.chtf.stuba.sk.

Došlo dňa 22. VI. 1999

úměrný logaritmu koncentrácie analyzovanej látky. Entalpic-ké biosenzory, nazývané aj termistory, poskytujú univerzálnydetekčný princip, pretože uvoTňovanie, alebo spotřeba teplajetypická pre všetky biochemické děje. Biosenzory s optickýmprevodníkom fungujú tak, že biokatalyzátor produkuje alebospotrebúva látku s optickými vlastnosťami a meranie koncen-trácie analytu sa prevádza na meranie vhodnej optickej veliči-ny, například absorpcie, emisie světla, fluorescencie.

Klučové šlová: biosenzory, monosacharidy, disacharidy, po-lysacharisy, potraviny

Obsah

1. Úvod2. Detekcia monosacharidov

2.1. Glukóza2.2. Fruktóza2.3. Galaktóza2.4. Xylóza

3. Analýza sacharidov obsahujúcich glukózu v molekule3.1. Disacharidy

3.1.1. Sacharóza3.1.2. Laktóza3.1.3. Maltóza3.1.4. Laktulóza

3.2. Polysacharidy3.2.1. Škrob3.2.2. Glykogén3.2.3 Pullulán

4. Stanovenie dalších sacharidov

1. Uvod

Sacharidy tvoria velkú skupinu látok (monosacharidy ažpolysacharidy) a zároveň patria k látkám, ktoré je nutné moni-torovat v medicíně (množstvo glukózy v krvi), vo fermentač-nom priemysle (najma on-line monitorovanie procesov), v ná-pojoch a potravinách ako jeden z najdóležitejších akostnýchukazovateTov, ale i ako indikátor šetrnosti spracovania (laktu-lóza sa prirodzene v mlieku nenachádza, vzniká izomerizácioulaktózy pri vyššej teplotě). Koncentrácie cukrov je velmidóležité sledovat metodami, ktoré sú rychle, selektivně, přes-né, lačné, atď. Týmto nárokom vyhovujú biosenzory, predo-všetkým pre skíbenie analytických princípov s výhodami,ktoré poskytuje špecificita interakcie substrát-biologická časť.Biosenzor teda pozostáva z dvoch častí: biologickej a prevod-níka. Biologická časť rozpoznává substrát a táto interakcia saprostredníctvom prevodníka mění na fyzikálnu veličinu (naj-častejšie prúd alebo napátie). Využitím amperometrickej de-tekcie snímáme prúd, ktorý je úměrný koncentrácii stanovova-nej látky, v případe potenciometrickej detekcie je potenciál

2. Detekcia sacharidov

K najdóležitejším monosacharidom z hladiska monitoro-vania, či už v potravinách alebo fermentačnom priemyslepatria glukóza, fruktóza, galaktóza a xylóza. Glukóza, fruktó-za a galaktóza sú hexózy, xylóza s piatimi uhlíkmi v molekulepatří k pentózam.

2 . 1 . G l u k ó z a

Glukóza bola prvým analytom detegovaným biosenzo-rom a je zároveň najčastejšie stanovovaným analytom, čomožno dokumentovat aj tým, že z 2152 záznamov týka-júcich sa hesla biosensor připadá na heslo biosensor andglucose 486 záznamov, čo je takmer 23 % (Medline data-báza, bez časového obmedzenia). Na tému glukózových bio-senzorov bolo publikovaných niekol"ko knílr'3, niekoiko pre-hladných článkov, s využitím amperometrickej ' potencio-metrickej ' 7 a entalpickej detekcie8. Nedávno bol publikovanýv Chemických listoch prehladný článok o optickej detek-cii glukózy . Vzhladom na všetky tieto skutečnosti sa obme-dzím len na stručnú charakteristiku glukózových biosenzorov.Na detekciu glukózy sa používajú dva enzymy: glukózaoxi-dáza a NAD-depcndentná glukózadehydrogenáza. Najčastej-ším princípom stanovenia je amperometrická detekcia vznika-júceho peroxidu vodíka, alebo spotřeba kyslíka pri oxidácii(11 a 12), pričom prúd tečúci elektrodou je úměrný koncen-trácii glukózy. Použitím glukózadehydrogenázy (19) sa mu-sí redukovaný NAD regenerovat použitím enzymu diaforá-zy a mediátora (4 a 5) a reoxidáciou mediátora elektrodoutečie prúd úměrný koncentrácii glukózy. Okrem amperomet-rickej detekcie sa používá aj potenciometrická detekcia pro-tónov vznikajúcich oxidáciou glukózy glukózadehydrogená-zou (19) a optická detekcia žiarenia vznikajúceho reakciouluminolu s peroxidom vodíka (13), ktorý je produktom oxidá-cie glukózy (12). Okrem toho sa glukóza dá stanovit' termi-storom, keď sa deteguje teplo vzniknuté oxidáciou glukózyglukózaoxidázou.

2 . 2 . F r u k t ó z a

Základom stanovenia fruktózy je jej oxidácia pomocouenzymu fruktóza dehydrogenázy (FDH, EC 1.1.99.11), ktoráobsahuje v molekule naviazaný koenzym pyrrolochinolíno-chinón (PQQ) podlá rovnic (7) a (2).

563

Chem. Listy 93, 563 - 569 (1999) Referáty

564

D-fruktóza + FDH/PQQ -» a-glukóza M U T > (3-glukóza (77)

-» 5-keto-D-fruktóza + FDH/PQQH2 ("7;(3-glukóza + O 2

G O D > kyselina glukónová + H 2 O 2 (72)

PQQH2 + M 0 X -+PQQ + M r e d + 2 H + (2)Peroxid vodíka reaguje s luminolom za vzniku 3-amino-

PQQH2 sa najčastejšie regeneruje hexakyanoželezitanom ftalátu a světla (13), ktoré bolo detegované chemiluminiscen-draselným, ako mediátorom , pričom sa na elimináciu kyše- čným detektorom .liny askorbovej využívá askorbátoxidáza ' . Fruktózadehy-drogenáza bola imobilizovaná aj do fosfolipidovej vrstvy vy- luminol + H 2 O 2 —> 3-aminoftalát + H2O + světlo (13)tvorenej na povrchu zlatej elektrody s následnou ampéromet-rickou detekciou fruktózy . Fruktózový biosenzor bol skonštruovaný adsorpciou S. ce-

Okrem fruktózadehydrogenázy bola na stanovenie fruktó- revisiae na acetylcelulózovú membránu v spojem s CO2 de-zy použitá aj sorbitoldehydrogenáza (SDH, EC 1.1.1.14), kto- tektorom40.rá redukuje fruktózu na sorbitol. Fruktóza bola stanovená v nealkoholických nápojoch10'14,

v jablkách a citrónoch , pomarančoch, citrónoch, kiwi, ja-c w- „ . n u TT+ SDH UM , k T , n + hodách akarfiole .

D-fruktoza + NADH + H — > D-sorbitol + NAD(3) 2 . 3 . G a l a k t ó z a

NAD+ sa regeneruje prostredníctvom enzymu diaforázy (DP,EC 1.6.99.-) a mediátora M podlá rovnic (4) a (5). Galaktózasatakmer výlučné stanovuje galaktózaoxidázou

(GalOD, EC 1.1.3.9), čo je vidieť z rovnice (14), i keď naNAD+ + DP r e d + H+ —> NADH + DP 0 X (4) konštrukciu laktózového biosenzora bola použitá aj galak-

tózadehydrogenáza.DP 0 X + M r e d ^ D P r e d + M 0 X (5)

galaktóza + O 2 > kyselina galaktónová + H 2 O 2

a mediátor sa redukuje na elektrodě a prúd tečúci elektrodou ,, .,je úměrný koncentrácii fruktózy.

Fruktóza bola stanovená aj použitím enzymu manitolde- , , . . . , . ., ,_ n , , ,, . , , ,n \s .u J - „ j n n T-«- 1 1 1 /n\ JT • i£\ Vznikajuci peroxid vodíka , alebo ubytok kyslíka jehydrogenazy (MDH, EC 1.1.1.67), podlá rovnice (6). , , ť . , _ .' ,, J , , , , J ,detegovany amperometricky. Bol skonštruovaný galaktozovy

t i t - > , , n „ TT+ MDH t , I>T*T^+ biosenzor s využitím polymérov (Nafion, Nafion + póly(1,3-D-fruktoza + NADH + H — > D-mamtol + NAD ,. . ' . , ,,\ ,• • . , \ , ,. . / . .

-diaminobenzen), poly( 1,3-diaminobenzen)) na elimmaciu ín-(6) terferencií kyseliny askorbovej, močoviny a acetaminofénu ,

galaktózový biosenzor na detekciu galaktózu obsahujúcichPři tejto metóde sa fluorimetricky stanoví úbytok NADH sacharidov, ako sú laktóza, stachyóza, melibióza a rafinóza,

počas reakcie, ktorý je priamo úměrný koncentrácii fruktózy keďže galaktózaoxidáza nie je specifická len na galaktózu ,vo vzorke14. Spektrofotometricky sa stanoví fruktóza za prí- ale aj mikroelektronický biosenzor s imobilizovanou galak-tomnosti enzýmov hexokinázy (HK, EC 2.7.1.1), glukóza- tózaoxidázou v polypyrrole na mikročipe s rozmermi lenfosfátizomerázy (PGI, EC 5.3.1.9) a glukóza-6-fosfátdehy- 16x16 mm (cit.2cf).drogenázy (G6PDH, EC 1.1.1.49) vyjádřenárovnicami (7), (8) Na detekciu peroxidu vodíka vznikajúceho oxidáciou ga-a (9). laktózy galaktózaoxidázou (14) bol použitý chemiluminis-

cenčný detektor (13).D-fruktóza + ATP — H K / M g 2 > ) D-fruktóza-6-P + ADP (7) Galaktóza bola stanovená v plazme19, ale aj pri monitoro-

vaní fermentácie rekombinantnej S. cerevisiae .D-fruktóza-6-P PG1 > D-glukóza-6-P (8)

2 . 4 . X y l ó z aD-glukóza-6-P + NADP+ G 6 P D H > D-glukonát-6-P + , , , - . , - - - , w- u-

° ° V literatuře nie je popisaný selektivny biosenzor na stano-NADPH H+ íO) veniexylózy. Na jej stanovenie sa využívá enzym glukózade-

+ iN AUFH + H f V) h y d r o g e n á z a (GDH, EC 1.1.1.47), ktorý je ovela citlivější nar> J i • J I a. M i n n - i r glukózu, rovnica (75).Produkcia redukovaného NADP sa stanoví spektrofoto- b

metricky pri 340 nm. ., »T»T^+ , , ^ GDH , ,. ,-T . , . „ . . , , , , , . xyloza + NAD + H9O > kyselina xylonova +Izomenzaciou fruktózy glukóza izomerazou (GI, EC 5.3.1.5) ' l J J

dostaneme glukózu (70), ktorá bola stanovená koimobilizá- NADH H+ (1^\ciou glukózaoxidázy (GOD, EC 1.1.3.4) amutarotázy (MUT, + lNAUhl + H {n)EC 5.1.3.3), podlá rovnic (77) a (72). , . , „ . _ . „ , l t f t . , 2 2

r redukovaný NAD je stanoveny spektrofotometncky .Xylóza bola stanovená mikrobiálně baktériami Glucono-

fruktóza—^—> a-glukóza (10) bacter oxydans za použitia kyslíkovej elektrody23 a FET-tran-

Chem. Listy 93, 563 - 569 (1999) Referáty

565

zistora24, keď interferovali glukóza, glycerol, sorbitol, xylitol, taním týchto dvoch hodnot určená výsledná koncentráciaarabitol, xylóza a arabinóza. sacharózy vo vzorke ,

- glukózu možno eliminovat' použitím enzýmov glukóza-oxidázy, mutarotázy a katalázy imobilizovaných do anti-

3. Analýza sacharidov obsahuj úcich glukózu inferenčnej vrstvy26'27 (obr. 1),v molekule - množstvo glukózy stanovené glukózovým biosenzorom

odčítané od hodnoty sacharózy stanovenej sacharózovýmDi- a polysacharidy obsahujúce molekulu glukózy sa sta- biosenzorom je zrejme najpriamočiarejšie riešenie, bez

novujú na základe rozštiepenia vazby (vázieb) hydrolázou, predbežnej úpravy vzorky alebo dodatočného spracovaniaktorou móže byť invertáza (16), (3-galaktozidáza (27) a (25), údajov, poskytuje priamo koncentráciu analytu ,glukoamyláza, alebo a-glukozidáza (23), a-amyláza a P-amy- - enzymatickým odstraněním glukózy před analýzou sacha-láza (26) a pullulanáza (27) za produkcie glukózy, ktorá sa rózy glukózadehydrogenázou,naj častej šie stanoví glukózaoxidázou (77)a(72)za produkcie - zriedením vzorky pri FIA analýze tak, aby glukóza prítom-peroxidu vodíka a vznikajúci peroxid vodíka, alebo ubúdajúci ná vo vzorke sposobovala interferenciu do 3 %,kyslík sa určí amperometricky. - imobilizáciou troch enzýmov: sacharózafosforylázy (SP,

Takto móžu byť stanovené nielen disacharidy (sacharóza, EC 2.4.1.7), fosfoglukomutázy (PGM, EC 5.4.2.2) a glu-laktóza, maltóza, atď), ale aj vyššie sacharidy, ako například kóza-6-fosfátdehydrogenázy (G6P-DH), konverziou pod-škrob. l'a rovnic3 0 (9), (17) a (18).

Výnimkou je stanovenie sacharózy termistorom, keď sadeleguje teplo uvolněné hydrolýzou sacharózy invertázou s a c h a r ó z a + f o s f á t _ ^ g l u k ó z a . j . f o s f á t + fmktózaa nenásleduje uz detekcia glukózy.

(17)3 . 1 . D i s a c h a r i d y

glukóza-1-fosfát P G M > glukóza-6-fosfát (18)K disacharidom obsahujúcim glukózu v molekule patří:

sacharóza (0-a-D-glukopyranozyl-(l->2)-|3-D-fruktofuranóza), Potvrdením poznatku, že přítomnost' mutarotázy zvyšujelaktóza (O-(3-D-galaktopyranozyl-(l—>4)-D-glukopyranóza), citlivosť sacharózového biosenzoraniekorkonásobneje práca,maltóza (O-a-D-glukopyranozyl-(l—>4)-P-D-glukopyranóza), ktorá tiež konstatuje, že použitím dvoch jednoenzýmovýchatď. Disacharidom je aj laktulóza(4-O-P-D-galaktopyranozyl- membrán je lineárny rozsah širší v dósledku difúznych ba--D-fruktofuranóza), ktorá sa v mlieku prirodzene nenachádza, riér31. Imobilizáciou všetkých troch enzýmov na guličky s kon-ale vzniká v alkalickom roztoku laktózy, alebo zahriatím trolovanou vellcosťou pórov sa podařilo skonštruovať biosen-mlieka izomerizáciou laktózy. zor s lineárnym rozsahom v rámci 4 rádov (0,025-100 mM).

Okrem spomínaných troch enzýmov (GOD, MUT, INV),3.1.1. Sacharóza boli na konštrukciu použité imobilizované enzymy invertáza

(INV) a glukózadehydrogenáza (GDH) s potenciometrickouSacharózajenajdóležitejší reprezentant spomedzi disacha- detekciou (FET-tranzistor) podlá rovnice (19), ale aj spek-

ridov, nachádzajúca sa v potravinách, nápojoch a vo fermentač- trofotometrickou analýzou redukovaného NAD-u (cit. ):ných pódach. Stanovenie sacharózy biosenzorom sa realizujepoužitím invertázy, ktoráju hydrolyzuje na fruktózu a glukózu, glukóza + NAD+ —^^—> kyseliny glukónová +a taje následné oxidovaná za produkcie elektrochemicky aktív-nych látok (peroxid vodíka, kyslík alebo protony), ktoré sú + NADH + H + (19)detegované na elektrodě. V případe použitia glukózaoxidázy jejej substrátom P-anomér glukózy a preto je nutné použit' muta- Imobilizáciou troch enzýmov: sacharózafosforylázy (SP),rotázu, ktorá premiefta a-formu na P-formu. Použitím mutaro- fosfoglukomutázy (PGM) a glukóza-6-fosfátdehydrogenázytázy dojde nielen k rýchlejšej odozve, ale aj k zosilneniu (G6P-DH) bol tiež skonštruovaný optický biosenzor, pričomsignálu, na druhej straně k zúženiu lineárneho rozsahu. bol použitý spektrofluorometrický detektor na detekciu redu-

Najčastejšieje sacharóza stanovovaná amperometricky po kovaného kofaktora34 (rovnice 9, 17 á 18).hydrolýze invertázou (INV, EC 3.2.1.26) na a-glukózu a P- Na detekciu sacharózy bol použitý FET-tranzistor, ktorý-fruktózu, izomerizáciou a-glukózy na P-glukózu mutarotá- detegoval kyselinu glukónovú, vznikajúcu hydrolýzou sacha-zou (MUT) a oxidáciou P-glukózy glukózaoxidázou (GOD), rózy, izomerizáciou a-glukózy na P-glukózu a oxidáciou P-podla rovnic (77), (12) a (16). -glukózy glukózaoxidázou35 (rovnice 77, 72 a 16).

Velmi zaujímavým princípom je stanovenie sacharózysacharóza ———> a-D-glukóza + P-D-fruktóza (16) pomocou fluorid citlivého polovodiča, ktorým sa peroxid vo-

díka uvolněný oxidáciou glukózy stanoví peroxidázou (POD,Ubúdajúci kyslík je detegovaný kyslíkovou elektrodou29. EC 1.11.1.7) (20):Ak stanovujeme sacharózu, váčšinou sa vo vzorkách na-

chádza aj glukóza, ktorá ovplyvňuje přesnost' stanovenia, v prí- H 2 O 2 + 4-fluoroanilín — P O D > F" + H2O +páde konečnej detekcie glukózy uvolnenej hydrolýzou sacha-rózy. Tento problém sa dá vyriešiť niekďkými spósobmi: + (polymery anilínu) (20)- po stanovení glukózy glukózovým biosenzorom bola do

reakčnej sústavy přidaná imobilizovaná invertáza a odčí- Signál senzora je tak úměrný koncentrácii sacharózy .

Chem. Listy 93, 563 - 569 (1999) Referáty

Chemiluminiscenčným detektorem využijúc reakciu pero-xidu vodíka uvolněného oxidáciou glukózy (73) a (16), bola sa-charóza detegovaná FIA systémom (flow injection analysis) .

Sacharózový biosenzor bol skonštruovaný imobilizáciouinvertázy na porézně skleněné guličky s detekciou uvolněnéhotepla hydrolýzy termistorem3 .

Okrem enzymových boli skonštruované aj mikrobiálněsacharózové biosenzory s viazaním buňkových stien Saccha-romyces cerevisiae a glukózaoxidázy38 a aj bimikrobiálnysenzor využívajúci imobilizované baktérie Gluconobacteroxydans (glukózadehydrogenázová aktivita) a kvasinky Sac-charomyces cerevisiae (obsah invertázy) s detekcoiu kyslí-kovou elektrodou, ale aj imobilizáciou S. cerevisiae s použitímCO 2 senzora40.

Sacharózovým biosenzorom boli stanovované rozličné dru-hy vzoriek, predovšetkym nealkoholické nápoje 2 7 ' 2 8 ' 3 3 ' 3 4 ' 4 1,med , víno i muka , fermentačné média s kultiváciourekombinantnej E. coli35, S. cerevisiae42, hydrolyzáty sacha-rózy3 7 atď.

3.1.2. Laktóza

Laktóza je disacharidom vyskytujúcim sa predovšetkymv mlieku cicavcov a to v koncentrácii okolo 0,3 mol.l" . Lak-tóza sa dá stanoviť biosenzorom dvomi spósobmi, jednýmz nich je jej hydrolýza (3-galaktozidázou (GAL, EC 3.2.1.23),pričom boli publikované práce bez imobilizácie mutarotázyi s jej imobilizáciou a následnou oxidáciou (3-D-glukózy, dru-hým z nich je hydrolýza (3-galaktozidázou (21) a oxidáciagalaktózaoxidázou (GalOD) (14) a galaktózadehydrogenázou(GalDH), podlá rovnice (22).

Imobilizáciou P-galakozidázy a glukózaoxidázy boloskonštruovaných niekollco laktózovych biosenzorov ' akoajkoimobilizácioumutarotázy44'4 ' .Zrovnice(2/)jevidieť,že aj v případe analýzy laktózy máme podobný problém akopri stanovení sacharózy vo vzorkách obsahujúcich glukózuv případe, že koncovým stanovujúcim analytom laktózovéhobiosenzora je glukóza. Tento problém sa dá obísť alebo použi-tím glukózu eliminujúcej vrstvy s imobilizovanou glukózaoxi-dázou a katalázou (obr. 1), alebo stanovením laktózy biosen-zorom, keďje dělovou molekulou galaktóza s imobilizovanougalaktózaoxidázou46'47.

Na simultánně stanovenie laktózy v přítomnosti glukózybol použitý aj spósob, ktorý je zřetelný z obr. 2.

Okrem použitia glukózaoxidázy bola laktóza stanovená ajpotenciometricky imobilizáciou (3-galaktozidázy a glukóza-dehydrogenázy (GDH) stanovením protónov vodíka (19)a glukózaoxidázy, keď sa potenciometricky stanovila vznika-júca kyselina glukónová FET-tranzistorom (12).

Velmi zaujímavým spósobom stanovenia laktózy je po-užitie biosenzora založeného na imobilizácii transportnéhoproteinu laktóza permeázy do dvojvrstvy lipidu, ktorou jepokrytá tenká folia z kremíka. Transportem laktózy cez mem-bránu sa kotransportujú aj protony, ktoré spósobia pokles pH,ktorý je detegovaný fluorescenčně reakciou protónov s farbi-vom4 .

Laktózový biosenzor bol skonštruovaný imobilizáciou [3--galaktozidázy a glukózaoxidázy a peroxid vodíka bol detego-vaný chemiluminiscenčne po reakcii s luminolom za produk-cie 3-aminoftalátu a světla ' (13).

Laktóza móže byť stanovená aj mikrobiálnym senzoremzaloženým na imobilizácii geneticky manipulovaného kmeňaE. coli, s glukózaoxidázou , ale aj imobilizáciou buniekGluconobacter oxydans spolu s permeabilizovanými kvasin-kami Kluyveromyces marxianus v kombinácii s kyslíkovouelektrodou a buniek S. cerevisiae s použitím CO 2 detektorá40

Laktóza bola stanovená predovšetkym vo vzorkách mliek,pasterizovaného ' ' , odtučneného , plechovkového ,

o 4 4sušeného , ale aj v moči a pri monitorovaní fermentá-

Obr. 1. Princip stanovenia oligosacharidov (A) alebo disacharidov (C) v přítomnosti glukózy použitím glukózu eliminujúcej vrstvy; a -hydroláza oligosacharidu (v případe, že A = škrob, tak a = oc-amyláza, B = dextríny + maltóza, b = glukoamyláza), c - hydroláza disacharidu,v případe, že C = laktóza, tak c = (3-galaktozidáza), GOD = glukózaoxidáza )

566

Chem. Listy 93, 563 - 569 (1999) Referáty

3.1.3. Maltóza

Maltóza je disacharid, ktorý sa volné v prírode nevysky-tuje, vzniká hydrolýzou škrobu, skládá sa z dvoch jednotiekglukózy. Je významná najma v potravinárstve. Na jej stanove-nie sa využívá imobilizácia glukoamylázy (GAM, EC 3.2.1.3)s glukózaoxidázou31, a-glukozidázy (GS, EC 3.2.1.20) spolus glukózaoxidázou313 , (12 a 23), ale aj koimobilizácia a-glu-kozidázy (GS) s glukózadehydrogenázou a stanovenie vzni-kajúcich protónov FET-tranzistorom30 (19) a (23).

maltóza G S G A M > a-D-glukóza + (3-D-glukóza (23)

Maltóza móže byť stanovená aj oxidáciou P-D-glukózyglukózaoxidázou za uvolnenia kyseliny glukónovej, ktorá jepotom detegovaná potenciometricky FET-tranzistorom (12).

Na stanovenie maltózy bol použitý aj enzym maltózafos-foryláza (MP) v kombinácii s glukózaoxidázou (11) a (12),ako to ukazuje nasledujúca rovnica:

maltóza + fosfát — ^ - ^ (3-D-glukóza + glukóza-1-fosfát

(24)

a peroxid vodíka vznikajúci oxidáciou P-D-glukózy glukóza-oxidázou je detegovaný amperometricky na Pt elektrodě .Táto reakcia by sa dala využit' na stanovenie maltózy v přítom-nosti glukózy rovnako ako v případe stanovenia sacharózysacharózafosforylázou, pričom nie je potřebné imobilizovaťizomerázu.

Podobné ako v případe stanovenia sacharózy bola stano-vená aj maltóza fluorid citlivým polovodičom imobilizáciouglukoamylázy (23), glukózaoxidázy aperoxidázy3 (12) a (20)a chemiluminiscenčne imobilizáciou glukoamylázy a glukó-zaoxidázy (12) a (23), keď peroxid vodíka reaguje s lumi-nolom ! 6(73).

Maltóza bola stanovená aj použitím mikrobiálneho bio-senzora adsorpciou Bacillus subtilis na filtračný papier zapoužitia kyslíkovej elektrody54 a adsorpciou S. cerevisiae naacetylcelulózovú membránu s použitím CO 2 detektora .

Maltózovým biosenzorom bol monitorovaný priebeh fer-mentácie E. co/;35, B. subtilis29, S. cerevisiae42 a pivovarskýchkvasiniek , i analýza muky, medu, nealkoholických nápojov

3.1.4. Laktulóza

Je disacharidom zloženým z galaktózy a fruktózy. Biosen-zorom sa dá stanovit' po hydrolýze P-galaktozidázou (GAL),rovnica (25) a oxidáciou fruktózy fruktózadehydrogenázou(FDH) spolu s mediátorom (hexakyanoželezitan draselný),podlá rovnic (7) a (2).

laktulóza + H2O 0 A L > D-galaktóza + D-fruktóza (25)

Redukovaný mediátor je potom oxidovaný na screen-prin-ted elektrodě a prúd tečúci elektrodou je úrnerný koncentráciilaktulózy 56

3 . 2 . P o l y s a c h a r i d y

Polysacharidy sa skladajú z váčšieho počtu monosachari-dových jednotiek. Najčastejšie sa vyskytujúcimi polysacha-ridmi sú celulóza, škrob a glykogén, pričom biosenzormi bolistanovované najma škrob, glykogén (rozvětvený živočišnýpolysacharid) a pullulán.

3.2.1. Škrob

Škrob sa skládá z vo vodě rozpustnej zložky amylózya nerozpustnej zložky amylopektínu. Biosenzorom sa dá sta-

Obr. 2. Simultánně stanovenie sacharózy, laktózy a škrobu v přítomnosti glukózy; A - sacharóza, laktóza, škrob, B - a-D-glukóza, C -(3-D-glukóza, D - peroxid vodíka, E - elektroda, a - invertáza, P-galaktozidáza, amyloglukozidáza, b - mutarotáza, c - glukózaoxidáza, x -celulózová membrána50. V případe, že stanovovanou látkou je sacharóza (případ 3), tak A = sacharóza, tá je rozštiepená invertázou (a) naa-glukózu (B), ktorá je izomerizovaná na (3-glukózu (C) mutarotázou (b). Vznikajúca |3-glukóza je oxidovaná glukózaoxidázou (c) na peroxidvodíka (D), ktorý je detegovaný na elektrodě. Ak sa vo vzorke spolu so sacharózou nachádza aj glukóza (a-glukóza (případ 1) alebo fl-glukóza(případ 2)), tá rovno přejde cez membránu a bude cez peroxid vodíka detegovaná. Sacharóza bude detegovaná so spozdením spósobeným jednakčasom potřebným na jej hydrolýzou, ale aj difúziou spósobenou usporiadaním experimentu

567

Chem. Listy 93, 563 - 569 (1999) Referáty

noviť len amylóza. Na jej detekciu sa najčastejšie využíváimobilizácia a-amylázy (oc-AM, EC 3.2.1.1), glukoamylázy(GAM), glukózaoxidázy a mutarotázy (11), (12), (23), (26)a detekcia kyslíkovou elektrodou48'57, pričom v práci Watana-beho4 8 bol škrob stanovený simultánně spolu s glukózou podláobr. 2.

amylóza °"AM'P'AM > maltóza

Koimobilizáciou troch enzýmov (3-amylázy (|3-AM, EC3.2.1.2), glukoamylázy a glukózaoxidázy, s detekciou vznika-júceho peroxidu vodíka s 4-fluoroanilínom fluorid citlivýmpolovodičom bol tiež připravený biosenzor na stanovenieškrobu, pozři rovnicu (20).

Imobilizáciou a-amylázy, glukoamylázy, glukózadehy-drogenázy s mutarotázou (77), (79), (23), (26) bol připravenýbiosenzor so spektrofotometrickou detekciou redukovanéhoNAD-u (cit.58). Týmto spósobom sa dajú stanoviť aj oligosa-charidy a maltóza.

3.2.2. Glykogén

Glykogén je polysacharid skladajúci sa z rozvětvenýchjednotiek glukóz usporiadaných 1 —>4 a 1 —>6 vazbami. Na jehostanovenie sa využívá hydrolýza a-amylázou na oligosacha-ridy a maltózu (26) a ich hydrolýza na glukózu glukoamy lázou(23). Vznikajúca glukóza bola stanovená glukózadehydroge-názou imobilizovanou s mutarotázou (77) aj79) a stanovenýbol redukovaný NAD spektrofotometricky 59

3.2.3. Pullulán

Je polymérom obsahujúcim maltotriózové jednotky spo-jené a-1,6-glykozidickými vazbami. Tento polysacharid vzni-ká asimiláciou glukózy kvasinkami Aureobasidium pullulansa na jeho detekciu sa využívajú enzymy pullulanáza (PUL,EC 3.2.1.41), glukoamyláza (GAM) a glukózadehydrogenáza(GDH) podlá rovnic (79), (23), (27) a (28).

pullulán — ^ ^ - > oc-maltotrióza (27)

a-maltotrióza — A M G > P-glukóza + a-maltóza (28)

a (3-glukóza je stanovená GDH a vznikajúci redukovaný NADje stanovený spektrofotometricky33.

4. Stanovenie dalších sacharidov

Okrem už spomínaných enzýmov sa na konštrukciu sacha-ridových biosenzorov používajú aj nespecifické enzymy: al-dózadehydrogenáza60, oligosachariddehydrogenáza (citlivána 16 sacharidov) , pyranózaoxidáza (citlivá na 7 sachari-dov) a hexózaoxidáza (citlivá na 13 sacharidov) . Biosen-zor skonštruovaný imobilizáciou takéhoto enzymu je vhodnýna stanovenie sacharidov v komplexných vzorkách, kde sa akovýsledok požaduje celkové množstvo sacharidov, připadneutilizovatelných sacharidov. Príkladmi ich využitia by bolianalýza lignocelulózového hydrolyzátu, hydrolyzátov škrobu,obilnin atď.

Další spósob využitia biosenzorov s nespecifickými enzý-

mami je ich spojenie s kvapalinovou chromatograiou, keď sapomocou HPLC jednotlivé sacharidy rozseparujú s detegujúbiosenzorom ako detektorom. Takýmto spósobom bol skon-štruovaný systém pozostávajúci z kvapalinovej chromato-grafie a biosenzora ako detektora s imobilizovanou pyranózaoxidázou (Phanerochaete chrysosporium) spolu s peroxidá-zou na detekciu glukózy, xylózy a galaktózy počas fermen-

(26) tácie Pichia pastoris64

LITERATURA

1. Clark L. C, Lyons C: Ann. N.Y. Acad. Sci. 702, 29(1962).

2. Turner A. P. F., Karube I.: Biosensors. Fundametals andApplications. Oxford University Press, Oxford 1987.

3. SchellerF.,SchubertF.:7?(Oíeníoren. BirkháuserVerlag,Berlin 1989.

4. Heller A.: Curr. Opin. Biotechnol. 7, 50 (1996).5. Gorton L.: Electroanalysis 7, 23 (1995).6. Kauffmann J. M., Guibault G. G.: Bioprocess Technol.

75, 63 (1991).7. Efremenko V. I., Stolbin S. V., Grekov L. I.: Prikl.

Biokhim. Mikrobiol. 26, 11 (1990).8. Danielsson B.: J. Biotechnol. 75, 187 (1990).9. Chudobová I., Vrbová E.: Chem. Listy 90, 295 (1996).10. XieX.,KuanS. S.,GuilbaultG. G.: Biosens. Bioelectron.

(5,49(1991).11. Matsumoto K., Baeza J. J., Mottola H. A.: Anal. Chem.

65, 1658 (1993).12. Ikeda T., Matsushita F., Senda M.: Biosens. Bioelectron.

6,299(1991).13. Kinnear K. T., Monbouquette G.: Anal. Chem. 69, 1771

(1997).14. Kiba N., Inoue Y., Furusawa M.: Anal. Chim. Acta 243,

183(1991).15. De Mana C. G., Townshend A.: Anal. Chim. Acta 267,

137 (1992).16. SwindlehurstC. A.,NiemanT. A.: Anal. Chim. Acta205,

195 (1988).17. Szabó E. E., Adányi N., Váradi M.: Biosens. Bioelectron.

77, 1051 (1996).18. Yokohama K., Sodě K., Tamiya E., Karube I.: Anal.

Chim. Acta 278, 137 (1989).19. Manowitz P., Stoecker P. W., Yacynych A. M.: Biosens.

Bioelectron. 10, 359 (1995).20. Hin B. F. Y., Sethi R. S., Lowe C. R.: Sens. Actuators57,

550 (1990).21. Nielsen J., Nikolajsen K., Benthin S., Villadsen J.: Anal.

Chim. Acta 237, 165(1990).22. Domínguez E., Marko-Varga G., Hahn-Hagerdal B.,

Gorton L.: Enzyme Microb. Technol. 16, 216 (1994).23. Reshetilov A. N., Iliasov P. V., Donova M. V., Dovbnya

D. V., Boronin A. M., Leathers T. D., Greene R. V.:Biosens. Bioelectron. 72, 241 (1997).

24. Reshetilov A. N., Donova M. V., Dovbnya D. V., BoroninA. M., Leathers T. D., Greene R. V.: Biosens. Bioelec-tron. 77, 401 (1996).

25. Scheller F., Karsten Ch.: Anal. Chim. Acta 755,29 (1983).26. Olsson B., Stalbom B., Johansson G.: Anal. Chim. Acta

779,203(1986).

568

Chem. Listy 93, 563 - 569 (1999) Referáty

27. Matsumoto K., Kamikado H., Matsubara H., Osajima Y.:Anal. Chem. 60, 147 (1988).

28. Xu Y., Guibault G. G.: Anal. Chem. 61, 782 (1989).29. Schgerl K., Brandes L., Dullau T., Holzhauer-Rieger K.,

Hotop S., Hbner U., Wu X., Zhou W.: Anal. Chim. Acta249, 87 (1991).

30. Kullick T., Beyer M., Henning J., Lerch T., Quack R.,Zeitz A., Hitzmann B., Scheper T., Schgerl K.: Anal.Chim. Acta 296, 263 (1994).

31. Filipiak M., Fludra K., Gocimiska E.: Biosens. Bioelec-tron. 7i, 355 (1996).

32. Leite V., Leao I. C, de Vasconcelos G. F. V., PimentelM. C. B„ Silva V. L., Melo E. H. M., Filho J. L. L.:Biotechnol. Tech. 9, 345 (1995).

33. Ogbomo I., Kittsteiner-Eberle R., Englbrecht U., Prin-zing U., Danzer J., Schmidt H.-L.: Anal. Chim. Acta 249,137(1991).

34. Kogure M., Moři H., Ariki H., Kojima Ch., YamamotoH.: Anal. Chim. Acta 337, 107 (1997).

35. Schgerl K., Brandes L., Wu X., Bode J., Ree J. L, BrandtJ., Hitzmann B.: Anal. Chim. Acta 279, 3 (1993).

36. MenzelC, Lerch T., Scheper T., Schgerl K.: Anal. Chim.Acta 317, 259(1995).

37. Mandelius C. F., Blow L., Danielsson B., Mosbach K.:Appl. Microbiol. Biotechnol. 21, 135 (1985).

38. Barlíková A., Švorc J., Miertuš S.: Anal. Chim. Acta 247,83(1991).

39. Švitel J., Čurilla O., Tkáč J.: Biotechnol. Appl. Biochem.27, 153 (1998).

40. Mascini M., Memoli A.: Anal. Chim. Acta 182, 113(1986).

41. Tzouwara-Karayanni S., Crouch S. R.: Food Chem. 35,109 (1990).

42. Kullick T., Bock U., Schubert J., Scheper T., Schgerl K.:Anal. Chim. Acta 300, 25 (1995).

43. Albery W. }., Kalia Y. N., Magner E.: J. Electroanal.Chem. 325, 83 (1992).

44. Narinesingh D., Stoute V. A., Davis G., Ngo T. T.: Anal.Biochem. 194, 16(1991).

45. Puchades R., Maquieira A., Torró L.: Analyst 118, 855(1993).

46. Hamid J. A., Moody G. J., Thomas J. D. R.: Analyst 114,1587 (1989).

47. Schumacher D., Vogel J., Lerche U.: Biosens. Bioelec-tron. 9, 85 (1994).

48. Watanabe E., Takagi M., Takei S.: Biotechnol. Bioeng.35,99(1991).

49. Kiefer H., Klee B., John E., Stierhof Y. D., Jáhnig F.:Biosens. Bioelectron. 6, 233 (1991).

50. Švorc J., Miertuš S., Barlíková A.: Anal. Chem. 62,1628(1990).

51. Tkáč J., Švitel J.: Bull. Potr. Výskumu 36, 113 (1997).52. Pfeiffer D., Ralis E. V., Makower A., Scheller F. W.: J.

Chem. Technol. Biotechnol. 49, 255 (1990).53. Hwel S., Haalck L., Conrath N., Spener F.: Enzyme

Microb. Technol. 21, 413 (1997).54. Renneberg R., Riedel K., LiebsP., SchellerF.: Anal. Lett.

17, 349(1984).55. Váradi M., Adányi N., Nagy G., Rezessy-Szabó J.: Bio-

sens. Bioelectron. 8, 339 (1993).56. MayerM., GenrichM., Knnecke W., Bilitewski U.: Anal.

Chim. Acta 324, 37 (1996).57. Vrbová E., Pecková J., Marek M.: Starch 45, 341 (1993).58. Emnéus J., Gorton L.: Anal. Chim. Acta276, 303 (1993).59. Emnéus J., Gorton L.: Anal. Chim. Acta276, 319 (1993).60. Smolander M.: Anal. Chim. Acta 280, 119 (1993).61. TessemaM., Ruzgas T., GortonL., IkedaT.: Anal. Chim.

Acta 310, 161 (1995).62. Petivalský M., Skládal P., Macholán L., Vole J.: Collect.

Czech. Chem. Commun. 59, 1226 (1994).63. Maes P. C, Nagels L. J.: Anal. Chim. Acta 284, 281

(1993).64. Buttler T., Lidén H., Jnsson J. A., Gorton L., Marko-Var-

ga G., Jeppson H.: Anal. Chim. Acta 324, 103 (1996).

J. Tkáč, J. Švitel, and E. Šturdík (Department ofBioche-mical Technology, Slovák Technical University, Bratislava,Slovák Republic): Biosensors in the Determination of Sac-charides

The article presents a survey of biosensors applied in thedetermination of selected monosaecharides (glucose, fructose,galactose and xylose), disaecharides (saceharose, lactose, mal-tose and lactulose) and polysaecharides (starch, glycogen andpullulane). A concise deseription of constructional details ofa biosensor is included: connection of the biological part to thephysicochemical transducer. The enzyme systems ušed indetection of saceharides are deseribed in detai 1. Attention wasdirected to the application of oxidative enzymes (oxidase ordehydrogenase) in detecting monosaecharides, further to theconstruction of multienzyme biosensors for the detection ofdi- and polysaecharides and to practical applications of bio-sensors mainly in food analysis.

569