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biosalud Manizales (Colombia) Vol. 10 No. 1 134 p. enero - junio 2011 ISSN 1657-9550

Revista Biosalud

ISSN 1657-9550Fundada en 2002

Nueva Periodicidad SemestralTiraje 300 ejemplares

Volumen 10, No. 1, 134 p.enero - junio, 2011

Manizales - Colombia.

Rector Universidad de CaldasRicardo Gómez Giraldo

Vicerrectora AcadémicaLuz Amalia Rios Vásquez

Vicerrector de Investigaciones y PostgradosCarlos Emilio García Duque

Vicerrector AdministrativoFabio Hernando Arias Orozco

Vicerrectora de ProyecciónFanny Osorio Giraldo

REVISTA BIOSALUD

Es una publicación de carácter científico del Grupo de Investigación BIOSALUD, adscrito al Departamento de Ciencias Básicas de la Salud de la Facultad de Ciencias para la Salud. Su misión es la publicación de artículos originales producto de proyectos de investigación, artículos de reflexión, de revisión y reportes de caso sobre diversos temas de salud humana tanto en ciencias básicas como clínicas. La revista va dirigida a la comunidad científica nacional e internacional que investiga sobre los temas antes relacionados, a los profesionales y estudiantes de pre y postgrado en diferentes áreas de la salud humana.

Indexada en: Latin American and Caribbean Health Science-LILACS, Índice Nacional de Publicaciones Seriadas Científicas y Tecnológicas Colombianas (Publindex-Categoría B).

Comité técnico:

Juan David Giraldo MárquezCoordinador comité técnico

Gerardo Quintero CastroCorrector de estilo

Claudia Marcela GómezTraductora

Juan David López GonzálezDiagramación

Carlos Eduardo Tavera Pinzón Soporte Tecnológico

Acceso en Línea:http://biosalud.ucaldas.edu.co

Ventas, Suscripciones y Canjes:Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados

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Manizales - Colombia

Editado por:Universidad de Caldas

Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados

La responsabilidad de lo expresado en cada artículo es exclusiva del autor y no expresa ni compromete la posición de la revista. El contenido de esta publicación puede reproducirse citando la fuente.

Director

Jorge Enrique Pérez Cárdenas, Bacteriólogo MSc. Departamento de Ciencias Básicas de la Salud, Universidad de Caldas.

coMitÉ eDitoriAL

Luís Fernando Uribe Vásquez, Médico Veterinario y Zootecnista PhD. Departamento de Salud Animal. Universidad de Caldas.

Rogelio Ocampo Cardona, Licenciado en Biología y Química, PhD. Departamento de Química. Universidad de Caldas.

Juan Carlos Sepúlveda Arias, Médico, PhD. Facultad de Medicina. Universidad Tecnológica de Pereira.

Fernando Delgado Blandón, Licenciado en Biología y Química, PhD. Universidad Católica de Manizales.

Pablo Moreno Acosta, Microbiólogo, PhD, Instituto Nacional de cancerología.

Gustavo Isaza Mejía, Miembro de la sala especializada de medicamentos y productos biológicos-comisión revisora. Instituto nacional de vigilancia de medicamento y alimentos (invima)-colombia

Carlos Alonso Polo Galíndez, Médico Veterinario Zootecnista- PhD. Toxicología. Departamento de Salud Animal, Universidad de Caldas.

Piedad Matilde Agudelo Flórez, Biologa, PhD, Investigadora Instituto Colombino de Medicina Tropical, Universidad CES.

coMitÉ iNterNAcioNAL

Mario Herrera-Marschitz MD, PhD Department of Physiology and Pharmacology. Karolinska Institute. Stockholm, Sweden.

Gustavo Zuccolilli, PhD. Instituto de Anatomía, Facultad de Ciencias Veterinarias UNLP, La Plata, Argentina.

Alejandro Vélez H.MD. Patólogo, Hospital Pablo Tobón Uribe, Medellín.

Dr. Sócrates Herrera, Médico, Director del Centro Internacional de Vacunas, Centro de Investigaciones Científicas Caucaseco.

Josep Balart Serra MD, Ph.D. Jefe Laboratorio de Radiobiologia Aplicada Laboratorio de Investigacion Translacional (IDIBELL)Instituto Catalan de Oncologia

TABLA DE CONTENIDO

EDITORIAL

La onicomicosis: de sus implicaciones cosméticas a las dificultades en su tratamientoJorge Enrique Pérez Cárdenas

ARTÍCULOS ORIGINALES

Actividad antiinflamatoria de extractos y fracciones de Myrcianthes leucoxila, Calea prunifolia, Curatella americana Y Physalis peruviana en los modelos edema auricular por TpA, edema plantar por carragenina y artritis inducida por colágenoMaría Cristina González GuevaraLuis Fernando Ospina GiraldoJavier Rincón Velandia

Evaluación de métodos moleculares y microscópicos para la detección de Cryptosporidium spp. (ApICOMpLEXA – CRYpTOSpORIDIIDAE)Ricardo José Ocampo GallegoLuz Adriana Cardozo DuqueGermán Ariel López GarnertMaría Elena ÁlvarezJorge Enrique PérezFredy Arvey Rivera Páez

Caracterización neuropsicológica de una muestra de niños y niñas con TDAH de la ciudad de ManizalesDiana Marcela Montoya LondoñoVilma Varela CifuentesCarmen Dussán Lubert

Evaluación de las buenas prácticas ganaderas en bovinos de carne en el centro de CaldasMarlyn Hellen Romero PeñuelaJorge Alberto Sánchez Valencia

Comparación de los niveles de hormonas tiroideas entre dos líneas de aves ponedorasJosé Henry OsorioDiana Marcela SalamancaJorge Enrique Pérez

ARTÍCULOS DE REVISIÓN

Biomarcadores de estrés como indicadores de bienestar animal en ganado de carneMarlyn Hellen Romero PeñuelaLuis Fernando Uribe-VelásquezJorge Alberto Sánchez Valencia

Diferencias bioquímicas y fisiológicas en el metabolismo de lipoproteínas de aves comercialesJosé Henry OsorioJancy Darly Flórez

Actualización en el funcionamiento de la glándula tiroides en caninos. primera parte: funcionamiento normalLuis Fernando Uribe-VelásquezJosé Henry OsorioCatalina López Salazar

NORMAS EDITORIALES

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TABLE OF CONTENTS

EDITORIAL

Onychomycomis: From cosmetic implications to difficulties in treatmentJorge Enrique pérez Cárdenas

ORIGINAL ARTICLES

Antiinflammatory activity of extracts and fractions of Myrcianthes leucoxila, Calea prunifolia, Curatella americana Y Physalis peruviana obtained from on TpA-induced ear oedema, carrageenan-induced paw oedema and collagen-induced arthritisMaría Cristina González GuevaraLuis Fernando Ospina GiraldoJavier Rincón Velandia

Evaluation of molecular and microscopic methods for detection of Cryptosporidium spp. (ApICOMpLEXA – CRYpTOSpORIDIIDAE)Ricardo José Ocampo GallegoLuz Adriana Cardozo DuqueGermán Ariel López GarnertMaría Elena ÁlvarezJorge Enrique PérezFredy Arvey Rivera Páez

Neuropsychological characterization of a sample of children with ADHD from the city of ManizalesDiana Marcela Montoya LondoñoVilma Varela CifuentesCarmen Dussán Lubert

Evaluation of good livestock farming practices on cattle beef in the central region of CaldasMarlyn Hellen Romero PeñuelaJorge Alberto Sánchez Valencia

Comparison of thyroid hormone levels between two lines of laying hensJosé Henry OsorioDiana Marcela SalamancaJorge Enrique Pérez

REVISION ARTICLES

Stress biomarkers as indicators of animal welfare in cattle beef farmingMarlyn Hellen Romero PeñuelaLuis Fernando Uribe-VelásquezJorge Alberto Sánchez Valencia

Biochemical differences in poultry lipoprotein metabolismJosé Henry OsorioJancy Darly Flórez

Update of the thyroid gland functioning in canines. part I: normal functioningLuis Fernando Uribe-VelásquezJosé Henry OsorioCatalina López Salazar

AUTHOR GUIDELINES

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EDITORIAL

LA ONICOMICOSIS: DE SUS IMPLICACIONES COSMÉTICAS A LAS DIFICULTADES EN SU TRATAMIENTO

La onicomicosis se ha considerado como un problema de salud que compromete principalmente a las personas adultas. Es una afección que se presenta en todas partes del mundo con diferentes frecuencias y con diferentes agentes etiológicos. Estas diferencias en los agentes etiológicos aislados se han asociado con factores geográficos y climáticos, entre otros.

La enfermedad se caracteriza por generar lesiones que afectan principalmente las uñas de los pies, asociada a diferentes factores como la baja velocidad de crecimiento de la uña (1 mm por mes aproximadamente), la disminución en la circulación sanguínea alrededor de la placa ungueal, la manipulación de las uñas por manicuristas, el uso de calzado cerrado y estrecho y la presencia de tiña pedis. Estas lesiones se caracterizan por tener manifestaciones variadas, que van desde un simple cambio en la coloración de la uña hasta la distrofia o la pérdida total de la misma. Por el grado de evolución y las características clínicas se podrían considerar estas manifestaciones clínicas como de tipo crónico.

Dentro de los agentes etiológicos asociados con la onicomicosis en nuestra región se presentan los dermatofitos como los más frecuentes, seguidos de diferentes especies de Candida y, por último, se encuentran los hongos filamentosos no dermatofitos, especialmente diferentes especies de Fusarium. Algunos autores consideran que los verdaderamente patógenos de las uñas son los dermatofitos, pero estudios recientes han demostrado que tanto Candida como otros hongos no dermatofitos pueden poseer factores de virulencia tales como enzimas que contribuyen a la digestión de la uña y a los cambios de la placa ungueal. Pero, además, aunque el tratamiento de las lesiones con los antimicóticos más utilizados como son la terbinafina, el fluconazol y el itraconazol, podría ser muy efectivo en la eliminación de los dermatofitos, debido a las lesiones instauradas se podría generar un oportunismo que permite la colonización de levaduras y hongos no dermatofitos.

La persistencia de las lesiones micóticas en las uñas no solo está asociada con los factores de riesgo antes mencionados, sino que también pueden haber factores intrínsecos del hospedero que permiten que a pesar de que muchas personas estén sometidas a los factores de riesgo, solamente unas pocas presenten invasión y persistencia en sus manifestaciones clínicas. Con relación a este aspecto, se han realizado pocos estudios que demuestren qué factor o factores pueden estar relacionados, mientras que dentro de los factores de riesgo ninguno ha demostrado una asociación significativa, lo cual también puede estar indicando que la presencia de las lesiones se debe a la conjugación de múltiples factores que llevan a la presentación de la enfermedad y a la invasión masiva de las uñas por parte de estos tres grupos de hongos.

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Uno de los conceptos que se poseen en cuanto al tratamiento es que este tipo de lesión micótica es difícil de erradicar y esta afirmación no se ha podido comprobar del todo, debido a la ausencia de estudios clínicos serios que demuestren cuál es la evolución de la enfermedad luego de un tratamiento instaurado. Aunque algunos estudios muestran que la sensibilidad in vitro de los hongos aislados varía dependiendo del género del hongo que está asociado con la lesión, no hay estudios que muestren la correlación entre los hallazgos in vitro y lo que ocurre in vivo. Este aspecto ha contribuido a determinar que la realización de las pruebas de susceptibilidad frente a antimicóticos no sea de utilidad para el establecimiento de un tratamiento. Sin embargo, los resultados obtenidos de estas pruebas de susceptibilidad sí pueden estar mostrando una tendencia de los diferentes grupos de hongos de una región hacia la resistencia frente a los antimicóticos más frecuentemente empleados en el tratamiento de esta dolencia.

Hay dos aspectos que preocupan al hacer el examen microbiológico de las uñas afectadas. Primero, la frecuencia con la cual se aíslan hongos dermatofitos ha ido bajando, encontrándose un aumento en la frecuencia de aislamientos de Candida y de hongos no dermatofitos; dentro de las especies de Candida hay predominio de levaduras de las especies no albicans que junto con los hongos no dermatofitos se consideran más resistentes a la acción de algunos de los antimicóticos antes mencionados. Segundo, los hongos dermatofitos han presentado también un aumento en los niveles de resistencia a dichos antimicóticos.

Por las razones antes mencionadas se podría decir que el panorama de las lesiones micóticas en las uñas es bastante sombrío si se tiene en cuenta que no se conocen los factores de susceptibilidad que inducen la lesión, que los agentes etiológicos han ido cambiando con el tiempo encontrándose especies de hongos que presentan mayor resistencia a los antimicóticos y, además, los hongos dermatofitos también han ido presentado mayores niveles de resistencia a los antimicóticos.

JORGE ENRIQUE PÉREZ CÁRDENASDirector revista BIOSALUD

Departamento de Ciencias BásicasFacultad de Ciencias para la Salud

Universidad de Caldas

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ARTÍCULOS ORIGINALES

Recibido: febrero 9 del 2011 - Aceptado: abril 15 del 2011Biosalud, Volumen 10 No. 1, enero - junio, 2011. págs. 9 - 18

RESUMEN

Introducción. El empleo etnofarmacológico de plantas en el manejo de procesos inflamatorios crónicos y la necesidad su caracterización farmacológica, promueven la evaluación de actividad antiinflamatoria de sustancias en modelos in vivo.

Materiales y métodos. Evaluación de extractos y fracciones de Calea prunifolia (CP), Curatella americana (CA), Myrcianthes leucoxila (ML) y Physalis peruviana (PP) sobre los modelos edema auricular por acetato de tetradecanoilforbol (TPA) en ratón albino ICR y edema plantar por carragenina en ratas Wistar, seleccionando un extracto para valorar su actividad antiartrítica en el modelo artritis inducida por colágeno en ratones DBA.

Resultados. Las fracciones con mayor porcentaje de inhibición del edema en el modelo edema auricular por TPA fueron ML etanólica total (82±6%), CP rica en terpenos (81±6%) y CA rica en terpenos (81±7%) (P<0,05). No se obtuvo actividad antiinflamatoria significativa sobre el modelo edema plantar por carragenina. Se evaluó la actividad antiartrítica de la fracción rica en terpenos de ML sobre el modelo artritis inducida por colágeno, sin encontrarse efecto significativo sobre edema de patas traseras, peso

ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA DE EXTRACTOS Y FRACCIONES DE Myrcianthes leucoxila, Calea prunifolia, Curatella americana Y

Physalis peruviana EN LOS MODELOS EDEMA AURICULAR POR TPA, EDEMA PLANTAR POR CARRAGENINA Y ARTRITIS INDUCIDA POR

COLÁGENO

María Cristina González Guevara1

Luis Fernando Ospina Giraldo2

Javier Rincón Velandia2

1 M.D. M.Sc. profesora Asistente, Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia.Dirección postal: Avenida Carrera 30 No. 45-03. Ciudad Universitaria, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Edificio 450, Oficina 215. Teléfonos: 3165000 Ext. 14622. Fax: 3165060.2 Q.F. ph.D. profesor Asociado, Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia.

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corporal, escala histopatológica de severidad de artritis ni inmunohistoquímica para factor de necrosis tumoral alfa (P>0,05).

Discusión. La actividad antiinflamatoria en el modelo de inflamación aguda edema auricular por TPA para los extractos y fracciones de CP, CA y ML se puede relacionar con la afectación de mediadores relacionados con fosfolipasa A2 dado el nivel de efecto similar a indometacina encontrado. La fracción terpénica de ML no mostró actividad antiartrítica ni modificó la expresión de TNF-α en el modelo de artritis crónica autoinmune empleado, por lo cual no posee actividad inmunomoduladora ni antiinflamatoria en la dosis evaluada.

Conclusión: Las fracciones terpénicas de los extractos de CA y CP y los extractos metanólicos de ML mostraron una actividad antiinflamatoria significativa en el edema auricular inducida por TPA. Estos extractos tuvieron poca actividad sobre el edema inducido por carragenina en la pata. La fracción terpénica del extracto ML no presentó actividad antiartrítica en el modelo de artritis inducido por el colágeno

Palabras clave: actividad antiinflamatoria, artritis inducida por colágeno, edema plantar por carragenina, Calea prunifolia, Curatella americana, Myrcianthes leucoxila, Physalis peruviana.

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María Cristina González Guevara, Luis Fernando Ospina Giraldo, Javier Rincón Velandia

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ANTIINFLAMMATORY ACTIVITY OF EXTRACTS AND FRACTIONS OF Myrcianthes leucoxila, Calea prunifolia, Curatella americana Y Physalis peruviana OBTAINED

FROM ON TPA-INDUCED EAR OEDEMA, CARRAGEENAN-

INDUCED PAW OEDEMA AND COLLAGEN-INDUCED ARTHRITIS

ABSTRACT

I n t r o d u c t i o n . E t h n o p h a r m a c o l o g i c a l use of plants in management of chronic inflammatory diseases and the need to have their pharmacological characterization promote the evaluation of anti-inflammatory activity over in vivo models.

Materials and methods. Evaluation of extracts and fractions of Calea prunifolia (CP), Curatella americana (CA), Myrcianthes leucoxila(ML) and Physalis peruviana (PP) on auricular edema by tetradecanoylphorbol acetate (TPA)-in ICR albino mice and carrageenan-induced leg edema in Wistar rats selecting an extract to evaluate its anti-arthritic activity in collagen-induced arthritis model in DBA mice.

Results. The fractions with greater edema inhibition percentage on TPA-induced ear edema included whole ethanolic fraction of ML (82±6%), CP terpenes rich fraction (81±6%) and CA terpenes rich fraction (81±7%) (P<0.05).

Significant antiinflamatory activity was not obtained on the carrageenan-induced leg edema. Evaluation of antiarthritic activityof the ML terpenes rich fraction was carried out on collagen induced arthritis. Without finding any significant effect on back leg edema, corporal weight, arthritis histopathology severity scale or immunohistochemical tumoral necrosis factor alfa immunohistochemical evaluation (P>0.05).

Discussion. Anti-inflammatory activity in TPA-induced acute ear edema model for CP, CA, and ML extracts and fractions can be interfered by phospholipase A2 related mediators due to similar effect with indomethacin was found. The ML terpens rich fraction neither show any anti-arthritic activity nor affected TNF-α expression on the autoimmune chronic arthritis model used, reason why it does not have immunomodulatory/anti-inflammatory effect on the evaluated dose.

Conclusion. CA and CP terpenic rich fractions and ML ethanol extract showed significant anti-inflammatory activity in TPA-induced ear edema. They did have some activity in carrageenan-induced leg edema. The ML terpenic rich fraction did not have anti-arthritic activity in the collagen-induced arthritis model

Key words: anti-inflammatory activity, collagen-induced arthritis, carrageenan-induced paw oedema, Calea prunifolia, Curatella americana, Myrcianthes leucoxila, Physalis peruviana.

INTRODUCCIÓN

El manejo farmacológico actual disponible para la artritis reumatoidea (AR) presenta, entre otras características, respuesta no predecible entre pacientes frente a los fármacos antirreumáticos modificadores de enfermedad (FAME), riesgo de reacciones adversas, y alto costo (1). Debido a lo anterior, se hace necesaria la búsqueda de alternativas terapéuticas y/o complementarias para dicha entidad, dentro de las cuales están

los productos derivados de fuentes naturales (2, 3). Teniendo en cuenta la diversidad vegetal colombiana y el empleo etnofarmacológico de sustancias obtenidas de fuentes naturales para diversas patologías, entre ellas procesos inflamatorios crónicos, se hace necesaria su evaluación en modelos biológicos. Dentro de las plantas de uso común para dichas entidades se encuentran: Calea prunifolia, Curatella americana, Myrcianthes leucoxila y Physalis peruviana (4), sobre las cuales se ha descrito en trabajos

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Actividad antiinflamatoria de extractos y fracciones de Myrcianthes leucoxila, Calea prunifolia...

previos actividad antiinflamatoria, antioxidante e inmunomoduladora (5, 6, 7, 8, 9, 10). Se considera necesario como complemento de la caracterización de actividad biológica, la valoración de la capacidad antiartrítica en modelos de inflamación crónica, para lo cual la literatura describe diversas metodologías en murinos (11, 12), dentro de las cuales se encuentran modelos espontáneos e inducidos de artritis. Dentro de estos últimos, se incluye el modelo artritis inducida por colágeno (Collagen-induced arthritis, CIA), descrito en 1977 por Trentham y cols. en ratas y en 1980 por Courtenay y cols. en ratones (13), el cual se caracteriza por la inducción de una reacción inmunológica frente a componentes del cartílago articular al aplicar colágeno II (CII) (homólogo o heterólogo). La susceptibilidad al modelo varía según la cepa de roedor, siendo la cepa de ratón DBA una para las que se describe alta respuesta artrítica (13). El modelo CIA presenta similitud en cuanto a fisiopatología y curso clínico con AR en humanos y es útil en la evaluación de sustancias con actividad inmunomoduladora, entre otras ventajas (14, 15, 16).

Para continuar la caracterización de la actividad antiinflamatoria de productos obtenidos de plantas colombianas, el presente estudio evaluó sobre los modelos edema auricular inducido por 13-acetato de 12-tetradecanoilforbol (EATPA) en ratón y edema plantar por carragenina en rata (EPC), extractos y fracciones de C. prunifolia, C. americana, M. leucoxila y P. peruviana. Sobre dichos resultados, se seleccionó el extracto con potencial efecto antiinflamatorio para la valoración de su actividad antiartrítica en el modelo artritis inducida por colágeno en ratón.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

Calea prunifolia (CP): se evaluó el extracto etanólico total, fracción rica en flavonoides y fracción rica en terpenos, obtenidos de partes aéreas.

Curatella americana (CA): se evaluaron una fracción rica en flavonoides y otra rica en terpenos, obtenidas de corteza.

Myrcianthes leucoxila (ML): se evaluó el extracto etanólico total y una fracción rica en terpenos.

Physalis peruviana (PP): se evaluó el extracto etéreo total A y su fracción primaria EtOH-H2O D, obtenidas previamente por Franco y cols. (6).

Modelos evaluados

Edema auricular inducido por TPA en ratón (EATPA)

Se emplearon ratones albinos ICR machos de 28 a 40 g, entre siete a diez semanas (n = 6-10), suministrados por el Departamento de Farmacia, Universidad Nacional de Colombia (DFUNC), mantenidos en condiciones estándar. Se administró el irritante 13-acetato de 12-tetradecanoilforbol (TPA, 2,5 µg/oreja) (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA) junto con indometacina 500 µg/oreja como patrón (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA) o con la sustancia evaluada (fracción o extracto 500-1000 mg/oreja) disueltas en acetona (Mallinckrodt Chemicals) vía tópica en la oreja derecha (volumen total: 20 µL/oreja, 10 µL/cara). La oreja izquierda se empleó como control. Transcurridas 4 horas se sacrificaron los animales por dislocación cervical y se obtuvo muestra de cada pabellón auricular por sacabocado (7 mm de diámetro) (17). Se calculó la diferencia de peso entre oreja tratada y no tratada [Delta de peso (mg) = ∆ peso (mg) = peso tratada – peso no tratada]. Finalmente se expresaron los resultados como porcentaje de inhibición del edema calculado con la fórmula: % de inhibición: 100 * (∆ peso grupo control – ∆ peso tratamiento)/(∆ peso grupo control).

Se considera como actividad antiinflamatoria moderada la inhibición del edema del 35 al 65% y como buen efecto antiinflamatorio un valor mayor de 65%.



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Edema plantar por carragenina (EPC)

Se emplearon ratas Wistar hembras, peso entre 100-320 g, 7 a 14 semanas de edad (n = 6-10) suministradas por el DFUNC. Previo ayuno de 12 horas, se administró vía oral el tratamiento a evaluar (patrón indometacina) (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA) 10 mg/kg; sustancia a evaluar (extracto o fracción 250 a 1000 mg/kg); vehículo (glicerina, propilenglicol, tween 80 y solución salina normal) (17). A la hora se administra carragenina λ al 3% como agente inductor de inflamación (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA) suspendida en solución salina (0,1 ml) en la pata trasera derecha. Se realiza la evaluación del efecto en la primera, tercera y quinta horas tras la aplicación del irritante mediante la determinación del desplazamiento de volumen que producen las patas de los animales en el pletismómetro digital (Ugo Basile 7140). Se calcula la diferencia de desplazamiento entre la pata derecha irritada (tratada) con la izquierda (no tratada). Los resultados se expresan como porcentaje de inhibición del edema aplicando la fórmula (siendo V desplazamiento de volumen):

% de inhibición = 100*[(Vt-Vnt) grupo control – (Vt-Vnt) tratamiento]/(Vt-Vnt) grupo control.

Se considera como actividad antiinflamatoria moderada la inhibición del edema del 30 al 65% y como buen efecto antiinflamatorio un valor mayor de 65%.

Artritis inducida por colágeno (CIA)

Animales de experimentación: ratones DBA/1 machos (Harlan Sprague Dawley, Inc, Chicago, IL, USA) de 10 a 11 semanas al inicio de la inducción de la artritis, previa cuarentena, mantenidos en el bioterio del DFUNC en condiciones estándar, con la administración de la comida empleada por el proveedor de los animales (Global 18% Sterilizable Rodent Diet. Cod. 1304, lote No. 010108, Harlan Teklad, Madison, WI, USA).

Preparación del antígeno: se disolvió el CII (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA, cód. C9301) en ácido acético 10 mM a una concentración de 4 mg/ml (100 µg de CII) para la inmunización inicial y de 2 mg/ml para el refuerzo mediante agitación continua durante un periodo de 8 horas a 4ºC. Se preparó el adyuvante completo de Freund (Complete Freund´s adjuvant, CFA) mediante la molida de 100 µg de Mycobacterium tuberculosis H37Ra (Becton Dickinson Diagnostic Systems ® MD, USA. Código. 231141) en mortero y su mezcla con adyuvante incompleto de Freund (Incomplete Freund´s adjuvant, IFA, Becton Dickinson Diagnostic Systems ® MD, USA, Codigo. 263910) hasta una concentración final de 4 mg/ml. Posteriormente, se preparó la emulsión de CII/CFA para la inmunización y de CII/IFA para el refuerzo (13).

Protocolo de inmunización: se realizó vía intradérmica en la base de la cola. El día cero se inyectaron 50 µL de la emulsión del antígeno (CII/CFA, 100 µg de CII) y se administró dosis de refuerzo en la semana 6 de la emulsión CII 50 µg en IFA (13Rosloniec) a un lote de 40 ratones.

Administración de sustancias a evaluar: durante las ocho semanas de inducción se evaluó el desarrollo de artritis mediante la escala visual de severidad de artritis (16) para cada extremidad (0 si no hay evidencia de edema ni eritema; 4 si eritema y edema severo alrededor del tobillo, pata y dedos). En la semana 9 se distribuyeron al azar los animales que presentaron signos de artritis en grupos, para la administración oral diaria durante dos semanas de la fracción seleccionada (ML fracción rica en terpenos disuelta en vehículo, 100 mg/kg) con grupo patrón blanco y control vehículo (coprecipitado de polivinilpirrolidona (PVP) (1:4), glicerina, polietilenglicol y tween), dando por terminado el estudio en la semana 10.

Parámetros de evaluación de actividad antiartrítica

Desplazamiento de volumen de patas traseras: se empleó pletismómetro digital (Ugo Basile 7140) para cuantificar el desplazamiento de la solución

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conductora contenida en el receptáculo donde se introduce la pata sumergida, hasta que el tobillo estuviera a la altura de la línea inferior impresa en el receptáculo. Se midió el volumen de las dos patas por duplicado. El grado de desplazamiento de volumen se relaciona con el grado de edema de cada pata. Se registraron datos previos al inicio de la administración de extractos, y luego cada dos días durante la administración de las sustancias evaluadas. Los resultados se expresaron como desplazamiento volumétrico (mL).

Peso corporal: cada dos días se registró el peso corporal en la balanza de platillo externo (Triple Beam Balance OHAUS®).

Evaluación histopatológica: una vez finalizado el periodo de administración y evaluación de actividad antiartrítica (semana 10), se sacrificaron los animales por dislocación cervical y se obtuvieron muestras de patas mediante disección siguiendo el protocolo de manejo y envío de muestras del Laboratorio de Patología, Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia. El material para estudio histopatológico se fijo en formalina bufferada al 4%, se realizó procesamiento automatizado del tejido en procesador automatizado de tejidos Citadel 2000®, con deshidratación mediante alcohol etílico en concentración ascendente, aclaramiento con xilol e imbibición en parafina de punto de fusión controlado (56 a 58 grados centígrados) y posterior inclusión y corte del tejido para obtener láminas histológicas de 3 a 4 micras de espesor que se colorearon con hematoxilina-eosina. El material se montó en medio resinoso y se interpretó con un microscopio óptico Nikon YS100.

Inmunohistoquímica para TNF alfa: se empleó un anticuerpo policlonal anti-factor de necrosis tumoral elaborado en conejo. Se realizaron cortes de los bloques de parafina en láminas cargadas, recuperación antigénica mediante el uso de calor, bloqueo de la peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno al 3% en metanol, incubación del tejido con el anticuerpo primario por una hora y lavados con buffer fosfato de

pH 7. El sistema de visualización utilizado fue el cromógeno aminoetil carbazol. Se realizó contratinción con hematoxilina de Mayer y se montó en medio resinoso. Se montaron paralelos a todo el procedimiento los correspondientes controles positivos y negativos de la técnica. La interpretación de la inmunorreactividad se hizo con un microscopio óptico Nikon YS100 estableciendo el tipo de célula presente.

La evaluación histopatológica e inmuno-histoquímica se realizó por un patólogo experimentado quien realizó una lectura ciega del material histológico, usando una escala semicuantitativa mediante cuatro parámetros: infiltración de células inflamatorias, hiperplasia sinovial, daño de cartílago y erosión ósea (0: ausente, 1: leve, 2: moderada, 3: severa).

Análisis estadístico

Los resultados se expresaron como media ± desviación estándar. Para los datos de delta de peso de orejas (EATPA) y delta de volumen de patas (EPC), se realizó análisis de varianza univariado seguido de prueba Tukey para comparaciones múltiples. Respecto a parámetros del modelo CIA, para comparar los cambios dependientes del tiempo para el desplazamiento volumétrico de patas traseras y peso corporal, se empleó el análisis de varianza de medidas repetidas que evalúa tanto el efecto del tiempo (día de medición) como el efecto de las sustancias evaluadas, con posterior prueba de Tukey de comparaciones múltiples. El puntaje histopatológico se analizó con estadística no paramétrica (prueba de Kruskal-Wallis). Se consideraron valores P<0,05 como significativos. Los datos fueron analizados empleando el programa SPSS 18.0 ®.

Consideraciones éticas

Todos los experimentos se real izaron cumpliendo con los requerimientos acerca del empleo de animales con fines experimentales en la legislación colombiana vigente y con la normativa de la Universidad Nacional de Colombia.



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RESULTADOS

En el modelo EATPA en ratón, los extractos con mayor actividad antiinflamatoria fueron ML etanólica total, CP terpenos y CA terpenos (Tabla 1), confirmando dicha actividad en un tercer ensayo obteniéndose similar actividad antiinflamatoria (alrededor del 81% de inhibición). Para el modelo EPC en rata, los extractos evaluados no mostraron actividad antiinflamatoria significativa al comparar con vehículo (P>0,05). La fracción que mostró el menor desplazamiento de volumen correspondió a ML fracción rica en terpenos en la quinta hora (∆ volumen = 242±23), aunque no presentó diferencias significativas respecto al control vehículo (∆ volumen = 370±57). Esta fracción fue seleccionada para evaluación sobre el modelo

CIA. La incidencia de artritis (% de animales que dentro de cada grupo desarrolló cualquier signo de artritis sin importar la severidad) en la semana 8 después de la primera inmunización fue de 50% (20 de 41). Durante las dos semanas de evaluación de actividad antiartrítica, no se observaron diferencias significativas en el desplazamiento de volumen de patas traseras ni en el peso corporal entre tratamientos (P<0,05).

El análisis histopatológico presentó puntajes sin diferencia significativa entre tratamientos (ver Tabla 2) al igual que la tinción para TNF alfa por inmunohistoquímica, la cual evidenció inmunorreactividad en macrófagos, fibroblastos y algunas células endoteliales presentes en los cortes respectivos.

Tabla 1. Actividad antiinflamatoria sobre el edema auricular inducido por 13-acetato de 12-tetradecanoilforbol (TPA) en ratón.

SUSTANCIA DOSIS (µg/oreja)

Delta de peso (mg)

% de inhibición

ENSAYO 1Vehículo 17±3 NAIndometacina 500 6±1* 67±7Physalis peruviana, fracción D 500 13±1* 24±6Physalis peruviana, fracción A 500 13±1* 22±4Myrcianthes leucoxila, terpenos 500 11±1* 36±5Myrcianthes leucoxila, etanólica 1000 10±1* 45±6Calea prunifolia, etanólica 1000 13±1* 26±4ENSAYO 2Vehículo 19±3 NAIndometacina 500 7±2* 63±8Calea prunifolia, flavonoides 1000 16±1 14±3Calea prunifolia, terpenos 1000 8±2* 58±11Curatella americana, flavonoides 1000 13±2* 30±8Curatella americana, terpenos 1000 8±2* 59±9ENSAYO 3Vehículo 15±3 NAIndometacina 500 3±1* 81±7Calea prunifolia, terpenos 500 3±1* 81±6Curatella americana, terpenos 500 3±1* 81±7Myrcianthes leucoxila, etanólicá 500 3±1* 82±6

Ensayo 1 y 2 n = 6. Ensayo 3 n = 10. Datos expresados como media ± D.S. w* Test de Tukey significativo (P<0,05) al comparar con control (vehículo). NA: no aplica.

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Tabla 2. Puntaje histopatológico e inmunohistoquímico para TNF alfa en cortes de articulación de ratones con artritis inducida por colágeno.

PARÁMETRO HISTOLÓGICO* Vehículo ML terpénica (100 mg/kg) Blanco

Infiltración células inflamatorias 2±1 2±2 0±0Hiperplasia sinovial 1±1 1±1 0±0Tejido de granulación 1±1 1±1 0±0Daño del cartílago 1±1 1±1 0±0Erosión ósea 1±1 1±1 0±0

Los ratones recibieron vía oral el tratamiento durante 15 días después de la instauración del proceso artrítico. n = 4-5. * Cada parámetro histopatológico se valoró siguiendo una escala de severidad de 0 (ausente) a 3 (severo), evaluación realizada por un patólogo ciego al tratamiento de cada espécimen. Los valores correspondientes tanto a la tinción por hematoxilina-eosina como por TNF alfa por inmunohistoquímica son similares. Datos presentados como media ± desviación estándar. No diferencias significativas según Kruskal-Wallis. ML: Myrcianthes leucoxila.

DISCUSIÓN

Los extractos de CA y CP ricos en terpenos y ML etanólico, mostraron buena actividad antiinflamatoria en el modelo EATPA similar a lo referido en estudios previos (9, 10, 18) en un rango comparable a la indometacina. La aplicación de TPA en la oreja de ratón se relaciona con activación de fosfolipasa A2, producción de prostaglandinas y leucotrienos (17, 19), mediadores que podrían intervenir en el efecto hallado para dichos extractos. En estudios previos sobre CA se refiere la presencia de triterpenos con capacidad captadora de radicales libres (8). Se ha comunicado para otras especies de Calea la presencia de sesquiterpenlactonas, que podría estar relacionada con dicha actividad (9, 20). Asimismo, para otras especies de Calea se ha reportado actividad antiinflamatoria en otros biomodelos de inflamación aguda y subaguda

(21, 22). En relación a extractos etanólicos de ML se describe actividad antiinflamatoria en modelos de inflamación aguda (10), y actividad antioxidante e inhibidora de la vía clásica y terminal del sistema del complemento (23), mecanismos que podrían vincularse con el potencial antiinflamatorio/inmunomodulador de dichas sustancias.

Se ha descrito el perfil de mediadores implicados en cada fase para el modelo EPC, con liberación inicial de serotonina e histamina, en la fase intermedia predominio de cininas y con participación de prostaglandinas en la tercera fase (18). La literatura reporta para otras especies de Calea actividad importante sobre este modelo (21, 22). En el presente estudio, ninguna de las sustancias evaluadas mostró actividad antiinflamatoria. El extracto que mostró la mayor actividad, aunque no significativa, en la quinta hora correspondió a la fracción terpénica de ML, la cual se consideró que por su mayor concentración en terpenos tendría un mayor potencial antiinflamatorio y fue evaluada en el modelo CIA.

En el modelo CIA se observó una incidencia de artritis menor y más tardía a la reportada en la literatura (13, 24, 25), a pesar del seguimiento del protocolo usualmente empleado para la inducción de CIA, que incluyó en el desarrollo de este estudio aspectos como empleo de una cepa de ratón susceptible, tipo de CII, protocolo de inmunización, condiciones de



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mantenimiento de los animales, entre otros. La severidad de artritis clínica y de inflamación tisular, no se afectó frente a la administración diaria de 100 mg/kg de la fracción terpénica de ML. No se encontraron reportes de evaluación sobre modelos de artritis crónica en las fuentes consultadas para ML. La literatura refiere que el modelo CIA tiene como ventaja especial el ser empleado para la evaluación de inhibidores de citoquinas, que han incluido evaluación de inhibidores de interleucina 1 (IL-1), IL-4 y factor de necrosis tumoral (TNF), entre otros (16), constituyéndose en uno de los modelos base de evaluación de potenciales antiartríticos para el empleo en humanos de terapias biológicas en AR, al demostrarse que el bloqueo de TNF-α e IL-1β disminuye la severidad clínica e histológica de la enfermedad en otros estudios (26). En el presente estudio, la expresión tisular de TNF-α no fue afectada por el extracto de ML, demostrando que no posee actividad inmunomoduladora frente a esta citoquina en el modelo de artritis autoinmune empleado.

CONCLUSIÓN

Este estudio demostró actividad antiinflamatoria en el modelo EATPA de las fracciones ricas en terpenos de CP, CA y fracción etanólica total de ML. No mostraron las muestras evaluadas actividad sobre el modelo edema plantar por carragenina, y la fracción terpénica de ML no presentó efecto antiartrítico sobre el modelo artritis inducida por colágeno en ratón.

AGRADECIMIENTOS

El presente trabajo se desarrolló como parte de las actividades del proyecto de investigación: “Estudio farmacológico de posibles antiartríticos de origen natural en un modelo murino”, financiado por la División de Investigación de Bogotá de la Universidad Nacional de Colombia (UNC) (Proyecto QUIPU 20301007495).

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REFERENCIAS

1. Van Vollenhoven RF. Treatment of rheumatoid arthritis: state of the art 2009. Nat Rev Rheumatol 2009 Oct; 5(10):531-41.

2. patwardhan B, Gautam M. Botanical immunodrugs: scope and opportunities. Drug Discov Today 2005 Apr 1; 10(7):495-502.

3. Zhang p, Li J, Han Y, Yu XW, Qin L. Traditional Chinese medicine in the treatment of rheumatoid arthritis: a general review. Rheumatol Int. 2010 Apr; 30(6):713-8. Epub 2010 Mar 5.

4. García Barriga H. Flora Medicinal Colombiana. Botánica médica. Colciencias; 1975. Tomo II, p. 207, 303. Tomo III, p. 33, 83, 303.

5. Rodríguez M, Vergel N, Ospina LF, Calle J y pinzón R. Evaluación de actividades enzimáticas elastasa y mieloperoxidasa como marcadores de degranulación leucocitaria en modelos de inflamación aguda. Rev. Col. Cienc. Quím. Farm. 2004; 34: 35-45.

6. Franco LA, Matiz GE, Calle J, pinzón R, Ospina LF. Actividad antinflamatoria de extractos y fracciones obtenidas de cálices de Physalis peruviana L. Biomédica 2007; 27:110-5.

7. Martínez W, Ospina LF, Granados D, Delgado G. In vitro studies on the relationship between the anti-inflammatory activity of Physalis peruviana extracts and the phagocytic process. Immunopharmacol Immunotoxicol 2010 Mar; 32(1):63-73.

8. Duarte E, Castañeda JA. Estudio fitoquímico y de la actividad inmunomoduladora de las fracciones más activas obtenidas del extracto etanólico de la corteza de Curatella americana (Tesis). Bogotá, Colombia: Universidad Nacional de Colombia; 2003.

9. Ospina LF, Cardozo CM, Mora AC, Calle J, pinzón R. Screening de actividades antioxidante y antiinflamatoria de plantas medicinales colombianas. En: Fresquet JL, Aguirre Cp, eds. 5º Coloquio Europeo de Etnofarmacología - El Mestizaje cultural en etnofarmacología: de los saberes indígenas a los científicos. Revista de Fitoterapia 2005; 5(Supl.1): 212.

10. González MC, Ospina LF, Calle J, Rincón J. Evaluación de extractos y fracciones de plantas colombianas en modelos de inflamación aguda, subcrónica y crónica Rev. Colomb. Cienc. Quím. Farm. 2007; 36(2):166-174.

11. Kerwar SS, Oronsky AL. Rheumatoid arthritis, experimental models. In: Roitt IM, Delves pJ, eds. Encyclopedia of immunology. London: Academic press; 1992. p. 1332-36.

12. Crofford LJ, Wilder RL. Arthritis and autoimmunity in animals. In: McCarty DJ, Koopman WJ, eds. Arthritis and allied conditions. A textbook of rheumatology. philadelphia: Lea & Febiger; 1993. p. 525-531.

13. Rosloniec EF, Cremer M, Kang A, Myers LK. Collagen-induced arthritis. In: Current protocols in immunology. New York: John Wiley and Sons; 1996. p. 15.5.1-15.5.24.

14. Myers LK, Rosloniec EF, Cremer MA, Kang AH. Collagen-induced arthritis, an animal model of autoimmunity. Life Sci. 1997; 61(19):1861-78.

15. Holmdahl R, Bockermann R, Bäcklund J, Yamada H. The molecular pathogenesis of collagen-induced arthritis in mice- a model for rheumatoid arthritis. Ageing Res Rev 2002 Feb; 1(1):135-47.

16. Wooley pH. The usefulness and the limitations of animal models in identifying targets for therapy in arthritis. Best pract Res Clin Rheumatol 2004 Feb; 18(1):47-58.



ISSN 1657-9550

17. García MD, Fernández MA, Álvarez A, Sáenz MT. Antinociceptive and anti-inflammatory effect of the aqueous extract from leaves of Pimenta racemosa var. ozua (Mirtaceae). J Ethnopharmacol 2004 Mar; 91(1):69-73.

18. Alexandre-Moreira MS, piuvezam MR, Araújo CC, Thomas G. Studies on the anti-inflammatory and analgesic activity of Curatella americana L. J Ethnopharmacol 1999 Nov 1; 67(2):171-7.

19. Hernández V, Recio MC, Máñez S, Giner RM, Ríos JL. Effects of naturally occurring dihydroflavonols from Inula viscosa on inflammation and enzymes involved in the arachidonic acid metabolism. Life Sciences 2007; 81:480-8.

20. Bork pM, Schmitz ML, Kuhnt M, Escher C, Heinrich M. Sesquiterpene lactone containing Mexican Indian medicinal plants and pure sesquiterpene lactones as potent inhibitors of transcription factor NF-ΚB. FEBS Lett 1997; 402:85-90.

21. Venegas-Flores H, Segura-Cobos D, Vázquez-Cruz B. Antiinflammatory activity of the aqueous extract of Calea zacatechichi. proc West pharmacol Soc 2002; 45:110-1.

22. Segura-Cobos D, Venegas-Flores H, Baiza-Gitman LA, Vázquez-Cruz B. Antinociceptive and anti-inflammatory effects of the methanol extract of Calea zacatechichi leaves and its fractions. pharmacologyonline 2010; 2:1100-1110.

23. Garnica Monroy C. Contribución al estudio fitoquímico y de la actividad inmunomoduladora del extracto etanólico de las hojas de Myrcianthes leucoxila (Tesis). Bogotá, Colombia: Universidad Nacional de Colombia; 2004.

24. Shin SS, Jin M, Jung HJ, Kim B, Jeon H, Choi JJ, et al. Suppressive effects of pG201, an ethanol extract from herbs, on collagen-induced arthritis in mice. Rheumatology (Oxford) 2003 May; 42(5):665-72.

25. Lin N, Liu C, Xiao C, Jia H, Imada K, Wu H, Ito A. Triptolide, a diterpenoid triepoxide, suppresses inflammation and cartilage destruction in collagen-induced arthritis mice. Biochem pharmacol 2007 Jan 1; 73(1):136-46. Epub 2006 Sep 6.

26. Williams RO. Models of rheumatoid arthritis. In: Zollner T, Renz H, Asadullah K., eds. Animal models of T cell-mediated skin Diseases. Ernst Schering Research Foundation, Workshop 50. New York: Springer-Verlag; 2005. p. 105-107.

RESUMEN

Introducción. La criptosporidiosis es una enfermedad emergente causada por protozoarios del género Cryptosporidium, afecta un amplio rango de vertebrados incluyendo al hombre, su prevalencia oscila entre el 4-6% en centro y sur América y puede llegar a causar la muerte en pacientes inmunosuprimidos, por lo que es considerada un problema de salud pública en todo el mundo. Se hace necesario implementar y evaluar estrategias de detección y tipificación de las distintas especies de Cryptosporidium, para adoptar medidas de control y seguimiento.

Objetivo. Realizar una comparación de métodos microscópicos y moleculares para la detección y tipificación de las especies de Cryptosporidium, con el fin de utilizar aquel de mayor sensibilidad en la detección del parásito en muestras de agua.

Materiales y métodos. La detección y tipificación de Cryptosporidium spp., en muestras fecales y de agua, usando inicialmente un método de concentración tanto para las heces como para el agua (formol-éter y el método de

floculación inorgánica con carbonato de calcio); la identificación del parásito se realizó por la tinción de Ziehl-Neelsen y la amplificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) de regiones del ADN ribosomal, de genes que codifican para la proteína Hsp70 y del gen que codifica para la proteína de la pared del ooquiste de Cryptosporidium (COWP). La tipificación se realizó por medio de digestión con las enzimas de restricción SspI, VspI y RsaI.

Resultados. La tinción de Ziehl-Neelsen, comprobó la presencia de Cryptosporidium spp., en 10 de las 168 muestras analizadas (humanos, terneros, perros y conejos), la tipificación por PCR, confirmaron 15 muestras positivas para C. parvum y una para C. hominis.

Conclusiones. Se demuestra la sensibilidad de la detección de Cryptosporidium, por PCR y su utilidad en el diagnóstico, al registrar la presencia de dos especies del parásito circulando en muestras del municipio de Manizales.

Palabras clave: Cryptosporidium spp., rADN, Hsp70, COWP, Ziehl-Neelsen.

EVALUACIÓN DE MÉTODOS MOLECULARES Y MICROSCÓPICOS PARA LA DETECCIÓN DE Cryptosporidium spp.

(APICOMPLEXA – CRYPTOSPORIDIIDAE)*

Ricardo José Ocampo Gallego1

Luz Adriana Cardozo Duque1

Germán Ariel López Garnert2

María Elena Álvarez3

Jorge Enrique pérez3

Fredy Arvey Rivera páez2

* Trabajo financiado por la Vicerrectoría de Investigaciones y postgrados de la Universidad de Caldas.1 Biólogos, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Caldas, Manizales (Caldas, Colombia).2 profesores Grupo de Investigación Genética, Biodiversidad y Fitomejoramiento (GEBIOME). Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Caldas, Manizales (Caldas, Colombia).3 profesores del Departamento de Ciencias Básicas para la Salud, Facultad de Ciencias para la Salud, Universidad de Caldas, Manizales (Caldas, Colombia).Correspondencia: Calle 65 No. 26-10, Departamento de Ciencias Biológicas, Cuarto piso Edificio Orlando Sierra Hernández, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Tel.: 6-8781500 Ext. 12189 - 12194. E-mail: [email protected]

ISSN 1657-9550Recibido: mayo 10 del 2011 - Aceptado: julio 14 del 2011

Biosalud, Volumen 10 No. 1, enero - junio, 2011. págs. 19 - 29

20Biosalud, Volumen 10 No.1, enero - junio, 2011. págs. 19 - 29

Ricardo José Ocampo Gallego, Luz Adriana Cardozo Duque, Germán Ariel López Garnert, María Elena Álvarez, Jorge Enrique pérez, Fredy Arvey Rivera páez

ISSN 1657-9550

EVALUATION OF MOLECULAR AND MICROSCOPIC METHODS

FOR DETECTION OF Cryptosporidium spp.

(APICOMPLEXA – CRYPTOSPORIDIIDAE)

ABSTRACT

Introduction. Cryptosporidiosis is an emerging disease caused by protozoa of the Cryptosporidium genus,which affects a wide range of vertebrates, including humansIts prevalence ranges from 4%-6% in Central and South America and can even cause death in immunosuppressed patients reason why it is considered a public health problem worldwide. It is necessary to implement and evaluate strategies for detection and typification of different Cryptosporidium species, to adopt control measures and monitoring.

Objective. To perform a comparison between microscopic and molecular methods for the detection and typification of Cryptosporidium species with the purpose of using the most sensitive method in the detection of Cryptosporidium oocysts in water samples.

Materials and methods. Detection and typification of Cryptosporidium spp, in feces and water samples were done initially using a concentration method for both feces and water (Formol-ether and inorganic flocculation method with Calcium carbonate); the parasite identification was carried out using the Ziehl-Nelseen staining and the Polymerase Chain Reaction PCR amplification of ribosomal ADN regions, of gens codified for Hsp70 protein and the gen that codifies for the Cryptosporidium oocyst wall protein (COWP). The typification was carried out by digestion with restriction enzymes SspI, RsaI and VspI.

Results. The Ziehl-Neelsen staining, confirmed the presence of Cryptosporidium spp., in 10 of the 168 samples tested (humans, calves, dogs and rabbits), the PCR typification, confirmed 15 positive samples for C. parvum and one for C. hominis.

Conclusion. The sensitivity of detection of Cryptosporidium by PCR and its utility in the diagnosis is shown, registering the presence of two species of the parasite circulating in samples taken in the municipality of Manizales

Key words: Cryptosporidium spp., rDNA, Hsp70, COWP, Ziehl-Neelsen.

INTRODUCCIÓN

La criptosporidiosis es una enfermedad emergente causada por parásitos del género Cryptosporidium, el cual se reconoció por primera vez como causa de enfermedad en humanos en 1976, pero solo en 1982 tomó relevancia, cuando el número de casos detectados empezó a incrementarse rápidamente junto con el SIDA (1). A través de la historia se han reportado numerosas epidemias de criptosporidiosis, destacándose la presentada en la primavera de 1993 en Milwaukee, estado de Wisconsin, donde se estima que 400.000 personas se enfermaron, y algunos pacientes con SIDA fallecieron (1).

La enfermedad causa diarrea aguda que puede estar acompañada de dolor abdominal, náuseas, vómito, inapetencia, pérdida de peso, fiebre y problemas respiratorios (2). La materia fecal puede contener mucus pero la presencia de sangre y leucocitos es rara, debido a que se trata de una diarrea no inflamatoria (3). Las alteraciones morfológicas del epitelio intestinal de los individuos infectados incluyen atrofia vellosa, cambios mitocondriales y una actividad lisosomal aumentada en las células infectadas (4). La duración y severidad de los síntomas clínicos son variables (5) y dependen en gran parte de la edad y del estado inmunológico de la persona infectada (6), pero también de la virulencia de la cepa del parásito (3). En las

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Evaluación de métodos moleculares y microscópicos para la detección de Cryptosporidium spp.

personas inmunocompetentes la enfermedad es asintomática o autolimitada, y puede persistir entre 7-10 días y algunas semanas (6). En individuos con deficiencias inmunitarias, la criptosporidiosis puede convertirse en una enfermedad crónica que se prolonga por meses o años y, en casos extremos como en los pacientes con SIDA, la enfermedad puede ser muy severa, y llegar a un 50% de mortalidad (4).

La transmisión de Cryptosporidium spp., puede producirse principalmente por contacto directo, por alimentos contaminados o por medio del agua en donde se encuentran ooquistes viables excretados por personas o animales infectados (7). La criptosporidiosis no puede ser diagnosticada solo por los síntomas, debido a que la sintomatología es similar a la presentada en otras enfermedades intestinales causadas por diferentes tipos de bacterias, virus o parásitos. Los métodos de detección e identificación para el género Cryptosporidium pueden agruparse en tres categorías:

Métodos clásicos. Normalmente, el diagnóstico se establece por métodos microscópicos convencionales, y se utilizan con frecuencia el método modificado de Ziehl-Neelsen y el de auramina-fenol en frotis fecales sin concentrar (8). Cuando en las muestras se espera un número bajo de ooquistes, la concentración de los ooquistes de las muestras fecales puede aumentar la sensibilidad de la detección.

Métodos inmunológicos. Han resultado útiles dos sistemas de detección inmunológica de ooquistes de Cryptosporidium los cuales se basan en la detección de antígenos (inmunofluorescencia directa y ELISA), para lo cual se han comercializado varios kits. Cada uno tiene un nivel similar de sensibilidad y puede emplearse tanto en muestras fecales concentradas como no concentradas, dependiendo del número probable de ooquistes en la muestra. Comparados con las tinciones convencionales, los kits son costosos, considerando que parecen tener un umbral similar de detección (8).

Métodos moleculares. Como alternativa al diagnóstico convencional se ha desarrollado una gran variedad de protocolos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección de ácidos nucleicos de Cryptosporidium spp. Los métodos moleculares son los más sensibles para detectar ooquistes en muestras ambientales, aunque la sensibilidad de los métodos publicados varía entre 1 y 106 ooquistes (8).

Debido a que el agua es una de las fuentes más importantes para la adquisición de este protozoario, el Ministerio de Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial junto con el Ministerio de la Protección Social publicaron la Resolución número 2115 de julio 22 de 2007 (9), la cual en su capítulo III indica que el valor aceptable de ooquistes de Cryptosporidium en el agua de consumo humano debe ser de cero, y por lo tanto se exige que las entidades prestadoras del servicio de agua, así como también los entes de control, adopten metodologías debidamente avaladas por el Instituto Nacional de Salud que permitan su detección en el agua de consumo humano; en el proceso de implementación de una metodología que permita la identificación de este parásito, la presente investigación pretende comparar diferentes alternativas metodológicas, microbiológicas y moleculares que permitan determinar cuál de estos métodos podría ser el más adecuado para la detección de los ooquistes de diferentes especies de Cryptosporidium en el agua.


Diagnóstico parasitológico de Cryptosporidium spp.

La identificación microscópica de parásitos del género Cryptosporidium, se realizó a 168 muestras de materia fecal de cuatro hospederos: humanos (Homo sapiens), terneros lactantes (Bos taurus), perros (Canis familiaris) y conejos (Oryctalagus cuniculus). Las muestras se colectaron en frascos



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coprológicos estériles y se rotularon con código para su posterior identificación. Cada una de las heces se depositó en nevera de icopor que contenía pilas refrigerantes, para evitar su descomposición antes de ser transportadas al Laboratorio de Genética de la Universidad de Caldas para su procesamiento. Cada muestra se concentró utilizando el método formol-éter (10).

Para definir la presencia o ausencia de los ooquistes de Cryptosporidium spp., mediante microscopía, 97 muestras se evaluaron y compararon por dos metodologías de tinción: tinción Ziehl-Neelsen (Heariksen & Pohlenz, 1981) la cual involucra el calentamiento de la fucsina fenicada hasta observar la emisión de vapores (11), y la tinción de Ziehl-Neelsen modificada (Casemore et al., 1984) en la cual la fucsina fenicada se agrega en frío (12). Ambas metodologías están fundamentadas en la demostración de las características de ácido-alcohol resistencia del parásito.

Las restantes 71 muestras, solo se evaluaron por el método de tinción de Ziehl-Neelsen, que presentó una mayor sensibilidad en la detección de Cryptosporidium spp.

Detección de ADN de Cryptosporidium spp. mediante PCR

La estandarización microscópica y molecular para la detección de Cryptosporidium, comprometió las primeras 97 muestras examinadas por microscopia y positivas por alguna de las dos metodologías de tinción, se les realizó la extracción de ADN, por el método fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (Gonçalves et al., 2008) (13), cada muestra se procesó individualmente en cámara de bioseguridad clase IIA. Para evitar interferencias en el diagnóstico individual, al iniciar cada jornada de trabajo, se realizó la extracción de una muestra control libre de parásitos, que permitía corroborar las condiciones del área de trabajo y la pureza de los reactivos. La cantidad y la calidad del ADN extraído, se determinó con la ayuda

de un espectrofotómetro Nano Vue (General Electric - serie 110482) a una absorbancia de 260/280 nanómetros.

Los análisis moleculares, correspondieron a la amplificación por PCR de la subunidad pequeña (SSU) 18S, subunidad grande (LSU) 26S y el gen 5.8S del ADN ribosomal (14), así como el gen Hsp 70 (proteína de choque térmico de 70 KDa) (15), y el gen COWP (proteína de la membrana externa de la pared del ooquiste) (16).

La utilización de 7 iniciadores (14, 15, 16), se complementó con el diseño de tres iniciadores diseñados con el programa Primer BLAST (www.ncbi.nlm.niv.gov), sobre una secuencia completa del ADN ribosomal para el género Cryptosporidium (código de acceso, GenBank Nº AF301594) (Tabla 1). La especificidad de cada uno de los cebadores se evaluó con la herramienta nucleótide-blast, sumado a que su especificidad, sensibilidad y reproducibilidad se han comprobado para Cryptosporidium por diferentes autores (14, 15, 16). Los productos de amplificación se separaron en geles de agarosa al 0,6% coloreados con bromuro de etidio y en geles de poliacrilamida al 6% coloreados con nitrato de plata (17).

La identificación microscópica y detección de ADN de Cryptosporidium por PCR, así como la sensibilidad de cada uno de los iniciadores, se evaluó con las restantes 71 muestras de materia fecal humana y bovina. Por último, se realizó una prueba piloto para la detección de Cryptosporidium spp. en muestras de agua, en dos localidades de la ciudad de Manizales: 1) quebrada Toldafría (latitud norte, 05°01’15,0’’; longitud oeste, 75°26’13,6’’), 2) quebrada Olivares (latitud norte, 05°03’47,3’’; longitud oeste, 75°29’06,6’’). De cada una de las localidades se tomaron dos muestras de 20 litros de agua, según la metodología propuesta por el Standard Methods de la AWWA APHA WPFC (18). Las muestras se llevaron al Laboratorio de Genética de la Universidad de Caldas, una vez allí las muestras de agua se distribuyeron en

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garrafones plásticos estériles de 20 litros para facilitar su manipulación.

Las muestras se concentraron con el método de floculación con carbonato de calcio para la recuperación de las formas quísticas (19). Para cada muestra de agua de 20 litros se realizaron 10 pruebas por medio de tinción de Ziehl-Neelsen y por PCR con los iniciadores UC18, BCOWP-CRY, HSP4-HSP3, para la identificación y detección de Crypstosporidium spp.

RESULTADOS

La etapa de estandarización, correspondiente al análisis microscópico de 97 muestras de materia fecal para la identificación de Cryptosporidium spp. por medio de la tinción de Ziehl-Nelseen, permitió confirmar la presencia del parásito en cinco muestras. Los ooquistes presentaron una morfología de discos ovoides teñidos irregularmente de rojo, y un diámetro aproximado de 4 a 6 micrómetros (11). En las placas también fue posible observar la presencia de levaduras y bacterias ácido-alcohol resistentes, que eran morfológicamente distintas al Cryptosporidium y no originaron confusión. La evaluación de los métodos de tinción, comprobaron que la metodología Ziehl-Neelsen (11) era más sensible que Ziehl-Neelsen modificada (12) con el número de muestras procesadas en este estudio (Tabla 2).

El ADN obtenido mediante la extracción (13), fue de buena calidad. Esto se puede afirmar debido a que las muestras analizadas mediante espectrofotometría, presentaron un rango entre 1,6-2 a una relación de absorbancia de 260/280 nanómetros. La concentración del ADN osciló entre 205-300,5 ng/µl, pero es de tener en cuenta que este ADN no corresponde en su totalidad al

del parásito, debido a que de las muestras fecales se puede extraer ADN correspondiente a otros parásitos, bacterias, e incluso del huésped.

En las 5 muestras positivas por microscopía, se confirmó la presencia de Cryptosporidium spp. por medio de PCR, presentando los tamaños moleculares correspondientes a los reportados en la literatura para cada iniciador (Figura 1).

La tipificación de las 5 muestras positivas por microscopia y corroboradas por PCR, con los iniciadores que amplifican sobre el gen SSU del ADN ribosomal (18S-18SN), y el gen COWP (BCOWP-CRY), y su posterior digestión con las enzimas de restricción SspI, VspI y RsaI (PCR-RFLP), demostraron la presencia de Cryptosporidium parvum en 3 muestras bovinas y 1 humana, así como la presencia de Cryptosporidium hominis en 1 muestra humana (Tabla 3).

La evaluación de 71 muestras de materia fecal humana y bovina, para confrontar la sensibilidad de la tinción de Ziehl-Neelsen y la PCR utilizando el iniciador UC18 (iniciador que mostró la mayor sensibilidad), registró la presencia de 5 muestras positivas para Cryptosporidium, a través de la tinción por Ziehl-Neelsen (prevalencia 7,04%) y un total de 11 muestras positivas por PCR (prevalencia 15,49%). Es de anotar que todas las muestras positivas bajo la lectura al microscopio se reconfirmaron por PCR.

Las 11 muestras positivas por PCR, amplificando los genes COWP y la SSU del rADN, además de su posterior digestión con las enzimas de restricción SspI, VspI y RsaI, confirmaron la presencia de Cryptosporidium parvum. La prueba piloto para la detección de Cryptosporidium en las quebradas Toldafría y Olivares, resultó negativa en los dos sitios de muestreo.



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Tabla 1. Iniciadores utilizados para evaluar Cryptosporidium spp.

iniciador Secuencia 5’-3’ LocusProducto obtenido

(Pb)

Producto esperado

(Pb)Autor

CPB-DIAGFCPB-DIAGR

AAGCTCGTAGTTGGATTTCTGTAAGGTGCTGAAGGAGTAAGG rDNA 430 420-450

Johnson e t a l . , 1995

18SF18SR18SNF18SNR

TTCTAGAGCTAATACATGCGCCCATTTCCTTCGAAACAGGAGGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAGAAGGAGTAAGGAACAACCTCCA

rDNA 850 826-864Xiao et al., 2000

UC18FUC18R

AACACGGGAAAACTCACCAGGTACAAAGGGCAGGGACGTA rDNA 450 446 *

UC5.SFUC5.8R

TCTCATAACGATGAAGGACGCTGTAAATTACTGCTATTTGCGTTGA rDNA 100 100 *

UC26FUC26R

GCGAGTGAACAGGAAAAAGCCGAGCTTCCACCAGACTTTC rDNA NA 867 *

HSPF3HSPR3HSPF4HSPR4

GCTGSTGATACTCACTTGGGTGGCTCTTGTCCATACCAGCATCCGGTGGTGGTACTTTTGATGTATCGCCTGAACCTTTGGAATACG

Hsp70 330 325

Morgan e t a l . , 2001

CRY-9CRY-15BCOWPFBCOWPR

GGACTGAAATACAGGCATTATCTTGGTAGATAATGGAAGAGATTGTGACCGCTTCTCAACAACCATCTTGTCCTCCGCACCTGTTCCCACTCAATGTAAACCC

COWP 550 553Spano et al., 1997

* Iniciadores diseñados con el programa Primer BLAST. NA: no amplifico. Fuente: Autores.

Tabla 2. Detección de Cryptosporidium spp. por los dos métodos de tinción.

Huésped Ziehl-NeelsenModificada (Casemore et al., 1984)

Ziehl-Neelsen(Heariksen & Pohlenz, 1981)

Humano 2/50 (4%) 2/50 (4%)

Ternero 1/39 (2,56%) 3/39 (7,69%)

Perro 0/6 (0%) 0/6 (0%)

Conejo 0/2 (0%) 0/2 (0%)

TOTAL 3/97(2,91%) 5/97(4,85%)

Fuente: Autores.

25


Tabla 3. PCR-RFLP utilizando los iniciadores que amplifi can sobre la SSU del rRNA (18S-18SN) y el gen COWP (BCOWP-CRY).

SSU del rRNA COWP

HuéspedProducto

PCR rDNA

DigestiónSSPI *

DigestiónVSPI *

Producto PCR

COWP

DigestiónRSAI* Especie

Bovino 848 449, 268, 108, 12, 11 625, 116, 104 550 410, 106, 34 C. parvum

Bovino 848 449, 268, 108, 12, 11 625, 116, 104 550 410, 106, 34 C. parvum

Bovino 848 449, 268, 108, 12, 11 625, 116, 104 550 410, 106, 34 C. parvum

Humano 848 449, 268, 111, 12, 11 561, 116, 104, 70 550 285, 125, 106, 34 C. hominis

Humano 848 449, 268, 108,12, 11 625, 116, 104 550 410, 106, 34 C. parvum

* Tamaños de las bandas visibles en geles de poliacrilamida al 4% en pb.

Fuente: Autores.

Fuente: Autores.

Figura 1. Amplifi cación del gen Hsp70 de Cryptosporidium spp., con los iniciadores HSP4-HSP3. Gel de poliacrilamida al 6%, coloreado con nitrato de plata. MP: Marcador de peso molecular

(Easy ladder I). CR: Control de reacción. CN: Control negativo. H: Bovino (Huésped Bovino). H: Humano (Huésped Humano).



ISSN 1657-9550

DISCUSIÓN

Tradicionalmente la técnica de referencia más utilizada en los laboratorios para la detección de ooquistes de Cryptosporidium spp. es la tinción de Ziehl-Neelsen, debido a su bajo costo y a la relativa sencillez. Sin embargo, a través del tiempo se han realizado varias modificaciones de este método de tinción.

Cuando se compararon los dos métodos de tinción, los mejores resultados obtenidos en la presente investigación, corresponden al método de tinción propuesto por Heariksen & Pohlenz en 1981, resultados similares han sido reportados en literatura (20, 21), llegando a la conclusión de que la coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante (fucsina fenicada) atraviese la pared celular que contiene ceras. El suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de los ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir del organismo, además el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a la célula (21).

Aunque no existe un método recomendado para extraer el ADN de ooquistes de Cryptosporidium, y la sensibilidad de la mayoría de los métodos no se ha establecido por completo, el protocolo de extracción de ADN utilizado en el presente estudio (13), mostró ser eficaz para extraer ADN de buena calidad a partir de materia fecal. La sensibilidad de los iniciadores utilizados en la presente investigación, diseñados sobre el ADN ribosomal, el gen COWP y el gen Hsp70, mostraron tener niveles similares de sensibilidad para detectar parásitos del género Cryptosporidium. Esto se pudo presentar debido a que se utilizaron buenas cantidades de ADN en los ensayos por PCR, lo que no permitió que se observaran diferencias notables de sensibilidad en las muestras analizadas. Sin embargo, estos resultados contrastan con los reportes en la literatura (22, 23), donde los iniciadores diseñados sobre el rDNA (SSU rRNA), presentan

una mayor sensibilidad debido a que el genoma de Cryptosporidium spp. posee cinco copias del gen, mientras que otros genes como el COWP solo posee una copia en su genoma.

La sensibi l idad de la detección para Cryptosporidium spp. por PCR, se confirma al encontrar 11 muestras positivas, de las 71 heces tenidas en cuenta para confrontar los resultados con la tinción de Ziehl-Neelsen (5 muestras positivas). Estos resultados se pueden explicar por el límite de detección de ambas pruebas. Se ha demostrado por estudios que se necesitan alrededor de 1 x 106 ooquistes de Cryptosporidium por gramo de heces sin concentrar, para tener un porcentaje de eficiencia en la detección del 100% utilizando el método de Ziehl-Neelsen, mientras que el límite de detección del mismo método, pero utilizando heces concentradas ya sea por formol-éter, percoll-sacarosa, sulfato de zinc, etc., es del orden de 1 x 104 y 5 x 104 ooquistes

por gramo de heces (24). De otro lado (8, 25, 26) han demostrado que son necesarios de 1 a 200 ooquistes por gramo de heces concentradas para que puedan ser detectados por PCR, lo cual representa un aumento en la sensibilidad de varios órdenes de magnitud respecto a los métodos convencionales de coprodiagnóstico, como lo es la tinción de Ziehl-Neelsen.3

A pesar de que los niveles de sensibilidad y especificidad de las técnicas microscópicas para la detección de Cryptosporidium spp. son bajas, estas técnicas siguen siendo utilizadas en países como Colombia por los especialistas de la salud (27, 28, 29), por lo tanto la implementación de variantes metodológicas que presenten niveles mayores de sensibilidad y especificidad como la PCR son bienvenidas.

El análisis molecular de 16 muestras de heces humanas y bovinas positivas para Crypstosporidium spp., pone de manifiesto dos especies del género Crypstosporidium, circulando en Manizales (Caldas), y confirma la presencia mayoritaria de Cryptosporidium parvum (15 muestras positivas), frente a un solo hallazgo

27


de Cryptosporidium hominis, en una muestra humana. Estos resultados son concordantes con los reportes previamente publicados (30, 31, 32), los cuales encontraron a Cryptosporidium parvum como el principal agente causal de criptosporidiosis en humanos y animales; sin embargo, hay que tener en cuenta que C. hominis junto con C. parvum se han considerado como los principales causantes de criptosporidiosis en el mundo, aunque otras especies como: C. canis, C. felis, C. baileyi y C. meleagridis también se han descrito como los causantes de diarrea en humanos; la diferenciación de las especies debe hacerse por métodos moleculares, como los anteriormente descritos, ya que las características morfológicas de los mismos no permiten distinguirlos (33).

A pesar de que no se detectó la presencia de Cryptosporidium en las muestras de agua, no se puede descartar del todo la ausencia del parásito en ninguno de los dos sitios de muestreo, debido a que el porcentaje de recuperación del método de floculación con carbonato de calcio es de aproximadamente el 70% y este se puede ver notablemente afectado por factores fisicoquímicos del agua como el pH, la temperatura, la turbidez y la cantidad de sólidos suspendidos que puedan llegar a estar presentes en el agua al momento de tomar la muestra, así

como también, la presencia de algas (33, 34); además, es necesario explorar otros métodos de separación de los ooquistes como es el uso de filtros de alto volumen (filtración en cartucho, filtración por membrana), los cuales pueden ser más eficaces en la obtención de los mismos en aguas previamente tratadas o no tratadas (33).

El bajo número de muestras de agua analizadas en este estudio, es determinante en los resultados obtenidos, ya que para la detección de los ooquistes en el agua se requiere el procesamiento de grandes volúmenes de agua (40 a 100 litros) así como de un gran número de muestras, para lograr una adecuada concentración de los microorganismos (25).

AGRADECIMIENTOS

A ASSBASALUD y a los propietarios de haciendas ganaderas del sector de Gallinazo (Manizales, Caldas), por su colaboración en la obtención de las muestras.

Conflictos de interés: los autores del presente artículo hacen constar que no tienen ningún tipo de vinculación laboral con los laboratorios que producen equipos y reactivos para la detección de Cryptosporidium spp.



ISSN 1657-9550

REFERENCIAS

1. Avery B, Lemley A, Hornsby A. Cryptosporidium: Un patógeno Transmitido por el Agua. Rev. University of Florida 2003; 54:11-17.

2. Tzipori S, Ward H. Cryptosporidiosis: biology, pathogenesis and disease. Microbes Infect 2002; 4:1047-1058.

3. Fahey T. Cryptosporidiosis. prim Care Update Ob Gyns 2003; 10:75-80. 4. Bogitsh BJ, Cheng TC. Human parasitology. 2 ed. San Diego: Academic press; 1998. p. 33.

5. Fayer R. Cryptosporidium: a water-borne zoonotic parasite. Vet parasitol 2004; 126:37-56.

6. Chen XM, Keithly JS, paya CV, LaRusso NF. Cryptosporidiosis. N Engl J Med 2002; 346:1723-1731. 7. Rodríguez JC, Royo G. Cryptosporidium y criptosporidiosis. Bol Control Calidad SEIMC 2001; 13:31-

35.

8. Manual de las pruebas de diagnóstico y de las vacunas para los animales terrestres [Internet]. Disponible en: http://www.oie.int/esp/normes/mmanual/pdf_es/2.10.09_cryptoporidiosis.pdf Consultado Marzo de 2009.

9. Resolución Número 2115 de 2007. Diario Oficial No. 46.679. Ministerio de protección Social, Ministerio de Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial.

10. Ritchie LS. An ether sedimentation technique for routine stool examinations. Bull. U.S. Army med.

1948; 8:326.

11. Heariksen SA, pohlenz JFL. Staining of Cryptosporidia by a modified Ziehl-Neelsen technique. Acta Vet. Scand. 1981; 22:594.

12. Casemore Dp, Armstrong M, Jackson B. Screening for Cryptosporidium in stools. Lanced 1984; 1:734-

735. 13. Gonçalves EMN, Araújo RS, Orban M, Matté GR, Matté MH, Corbett CEp. protocol for DNA extraction

of Cryptosporidium spp. oocysts in fecal samples. Inst. Med. trop. S. paulo. 2008; 50:165-167. 14. Xiao L, Alderisio K, Limor J, Royer M, Lal AA. Identification of species and sources of Cryptosporidium

oocysts in storm waters with a small-subunit rRNA-based diagnostic and genotyping tool. Appl Environ Microbiol 2000; 66:5492-5498.

15. Morgan UM, Monis p, Xiao L, Limor J, Sulaiman I, Raidal S, et al. Molecular and phylogenetic characterization of Cryptosporidium from birds. International journal for parasitology 2001; 31:289-296.

16. Spano F, putignani L, Mclauchlin J, Casemore Dp, Crisanti A. pCR-RFLp analysis of the Cryptosporidium oocyst wall protein (COWp) gene discriminates between C. wrairi and C. parvum, and between C. parvum isolates of human and animal origin. FEMS Microbiol Lett. 1997; 150:209-217.

17. Sanguinetti CJ, Dias N, Simpson A. Rapid silver staining and recovery of pCR products separate on polycrylamide gels. Biotechniques 1994; 17:914-921.

18. ApHA-AWWA-WpCF. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 16 ed. Washington, USA; 1985.

29


19. Vesey G, Slade JS, Byrne M, Shepherd K, Fricker CR. A new method for the concentration of Cryptosporidium oocysts from water. J. Appl. Bacteriol. 1993; 75:82-86.

20. Alonso M, Corcuera M, Roldán M, picazo A, Gómez F. Modificación de la técnica de Ziehl-Neelsen para la detección de micobacterias con la utilización de microondas. Técnicas en patología 1996; 29:33-35.

21. Arrowoodt MJ, Sterling MM. Comparison of conventional staining methods and Monoclonal Antibody-Based methods for Cryptosporidium Oocyst Detection. J. Clin. Microbiol.1989; 27:1490-1495.

22. Le Blancq SM, Khramtsov NV, Zamani F, Upton SJ, WU TW. Ribosomal RNA gene organization in Cryptosporidium parvum. Mol Biochem parasitol 1997; 90:463-478.

23. piper M, Bankier AT, Dear pH. A happy map of Cryptosporidium parvum. Genome Res. 1998; 8:1299-307.

24. Weber R, Bryan RT, Bishop HS, Walquist Sp, Sullovan J, Juranek D. Threshold of detection of Cryptosporidium oocysts in human stool specimens: evidence for low sensitivity of current methods. J. clin. Microbiol. 1991; 29:1323-1327.

25. Johnson DW, pieniazek NJ, Griffin DW, Misener L, Rose JB. Development of a pCR protocol for sensitive detection of Cryptosporidium in water samples. Appl. Environ. Microbiol. 1995; 61:3849-3855.

26. Webster KA, Smith HV, Giles M, Dawson L, Robertson LJ. Detection of Cryptosporidium parvum oocysts

in faeces: comparison of conventional coproscopical methods and the polymerase chain reaction. Veterinary parasitology 1996; 61:5-13.

27. Arango M, Rodríguez D, prada N. Frecuencia de Cryptosporidium spp. en materia fecal de niños entre un mes y trece años en un hospital local colombiano. Colomb. Med. 2006; 37(2):121-125.

28. Rivera O, Vásquez LR. Cryptosporidium spp.: informe de un caso clínico en popayán, Cauca. Rev Col Gastroenterol 2006; 21(3):125-129.

29. Rodríguez E, Manrique-Abril F, pulido M, Ospina-Díaz J. Frecuencia de Cryptosporidium spp. en caninos de la ciudad de Tunja, Colombia. Rev. MVZ Córdoba 2009; 14(2):1697-1704.

30. Fayer R, Morgan U, Upton SJ. Epidemiology of Cryptosporidium: Transmission, detection and identification. Int J parasitol 2000; 30:1305-1322.

31. Keshavarz A, Athari A, Haghighi A, Kazami B, Abadi A. Genetic characterization of Cryptosporidium spp. Among children with diarrhea in Tehran and Qazvin provinces, Iran. Iranian J parasitol 2008; 3:30-36.

32. Trotz-Williams LA, Martin DS, Gatei W, Cama V, peregrine AS, Martin SW, et al. Genotype and subtype analyses of Cryptosporidium isolates from dairy calves and humans in Ontario. parasitology research 2006; 99:346-352.

33. Carey CM, Lee H, Trevors JT. Biology, persistence and detection of Cryptosporidium parvum and Cryptosporidium hominis oocyst. Water research 2004; 38:818-862.

34. Fayer R, Xiao L. Cryptosporidium y cryptosporidosis. 2 ed. Taylor & Francis group editorial; 2008.

RESUMEN

Introducción. En la presente investigación se describe el desempeño neuropsicológico de una muestra de niños y niñas escolarizados, entre 6 y 14 años con diagnóstico de Trastorno por Déficit de Atención/Hiperactividad (TDAH), y se comparan los resultados obtenidos con el desempeño neuropsicológico de un grupo Control.

Objetivo. Comparar las características del desempeño neuropsicológico de una muestra de niños y niñas con TDAH-C y TDAH-I y de un grupo Control de la ciudad de Manizales.

Materiales y métodos. El artículo se originó de una investigación de tipo no experimental de corte transversal. Se realizó un análisis de varianza de tres grupos: TDAH Combinado (TDAH-C), TDAH Inatento (TDAH-I) y grupo Control. Las variables neuropsicológicas fueron

las variables respuesta, y cada uno de los niños afectados se pareo con un control.

Resultados. Se establecieron diferencias en el desempeño en una tarea de ejecución continuaw (cancelación de dibujos) entre ambos subtipos de TDAH (P<0,001), teniendo el grupo de TDAH-C, una media menor que el subtipo TDAH-I (P<0,001); así mismo, se encontraron diferencias estadísticamente significativas a nivel del lenguaje, en relación con las habilidades metalingüísticas, específicamente, en la tarea de conteo de sonidos (P<0,001), entre la estimación de la media en el grupo TDAH-I y el grupo Control (P<0,001).

Conclusiones. Los hallazgos de la presente investigación confirman la presencia de algunas diferencias en el desempeño neuropsicológico entre niños y niñas con TDAH y grupos Control. Así mismo, se evidencia la necesidad de seguir avanzando en el empleo de la Batería de

CARACTERIZACIÓN NEUROPSICOLÓGICA DE UNA MUESTRA DE NIÑOS Y NIÑAS CON TDAH DE LA CIUDAD DE MANIZALES*

Diana Marcela Montoya Londoño1

Vilma Varela Cifuentes2

Carmen Dussán Lubert3

* Artículo derivado del macroproyecto de investigación: “Caracterización neuropsicopedagógica de niños y niñas con TDAH que asisten a programas de atención de la ciudad de Manizales”, adscrito al Grupo de Investigación en Desarrollo Infantil del programa de psicología –Facultad de Ciencias Sociales y Humanas de la Universidad de Manizales–, según convenio de cooperación interinstitucional con el Grupo de Investigación de Neuroaprendizaje de la Universidad Autónoma de Manizales, desde el proyecto: “Caracterización de los potenciales relacionados a eventos cognitivos en la diferenciación de los subtipos clínicos del trastorno por déficit de atención”, y según contrato de prestación de servicios con el Grupo de Investigación Control y procesamiento de Señales Digitales de la Universidad Nacional sede Manizales, a partir del proyecto apoyado por Colciencias: “Identificación automática del trastorno por déficit de atención hiperactividad sobre registros de potenciales evocados cognitivos”.1 psicóloga. Mgra. en Educación con Énfasis en Relaciones pedagógicas, Magíster en Neuropsicología. Docente programa de psicología y Especialización en Neuropsicopedagogía, Universidad de Manizales. E- mail: [email protected], Docente Departamento de Estudios Educativos, Universidad de Caldas. E-mail: [email protected] Fonoaudióloga. Especialista en Neuropsicopedagogía. Mgra. en Neuropsicología. Coordinadora de la Especialización en Neuropsicopedagogía, Universidad de Manizales. E-mail: [email protected] Ingeniera Química. Mgra. en Enseñanza de las Matemáticas. Docente Departamento de Matemáticas, Universidad de Caldas. E-mail: [email protected]

ISSN 1657-9550Recibido: junio 7 de 2011 - Aceptado: julio 4 de 2011


31

Caracterización neuropsicológica de una muestra de niños y niñas con TDAH de la ciudad de Manizales

Evaluación Neuropsicológica (ENI) en ejercicios investigativos con poblaciones clínicas, para revisar la validez y el comportamiento de la prueba en la evaluación de niños y niñas con TDAH y en la de otros grupos clínicos de interés.

Palabras clave: desempeño neuropsicológico, atención, memoria, lenguaje, funciones ejecutivas, capacidad intelectual, Trastorno por Déficit de Atención/Hiperactividad (TDAH).

NEUROPSYCHOLOGICAL CHARACTERIZATION OF A

SAMPLE OF CHILDREN WITH ADHD FROM THE CITY OF

MANIZALES

ABSTRACT

Introduction. The present investigation describes the neuropsychological performance of a sample of school children between 6 and 14 years old diagnosed with Attention Deficit Disorder/Hyperactivity Disorder (ADHD) and compares the results with the neuropsychological performance of a Control group.

Objective. To compare the neuropsychological performance characteristics of a sample of children diagnosed with ADHD-C and ADHD-I and a Control group in the city of Manizales.

Materials and Methods. This article originated from a cross section non-experimental research. A

variance analysis was made using the following treatments: ADHD combined (ADHD-C) and Control group, ADHD inattentive (ADHD-I) and Control group, the neuropsychological variables were the response variables, and each of the affected children was paired with a control child.

Results. Differences in a continuous performance task (cancellation of drawings) were established between the two subtypes of ADHD (P<0.001), having the ADHD-C, group lesser measure than the ADHD-I (P<0.001) subtype. Similarly, statistically significant differences at the language level in relation to metalinguistic skills was found, specifically in the task of counting sounds (P<0.001) between the mean estimate in group ADHD-I and the Control group (P<0.001).

Conclusions. The findings of this study confirm the presence of some differences in neuropsychological performance among children with ADHD and Control groups. Also, it highlights the need for further progress in the use of the Neuropsychological Assessment Battery (IPD) in research exercises with clinical populations to verify the validity and performance of the test in the evaluation of children with ADHD and in that of other clinical groups of interest.

Key words: neuropsychological performance, attention, memory, language, executive functions, intellectual capacity, attention deficit /hyperactivity Disorder (ADHD).


Diana Marcela Montoya Londoño, Vilma Varela Cifuentes, Carmen Dussán Lubert

ISSN 1657-9550

INTRODUCCIÓN

El Trastorno por Déficit de Atención/Hiperactividad (TDAH), es probablemente la alteración neurocomportamental de inicio durante la infancia más estudiada en Colombia y en el mundo, en cuanto se asume que esta entidad es actualmente el trastorno mental crónico más frecuente en la población escolar (1, 2) en la medida en que representa el primer motivo de consulta en los servicios de salud mental y neurología pediátrica (3). En algunas investigaciones se estima que su prevalencia oscila entre el 3-5% (4), mientras que otros estudios informan una prevalencia mucho mayor, que varía aproximadamente entre el 10-20% de la población escolar normal colombiana (5, 6).

Desde la misma naturaleza multidimensional que caracter iza e l TDAH, di ferentes estudios han determinado que el perfil de funcionamiento cognitivo que se presenta varía desde las diferentes perspectivas de abordaje, dependiendo del modelo teórico desde el cual se explica el trastorno, el núcleo del síndrome, el subtipo, el rango de edad, el nivel de escolarización, e incluso, dependiendo del contexto social y/o cultural donde se ubique el estudio de caracterización, sin embargo, parece haber elementos comunes que representan cierto nivel de acuerdo entre los diferentes investigadores que permite plantear en torno al perfil neuropsicológico de los niños y niñas con TDAH la presencia de alteraciones en los procesos de la atención, la memoria, las funciones ejecutivas y/o el funcionamiento

motor, en la mayoría de los casos, que se hacen evidentes en aquellas situaciones en las que la atención tiene que mantenerse por periodos prolongados de tiempo. Es así, como se ha considerado que el núcleo del síndrome en todos los niños con TDAH no es el mismo, en cuanto se asume que al menos en un subgrupo de ellos, la inatención es el elemento fundamental, mientras que en otro grupo lo es el funcionamiento motor desorganizado (7).

Entre los componentes cognitivos que parecen estar afectados en el desempeño neuropsicológico de los niños, niñas y jóvenes con TDAH, se encuentran: las fallas en la atención sostenida; atención difusa e inespecífica especialmente cuando la atención tiene que mantenerse por periodos prolongados de tiempo; dificultades a nivel de los componentes frontales de la atención (atención tónica o sostenida, atención selectiva, y atención dividida); el pobre control de impulsos; la carencia de un organizador flexible de la información; las dificultades en la organización y en la planeación, así como en la memoria, especialmente a nivel del componente de recobro de la información, más que en el almacenamiento de la misma (7); dificultades en la memoria de trabajo y, en general, en tareas de memoria que exijan concentración; lentificación en la resolución de tareas de razonamiento matemático y en la producción de operaciones aritméticas automáticas (7).

La Tabla 1 muestra algunos estudios nacionales e internacionales que reportan diferentes características neuropsicológicas del TDAH.

33


Tabla 1. Relación de investigaciones sobre el perfil neuropsicológico de los niños y niñas con TDAH y algunos de sus hallazgos.

Nombre del estudio y lugar donde se realizó

Equipo investigador Características neuropsicológicas

“Análisis neuropsicológicode las características cognoscitivasde un grupo de adolescentes con trastorno por déficit de atención”. Distrito Federal (México).

Galindo et al. (8)

- Nivel de rendimiento intelectual que se ubica dentro de los límites de la normalidad promedio.- Dificultades en el funcionamiento ejecutivo, como una alteración subyacente al déficit de atención.- Déficit particular en el procesamiento de la información visoespacial. - Defectos significativos en la síntesis visual y la percepción espacial.

“Disfunción ejecutiva en el trastorno por déficitde atención con hiperactividad en la infancia”. Madrid (España).

Romero et al. (1)

- Disfunción ejecutiva, específicamente, déficit para el control inhibitorio conductual. - Déficit similares en ambos grupos clínicos, TDAH-C, TDAH-I, tales como la amplitud atencional y memoria de Trabajo (MT). - En el grupo de TDAH-I se observó un déficit más generalizado en la amplitud atencional, tanto con el material visoespacial como auditivo.- Dificultades en el proceso del control de la inhibición, en el grupo de niños TDAH-C para una respuesta dominante en este subtipo. Los niños del subgrupo TDAH-C tienen dificultades en el “sistema atencional supervisor”. - Los niños con TDAH procesan la información más lentamente y su conducta no se adapta cuando reciben retroalimentación.- Amplia disminución en el tiempo de vigilancia y son más impulsivos que los controles. - En el grupo TDAH-C se establecieron mayores dificultades para la generación de reglas, solución de problemas y flexibilidad cognitiva. - Los niños del subtipo TDAH-C presentan impulsividad cognitiva. Los niños con TDAH tienen un rendimiento inferior en las pruebas de fluidez verbal. - Las dificultades lingüísticas son secundarias a los déficits en las funciones ejecutivas, que podrían influir en el desarrollo de la lectoescritura, y afectar también la conciencia fonológica y al procesamiento del contenido del lenguaje, que puede observarse cuando se les pide a estos niños que operen con los significados. - El subtipo Combinado muestra una afectación más generalizada, y el Inatento, un menor rendimiento en las tareas de MT (memoria de trabajo) y planificación. Se evidencia mayor impulsividad cognitiva en el grupo TDAH -C.



ISSN 1657-9550



“Perfiles neuropsicológicos y conductuales de niños con trastorno por déficit de atención/hiperactividad de Cali, Colombia”. Cali (Valle, Colombia).

Bará et al. (9)

- Los niños con TDAH de tipo Inatento presentan CI totales más bajos y deficiencias en la rapidez perceptual, a pesar de tener un CI normal, puntúan entre 7 y 15 puntos por debajo del resto de la población en pruebas de capacidad intelectual. - Déficit en la memoria verbal de trabajo y demora en la internalización del lenguaje, especialmente en los aspectos relacionados con la inteligencia verbal.- Presencia de una alteración en los mecanismos de atención sostenida y comportamientos de impulsividad. - Déficit compartido en vigilancia o esfuerzo atencional. Entendido como un déficit en el desarrollo de la inhibición comportamental, en el cual se altera el control de las conductas motoras con un objetivo dirigido; ello ocasiona que el comportamiento de los sujetos con TDAH esté más controlado por el contexto inmediato y sus consecuencias que por la información representada internamente, en aspectos como la previsión, el tiempo, la planificación, las reglas y la automotivación.- Dificultad en la memoria visual, particularmente en mantener la representación de los eventos por tiempos prolongados. - Baja fluidez semántica. - Déficit en la velocidad de lectura (grupo Inatento), y en la velocidad de denominación (grupo Combinado).- Dificultades a nivel de la función ejecutiva y la inhibición comportamental.

Características clínicas, neuropsicológicas ysocio-demográficas de niños varones con déficit de atención/hiperactividad de tipo inatento enMedellín, Antioquia, Colombia 2004-2005”. Medellín – Sabaneta (Antioquia, Colombia).

Zuliani et al. (2)

- No se muestran alteraciones de la función ejecutiva de forma psicométrica, pero sí desde la evaluación clínica neuropsicológica. - No se muestra una alteración de la inhibición de la conducta y de las demás funciones ejecutivas que le son subsidiarias.- Las dificultades encontradas en niños con TDAH de tipo Inatento fueron en la velocidad de procesamiento y en la focalización selectiva de la atención. - Se manifiesta dificultad a nivel de la flexibilidad cognitiva, en la medida en que los niños TDAH con predominio Inatento manifiestan deterioro en el desempeño en pruebas que les permitan aprender de sus errores.

35




“Caracterización de la memoria visual, semántica, y auditiva en niños y niñas con déficit de atención tipo combinado, predominantemente inatento y un control”. Medellín (Antioquia, Colombia).

Ramírez et al. (10)

- Nivel promedio de funcionamiento intelectual, tanto en el caso del TDAH-C, como en el caso del TDAH-I. - Heterogeneidad en el rendimiento a nivel de la memoria visual, operativa, prospectiva. - Dificultad en el procesamiento de información visual y déficit en la percepción espacial, lo que interviene en el funcionamiento de la memoria visoespacial inmediata. - Dificultad en el control atencional requerido para la selección de procesos de evocación. - Dificultad en la utilización de estrategias de memoria, o procesos de control tales como: el repaso, la organización o la recodificación, situación congruente con las dificultades reportadas a nivel de las funciones ejecutivas. - Dificultad en el procesamiento de componentes semánticos básicos del lenguaje y pobre desempeño en las tareas que requieren de retención de unidades específicas dentro de la memoria. - Empleo de pocas estrategias para el recuerdo de tareas con el paso del tiempo. - Déficit en la atención sostenida, memoria visual y control inhibitorio.- Poca capacidad de inhibición y demora en la respuesta.- Poca capacidad para seguir una secuencia desconocida de actos dirigidos a un fin determinado, que interfiere en el empleo de estrategias para la recuperación de información. - Las dificultades de memoria visual se relacionan con un déficit, en el uso de estrategias de planeación para la evocación de la información almacenada. - Ausencia de estrategias de organización, lo que propicia que el almacenamiento de la información sea de forma temporal en la memoria inmediata, con mayores dificultades para su almacenamiento en la memoria a largo plazo.

“Características conductuales y neuropsicológicasde niños de ambos sexos, de 6 a 11 años, con trastorno por déficit de atención/hiperactividad”. Barranquilla (Atlántico, Colombia).

Puentes et al. (11)

- No se evidencian diferencias en la medida de CI Total entre los niños con TDAH y entre un grupo Control. - Alteraciones específicas en pruebas que evalúan la atención sostenida, funciones ejecutivas y fluidez semántica. - Alteraciones en la atención sostenida y el control inhibitorio, que se traducen en la pobre autorregulación y dificultades de conducta. - En el lenguaje, se establece una “disfunción ejecutiva lingüística”.



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Es oportuno señalar que a pesar de que algunos estudios han encontrado que los subtipos del TDAH presentan matices diagnósticos diferenciales, así como distintas manifestaciones conductuales, cognitivas y de aprendizaje, entre otras (12, 13, 14), los resultados no son concluyentes, e incluso, en algunas ocasiones se tornan contradictorios, situación posiblemente derivada del uso de diferencias metodológicas y, sobre todo, de la heterogeneidad de las muestras utilizadas, o de los instrumentos de evaluación empleados (15). Parece existir cierto acuerdo respecto a las dificultades encontradas en el lenguaje, desde la descripción del perfil de funcionamiento cognitivo de los niños, niñas jóvenes con TDAH, a partir de lo cual se evidencian dificultades en la pragmática del lenguaje, el componente semántico y la comprensión, en cuanto se considera que el principal problema del niño con TDAH no está en la presencia de un retraso en el desarrollo del lenguaje o en los subsistemas básicos del lenguaje como son el fonológico o morfosintáctico, sino en el aspecto pragmático del lenguaje y en consecuencia en el aspecto semántico, en tareas que implican mayor complejidad de procesamiento cuando el niño no consigue desarrollar ideas alrededor de un tema o pierde con facilidad el hilo conector de la información (16). Así mismo, puede plantearse que a nivel de los procesos de memoria y atención, se evidencian dificultades a nivel de la memoria de trabajo, almacenamiento verbal y visoespacial, en la medida en que se asume que los niños y niñas con TDAH, presentan dificultades en el procesamiento de información visual, y déficit en la percepción espacial, lo que interviene en el funcionamiento de la memoria visoespacial inmediata. Del mismo modo, lo niños con diagnóstico de TDAH, presentan dificultades en el control atencional requerido para la selección de procesos de evocación, la utilización de estrategias de memoria, o procesos de control tales como el repaso, la organización o la recodificación, situación congruente con las dificultades reportadas a nivel de las funciones ejecutivas (10).

En torno al perfil neuropsicológico se reportan también dificultades en el funcionamiento ejecutivo, en cuanto se considera que estos niños y niñas cursan con defectos particulares de la atención selectiva, defectos en la flexibilidad cognoscitiva, y en la memoria de trabajo; en este sentido, se considera que los diferentes subtipos presentan perfiles cognoscitivos distintos, y que los déficits en el funcionamiento ejecutivo, en particular en relación con la capacidad de planeación, son los que más claramente caracterizan al TDAH de subtipo Combinado (8).

En la exploración neuropsicológica de la capacidad intelectual y de los procesos cognitivos, desde diversos campos del saber relacionados con profesiones afines a las áreas de salud y educación, en el marco de las cuales se lideran procesos de evaluación e intervención del TDAH en la ciudad de Manizales, se ha trabajado con la información reportada desde diferentes ejercicios de caracterización neuropsicológica realizados en el país, entre los que se destacan el conocimiento que se tiene de las características del funcionamiento intelectual y cognitivo de los niños y niñas con TDAH en la ciudades de Medellín, Bogotá y Barranquilla (9, 11). Dicha situación, ha llevado a que tanto desde el punto de vista de la consulta clínica, de las acciones de intervención en el ámbito educativo, así como desde las diversas alternativas terapéuticas que se brindan a los niños y niñas que se encuentran afectados por el TDAH en la ciudad, estén casi exclusivamente sustentadas en los desarrollos de otros grupos de investigación internacionales y nacionales (9, 11, 17, 18, 19, 20), que aunque son estudios que aportan datos muy valiosos en torno al conocimiento del fenotipo neuropsicológico de los niños y niñas con TDAH en Colombia, por la misma población objetivo y participantes del estudio, no logran dar cuenta de las características específicas de los niños con TDAH de la ciudad de Manizales.

Desde el punto de vista regional, puede plantearse que es importante para el trabajo de los equipos interdisciplinarios de la ciudad,

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poder contar con información derivada de estudios investigativos realizados con niños, niñas y jóvenes de Manizales, en los que puedan tenerse referentes específicos en términos culturales y contextuales de las características neuropsicológicas de los niños y niñas con TDAH de la ciudad, que permitan direccionar de forma más pertinente los procesos de evaluación e intervención según el fenotipo neuropsicológico del trastorno en esta región. Esto puede plantearse, en cuanto se sabe que el TDAH es un trastorno neurocomportamental muy heterogéneo, cuyo diagnóstico, tanto a nivel epidemiológico como clínico, demanda familiarizarse con los cambios que pueda presentar la sintomatología a través de las diferentes edades y en ambos sexos, y que requiere parámetros e instrumentos de diagnóstico estandarizados validados y fiables en cada contexto (21).

En el presente artículo se plantea como objetivo comparar el desempeño neuropsicológico de una muestra de niños y niñas con TDAH de tipo Combinado e Inatento y de un grupo Control de la ciudad de Manizales.


Tipo de investigación: el presente artículo se originó de una investigación no experimental, de corte transversal (22, 23).

Población de referencia: niños, niñas y jóvenes afectados por el TDAH en el rango de edad de 6 a 14 años escolarizados en la ciudad de Manizales.

Selección de la muestra: la selección de la muestra se realizó de manera intencional, de acuerdo con los lineamientos metodológicos de un muestreo por conveniencia. Estuvo constituida por 30 casos de niños y niñas con TDAH tomados de una base de datos general del programa de Especialización en Neuropsicopedagogía adscrito a la Facultad de Ciencias Sociales y Humanas de la Universidad

de Manizales, que cuenta con información de una evaluación médica, psiquiátrica, neuropsicológica, académica y neurofisiológica de 150 niños, niñas y jóvenes con TDAH evaluados en el rango de edad de 5 a 15 años, que en el año 2010 se encontraban escolarizados en alguno de los 18 colegios públicos y privados de la ciudad que fueron incluidos en el estudio, según el compromiso e interés de participación de las instituciones educativas convocadas en la ciudad.

Es preciso aclarar que aunque se contaba con una base de datos amplia para los casos (150 casos), que fue evaluada durante el primer y segundo semestre del 2010 siguiendo los criterios de inclusión y exclusión, y según el protocolo de evaluación de la capacidad intelectual y desempeño neuropsicológico planteado para la presente investigación, en aproximadamente 18 instituciones educativas y 2 programas de atención integral al TDAH, únicamente se seleccionaron 30 de ellos (con edades comprendidas entre los 4 a 14 años), debido a que ese fue el número de controles correspondientes con el que se pudo contar al momento de realizar el presente análisis.

Los criterios de inclusión y exclusión tenidos en cuenta en el proceso de selección de casos y de controles, fueron los siguientes: poseer un coeficiente intelectual total (CIT) estimado como mínimo de 85 puntos (según la escala de inteligencia de Wechsler para niños revisada, WISC-R, en su versión hispana) (24) según la forma abreviada C6 (25) y el tener una puntuación T de 65 o más para los casos, e igual o menor de 50 para los controles en las dimensiones de inatención e hiperactividad/impulsividad en un cuestionario para TDAH contestado por los padres y maestros (según el Conners y el Checklist); en un momento posterior, a las familias de los niños y niñas que cumplieron con los criterios de inclusión tanto de casos como controles, se les pidió que firmaran el consentimiento informado para aceptar la participación de su hija o hijo



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en el proyecto, una vez pasado este proceso inicial de tamizaje, en 2 citas concertadas con los padres, a los niños y niñas participantes se les aplicó de manera individual por personal especializado adscrito al proyecto y a las universidades cooperantes (Universidad de Manizales, Universidad Autónoma de Manizales y Universidad Nacional sede Manizales) una valoración médica-neurológica y una evaluación psiquiátrica, para descartar enfermedades neurológicas mayores y posibles comorbilidades que pudieran sesgar los resultados del estudio (trastorno depresivo mayor, trastorno negativista desafiante, trastorno disocial de la conducta, trastornos del aprendizaje, trastorno bipolar, trastorno de la Tourette, abuso de sustancias y otros trastornos psiquiátricos).

Además, para la conformación del grupo Control, se exigió como criterio de inclusión, que dichos estudiantes se ajustaran a un adecuado desempeño académico y que no tuvieran antecedentes de repitencia o dificultad escolar.

Instrumentos utilizados

Tamizaje para determinar el cumplimiento de criterios de inclusión y exclusión

- Cuestionario breve (Checklist) para el diagnóstico de TDAH del DSM-IV. Esta es una escala de indicadores que toma los criterios diagnósticos del DSM-IV (21, 26, 27, 28).

- Cuestionarios de los criterios del DSM-IV para trastorno negativista desafiante (TND) y trastorno disocial de la conducta (TC) (26).

- Cuestionario de Conners para padres (CPRS) y maestros (CTRS), versión colombiana (29). - WISC III abreviado, forma C6 x2: subescalas de vocabulario y diseño con cubos. Test de Inteligencia para niños de Wechsler – Tercera edición (WISC-III). Basado en el test de inteligencia para niños de Wechsler (WISC) (25, 30).

- Entrevista psiquiátrica semiestructurada MINI Kid (Mini International Neuropsychiatric Interview para Niños y Adolescentes) (31, 32).

Análisis y descripción del desempeño neuropsicológico

- Protocolo neuropsicológico: conformado por diferentes subpruebas de atención, memoria, y funciones ejecutivas de la Batería ENI. Tareas de atención visual y auditiva, memoria verbal y visual, flexibilidad cognoscitiva y fluidez verbal semántica y fonémica, seguimiento de instrucciones y habilidades metalingüísticas (33, 34).

Atención visual

- Cancelación de dibujos. Incluye una página con una serie de dibujos de 44 conejos grandes y pequeños. El niño debe tachar con un lápiz los conejos grandes, lo más rápido posible, dentro de un tiempo límite de un minuto. Se da un punto por cada conejo correctamente tachado y se sustrae un punto por cada conejo pequeño señalado. La puntuación máxima es 44.

- Cancelación de letras (paradigma AX). Incluye una página con 82 letras distribuidas en varios renglones. El niño debe tachar con un lápiz la letra X, únicamente cuando está precedida por la letra A. El tiempo límite es un minuto. Se da un punto por cada letra X correctamente tachada y se sustrae un punto por cada letra incorrectamente tachada. La puntuación máxima es 82.

Atención auditiva

- Dígitos en progresión. El niño debe repetir series de números, empezando por series de 2 números y terminando con una serie de 8 números. La puntuación representa el número de dígitos repetidos correctamente. La puntuación máxima es 8.

- Dígitos en regresión. El niño debe repetir en orden inverso series de números, comenzando

39


con series de 2 dígitos y terminando con series de 7. La puntuación representa el número de dígitos repetidos correctamente. La puntuación máxima es 7.

Memoria visual

- Copia de una figura compleja. Se le pide al niño que copie una figura geométrica que contiene 10 elementos para los niños menores de 10 años, y 13 elementos para los niños de 10 años o más. Cada elemento se califica por separado. Se da un punto por cada unidad correctamente copiada y 0,5 si la unidad se copia con errores pero se reconoce. Se califica, además, la correspondencia de tamaño (un punto) y de orientación (un punto). La puntuación máxima es 15.

- Evocación diferida. A los 30 minutos de haberse copiado la figura compleja, se inicia con la evaluación de esta área en el siguiente orden: Recuperación de la figura compleja. El niño dibuja, sin la presencia del modelo, la figura copiada anteriormente. Se califica igual que la copia. La puntuación máxima es 12 para niños entre los 5 y los 8 años, y 15 para los niños entre 9 y 16 años.

Codificación-memoria verbal auditiva

- Lista de palabras. Se presentan, en 4 ensayos consecutivos, 9 palabras (para los niños de 5-8 años) o 12 (para los niños de 9-16 años). Las palabras pertenecen a 3 categorías semánticas: animales, frutas y partes del cuerpo. La puntuación total es el número de palabras recordadas en los 4 ensayos. La puntuación máxima para los niños de 5 a 8 años es 36, y para los niños de 9-16 años es 48.

- Evocación de estímulos auditivos.

- Recuperación espontánea de la lista de palabras. Evocación libre de las palabras presentadas previamente. Se da un punto por cada palabra evocada. La puntuación máxima es 9 para niños entre los 5 y los 8 años, y 12 para los niños entre 9 y 16 años.

- Recuperación por claves. Se le indica al niño cada una de las categorías (frutas, animales y partes del cuerpo) en las que se incluyen las palabras presentadas, y el niño tiene que decir las palabras pertenecientes a cada una de ellas. Se da un punto por cada palabra evocada dentro de la categoría correspondiente. La puntuación máxima total es 9 para los niños entre los 5 y los 8 años, y 12 para los niños entre 9 y 16 años.

- Reconocimiento verbal-auditivo. En una lista de 18 palabras para los niños de 5-8 años, y de 24 para los niños de 9-16 años de edad, el niño debe reconocer las palabras presentadas. Se da un punto por cada palabra correcta. La puntuación máxima total es 18 para niños entre los 5 y los 8 años, y 24 para los niños entre 9 y 16 años.

Funciones ejecutivas

- Fluidez verbal semántica. Se aplica de manera individual. El niño debe decir el mayor número posible de animales en un minuto. Se da un punto por cada animal. La puntuación total es el número total de animales dichos en un minuto.

- Fluidez verbal fonémica. Número total de palabras producidas en un minuto que comiencen con la letra M.

- Flexibilidad cognitiva. Clasificación de tarjetas. El niño tiene que decidir cuál es el principio (color, forma o número) que subyace a la agrupación de tarjetas, con la retroalimentación (correcta o incorrecta), que da el examinador a sus respuestas. Esta prueba es similar a la prueba de clasificación de tarjetas de Wisconsin. Se califica el número de errores, el número de respuestas correctas y el número de categorías. El máximo número de categorías es 3 y el de ensayos es 54.

Lenguaje

- Comprensión - seguimiento de instrucciones. Ante una lámina que contiene aviones y automóviles de 2 tamaños diferentes (grandes



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y pequeños) y de 4 colores (azul, amarillo, rojo y verde), el niño debe seguir una serie de 10 instrucciones (p. ej. “Señala un coche rojo”), que se presentan oralmente en orden creciente de dificultad. Se da un punto por cada respuesta correcta. La puntuación máxima es 10.

- Habilidades metalingüísticas.

- Síntesis fonémica. Evalúa la capacidad del niño para formar palabras al escuchar los fonemas que la integran. Se le dicen los sonidos constitutivos de una palabra (p. ej., / k /, / a /, / s /, / a /) y el niño debe decir la palabra. Se presentan 8 palabras y se da un punto por cada palabra identificada correctamente. La puntuación máxima es 8.

- Deletreo. Se le pide al niño deletrear 8 palabras. Se otorga un punto por cada palabra deletreada correctamente. La puntuación máxima es 8.

- Recuento de sonidos. Se le pide al niño que cuente los sonidos que integran cada una de las 8 palabras. Se da un punto por cada palabra correctamente segmentada. La puntuación máxima es 8.

- Recuento de palabras. El niño debe decir el número de palabras que hay en una oración después de que se le lea. Se presentan 8 oraciones y se da un punto si el niño identifica correctamente el número de palabras por oración. La puntuación máxima es 8.

Plan de análisis estadístico: para analizar los grupos Caso y Control, en relación con las características demográficas y puntuaciones obtenidas en las diferentes tareas de evaluación neuropsicológica administrada, se utilizaron medidas de tendencia central y dispersión. Para la sistematización de la información, se empleó el programa estadístico SPSS versión 14.0.

Para el desarrollo de la investigación se tuvo previsto el siguiente plan de análisis: se demostró que los 2 grupos (casos y controles) iniciaron

en condiciones homogéneas en cuanto a las variables socioeconómicas edad, grado, CI Total, sexo, estrato y carácter de la institución. Para ello, se distinguieron las variables cuantitativas (edad, grado y CI Total) de las cualitativas (sexo, estrato y carácter de la institución). A las primeras se les realizó la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk, para decidir cómo comparar los casos y los controles, si mediante la prueba t de Student (en caso de normalidad de las variables) o mediante la prueba no paramétrica de Mann-Whitney (en caso de no normalidad).

Los casos y los controles en las variables de tipo cualitativo (sexo, estrato y carácter de la institución), fueron comparados mediante la prueba no paramétrica Chi-cuadrado. Para comparar si existía diferencia entre los grupos TDAH Combinado, TDAH Inatento y Control, se aplicó inicialmente pruebas de normalidad y de homocedasticidad a las variables bajo estudio, si estas cumplían con tales criterios se realizaba análisis de varianza; en caso contrario, se aplicó la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis, y para determinar qué grupos eran diferentes se empleó la prueba U de Mann-Whitney.

RESULTADOS

Descripción de las variables bajo estudio: la variable edad no se distribuyó de forma normal ni para casos (P=0,014), ni para controles (P=0,013), las variables grado y CI Total no lo hicieron para los casos (P=0,029 y 0,010, respectivamente); por ello, y como se indicó en la metodología, se realizó la prueba no paramétrica de Mann-Whitney para comparar en cada variable si ambos grupos (casos y controles) iniciaron en circunstancias estadísticamente iguales en promedio.

Realizada dicha prueba se encontró que efectivamente tales condiciones fueron homogéneas para todas las variables (valores P

41


de 0,976, 0,597 y 0,150, para la edad, el grado y el CI Total, respectivamente).

Los casos y los controles en las variables de tipo cualitativo (sexo, estrato y carácter de la institución), fueron comparados mediante la prueba no paramétrica Chi-cuadrado, donde nuevamente se observó que ambos grupos iniciaron en condiciones homogéneas para tales variables (valores P de 1,000, 0,660 y 1,000, respectivamente).

Descripción socio-demográfica: los grupos de casos y controles presentaron las siguientes características: edades comprendidas entre 6 y 14 años de edad; 21 niños y 9 niñas; estudiantes del ciclo básico de formación en los niveles de básica primaria y básica secundaria; adscritos a uno de los 18 colegios oficiales y privados de la ciudad de Manizales que participaron del estudio; pertenecientes a estrato alto (5 y 6), medio (3 y 4) o bajo (1 y 2), de acuerdo con la distribución socioeconómica de la ciudad de Manizales, que atiende a los lineamientos nacionales que permiten clasificar la población

de los municipios y distritos del país en 6 estratos o grupos socioeconómicos diferentes, de acuerdo con el lugar de vivienda y el ingreso expresado en salarios mínimos vigentes.

Los participantes se dividieron en 3 grupos, así:

- TDA/+H (tipo Combinado: 1), 13 niños, 5 niñas.- TDA/-H (tipo Inatento: 2), 8 niños, 4 niñas.- Grupo de controles (no afectados: 3), 21 niños, 9 niñas.

La Tabla 2 muestra algunos estadísticos medidos en cada uno de los grupos (casos y controles), de las variables cuantitativas edad, grado y CI Total. Se confirma en ella lo ya presentado acerca que no existe diferencia en el promedio de tales variables entre los 2 grupos de comparación; sin embargo, se observa que al menos el 25% superior (cuartil 3) de los niños Control en la variable CI Total obtuvieron una calificación de 118 o mayor, mientras que en el grupo de casos, tal valor fue de 106 o mayor.

Tabla 2. Estadísticos para las variables sociodemográficas.

Edad Grado CI Total EscalarEstadístico Casos Controles Casos Controles Casos Controles

Media 9,9 9,9 4,4 4,7 100,9 106,2Mediana 10,0 10,0 5,0 5,0 98,5 104,5

Desviación estándar 2,8 2,7 2,6 2,7 12,5 15,1Mínimo 6,0 6,0 0,0 0,0 85,0 85,0Máximo 14,0 14,0 9,0 9,0 141,0 141,0Cuartil 1 7,0 7,0 2,0 2,0 94,0 94,0Cuartil 3 12,0 12,0 6,0 7,0 106,0 118,0

Coeficiente de variación 27,7% 27,6% 59,7% 56,8% 12,4% 14,2%

Descripción del desempeño neuropsicológico de casos y controles. Comparación entre los grupos de casos y los subtipos TDAH Combinado y TDAH Inatento. A partir de los resultados encontrados en la Tabla 3, puede plantearse que

en la comparación realizada de la evaluación neuropsicológica del grupo de controles, contra los subtipos de TDAH Combinado, y TDAH Inatento, se encontraron pocas diferencias estadísticamente significativas.



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Tabla 3. Descripción y comparación de las variables neuropsicológicas de los 3 grupos.

Variable

SubtipotDAH

combinado: 1 inatento: 2 control: 3

Prueba de

Kruskal-Wallis

Prueba U de Mann-Whitney

Media Desv. est. Media Desv.

est. Media Desv. est. Valor P

Valor PSubtipo

1 vs. Subtipo 2

Valor PSubtipo 1 vs. Subtipo

3

Valor PSubtipo

2 vs. Subtipo

3

CI Total 101,1 13,3 100,7 11,7 106,2 15,1 0,4 1,0 0,2 0,3

Memoria

MVDFCPECopia de la figura

compleja7,4 3,1 8,9 1,7 8,2 3,5 0,4 0,2 0,4 0,5

CMVALISTADEP Codificación – Lista

de palabras 26,0 8,4 26,0 5,0 27,9 7,6 0,5 1,0 0,4 0,3

CMVA MT Codificación – MT

primer ensayo5,0 2,0 5,3 1,5 5,1 1,4 0,8 0,5 0,6 0,8

CMVARECOBRE Codificación –

Recobro espontáneo7,3 2,8 8,0 1,8 8,3 2,4 0,6 0,5 0,4 0,7

CMVARECOBRC Codificación –

Recobro diferido por claves

7,3 2,5 8,1 1,2 8,4 2,8 0,2 0,2 0,1 0,5

CMRVA Reconocimiento verbal auditivo

19,0 4,3 20,9 2,6 20,1 5,2 0,3 0,4 0,1 0,6

Atención

AVCDIBUJOS Atención visual

– Cancelación de dibujos

16,7 7,8 25,6 9,0 23,1 11,3 <0,001 <0,001 0,1 0,4

AVCLETRAS Atención visual

– Cancelación de letras

22,1 12,4 28,8 9,4 25,1 12,1 0,2 0,1 0,4 0,2

AADP Atención auditiva

– Dígitos en progresión

5,0 1,1 5,4 0,8 5,1 1,3 0,4 0,4 0,9 0,2

AADRAtención auditiva – Dígitos en regresión

3,1 1,0 3,3 0,9 3,6 1,2 0,3 0,5 0,2 0,5

43


Variable

SubtipotDAH


Prueba de

Kruskal-Wallis




Valor PSubtipo

1 vs. Subtipo 2


3

Valor PSubtipo

2 vs. Subtipo

3

Función ejecutiva

FEFLEXCNE Función ejecutiva –

Flexibilidad mental – Número de ensayos

49,6 7,2 49,5 7,1 52,3 3,7 0,3 0,8 0,3 0,3

FEFLEXCRCRespuestas correctas 33,6 6,3 33,4 6,5 34,6 5,7 0,7 0,9 0,5 0,7

FEFLEXCPRCPorcentaje de

respuestas correctas69,3 15,7 69,2 17,3 66,7 13,2 0,7 0,9 0,4 0,6

FEFLEXCTDEERRORES

Total de errores15,9 9,0 16,1 9,8 17,7 7,5 0,6 0,9 0,4 0,6

FEFLEXCPDEERRORES

Porcentaje de errores30,4 15,7 31,0 17,2 33,1 13,2 0,7 1,0 0,4 0,7

FEFLEXCNCNúmero de categorías

2,0 1,0 1,8 1,0 1,9 0,8 0,8 0,7 0,5 0,9

FEFLEXCIMOIncapacidad

para mantener la organización

0,6 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,4 0,5 0,2 0,9

FEFLEXCNRPNúmero de respuestas

perseverativas

10,0 9,5 9,2 8,2 11,1 7,3 0,6 1,0 0,4 0,4

FEFLEXCPRPPorcentaje de

respuestas perseverativas

19,3 17,5 17,7 15,6 20,8 13,2 0,6 0,9 0,5 0,4

FEFLEXNENSCINúmero del ensayo

de conceptualización inicial

15,3 9,0 15,7 9,1 17,6 10,0 0,8 1,0 0,6 0,6

FEFVSA Fluidez verbal

semántica – Animales

14,6 6,1 15,6 3,3 15,6 3,7 0,6 0,4 0,4 0,9

FEFVFM Fluidez verbal fonémica- M

4,7 4,4 7,0 3,0 6,6 4,4 0,1 0,1 0,1 0,5



ISSN 1657-9550

Variable

SubtipotDAH


Prueba de

Kruskal-Wallis




Valor PSubtipo

1 vs. Subtipo 2


3

Valor PSubtipo

2 vs. Subtipo

3

Lenguaje

LSI Lenguaje –

Seguimiento de instrucciones

8,4 1,5 9,2 1,1 9,2 1,1 0,1 0,1 0,1 0,9

LHMLS Habilidades metalingüísticas –

Síntesis2,1 2,0 3,1 2,2 3,2 2,5 0,3 0,2 0,2 1,0

LHMLCSConteo de sonidos 4,2 2,6 4,0 2,5 5,7 2,5 <0,001 0,9 0,1 <0,001

LHMLDDeletreo 4,1 2,4 5,1 2,1 5,0 2,2 0,3 0,2 0,2 1,0

LHMLCPConteo de palabras 3,3 3,0 4,9 2,5 4,4 2,5 0,3 0,2 0,2 0,6

Referente a las variables socio-demográficas, resalta que el promedio de edad sea 9,9 años, lo que concuerda con el momento escolar en el que parece hacerse más notorio el trastorno, en cuanto en los primeros años correspondientes al inicio de la escolarización formal (grado de transición y primero) con edades comprendidas entre los 6 y 7 años, el medio educativo y los respectivos actores sociales que interactúan con el niño y la niña parecen manejar cierto tiempo de espera ante la expectativa de que tras los logros de la maduración y de la mielinización propios del neurodesarrollo, el niño termine presentando unos mejores niveles de adaptación a las exigencias académicas del medio escolar, momento del desarrollo en que el trastorno termina pasando quizá un tanto desapercibido, aspecto que se confirma desde otros estudios en los que se considera que en la edad preescolar se tendrían alrededor de 8 millones de niños con TDAH, sin diagnóstico, ni tratamiento en Latinoamérica (35) mientras que en los grados de 3 a 5 de básica primaria, grados en los que estaría ubicada la edad de los

9 años se espera del niño el cumplimiento con ciertos indicadores académicos, y con ciertos logros escolares respecto a sus procesos de aprendizaje, que si no son cumplidos, terminan por ser atribuidos a la presencia de un TDAH, aspecto que se hace mucho más evidente ante las dificultades atencionales y de autorregulación características del trastorno, en cuanto se considera que a partir de la presencia de un TDAH, en niños y niñas de edad escolar, los síntomas de inatención pueden afectar el trabajo de clase y la actuación académica, mientras que los síntomas impulsivos pueden llegar a romper con reglas familiares, interpersonales y/o educativas, es así, como se asume que este trastorno, que provoca dificultades para mantener la atención y autorregular la conducta, influye significativamente en la adaptación tanto al contexto escolar como sociofamiliar del estudiante que lo presenta (36). En el análisis de la presente investigación, más allá de los factores de riesgo que representan las comorbilidades del TDAH, se destacan las dificultades asociadas

45


a los trastornos específicos del aprendizaje y el funcionamiento escolar, y la forma como estas dificultades parecen afectar de manera significativa a los niños que lo padecen (37) en cuanto se considera que cerca del 80% de los casos con TDAH sin tratamiento, tienen bajo rendimiento académico, estimándose que un 45% de estos niños repetirá por lo menos un año escolar (38).

En cuanto al grado educativo promedio, se evidencia en el ciclo de básica primaria que la media estuvo representada en el grado cuarto (4), grado escolar que coincide con momentos dentro de la escolarización formal en los que se realiza el diagnóstico del TDAH, se aprende y se consolida la lecto-escritura como base del aprendizaje escolar, y se vivencia el inicio de la preadolescencia donde en algunos casos que no se ha contado con la intervención adecuada, la semiología del trastorno no mejora, sino que por el contrario, se acentúa y complejiza, desde la posible co-morbilidad con otros trastornos del comportamiento, que al parecer tienen una alta prevalencia en la región, en cuanto se considera que en el departamento de Caldas, 3 de cada 100 niños y adolescentes fueron diagnosticados con un trastorno negativista desafiante y 2 de cada 100 con un trastorno de conducta disocial durante el 2010 (39).

Es posible plantear que a nivel neuropsicológico se establecieron diferencias en el desempeño en la atención, específicamente, en el proceso de atención selectiva, indicándose diferencias en la tarea de cancelación de dibujos entre el subtipo TDAH Combinado y TDAH Inatento, teniendo el grupo de TDAH con predominio Combinado en la estimación de la media, un menor resultado en la ejecución en dicha tarea (16,7) que el subtipo Inatento (25,6); así mismo, se establecieron diferencias estadísticamente significativas, a nivel del lenguaje, en relación con las habilidades metalingüísticas, específicamente, en la tarea de conteo de sonidos, entre la estimación de la media en el grupo de casos subtipo TDAH Inatento (4,0) y el desempeño presentado por el grupo Control (5,7).

A partir de las diferencias encontradas en estas 2 tareas de evaluación neuropsicológica de los procesos de atención y lenguaje, entre los 3 grupos comparados, resulta de especial interés desde el punto de vista psicométrico, la media obtenida por el grupo de controles (23,1) en la tarea de cancelación de conejos de la ENI, que evalúa el constructo de atención selectiva, en cuanto este grupo se ubica por debajo del puntaje obtenido por el grupo de TDAH Inatento (25,6), que es el grupo que teórica y clínicamente tendría más dificultades a nivel del proceso atencional. Dado que en la presente investigación en el proceso de selección de casos y controles, se cumplió con estrictos criterios de inclusión y exclusión, y los instrumentos de evaluación fueron cuidadosamente aplicados, dicho resultado permite establecer al menos 2 inferencias básicas, en primera instancia una probable limitación de este resultado de la investigación en cuanto en el presente estudio no se contó con una representación del mismo número de niños y niñas, para cada grupo de edad y grado escolar, en función de poder así establecer desde el punto de vista estadístico si en el hecho de que los niños y niñas con TDAH Inatento, tuvieran un mejor desempeño que los controles en la tarea de cancelación de conejos, hubo variables intervinientes que pudieron influir en este resultado, como el hecho de que este grupo de TDAH Inatento, tuviera niños y niñas en un rango de mayor edad y grado escolar, que los demás grupos incluidos en el análisis; así mismo, en una segunda interpretación de dicho resultado podría estar representando, más que fallas en el proceso atencional del grupo de controles, probablemente, una posible dificultad del instrumento para la evaluación de poblaciones clínicas, específicamente, de esta tarea de cancelación, para discriminar el desempeño en tareas de atención selectiva y sostenida, en la comparación de los puntajes directos que pueden encontrarse entre los desempeños obtenidos por poblaciones normales y desde la evaluación de entidades clínicas específicas como lo sería el TDAH.



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Los resultados encontrados en torno a la tarea de cancelación de dibujos de la ENI, en la presente investigación, no son consistentes con lo planteado en otro estudio realizado en Cali, en el cual la exploración neuropsicológica, permitió establecer diferencias significativas en tareas de atención (como las series de control mental y las omisiones y adiciones de las tareas de ejecución continua auditiva) entre los grupos TDAH Mixto y Control, lo que se asumió como indicador de una alteración en los mecanismos de atención sostenida y presencia de impulsividad en el grupo con TDA de tipo Mixto; así mismo, entre el grupo Control y el Inatento se encontraron diferencias en las omisiones del test de ejecución continua auditiva, lo que confirma la dificultad en la atención sostenida (9, 12). A nivel de las habilidades metalingüísticas, se confirman las dificultades en conciencia fonológica de los niños y niñas con TDAH, a partir de su bajo desempeño en la tarea de conteo de sonidos, respecto al grupo de controles.

A fin de revisar la sensibilidad de la tarea de cancelación de dibujos de la ENI, para el establecimiento de diferencias estadísticamente significativas y para la discriminación en el funcionamiento neuropsicológico de poblaciones normales y clínicas, como lo sería la muestra evaluada de niños y niñas con TDAH, en investigaciones futuras se recomienda incluir en los análisis estadísticos, no solo los puntajes directos del total de aciertos de la prueba, sino además las medidas de omisiones, comisiones y total de errores; en cuanto el registro de las omisiones, el estudio realizado en Cali (9) pareció determinar el establecimiento de diferencias entre los grupos a nivel de déficits compartidos en vigilancia o esfuerzo atencional.

De forma adicional, es preciso señalar que en la presente investigación, no se encontraron diferencias significativas en otras medidas incluidas en la evaluación, como lo fueron: la valoración de la capacidad intelectual, la memoria y las funciones ejecutivas.

Las diferencias encontradas en el funcionamiento metalingüístico entre el grupo de TDAH Inatento y el grupo Control, específicamente, en la tarea de conteo de sonidos, evidencia la importancia de la conciencia fonológica para analizar y segmentar los componentes del habla que parece estar de alguna forma afectada en el caso de los niños y niñas con TDAH de predominio Inatento; desde el tipo de tarea en la que se establecen diferencias en el presente estudio, se demuestra la dificultad de este grupo de TDAH Inatento, en el dominio de los aspectos relacionados con la conciencia de segmentación que afecta la capacidad para el establecimiento de las correspondencias entre grafemas-fonemas. Los resultados encontrados se distancian de los hallazgos presentados en un estudio realizado en Medellín, que tuvo como objetivo encontrar diferencias en el desarrollo de la conciencia fonológica, evaluada a través de una prueba de segmentación lingüística y de un test de fluidez lexical con un mediador fonético, en niños con TDAH y en niños normales; estudio en el que no se encontraron diferencias entre niños con TDAH y controles. En dicho estudio se indicó que los 2 grupos de niños con TDAH y el grupo Control tuvieron un desempeño similar en las mediciones de la conciencia fonológica usadas en el estudio, lo que permitió suponer que el tipo de habilidad evaluada ya se ha consolidado para las edades (7 a 10 años), grados escolares y niveles socioeconómicos de la muestra; es decir, los grupos estudiados ya tenían un conocimiento fonológico, independientemente del diagnóstico de TDAH (20).

En relación con el estimativo de capacidad intelectual, no se encontraron diferencias significativas entre el coeficiente intelectual de los niños y niñas afectados por el TDAH (subtipos TDAH Combinado y TDAH Inatento), respecto al grupo Control, ubicándose su desempeño dentro de un rango de normalidad. En este sentido, los resultados encontrados se distancian de otros productos de investigación en los que se ha planteado que los niños con TDAH Inatento, a pesar de tener un CI normal, puntúan entre

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7 y 15 puntos por debajo de las puntuaciones obtenidas por el resto de la población (40, 41, 9). Dicho resultado puede ser indicador de una diferencia conceptual encontrada en la presente investigación, con respecto a resultados previos identificados en otros estudios que evidencian la diferencia entre 7 y 15 puntos entre TDAH Inatento y controles, o de la limitación de los resultados estadísticos encontrados en el presente informe, para replicar resultados de otras investigaciones, probablemente debido a las diferencias en el tipo de protocolo empleado en cada uno de estos estudios para la valoración de la capacidad intelectual, diferencias que van desde propuestas de evaluación de la capacidad intelectual en las que se emplean todas las tareas reglamentarias de la escala Wechsler, en su versión completa, hasta propuestas de CI prorrateados o abreviados.

En relación con los resultados obtenidos en la evaluación de la memoria y de las funciones ejecutivas en el desempeño neuropsicológico de casos y controles, no se observaron diferencias estadísticamente significativas al comparar los 3 grupos, aun cuando la literatura especializada reporta que el principal compromiso en el desempeño de los procesos cognitivos de los niños y niñas con TDAH, está en la presencia de dificultades asociadas a los procesos de atención, funciones ejecutivas y, en menor grado, a las dificultades encontradas en ciertas áreas del lenguaje (11). Los resultados de la presente investigación, no permitieron reconocer en la evaluación de la muestra con la que se trabajó, las diferencias reportadas en otras investigaciones entre casos y controles en el desempeño de las funciones ejecutivas y la memoria de trabajo (42, 11).

Dicho resultado desde una primera lectura, es consistente con lo planteado en un estudio realizado con 62 niños con TDAH Combinado y 62 controles, en el que se hizo un análisis factorial de las ejecuciones de diversas pruebas neuropsicológicas de función ejecutiva, en el que se planteó que aunque lo que distinguía a

los controles, de los niños TDAH Combinado, era la carencia de un organizador flexible de la información conceptual, en dicho estudio no se encontraron diferencias entre casos y controles a nivel de los factores de organización perceptual temporo-espacial, atención sostenida, atención divida, y preplanificación espacial mediante ensayo y error (43), así mismo, coincide con los resultados negativos encontrados en el estudio realizado en Cali, en el que no se encontraron diferencias entre los 3 grupos en la aplicación del test Wisconsin (WCST) (9). Sin embargo, desde una segunda lectura de los resultados de la presente investigación, en el hecho de que en la evaluación de las funciones ejecutivas a través de la tarea de flexibilidad mental de la ENI, no fuera posible encontrar diferencias estadísticamente significativas en el desempeño entre casos y controles, puede inferirse una probable limitación del instrumento, específicamente, de dicha tarea, para determinar diferencias en el funcionamiento ejecutivo entre poblaciones clínicas y normales, aun cuando otras investigaciones reportan diferencias en el desempeño en la evaluación de las funciones ejecutivas (en errores perseverativos en las tarjetas del Winconsin) y en tareas de fluidez semántica (11).

Es posible plantear una probable limitación psicométrica de la tarea, en cuanto en la presente investigación se incluyeron todas los ítems de la prueba de flexibilidad mental de la ENI (número total de ensayos administrados, total de respuestas correctas, porcentaje de respuestas correctas, total de errores, porcentaje de errores, número de categorías, incapacidad para mantener la organización, número de respuestas perseverativas y porcentaje de respuestas perseverativas), y a partir del análisis estadístico realizado no fue posible establecer ninguna diferencia entre los grupos evaluados en cada una de estas variables. Dicha dificultad del instrumento para discriminar entre poblaciones normales y clínicas en el funcionamiento ejecutivo, desde la tarea de flexibilidad mental, podría estar asociada al número de tarjetas



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empleadas en la prueba 54, en relación con el número total de tarjetas usadas en el Wisconsin 128, en cuanto que dado que la tarea del WCST es más larga y requiere por lo mismo mayores recursos de vigilancia y atencionales, pudiera favorecer más la discriminación de fallas en los procesos de planificación, autorregulación e impulsividad, entre casos y controles. Este resultado hace manifiesta la necesidad de seguir avanzando, en el empleo de la ENI en ejercicios investigativos con poblaciones clínicas para revisar la validez y el comportamiento de la prueba, en la evaluación de niños y niñas con TDAH, y en la de otros grupos clínicos de interés. Tal y como se ha hecho con el WCST, el cual ha sido empleado para evaluar grupos de diferentes trastornos neurológicos y psicopatologías que han incluido sujetos con daño cerebral difuso o focal (44), ataques de tipo epiléptico, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple y problemas psiquiátricos como esquizofrenia (44), así mismo, el WCST se ha empleado en estudios para evaluar el cambio cognitivo durante la infancia que han incluido investigaciones sobre el comportamiento del instrumento en grupos de niños con trastornos por déficit de atención y trastornos del aprendizaje (44). En este sentido las autoras y autor de la ENI, plantean la importancia de que en investigaciones futuras se puedan utilizar estos mismos instrumentos de evaluación que componen la Batería de Evaluación Neuropsicológica Infantil (ENI), para caracterizar poblaciones de niños con problemas en el desarrollo cognoscitivo, tales como grupos de niños con problemas específicos de aprendizaje o retraso cognoscitivo generalizado (34) que permitan la realización

de ajustes y el refinamiento del instrumento en algunas de sus tareas, según las características y necesidades específicas de poblaciones clínicas determinadas.

CONCLUSIONES

En las diversas correlaciones establecidas, se confirma que el aprendizaje de habilidades académicas como la lectura y la escritura, tiene a la base unos prerrequisitos cognitivos entre los cuales se evidencia la implicación que tienen en dichos aprendizajes, la atención, la memoria, el lenguaje y las funciones ejecutivas.

Dado que se precisan algunas diferencias en el funcionamiento cognitivo entre los subtipos de TDAH respecto a grupos Control, específicamente, en relación con la atención selectiva y las habilidades metalingüísticas, es importante continuar realizando estudios que profundicen en el reconocimiento de las diferencias neuropsicológicas entre los subtipos, en cuanto la literatura especializada reporta diferencias y una mayor afectación en los procesos académicos particularmente del subtipo TDAH-I.

Respecto a la evaluación neuropsicológica, se recomienda incluir en la evaluación de la atención no solo los aciertos, sino las medidas de comisiones, omisiones, y errores, así mismo, respecto a la evaluación de las funciones ejecutivas, se sugiere el empleo del Wisconsin en su versión larga, y la consideración de otras funciones ejecutivas como la planificación.

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REFERENCIAS

1. Romero A, Maestú F, González J, Romo C, Andrade J. Disfunción Ejecutiva en el trastorno por déficit de atención con hiperactividad en la infancia. Rev Neurol 2006; 42(5):265-271.

2. Zuliani L, Uribe M, Cardona J, Cornejo J. Características clínicas, neuropsicológicas y sociodemográficas de niños varones con déficit de atención/hiperactividad de tipo inatento en Medellín, Antioquia, Colombia 2004-2005. Iatreia 2008 Dic, 21(4):375-384.

3. Castro Viejo I. Enfermedad comorbida del Síndrome de déficit de atención con hiperactividad. Rev Neurol 2002; 35(1):11-12.

4. American psychiatric Association (ApA). Manual diagnóstico y estadístico de los trastornos mentales. Barcelona: Masson; 1995.

5. Acosta M. Aspectos Neurobiológicos del déficit de atención/hiperactividad. Estado actual del conocimiento. Revista de Neuropsicología, Neuropsiquiatría y Neurociencias 2000; 2:4-5.

6. Cornejo J, Osío O, Sánchez Y, Carrizosa J, Sánchez G, Grisales H, Castillo-parra, Holguín J. prevalencia del trastorno por déficit de atención-hiperactividad en niños y adolescentes colombianos. Rev Neurol 2005; 40(12):716-722.

7. Rosselli M, Ardila A. Neuropsicología del déficit atencional con hiperactividad (DAH). Revista Neuropsicología, Neuropsiquiatría y Neurociencias 2000; 2:38-43.

8. Galindo G, De la peña F, De la Rosa N, Robles E, Salvador J, Cortés J. Análisis neuropsicológico de las características cognoscitivas de un grupo de adolescentes con trastorno por déficit de atención. Salud Mental 2001; 24(4):50-57.

9. Bará S, Vicuña p, pineda D, Henao G. perfiles neuropsicológicos y conductuales de niños con trastorno por déficit de atención/hiperactividad de Cali, Colombia. Rev Neurol 2003; 37(7):608-615.

10. Ramírez L, Arenas A, Henao G. Caracterización de la memoria visual, semántica, y auditiva en niños y niñas con déficit de atención tipo combinado, predominantemente inatento y un control. Revista electrónica de investigación psicoeducativa 2005; 7, 3(3):99-108.

11. puentes p, Barceló E, pineda D. Características conductuales y neuropsicológicas de niños de ambos sexos, de 6 a 11 años, con trastorno por déficit de atención/hiperactividad. Rev Neurol 2008; 47(4):175-184.

12. Roselló B. Subtipos de trastornos por déficit de atención con hiperactividad. Manifestaciones, correlatos y efectos del metilfenidato. [Tesis doctoral]. Valencia: Universitat de València; 2001.

13. Capdevila-Brophy C, Artigas-pallarés J, Ramírez-Mallafré A, López-Rosendo M, Real J, Obiols-Llandrich J. Fenotipo neuropsicológico del trastorno de déficit atencional/hiperactividad: ¿existen diferencias entre los subtipos? Rev Neurol 2005; 40(Supl.1):S17-S23.

14. Capdevila-Brophy C, Artigas-pallarés J, Obiols-Llandrich J. Tempo cognitivo lento: ¿síntomas del trastorno de déficit de atención/hiperactividad predominantemente desatento o una nueva entidad clínica? Rev Neurol 2006; 42(Supl.2):S127-S134.

15. Miranda A, García R, Melià A, Marco R. Aportaciones al conocimiento del trastorno por déficit de atención

con hiperactividad. Desde la investigación a la práctica. Rev Neurol 2004; 38(Supl.1):S156-S163.

16. pineda D, Lyketsos C, Aguirre D, Henao E, Taragano F, Lopera F, puerta I, Hincapié L, Gómez L, García M, Arango O, Allegri R, Bocanegra Y. 10 años de investigación en Neuropsicología. Grupo de Investigación en Neuropsicología y Conducta (GRUNECO). Facultad de psicología, Dirección de Investigaciones, Universidad San Buenaventura, Medellín; 2008. p. 101.



ISSN 1657-9550

17. Sánchez Carpintero R, Narbona J. Revisión conceptual del sistema ejecutivo y su estudio en el niño con trastorno por déficit de atención e hiperactividad. Rev Neurol 2001; 33(1):47-53.

18. Rebollo M, Montiel S. Atención y funciones ejecutivas. Rev Neurol 2006; 42(Supl.2):S3-S7.

19. Idiazábal-Alecha MA, Guerrero-Gallo D, Sánchez-Bisbal MM. procesamiento del lenguaje en el trastorno por déficit de atención con hiperactividad. Rev Neurol 2006; 42(Supl.2):S29-S36.

20. Gómez L, pineda D, Aguirre D. Conciencia fonológica en niños con trastorno de la atención sin dificultades en el aprendizaje. Rev Neurol 2005; 40(10):581-586.

21. pineda D, Henao G, puerta IC, Mejía S, Gómez LF, Miranda ML, et al. Uso de un cuestionario breve para el diagnóstico de deficiencia atencional. Rev Neurol 1999; 28:344-51.

22. Hernández R, Fernández C, Baptista p. Metodología de la Investigación. México: McGraw-Hill; 2006. p. 102.

23. Rada G, Merino T. Estudios transversales. Disponible en: http://escuela.med.puc.cl/Recursos/

recepidem/epiDesc6.htm Consultado 9 de Abril de 2010.

24. Weschler D. Escala de Inteligencia para Niños revisada WISC-R. Madrid: TEA; 1993.

25. Satller J. Evaluación Infantil. Aplicaciones cognitivas. Volumen 1. Apéndice D. México: Manual Moderno; 2003. p. 882 y ss.

26. American psychiatric Association (ApA). Diagnostic and statistical manual of mental disorder.

Washington DC: ApA; 1994.

27. pineda D, Ardila A, Roselli M, Arias BE, Henao GC, Gómez LF. prevalence of attention deficit/hyperactivity disorder symptoms in 4 to 17 years old children in general population. J Abnorm Child psychol 1999; 27:455-62.

28. pineda D, Lopera F, palacio J, Ramírez D, Henao G. prevalence estimations of attention-deficit/hyperactivity disorder: differential diagnosis and comorbidities in a Colombian simple. Intern J Neurosci 2003; 113:49-71.

29. pineda DA, Rosselli M, Henao GC, Mejía SE. Neurobehavioral assessment of attention deficit hyperactivity disorder in a Colombian sample. Applied Neuropsychology 2000; 7:406.

30. Henao G, González L, Varela V. Diseño e implementación de protocolos de evaluación Neuropsicopedagógica. parte II. Especialización en Neuropsicopedagogía - VII promoción. Manizales: Universidad de Manizales, Facultad de psicología; en prensa. p. 17.

31. Sheehan D, Lecrubier Y, Colón-Soto. MINI KID. Mini International Neuropsychiatric Interview para niños y adolescentes. Versión en español, 2000. www.medical-outcomes.com

32. Sheehan D, Shytle D, Milo K, Lecrubier Y, Hergueta T. MINI International Neuropsychiatric Interview para Niños y Adolescentes. Versión en español, 2005. www.medical-outcomes.com

33. Rosselli M, Matute E, Ardila A, Botero V, Tangarife G, Echeverría S, Arbeláez C, Mejía M, Méndez L, Villa p, Ocampo p. Evaluación Neuropsicológica Infantil (ENI): una batería para la evaluación de niños entre 5 y 16 años de edad. Estudio normativo colombiano. Rev Neurol 2004; 38(8):720-731.

34. Rosselli M, Matute E, Ardila A, Ostrosky-Solis F. Desarrollo de habilidades cognoscitivas en niños y niñas latinoamericanos con edades comprendidas entre los 5 y los 16 años. Cuadernos de línea, No. 1. Desarrollo Infantil. Sublínea Evaluación Neuropsicopedagogica. Manizales: Universidad de Manizales; 2004. p. 133-158.

51


35. palacio J, Ruiz M, Bauermeister J, Montiel C, Henao G, Agosta G. Algoritmo de Tratamiento Multimodal para preescolares Latinoamericanos con Trastorno por Déficit de Atención con Hiperactividad (TDAH). Salud Mental 2009; 32(Supl.1):200.

36. Arco J, Fernández F, Hinojo F. Trastorno por déficit de atención con hiperactividad: intervención psicopedagógica. psicothema 2004; 16(3):408-414.

37. peña J, Montiel Nava C. Trastorno por déficit de atención/hiperactividad: ¿mito o realidad? Rev Neurol 2003; 36(2):173-179.

38. Martínez M, Henao G, Gómez L. Comorbilidad del trastorno por déficit de atención e hiperactividad con los trastornos específicos del aprendizaje. Rev.colomb.psiquiatr. 2009 Oct; 38(Supl.1):178-194.

39. Castaño M, Calderón J, Jiménez D, Dussan C, Valderrama A. Trastornos mentales y trastornos por uso de sustancias en el Departamento de Caldas. Universidad de Caldas, Vicerrectoría de Investigaciones y postgrados, Facultad de Ciencias para la Salud. Manizales: Editorial Universidad de Caldas; 2010. p. 75-76.

40. Regard M. Cognitive rigidity and flexibility; a neuropsychological study. [Unpublished dissertation,

1981]. University of Victoria. 41. Faraone S, Biederman J, Lehman B, Keenan K, Norman D, Seidman L. Evidence for the independent

familial transmission of attention deficit hyperactivity disorder and learning disabilities: results from a family genetic study. Am J psychiatry 1993; 150:891-5.

42. Sergeant JA, Oosterlaan J, Van der Meere J. Information processing and energetic factors in attention deficit/hyperactivity disorder. In: Quay HC, Hogan A, eds. Handbook of Disruptive Behavior Disorders. New York: Kluwer/plenum; 1999. p. 75-104.

43. pineda DA, Ardila A, Rosselli M, Cadavid C, Mancheno S, Mejía S. Executive dysfunctions in children with attention deficit hyperactivity disorder. Int J Neurosci 1998; 96:177-96.

44. Heaton R, Chelune G, Talley J, Kay G, Curtiss G. WCST. Test de Clasificación de Tarjetas de Wisconsin. Madrid: TEA Ediciones; 1997. p. 51-52.

RESUMEN

Objetivo. Evaluar la implementación de las buenas prácticas ganaderas en explotaciones de ganado bovino de ceba, de acuerdo a los lineamientos de la legislación sanitaria vigente.

Materiales y métodos. De acuerdo con los registros de la vacunación anti-aftosa del Comité de Ganaderos de Caldas, se seleccionaron 100 fincas localizadas en los municipios de Manizales (n = 38), Palestina (n = 18), Neira (n = 39) y Chinchiná (n = 5), en donde se aplicó un instrumento estructurado con el esquema de lista de chequeo, para evaluar requerimientos sanitarios y de inocuidad.

Resultados. El 70% de los sistemas productivos fueron clasificados como ceba extensiva, el 30% restante, doble propósito, levante y cría. Los requisitos sanitarios para las instalaciones, se encontraron en un nivel aceptable de implementación (74 al 96%); la adopción de normas de bienestar animal (60 al 92%), de sanidad animal y bioseguridad (15 al 74%), y almacenamiento (23 al 59 %), en un nivel medio; siendo deficiente el componente de personal (11 al 26%) y el plan de saneamiento (4 al 35%).

Conclusiones. Se requiere una mayor implementación de las Buenas Prácticas Ganaderas, siendo posible establecer incentivos comerciales y sanitarios, que hagan más atractiva su adopción.

Palabras clave: bioseguridad, buenas prácticas ganaderas, inocuidad, producción primaria.

EVALUATION OF GOOD LIVESTOCK FARMING PRACTICES

ON CATTLE BEEF IN THE CENTRAL REGION OF CALDAS

ABSTRACT

Objective. To evaluate the implementation of good farming practices in beef cattle farms according to current sanitary legislation.

Materials and methods. Using Foot and Mouth disease vaccination records from the Comité de Ganaderos de Caldas, 100 farms from the municipalities of Manizales (n = 38), Palestina (n = 18), Neira (n = 39), and Chinchiná (n = 5), where were selected to apply a check list questionnaire to evaluate compliance to the sanitary and food safety requirements.

Results. Seventy percent of the evaluated production systems were classified as extensive growing and fattening, the remaining 30% belonged to double purpose or breeding systems. Infrastructure compliance was found at an acceptable level (74 to 96%), animal welfare adoption (60 to 92%), animal health and biosecurity (15 to 74%), and storage (23 to 59%) at a medium level. Compliance in personnel (11 to 26%) and sanitizing procedures (4 to 35%) were found deficient.

Conclusions. Greater implementation of good farming practices is needed, perhaps through the establishment of commercial and health incentives for their adoption.

Key words: biosecurity, good farming practices, food safety, primary production.

EVALUACIÓN DE LAS BUENAS PRÁCTICAS GANADERAS EN BOVINOS DE CARNE EN EL CENTRO DE CALDAS

Marlyn Hellen Romero peñuela1

Jorge Alberto Sánchez Valencia1

1 profesores Departamento Salud Animal, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Caldas, Calle 65 No. 26-10, Manizales. Tele-fax: 8781516. E-mail: [email protected], [email protected]

ISSN 1657-9550Recibido: abril 28 del 2011 - Aceptado: agosto 2 del 2011


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Evaluación de las buenas prácticas ganaderas en bovinos de carne en el centro de Caldas

INTRODUCCIÓN

La política sanitaria y de inocuidad para las cadenas de la carne bovina y la leche, contempla el fortalecimiento del estatus sanitario de la ganadería colombiana, el mejoramiento de la capacidad científica y técnica del sistema de Medidas Sanitarias y Fitosanitarias, el desarrollo e integración de la cadena, así como, la prevención y el control de los riesgos sanitarios con el enfoque “de la granja a la mesa” (1). La finalidad de esta política consiste en mejorar la competitividad y obtener la admisibilidad de los productos en los mercados internacionales, siendo fundamental la intervención de la producción primaria agropecuaria (1). En este sentido, el Instituto Colombiano Agropecuario (ICA) lidera la adopción de programas de buenas prácticas sanitarias y de inocuidad en la producción primaria de ganado bovino y bufalino destinado al sacrificio para consumo humano, que tiene como meta la certificación gradual de los hatos ganaderos, e incluye consideraciones relacionadas con requisitos sanitarios para las instalaciones, plan de saneamiento, requisitos para el almacenamiento de insumos, sanidad animal y bioseguridad, programa de trazabilidad, buenas prácticas para el uso de medicamentos veterinarios, buenas prácticas para la alimentación animal, bienestar animal, condiciones del personal y el transporte terrestre de los animales (2).

De acuerdo con la FAO, se entiende por Buenas Prácticas Ganaderas (BPG) todas las acciones involucradas en la producción primaria y transporte de productos alimenticios de origen pecuario, orientadas a asegurar su inocuidad. La producción primaria es una fuente de peligros biológicos, físicos y químicos que pueden afectar la inocuidad de la carne, aspecto que ha hecho relevante que en la cadena agroalimentaria de la carne fresca bovina se incluya este importante eslabón (3). El objetivo de la presente investigación, consistió en evaluar la implementación de las BPG en fincas de ganado

bovino de ceba en la región central de Caldas que provee animales que se benefician en la ciudad de Manizales, a la luz de la legislación sanitaria vigente.


Área geográfica

El municipio de Manizales está localizado en el centro occidente de Colombia, con un área de 571,84 km2, una temperatura promedio de 18oC y una precipitación promedio anual de 1495 mm (4).

Selección de los predios

Usando los registros de vacunación contra la fiebre aftosa del Comité de Ganaderos de Caldas, se definió una población conformada por 157 predios con un número igual o mayor de 100 bovinos, de los cuales 100 predios de los municipios de Manizales (n = 38), Palestina (n = 18), Neira (n = 39) y Chinchiná (n = 5), participaron en el muestreo.

Encuesta

Se estructuró un instrumento con el esquema de lista de chequeo de acuerdo a los requerimientos de la Resolución del ICA 002341 de 2007 (2), que fue aplicado en las fincas, previo consentimiento informado de los propietarios.

Análisis estadístico

Se elaboró una base de datos en el programa Epi Info versión 6.04 para hacer el análisis descriptivo de las variables incluidas en el estudio. Así mismo, se realizó un análisis de correspondencia múltiple (ACM) para estudiar la asociación entre los componentes de las buenas prácticas con el área de las fincas, localización y tipo de explotación (doble propósito, ceba).

54Biosalud, Volumen 10 No. 1, enero - junio, 2011. págs. 52 - 60

Marlyn Hellen Romero peñuela, Jorge Alberto Sánchez Valencia

ISSN 1657-9550

RESULTADOS

En el área de estudio, ninguna finca había implementado sistemas productivos en confinamiento. El 70% estaban dedicados exclusivamente a actividades de ceba extensiva, el 30% restante, a sistemas productivos de doble propósito, levante y cría. Los primeros, localizados principalmente en clima cálido, con animales pertenecientes a cruces comerciales de ganado Cebú; los segundos, principalmente de la raza Normando, establecidos en el páramo. En general, todos los predios se caracterizaron por presentar sistemas productivos poco tecnifi cados y por la contratación de personal con un nivel de capacitación escasa para su labor, orientando su trabajo de acuerdo con las enseñanzas recibidas por tradición familiar o experiencias propias.

Las condiciones sanitarias y de inocuidad de las BPG se encuentran en diferentes grados de implementación (Tabla 1).

El análisis de correspondencias múltiples, evidenció que no existe asociación entre la implementación de las buenas prácticas con el municipio y el tipo de explotación (P> 0,05). Así mismo, estableció que en el municipio Manzanares (municipio 1) se localizó el 71% de las fi ncas de menor extensión y estas no contaban con áreas para el aislamiento de animales enfermos (P< 0,05), y que las fi ncas más grandes, localizadas en Neira (municipio 4), contaban con suministro de agua potable para los animales (Gráfi co 1). Se observó relación entre los predios localizados de acuerdo al Plan de Ordenamiento Territorial de los cuatro municipios evaluados y el contar con áreas para el aislamiento de bovinos (P< 0,05).

Gráfi co 1. Análisis de correspondencias múltiples de puntos de alternativas de los requisitos de instalaciones y programas de saneamiento de acuerdo al área de las fi ncas.

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Tabla 1. Evaluación de las BPG de acuerdo a los lineamientos de la legislación sanitaria vigente, área de influencia de Manizales, 2009.

VARIABLES CUMPLE NO CUMPLERequisitos sanitarios para instalaciones y áreas- Localización de acuerdo con el Plan de Ordenamiento Territorial 96 4- Cercos perimetrales en buen estado 74 26- Áreas cómodas y seguras 68 32- Áreas para el aislamiento de animales enfermos 85 15

Plan de Saneamiento- Programa limpieza y desinfección 4 96- Control integrado de plagas 29 71- Manejo de residuos sólidos 32 68- Monitoreo periódico de agua, registros 35 65- Agua potable para animales 9 91- Consumo ad libitum 40 60

Almacenamiento- Bodegas limpias y ordenadas 59 41- Separadas y cerradas 26 74- Separación de plaguicidas y fertilizantes 23 77- Control de temperatura y humedad 51 49

Sanidad animal y bioseguridad- Programa de prevención, control y erradicación de enfermedades 59 41- Asesoría médico veterinario, programa complementario 46 54- Cuarentena previa al ingreso de animales 74 26- Registro ingreso y salida de visitantes y vehículos 15 85- Programa continuo de capacitación al personal 23 77

Manejo de medicamentos veterinarios- Asignación persona idónea 54 46- Registro ICA (medicamentos, fertilizantes, plaguicidas) 95 5- Medicamentos clasificados bajo llave 16 84- Registro aplicación, control de inventarios 44 56- Reutilización envases 86 14- Tiempo de retiro 44 56- Uso de guardián 12 88- Identificación animales tratados 54 46

Bienestar animal- Manejo evitando el estrés 92 8- Uso de elementos cortopunzantes o eléctricos 97 3- Cargue y descargue adecuado 60 40

Personal- Capacitación sobre bioseguridad y oficio 26 74- Con seguridad social 26 74- Botiquín primeros auxilios 11 89- Dotación apropiada 22 78



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DISCUSIÓN

El área de estudio se caracterizó por presentar sistemas productivos extensivos, muy similares a los descritos en otras partes del mundo (5). Dentro de las BPG incluidas en la legislación sanitaria, se encuentran los requisitos sanitarios de las instalaciones (2). Investigadores han demostrado que las instalaciones bien diseñadas para el trabajo veterinario, el cargue de los camiones y para otros procedimientos de selección de los bovinos, hacen más eficiente el trabajo, reducen el estrés y las lesiones (6). Así mismo, se ha sugerido que la generación de estrés durante el manejo, puede disminuir las tasas de concepción, produce inmunosupresión, eleva los niveles de cortisol, incrementa la frecuencia cardiaca, reduce las ganancias de peso y aumenta la contracción muscular, entre otros aspectos (6, 7).

Los predios evaluados en general cumplían los requisitos enunciados en la legislación en una proporción entre media y alta (Tabla 1), pero estos requerimientos no son específicos y no describen de forma detallada las características de las mismas. En este sentido, estudios basados en el comportamiento bovino, han permitido establecer las características de diseño que deben tener las instalaciones, en donde se recomienda que las paredes de los corrales de encierro, los dispositivos de retención y los patios de maniobras, deben tener paredes macizas; las áreas de conducción deben presentar una estructura curva; siendo necesario, además, evitar las sombras, los reflejos brillantes y el ruido de tono alto (8, 9).

Con relación al Plan de Saneamiento (Programas: Monitoreo de agua potable, Limpieza y desinfección, Control integrado de plagas y Manejo de residuos sólidos) su implementación es deficiente (Tabla 1). La calidad del agua usada para el consumo de los animales, es fundamental para evitar que se convierta en una fuente de infección de microorganismos como E. coli O157:H7, Salmonella sp., Shigella sp.,

Vibrio cholerae y Cryptosporidium sp., así como de virus, protozoarios y parásitos, tanto para los animales del mismo hato o de aquellos que usan la misma fuente; y para el hombre (10). De otra parte, el agua puede participar como fuente de contaminación de sustancias químicas como los nitratos, que son usados como fertilizantes; o de pesticidas y metales pesados, que pueden acumularse en altas concentraciones, filtrarse en el suelo y de esta forma pasar a aguas subterráneas y superficiales (10, 11).

Los residuos sólidos generados en los predios, son variados y representan diferentes grados de riesgo para los animales y para el ambiente; aspecto que ha llevado a comprometer a los productores a implementar sistemas de manejo sostenible para su disposición y tratamiento (12). En el área de estudio, ninguna finca contaba con un sistema de tratamiento de las heces, y de los residuos patógenos con riesgo microbiológico, como piezas anatomopatológicas (muestras, necropsias, tejidos) y residuos biosanitarios (elementos o instrumentos que tienen contacto con materia orgánica, sangre o fluidos corporales). Solo un 12% manejaba correctamente los residuos cortopunzantes (agujas, cuchillas, restos de ampolletas, entre otros). Este aspecto ofrece un riesgo ocupacional y de diseminación de microorganismos como Cryptosporidium, Giardia, Coxiella, Leptospira, Mycobacterium, Salmonella, E. coli, Listeria monocytogenes, entre otros, que pueden afectar la productividad de los bovinos (13, 14).

Solo el 29% de los predios realizaba alguna labor de control de plagas (artrópodos y roedores) de forma ocasional y poco tecnificada, a pesar de que manifestaron que éste era uno de los problemas más importantes de las explotaciones, en especial la infestación de roedores, resultados que coinciden con los reportados en Alemania (15). La presencia de roedores en las explotaciones ganaderas, implica riesgos para los bovinos y para el personal, porque son reservorios o fuentes de infección de microorganismos como Leptospira

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icterohaemorrhagiae, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni y el virus de la fiebre aftosa, los cuales pueden diseminarse a través de las heces, orina o carcasas, según el microorganismo vinculado; por lo tanto, su control es una medida de bioseguridad para interrumpir las cadenas de transmisión de estas infecciones (15).

El 59% de las fincas contaba con programas de control y erradicación de enfermedades. Investigaciones realizadas con ganaderos ingleses, han demostrado que este proceso requiere de un cambio de actitud frente a barreras que limitan su responsabilidad social de producir alimentos inocuos, y a la falta de credibilidad de su eficacia frente al costo-beneficio de la implementación. Las creencias culturales, la falta de conocimiento y la ausencia de presiones sociales y económicas por parte de los consumidores, son factores que inciden en la baja adopción de estos programas (16, 17).

La legislación colombiana no definió de forma precisa y completa, los lineamientos de bioseguridad requeridos en las explotaciones bovinas y bufalinas de carne (2). En las fincas evaluadas su implementación fue pobre, coincidiendo con los resultados reportados en el Reino Unido (18). En este último país, estudios sugieren que su baja implementación se relaciona con el concepto que tienen los médicos veterinarios, el personal de apoyo y los ganaderos, de ser medidas costosas que requieren de tiempo, así mismo, por la falta de apoyo y pobre conocimiento sobre su impacto por parte de los ganaderos, la falta de educación y cambio de actitud, y porque en ocasiones se consideran medidas poco viables de aplicar (18). Se ha reportado, en relación con las normas de bioseguridad, que los factores que más contribuyen a la diseminación de enfermedades como la tuberculosis bovina y la fiebre aftosa entre predios, son el movimiento de personas, animales y vehículos, compartir equipos y el contacto con las heces (19).

Son bien conocidos los riesgos del uso indiscriminado de medicamentos veterinarios

para la inocuidad de los alimentos de origen animal, los cuales tienen implicaciones para el consumidor como el incremento de las alergias y el desarrollo de resistencia de los microorganismos a los antibióticos; así como para los productores de alimentos, porque los residuos de los antibióticos o sus metabolitos, interfieren en los procesos de fermentación de los productos lácteos y cárnicos (20, 21). En los predios evaluados, la implementación de buenas prácticas en el uso de medicamentos veterinarios se encuentra en un nivel entre medio y bajo, lo cual difiere con los sistemas productivos europeos, en donde solo se aplican bajo circunstancias específicas y bajo estrictas medidas de control (21).

Las labores agropecuarias, en las cuales el personal tiene contacto directo o permanente con sangre u otros fluidos corporales con potencial capacidad de contaminación, se consideran como de alto riesgo (14). En el área estudiada, fue baja la capacitación de los trabajadores de las fincas sobre bioseguridad y los riesgos propios de su oficio (26%), así como, la afiliación al Sistema de Seguridad Social (26%). Adicionalmente, no se les suministra dotación de trabajo apropiada y botiquín de primeros auxilios (Tabla 1).

Los resultados permiten sugerir que existe una baja cultura de los ganaderos frente a la adopción de prácticas de prevención de riesgos profesionales en sus empleados, y que se hace necesario fortalecer hábitos de autocuidado en el personal.

Teniendo en cuenta que el objetivo de la implementación de las BPG es garantizar la inocuidad de los productos de origen animal, la protección del medio ambiente y de las personas que trabajan en las explotaciones, se podría sugerir que los componentes aplicables a los programas de prevención y control serían prioritarios para iniciar los procesos de implementación, incluyendo entre otras las relacionadas con los siguientes: sanidad animal, instalaciones y construcciones, bienestar animal,



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gestión del medio ambiente y transporte (22). Los desafíos que afrontan las instituciones responsables de la adopción de las BPG, en nuestro caso el Instituto Colombiano Agropecuario (ICA), serían: a) fortalecer los programas de capacitación y de extensión rural para los pequeños y medianos productores, b) evaluar su aplicabilidad como herramientas epidemiológicas y económicas, d) implantar el programa de trazabilidad del ganado a nivel nacional, y e) establecer categorías diferenciadas de los sistemas productivos que las adopten. Esta última alternativa podría ser exitosa, como se ha demostrado en Chile, en donde las fincas ingresan a un programa denominado PABCO (Planteles Animales Bajo Certificación Oficial), con el objetivo de generar las condiciones sanitarias y comerciales para la exportación de alimentos de origen animal, mediante la aplicación de algunas BPG; en estas explotaciones los productos son diferenciados y

mejor posicionados económica y comercialmente (22).

Se concluye que se requiere de una mayor promoción de la implementación de las BPG, en especial en lo relacionado con los lineamientos de sanidad animal y bioseguridad, manejo de medicamentos veterinarios, adopción del plan de saneamiento y de beneficios sociales para los trabajadores. Así como el establecimiento de incentivos comerciales y sanitarios, que hagan más atractiva su adopción.

AGRADECIMIENTOS

A la Vicerrectoría de Proyección de la Universidad de Caldas y al Comité de Ganaderos de Caldas (Colombia), por el financiamiento de esta investigación.

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REFERENCIAS

1. Documento Conpes 3376, de política sanitaria y de inocuidad para las cadenas de la carne bovina y de la leche. Departamento de planeación Nacional. Septiembre 5 de 2005.

2. Resolución 002341, Condiciones sanitarias y de inocuidad en la producción primaria de ganado bovino y bufalino destinado al sacrificio para consumo. Boletín Oficial del Estado, número 46730. Agosto 24 de 2007.

3. OMS (Organización Mundial de la Salud), FAO (Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación). Codex Alimentarius - producción de alimentos de origen animal. 2a ed. Roma: OMS/FAO; 2009.

4. IGAC (Instituto Geográfico Agustín Codazzi). Diccionario geográfico de Colombia. Santafé Bogotá; 1996.

5. petherick JC. Animal welfare issues associated with extensive livestock production: The northern Australian beef cattle industry. Appl Anim Behav Sci 2005; 92:211-234.

6. Grandin T. The design and construction of facilities for handling cattle. Livest prod Sci 1997; 49:103-119.

7. Hemsworth pH, Coleman GJ, Barnett JL, Borg S. Relationships between human-animal interactions and productivity of commercial dairy cows. J Anim Sci 2000; 78:2821-2831.

8. Grandin T. Transferring results of behavioral research to industry to improve animal welfare on the farm, ranch and the slaughter plant. Appl Anim Behav Sci 2003; 81:215-228.

9. Grandin T. progress and challenges in animal handling and slaughter in U.S. Appl Anim Behav Sci 2006; 100:129-139.

10. Kirby RM, Bartram J, Carr R. Water in food production and processing: quantity and quality concerns. Food Control 2003; 14:283-299.

11. Galka A. Using a cleaner production preventive strategy for the reduction of the negative environmental impacts of agricultural production using cattle husbandry as a case study. J Clean prod 2004; 12:513-516.

12. Harikishan S, Sung S. Cattle waste treatment and class a biosolid production using temperature-phased anaerobic digester. Adv Environ Res 2003; 7:701-706.

13. Klein M, Brown L, van den Akker B, peters GM, Stuetz RM, Roser D. Monitoring bacterial indicators and pathogens in cattle feedlot waste by real-time pCR. Water Res 2010; 44:1381-1388.

14. Cediel N, Villamil LC. Riesgo biológico ocupacional en la Medicina Veterinaria, área de intervención prioritaria. Rev Salud pública 2004; 6(1):28-43.

15. Endepols S, Klemann N, pelz HJ, Ziebell KL. A scheme for the placement of rodenticide baits for rat eradication on confinement livestock farms. prev Vet Med 2003; 58:115-123.

16. Ellis-Iversen J, Cook AJC, Watson E, Nielen M, Larkin L, Wooldridge M, et al. perceptions, circumstances and motivators that influence implementation of zoonotic control programs on cattle farms. prev Vet Med 2010; 93:276-285.

17. Benjamin LA, Fosgate GT, Ward Mp, Roussel AJ, Feagin RA, Schwartz AL. Attitudes towards biosecurity practices relevant to Johne’s disease control on beef cattle farms. prev Vet Med 2010; 94:222-230.



ISSN 1657-9550

18. Gunn GJ, Heffernan C, Hall M, McLeod A, Hovi M. Measuring and comparing constraints to improved biosecurity amongst GB farmers, veterinarians and the auxiliary industries. prev Vet Med 2008; 84:310-323.

19. Brennan ML, Kemp R, Christley RM. Direct and indirect contacts between cattle farms in north-west England. prev Vet Med 2008; 84:242-260.

20. Reig M, Toldrá F. Veterinary drug residues in meat: concerns and rapid methods for detection. Meat Sci 2008; 78:60-67.

21. Toldrá F, Reig M. Methods for rapid detection of chemical and veterinary drug residues in animal foods. Trends Food Sci Techonol 2006; 17:482-489.

22. Benavides B, Rosenfeld C. Análisis de las buenas prácticas ganaderas y su aplicación epidemiológica. Rev sci tech Off int Epiz 2009; 28(3):909-916.

RESUMEN

Objetivo. Establecer valores de referencia en los niveles de TSH y T4 libre, para las líneas de ponedoras Hy-Line W-36 y Lohmann Brown-Classic, asimismo, comparar los niveles de hormonas tiroideas en suero sanguíneo entre estas dos líneas.

Materiales y métodos. Se obtuvo suero en ayunas de 100 gallinas ponedoras (50 Hy-Line W-36 y 50 Lohmann Brown-Classic) de 25 semanas de edad, y se determinaron los niveles de TSH y T4 libre mediante inmunoensayo enzimático.

Resultados. Los valores de TSH para la línea Hy-Line W-36 (µUI/ml) fueron: promedio, mínimo, máximo y desviación estándar de 0,09, 0,00, 0,82, 0,15, respectivamente. Para la línea Lohmann Brown-Classic (µUI/ml) fueron: 0,29; 0,00; 4,98; 0,78, respectivamente. El valor P del test F es mayor o igual a 0,05, por lo cual no hay diferencia estadísticamente significativa,

con una confidencia del 95% para la TSH entre líneas. Los valores de T4 libre para la línea Hy-Line W-36 en ng/dl fueron: promedio, mínimo, máximo y desviación estándar de 0,95, 0,11, 2,00, 0,53, respectivamente, mientras que los valores encontrados para la línea Lohmann Brown-Classic en ng/dl fueron: 1,54, 0,21, 2,58, 0,49, respectivamente. El valor P del test F es inferior a 0,05, evidenciando diferencia estadísticamente significativa, con una confidencia del 95% para T4 libre entre líneas.

Conclusión. Se observó diferencia estadística para los niveles de T4 libre entre las líneas estudiadas; esto podría explicarse ya que la línea semi-pesada (Lohman Brown-Classic) deposita una mayor cantidad de grasa en el organismo, influyendo en el aumento de los niveles de T4 para esta y no para la línea liviana Hy-Line W-36. Se aportan valores de referencia para las dos líneas comerciales de ponedoras evaluadas.

Palabras clave: gallinas, TSH, T4 libre, metabolismo.

COMPARACIÓN DE LOS NIVELES DE HORMONAS TIROIDEAS ENTRE DOS LÍNEAS DE AVES PONEDORAS

José Henry Osorio1

Diana Marcela Salamanca2

Jorge Enrique pérez3

1 Laboratorio de Investigación en Bioquímica Clínica y patología Molecular. Departamento de Ciencias Básicas de la Salud. Universidad de Caldas. E-mail: [email protected] Departamento de Salud Animal. Universidad de Caldas.3 Laboratorio de Microbiología. Departamento de Ciencias Básicas de la Salud. Universidad de Caldas.

ISSN 1657-9550Recibido: junio 7 del 2011 - Aceptado: septiembre 1 del 2011



José Henry Osorio, Diana Marcela Salamanca, Jorge Enrique pérez

ISSN 1657-9550

COMPARISON OF THYROIDHORMONE LEVELS BETWEEN TWO LINES OF LAYING HENS

ABSTRACT

Objective. To establish reference values for TSH and free T4, in two lines of laying hens (Hy-Line W-36 and Lohmann Brown-Classic),as well as to compare the thyroid hormone levels in serum between those two lines.

Materials and methods. One hundred, 25 weeks of age laying fasting hens serum (50 Hy-Line W-36 and 50 Lohmann Brown-Classic) was obtained and TSH and free T4 levels were measured using enzymatic inmunoessay.

Results. The values obtained for TSH for High-Line W-36 (µUI/ml) were: mean, minimal, maximal, and standard deviation, 0.09, 0.00, 0.82, 0.15 respectively. For the Lohmann Brown-Classic (µUI/ml) the values were, 0.29, 0.00, 4.98, 0.78, respectively. The P value of test F

was greater or equal to 0.05 reason why there is not statistical significant difference, with a 95% confidence for TSH between the lines studied. The free T4 values obtained for Hy-Line W-36 in ng/dl were mean, minimal, maximal, and standard deviation of 0.95, 0.11, 2.00, 0.53 respectively while the values found for the Lohmann Brown-Classic line in ng/dl were 1.54, 0.21, 2.58, 0.49 respectively. The P value for the F test was inferior to 0.05, showing statistically significant difference with a 95% confidence for free T4 between the lines studied.

Conclusion. Statistical difference was observed for free T4 between the two studied lines. This could be explained because the semi-heavy line (Lohman Brown-Classic) deposits a higher quantity of fattening in the organism influencing the increase of T4 levels for this line and not for the light Hy-Line W-36. Reference values for the two laying hens studied lines are presented.

Key words: hens, TSH, free T4, metabolism.

INTRODUCCIÓN

En las aves, la glándula tiroides es la encargada de la producción de las hormonas tiroideas, tanto triyodotironina (T3) como tiroxina (T4). Para que este proceso se lleve a cabo, esta glándula está regulada primeramente por el hipotálamo, donde se produce la hormona liberadora de tirotropina, que ejerce su acción sobre la adenohipófisis permitiendo la liberación de la hormona estimulante de tiroides (TSH) (1). Esta hormona está involucrada en el acoplamiento del yodo obtenido en la dieta y la molécula de tirosina, aminoácido que conforma la tiroglobulina (TGB) formada en la célula folicular (2, 3), unión necesaria para dar origen a las hormonas tiroideas dentro de la glándula (2). Además, actúa sobre las células tiroideas desencadenando la liberación de T3 y T4 desde su almacenamiento en el coloide (4). Seguidamente,

en los tejidos la tiroxina es convertida en triyodotironina, la cual ejerce la actividad biológica (5, 6). En las ponedoras, estas hormonas juegan un papel importante en el metabolismo y el desarrollo embrionario, además son fundamentales para el desarrollo del ovario y la producción de huevo (7). Estas hormonas actúan a través de receptores nucleares implicados en la regulación del eje hipófiso-ovárico y los procesos asociados con el crecimiento y la maduración del folículo (8). Siendo necesarias, también, para el desarrollo del cerebro de las aves (9). Debido a que la elevación o disminución de los valores de estas hormonas afectan los parámetros productivos de las aves comerciales de forma negativa, se crea la necesidad de comparar las líneas genéticas comerciales que se utilizan en nuestro país, tratando de establecer los valores de referencia para T4 libre y TSH en ponedoras.

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Comparación de los niveles de hormonas tiroideas entre dos líneas de aves ponedoras


Gallinas ponedoras de las líneas Hy-Line W-36 y Lohmann Brown-Classic, fueron criadas en la Granja Montelindo, propiedad de la Universidad de Caldas, a una temperatura promedio de 25°C y 13 horas de luz aproximadamente. Fueron alimentadas hasta la semana 24 de edad con una dieta comercial para gallinas ponedoras, junto con todo el lote de aves. Se eligieron completamente al azar las aves a estudiar, manteniéndose en el mismo galpón, y durante las semanas 25 y 26 de edad se alimentaron con una dieta a base de maíz y torta de soya (Tabla 1).

La producción para la semana 26 de las gallinas escogidas (50 de cada línea) fue del 96% en la gallinas Hy-Line W-36, con un peso promedio de 1.444 g, y 98% en las gallinas Lohman Brown-Classic, con un peso promedio de 1.851 g. Se les realizó un ayuno de 16 h y se tomaron 20 cm de sangre directamente de la yugular, a todos los animales a las 8 de la mañana. La sangre se centrifugó a 3000 rpm durante 15 minutos y el suero se congeló a -30°C. Las muestras se llevaron a una temperatura de 37°C por 10 minutos.

Para la determinación del T4 libre se utilizó la prueba de inmunoensayo enzimático competitivo (Accubind T4L, Monobind Inc©); brevemente, los sueros fueron colocados en contacto con una fase sólida que contenía anticuerpos contra la T4 a la cual se le agregó el conjugado compuesto por T4 libre unido a peroxidasa de rábano (HRP); luego de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, se hizo un lavado para liberar aquellas moléculas no unidas y se agregó el substrato formado por una mezcla de tetrametil bencidina (TMB) y peróxido de hidrógeno disuelto en buffer de acetato, con una incubación de 15 minutos, tiempo al cabo del cual se detuvo la reacción al agregarle una solución de ácido clorhídrico 1N. La lectura se hizo en un equipo lector de microELISA (Titertek Multiscan™) a una absorbancia de 450 nm; las absorbancias obtenidas de los estándares

se graficaron junto con las concentraciones, y de la curva de calibración se obtuvieron las concentraciones de T4 libre de las respectivas muestras.

Para la determinación de los niveles de TSH (hormona estimulante del tiroides), se utilizó una prueba de inmunoensayo enzimático colorimétrico tipo sándwich, utilizada para la cuantificación del TSH de origen humano (Accubind TSH-Monobind Inc®); brevemente, a una placa de 96 pozos que tenía unidos anticuerpos monoclonales contra la TSH en una interacción estreptavidina-biotina, se le agregó una alícuota de suero obtenido de ponedoras y una alícuota de conjugado compuesta de un anticuerpo policlonal contra la TSH unido a la peroxidasa de rábano; se incubó dos horas a temperatura ambiente, tiempo al cabo del cual se lavó la placa con una solución de fosfatos para eliminar todas aquellas moléculas no unidas, y se agregó el substrato formado por una mezcla de tetrametil bencidina (TMB) y de peróxido de hidrógeno; gracias a la presencia de la enzima en el complejo inmune previamente formado, se produjo la generación de oxígeno a partir de peróxido de hidrógeno, el cual al actuar sobre la tetrametil bencidina generó un cambio de color cuya intensidad es proporcional a la concentración de la hormona; para detener la reacción enzimática luego de un periodo de incubación de 15 minutos se agregó ácido clorhídrico 1N, y posteriormente se procedió a hacer la lectura en un fotómetro lector de microELISA (Titertek Multiscan™) a una longitud de onda de 450 nm; los resultados obtenidos de los estándares se graficaron frente a sus concentraciones, generándose una curva de calibración en la cual se pudieron obtener las concentraciones de cada uno de los sueros probados.

Para realizar el análisis estadístico, se empleó el programa estadístico Statgraphics Plus, mediante el StatAdvisor, procedimiento que realizó un análisis de la varianza simple, realizando varios tests y gráficos para comparar



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los valores medios (T4 libre, TSH) para 2 diferentes niveles de línea (Hy-Line W-36 y Lohmann Brown-Classic). El F-test en la tabla de ANOVA simple, comprobó la existencia o no de diferencias significativas entre las medias. Para todas las inferencias se estipularon α = 5%, por debajo del cual se rechazó la hipótesis nula de igualdad entre grupos. La probabilidad fiducial se evaluó por intervalos de confianza (IC±95%). Las estadísticas paramétricas incluyen estimadores de tendencia central (media aritmética) y dispersión (desviación estándar).

RESULTADOS

Las Tablas 1 y 2 muestran los valores obtenidos para los niveles de TSH y T4 libre en las dos líneas de ponedoras, respectivamente. Al evaluar los niveles de TSH entre líneas, el valor P del test F es mayor o igual a 0,05, por lo cual no hay diferencia estadísticamente significativa, con una confidencia del 95%. Para T4 libre entre líneas, el valor P del test F es inferior a 0,05, evidenciando diferencia estadísticamente significativa, con una confidencia del 95%.

Tabla 1. Valores de TSH (µUI/mL) en dos líneas comerciales de gallinas ponedoras.

Promedio Mínimo Máximo SD

Hy-Line W-36 0,09 0,00 0,82 0,15

Lohmann Brown-Classic 0,29 0,00 4,98 0,78

Tabla 2. Valores de T4 libre (ng/dL) en dos líneas comerciales de gallinas ponedoras.

Promedio Mínimo Máximo SD

Hy-Line W-36 0,95 0,11 2,00 0,53

Lohmann Brown-Classic 1,54 0,21 2,58 0,49

DISCUSIÓN

Se conoce que las hormonas tiroideas juegan un papel importante para el desarrollo del ovario y la producción de huevo (7, 10). En las aves, estas hormonas son modificadas por diferentes factores como la temperatura ambiental, ya que las aves regulan la producción de hormonas tiroideas según las variaciones ambientales a las que se encuentren sometidas, de esta manera si la temperatura aumenta la secreción disminuye y viceversa (11). La dieta es otro factor importante que puede alterarlas, ya que el yodo es esencial para la formación de estas hormonas, su deficiencia y/o exceso conlleva a la presentación de bocio (aumento de la glándula tiroides) tanto

en aves como en mamíferos. Las manifestaciones clínicas de esta afección están directamente relacionadas con problemas respiratorios como resultado de la presión ejercida por la glándula sobre la tráquea (12). Además, la deficiencia de aminoácidos esenciales limita la síntesis de tiroglobulina glicoproteína esencial para su síntesis, disminuyendo la T3 y T4 circulantes (2); generando así un crecimiento lento (5). Por otro lado, el ayuno provoca en las aves disminución de T3 y TSH y aumento de la T4 (6, 13), esta además se mantiene elevada a nivel hepático después del suministro del alimento (5). Estos cambios son debidos a que durante este estado, la actividad de las deyodasas varía (14).

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Al ser evaluadas las concentraciones de TSH en la hipófisis, se evidencia que su concentración más baja se encuentra 5 horas después de la ovulación y la más alta 20 horas después de la misma, por otro lado el contenido mínimo de tiroxina (T4) en el suero sanguíneo se presenta 10 horas después de la ovulación y el máximo 15 horas después de esta (15). Durante el pico de producción los niveles plasmáticos de T3 y T4 disminuyen, mientras que durante el proceso de muda los niveles de T4 aumentan y los de T3 disminuyen (16). Este periodo se alarga si los niveles de T4 están disminuidos (17). Si a nivel productivo hay un aumento en la densidad de población los valores de las hormonas tiroideas no se ven afectados (16).

Los fotoperiodos, pueden ser causa de cambios en los niveles de hormonas tiroideas. En hembras sometidas a fotoperiodos cortos (8 horas de luz), no se observan cambios significativos en las concentraciones plasmáticas de T3, mientras que al exponerlas a fotoperiodos largos (16 horas de luz) la T3 aumenta, sin que se evidencien cambios en la T4 plasmática en ninguno de los fotoperiodos (18). En nuestro caso, los animales no estuvieron expuestos a fotoperiodos largos, y la toma de muestras se realizó en todos los animales, en horas de la mañana, luego de una exposición a dos horas de luz aproximadamente, buscando con esto evitar el posible efecto de la luz en los niveles de hormonas tiroideas, aunque no encontramos información relacionada con posibles cambios de los niveles de hormonas tiroideas en horas de la mañana.

Se sabe que durante el replume, las concentraciones plasmáticas de T3 aumentan, mas no cambian las de T4; esto demuestra la participación de la T3 al promover la fotosensibilización y disminuir la fotorrefractariedad en la muda inducida por fotoperiodos cortos (18). Se ha evidenciado que no es necesario un cambio en las hormonas tiroideas para que ocurra la fotosensibilización (19). Luego de la fotosensibilización los niveles

de T3 disminuyen y los de T4 aumentan (20, 21) y permanecen estables. Las concentraciones plasmáticas de T3 y T4, en hembras y machos sometidos a fotosensibilización y con una restricción alimenticia, se mantienen estables en hembras, mientras en machos varían semana a semana22. Durante el periodo de oscuridad, la liberación hormonal desde la glándula tiroidea es mucho mayor, aunque la conversión extratiroidea de T4 a T3 se eleva en el periodo de luz. El pico en la concentración plasmática de T4 ocurre en el periodo de oscuridad, mientras que el de la T3 se da en el de luz (1). Asimismo durante el estrés, el cual puede ser causado por múltiples factores como el aislamiento, cambios climáticos, miedo, hambre y manejo, se observa aumento en los niveles de corticosterona la cual afecta el eje tiroideo, induciendo una disminución en las concentraciones plasmáticas de TSH (22, 23).

Los depósitos de grasa estimulan la producción de T3 a partir de la T4, entre más abundantes sean dichos depósitos más elevados estarán los niveles de la T4 total (24, 25); y de T4 libre, en este estudio los resultados indican que hay una diferencia estadística para los niveles de T4 libre entre las líneas comparadas; esto podría explicarse ya que la línea semi-pesada (Lohman Brown-Classic) deposita una mayor cantidad de grasa en el organismo, influyendo en el aumento de los niveles de T4 para esta y no para la línea liviana Hy-Line W-36. La gran mayoría de trabajos encontrados miden valores totales de T3 y T4, del mismo modo, la gran mayoría de determinaciones son hechas en pollos de engorde, bajo múltiples condiciones experimentales, sin embargo, algunos autores (26), han reportado valores de TSH y T4 libre en ponedoras Hisex Brown Line a las 30 semanas de edad, por el método de elctroquimioluminiscencia, con resultados, de alguna manera, similares a los nuestros así: TSH (mU/ml) 0,07±0,006 y T4 libre (ng/dl) 4,35±0,378.



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Los parámetros productivos pueden ser modificados, ya que en las últimas décadas la avicultura ha realizado una selección más minuciosa en cuanto a las líneas genéticas que utiliza. Aunque se les conocía como razas, las gallinas que actualmente hacen parte del sistema productivo son líneas genéticas cuyos nombres comerciales son fijados por las compañías que las producen. La elección que hace el productor a la hora de usar una u otra línea, se basa en los estudios previos que se tengan de las mismas y su eficiencia productiva con respecto a las demás líneas existentes, esto lo demuestran claros estudios que comparan diferentes factores entre líneas no solo de ponedoras sino también de pollos de engorde (16, 27, 28). Esta selección genética afecta no solo los rasgos de producción, sino también el patrón de desarrollo del embrión y su metabolismo (29, 30).

CONCLUSIÓN

Debido a que la elevación o disminución de los valores de hormonas tiroideas afecta los parámetros productivos de las aves comerciales de forma negativa (cuando los niveles de T4 aumentan o disminuyen se produce un cese de la producción de huevo, efecto que puede ser transitorio) (28, 29), se hace necesario comparar líneas genéticas, en nuestro caso líneas comerciales que se utilicen en nuestro país, abriendo las puertas a nuevos estudios que corroboren los cambios bioquímicos y fisiológicos de las hormonas tiroideas al implicar en ellos todos estos factores que las alteran. Con lo cual, se lograrán establecer los valores de referencia del perfil tiroideo específicamente T4 libre y TSH para las líneas Hy-Line W-36 y Lohman Brown-Classic. Se crea así, la iniciativa de seguir experimentando con las demás líneas y con todos los posibles factores que las pueden modificar para conseguir el mejor rendimiento en producción aviar.

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BIBLIOGRAFÍA

1. Anne Mcnabb FM. Sturkie’s avian physiology. 5 ed. USA: Academic press; 1999. p. 455-10. 2. Dickson WM, Feldman EC, Hedge GA, Martin R, McDonald LE. Fisiología veterinaria cunningham. In:

Cunningham JG, editors. Las glándulas endocrinas y su función. 3 ed. Madrid: Elsevier España S.A.; 2003. Chapter 33, p. 342-42.

3. Banks WJ. Histología veterinaria aplicada. 1 ed. Ciudad de México: El Manual Moderno S.A. de C.V.; 1986. p. 583-8.

4. Lumeij, J. T. Endocrinology. In: Ritchie, B. W., G. J. Harrison, and L. R. Harrison, editors. Avian Medicine: principles and Application. Lake Worth, Florida: Wingers publishing; 1994. p. 582-606.

5. Reyns GE, Janssens KA, Buyseb J, Kühn ER, Darras VM. Changes in thyroid hormone levels in chicken

liver during fasting and refeeding. Comparative Biochemistry and physiology 2002; 132:239-6.

6. Decuypere E, Van Asa p, Van der Geyten S, Darras VM. Thyroid hormone availability and activity in avian species: A review. Domestic Animal Endocrinology 2005; 29:63-14.

7. Winchester CF. Influence of thyroid on egg production [Abstract]. Endocrinology 1939; 24(5):697-4.

8. Sechman A, pawlowska K, Rzasa J. Thyroid hormone receptor expression in chicken ovarian follicles. Domestic Animal Endocrinology 2009; 37:61-12.

9. Darras VM, Van Herck SLJ, Geysens S, Reyns GE. Involvement of thyroid hormones in chicken embryonic brain development. General and Comparative Endocrinology 2009; 163:58-4.

10. Blivaiss BB. Development of secondary sexual characters in thyroidectomized brown Leghorn hens. Journal of Experimental Zoology 1947; 104(3):267-42.

11. Silva JE. The thermogenic effect of thyroid hormone and its clinical implications. Annals of Internal Medicine 2003; 139:205-8.

12. Macwhirter p. Avian Medicine: principles and application. In: Ritchie BW, Harrison GJ, Harrison LR,

editors. Malnutrition. Lake Worth, Florida: Wingers publishing; 1994. Chapter 31, p. 859.

13. Julian RJ. production and growth related disorders and other metabolic diseases of poultry: A review. The Vet Jour 2005; 169:350-19.

14. Gyorffy A, Sayed-Ahmed A, Zsarnovszky A, Frenyó Vl, Decuypere E, Bartha T. Effects of energy

restriction on thyroid hormone metabolism in chickens. Acta Vet Hungarica 2009; 57(2):319-11.

15. Soliman FA, Saleh SY. Thyroid-Ovary Relationship in Laying Hens. Zentralblatt für Veterinärmedizin 1980; 27(7):544-10.

16. Davis GS, Anderson KE, Carroll AS. The effects of long-term caging and molt of single comb white

leghorn hens on herterophil to lymphocyte ratios, corticosterone and thyroid hormones. poult Sci 2000; 79:514-4.

17. Hangalapura BN, Nieuwland MGB, Buyse J, Kemp B, parmentier HK. Effect of duration of cold stress

on plasma adrenal and thyroid hormone levels and immune responses in chicken lines divergently selected for antibody responses. poult Sci 2004; 83:1644-5.

18. Siopes TD. Circulating thyroid hormone levels in recycled turkey breeder hens during a short day prelighting period and renewal of photosensitivity for egg production. poult Sci 2002; 81:1342-4.



ISSN 1657-9550

19. proudman JA, Siopes TD. potential role of thyroid hormones and prolactin in the programming of photorefractoriness in turkey hens. poult Sci 2006; 85:1457-4.

20. proudman JA, Siopes TD. Relative and absolute photorefractoriness in turkey hens: profiles of prolactin, thyroxine, and triiodothyronine early in the reproductive cycle. poult Sci 2002; 81:1218-5.

21. proudman JA, Siopes TD. Thyroid hormone and prolactin profiles in male and female turkeys following photostimulation. poult Sci 2005; 84:942-4.

22. Geris KL, Berghman LR, Kühn ER, Darras VM. The drop in plasma thyrotropin concentrations in fasted chickens is caused by an action at the level of the hypothalamus: role of corticosterone. Domestic Anim Endocrinol 1999; 16(4):231-6.

23. Hudelson KS, Hudelson p. Endocrine considerations. In: Harrison GJ, Lightfoot TL, eds. Clinical avian medicine. Internet publisher: international veterinary information service, Ithaca NY; 2009.

24. D´Andre Hirwa C, Yan W, Wallace p, Nie Q, Luo C, Li H, Shen X, Sun L, Tang J, Li W, Zhu X, Yang G, Zhang X. Effects of the thyroid hormone responsive spot 14α gene on chicken growth and fat traits. poult Sci 2010; 89:1981-10.

25. Ferrini G, Manzanilla E.G, Menoyo D, Esteve-Garcia E, Baucells M.D, Barroeta A.C. Effects of dietary n-3 fatty acids in fat metabolism and thyroid hormone levels when compared to dietary saturated fatty acids in chickens. Livestock Science 2010; 131:287-5.

26. Bobinienė R. Gudavičiūtė D. Miškinienė M. The impact of iodine on biochemical blood parameters in laying hens. Vet Med Zoot 2010; 51(73):3-7.

27. Tona K, Onagbesan OM, Jego Y, Kamers B, Decuypere E, Bruggeman V. Comparison of embryo physiological parameters during incubation, chick quality, and growth performance of three lines of broiler breeders differing in genetic composition and growth rate. poult Sci 2004; 83(3):507-6.

28. Druyan S. The effects of genetic line (broilers vs. layers) on embryo development. poult Sci 2010;

89:1544-4.

29. Lien RJ, Siopes TD. Effects of short-term thyroxine administration during the laying period on egg production and moulting by Turkeys. Brit poult Sci1993; 34 (2): 405-416.

30. Lien RJ, Siopes TD. Effects of thyroidectomy on egg production, molt, and plasma thyroid hormone concentrations of turkey hens. poult Sci 1989; 68(8):1126-32.

ARTÍCULOSDE REVISIÓN

RESUMEN

La presente revisión presenta los cambios fisiológicos que presentan los bovinos durante el estrés agudo, así como los biomarcadores sanguíneos utilizados para medir su impacto en el bienestar animal. Durante el presacrificio, el ganado es expuesto con frecuencia a diferentes factores que causan agotamiento físico y estrés fisiológico, los cuales pueden tener efectos adversos para la salud, el bienestar animal y la calidad de la carne. Los más comunes factores son: velocidad y movimientos bruscos del camión, ruido, fuerza centrífuga, ruptura de la estructura social debido a la mezcla de animales, ambiente extraño, manejo rudo de los bovinos durante el cargue y descargue, condiciones climáticas, privación de alimento y agua, entre otros. El estrés ha sido utilizado como un indicador de bienestar animal. Este altera la homeostasis interna de los animales induciendo cambios en la actividad del eje hipotálamo-pituitaria-adrenocortical (HPA) y el sistema simpático-adreno-medular. La activación endocrina promueve la liberación de varias hormonas: catecolaminas, especialmente adrenalina y noradrenalina; hormona liberadora de corticotropina (CRH); hormona adrenocorticotrópica (ACTH) y corticosteroides, principalmente cortisol. Diferentes autores han utilizado distintos constituyentes sanguíneos para determinar el estrés. El cortisol, a pesar de su variabilidad y vida corta, sigue siendo

uno de los indicadores más usados. Estos autores también han usado el volumen celular acumulado (VGA), la concentración de glucosa, la actividad de la enzima creatinfosfoquinasa (CK), las concentraciones de ß-hidroxibutirato y lactato, como indicadores de estrés. La determinación de estos biomarcadores es un método práctico para monitorear el bienestar animal en ganado bovino de carne.

Palabras clave: catecolaminas, cortisol, fisiología del estrés, presacrificio.

STRESS BIOMARKERS AS INDICATORS OF ANIMAL

WELFARE IN CATTLE BEEF FARMING

ABSTRACT

The present review presents the physiological changes that occur in cattle during acute stress, as well as blood biomarkers used to measure their impact on animal welfare. During the pre-slaughter process, cattle are often exposed to different factors that cause physical exhaustion and physiological stress which can have adverse effects on health, animal welfare, and meat quality. The most common stressors are: fast and forced movements of the truck, centrifuged force, breakdown of the social structure due to mixing of the animals, strange environment,

BIOMARCADORES DE ESTRÉS COMO INDICADORES DE BIENESTAR ANIMAL EN GANADO DE CARNE

Marlyn Hellen Romero peñuela1

Luis Fernando Uribe-Velásquez1

Jorge Alberto Sánchez Valencia1

1 profesores Departamento Salud Animal, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Caldas, Calle 65 No. 26-10, Manizales. Tele-fax: 8781516. E-mail: [email protected], [email protected], [email protected]

ISSN 1657-9550Recibido: abril 28 de 2011 - Aceptado: julio 18 de 2011



Marlyn Hellen Romero peñuela, Luis Fernando Uribe-Velásquez, Jorge Alberto Sánchez Valencia

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rough treatment of cattle during loading and unloading, weather conditions, deprivation of feed and water among others. Stress has been identified as an indicator of animal welfare. Stress alters the internal animal homeostasis inducing changes in the hypothalamic-pituitary-adrenocortical (HPA) axis and the sympatho-adreno-medullary system. The endocrine activation promotes the release of several hormones: catecholamines, mainly adrenaline and noradrenaline; corticotrophin-releasing hormone (CRH); adrenocorticotrophin (ACTH) and corticosteroids, mainly cortisol. Different

authors have used several blood constituents to determine stress. Cortisol, despite its variability and short life, is still one the most used indicators of stress. These authors have also used the packed cell volume (PCV), glucose concentration, creatine phosphokinase (CK) activity, ß-hidroxybutyrate and lactate concentration as stress indicators. The determination of these biomarkers is a practical method to monitor animal welfare in cattle beef.

Key words: catecholamines, cortisol, stress physiology, preslaughter.

INTRODUCCIÓN

Las actividades previas al sacrificio incluyen las prácticas y condiciones aplicadas al bovino durante el período comprendido entre la movilización y el transporte, desde la granja hasta su ingreso al cajón de insensibilización en la planta de sacrificio (1). Durante este período los animales son sometidos a factores desencadenantes de estrés que incluyen: a) incremento del manejo, recolección y arreo con elementos punzantes o con tábano eléctrico; b) mezcla de bovinos de diferente procedencia y contacto con personal extraño; c) transporte y desafíos físicos como rampas, superficies resbaladizas, densidad de carga, movimiento, ruido y vibración del vehículo; d) contacto con ambientes nuevos y no familiares; e) privación de alimento y agua; f) cambios en la estructura social; g) cambios en las condiciones climáticas como temperatura, radiación y humedad; h) imposibilidad de descanso; i) métodos inapropiados durante el sacrificio (insensibilización y sangría), entre otros aspectos (2, 3, 4, 5). Estos factores desencadenan reacciones inevitables en el ganado que se traducen en estrés físico, fisiológico y psicológico (6, 7) afectando el bienestar animal (BA). El primero se genera por el esfuerzo físico de los bovinos durante el arreo, el cargue y descargue del

camión, así como el intento para mantenerse en pie durante el movimiento del vehículo. El estrés fisiológico puede ser medido en términos de cambios de la homeostasis del animal, por la privación de alimento y agua, la capacidad de utilizar sus reservas en el mantenimiento de la temperatura corporal y actividad física, o para superar alguna lesión o enfermedad. El psicológico, es el percibido por la conciencia animal, siendo por lo tanto difícil de medir (8, 9).

La alteración del BA producido por un desafío ambiental, puede ser evaluado en dos niveles: en primer lugar, la magnitud de las respuestas fisiológicas y de comportamiento y, en segundo lugar, el costo biológico de estas respuestas (10, 11). La medición objetiva del BA es un proceso complejo, siendo necesario combinar indicadores fisiológicos, productivos y etológicos relacionados con la presencia de estrés. Las variables fisiológicas pueden ayudar a entender el costo biológico de la adaptación de los bovinos a los procesos del manejo previo en la finca, durante el transporte, descargue, permanencia en el frigorífico y durante el sacrificio (insensibilización y sangría) (6, 12). Así mismo, la identificación de biomarcadores de la condición fisiológica o de la predisposición a la enfermedad en los animales, puede aumentar la habilidad de los médicos veterinarios para

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Biomarcadores de estrés como indicadores de bienestar animal en ganado de carne

prevenir brotes de afecciones como la fiebre de embarque, en bovinos de reemplazo que ingresen al hato y que han sido expuestos al estrés del transporte (4, 13). El objetivo de la presente revisión consiste en describir los cambios fisiológicos que presentan los bovinos durante el estrés agudo, los biomarcadores sanguíneos utilizados para medir su impacto en el bienestar animal y la relación de los biomarcadores con la calidad de carne bovina (BA).

Estrés y bienestar animal

El concepto de BA está basado en la relación armoniosa del animal con el medio. En esta relación, entran a jugar un papel importante su estado físico y psicológico, así como la capacidad de entrar en funcionamiento los sistemas de reparación del cuerpo, las defensas inmunológicas, la respuesta al estrés fisiológico y a una variedad de respuestas de comportamiento (10, 14). Se han descrito como condiciones básicas que aseguran el BA, cinco componentes que se han denominado “las cinco libertades”: a) libre de hambre, sed o un nivel de nutrición insuficiente; b) no presentar dolor, heridas o enfermedad; c) libre de temor o angustia; d) no presentar incomodidad; e) libre de manifestar un comportamiento natural; las cuales deben regir el BA (15). El concepto de calidad de vida de los bovinos no solo incluye la ausencia de sufrimiento, sino también la calidad de las relaciones de estos con el ambiente de manera que puedan satisfacer sus necesidades preferenciales (16, 17).

El estrés ha sido utilizado como indicador de la pérdida de BA (18), y es definido como la acción de estímulos nerviosos y emocionales provocados por el ambiente sobre los sistemas nervioso, endocrino, circulatorio y digestivo de un animal, produciendo cambios medibles en los niveles funcionales de estos sistemas, en especial, altera la homeostasis interna induciendo cambios en la actividad del sistema nervioso autónomo y el eje hipotálamo-pituitaria-adrenocortical-

HPA (14). Se ha denominado “diestrés”, cuando la repuesta del animal al factor estresante provoca riesgos a su bienestar y su vida (19). De acuerdo con la duración y sus efectos, el estrés puede ser agudo (transitorio) o crónico (de largo efecto). En cualquier caso, una vez que el sistema nervioso central percibe una amenaza, se desarrolla una respuesta que consiste en una combinación de las cuatro respuestas generales de defensa biológica: comportamiento, sistema nervioso autónomo, inmune y neuroendocrino. A pesar de que los cuatro sistemas biológicos de defensa están disponibles para que el animal responda a un factor estresante, no todos los cuatro son necesariamente utilizados contra todos los factores de estrés. En particular, la homeostasis se mantiene cuando solo los dos primeros mecanismos están involucrados; por el contrario, cuando los cuatro mecanismos de defensa han sido implicados, algunas de las funciones biológicas pueden verse modificadas adversamente y los animales estarán en peligro (20).

Dentro de la respuesta neuroendocrina tienen vital importancia los sistemas simpático/suprarrenal (SS) y el HPA, donde la activación de cualquiera de los dos depende del factor estresante que está produciendo el estímulo (8, 21). En la activación del primero, denominado “síndrome de emergencia”, el organismo se prepara para hacer frente a peligros súbitos generando una respuesta de carácter rápida y breve, que conlleva a la activación neuronal del hipotálamo y la liberación de adrenalina desde la médula adrenal, así como noradrenalina de las fibras nerviosas del locus coeruleus (LUC-NE), región localizada en el tronco cerebral. Estas catecolaminas son las encargadas de poner al animal en estado de alerta, preparándolo para luchar o huir, provocando un aumento de la frecuencia cardiaca, vasoconstricción periférica, aumento de la glicemia, dilatación pupilar, hiperventilación y aumento del volumen sanguíneo (22). En el eje HPA, los centros cognitivos del cerebro como la corteza cerebral, al percibir amenazas externas inician los



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mecanismos de respuesta vía señales nerviosas que activan la liberación del factor liberador de corticotropina (CRH) y la vasopresina, especialmente en el núcleo paraventricular del hipotálamo (23). La CRH es liberada por terminales de axones que se proyectan hacia la región de la eminencia media, y es transportada por el sistema sanguíneo portal hipofisiario hacia la hipófisis anterior estimulando la liberación de la hormona adenocorticotrópica (ACTH), la cual es liberada al torrente sanguíneo para estimular la síntesis y secreción de glucocorticoides (GC), especialmente cortisol desde la corteza adrenal, cuya secreción es pulsátil, con una periodicidad de 90 minutos (19). Simultáneamente, se estimula la liberación de catecolaminas (adrenalina, noradrenalina y dopamina) desde la médula adrenal, así como hormonas tiroideas (20, 23). Por su parte, el cortisol aumenta la disponibilidad de energía y las concentraciones de glucosa en la sangre, porque estimula la proteólisis, lipólisis, la

gluconeogénesis en el hígado aumentando la síntesis de enzimas implicadas en la conversión de aminoácidos, glicerol y lactato en glucosa, aumentando la movilización de los aminoácidos desde el músculo (24). También disminuye el transporte de glucosa y su utilización por las células, produciendo una elevación de la concentración de glucosa sanguínea hasta un 50% sobre el nivel normal (véase la Figura 1) (20, 22). En esta compleja respuesta fisiológica se presenta un proceso de retroalimentación negativa, permitiendo que el cortisol actúe sobre el hipotálamo y la hipófisis disminuyendo la producción de CRH y ACTH (22). En esta etapa el organismo intenta adaptarse o afrontar la presencia de los factores que percibe como amenaza, en donde se presenta una normalización de los niveles de corticosteroides y, por ende, la desaparición del estado de estrés, etapa que se ha denominado “de resistencia o relajación” (19, 25).

ESTRÉS

Respuesta neuroendocrinaSISTEMA SIMPÁTICO SUPRARENAL

EJE HPA

MÉDULA ADRENAL

Respuesta de lucha o huida

CRH, VASOPRESINA

HIPÓFISIS

CORTEZA ADRENAL

Cortisol

Activa vías metabólicas energéticas concentraciones de glucosa

sanguíneaProteólisis, lipólisis, gluconeogénesis

Inhibe la liberación de insulina

Estado de alerta, bradicardia,Vasoconstricción periférica,Hiperglucemia, midriasis,

Hiperventilación, Aumento del gasto cardiaco

Adrenalina

LUC-NE

NoradrenalinaACTH

Figura 1. Esquema de la respuesta general del estrés.

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El estrés crónico consiste en un estado de activación fisiológica en curso, que se presenta cuando el cuerpo experimenta estrés por varios factores o la exposición repetida a los mismos estresores agudos, etapa en la cual el sistema nervioso autónomo rara vez tiene la oportunidad de activar la respuesta de relajación. En este caso, se presenta una sobreexposición a las hormonas del estrés, que produce un costo biológico suficiente para alterar las funciones biológicas y producir diestrés. El estrés crónico coincide con un estado de larga duración en el animal, como un problema de salud grave, que no permite su recuperación satisfactoria, en donde la intensidad y duración del sufrimiento contribuye a la severidad de la respuesta del animal. Por lo tanto, el estrés crónico es una condición de mala adaptación que puede estar asociada con una reducción directa en el nivel de bienestar. Por otra parte, esta condición puede afectar la susceptibilidad a las enfermedades, o favorecer su progresión (20).

Aunque la respuesta al estrés es muy variable y dependiente de la capacidad de cada animal para responder, resulta evidente que si el agente estresante actúa por largo tiempo (transporte y ayuno prolongado), el efecto encontrado será mayor, sea alta o baja la capacidad de respuesta de cada animal. Por ello, mientras más largo son los tiempos de transporte y ayuno, mayores probabilidades existen de presentar estrés,

afectando negativamente el bienestar de los animales, aumentando las pérdidas de peso de la canal, mayor presencia de contusiones y efectos negativos en la calidad de la carne como la aparición de corte oscuro, que se caracteriza por la presentación de carnes de consistencia dura, color rojo oscuro y apariencia seca. Estas carnes por su pH alto, favorecen la proliferación de microorganismos y, por lo tanto, tienen una vida útil más corta (26).

Biomarcadores del estrés

Existe una variedad de parámetros de comportamiento, fisiológicos, bioquímicos, inmunológicos y patológicos que han sido propuestos para evaluar la capacidad de respuesta de los animales ante el estrés agudo (Tabla 1). Dentro de los biomarcadores descritos sobresalen la medición de cortisol y progesterona, las concentraciones de albúmina plasmática, urea, globulina, proteínas totales, la actividad de creatinfosfoquinasa (CK), ß-hidroxibutirato (ß-OHB), haptoglobina, fibrinógeno, el volumen celular acumulado (VCP) y el conteo de leucocitos (27). Amtmann et al. (26) reportan que las variables anteriormente descritas se utilizan como indicadores de estrés, especialmente cuando se están comparando valores previos y posteriores a un determinado manejo que se cree induce estrés.



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Tabla 1. Principales indicadores de estrés agudo en bovinos, que permiten evaluar el bienestar animal durante el transporte. Adaptado de Knowles & Warriss (28).

Indicadores Índices referenciaComportamiento Vocalización, agitación, lucha, dejar de avanzar,

erizamiento y temblor.(14, 16, 18, 21, 29)

Fisiológicos Hipertermia-hipotermia: incremento y variabilidad de tasa cardiaca, presión sanguínea, tasa respiratoria, transpiración, temperatura corporal.

(16, 18, 30)

Estrés fisiológico: mortalidad.

Debilidad: aumento vasopresina.

Marcadores de miedo/excitación: aumento tasa cardiaca.

Desempeño Reducción del rendimiento de leche, interferencia con la deyección láctea.

(22)

Medidas endocrinas Incremento de cortisol, oxitocina, catecolaminas (epinefrina y norepinefrina), CRH, ACTH, vasopresina, ß-endorfinas.

(30)

M a r c a d o r e s bioquímicos

Índices de privación de alimento: incremento de Ac. Grasos no esterificados, ß-hidroxibutirato, urea. Disminución de glucosa.

(8, 16, 18, 26, 3132)

Indicadores de deshidratación y/o hemoconcentración: incremento de la osmolaridad, VGA, proteína total, albúmina.

Índices de esfuerzo físico: incremento de CK, lactato, lactato deshidrogenasa.

Índices de miedo/excitación y la liberación de catecolaminas: aumento VGA, glucosa, urea, ß-HOB.

Indicadores de ayuno: peso vivo, ß-HOB, Ac. Grasos libres, glucógeno muscular.

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Cortisol

El cortisol, a pesar de su variabilidad y corta vida, es uno de los biomarcadores más utilizados para evaluar el estrés experimentado por animales, aunque el aumento de su concentración plasmática solo sería un indicador neuroendocrino primario (31). Las mediciones de los niveles de cortisol basal y de su variación después de la exposición a un factor estresante, son buenos biomarcadores para la evaluación de estrés crónico. Sin embargo, se puede encontrar aumentado en procesos de estrés agudo, mostrando variaciones antes y durante el diestrés, relacionándose con mala-adaptación, especialmente cuando se presentan fallas para restablecer la homeostasis o tras un estrés repetido (20). Las concentraciones de cortisol plasmático se aumentan cuando los animales son expuestos a condiciones adversas como el aislamiento, la restricción de movimiento, reagrupamiento y transporte, pobres condiciones de rodamiento y transporte intermitente (12). Los niveles de cortisol basal en plasma se encuentran por debajo de 10 ng/ml, pero se ha descrito que fluctúa en un rango entre 0 y 20 ng/ml (19). La interpretación de los niveles basales de cortisol se dificulta porque se afecta por múltiples factores, incluyendo los siguientes: el ritmo circadiano (concentraciones aumentadas en la mañana y baja en la tarde), aunque estudios recientes han indicado que el ritmo circadiano en bovinos es débil; otros factores como el muestreo, la restricción de movimiento, la lactancia, el coito, el ordeño, el grado de habituación, otras hormonas (p.e. la vasopresina puede potenciar la secreción de ACTH) y las infecciones, así como las endotoxinas (20, 25, 33). Es bien conocido que el ganado muestra bajos niveles de cortisol después de la exposición repetida a un factor estresante, y la habituación a este depende del tipo de estresor, su intensidad, la duración y experiencias previas individuales; por esta razón, no todos los individuos responden de la misma forma ante cambios ambientales (10, 34). Teniendo en cuenta estas dificultades, en especial cuando el análisis de cortisol se realiza en sangre, se han propuesto diferentes muestras biológicas para su análisis como heces, orina y saliva; sin

embargo, su interpretación se puede dificultar porque los niveles de cortisol en estos materiales pueden ser más bajos que en sangre (p.e. cerca de 10 veces menos en saliva), la hormona puede ser conjugada antes de la excreción (p.e. en orina y heces), o puede ser transformada por bacterias en el intestino. Sin embargo, se ha considerado promisoria la evaluación de cortisol en heces acompañadas de otros biomarcadores fisiológicos y de comportamiento, porque proporciona una medición integrada de la producción de hormonas durante un período de tiempo prolongado (35, 36). La medición del cortisol es dependiente del tiempo porque requiere entre 10 y 20 minutos para alcanzar valores máximos y tiene una vida media de 60 minutos, eliminándose principalmente por el hígado (27, 37, 38). En la Tabla 2 se presentan algunas ventajas y desventajas de los métodos para medir cortisol en los bovinos.

Se ha sugerido que las manifestaciones conductuales de los animales ante un agente estresor están íntimamente asociadas con el incremento de cortisol, debido a que sus receptores se encuentran localizados en regiones específicamente involucradas con la regulación hormonal (hipotálamo e hipófisis) y particularmente con el sistema límbico, que juega un papel relevante en las conductas emocionales, por lo tanto, las concentraciones plasmáticas de cortisol, en combinación con las mediciones de glucosa y CK, han sido usadas como un confiable indicador de estrés físico agudo y estrés emocional; este último, causado por el ruido durante el cargue y descargue, vibración del vehículo durante el transporte del ganado y cambios en la estructura social (40).

Debido a la alta variabilidad de los niveles plasmáticos de cortisol, no se recomendaría hacer comparaciones absolutas entre los diferentes estudios que evalúan las condiciones de estrés previas al sacrificio de bovinos de abasto público, requiriéndose para tal efecto, la medición de los niveles basales para realizar comparaciones antes y después del evento a evaluar (transporte, estadía en planta, sacrificio, entre otros).



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Tabla 2. Ventajas y desventajas de medir cortisol o sus metabolitos en los fluidos más usuales para su evaluación (31, 35, 39).

Muestras Ventajas DesventajasSangre - Muestra más usada en estudios de

BA.- El nivel sérico de cortisol aumenta en minutos y permanece elevado durante horas. - Medición directa del cortisol. - Permite hacer la medición de otros biomarcadores de estrés que se evalúan en suero o plasma.

- Invasivo.- Sus niveles son influenciados por el manejo, la restricción y manipulación.- Se puede presentar una disminución de las concentraciones sanguíneas porque los animales se tornan refractarios al estímulo estresante.

Saliva - No invasivo.- El cortisol presente en forma libre y no unido a proteína.

- Concentración menor al 10% del valor en sangre.- Problemas de contaminación con alimento o fluido ruminal durante la recolección de la muestra.- Manipulación excesiva. - Baja sensibilidad y especificidad de la técnica.- Posibles lesiones bucales durante la recolección de la saliva (ovinos y caprinos).

Leche - No invasivo.- Medición directa.- Útil en ganado lechero.- Se correlaciona altamente con las concentraciones plasmáticas.

- Manipulación de los animales. - Las condiciones climáticas pueden afectar la secreción. - Concentración menor al (4 y 10%) del valor en plasma.

Orina - No invasivo.- S e p u e d e m e d i r p o r radioinmunoanálisis (RIA) o por cromatografía líquida con UV.- Permite medir catecolaminas y sus metabolitos.- Mayor uso en porcinos y ovinos.

- Niveles de cortisol muy bajos.- La hormona es conjugada antes de la secreción.- En bovinos y equinos se dificulta la obtención de la muestra.- Se presenta un retraso entre la liberación de cortisol y su excreción.- La muestra debe ser recogida a lo largo del día.

Heces - No invasivo.- Útil para la medición de estrés en animales silvestres.- Se puede medir por la técnica ELISA.

- Se presenta un retraso entre la liberación de cortisol y su excreción.- La muestra debe ser recogida a lo largo del día. - Tener en cuenta el volumen de las heces para el muestreo y el tránsito intestinal.- Las concentraciones presentan fluctuaciones diurnas. - Validar la técnica según la especie y el sexo.- Congelar la muestra a -20oC inmediatamente después de obtenerla hasta su procesamiento.

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El volumen celular acumulado (VGA)

El VGA o hematocrito es el porcentaje del volumen sanguíneo ocupado por células, principalmente eritrocitos; el excedente está conformado por fluido y la diferencia permite tener una aproximación del volumen plasmático. El VGA permite evaluar la alteración de electrolitos y fluidos, siendo considerado como un indicador moderadamente bueno de estrés (41). El transporte, el ayuno y la baja ingesta de agua producen un aumento del VGA, teniendo en cuenta que el valor promedio para bovinos es de 28 a 38% (28). La principal función del bazo de los mamíferos es almacenar glóbulos rojos, los cuales son fácilmente liberados en respuesta a una excitación o factor estresante (42). El aumento de VGA durante el ayuno se puede deber al movimiento de fluidos fuera del compartimiento vascular y a la contracción esplénica durante el estrés, inducida por actividad nerviosa simpática o por catecolaminas circulantes (28, 31). Se ha descrito como valioso el uso de la proteína total y de albúmina plasmáticas en relación con el VGA cuando se desea evaluar los niveles de hidratación. Se supone que la cantidad de proteína total presente en el plasma sigue siendo la misma, por lo tanto, las proteínas totales y albúmina plasmáticas deben mostrar el mismo tipo de cambio, si este se debe a la deshidratación y no a un efecto de la dieta. Se ha reportado también que cuando el estrés es crónico el VGA puede estar disminuido (43). Es necesario tener en cuenta que este parámetro se puede aumentar durante la sangría por contracción esplénica, debido a la acción de las catecolaminas secretadas en ese momento (35).

Indicadores de ayuno

El peso vivo, el ß-hidroxibutirato, los ácidos grasos libres y el glucógeno muscular son indicadores de ayuno (44). Una vez el bovino es privado de alimento y agua, recurre a sus reservas de energía, que se encuentran principalmente en forma de lípidos, especialmente triacilglicerol o triglicéridos,

a partir de los cuales se obtienen glicerol y ácidos grasos libres o no-esterificados; estos últimos son transportados unidos a proteínas a la sangre. Los triglicéridos son sintetizados principalmente en el hígado, tejido adiposo e intestino delgado. Si la cantidad de grasa movilizada excede la capacidad de oxidación del hígado se produce un incremento de los cuerpos cetónicos como el ß-OHB, acetona y acetato, que son el producto del metabolismo energético de los bovinos. Estos cuerpos cetónicos funcionan como sustitutos energéticos aportando un 60 a 80% de la energía de la dieta de los rumiantes (28, 31). Durante el ejercicio la glucosa, los cuerpos cetónicos y los ácidos grasos libres son usados totalmente. Después de este proceso, la oxidación de cetona muscular se reduce y se aumentan los niveles de ácidos grasos libres y ß-OHB hasta seis veces por encima de los valores previos al ejercicio, sin embargo, unos minutos inmediatamente después del ejercicio intenso estos valores pueden disminuir momentáneamente como un ajuste metabólico. Los valores promedio de la concentración de ß-OHB en sangre bovina son de 0,02 a 0,46 mmol/L. Cuando estos niveles basales aumentan, los bovinos tardan entre uno a dos días para alcanzar nuevamente su valor normal (28). El ß-OHB no es un buen indicador de estrés agudo. Así mismo, se ha indicado que durante las primeras 24 h de transporte el ß-OHB puede disminuir, debido a la utilización del “pool” circulante aportado por el rumen. Las concentraciones plasmáticas de este cuerpo cetónico se pueden ver afectadas por la variabilidad animal y la alimentación previa recibida por los bovinos antes del sacrificio (en la finca), motivo por el cual se pueden encontrar valores contradictorios de este indicador en diferentes investigaciones que lo han evaluado (41).

Glucosa

Debido a la acción de las catecolaminas (adrenalina y noradrenalina) liberadas desde las glándulas adrenales hacia la circulación sanguínea durante la respuesta inicial al estrés,



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se incrementa la frecuencia cardíaca y la presión sanguínea, y se estimula la gluconeogénesis hepática, lo cual incrementa la disponibilidad de glucosa plasmática (glicemia) en minutos. Este proceso también es producido por el cortisol y por hormonas específicas que participan en la regulación de la glucosa, como el glucagón y la insulina (42). Dentro de la respuesta al estrés los niveles de cortisol activan la glicólisis hepática, la gluconeogénesis e incremento del catabolismo de las proteínas libres (28, 31). Por lo anterior, se ha descrito que la concentración de glucosa es un buen indicador indirecto de estrés (31). La concentración de glucosa sanguínea en bovinos es de 3,0 a 4,4 mmol/L (28). Se ha descrito, que cuando los bovinos son transportados bajo condiciones climáticas de baja temperatura, se puede presentar un incremento de la concentración plasmática de glucosa debido al frío y no a las condiciones de manejo previas al sacrificio (4).

Creatín fosfoquinasa (CK)

Esta enzima muscular cataliza la reacción para obtener adenosín trifosfato (ATP) a partir del adenosín difosfato (ADP) más el fosfato de creatinina en la mitocondria (28, 37). El transporte prolongado es un factor extenuante; los bovinos tienen que mantener el balance y el contacto entre bovinos produce fatiga y contusiones, que afectan la permeabilidad de la membrana celular y la liberación de CK hacia el torrente sanguíneo. De igual forma, los niveles basales de CK se pueden aumentar debido al ayuno y al ejercicio, siendo mayor el incremento durante la insensibilización y sangría (44, 45). La enzima es ampliamente evaluada porque es órgano-específica, es decir, permite identificar el tejido que la está produciendo, debido a que presenta cuatro isoformas diferentes (28, 40). Los valores de referencia de CK para el bovino son de 35-280 U/L (46).

Lactato

Independientemente del tiempo de transporte y de permanencia en la planta de sacrificio, el

lactato es considerado un indicador de estrés, relacionado especialmente con las condiciones de manejo de los animales, especialmente de ejercicio físico (47). Una vez el músculo esquelético entra en estado de hipoxia durante el ejercicio o la fatiga, se activa la vía anaerobia de la glicólisis interrumpiéndose la entrada del piruvato al ciclo de Krebs para la obtención de ATP; se desvía hacia la formación de lactato o ácido láctico que satura el ciclo de Cori, produciendo unos ácidos de origen metabólico dentro de la fibra muscular, siendo liberado desde las células musculares a la circulación sanguínea. Por lo anterior, la concentración plasmática de lactato es utilizada como indicador de actividad física, agotamiento y daño muscular durante el presacrificio (47, 48). Se ha demostrado que el manejo y transporte presacrificio de los bovinos, causa incrementos significativos en las concentraciones plasmáticas o séricas del lactato, siendo mayor su recuento durante la sangría, debido quizás, a aumentos en los niveles de catecolaminas (31). Los valores promedio de lactato plasmático se encuentran en el rango de 0,6-2,2 mmol/L. El lactato es un indicador de estrés agudo, durante el cual sus concentraciones plasmáticas aumentan debido a la liberación de catecolaminas que pueden inducir una rápida glicólisis y su excesiva producción. Generalmente, la concentración de lactato durante el sacrificio no es un predictor de la aparición de corte oscuro (DFD), porque esta condición de calidad es una consecuencia del estrés crónico desde la granja hasta la planta (49).

Catecolaminas

Las catecolaminas son un grupo de sustancias que incluyen la adrenalina (epinefrina), noradrenalina (norepinefrina) y la dopamina, las cuales son sintetizadas a partir del aminoácido tirosina. Durante el estrés agudo se produce su liberación como resultado del miedo y excitación de los bovinos (49). Las catecolaminas pueden ser producidas en la médula de la glándula adrenal ejerciendo una función hormonal, o en las terminaciones nerviosas,

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por lo que se consideran neurotransmisores. Durante situaciones de estrés, la adrenalina y noradrenalina son liberadas rápidamente (uno o dos segundos después de la percepción del estímulo) y tienen una vida media corta (minutos) cuando circulan en la sangre, motivo por el cual sus concentraciones plasmáticas son una medida de BA durante procesos de estrés agudo, pero solo cuando las muestras pueden ser tomadas inmediatamente (43). La adrenalina generalmente refleja estrés fisiológico, mientras que la noradrenalina está relacionada con actividad física del ganado (28). Se ha establecido que estas dos hormonas tienen un valor limitado para evaluar el estrés producido por el sacrificio (insensibilización y sangría), porque durante la insensibilización eléctrica o con perno cautivo, los animales liberan de forma masiva estas sustancias, que pueden causar además la elevación de la concentración sanguínea de glucosa (50).

Urea

Los niveles de urea se incrementan como respuesta al estrés, ya que se aumenta el catabolismo proteico y los grupos amino desechados por este proceso son transformados en urea por el hepatocito, para ser eliminados posteriormente por filtración glomerular y excretados por medio de la orina. La concentración plasmática de urea es indicadora de privación de alimento (48).

Hemograma: relación neutrófilos/linfocitos

Existe una estrecha relación entre el perfil de leucocitos y el nivel de glucocorticoides plasmáticos durante el estrés fisiológico (8). Estas hormonas pueden actuar incrementando el número y el porcentaje de neutrófilos (neutrofilia), mientras que decrecen los linfocitos (linfopenia o linfocitopenia) (33). Teniendo en cuenta que el número de estos leucocitos son afectados por el estrés en direcciones opuestas, los investigadores usan la relación neutrófilos/linfocitos como una medida complementaria de la respuesta al estrés, siendo relacionado

con la magnitud del estresor y con la concentración de glucocorticoides circulantes (16, 51). Los neutrófilos son fagocitos primarios que proliferan en la circulación como respuesta a infecciones, inflamaciones y al estrés. Por otra parte, los linfocitos tienen una variedad de funciones inmunológicas, como la producción de inmunoglobulinas y la modulación de la respuesta inmune (27, 51). La proporción de cada tipo de células blancas (neutrófilos, basófilos, linfocitos, monocitos y eosinófilos), usualmente obtenida al observar al microscopio de luz extendidos de sangre teñidos es lo que se denomina “perfil de leucocitos” o “hemograma” (51). Como respuesta al incremento de los glucocorticoides durante el estrés, los linfocitos circulantes se adhieren a las células endoteliales que cubren las paredes de los vasos sanguíneos y, posteriormente, pasan de la circulación a otros tejidos como los ganglios linfáticos, médula ósea, bazo y piel, donde son secuestrados, produciendo por lo tanto una reducción del número de linfocitos circulantes (linfopenia). Así mismo, los glucocorticoides estimulan el flujo de neutrófilos desde la médula ósea hacia la sangre y atenúan el paso de estos hacia otros compartimentos, generando neutrofilia, que consiste en un incremento de los neutrófilos maduros e inmaduros en la circulación sanguínea (13). Estos cambios aseguran que los diferentes tipos de células sean dirigidas a los tejidos donde se requieran durante el estrés (51). El transporte, además, aumentaría los niveles de adrenalina, provocando consigo un aumento en los leucocitos (41).

El estrés y la calidad de la carne

El manejo de los bovinos durante el presacrificio les provoca estrés, que conlleva a cambios de tipo metabólico y hormonal en el animal vivo, descritos previamente, produciendo efectos adversos en la calidad de la carne, específicamente en el pH, color, textura y la capacidad de retención de agua (52, 53). Así mismo, pueden causar disminuciones de peso, que se traducen en menor cantidad de



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carne producida, lesiones como hematomas de diverso grado que implican recortes y disminución de precio o categoría de las

canales. En la Tabla 3, se presenta un resumen de estas alteraciones.

Tabla 3. Alteraciones de la calidad de la carne obtenida de animales manejados bajo condiciones de estrés.

Alteraciones Características ReferenciasPérdidas de peso vivo y canal

- Pérdidas por transporte entre el 5 y 12%.- Aumento directamente proporcional con el tiempo de transporte, ayuno y tiempo de espera en la planta de sacrificio.- Relacionadas con ejercicio previo al transporte, alimentación, condiciones climáticas.

(52, 53)

Contusiones - Prevalencias variables:Bos indicus: 12,3% (Chile), 54,9% de contusiones leves y 12,0% de lesiones severas (Italia),Bos indicus: África Occidental (20,9%),

- Factores de riesgo: tiempos de transporte, temperamento de los animales, manejo, procedencia (finca o feria ganadera), mezcla de animales durante presacrificio, sexo (mayor en hembras que machos), edad (mayor en vacas de descarte y toros), densidad de carga durante el transporte, características de los vehículos, estilos de conducción, entre otros.

(3, 54, 55)

Alteraciones del pH, color y capacidad de retención de agua

- Consumo excesivo de glucógeno muscular en el animal vivo.- Disminución de la formación de ácido láctico en el músculo post-mortem.- Canales con pH24 >5,8 (corte oscuro).- Carnes con coloración oscura, alta capacidad de retención de agua.- No aptas para empaque al vacío.- Mayor proliferación microbiana.- Menor vida útil.

(17, 26, 53)

CONCLUSIONES

La evaluación del BA basada en biomarcadores de estrés, es un proceso complejo porque la respuesta de los bovinos a las condiciones cambiantes y novedosas del presacrificio puede alterar los resultados, teniendo en cuenta, además, que la diversidad de respuestas

depende de factores que los investigadores en ocasiones no pueden controlar como la edad, dieta, nutrición, variabilidad individual y las experiencias de manejo previas, entre otros aspectos. La complejidad de la biología del estrés requiere de estudios más profundos, que incluyan una muestra importante de animales, con el fin de identificar los mejores indicadores

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de estrés agudo y crónico, que puedan ser útiles y fáciles de medir en condiciones de campo.

En el futuro, con la finalidad de entender con mayor claridad la respuesta fisiológica y endocrina de los bovinos sometidos a manejos estresantes como el cargue, descargue, transporte, ayuno, insensibilización y sangría, sería conveniente integrar indicadores de comportamiento, como número de animales que reposan o se paran, montas, cornadas, vocalizaciones (mugidos), defecación, caídas y otras interacciones, que pueden generar respuestas distintas de los indicadores sanguíneos de estrés.

Teniendo en cuenta que el BA se ha convertido en un elemento diferenciador y un valor agregado en la comercialización de la carne bovina, la legislación colombiana ha integrado este componente dentro de los requerimientos de las buenas prácticas de producción primaria y secundaria. Por tal motivo, se hace necesario incentivar y fortalecer la introducción del BA en los currículos de los programas de Medicina Veterinaria y/o Zootecnia, la conformación de líneas de investigación aplicada en el área, y la vinculación de la academia en la resolución de problemas de la industria, relacionados con su falta de implementación.



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REFERENCIAS

1. Ferguson DM, Warner RD. Have we underestimated the impact of pre-slaughter on meat quality in ruminants? Meat Sci 2008; 80:12-19.

2. Grandin T. Transferring results of behavioral research to industry to improve animal welfare on the farm, ranch and the slaughter plant. Appl Anim Behav Sci 2003; 81:215-228.

3. Minka NS, Ayo JO. Effects of loading behaviour and road transport stress on traumatic injuries in cattle transported by road during the hot-dry season. Livest Sci 2007; 107:91-95.

4. Costa NL. Short-term stress: the case of transport and slaughter. Ital J Anim Sci 2009; 8(Suppl.1):241-252.

5. De Witte K. Development of the Australian Animal Welfare standards and guidelines for the land transport of livestock: process and philosophical considerations. J Vet Behav 2009; 4:148-156.

6. Gregory NG. Animal welfare at markets and during transport and slaughter. Meat Sci 2008; 80:2-11.

7. Fisher AD, Colditz IG, Lee C, Ferguson DM. The influence of land transport on animal welfare in extensive farming systems. J Vet Behav 2009; 4:157-162.

8. Gupta S, Earley B, Crowe MA. Effect of 12-hour road transportation on physiological, immunological and hematological parameters in bulls housed at different space allowances. Vet J 2007; 173:605-616.

9. Minka NS, Ayo JO. physiological responses of food animals to road transportation stress. Afr J Biotechnol 2009; 8(25):7415-7427.

10. Solano J, Galindo F, Orihuela A, Galina CS. The effect of social Rank on the physiological response during repeated stressful handling in Zebu cattle (Bos indicus). physiol Behav 2004; 82:679-683.

11. Colditz IG, Ferguson DM, Greenwood pL, Doogan VJ, petherick JC, Kilogour RJ. Regrouping unfamiliar animals in the weeks prior to slaughter has few effects on physiology and meat quality in Bos Taurus feedlot steers. Aust J Agri Res 2007; 47:763-769.

12. Miranda-de la Lama GC, Rivero L, Chacón G, Garcia-Belenguer S. Effect of the pre-slaughter logistic on some indicators of welfare in lambs. Livest Sci 2010; 128:52-59.

13. Buckham Sporer KR, Weber pSD, Burton JL, Earley B, Crowe A. Transportation of young beef bulls alters circulating physiological parameters that may be effective biomarkers of stress. J Anim Sci 2008; 86:1325-1334.

14. Broom DM. The effects of land transport on animal welfare. Rev Sci Tech Off int Epiz 2005; 24(2):683-691.

15. Cockram MS, Baxter EM, Smith LA, Bell S, Howard CM, prescott RJ, et al. Effect of driver behaviour, driving events and road type on the stability and resting behaviour of sheep in transit. J Anim Sci 2004; 79:165-176.

16. Stockman CA, Collins T, Barnes AL, Miller D, Wickham SL, Beatty DT, et al. Qualitative behavioural assessment and quantitative physiological measurement of cattle naïve and habituated to road transport. J Anim prod Sci 2011; 51:240-249.

17. Romero MH, Sánchez JA. Implicaciones de la inclusión del bienestar animal en la legislación sanitaria colombiana. Rev Colomb Cien pecu 2011; 24:93-101.

85


18. Broom DM. Transport stress in cattle and sheep with details of physiological, ethological and other indicator. Dtsch Tierârztl Wschr 2003; 110:83-89.

19. Mormède p, Andanson S, Aupérin B, Beerda B. Guémené D, Malmkvist J, et al. Exploration of the hypothalamic-pituitary-adrenal function as a tool to evaluate animal welfare. physiol Behav 2007; 92:317-339.

20. Trevisi E, Bertoni G. Some physiological and biochemical methods for acute and chronic stress evaluation in dairy cows. Ital J Anim Sci 2009; 8(Suppl.1):265-286.

21. Herskin MS, Munksgaard L, Ladewig J. Effects of acute stressors on nociception, adrenocortical responses and behavior of dairy cows. physiol Behav 2004; 83:41-420.

22. Lay D, Wilson M. physiological indicators of stress in domestic livestock. Symposium on Concentrated Animal Feeding Operations Regarding Animal Behavior, Care, and Well-Being, Indiana; 2001. p. 1-25.

23. Borell EH. The biology of stress and its application to livestock housing and transportation assessment. J Anim Sci 2001; 79:260-267.

24. Muchenje V, Dzama K, Chimonyo M, Strydom pE, Raats JG. Relationship between pre-slaughter stress responsiveness and beef quality in three cattle breeds. Meat Sci 2009; 81:653-657.

25. Sapolsky RM, Romero ML, Munck AU. How do glucocorticoids influence stress responses? Integrating permissive, suppressive, stimulatory and preparative actions. Endocrinol Rev 2000; 21(1):55-89.

26. Amtmann VA, Gallo C, van Schaik G, Tadich N. Relaciones entre el manejo ante-mortem, variables sanguíneas indicadoras de estrés y pH de la canal en novillos. Arch Med Vet 2006; 38(3):259-264.

27. Buckham Sporer KR, Xiao L, Tempelman RJ, Burton JL, Earley B, Crowe MA. Transportation stress alters the circulating steroid environment and neutrophil gene expression in beef bulls. Vet Immunol Immunopathol 2008; 121:300-320.

28. Knowles T, Warriss p. Stress physiology of animals during transport. In: Livestock handling and transport, eds. Temple Grandin. 3 ed.; 2006.

29. Grandin T. Cattle vocalizations are associated with handling and equipment problems at beef slaughter plants. Appl Anim Behav Sci 2001; 71:191-201.

30. Mounier L, Dubroeucq H, Andanson S, Veissier I. Variations in meat pH of beef bulls in relation to conditions of transfer to slaughter and previous history of the animals. J Anim Sci 2006; 84:1567-1576.

31. Tadich N, Gallo C, Bustamante H, Schwerter M, van Schaik G. Effects of transport and lairage time on some blood constituents of Friesian-cross steers in Chile. Livest prod Sci 2005; 93:223-233.

32. Cooke RF, Bohnert DW. Technical note: Bovine acute-phase response after corticotrophin-release hormone challenge. J Anim Sci 2011; 89:252-257.

33. Blanco M, Casasús I, palacio J. Effect of age at weaning on the physiological stress response and temperament of two beef cattle breeds. Animal 2009; 3(1):108-117.

34. parker AJ, Hamlin Gp, Coleman CJ, Fitzpatrick LA. Excess cortisol interferes with a principal mechanism of resistance to dehydratation in Bos indicus steers. J Anim Sci 2004; 82:1037-1045.

35. Möstl E, palme R. Hormones as indicators of stress. Domest Anim Endocrinol 2002; 23:67-74.



ISSN 1657-9550

36. Cafe LM, Robinson DL, Ferguson DM, Geesink GH, Greenwood pL. Temperament and hypothalamic-pituitary-adrenal axis function are related and combine to affect growth, efficiency, carcass, and meat quality traits in Brahman steers. Domest Anim Endocrinol 2011; 40(4):230-240.

37. Averós X, Martín S, Riu M, Serratosa J, Gosálvez LF. Stress response of extensively young being transported to growing-finishing farms under Spanish summer commercial conditions. Lives Sci 2008; 119:174-182.

38. Souza MIL, Uribe-Velásquez LF, Ramos AA, Oba E. Níveis plasmáticos de colesterol total, lipoproteínas de alta densidad (HDL) e cortisol, e sua biorritmicidades, em carneiros Ideal-polwarth. Cien Anim Bras 2006; 7(4):433-438.

39. Tsigos C, Chrousos p. Hypothalamic-pituitary-adrenal axis, neuroendocrine factors and stress. J pshychosom Res 2002; 53(4):865-871.

40. Kannan G, Kouakou B, Terril TH, Gelaye S. Endocrine, blood metabolite, and meat quality changes in goats as influenced by short-term, preslaughter stress. J Anim Sci 2003; 81:1499-1507.

41. Tadich N, Gallo C, Echeverría R, van Schaik G. Efecto del ayuno durante dos tiempos de confinamiento y de transporte terrestre sobre algunas variables sanguíneas indicadoras de estrés en novillos. Arch Med Vet 2003; 2:171-185.

42. Bórnez R, Linares MB, Vergara H. Haematological, hormonal and biochemical blood parameters in lamb: effect of age and blood sampling time. Lives Sci 2009; 121:200-206.

43. Broom DM. Behaviour and welfare in relation to pathology. Appl Anim Behav 2006; 97:73-83.

44. Vogel KD, Claus JR, Grandin T, Oetzel GR, Schaefer DM. Effect of water and feed withdrawal and health status on blood and serum components, body weight loss, and meat and carcass characteristics of Holstein slaughter cows. J Anim Sci 2010; 89(2):538-548.

45. Munhoz CD, García-Bueno B, Madrigal JLM, Lepsch LB, Scavone C, Leza JC. Stress-induced neuroinflammation: mechanism and new pharmacological targets. Braz J Med Biol Res 2008; 41(12):1037-1046.

46. Radostits OM, Houston DM, Mayhew IG. Examen y diagnóstico clínico en veterinaria. 1a ed. philadelphia: Ed. Elsevier; 2002.

47. Hambrecht E, Eissen JJ, Newman DJ, Smits CHM, den Hartog LA, Verstegen MWA. Negative effects of stress immediately before slaughter on pork quality are aggravated by suboptimal transport and lairage conditions. J Anim Sci 2005; 83:440-448.

48. Kaneko J, Harvey J, Bruss M. Clinical Biochemistry of domestic animals. 6th ed. San Diego, USA: Academic press; 1997.

49. Warner RD, Ferguson DM, Cottrel JJ, Knee BW. Acute stress induced by the preslaughter use of electric prodders causes tougher beef meat. Aust J Agri Res 2007; 47:782-788.

50. Grandin T. progress and challenges in animal handling and slaughter in U.S. Appl Anim Behav Sci 2006; 100:129-139.

51. Davis AK, Maney DL, Maerz JC. The use of leukocyte profiles to measure stress in vertebrates: a review for ecologists. Functional Ecol 2008; 22:760-772.

52. Van de Water G, Verjans F, Geers R. The effect of short distance transport under commercial conditions on the physiology of slaughter calves; pH and colour profiles of veal. Livest prod Sci 2003; 82:171-179.

87


53. Gallo C, Lizondo G, Knowles G. Effects of journey and lairage time on steers transported to slaughter in Chile. Vet Rec 2003; 152:361-364.

54. Nanni Costa L, Lo Fiego Dp, Tassone F, Russo V. The relationship between carcass bruising in bulls and behavior observed during pre-slaughter phases. Veterinary Research Communications 2006; 30:379-381.

55. Strappini AC, Frankena K, Metz JHM, Gallo B, Kemp B. prevalence and risk factors for bruises in Chilean bovine carcasses. Meat Sci 2010; 86:859-864.

RESUMEN

El trabajo tuvo como objetivos, analizar el metabolismo básico de los lípidos en aves comerciales e identificar las principales diferencias entre líneas genéticas y propósitos productivos, se analizó la literatura disponible de los últimos 50 años en las bases de datos BBCS-LILACS, Fuente Académica, IB-PsycINFO, IB-SSCI, IB-SciELO, Scopus y Scirus, así como artículos históricos, textos y referencias citadas en trabajos públicos. Se obtuvo información pertinente relacionada con los objetivos propuestos en la presente revisión, por lo cual puede clasificarse en cinco secciones a saber: digestión y absorción lipídica en las aves, transporte de lípidos exógenos, transporte endógeno de los lípidos, diferencias del metabolismo lipídico en pollo de engorde y diferencias de metabolismo de lípidos en gallinas ponedoras. En las aves los portomicrones son transportados por vía vena porta, y no linfática como los quilomicrones en los mamíferos. El metabolismo de las lipoproteínas, los niveles de lípidos en plasma y la acumulación de lípidos difiere entre machos y hembras y entre estirpes o líneas genéticas.

Palabras clave: gallinas, lípidos, pollo, metabolismo.

BIOCHEMICAL DIFFERENCES IN POULTRY LIPOPROTEIN

METABOLISM

ABSTRACT

The objectives of this work were to analyze the basic lipids metabolism in poultry and to identify the main differences between genetic lines and productive purposes: Information from the last 50 years included in the BBCS-LILACS, Fuente Académica, IB-PsycINFO, IB-SSCI, IB-SciELO, Scopus and Scirus, databases as well as historical articles, texts and references cited in research published to date were analyzed. Important information related to the proposed objectives in the present review was found and analyzed, reason why it can be divided into five sections as follows: lipid digestion and absorption in poultry, exogenous lipids transport, endogenous lipids transport, differences on lipid metabolism in broilers and differences for lipid metabolism in laying hens. Portomicrons In poultry are transported by portal vein instead of by lymphatic vessels as it happens with chylomicrons in mammals. In the lipoprotein metabolism, the serum lipids and the lipid accumulation levels are different between males and females and lineage or genetic line.

Key words: broiler, hens, lipids, metabolism.

DIFERENCIAS BIOQUÍMICAS Y FISIOLÓGICAS EN EL METABOLISMO DE LIPOPROTEÍNAS DE AVES COMERCIALES

José Henry Osorio1

Jancy Darly Flórez2

1 Laboratorio de Bioquímica Clínica y patología Molecular, Departamento de Ciencias Básicas de la Salud, Universidad de Caldas. 2 Departamento de Salud Animal, Universidad de Caldas, Calle 65 No. 26-10, Manizales, Colombia.

ISSN 1657-9550Recibido: abril 28 de 2011 - Aceptado: agosto 4 de 2011


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Diferencias bioquímicas y fisiológicas en el metabolismo de lipoproteínas de aves comerciales

INTRODUCCIÓN

Los lípidos son un grupo de compuestos orgánicos, caracterizados por ser muy pocos solubles en agua pero fáciles de disolver en compuestos orgánicos como el benceno, cloroformo y éter, entre otros. En general, pueden mencionarse en este grupo los ácidos grasos y sus ésteres (acilgliceroles, ceras y fosfolípidos); grasas que a temperatura ambiente son sólidas, aceites (grasas que a temperatura ambiente son líquidas), los cuerpos cetónicos y lípidos no saponificables (esteroides, carotenos y terpenos) (1).

En la alimentación animal, los lípidos son importantes por su elevado valor energético, y entre ellos están los ácidos grasos esenciales y las vitaminas liposolubles. Dentro de las principales funciones de los lípidos, cabe mencionar que son fuente de energía metabólica (ácidos grasos y cuerpos cetónicos) oxidándose para producir ATP (fuente de energía directa); depositarse en el tejido adiposo como acilgliceroles (fuente de energía potencial); también cumplen una función estructural, principalmente formando parte de las membranas (fosfolípidos y glucoesfingolípidos), además sirven como antígenos de superficie (esfingolípidos); como aislante térmico cuando se almacena la grasa en el tejido subcutáneo; y como aislante eléctrico cuando se trata de lípidos no polares, ya que permiten la rápida propagación de las ondas de despolarización a lo largo de los nervios mielinizados (2, 3).

En las aves, la digestión y transporte hasta el hígado de los lípidos difiere en gran manera con los mamíferos; los triglicéridos se almacenan especialmente en los hepatocitos, la yema de huevo o en el tejido adiposo; asimismo, son fuente de energía para el embrión.

DIGESTIÓN Y ABSORCIÓN LIPÍDICA EN LAS AVES

En las aves no se reporta la acción de las lipasa lingual ni de la lipasa gástrica, por lo tanto la

molleja y el intestino son los encargados de la emulsificación de los lípidos, formación de micelas y absorción de lípidos, dicha emulsificación está a cargo de los ácidos biliares y el jugo pancreático, con sus componentes más importantes: las sales biliares y la lipasa pancreática (LP), respectivamente, además, de la fosfolipasa A2 y la colipasa secretadas también por el páncreas (4). En las sales biliares de las aves, el ácido tauroquenodesoxicólico está presente en gran proporción, y es uno de los ácidos de dichas sales que inhiben la LP, efecto que se contrarresta con la colipasa (5); finalmente, los lípidos hidrolizados en el intestino son devueltos a la molleja (reflejo entero-gástrico) (6) antes de ser absorbidos por el duodeno y la parte anterior del yeyuno, principalmente (7).

La regulación del flujo biliar y enzimas pancreáticas, está a cargo de la colecistoquinina (hormona peptídica), la cual es sintetizada por la mucosa del intestino delgado y secretada en el duodeno cuando hay presencia de ácidos grasos y aminoácidos (8).

En las aves comerciales una de las causas de la alteración en la absorción de lípidos, es cuando hay cambios en la composición de la dieta que alteran la microflora intestinal, afectando la conversión de las sales biliares primarias (ácido quenodesoxicólico y cólico) a las secundarias (ácido litocólico y desoxicólico) (4); por tal razón, si se alimenta a las aves con sales biliares primarias y antibióticos para reducir los microorganismos intestinales, se favorece la absorción de los lípidos, hay mejor conversión alimenticia y se disminuye la mortalidad de las aves (9, 10). Pero el uso de antibióticos como promotores de crecimiento son prohibidos actualmente según el Codex Alimentarius (11), por lo tanto actualmente se investigan sustancias tales como polifenoles, los cuales modifican la morfología y microflora intestinal de las aves (12).

Las micelas compuestas facilitan la absorción de los lípidos, debido a que proveen altas concentraciones de los productos de la digestión

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José Henry Osorio, Jancy Darly Flórez

Biosalud, Volumen 10 No. 1, enero - junio, 2011. págs. 88 - 98 ISSN 1657-9550

de las grasas (TAG, fosfolípidos, ésteres de colesterol y vitaminas liposolubles) en las células de la mucosa intestinal. En el caso de los TAG son monoacilglicéridos y los ácidos grasos de cadena larga, y al entrar a células son resintetizados; en las aves la resíntesis intramucosal de los TAG está dada por las vías de los monoacilgliceroles y la del ácido fosfatídico (13). La reesterificación de los ácidos grasos depende de la suplementación con carbohidratos, debido a que estos proveen substrato y energía para su síntesis (4).

Los fosfolípidos son hidrolizados por la lipasa pancreática, la cual hidroliza el ácido graso en posición 1 y la fosfolipasa A2 también segregada por el páncreas, la cual elimina el ácido graso en posición 2; estas hidrólisis dan lugar a lisofosfoglicéridos más ácidos grasos. El colesterol en la dieta, cuya molécula base es el ciclopentanoperhidrofenantreno, viene en forma de ésteres de colesterol, son hidrolizados en la luz del intestino por la colesterol esterasa, igualmente segregada por el páncreas, este colesterol hidrolizado y el colesterol libre proveniente de las células epiteliales de descamación y junto con los fosfolípidos también hacen parte de las micelas compuestas (3, 14). Otros compuestos lipídicos que hacen parte de las micelas son las vitaminas liposolubles (A, D, E y K). Todos estos lípidos son transportados a las células epiteliales, las cuales los absorben para su posterior paso a la vía sanguínea. La transferencia del medio micelar favorable al medio acuoso desfavorable del epitelio, se facilita por la proteína enlazante de ácidos grasos (FABP, del inglés Fatty Acid Binding Protein). Esta proteína tiene preferencia por los ácidos grasos de cadena larga. En las aves, la concentración de FABP es alta en la porción proximal del intestino y disminuye a medida que se acerca a la parte distal del mismo, aunque su nivel puede estar mediado por las sales biliares (15).

El sitio de absorción de los lípidos en el intestino delgado es variado según los estudios realizados, por ejemplo unos estudios encontraron que

la mayoría del ácido palmítico en los pollos se absorbe en el duodeno (16), en gallinas ponedoras el ácido linoleico, esteárico y el palmítico se absorben significativamente en el íleon (17), sin embargo, en las aves la mayoría de los lípidos son absorbidos en el yeyuno (18); dicha absorción se realiza a través de los cilios de las membranas celulares de forma pasiva (19), para formar las lipoproteínas encargadas del transporte de lípidos. Las sales biliares se absorben por el yeyuno y por el íleon en similares cantidades, esto indica que la absorción de lípidos y sales biliares se superponen (4, 17), las sales llegan al hígado por el sistema porta-hepático para ser secretados nuevamente por la bilis y las que se pierden por las heces son sustituidas por las síntesis de novo en el hígado (14).

En las aves después de la eclosión, la yema (principal fuente de energía en el pollito) y su digestión es catalizada por las lipasas secretadas desde la cara interna del saco vitelino; la yema no pasa al intestino antes de la eclosión o lo hace en muy pocas cantidades y su tasa de asimilación incrementa después de la eclosión por medio de: la membrana del saco vitelino, el epitelio del conducto onfalomesentérico y la mucosa intestinal. Por otra parte, los procesos que realizan las enzimas pancreáticas, las sales biliares y el hígado en los pollitos recién nacidos, no son importantes hasta que el pollito empiece a comer, ya que la yema lleva a cabo su propia asimilación (20).

La digestibilidad de los lípidos en pollitos va incrementando gradualmente, desde la primera semana hasta estabilizarse en la octava (8), esto se debe probablemente a que los pollitos no tienen la habilidad de incrementar la síntesis de sales biliares para sufragar su demanda, sin embargo, después de la sexta semana esta se estabiliza (21); además, la concentración de FABP es baja en la primera semana de edad pero incrementa hasta en un 50% entre la semana 3 y 5 de edad (22). Sin embargo, los pollitos tienen una concentración alta de lípidos en

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sangre e hígado, principalmente de colesterol, lo cual probablemente se debe a la transferencia intacta de éste desde la madre hacia el embrión permaneciendo hasta después de la eclosión (23).

TRANSPORTE DE LÍPIDOS EXÓGENOS

Para ser transportados los lípidos hidrolizados en la luz del intestino deben ser reesterificados, en las aves solo la mitad de los lípidos consumidos tienen este proceso dentro de las células de la mucosa intestinal; luego en las células epiteliales del intestino, se combinan TAG, fosfolípidos, colesterol, ésteres de colesterol y apolipoproteínas formando portomicrones (PM) (24); los ácidos grasos no reesterificados son absorbidos directamente y son transportados por la albúmina (24, 25). En las aves toma el nombre de portomicrón, debido a que las lipoproteínas formadas entran en los vasos sanguíneos a través de las vesículas intracitoplasmáticas endoteliales (26) y son transportados desde las venas pancreaticoduodenal y yeyunal hasta la vena porta (16), en cambio los quilomicrones en los mamíferos entran en los vasos linfáticos intestinales a través de los espacios intercelulares endoteliales (26), para ser segregados al torrente circulatorio a través del conducto torácico. Los portomicrones de las aves, tienen igual tamaño que los quilomicrones de los mamíferos (27), están compuestos por 88,8% de TAG, 6,2% de fosfolípidos, 3,6% de colesterol libre y ésteres de colesterol, y 1,4% de proteína (apolipoproteínas: apo B y apo C-II) (24). Los portomicrones, aunque pasan directamente a la circulación portal, no son metabolizados por el hígado debido al gran tamaño que poseen (26), por lo tanto siguen su camino para ser parcialmente metabolizados en un tiempo entre 3-4 minutos por tejidos extrahepáticos (24).

El ingreso de los TAG que transportan los portomicrones a los tejidos, depende de la hidrólisis realizada por la lipoproteína lipasa (LPL), la cual se encuentra en los tejidos

extrahepáticos en la cara externa de las células endoteliales que rodean los capilares; la LPL hidroliza a los TAG a glicerol y ácidos grasos, el glicerol es transportado al hígado y al riñón para su posterior metabolismo y los ácidos grasos son captados por el tejido donde se realizó la hidrólisis; no obstante, para que los portomicrones sean sustrato de la LPL deben adquirir apolipoproteína C-II a partir de las HDL (28), una vez ha disminuido la relación la relación lípido/proteína quedan partículas más pequeñas que son metabolizadas en el hígado, las cuales en los mamíferos toman el nombre de quilomicrones remanentes (29, 30). La LPL es sintetizada en el tejido adiposo, muscular, pulmonar y renal pero solo una fracción es secretada a la cara externa de los capilares para realizar su función (28). La LPL es sensible a hormonas como la insulina, glucagón, glucocorticoides y tiroxina, y su actividad difiere según el tejido o el estado nutricional ya que es mayor en estados de ayuno en tejidos como músculo estriado y cardíaco, y en estados de alimentación es mayor en el tejido adiposo (24).

TRANSPORTE ENDÓGENO DE LOS LÍPIDOS

El transporte endógeno de los lípidos se realiza desde el hígado a los tejidos periféricos. Este transporte está a cargo de las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL). Las VLDL de las aves tienen una densidad <1,013 g/cm3, están compuestas por 41,7% de TAG, 15,2% de fosfolípidos, 3,1% de colesterol, 15% de ésteres de colesterol y 26,8% de proteína (apo A-I, apo B-100, apo B48, apo C-II y además las apo VLDL-II para gallinas), siendo la apo B-100 de mayor cantidad en las VLDL (24, 31).

Debido a que el hígado en las aves es el mayor productor de TAG (32), se destacan las tres fuentes de ácidos grasos para la síntesis de VLDL: a partir del acetil coenzima A (acetil-CoA) en la síntesis de novo; de los portomicrones y por captación de los AG libres unidos a la

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albúmina procedentes del tejido adiposo (28); además de generar TAG, el hígado es también la fuente principal de colesterol y fosfolípidos (28). La síntesis y la lipogénesis de novo de las VLDL es mejorada por la insulina, mientras que la tiroxina y el glucagón tienen el efecto contrario, esta situación activa la lipoproteína lipasa, aumentado los ácidos grasos libres en sangre (32). Después de adquirir la apo C-II, las VLDL son hidrolizadas por la LPL, liberando sus TAG para su acumulación respectiva; después de la disminución en la relación lípido/proteína se producen las lipoproteínas de densidad intermedia (IDL), las cuales siguen metabolizándose hasta formar las lipoproteínas de baja densidad (LDL) (28). Las IDL tienen una densidad entre 1,013-1,023 g/cm3 y están compuestas por 14,4% de TAG, 17,7% de fosfolípidos, 7,3% de colesterol libre, 30,3% de ésteres de colesterol y 29,8% de proteína, y las LDL tienen una densidad entre 1,023-1,046 g/cm3 y están compuestas por 7,5% de TAG, 21,9% de fosfolípidos, 10,1% de colesterol libre, 30,4% de ésteres de colesterol y 29,7% de proteína (33), siendo la misma para las dos lipoproteínas (apo A-I y apo B) (24), estas diferencias se deben a que las IDL pierden TAG por la hidrólisis de la LPL, y entregan las apo C y reciben ésteres de colesterol de las HDL. Las LDL suministran su colesterol para la síntesis de membranas celulares en su degradación o para su almacenamiento, la proteína de las apolipoproteínas se hidroliza a aminoácidos. La acumulación de colesterol y ésteres de colesterol a nivel intracelular, se puede controlar inhibiendo la enzima hidroximetilglutaril CoA reductasa (HMG-CoA reductasa), la que es específica para la biosíntesis del colesterol (34), o con la disminución de los receptores de LDL debido a un aumento de la concentración de colesterol (35).

Las HDL tienen una densidad entre 1,052-1,130 g/cm3, están compuestas por 1,7% de TAG, 28,6% de fosfolípidos, 3,9% de colesterol, 23,4% de ésteres de colesterol y 45,4% de proteínas (apo A-I y C-II) (24). La apo A-I es la proteína más importante en las HDL (36) y la mayoría de

los fosfolípidos se asocian a la apo A-I dentro de las HDL (28). El hígado en las aves es el mayor productor de HDL y dentro del aparato de Golgi se encuentran formas esféricas y discoidales de dicha lipoproteína (36), pero en la circulación a diferencia de los mamíferos solo se conoce una forma de HDL (24) en las aves sin importar el estado de alimentación, línea de pollo de engorde o sexo (pollos y gallinas inmaduras), la concentración es mayor comparada con las otras lipoproteínas (37, 38).

Las funciones de las HDL son las de aceptar las apolipoproteínas y fosfolípidos de las �lipoproteínas degradadas, aceptar el colesterol de los tejidos y de las lipoproteínas, entregar a estas los ésteres de colesterol para mantener el equilibrio lípido/proteína, para esto necesita de la fosfolipasa A2 adherida al endotelio capilar y de la lecitina-colesterol aciltransferasa (LCAT); la fosfolipasa actúa sobre los fosfolípidos que transportan las lipoproteínas y la LCAT es necesaria para la conversión del colesterol de las HDL a ésteres de colesterol, los ésteres de colesterol entregados por las HDL a las LDL y a los remanentes proteicos son transportados hacia el hígado y a los tejidos extrahepáticos (39, 40). Asimismo, enzimas como la LCAT y la proteína de transferencia de ésteres de colesterol participan en el transporte inverso del colesterol, transportando el colesterol de las paredes arteriales al hígado usando como intermediario a la cascada de las VLDL, además del hígado las HDL pueden proporcionar colesterol a las glándulas suprarrenales, ovarios y testículos (40, 41).

DIFERENCIAS DEL METABOLISMO LIPÍDICO EN POLLOS DE

ENGORDE

La lipogénesis en el tejido adiposo de las aves es limitada, lo que implica que el depósito de grasa dependa de los lípidos ingeridos en la dieta y de la lipogénesis hepática (32), por lo tanto la acumulación de los triglicéridos en los

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adipocitos se relacionan con el metabolismo de las VLDL y otras sustancias, sin embargo ésta puede estar afectada por sustancias que no alteran directamente las VLDL (42).

Las líneas genéticas modernas de pollo de engorde, se seleccionan a partir de altas o bajas concentraciones en el plasma de VLDL dando lugar a las líneas grasas y magras de pollo, respectivamente (32). Debido a la mayor concentración de VLDL en sangre en las líneas grasas, hay una mayor cantidad de TAG disponible para ser depositado en el tejido adiposo con una menor cantidad de ésteres de colesterol y proteína. Las IDL, LDL y HDL presentan menor cantidad de ésteres de colesterol en las líneas grasas, pero solo las IDL tienen mayor contenido de TAG en dichas líneas (33). No obstante, se ha encontrado que la mayor cantidad de grasa abdominal en pollos tipo graso, está relacionada positivamente con los niveles de LDL y colesterol total y negativamente con los niveles de TAG, HDL, VLDL, pero, en los pollos tipo magro, la grasa abdominal se relaciona positivamente con TAG, VLDL, HDL, LDL y colesterol total (38). Además, la selección de aves para un rápido y mayor crecimiento muscular a partir de un incremento en el consumo de alimento, repercutió en un aumento en el depósito de grasa (43) y se ha demostrado que el tipo de alimentación ejerce un papel importante en el metabolismo lipídico, en la acumulación de grasa abdominal, haciendo parte dichos lípidos del tejido muscular, esquelético o visceral (44-46). Por otra parte, los niveles de insulina también están involucrados en las diferencias entre líneas magras y grasas de pollo, pues altas concentraciones de ésta, están asociadas con alto contenido de grasa abdominal (47).

En cuanto a la actividad de la LPL en las dos líneas (grasas y magras), es un poco mayor en los músculos cardiaco y estriado de las líneas con concentraciones bajas de VLDL (32), lo contrario ocurre con las líneas de alta concentración de VLDL, pues hay una mayor

actividad funcional de la LPL en el tejido adiposo debido a la hipertrofia e hiperplasia de los adipositos, (48); por otro parte, la concentración de β-hidroxibutirato en el plasma de las líneas de baja concentración VLDL es más alta, esto indica que los ácidos grasos tienden a ser oxidados en vez de transportarse para la síntesis de VLDL (32). La actividad de la LPL se puede inhibir para modificar la grasa abdominal en los pollos (49), pero no es un factor limitante para la acumulación de TAG en el tejido adiposo, debido a que este almacenamiento depende del substrato de las VLDL del plasma hacia dicho tejido (32). Respecto a las HDL en los pollos tipo magro y graso, también se han reportado diferencias. Se postula que no hay relación de las HDL con el colesterol total y TAG en los tipo graso, pero sí entre las HDL con el colesterol total en algunas tipo magro (38, 50).

DIFERENCIAS DE METABOLISMO DE LÍPIDOS EN AVES DE

POSTURA

La vitelogénesis se caracteriza por la acumulación de lípidos especialmente TAG (51), por tal razón la cantidad sérica de VLDL es mayor en las líneas de huevo comparadas con los machos (52) o hembras inmaduras (53), además en las gallinas existe la vitelogenina (VTG) la cual es una lipofosfoproteína de alta densidad que junto con otras lipoproteínas van a ser parte de la yema de huevo (54).

En las hembras hay un aumento en la concentración y secreción de VLDL, y no solo de manera cuantitativa sino también cualitativa debido a que hay mayor cantidad de colesterol libre que de ésteres de colesterol en su composición lo cual difiere de los machos (51, 54), además, hay diferencias en la concentración de las lipoproteínas entre las mismas gallinas, lo cual puede ir relacionado con la cantidad de 17 β-estradiol pues las gallinas inmaduras están en un rango menor que las gallinas en producción (54).

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Los oocitos son los receptores de los TAG de las VLDL con apo B-100 en las gallinas ponedoras, únicamente la subclase lipoproteínas apo B tiene acceso a los oocitos receptores. Las VLDL con tamaño mayor a 44 nm sufren una serie de cambios metabólicos y de ensamblaje para formar las VLDLy, que son más pequeñas en diámetro (25-44 nm) pero ricas en TAG y son las encargadas de transportar energía necesaria para la yema de huevo (la “y” viene del inglés “yolk”, por esta razón se han denominado VLDLy); las VLDLy contienen grandes cantidades de apo VLDL-II, son resistentes a la actividad lipolítica de la LPL, por lo tanto previenen la formación de IDL o LDL; las VLDLy tienen gran cantidad de TAG pero bajos niveles de ésteres de colesterol (55). El proceso de ensamble de las VLDLy depende del nivel de estrógenos (31, 55).

Los estrógenos estimulan la síntesis fosfolípidos y TAG, así como la incorporación de acetato y glucosa para la formación de los TAG, además, de la liberación de estos hacia el torrente sanguíneo y la síntesis y acumulación en el hígado, mientras que la síntesis de colesterol aumenta en menor grado por el hígado (56, 57). Los estrógenos también estimulan la síntesis de apo B (58) y apo VLDL-II por el hígado (31), pero la apo B formada en el riñón no depende de los estrógenos (59). En las aves, en el retículo endoplásmico de los túbulos proximales del riñón se ensamblan partículas de VLDL de 60 nm de diámetro, estas VLDL nacientes son excretadas y llegan rápidamente la sangre, mientras que son sintetizadas las apo B a lo largo del tubo, por lo tanto se ha considerado a los túbulos proximales como análogos del intestino delgado. Al parecer, en las gallinas ponedoras los estrógenos transforman todas las VLDL nacientes en VLDLy en los hepatocitos; las VLDLy poseen apo B-100 y apo VLDL-II, pero los túbulos proximales no sintetizan apo VLDL-II, por lo tanto, las VLDL estarían expuestas a la hidrólisis por parte de la LPL mientras llegan al hígado (55).

En las aves los estrógenos pueden causar un incremento en la concentración de ácidos grasos libres en el plasma (60), lo cual podría incrementar el flujo de ácidos grasos en el sistema urinario y estimular la producción en tamaño y número de VLDL nacientes en los túbulos proximales. Por otra parte, la LPL está incrementada en el corazón y disminuida en el tejido adiposo, para suplir las necesidades energéticas del músculo cardiaco a partir de las VLDL nacientes (55).En los casos donde el hígado se excede en la producción de lípidos pero disminuye en la secreción de las VLDL, se produce esteatosis hepática o síndrome de hígado graso por acumulación excesiva de TAG en dicho órgano, este problema afecta a las gallinas ponedoras reduciendo la producción de huevo e incrementando la mortalidad, consecuentemente, es considerada el desorden metabólico más importante en las gallinas (28, 61), pero con una dieta rica en fosfolípidos se puede reducir la acumulación de TAG en el hígado (44).

CONCLUSIONES

La anatomía y fisiología de las aves comerciales, les permite diferenciarse de las demás especies, principalmente por los aspectos bioquímicos, tales como la presencia de portomicrones que transportan los lípidos de la dieta, vía vascular desde el intestino hasta el sistema porta, en vez de quilomicrones que van vía quilífera al sistema circulatorio, como sucede en otras especies. En las diferentes líneas de pollo (grasas y magras), hay diferencias en la acumulación de tejido adiposo, por factores tales como: diferencias cuantitativas en la síntesis de lipoproteínas, diferencias en la relación de las lipoproteínas con la acumulación de grasa abdominal y con los niveles de lípidos transportados, diferencias en la actividad de la LPL, y diferencias en los niveles de insulina. Las lipoproteínas de las gallinas ponedoras se diferencian de los machos y de las hembras inmaduras de forma cuantitativa y cualitativa,

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siendo las VLDL las de mayor importancia, pues sus niveles sanguíneos son elevados con el fin de tener energía disponible para el desarrollo del embrión, las cuales llegan intactas a la yema por cambios metabólicos y de ensamblaje

produciendo VLDL de la yema (VLDLy), lo que las hace resistentes a la hidrólisis de la LPL, y todo esto depende de los niveles de estrógenos en las gallinas.

REFERENCIAS

1. Murray RK, Mayes pA, Granner DK, Rodwell VW. Harper - Bioquímica Ilustrada. 16 ed. México D.F.: Manual Moderno; 2004.

2. Montgomery R, Conway T. Bioquímica casos y texto. 6 ed. Madrid: Harcourt Brace; 1998.

3. Newsholme EA, Leech AR. Bioquímica Médica. Madrid: Interamericana McGraw-Hill; 1987.

4. Krogdahl Á. Digestion and absorption of lipids in poultry. J Nutri 1985; 115(5):675-85.

5. Bosc-Bierne I, Rathelot J, perrot C, Sarda L. Studies on chicken pancreatic lipase and colipase. Biochim Biophys Acta 1984; 794(1):65-71.

6. place AR. Birds and lipids: living off the fat of the earth. poult Avian Biol Rev 1996; 7:127-41.

7. Sklan D, Hurwitz S, Budowski p, Ascareli I. Fat digestion and absorption in chicks fed raw or heated soybean meal. J Nutri 1975; 105(1):57-63.

8. Gibbs J, Young RC, Smith Gp. Cholecystokinin decreases food intake in rats. J Comp physiol psychol 1973; 84(3):488-95.

9. Baurhoo B, Ferket pR, Zhao X. Effects of diets containing different concentrations of monoligosacharide or antibiotics on growth performance, intestinal development, cecal and litter microbial populations, and carcass parameters of broilers. poult Sci 2009; 88(11):2262-72.

10. Sun X, McElroy A, Webb KE, Sefton AE, Novak C. Broiler performance and intestinal alterations when fed drug-free diets. poult Sci 2005; 84(8):1294-302.

11. FAO. Código de prácticas sobre buena alimentación animal, CAC/RCp 54. FAO (Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación); 2004. Disponible en: http://www.codexalimentarius.net/web/standard_list.do?lang=es Consultado Junio 16 de 2011.

12. Viveros A, Chamorro S, pizarro M, Arija I, Centeno C, Brenes A. Effects of dietary polyphenol-rich grape products on intestinal microflora and gut morphology in broiler chicks. poult Sci 2011; 90(3):566-78.

13. Bickerstaffe R, Annison EF. Triglyceride synthesis by the small intestinal epithelium of the pig, sheep and chicken. Biochem J 1969; 111(4):419-29.

14. Lehninger AL, Nelson D, Cox M. principles of biochemistry. 3 ed. Barcelona, España: Omega; 2001.

15. Katongole JBD, March BE. Fatty acid binding protein in the intestine of the chicken. poult Sci 1979; 58:372-5.

16. Noyan A, Lossow WJ, Brot N, Chaikoff IL. pathway and form of absorption of palmitic acid in the chicken. J Lipid Res 1964; 5(4):538-41.

96



17. Hurwitz S, Bar A, Katz M, Sklan D, Budowski p. Absorption and secretion of fatty acids and bile acids in the Intestine of the laying fowl. J Nutri 1973; 103(4):543-7.

18. Hurwitz S, Eisner U, Dubrov D, Sklan D, Risenfeld G, Bar A. protein, fatty acids, calcium, and phosphate absorption along the gastro-intestinal tract of the young turkey. Comp Biochem physiol 1979; 62A(4):847-50.

19. Garret RL, Young RJ. Effect of micelle formation on the absorption of natural fat and fatty acids by the chicken. J Nutri 1975; 105:827-38.

20. Romanoff AL. The extraembryonic membranes. The Avian Embryo. New York: The Macmillan Co.; 1969. p. 1041-140.

21. Serafin JA, Nesheim MC. Influence of dietary heat-labile factors in soybean meal upon bile acid pools and turnover in the chick. J Nutri 1970; 100(7):786-96.

22. Katongole JBD, March BE. Fat utilization in relation to intestinal fatty-acid binding protein and bile salts in chicks of different ages and different genetic sources. poult Sci 1980; 59:819-27.

23. Connor WE, Johnston R, Lin DS. Metabolism of cholesterol in the tissues and blood of the chick embryo. J Lipid Res 1969; 10(4):388-94.

24. Griffin H, Hermier D. plasma lipoprotein metabolism and fattening in poultry. In: Leclercq B, Whitehead CC, eds. Leanness in Domestic Birds. Londres: Butterworths; 1988. p. 175-201.

25. Baynes JW, Dominiczak MH. Medical biochemistry. 2 ed. Filadelfia: Elsevier Mosby; 2005.

26. Fraser R, Heslop VR, Murray FEM, Day WA. Ultrastructural studies of the portal transport of fat in chickens. Br J Exp pathol 1986; 67(6):783-91.

27. Griffin HD, Grant G, perry M. Hydrolysis of plasma triacylglycerol rich lipoproteins from immature and laying hens (Gallus domesticus) by lipoprotein lipase in vitro. Biochem J 1982; 206:647-54.

28. Hermier D. Lipoprotein metabolism and fattening in poultry. J Nutri 1997; 127(5):805S-8S.

29. César TB, Oliveira MRM, Mesquita CH, Maranhão RC. High cholesterol intake modifies chylomicron metabolism in normolipidemic young men. J Nutri 2006; 136(4):971-6.

30. Cooper AD. Hepatic uptake of chylomicron remnants. J Lipid Res 1997; 38:2173-92.

31. Nimpf J, Schneider WJ. Receptor mediated lipoprotein transport in laying hens. J Nutri 1991; 121(9):1471-4.

32. Griffin H, Acamovic F, Guo K, peddie J. plasma lipoprotein metabolism in lean and in fat chickens produced by divergent selection for plasma very low density lipoprotein concentration. J Lipid Res 1989; 30(8):1243-50.

33. Hermier D, Chapman J, Leclercq B. plasma lipoprotein in fasted and refed chickens of two strains selected for high or low adiposity. J Nutri 1984; 114(6):1112-21.

34. Ide T, Okamatsu H, Sugano M. Regulation by dietary fats of 3-hydroxy-3-methylglutary coenzyme A reductase in rat liver. J Nutri 1978; 108:601-12.

35. Tabas I. Consequences of cellular cholesterol accumulation: basic concepts and physiological implications. J Clin Invest 2002; 110(7):905-11.

36. Banerjee D, Redman CM. Biosynthesis of high density lipoprotein by chicken liver: nature of nascent intracellular high density lipoprotein. J Cell Biol 1983; 96:651-60.

97


37. Chapman MJ. Animal lipoproteins: chemistry, structure, and comparative aspects. J Lipid Res 1980; 21:789-853.

38. Musa HH, Chen GH, Cheng JH, Yousif GM. Relation between abdominal fat and serum Cholesterol, Triglycerides, and lipoprotein concentration in chicken Breeds. Turk J Vet Anim Sci 2007; 31(6):375-9.

39. De Beer FC, Connell pM, Yu J, De Beer MC, Webb NR, Van der Westhuyzen DR. HDL modification by secretory phospholipase A2 promotes scavenger receptor class B type I interaction and accelerates HDL catabolism. J Lipid Res 2000; 41:1849-57.

40. Ding ST, Lilburn MS. The Developmental Expression of Acyl-Coenzyme A:CholesterolAcyltransferase in the Yolk Sac Membrane, Liver, and Intestine of Developing Embryos and posthatch Turkeys. poult Sci 2000; 79(10):1460-4.

41. Toth pp. The “Good Cholesterol” High-Density Lipoprotein. Circ 2005; 111:e89-e91.

42. Xu ZR, Wang MQ, Mao HX, Zhan XA, Hu CH. Effects of L-carnitine on growth performance, carcass composition, and metabolism of lipids in male broilers. poult Sci 2003; 82(3):408-13.

43. Havenstein GB, Ferket pR, Qureshi MA. Carcass composition and yield of 1957 versus 2001 broilers when fed representative 1957 and 2001 broiler diets. poult Sci 2003; 82(10):1509-18.

44. An BK, Nishiyama H, Tanaka K, Ohtani S, Iwata T, Tsutsumi k, et al. Dietary safflower phospholipid reduces liver lipids in laying hens. poult Sci 1997; 76(5):689-95.

45. Crespo AN, Esteve-García E. Dietary fatty acid profile modifies abdominal fat deposition in broiler chickens. poult Sci 2001; 80:71-8.

46. Crespo AN, Esteve-García E. Dietary polyunsaturated fatty acids decrease fat deposition in separable fat depots but not in the remainder carcass. poult Sci 2002; 81:512-8.

47. Sinsigalli N, McMurtry Jp, Cherry JA, Siegel pB. Glucose tolerance, plasma insulin and immunoreactive glucagon in chickens selected for high and low body weight. J Nutri 1987; 117(5):941-7.

48. Hermier D, Quignard-Boulangé A, Dugail I, Guy G, Salichon MR, Brigant L, et al. Evidence of enhanced storage capacity in adipose tissue of genetically fat chickens. J Nutri 1989; 119(10):1369-75.

49. Sato K, Akiba Y, Chida Y, Takahashi K. Lipoprotein hydrolysis and fat accumulation in chicken adipose tissues are reduced by chronic administration of lipoprotein lipase monoclonal antibodies. poult Sci 1999; 78(9):1286-91.

50. Musa HH, Chen GH, Wang KH, Li BC, Mekki DM, Shu JT, et al. Relation between serum cholesterol level, lipoprotein concentration and carcass characteristics in genetically lean and fat chicken breeds. J Biol Sci 2006; 6(3):616-20.

51. Hermier D, Catheline D, Legrand p. Relationship between hepatic fatty acid desaturation and lipid secretion in the estrogenized chicken. Comp Biochem physioly 1996; 115A(3):259-64.

52. Walzem RL, Davis pA, Hansen RJ. Overfeeding increase very low density lipoprotein diameter and causes the appearance of a unique lipoprotein particle in association with failed yolk deposition. J Lipid Res 1994; 35(8):1354-66.

53. Bacon WL, Musser MA, Brown KI. plasma free fatty acid and neutral lipid concentrations in immature, laying and broody turkey hens. poult Sci 1974; 53:1154-60.

54. Hermier D, Forgez p, Williams J, Chapman MJ. Alterations in plasma lipoproteins and apolipoproteins associated with estrogen-induced hyperlipidemia in the laying hen. Eur J Biochem 1989; 184(1):109-18.

98



55. Walzem RL, Hansen RJ, Williams DL, Hamilton RL. Estrogen induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying hens. J Nutri 1999; 129(2):467S-72S.

56. Dashti N, Kelley JL, Thayer RH, Ontko JA. Concurrent inductions of avian hepatic lipogenesis, plasma lipids, and plasma apolipoprotein B by estrogen. J Lipid Res 1983; 24(4):368-80.

57. Kudzma DJ, Claire F, DeLallo L, Friedberg SJ. Mechanism of avian estrogen-induced hypertriglyceridemia: evidence for overproduction of triglyceride. J Lipid Res 1975; 16(2):123-33.

58. Kirchgessner TG, Heinzmann C, Svenson KL, Gordon DA, Nicosia M, Lebherz HG, et al. Regulation of chicken apolipoprotein B: cloning, tissue distribution, and estrogen induction of mRNA. Gene 1987; 59(2-3):241-51.

59. Laziera CB, Wiktorowicza M, DiMattiaa GE, Gordonb DA, Binderb R, Williamsb DL. Apolipoprotein (apo) B and apoII gene expression are both estrogen-responsive in chick embryo liver but only apoII is estrogen-responsive in kidney. Mol Cell Endocrinol 1994; 106(1):187-94.

60. Bacon WL, Leclercq B, Blum JC. Difference in metabolism of very low density lipoprotein from laying chicken hens in comparison to immature chicken hens. poult Sci 1978; 57:1675-86.

61. Rahim A. Type of fatty acids, lipoprotein secretion from liver and fatty liver syndrome in laying hens. Int J poult Sci 2005; 4(11):917-9.

RESUMEN

Objetivo. Actualizar conceptos sobre el funcionamiento normal de la glándula tiroides en caninos.

Materiales y métodos. Se analizó la literatura disponible de los últimos 50 años en las bases de datos BBCS-LILACS, Fuente Académica, IB-PsycINFO, IB-SSCI, IB-SciELO, Scopus y Scirus, al igual que artículos históricos, textos y referencias citadas en trabajos públicos.

Resultados. Se obtuvo información pertinente relacionada con los objetivos propuestos en la presente revisión, por lo cual puede clasificarse en 3 secciones a saber: síntesis de las hormonas tiroideas, transporte de las hormonas tiroideas, funciones de las hormonas tiroideas.

Conclusión. La glándula tiroides juega un papel importante, como productora de hormonas tiroideas, siendo necesarias para la diferenciación celular y crecimiento del organismo. El buen funcionamiento de las vías metabólicas depende de estas hormonas, las que tienen efectos específicos sobre diferentes órganos, manteniendo la homeostasis entre todos los tejidos.

Palabras clave: hormonas, tiroides, perros.

UPDATE OF THE THYROID GLAND FUNCTIONING IN CANINES.

PART I: NORMAL FUNCTIONING

ABSTRACT

Objective. To update concepts related to normal function of the thyroid gland in canines.

Materials and methods. Information from the last 50 years including the BBCS-LILACS data bases, Fuente Académica, IB-PsycINFO, IB-SSCI, IB-SciELO, Scopus and Scirus, databases as well as historical articles, texts and references cited in work published to date were analyzed.

Results. Pertinent information related with the objectives proposed in the present review was found and analyzed. It was then divided into three sections as follows: synthesis of thyroid hormones, transport of thyroid hormones and functions of thyroid hormones.

Conclusion. The thyroid gland plays an important role producing thyroid hormones which are necessary for cellular differentiation and organic growth. The adequate functioning of metabolic ways depends of these hormones, which have specific effects on different organs maintaining homeostasis between all tissues.

Key words: hormones, thyroid, dogs.

ACTUALIZACIÓN EN EL FUNCIONAMIENTO DE LA GLÁNDULA TIROIDES EN CANINOS.

PRIMERA PARTE: FUNCIONAMIENTO NORMAL.

José Henry Osorio1

Catalina López Salazar2

1 Laboratorio de Investigación en Bioquímica Clínica y patología Molecular, Departamento de Ciencias Básicas de la Salud, Universidad de Caldas. E-mail: [email protected] Departamento de Salud Animal, Universidad de Caldas.

ISSN 1657-9550Recibido: febrero 16 de 2011 - Aceptado: agosto 4 de 2011


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José Henry Osorio, Catalina López Salazar


INTRODUCCIÓN

La glándula tiroides se localiza circundando la tráquea, y es una glándula endocrina que se caracteriza por tener un alto grado de vascularización, estructura compacta y un color rojizo. Esta glándula representa aproximadamente 0,2% del peso corporal de un canino. Por su condición de glándula endocrina secreta las hormonas producidas al torrente sanguíneo, donde se dirigen a las células blanco (1). Los dos lóbulos laterales, izquierdo y derecho, comprenden la mayor parte de la glándula. Tienen una forma alargada, estrecha, elipsoidal y aplanada. Están situados sobre las caras laterales de la tráquea, cerca a la laringe y se extienden a lo largo de los seis o siete primeros anillos (2). Ambos lóbulos están conectados por un istmo que se extiende a través de la cara ventral de la tráquea. Dicho istmo es de carácter variable, ya que en perros de tamaño grande se presenta como una cinta glandular de 1cm de ancho, en perros medianos a menudo está ausente y en perros pequeños habitualmente no se encuentra. En caninos, pueden encontrarse glándulas tiroideas accesorias, 3 o 4 a cada lado, o en la línea media cerca al hioides, después de la extirpación de la glándula. Las glándulas tiroides normales en los perros, no son palpables (3).

La vascularización de la glándula consta principalmente de dos arterias tiroideas, relativamente gruesas, que se originan desde la carótida. Sus ramas penetran la glándula por las extremidades o el borde dorsal. Las venas son voluminosas y abocan a la vena yugular interna. La glándula posee una doble innervación autonómica, adrenérgica de los ganglios cervicales y colinérgica de los nervios vagos. Esta inervación regula básicamente el flujo sanguíneo de la glándula, lo que modula el aporte de TSH (hormona estimulante de la tiroides), yodo y otros sustratos esenciales para el metabolismo normal de la tiroides (4). La función principal de la tiroides es la producción de las hormonas tiroideas tiroxina (T4) y triyodotironina (T3). Para mantener una cantidad adecuada de hormonas

tiroideas en el organismo, el organismo cuenta con un mecanismo de retroalimentación endocrino, conformado por el hipotálamo, la adenohipófisis y la tiroides. La síntesis y secreción de las hormonas tiroideas está regulada principalmente por la hormona estimulante de la tiroides, TSH, también llamada tirotropina. Esta es producida por las células tirotropas presentes en la adenohipófisis. Esta hormona presenta un ritmo diario normal, y su nivel máximo en la circulación se alcanza durante la noche (5). Por su parte, la producción de TSH está regulada por la hormona liberadora de la tirotropina, TRH, producida en el hipotálamo. La TRH es secretada a las terminaciones nerviosas de la eminencia media y de allí es transportada a la adenohipófisis. La TSH en la tiroides, estimula todas las actividades de síntesis y secreción dentro de la célula folicular tiroidea. Las hormonas tiroideas al ser liberadas a la circulación, ejercen una retroalimentación negativa sobre la producción de TRH y TSH (6). Los estados de ansiedad y excitación, producen una disminución en la secreción de TSH ya que se aumenta el metabolismo y el calor, lo cual tiene un efecto negativo en el centro del calor. En cambio, en condiciones de frío se eleva la producción y secreción de la TRH y la TSH, debido al estímulo de los centros hipotalámicos del control de la temperatura (7). Las células tirotropas de la adenohipófisis son las controladoras del sistema, ya que el nivel de hormonas tiroideas que perciben es representativo de la concentración de estas en el organismo, y no se requiere recibir señales de otros tejidos como el muscular sobre la cantidad de hormonas tiroideas que llegan a éste (8). La TSH estimula la célula funcional de la tiroides, la célula folicular o folículo. Los folículos son la unidad básica funcional de la tiroides, y consisten en una capa simple de células epiteliales que encierran una cavidad llamada lumen folicular, cuyo diámetro oscila entre 3 y 300 µm. El lumen está lleno de un coloide proteináceo de aspecto claro, que contiene gránulos homogéneos de glicoproteína, la tiroglobulina principalmente, producto de las actividades secretorias de las células

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Actualización en el funcionamiento de la glándula tiroides en caninos. primera parte: funcionamiento normal.

foliculares. Este coloide es la principal forma de almacenamiento de las hormonas tiroideas (9). El segundo tipo de célula endocrina encontrada en la tiroides, la células C o parafoliculares, se localizan en la pared folicular o los espacios interfoliculares. Estas células producen y secretan una hormona polipeptídica llamada calcitonina, importante en la regulación del calcio (10). El yodo es fundamental en la síntesis de las hormonas tiroideas triyodotironina (T3) y tiroxina (T4), siendo utilizado para yodación de la proteína tiroglobulina para obtener las formas finales de las hormonas tiroideas. Por esta razón, es una ventaja que la glándula tenga un sistema altamente especializado de acumulación de la mayor cantidad posible de yodo disponible en la sangre. Por otro lado, debido a la morfología del folículo tiroideo, la tiroides está conformada no solo para transportar, sino para almacenar el yodo para cumplir con demandas futuras, mostrando una adaptación notable a la escasez de yodo en el ambiente (11). En la dieta de los animales el yodo se encuentra en cantidades

limitadas, muchas veces insuficiente para los requerimientos del organismo. Las plantas marinas son ricas en yodo, pero en lugares terrestres muchas regiones del mundo tienen deficiencias de yodo (12). La dosis diaria recomendada de yodo es 35 µg/kg (276 nmol/kg pv) para un perro adulto y 70 µg/kg (551,6 nmol/kg pv) para un cachorro en crecimiento. La absorción intestinal de este mineral es muy eficiente y existe un mecanismo de reciclaje interno del mismo. Pocas cantidades de yodo se pierden del organismo por vías excretorias como la orina, saliva, lágrimas, leche, sudor y heces. Es notable también que la tiroides puede almacenar grandes cantidades de hormona, suficientes para 1 a 3 semanas de secreción normal, a diferencia de otras glándulas endocrinas. La tiroides contiene aproximadamente el 20% del yodo total del organismo. El contenido de yodo varía con la cantidad ingerida de este mineral y con el estado funcional de la glándula, pero usualmente contiene alrededor de 10 a 40 mg de yodo por 100 g de tejido tiroideo (13).

Figura 1. Proceso de síntesis de hormonas tiroideas. 1: Captación de yodo. 2: Organificación del yodo, yodación de la tirosina. 3: Acoplamiento. 4: Pinocitosis por medio de pseudópodos

desde el coloide. 5: Proteólisis de la tiroglobulina. 6: Reciclaje de yodo. 7: Liberación.

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La captación de yodo es el primer paso para la producción de las hormonas tiroideas. La fuente de yodo del organismo es exclusivamente la ingestión de alimentos que contengan este mineral. El yodo puede ser absorbido tanto en su forma inorgánica (I-) como la orgánica (IO4

-). La vía de absorción más importante es a través de las células de la mucosa del intestino delgado proximal. También puede haber absorción en menor grado de compuestos yodados a través de las membranas mucosas o epitelio dañado (14). Posteriormente, se realiza la hidrólisis enzimática del yoduro en células del hígado y el riñón, de ahí pasa a la circulación sanguínea al unirse a proteínas séricas, principalmente la albúmina. El yodo circulante es captado especialmente por la glándula tiroides, pero también entra al riñón, las glándulas salivales y la glándula mamaria lactante (15). Esta es importante ya que permite la transferencia de yoduro a la leche, donde es ingerido por el recién nacido lactante para que este tenga disponibilidad del mineral para sintetizar hormonas tiroideas. La eliminación de yodo se realiza primordialmente en forma de yoduro a través del riñón, y en menor cantidad por las heces en forma de yodo orgánico (16).

Para que la síntesis de hormonas se pueda llevar a cabo, el yodo ingerido en la dieta es transportado activamente desde la sangre contra un gradiente de concentración a través de la membrana plasmática hacia el citoplasma de las células foliculares (captación de I-). Posteriormente, es transportado pasivamente hacia el lumen folicular (flujo de I-), donde se realiza la síntesis hormonal (17). El simportador Na+/I-, NIS, consiste en una glucoproteína presente en la membrana plasmática de las células foliculares, que permite el transporte activo de yodo al interior de las células. Tiene un peso molecular de 87 KDa y está compuesta por 643 aminoácidos. El mecanismo de acción del NIS, consiste en asociar el transporte de Na+

al interior de la célula a favor de su gradiente electroquímico y simultáneamente el transporte de I- en contra del gradiente de concentración, hacia el citoplasma de la célula folicular (18).

En condiciones fisiológicas, el NIS permite la concentración de iones I- dentro de la célula de 20 a 40 veces superiores a las encontradas en la circulación sanguínea en condiciones normales, y hasta 250 veces en etapas activas (19). Por cada molécula de I- se transportan dos moléculas de Na+. El gradiente de Na+ que permite la captación de yodo, se mantiene en equilibrio gracias a la Na+/K+ ATPasa, que con gasto de ATP, transporta activamente 3 moléculas de Na+ hacia el exterior de la célula, y 2 moléculas de K+ hacia el citoplasma. Ambos transportadores de membrana se localizan en la cara basolateral de las células foliculares, adyacentes al flujo sanguíneo (20).

Aunque la presencia del simportador NIS se concentra principalmente en la tiroides, también se ha encontrado en células epiteliales de órganos secretores como el estómago, las glándulas salivares o la glándula mamaria; además, puede encontrarse en las mucosas intestinales, placentarias y renales. Su función está regulada directamente por la TSH (21).

En la actualidad se conocen algunos compuestos que inhiben la entrada de iones I- a las células foliculares. La ouabaína por ejemplo, un potente esteroide cardiotónico, inhibe la bomba Na+/K+

ATPasa, interrumpiendo el gradiente necesario para el transporte de I- (22).

Otro tipo de compuestos como los tiocianatos (SCN-), los percloratos (CLO4), los nitratos y bromuros, inhiben el paso a través de la membrana del yodo, ya que pueden actuar como inhibidores competitivos del yodo al ser iones de tamaño, forma y carga similar. El transporte también es autorregulado por los niveles intratiroideos de I-, aumentando en estados de depleción y disminuyendo en caso de exceso (23). Por otra parte, el mecanismo del flujo de I- hacia el lumen folicular, no está esclarecido completamente, pero se sugiere que es mediado por otro transportador de membrana situado en el borde apical de las células foliculares. Dicho transportador se desconoce, pero existen

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2 proteínas, la pendrina y el AIT (transportador apical de yodo), que han sido propuestas como posibles mediadoras del flujo de yodo hacia el lumen folicular (24).

La pendrina es una proteína con peso molecular de 100 KDa y compuesta de 780 aminoácidos. Este transportador se encuentra esencialmente en la tiroides, pero también puede hallarse en las células de los túbulos recolectores en el riñón. Su función principal es permitir el transporte de aniones, especialmente cloruros, nitratos y bicarbonatos, independientemente del transporte de sodio. El papel que desempeña en el transporte de yodo al folículo luminar no está comprobado hasta el momento, pero se sugiere que puede tener un cotransportador o ser parte de un complejo multiproteico que se encarga de este transporte (25).

Por su parte el AIT o transportador apical de yodo también es considerado como un transportador potencial de yodo al folículo luminar. Se trata de una proteína de peso molecular de 69 KDa compuesta por 610 aminoácidos y se localiza en el polo apical de la célula folicular. Se conoce que su función es transportar iones monocarboxílicos en contra del gradiente de Na+. Su papel en el transporte de yodo es discutido ya que la TSH no tiene influencia sobre su regulación (26). Una vez el yodo se encuentra en el lumen folicular, se lleva a cabo un paso crítico en la formación de las hormonas tiroideas, la conversión de iones yoduro a una forma oxidada de yodo, I0 o I3, que tiene la capacidad de unirse directamente al aminoácido tirosina (27).

Esta reacción es catalizada por la enzima peroxidasa tiroidea (TPO), y cuenta con la presencia de peróxido de hidrógeno, generado por la actividad catalítica de una enzima NADPH dependiente de calcio presente en el borde apical; estos componentes combinados conforman un sistema eficiente para la oxidación del yodo. La peroxidasa se encuentra en la membrana apical de la célula folicular, allí se libera el yodo en el lugar donde se libera la

tiroglobulina desde el aparato de Golgi hacia el lumen folicular. Cuando el sistema de la enzima peroxidasa se bloquea, o existe una ausencia congénita de esta enzima, la capacidad de síntesis de hormonas tiroideas es nula (28).

La función normal de esta enzima puede ser inhibida por agentes tirotóxicos como los tiouracilos y tioureas (29).

El paso siguiente en la síntesis de hormonas tiroideas tiene que ver con la presencia de la tiroglobulina (Tgb), esta es una glicoproteína de peso molecular de 660 KDa, solo 10% de su estructura consiste en carbohidratos y constituye el 75% de las proteínas tiroideas. Esta glicoproteína es la matriz para la síntesis de las hormonas tiroideas, y es la forma de almacenamiento de estas últimas en la glándula. Está codificada por un RNA con 8600 nucleótidos, y al sintetizarse la porción peptídica en los ribosomas que se encuentran en retículo endoplásmico rugoso, se comienza la glucosilación en dicho organelo y se continúa en el aparato de Golgi. Una vez concluye este proceso, la Tgb se incorpora a las vesículas citoplasmáticas exocíticas, que migran hacia la membrana apical para fusionarse con ella. En este estadio, la Tgb glucosilada, es apta para ser yodinada y luego almacenada en el lumen folicular (30). Posteriormente se da la organificación de la tiroglobulina, este proceso consiste en la unión del yodo a la molécula de tiroglobulina. El yodo oxidado, se une directamente al aminoácido tirosina, lo cual es eficiente gracias a la enzima yodasa, que cataliza la unión. Así, a medida que la tiroglobulina se libera al lumen folicular, el yodo se une a una molécula de tirosina. Cada molécula de tiroglobulina contiene unas 70 tirosinas disponibles para convertirse en los sustratos que se combinan con el yodo oxidado para formar las hormonas tiroideas. De esta forma las hormonas tiroideas se forman dentro de la tiroglobulina. Es decir, la tiroxina y triyodotironina formadas a partir de la tirosina hacen parte de la molécula de tiroglobulina durante la síntesis de más hormonas y durante

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el almacenamiento dentro del coloide en el lumen folicular (31). Los productos yodados iniciales son la monoyodotirosina (MIT) y la diyodotirosina (DIT). En condiciones normales se forma mayor cantidad de DIT, pero cuando el yodo es escaso hay menor tasa de yodación y la relación DIT/MIT es inversa. Este proceso también es catalizado por la TPO. El acoplamiento de dos moléculas de tirosina yodada permite la aparición de las hormonas tiroideas, 2 moléculas de diyodotirosina unidas forman tetrayodotironina (T4 o tiroxina) que constituye el producto más importante de la síntesis hormonal, y la unión de una monoyodotirosina y una diyodotirosina forman triyodotironina (T3), que representa la quinceava parte del número total de hormonas producidas (32). Existen mecanismos de control que forman parte de la hormonogénesis tiroidea, entre ellos están los mediados por el aumento de los niveles citoplasmáticos de ácido ascórbico y del glutatión reducido, que disminuyen los niveles de H2O2

- (33).

Al finalizar la síntesis hormonal, cada molécula de tiroglobulina contiene hasta 30 moléculas de tiroxina y algunas de triyodotironina. En un canino normal, aproximadamente el 30% de la masa tiroidea corresponde a tiroglobulina, lo que corresponde a una cantidad suficiente de hormona para cubrir las necesidades del organismo durante 2 a 3 meses. Por esta razón cuando cesa la síntesis hormonal, los efectos fisiológicos causados por el déficit tardan meses en aparecer (34).

La tiroglobulina almacenada en el lumen folicular está separada de los capilares por una capa densa de células foliculares. Por esta razón esta molécula debe entrar a la célula folicular para que las hormonas sean liberadas a la circulación sistémica. La tiroglobulina como tal, no se libera a la sangre en cantidades significativas, por esta razón debe pasar por un proceso de escisión, para que así puedan separarse la tiroxina y triyodotironina y sea posible enviarlas a través del torrente sanguíneo a los diferentes tejidos

blanco (35). Este proceso comienza al emitirse extensiones de protoplasma desde la superficie apical de la célula, llamadas pseudópodos, que captan pequeñas porciones del coloide luminar formando vesículas pinocíticas, que entran de nuevo a la célula. Dicho proceso se lleva a cabo por estimulación aguda de TSH. Inmediatamente las vesículas pinocíticas migran a la membrana basal de la célula y se fusionan con los lisosomas celulares. Estos lisosomas son ricos en proteasas, esterasas y fosfatasas; las proteasas degradan las moléculas de tiroglobulina a fragmentos peptídicos y aminoácidos libres, incluidos T4, T3, MIT y DIT. Solamente la tiroxina y triyodotironina son liberadas a la sangre, en una relación 20:1. Este proceso no está muy claro, pero se mantiene la teoría de que las hormonas se difunden al torrente sanguíneo desde la célula folicular por un gradiente de concentración (36).

Alrededor de las tres cuartas partes de tirosina no es liberada como hormonas, sino que permanece como MIT y DIT, estas no se liberan a la circulación, sino que el yodo que contienen es desprendido por la acción de la yodotirosina deshalogenasa (enzima microsomal dependiente de NADPH) que libera el yodo. Esto impide que las tironinas no activas metabólicamente se secreten al torrente sanguíneo. Estas enzimas son activadas por la acción de la TSH, ya que esta aumenta las concentraciones intratiroideas de NADPH. Cuando hay una ausencia congénita de estas enzimas, se presenta un déficit de yodo debido al fracaso en el reciclaje del mismo (37).

El yodo liberado es almacenado de dos formas: un acúmulo pequeño, que contiene el yodo recién liberado, que es utilizado para el recambio inmediato, y un depósito grande que contiene la mayoría del yodo antiguo. Una parte de este yodo es reutilizado en la síntesis, mientras que el resto es secretado desde la glándula a la circulación, y es excretado por los riñones (38).

Alrededor del 93% de las hormonas liberadas por la glándula tiroidea corresponde en condiciones normales a la tiroxina y solo el 7% a la triyodotironina (39).

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Transporte de hormonas tiroideas

Dado que las hormonas t iroideas son lipososolubles, estas son transportadas en la sangre unidas a proteínas plasmáticas específicas. Al llegar al torrente sanguíneo, el 99% de T4 y T3 se combinan con estas proteínas, sintetizadas en el hígado. La más importante de estas proteínas es la TBG (globulina fijadora de la tiroxina), siendo la prealbúmina ligante de tiroxina y la albúmina fijadora de la tiroxina utilizadas en menor medida (40).

Las funciones de estas proteínas plasmáticas incluyen aumentar la cantidad de hormonas circulantes, retrasar la depuración hormonal y regular el suministro de hormonas a los distintos tipos de tejidos. Los cambios en la síntesis y degradación, o cambios en la estructura de estas proteínas, afectan directamente la cantidad de T3 y T4 circulantes. La producción de TBG está controlada por los estrógenos, por esta razón hay aumento de las hormonas tiroideas en las hembras durante el embarazo (41).

La TBG tiene una alta afinidad a la T4, pero tiene baja capacidad de transporte de las hormonas tiroideas debido a su baja concentración el plasma. Por el contrario, la albúmina tiene baja afinidad por las hormonas tiroideas, pero debido a sus altas concentraciones tiene una alta capacidad de transporte. En ausencia de TBG, esta proteína es la principal transportadora de hormonas tiroideas. También se presenta la tercera clase de proteína transportadora, la prealbúmina, que es específica para tiroxina, y su especificidad y capacidad son intermedias entre la albúmina y la TBG (42). Los niveles circulantes de las proteínas ligadoras pueden afectarse por agentes farmacológicos como los salicilatos y la fenitoína (43).

La hormona que se encuentra ligada a las proteínas transportadoras, está en equilibrio reversible con una fracción “libre”. Solo la hormona libre está disponible para su uso en los diferentes tejidos. Por ende, los mecanismos

homeostáticos que regulan el eje tiroideo, pretenden mantener concentraciones adecuadas de hormonas libres. Los ajustes para mantener una cantidad normal de hormona libres, se producen rápidamente con un descenso abrupto en la tasa metabólica o estimulando la producción de hormonas tiroideas al liberarse TSH (44).

En caninos aproximadamente algo menos del 1% de T4 y un poco más del 1% de T3 están libres en la sangre, esto se debe a la menor afinidad de las hormonas a las proteínas ligadoras en el plasma de los caninos con respecto a otras especies, donde los porcentajes de hormonas libres son menores. Debido a la gran afinidad de las hormonas tiroideas por las proteínas plasmáticas previamente mencionadas, estas hormonas, especialmente la tiroxina, son liberadas lentamente a los tejidos blanco. La mitad de la T4 en la sangre se libera aproximadamente cada 6 días, y la T3 que tiene menor afinidad, se libera en un día (45). Las concentraciones en sangre de las hormonas tiroideas pueden estar influenciadas por la edad, condiciones climáticas, preñez, medicamentos, estrés, ejercicio y nutrición (46).

Al llegar a los tejidos, las hormonas tiroideas penetran las células a través de mecanismos que aún no están esclarecidos. Dentro de las células, las hormonas pueden ser metabolizadas por distintas vías. La desyodación es la más importante, presentándose también la formación de glucurónidos y sulfatos en procesos de conjugación hepática. En fracciones menores se modifica la fracción alanina de las tironinas por descarboxilación o transaminación (47). El metabolismo de las hormonas tiroideas en los órganos difiere, lo que indica que las enzimas encargadas de metabolizar las hormonas en cada tejido varían, además que existen diversas isoformas de receptores específicos para las hormonas en cada tejido (48).

La mitad de la T4 se desyoda de forma lenta en los días siguientes a la liberación desde

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la glándula, formando T3. Por esta razón, la hormona empleada en los tejidos es la T3. El hígado y los riñones, cuentan con la mayor cantidad de enzimas desyodadoras, pero el músculo es el que presenta mayor producción de T3 respecto a su tamaño relativo. La enzima que retira el yoduro del anillo fenólico externo de la tiroxina para formar triyodotironina, es la 5’-monodesyodinasa. Esta enzima es una selenoproteína, ya que en su sitio activo está presente el aminoácido selenocisteína (Se-Cis). También puede presentarse la formación de otro tipo de T3 al retirarse el yodo del anillo fenólico interno de la T4, este producto se llama T3 inversa o reversa (rT3), y tiene un efecto metabólico menor que las hormonas producidas en la tiroides. Este tipo de hormona se forma exclusivamente por la acción de enzimas desyodadoras extratiroideas (49). Dentro del citoplasma la T3, la forma activa metabólicamente de la hormona tiroidea, migra al núcleo y se une al receptor de hormona tiroidea (TR). Se forma entonces el complejo hormona-receptor y se une a elementos de respuesta de hormona tiroidea (TRE), situados encima del promotor de los genes diana, donde puede ejercer una regulación negativa o positiva. Se han descrito 2 isoformas de receptores tiroideos, TRα y TRβ. La localización en el organismo de ambas isoformas varía, ya que ambas se encuentran en tejido muscular, óseo, adiposo y cerebral pero TRβ se encuentra además en el oído interno, cerebelo, adenohipófisis e hipotálamo, ya que tiene un papel importante en la regulación del eje hipotálamo-hipófisis-tiroides (50).

Funciones de las hormonas tiroideas

Los productos hormonales de la glándula tiroides están involucrados en una amplia gama de procesos fisiológicos, y causan alteraciones en la mayoría de vías metabólicas en todos los órganos (51). Los efectos de las hormonas tiroideas se pueden describir en 3 categorías: efectos en diferenciación celular y crecimiento, efectos en vías metabólicas y efectos específicos en órganos y sistemas del organismo.

Uno de los efectos más notables de las hormonas tiroideas es en el crecimiento corporal. El crecimiento fetal temprano, aparentemente está controlado solamente por genes. No existen estudios que determinen que las hormonas tiroideas sean necesarias antes de la aparición de la tiroides funcional en el feto (36). Sin embargo, el crecimiento del neonato y la obtención del tamaño de un adulto normal requieren cantidades adecuadas de hormonas tiroideas (52). Estas hormonas estimulan tanto la osteogénesis como la osteólisis. En el proceso de la osteogénesis estimulan proteínas implicadas en la formación de la matriz ósea como la fosfatasa alcalina, osteocalcina y colágeno. Por otro lado, en la osteólisis el efecto es indirecto, al estimular la liberación paracrina de factores específicos por parte de los osteoblastos, cuya función es activar los osteoclastos, responsables de la resorción ósea (53). Las hormonas tiroideas también actúan sinérgicamente con la hormona del crecimiento, el factor de crecimiento similar a la insulina I, y otros factores de crecimiento que promueven el crecimiento óseo. También ejercen una acción indirecta en el crecimiento al actuar en la adenohipófisis y el hipotálamo, al ser necesarias para la síntesis y secreción óptima de la hormona del crecimiento, además, estimulan la proliferación de cartílago y la maduración de la epífisis (54).

En el sistema nervioso central, las hormonas y sus receptores se presentan tempranamente en el desarrollo del cerebro del feto, mucho antes de que la glándula tiroides como tal sea funcional. Probablemente, las hormonas presentes en el feto se originan de la madre, y oportunamente cruzan la barrera plancetaria hacia el feto. La maduración del sistema nervioso en el periodo después del nacimiento depende totalmente de las hormonas tiroideas, y estas deben estar presentes para el desarrollo normal del cerebro (55). En experimentos realizados en ratas, a las cuales se les retiró la tiroides al nacer, se notó que el crecimiento del cerebro y cerebelo y la mielinización de los nervios se retrasaron considerablemente. Esto se debe a que las

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hormonas tiroideas regulan la acción del factor de crecimiento neural (NGF), como también otras proteínas y glucósidos importantes en la mielinización. La vascularidad y el tamaño del cerebro se vieron disminuidos, debido a que se redujo la densidad axonal y la ramificación dendrítica (56).

La tasa de metabolismo basal, que mide el consumo de oxígeno en condiciones de reposo, es altamente sensible al estado tiroideo. La tasa de metabolismo basal de un organismo es la medida de la energía gastada después de la absorción intestinal de la comida, y es proporcional al consumo de oxígeno y al volumen corporal del individuo. Una disminución el consumo de O2 se deriva de una deficiencia de hormonas tiroideas, y se da el caso contrario en una producción exagerada de estas. El consumo de oxígeno en todos los tejidos excepto el cerebro, el bazo y los testículos depende de las hormonas tiroideas, y aumenta si se presenta un estímulo por parte de estas (57). El consumo de O2 se debe a la actividad de la mitocondria y es simultáneo a la formación de enlaces de alta energía en ATP. Entonces, se infiere que el consumo de oxígeno es proporcional a la utilización de energía. La T3 acelera los procesos dependientes de ATP, incluyendo la actividad de la ATPasa sodio-potasio, que mantiene la integridad iónica de todas las células y representa el 20% de consumo de O2 en reposo. La fosforilación del ADP para formar ATP está dada por el gradiente de protones producido a través de la membrana mitocondrial interna por el sistema de transporte de electrones, el cual entrega protones al O2 para formar agua. Por esta razón ambos procesos, consumo de oxígeno y síntesis de ATP, van de la mano (58). La filtración de protones a través de la membrana, produce una disparidad entre este consumo y la síntesis de ATP, al disipar el gradiente. Por esta razón el consumo de O2 produce una cantidad de energía extra, que es disipada en forma de calor. Esta filtración de protones depende de proteínas desacoplantes mitocondriales (UCPs) presentes en la membrana mitocondrial interna. Se han

identificado tres tipos de estas proteínas, y todas son reguladas por T3 (59). En animales jóvenes la grasa parda es una importante fuente de calor. Este tejido tiene una amplia cantidad de mitocondrias, que contienen la proteína desacoplante de la mitocondria UCP-1, también llamada termogenina, la cual permite que se oxide una mayor cantidad de ácidos grasos y así producir calor independientemente de las limitaciones impuestas por la cantidad de ADP disponible. La síntesis de la UCP-1 es inducida por T3 y también por la noradrenalina, con efectos sinérgicos entre ambas sustancias. La T3 también aumenta la eficacia de la noradrenalina para liberar ácidos grasos de triglicéridos almacenados, y así brinda combustible para la producción de calor (60).

Las hormonas t iroideas son l lamadas “calorigénicas” porque inducen de muchas maneras la producción de calor en la célula, como ya se expuso anteriormente. Estos efectos sobre el metabolismo oxidativo se presentan solo en especies animales que tienen una temperatura corporal constante, lo cual comprueba que los efectos calorigénicos de las hormonas tiroideas están relacionados con la termorregulación. Por esta razón, la exposición prolongada al frío ocasiona un aumento en la producción de TSH por parte de la glándula pituitaria y, por ende, el incremento de los niveles de T3 y T4 en la sangre y los tejidos periféricos. Los principales tejidos blanco de las hormonas tiroideas en cuanto a la estimulación del consumo de O2 son músculo esquelético, músculo cardíaco, hígado, tracto gastrointestinal y riñón (61). La T3 acelera prácticamente todos los aspectos del metabolismo, incluyendo el uso de carbohidratos. En primera instancia, aumenta la absorción de glucosa en el tracto digestivo, glucogenólisis y gluconeogénesis en las células hepáticas, y la oxidación de la glucosa en el hígado, tejido graso y miocitos. El mecanismo por el cual la hormona produce estos efectos no es directo, aunque induce la síntesis de enzimas que están involucradas en el metabolismo de carbohidratos y lípidos como la enzima

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málica, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y la 6-fosfogluconato deshidrogenasa, además la T3 actúa como amplificador de otras señales al inducir expresión de genes específicos (62). Algunos transportadores de glucosa como el GLUT4, están también regulados por T3, y al presentarse un estímulo de esta última, se aumenta la captación de glucosa en la célula. También induce la absorción intestinal de carbohidratos. Debido a que la glucosa es un precursor importante para la síntesis de ácidos grasos en células hepáticas y células del tejido adiposo, se necesitan niveles óptimos de T3 para la lipogénesis en dichas células, ya que esta tiene influencia sobre la cantidad disponible de carbohidratos. Además, estimulan las enzimas lipolíticas en el hígado y actúan en la movilización de depósitos de ácidos grasos desde el adipocito, y esta se ve disminuida en individuos con deficiencia de esta hormona (63).

En el organismo animal, las proteínas son degradadas y resintetizadas constantemente. Ambos procesos se ven acelerados con la presencia de la hormona tiroidea. En el caso de exceso de T4 o T3, se presenta catabolismo severo de las fibras musculares. En cuanto a la concentración de proteínas y enzimas en la sangre, las hormonas tiroideas tienen un efecto directo en algunas de ellas como la enzima convertidora de angiotensina (ECA), la albúmina y la proteína transportadora de hormonas sexuales (SHBG), afectándose entonces directamente la concentración de hormonas sexuales en el plasma, y presentándose síntomas de impotencia e irregularidades del ciclo estral si la concentración normal varía (64). Las hormonas tiroideas aumentan la actividad de las coenzimas y, por ende, se aumenta su demanda y la de las vitaminas de las cuales se derivan. También

participan en la síntesis de algunas enzimas a partir de vitaminas, por ejemplo permiten la síntesis de la flavina mononucleótido (FMN) y la flavina adenina dinucleótido (FAD) a partir de la riboflavina, al estimular la enzima flavoquinasa que participa en dicha reacción, y son importantes en el metabolismo de algunas vitaminas liposolubles, como el de la vitamina A, ya que influyen en la síntesis de esta a partir del caroteno, participando en la conversión de esta a retineno, sustancia necesaria para la visión nocturna. Se sabe además que inducen la síntesis de transaminasas (GPT y GTO) (65). En cuanto a los efectos en el sistema cardiovascular, las hormonas tienen un efecto inotrópico y cronotrópico positivo al favorecer la síntesis de la piruvato deshidrogenasa que disminuye la resistencia vascular sistémica. Asimismo, pueden regular el número de receptores beta adrenérgicos, incrementado la sensibilidad a catecolaminas. Por otro lado, en el sistema hematológico estimulan la eritropoyesis. En el músculo esquelético, favorecen la acción contráctil, la síntesis de miosina y de enzimas lisosómicas, además incrementando la acción de la creatinínquinasa y la captación de glucosa (66).

CONCLUSIÓN

La glándula tiroides juega un papel importante, como productora de hormonas tiroideas, siendo necesarias para la diferenciación celular y crecimiento del organismo. El buen funcionamiento de las vías metabólicas depende de estas hormonas, las que tienen efectos específicos sobre diferentes órganos, manteniendo la homeostasis entre todos los tejidos.

109


BIBLIOGRAFÍA

1. Sisson S, Grossman JD. Anatomía de los animales domésticos. 4a ed. Barcelona: Salvat; 1959. p. 524-526, 543.

2. O’Rahilly R, et al. Anatomía de Gardner. 5ª ed. México: McGraw-Hill, Interamericana S.A. de C.V.; 1989. p. 794-796.

3. Smith BJ. Canine Anatomy. philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 1999. p. 54-55.

4. Capen CC. Endocrine Glands. In: Maxie MG, ed. Jubb, Kennedy & palmer’s pathology of Domestic Animals. 5th ed. philadelphia: Elsevier Saunders; 2007. p. 379-382.

5. Landek M, Caturegli p. Anatomy of the Hypothalamic-pituitary-Thyroid Axis. In: Wondisford FE, Radovick S, eds. Clinical Management of Thyroid Disease. philadelphia: W.B. Saunders; 2009. p. 3-6.

6. Dumont JE. The action of thyrotropin on thyroid metabolism. Vitams. Horm. 1971; 29:287-412.

7. Fregly MG. Activity of the hypothalamic-pituitary-thyroid axis during exposure to cold. pharmacol Ther 1989; 4(1-2):85-142.

8. Molina pE. Endocrine physiology. 2nd ed. New York: McGraw-Hill; 2004. p. 73-92.

9. Brook CGD, Marshall NJ. Essential endocrinology. 4th ed. London: Blackwell Science; 2001. p. 78-85.

10. Rijnberk A. Clinical Endocrinology of Dogs and Cats. Dordrecht/Boston: Kluwer Academic publishers; 1996. p. 35-40.

11. Dohan O, Carrasco N. Advances in Na+/I- symporter (NIS) research in the thyroid and beyond. proceedings of the Conference entitled Thyroid and Gonadal Hormones in Health and Disease. Mol. Cell. Endocrinol. 2003 Dec; 213(1):59-70.

12. McDowell LR. Iodine, Minerals in Animal and Human Nutrition. 2ª ed. Amsterdam: Elsevier; 2003. p. 305-334.

13. Andersson H. Clinical Reproductive Endocrinology, Clinical Biochemistry of Domestic Animals 6th ed. San Diego: Academic press; 2008. p. 623-628.

14. Berson SA. pathways of iodine metabolism, Symposium on the pathologic physiology of Thyroid Diseases. Am J Med. 1956 May; 20 (5):653-669.

15. Myant NB, Corbett BD, Honour AJ, pochin EE. Distribution of radioiodide in man. Clin. Sci. 1950; 9:405.

16. Keating FR, power MH, Berkso l, Haines SF. The urinary excretion of radioiodine in various thyroid states. J. Clin. Invest. 1947; 26(6):1138.

17. Wolff J, Chaikoff IL. plasma inorganic iodide as a homeostatic regulator of thyroid. J. Biol. Chem. 1948; 174:555-564.

18. Levy O, Carrasco N. Structure and function of the thyroid iodide transporter and its implications for thyroid disease. Curr Opin Endocrinol Diabetes 1997; 4:364-370.

19. Riedel C, Dohán O, De la Vieja A, Ginter CS, Carrasco N. Journey of the iodide transporter NIS: from its molecular identification to its clinical role in cancer. Trends. Biochem. Sci. 2001; 26:490-496.

20. Dai G, Levy O, Amzel LM, Carrasco N. The mediator of thyroidal iodide accumulation: the sodium/iodide symporter. In: Konings WN, Kaback HR, Lolkema JS, eds. Handbook of biological physics.

110



Transport processes in eukaryotic and prokaryotic organisms. Amsterdam: Elsevier; 1996. p.343-367.

21. Dohan O, De la Vieja A, Carrasco N. Molecular Study of the Sodium-Iodide Symporter (NIS): A New Field in Thyroidology. Trends endocrinol metab. 2000 Apr; 11(3):99-105.

22. Massart C, Corbineau E. Transporteurs d’iodures et fonction thyroidienne. Immuno-analyse & Biologie Specialisée 2006; 21(3):138-143.

23. Vanderlaan LE, Vanderlaan Wp. The iodide concentrating mechanism of the rat thyroid and its inhibition by thiocyanate. Endocrinology 1947; 40:403.

24. Carrasco N. Iodide transport in the thyroid gland. Biochim Biophys Acta 1993; 1154:65-82.

25. Kohn LD, Suzuki K, Nakazato M, Royaux I, Green ED. Effects of thyroglobulin and pendrin on iodide flux through the thyrocyte. Trends endocrinol metab. 2001 Jan; 12(1):10-16.

26. Rodríguez AM, perron B, Lacroix L, Caillou B, Leblanc G, Schlumberger M, et al. Identification and characterization of a putative human iodide transporter located at the apical membrane of thyrocytes. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2002; 87:3500-3503.

27. Roche J, Michel R. Nature, biosynthesis and metabolism of thyroid hormones. physiol. Rev. 1955; 35:583.

28. Nussey SS, Whitehead SA. Endocrinology: An integrated approach. Exeter: BIOS Scientific publishers limited; 2001. p. 71-79.

29. McGinty DA, Sharp EA. Effect of iodine intake on thyroid iodine distribution and thyroid weight of rats treated with thiouracil and other goitrogens. J. Clin. Endocrinol. 1946; 6:473.

30. Roland M, Montfort M, Lissitsky S. Efficiency of thyroglobulin as a thyroid hormone-forming protein. Biochim Biophys Act 1993; 303:338-347.

31. Gross J, pitt-R R. 3,5,3’ triiodothryonine. Isolation from the thyroid gland and synthesis. Biochem J. 1953; 53:645-650.

32. Harington CR, Barger G. Chemistry of thyroxine III: Constitution and synthesis of thyroxine. Biochem. J. 1927; 21:169-171.

33. Vélez H, Rojas W, Borrero J, Restrepo J. Endocrinología - Fundamentos de medicina. 6ª ed. Medellín, Colombia: Corporación para Investigaciones Biológicas; 2004. p. 40-90.

34. Goodman HM. Thyroid Gland, Basic Medical Endocrinology. 3rd ed. San Diego: Academic press; 2003. p. 77-109.

35. Nunez J. Iodination and thyroid hormone synthesis. In: De Visscher M, ed. The thyroid gland. New York: Raven press; 1980. p. 39-60.

36. Lissitzky S. Thyroid hormones. In: Baulieu EE, Kelly pA. Hormones: From molecules to disease. France: Chapman and Hall; 1990. p. 343-363.

37. Roche J, Michel R, Lafon M. Sur la formation et des ses précurseurs dans les iodoprotéines. Biochim. et biophys. Acta, 1947; 1:453-466.

38. Murray RK, Granner DK, Mayes pA, Rodwell VW. Bioquímica de Harper. 15a ed. México: El Manual Moderno; 2001. p. 641-646.

39. Gershengorn MC, Glinoer D, Robbins J. Transport and metabolism of thyroid hormones. In: De Visscher M, ed. The thyroid gland. New York: Raven press; 1980. p. 81-121.

111


40. Leeper R. Recent Advances in the Biochemistry of Thyroid Regulation. In: Bodansky O, Stewart Cp, eds. Advances in Clinical Chemistry. New York: Elsevier; 1969; 12:387-424.

41. Wiersinga WM. Thyroid Gland, Anatomy and physiology. In: Luciano Martini, Editor in Chief. Encyclopedia of Endocrine Disease. New York: Elsevier; 2004. p. 453-45.

42. Oppenheimer JH. Role of the plasma proteins in the binding, distribution and metabolism of the thyroid hormones. N. Eng. J. Med. 1968; 278:1153-1662.

43. Merchant B, Lees FH, Alexander WK. Antithyroid drugs. In: Hershman JA, Bray GA, eds. The thyroid. Oxford: pergamon press; 1979. p. 252-290.

44. Gordon AH, Gross J, O’Connor D, pitt-Rivers R. Nature of the circulating thyroid hormone plasma protein complex. Nature 1952; 169:19-20.

45. Cunningham JG. Fisiología Veterinaria. 3a ed. Madrid: Saunders; 2003. p. 342-346.

46. Journal of Equine Veterinary Science. Thyroid hormone 1997 Dec; 17(12):654-655.

47. Leonard JL, Visser TJ. Biochemistry of deodination. In: Henneman G, ed. Thyroid hormone metabolism. New York: Marcel Dekker; 1986. p. 189.

48. Bianco AC, Larsen pR. Intracellular pathways of iodothyronine metabolism. In: Braverman LE, Utiger RD. Werner & Ingbar’s the thyroid: A fundamental and clinical test. 9th ed. philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2005. p 109-131.

49. St. Germain DL, Galton VA. The deodinase family of selenoproteins. Thyroid 1997; 7:655.

50. Oppenheimer JH. Thyroid hormone action at the cellular level. Science 1979. 20:971-979.

51. Neal JM. How the endocrine system works. Massachusetts: Blackwell Science; 2001. p. 23-26.

52. Weiss RE, Refetoff S. Effect of thyroid hormone on growth. Lessons from the syndrome of resistance to thyroid hormone. Endocrinol. Metab. Clin. North Am. 1996; 25:719-730.

53. Greenspan SL, Greenspan FS. The effect of thyroid hormone on skeletal integrity. Ann. Intern. Med. 1999; 130:750-758.

54. Bassett JHD, Williams GR. The molecular actions of thyroid hormone in bone. Trends endocrinol metab. 2003 Oct; 14(8):356-364.

55. porterfield Sp, Henderson CE. The role of thyroid hormone in prenatal and neonatal neurological development – current perspectives. Endocr. Rev. 1993; 14:94-106.

56. Bernal J. Thyroid Hormones and Brain Development. In: pfaff DW, Arnold Ap, Fahrbach SE, Etgen AM, Rubin RT, eds. Hormones, Brain and Behavior. San Diego: Academic press; 2002. p. 543-587.

57. Yen pM. physiological and Molecular Basis of Thyroid Hormone Action. physiol Rev 2001 Jul; 81:1097-1142.

58. Simonides WS. Thyroid Hormone Action. In: Martini L, Editor in Chief. Encyclopedia of Endocrine Diseases. New York: Elsevier; 2004. p. 462-473.

59. Lanni A, Moreno M, Lombardi A, Goglia F. Thyroid hormone and uncoupling proteins. FEBS Letters 2003 May; 543(1-3):5-10.

60. Hoch FL. Lipids and thyroid hormones. prog Lipid Res 1988; 27(3):199-270.

112



61. Collin A, Cassy S, Buyse J, Decuypere E, Damon M. potential involvement of mammalian and avian uncoupling proteins in the thermogenic effect of thyroid hormones. Farm Animal Endocrinology Special Issue part 1. Domest Anim Endocrinol 2005 Jul; 29(1):78-87.

62. Reece WO. Functional anatomy and physiology of domestic animals. 4th ed. Iowa: Wiley-Blackwell; 2009. p. 165-167.

63. Netter FH, Forsham pH, Monteys EG. Sistema endocrino y enfermedades metabólicas. 1a ed. Barcelona: Elsevier; 2006. p. 47-49.

64. Harvey CB, Williams GR. Mechanism of thyroid hormone action. Thyroid 2002; 12:441-446.

65. Brandan NC, Llanos IC, Miño CA, Ruiz DA. Hormonas tiroideas. Actualización. Argentina: Universidad Nacional del Nordeste; 2007. p. 1-7.

66. Cini G, Carpi A, Mechanick J, Cini L, Camici M, Galetta F, Giardino R, Russo MA, Lervasi G. Thyroid hormones and the cardiovascular system: pathophysiology and interventions. Biomed pharmacother 2009 Dec; 63(10):742-753.

NORMAS EDITORIALES

La revista BIOSALUD es una publicación de periodicidad anual editada en la Universidad de Caldas cuya vocación es la publicación de artículos originales, de revisión, de reflexión y de reportes de caso asociados con diferentes temas de la salud humana; esta publicación ha sido concebida también como una tribuna de opinión sobre diferentes temas relacionados con las políticas y la problemática de la salud y de la investigación en salud en Colombia. La revista ha sido catalogada en la categoría B por el Sistema Nacional de Indexación y homologación de revistas especializadas de CT+I (publindex), desde el año 2008, con una vigencia de dos años.

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Asimismo cuando en los experimentos se utilizan animales y humanos se debe indicar si los procedimientos seguidos están en concordancia con las normas de los comités de ética médica y animal de la institución patrocinadora de la investigación y con la declaración de Helsinki de 1975, actualizada en el año 2000; para el caso de los animales de experimentación se debe indicar si se siguieron los lineamientos relacionados con el uso y cuidado de los animales de laboratorio.

REQUISITOS PARA LA PREPARACIÓN Y REMISIÓN DE MANUSCRITOS

Principios generales

El texto de los artículos producto de la observación y la experimentación usualmente está dividido en secciones como: introducción, materiales y métodos, resultados y discusión; los artículos extensos necesitan ser divididos en subsecciones especialmente en los resultados y la discusión con el fin de hacer más comprensible su contenido. Otros artículos como por ejemplo: reportes de caso, revisiones, artículos de reflexión y editoriales, probablemente requieren de otros formatos.

El uso del doble espacio en todas las porciones del manuscrito y de márgenes adecuadas, hacen posible que editor y revisores editen el texto línea a línea, agregando comentarios o dudas directamente en el manuscrito. Si los manuscritos son remitidos por vía electrónica, dicho artículo también debe ser escrito a doble espacio ya que también debe ser impreso para su revisión y edición.

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del estudio u observaciones, los procedimientos básicos, hallazgos principales, en lo posible con sus significancias estadísticas y las principales conclusiones. La extensión no debe ser mayor de 300 palabras.No debe incluir información o aspectos que no son contemplados en el texto, abreviaturas, referencias al texto o citas bibliográficas. Debe redactarse en tercera persona.

Ya que los resúmenes son las partes citadas en muchas bases de datos, se requiere especial cuidado en la redacción de los mismos de modo que el resumen refleje fielmente el contenido de los artículos.

pueden incluirse entre 3 a 10 palabras clave en español e inglés; estás pueden ser también frases cortas que capturen los tópicos principales del artículo. Las palabras clave son importantes para la indexación del artículo en las bases de datos. Deben usarse las palabras clave listadas en el Medical Subject Headings (MeSH) del Index medicus: http://www.nlm.nih.gov/mesh/MBrowser.html, para las palabras en inglés. para las palabras clave en español utilizar la página electrónica de la biblioteca virtual en salud; descriptores en ciencias de la salud:

http://decs.bvs.br/cgi-bin/wxis1660.exe/decsserver/?IsisScript=../cgi-bin/decsserver/decsserver.xis&interface_language=e&previous_page=homepage&previous_task=NULL&task=start

Si no hay palabras disponibles para términos recientemente introducidos, ellos pueden ser usados.

Introducción

La introducción contiene un contexto del estudio en el cual se justifica el problema a estudiar, cual es el propósito u objetivos de la investigación; el estado del arte sobre el asunto a investigar apropiadamente referenciado, pero no se deben incluir datos o conclusiones de la investigación a publicar.

Materiales y métodos

Se deben describir aquí las alternativas metodológicas utilizadas para llegar a los resultados obtenidos, no se deben incluir datos producto de la aplicación de dichos métodos; se deben describir claramente los mecanismos de selección de las personas sujetas a observación o de los animales de experimentación, incluyendo los criterios de inclusión. Algunas de las variables utilizadas deben explicarse, por ejemplo la razón por la cual se prefieren individuos de ciertas edades o sexo; en el caso de que se usen variables como etnicidad o raza, se deben enumerar los criterios de clasificación y justificar su relevancia.

Se deben identificar los métodos de medición, los equipos utilizados dando el nombre del fabricante y dirección entre paréntesis. Los procedimientos deben ser enunciados de manera que permitan la reproducción de los mismos por otros investigadores; estos métodos deben ser adecuadamente referenciados y en caso de que ellos hayan sufrido

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modificaciones explicar la razón por la cual se han hecho estas modificaciones y además evaluar sus limitaciones. Se deben identificar drogas o sustancias químicas usadas; en el caso de las drogas se debe incluir su nombre genérico, dosis y ruta de administración.Los autores que someten manuscritos de revisión deben incluir una sección describiendo los métodos usados para localizar, seleccionar, extraer y sintetizar datos. Estos métodos deben también ser presentados de manera concisa en el resumen.

Los métodos estadísticos utilizados en el análisis de la información deben ser descritos con suficiente detalle, cuando sea posible cuantificar los hallazgos y presentar ellos con indicadores apropiados de mediciones de error o incertidumbre (intervalos de confianza); se deben definir los términos estadísticos, las abreviaciones y muchos de los símbolos utilizados; se debe especificar el programa estadístico de computación utilizado.

Resultados

Se deben presentar en una secuencia lógica, enunciando los hallazgos principales y más importantes primero. No se deben repetir en el texto todos los datos de las tablas o ilustraciones. Material suplementario o adicional y los detalles técnicos deben ser colocados en un apéndice que no interrumpa el flujo del texto; estos apéndices solo se publicarán en la versión electrónica de la revista.

Los resultados numéricos no solo se deben expresar en porcentaje sino también en números absolutos y se deben explicar los métodos estadísticos usados para analizar los mismos. Se deben restringir las tablas y figuras a aquellas necesarias para la argumentación y valoración de la discusión. No se deben duplicar datos en tablas y gráficas.

Discusión

Enfatizar los aspectos nuevos e importantes del estudio y las conclusiones que surgen de ellos. No repetir datos dados en la introducción o en los resultados. En los estudios experimentales es útil comenzar la discusión resumiendo brevemente los principales hallazgos, posteriormente explicando el porqué de estos resultados; se debe hacer una comparación y contrastación de los resultados con otras investigaciones relevantes; enumerar las limitaciones de la investigación y explorar las implicaciones de los hallazgos para futuras investigaciones y para la práctica clínica si es posible.

Relacionar las conclusiones con los hallazgos del estudio pero evitar afirmaciones y conclusiones que no se puedan confirmar con los datos suministrados; en particular no se deben hacer afirmaciones sobre los beneficios económicos a menos que los manuscritos incluyan datos económicos apropiados y análisis; enunciar hipótesis nuevas si ellas están adecuadamente sustentadas, pero es necesario indicar claramente que estas son hipótesis.

Bibliografía

En los artículos de revisión, se deben utilizar principalmente artículos originales como referencias; evitar el uso de resúmenes como referencias; en caso de que una referencia

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no haya sido publicada aún se debe indicar que está “en prensa”; los autores deben obtener un permiso escrito para citar tales artículos así como también verificar que ellos han sido aceptados para su publicación, en caso de que una referencia no haya sido publicada se debe citar en el texto como “observaciones no publicadas” con el consentimiento escrito de la fuente.

Evitar las citaciones de “comunicaciones personales” a menos que ellas sean una fuente de información esencial no disponible a partir de una publicación, en este caso el nombre de la persona y la fecha de comunicación deben ser citadas en paréntesis en el texto. para un artículo científico, los autores deben obtener permiso escrito y confirmación de la veracidad de la fuente de una comunicación personal.

Las referencias deben ser numeradas consecutivamente en el orden en el cual ellas son mencionadas en el texto. Se deben identificar las referencias en el texto, tablas y leyendas con números arábigos entre paréntesis. Las leyendas citadas en tablas o figuras deben ser numeradas de acuerdo a la secuencia establecida en el texto. Los títulos de las revistas deben ser abreviados de acuerdo al estilo usado en Index medicus, para lo cual se debe consultar la lista de revistas indexadas por MEDLINE o SCIELO:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=journals

La citación de los autores de una publicación referenciada se debe hacer de la siguiente forma: apellidos en minúsculas, iniciales de los nombres; cada autor debe ir separado por una coma; se deben citar todos los autores de dicha referencia.

Con el fin de tener una presentación uniforme de las referencias, se seguirán las normas del comité internacional de editores de publicaciones periódicas médicas, las cuales pueden ser consultadas en:

http://www.nlm.nih.gov/bsd/uniform_requirements.html

Artículos de Revistas:

proporcionar primer apellido e iniciales de los nombres de cada uno de los autores, título, revista, año de publicación, volumen, número entre paréntesis (si es necesario) y páginas. Incluya sólo seis autores y si hay más de seis colocar después del sexto autor la abreviatura “et al.”.

Soberón GA, Naro J. Equidad y atención de salud en América Latina. principios y dilemas. Bol Of Sanit panam 1985; 99(1):1-9.

March F, Coll p, Guerrero RA, Busquets E, Cayla JA, prats G, et al. predictors of tuberculosis transmission in prisions: an analysis using conventional and molecular methods. AIDS 2000; 14:525-535.

Si el autor es una institución colocar el nombre de esta en vez de los nombres individuales. Cuando no hay autor: Cancer in South Africa [editorial]. S Afr Med J 1994; 84:15.

118

Libros:

proporcionar primer apellido e iniciales de los nombres de cada uno de los autores o editores, título del libro, número de edición, lugar, editorial, fecha y, si es necesario las páginas después de la abreviatura p.

Monson RR. Occupational epidemiology. 2nd Edition. Boca Ratón, Fl: CRC press; 1990.White Kl., Henderson MH, eds. La epidemiología como una ciencia fundamental. New York: Oxford University press; 1976. p. 35-37.

Capítulo de libro:

Allison RF, Dowling Wl, Munson FC. The role of the health services administrator and implications for education. In: Commission on Education for Health Administration, eds. Education for health administration. Vol. 2. Ann Arbor, MI: Health Administration press; 1975.

Antó JM. Los métodos cuantitativos y cualitativos en la salud pública. En: Martínez FN,

Antó JM, Castellanos pL, Gili M, Marset p, Navarro V. Salud pública. Madrid: McGraw-Hill, Interamericana; 1998.

Sitios en Internet:

American Center Society [Internet]. Disponible en: http://www.cancernet.nci. nih.gov/dictionary.html . Consultado Febrero de 2000.Las comunicaciones personales deben ser indicadas en el cuerpo del texto, entre paréntesis, no en notas de pie de página, indicando fecha e institución de quien da la comunicación.No deben incluirse como referencias: documentos no publicados, incluso si han sido presentados en conferencias o congresos; artículos enviados para publicación que no han sido aceptados y resúmenes. Si es absolutamente necesario citar fuentes no publicadas, estas deben ser mencionadas en el texto entre paréntesis o en una nota de pie de página.La manera apropiada de citar como referencia otro tipo de material no considerado arriba, debe ser consultada en los sitios de Internet ya indicados.

Las tablas

Las tablas deben ser concisas con el nivel adecuado de detalle y precisión, para ello es deseable incluir datos más que texto. Cada tabla debe ir en una hoja separada, debe estar adecuadamente identificada y en el orden de su primera citación en el texto; cada tabla debe tener un título corto; no utilizar líneas horizontales o verticales; cada columna debe tener un encabezado corto o abreviación; cuando sea necesario se deben colocar notas aclaratorias al pie de la tabla; se deben explicar todas aquellas

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abreviaturas no comunes; se pueden utilizar los siguientes símbolos secuencialmente para dichas explicaciones: *,†,‡,§,||,¶,**,††,‡‡. Identificar medidas estadísticas de variación como desviación estándar y el error estándar de la media. Asegurarse de que todas las tablas se han citado en el texto.

Ilustraciones o figuras

Las figuras todas ellas de muy buena calidad deben ser fotografiadas y escaneadas o remitidas como fotografías digitales, también es necesario enviarlas en formato JpEG o GIF, de modo que puedan ser publicadas en la versión electrónica de la revista. Las placas de rayos X, las escanografías, ecografías u otras imágenes diagnósticas, así como también microfotografías deben ser enviadas en blanco y negro, y también en formato digital.

Cada figura debe ir en una página aparte y debe tener un título con una numeración consecutiva de acuerdo con el orden en el que se citó en el texto; debe tener además una leyenda que haga énfasis en los que se quiere mostrar. Si en las figuras o fotografías hay símbolos, flechas, números o letras para identificar partes de la misma, estos símbolos deben referenciarse y explicarse claramente en la leyenda de la figura. Si se incluyen fotografías de personas estas no deben permitir la identificación de la misma o en caso contrario deben ir acompañadas del consentimiento escrito de la persona que aparece en dicho documento.

Unidades de medida

Se prefiere las unidades métricas (metros, kilogramos o litros) o sus múltiples decimales; la temperatura debe estar en grados Celsius, la presión sanguínea en milímetros de mercurio; en los resultados de parámetros sanguíneos no utilizar unidades SI exclusivamente sino las unidades alternativas de medida (ejemplo: mg/dl., mm/h. mm3, etc).

Símbolos y abreviaciones

Usar solamente las abreviaciones más comunes; evitar abreviaciones en el título; el término completo de una abreviación debe preceder dicha abreviación la primera vez que se utiliza en el texto con la abreviación entre paréntesis.

Envío del manuscrito

El manuscrito puede ser enviado en formato físico y electrónico al director de la revista, al Departamento de Ciencias Básicas, Facultad de Ciencias para la Salud, Universidad de Caldas A.A. 275, Manizales-Caldas-Colombia; se debe incluir el nombre de la persona responsable del contenido del artículo, con la dirección para la recepción de correspondencia y para el envío de los manuscritos que requieren correcciones. El manuscrito también puede ser enviado al E-mail: [email protected], [email protected]

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Proceso de evaluación

El comité editorial en cabeza de su director, realiza una selección de los artículos que se considera pueden hacer parte de la revista. posteriormente, se somete el artículo a un grupo de evaluadores (mínimo 2) idóneos en el tema para su respectivo análisis. Dichos pares determinan la pertinencia de la publicación del material.

Reserva de derechos

Si el manuscrito es aceptado para publicación los derechos de reproducción serán de la Universidad de Caldas. El manuscrito debe ir acompañado de la carta o comunicación original en la cual se otorga permiso para reproducir texto, figuras o cualquier otro material que tenga reserva de derechos. Los autores son responsables de los contenidos, juicios y opiniones de cada uno de los artículos.

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AUTHOR GUIDELINES

The BIOSALUD Journal is an annual publication of Universidad de Caldas, whose objective is the publication of original, revision, and reflection articles, as well as case reports associated with different subjects related to human health. This publication has also been conceived as a tribune of opinion on different subjects related to the policies and the health problems and the health researched carried out in Colombia.

The journal has been catalogued in the B category by the National System of Indexing and homologation of specialized journals of CT+I (publindex), since 2008, for a two—year period.

DEFINITION OF EACH TYPE OF ARTICLE PUBLISHED IN THE JOURNAL 1. Scientific and technological research article: it is a document that presents in detail the results obtained from a research project. This article must contain: title, summary in English and Spanish, introduction, materials and methods, results and discussion.2. Reflection article: it is a document that presents a personal and critical analysis of the research results, based on original sources.3. Revision article: a document in which the state of the art of a specific research topic is analyzed and presented. This document must highlight the contributions of the authors in the extension of the knowledge on the specific topic. It must contain at least 50 references from original articles.4. Short article: it is a document in which an advance of the results obtained in the development of a research project are presented, must be to their impacts, making their publication essential before the investigative process is finalized. 5. Case report: it is a writing in which the results of a particular situation appear, since they are considered to be new findings, methodologies, or therapies, associated with a short and critical revision of the state of the art at a worldwide level of similar cases that have been presented.6. Subject revision: it is the document in which a specific subject is updated, accompanied by an analysis of the data collected for said revision.7. Editorial: a document written by the editor or any member of the Editorial Committee or by guest invited by the publisher. The editorial can be related to present problems in the health field, health education, as well as an analysis of new findings in the biomedical research.8. Letter to the editor: it is a document sent to the editor by the readers of the journal in which critics are made, results are refuted or reviews related to articles published in previous numbers of the journal, that according to the Editorial Committee, their knowledge by the scientific community is considered important.9. Bibliographical reviews: a section of the journal in which commentaries on recent publications are made by the scientific community of the Faculty of Health Sciences in particular, and by publications made at national or worldwide level.For the submission of different articles, the following requirements for the uniformity of the manuscripts presented to biomedical journals (Vancouver norms) should be followed. These have been extracted from: International Committee of Medical Journal Editors. Uniform Requirement for Manuscript Submitted to Biomedical Journal: Writing

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and editing for Biomedical publications, updated February, 2006, IN: http://www.icmje.org/

ASPECTS TO CONSIDER BEFORE THE SUBMISSION OF MANUSCRIPTS:

Originality

Any article sent to the journal for its publication must be unpublished and the authors must send to the director of the journal a written document in which they give their consent for its publication, in case that it was satisfactorily evaluated; in this consent the authors will also give faith that said article has not been published totally or partially in another written or electronic publication, in order to avoid infringing copyright laws.

Nevertheless, it is possible to make a second publication in the same language of the first publication or in a second language when: there is consent on part of the directors of both journals; the priority of the first publication is respected by a week; the group of readers is different; the second publication faithfully reflects the information and interpretations of the first.

In the second version, as a footnote, the readers will be informed that this article has already been published partially or totally in another journal, mentioning said journal; the permission for the second publication must be gratuitous.

Protection of the identity of the subjects of study

When a research study involves humans, the description of details should be avoided as much as possible, that might lead to the identification of a person or persons subjects of study. The use of patients’ names, initials, clinical history numbers, photographs, genealogies or personal data that might injure their right to privacy are prohibited; if it is necessary to publish said data, the written consent of these people is required. Said consent must guarantee that the manuscript is known and understood, and that they agree with the publications of the descriptions or images made with the related people, even if the material subject to possible identification is going to be available on the Internet after its publication. This informed consent must be sent along with the manuscript for its revision.

In addition, when the experiments require the use of animals and humans, it should be indicated if the procedures are in agreement with the norms of the medical ethics and animal committees of the sponsoring institution and with the Declaration of Helsinki of 1975, updated in 2000. For the specific case of animal experimentation, it should be indicated if the norms related to the use and care of the laboratory animals were followed.

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REQUIREMENTS FOR THE PREPARATION AND SUBMISSION OF MANUSCRIPTS

General principles

The text of articles product of the observation and experimentation are usually divided in sections such as: introduction, materials and methods, results and discussion. The extensive articles specially need to be divided in subsections in the results and the discussion with the purpose of being more comprehensible. Other articles such as: case reports, revisions, reflection articles and editorials, probably require other formats.

The use of double space throughout the manuscript, as well as suitable margins, allow the editor and reviewers to edit the text directly line by line, adding commentaries or doubts in the manuscript. If the manuscripts are sent via e-mail, this article also must be doubled space, since it must also be printed for its revision and edition.

The page numbers is another important aspect, so that the reviewers and the editor can reference specific portions of the manuscripts. Each section of the manuscript must be separated in the following way:

Title page

It must include the following information: · Title of the article: it must be concise and easy to understand.· Names of the authors and institutional affiliation.· Name of the section of the institution to which the authors are enrolled, with

the corresponding institutional name.· Correspondence for authors: it must contain: address, telephone number, fax

and electronic mail address of the author responsible for the manuscript. In addition, the author must state if he/she wishes their electronic address to be published.

· Name and address of the authors to whom reimpressions can be solicited. · Source or sources of the resources that served to finance the investigation.

Abstract and key words

It must be on the following page after the title page. The abstract must be in English and in Spanish. It must contain a short summary of the introduction, materials and methods, results and discussion, enunciating each of these sections before their contents. New and important aspects of the study or observations must be emphasized, as well as the basic procedures, main findings, wherever possible with their statistical significances and the main conclusions. The extension should not exceed 300 words.

It should not include information or aspects that are not contemplated in the text, bibliographical abbreviations, references to the text or citations. It must be written in third person.

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Since the abstracts are the parts mentioned in many databases, special care is required in their writing, so that it faithfully reflects the content of the articles. 3 to 10 key words in English and Spanish should be included. They can also be short phrases that capture the main topics of the article. Key words are important for the indexation of the article in databases. The key words used should be listed in the Medical Subject Headings (MeSH) of the Medicus Index: http://www.nlm.nih.gov/mesh/MBrowser.html, for the key words in English. For the key words in Spanish, use the electronic page of the virtual health library; descriptores en ciencias de la salud:

http://decs.bvs.br/cgi-bin/wxis1660.exe/decsserver/?IsisScript=../cgi-bin/decsserver/decsserver.xis&interface_language=e&previous_page=homepage&previous_task=NULL&task=start

If there are no words available for recently introduced terms, they can be used.

Introduction

The introduction contains a context of the study in which the problem is justified, what is the intention or objectives of the research; the state of the art on the subject being studied should be appropriately referenced, but data or conclusions of the research being published should not must be be included.

Materials and methods

The methodological alternatives used are should be described here to reach the obtained results. Data product of the application of these methods should not be included. The mechanisms of selection of the subjects of study observed or of the animals experimented on should be clearly described, including the inclusion criteria. Some of the variables used must be explained, for example, the reason why individuals of certain ages or sex were preferred; in case variables such as ethnicity or race are used, their classification criteria must be enumerated, and their relevance should be justified.

The measurement methods, the equipment implemented should be identified, including the name of the manufacturer and its address in parentheses. The procedures must be enunciated so that they can be reproduced by other researchers. These methods must be adequately referenced, and in case they have undergone modifications, the reason why these modifications were made must be explained, in addition to evaluating their limitations. The drugs or chemical substances should be identified; in the case of drugs, their generic name, dosage and administration route must be included.

The authors who submit their manuscripts must include a section describing the methods implemented to locate, select, extract and synthesize data. These methods must also be presented in a concise way in the abstract.The statistical methods used in the analysis of the information must be described with sufficient detail, whenever possible the findings must be quantified and presented with the appropriate indicators of measurements of error or uncertainty (confidence

125

intervals); the statistical terms, abbreviations and many of the symbols used should be defined. The statistical computerized program implemented should be specified.

Results

They must be presented in a logical sequence, enunciating the main and most important findings first. All the data in the charts or illustrations should not be repeated in the text. Additional material and the technical details must be placed in an appendix that does not interrupt the flow of the text; these appendices will only be published in the electronic version of the journal.

The numerical results not only are must be to express in percentage but also in absolute numbers and the statistical methods used are must be to explain to analyze such. The charts and figures to those necessary for the argumentation and valuation of the discussion are must be to restrict. To charts data in and graph are not must be to duplicate.

Discussion

Emphasizing the new and important aspects of the study, as well as the conclusions derived from them. Information should not be repeated in the introduction or the results. In the experimental studies, it is useful to begin the discussion briefly summarizing the main findings, and later explaining the reason for these results. A comparison and contrast of the results with those of other relevant researches must be carried out. The limitation of the research must be enumerated, as well as exploring the implications of the findings for future researches, and for the clinical practice whenever possible.

It is important to relate the conclusions with the findings of the study, but avoiding affirmations and conclusions that cannot be confirmed with the enclosed data; particularly, affirmations regarding economical benefits should not be expressed, unless the manuscript includes appropriate economical information and analysis. New hypotheses should be enunciated if they are adequately backed up, but it is necessary to clearly indicate that they constitute hypotheses.

Bibliography

Revision articles must implement original articles as references, avoiding the use of abstracts as references. In case that a reference hasn´t been published yet, it must be indicated that it is “in process”; the authors must obtain a written permit to reference such articles, as well as verifying that the articles have been accepted for its publication. And in case a reference has not been published, it should be identified as “unpublished observations” with the written consent of the source.

Avoid the references of “personal communication”, unless they are a source of essential information unavailable from a publication, in this case, the name of the person and the date of the mail should be referenced in parentheses in the text. For a scientific article, the authors must obtain written permission and confirmation of the source of said communication.

126

The references must be consecutively numbered in the order in which they are mentioned in the text. The references, charts and legends in the text must be identified with Arabic numbers in parentheses. The legends mentioned in charts or figures must be numbered according to the sequence established in the text. The titles of journals must be abbreviated according to the style used in the Medicus Index, consulting the list of the journals indexed by MEDLINE or SCIELO:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=journals

The citation of the authors of a referenced publication must be done in the following manner: last names in lower case letters, initials of the first names. Each name must be separated by a comma; all the authors of said reference must be mentioned. With the purpose of having a uniform presentation of the references, the norms of the international committee of medical periodic publication publishers will be followed, which can be consulted in:http://www.nlm.nih.gov/bsd/uniform_requirements.html

Journal Articles:

provide last name and initials of the first names of each of the authors, title, journal, year of publication, volume, number in parentheses (if necessary) and pages. Include only six authors and if there are more than six, after the last one place the abbreviation “et al.”.

Soberón GA, Naro J. Fairness and health attention in Latin America. principles and dilemmas. Bol of Sanit panam 1985; 99 (1): 1-9.

March F, Coll p, Guerrero RA, Busquets and, Cayla JA, prats G, et al. predictors of tuberculosis transmission in prisons: an analysis using conventional and molecular methods. AIDS 2000; 14:525 - 535.

If the author is an institution, place its name instead of the individual names.

When there is no author: Cancer in South Africa [editorial]. S Afr Med J 1994; 84:15.

Books:

provide last name and initials of the names of each of the authors or publishers, book title, edition number, place, editorial, date and, if necessary, the pages after the abbreviation p.

Monson RR. Occupational epidemiology. 2nd Edition. Boca Ratón, Fl: CRC press; 1990.White Kl., Henderson MH, eds. Epidemiology as a fundamental science. New York: Oxford University press; 1976. p. 35-37.

127

Book chapter:

Allison RF, Dowling Wl, Munson FC. The role of the health services administrator and implications for education. In: Commission on Education for Health Administration, eds. Education for health administration. Vol. 2. Ann Arbor, MI: Health Administration press; 1975.

Antó JM. The quantitative and qualitative methods in public health. In: Martinez FN, Antó JM, Castellanos pL, Gili M, Marset p, Navarrese V. public health. Madrid: McGraw-Hill, Inter-American; 1998.

Internet Sites:

American Center Society [Internet]. Available at: http://www.cancernet.nci. nih.gov/dictionary.html . Consulted February 2000.

personal communications must be indicated in the body of the text, in parentheses, not as footnotes, indicating date and institution of whom communicates.The following do not have to be included as references: unpublished documents, even if they have been presented in conferences or congresses; articles sent for publication that have not yet been accepted and abstracts. If it is absolutely necessary to mention unpublished sources, these must be mentioned in the text in parentheses or in a footnote.The appropriate way to mention other types of material not considered above, must be consulted on the internet sites already indicated.

Charts

The charts must be concise with the suitable level of detail and precision, for said purpose, it is desirable to include data instead of text. Each table must go on a separated page, adequately identified and in the order of its first reference in the text. Each table must have a short title; horizontal nor vertical lines should be used; each column must have a short heading or an abbreviation. When necessary, explanatory notes must be placed at the end of the table; all the uncommon abbreviations must be explained; sequentially use the following symbols for these explanations: *, †, ‡, §,||, ¶, **, ††, ‡‡. Identify statistical measures of variation as standard deviation and the mean standard error. Make sure that all the charts have been mentioned in the text.

Illustrations or figures

All the figures must be of an excellent quality, and they must be photographed and scanned or sent as digital photographs, it is also necessary to send them in JpEG or GIF format, so that they can be published in the electronic version of the journal. The x-rays plates, the scanographs, ultra sounds, or other diagnostic images, as well as microphotographs must be sent in black and white, and in digital format.

128

Each figure must be placed on a separate page and must have a title with a consecutive numeration in agreement with the order in which it was mentioned in the text; they must also have a legend that emphasizes what they are showing. If in the figures or photographs there are symbols, arrows, numbers or letters to identify their parts, these symbols must be referenced and explained clearly in the legend of the figure. If photographs of people are included, these cannot allow the identification of the people, or in the other case, they must be accompanied by the written consent of the person who appears in said document.

Units of measurement

Metric units are preferred (meters, kilograms or liters) or their multiple decimals; the temperature must be in degrees Celsius, the blood pressure in millimeters of mercury; in the results of sanguineous parameters SI units should not be used exclusively, but instead, the alternative units of measurement (example: mg/dl., mm/h. mm3, etc).

Symbols and abbreviations

The most common abbreviations should only be use. Avoid abbreviations in the title; the complete term of an abbreviation must precede it the first time that it is used in the text with the abbreviation in parentheses.

Shipment of the manuscript

The manuscript can be sent in physical and electronic format to the director of the journal, at Departamento de Ciencias Básicas, Facultad de Ciencias para la Salud, Universidad de Caldas A.A. 275, Manizales-Caldas-Colombia. The name of the person responsible for the content of the article must be included, with the address for the reception of correspondence and the shipment of manuscripts that require corrections. The manuscript can also be sent to the following e—mails: [email protected], [email protected]

Process of evaluation

The Editorial Committee led by its director, selects the articles that are considered to be included in the journal. Afterwards, the article is evaluated by at least 2 professionals with experience in the subject for its respective analysis. These pairs determine the pertinence regarding the publication of the manuscript.

Reserved rights

If the manuscript is accepted for publication the reproduction rights will belong to Universidad de Caldas. The manuscript must be accompanied of the letter or original communication in which permission is granted to reproduce text, figures or any other material that has reserved rights. The authors are responsible for the contents, judgments and opinions of their articles.

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FORMATO DE SUSCRIPCIÓN

Nombre / Name

Cédula / Identification number

Dirección / Address

Ciudad / City

Departamento / State Código Postal / Zip Code

País / Country

Teléfono / Phone Number

Profesión / Profession

Institución / Employer

Correo Electrónico / E-mail

Dirección de envío / Mailing Address

Suscriptores Nacionales por un año. (1) EjemplarSe debe consignar en Bancafé, cuenta de ahorros No. 255050114 código 00HD005

Promoción e indexación de publicaciones científicas.

Mayores informes: Vicerrectoría de Investigaciones y postgrados Universidad de Caldas. Calle 65 N° 26 - 10

A.A. 275 Manizales - ColombiaTel: 8781500 ext. 11222Fax: 8781500 ext. 11622

E-mail: [email protected]

Último ejemplar recibido / Last issue mailed:

Año/Year Volumen/Volume Número/Number Fecha / Date

Esta revista se terminó de imprimiren el mes de septiembre de 2011

en el Centro Editorial de laUniversidad de CaldasManizales - Colombia

biosalud Manizales (Colombia) Vol. 10 No. 1 134 p. enero...

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