UNIVERSIDADE DE PASSO FUNDO

FACULDADE DE ENGENHARIA E ARQUITETURA

CURSO DE ENGENHARIA AMBIENTAL

Naiara Elisa Kreling

Biorremediação de solo contaminado com biodiesel

utilizando biomassa e manoproteínas obtidas através da

levedura Saccharomyces cerevisiae

Passo Fundo, 2014.

1

Naiara Elisa Kreling

Biorremediação de solo contaminado com biodiesel

utilizando biomassa e manoproteínas obtidas através da

levedura Saccharomyces cerevisiae

Trabalho de conclusão de curso apresentado ao

curso de Engenharia Ambiental, como parte

dos requisitos exigidos para obtenção do título

de Engenheiro Ambiental.

Orientador: Prof. Luciane M. Colla, Drª.

Passo Fundo , 2014.

2

Naiara Elisa Kreling

Biorremediação de solo contaminado com biodiesel utilizando

biomassa e manoproteínas obtidas através da levedura Saccharomyces cerevisiae

Trabalho de Conclusão de Curso como requisito parcial para a obtenção do título de

Engenheiro Ambiental – Curso de Engenharia Ambiental da Faculdade de Engenharia e

Arquitetura da Universidade de Passo Fundo. Aprovado pela banca examinadora:

Passo Fundo, 02 de junho de 2014.

3

4

A toda a minha família, em

especial ao meu avô Francisco, por fazer

deste diploma tanto seu quanto meu.

5

Agradecimentos

Diversas pessoas contribuíram para o andamento e conclusão deste trabalho.

A minha mãe e meu pai, por todo o apoio, cooperação, disponibilidade e interesse pela minha

vida acadêmica, eu os amo muito.

A minha irmã, por sua amizade e amor acima de tudo.

Aos demais familiares, pelo carinho com que sempre fui recebida.

Ao Iziquiel, co-orientador deste trabalho, pelo grande auxilio prestado e pelos desafios que

me lançou. Ao professor Cleomar por sua ajuda quando necessário e a Professora Luciane,

por sempre acreditar que eu era capaz de realizar este trabalho em laboratório, mesmo com

horários tão apertados.

As amigas e auxiliares de laboratório Marilda, Manuelli e Deise, que estiveram sempre me

apoiando e me auxiliando em toda a etapa experimental. Ao laboratorista João pelo seu

auxilio no começo deste.

A todos os colegas do sétimo semestre, e em especial ao Allan, Bruna e Eloisa, sempre

preocupados com minhas analises e prontos para me ajudar.

Aos meus colegas quase ou já graduados, Bruna W., Giovana, Nicoli,Thaise e Bruna L., por

fazerem desta graduação divertida e inesquecível.

Aos amigos Vanessa e Lucas, por fazerem parte da minha historia.

Muito Obrigada!!!

6

"Que eu não perca a garra, mesmo

sabendo que a derrota e a perda são dois

adversários extremamente perigosos. Que eu não

perca a vontade de ser grande, mesmo sabendo que

o mundo é pequeno. Que eu jamais me esqueça que

Deus me ama infinitamente"

(Francisco Cândido Xavier)

7

RESUMO

O biodiesel é um biocombustível que vem sendo cada vez mais explorado, e seu uso faz

crescer as preocupações com contaminações de solos e águas superficiais. A biorremediação é

uma técnica muito utilizada para recuperação de áreas contaminadas, baseando-se no uso de

microrganismos para a realização dos processos de degradação de contaminantes. Objetivou-

se a biorremediação de biodiesel em solo pela adição de biomassa microbiana inativa e

biossurfactantes. A biomassa microbiana utilizada foi a da levedura S. cerevisiae e os

biossurfactantes foram as manoproteínas, biocompostos extraídos da parede celular da mesma

levedura. Esta levedura pode ser considerada como um subproduto de indústrias de alimentos

que processam bebidas destiladas, podendo ser valorada pela sua utilização como

bioestimulante ou biossurfactante. Ainda, avaliou-se a influência do bioestimulante e

biossurfactantes adicionado no processo de adsorção do contaminante no solo. Os ensaios

foram realizados em frascos herméticos contendo o solo, o contaminante e os bioestimulantes,

em comparação com ensaios de atenuação natural. Controles foram realizados com solo

estéril a fim de avaliar-se a adsorção física do contaminante no solo. Avaliou-se a atividade

respirométrica, umidade e percentual de degradação. Ao final de 60 dias, o máximo valor de

CO2 evoluído foi verificado na bioestimulação com a manoproteína. Para os índices de

degradação em solo estéril, constatou-se que 10 a 20% do percentual de degradação, antes

tomado como ação dos microrganismos, deve ser atribuído à adsorção do contaminante ao

solo, provando que há significativa interação entre as partículas do solo e do contaminante. O

máximo percentual de degradação foi obtido no ensaio onde utilizou-se a biomassa da

levedura como bioestimulante.

Palavras-chaves: bioestimulação, atenuação natural, resíduos oleosos, adsorção de

contaminante.

8

ABSTRACT

Biodiesel is a biofuel that is being increasingly exploited, and use is growing concerns about

contamination of soils and surface waters. Bioremediation is a technique widely used for

recovery of contaminated areas, based on the use of microorganisms for the achievement of

the degradation processes of contaminants. Aimed to bioremediation of biodiesel in soil

microbial biomass by adding inactive and biosurfactants. The microbial biomass used was the

yeast S. cerevisiae and biosurfactants are mannoproteins, biocompounds extracted from the

same yeast cell wall. This yeast can be considered as a byproduct of food processing

industries liquor, can be valued for its use as growth promoter or biosurfactant. Furthermore,

we assessed the influence of the growth promoter and biosurfactants added in the adsorption

process of the contaminant in the soil. Assays were performed in sealed vials containing soil

and contaminant biostimulants, compared with natural attenuation tests. Controls were

performed with sterile soil to evaluate the physical adsorption of the contaminant in the soil.

We evaluated the respiration activity, humidity and percentage of degradation. After 60 days,

the maximum amount of CO2 evolved was found in biostimulation with mannoproteins. . For

degradation rates in sterile soil, it was found that 10 to 20 % the percentage of degradation

before taken as the action of microorganism, should be attributed to adsorption of the

contaminant to the soil, proving that there is significant interaction between the soil particles

and's contaminant. The maximum percentage of degradation was determined in the test where

we used the biomass of yeast as growth promoter.

Key – words: biostimulation, natural attenuation, oily residues, contaminant adsorption.

9

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Pirâmide dos requisitos da biorremediação............................................................. 19 Figura 2 – Organograma experimental para o trabalho de conclusão de curso ........................ 32 Figura 3 – Caracterização do solo utilizado nos experimentos. ............................................... 33 Figura 4 – Teor de umidade do ensaio de biorremediação ....................................................... 40

Figura 5 – Teor de umidade para o solo esterilizado ................................................................ 41 Figura 6 – Atividade microbiana durante os 60 dias de ensaio ................................................ 42 Figura 7 - Valores máximos obtidos no ensaio de atividade microbiana ................................. 43 Figura 8 – Biodegradação obtida no tempo 60 dias, para as técnicas de biorremediação

adotadas. ............................................................................................................................ 45 Figura 9 – Retenção do contaminante obtida no tempo 60 dias, para as técnicas de remedição

adotadas. ............................................................................................................................ 46 Figura 10 – Máximos valores obtidos para a retenção do contaminante e biodegradação em

solos. .................................................................................................................................. 46

10

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Vantagens e desvantagens do uso das técnicas de biorremediação. ....................... 16 Tabela 2 – Contaminantes e sua relação com a biorremediação .............................................. 17 Tabela 3 – Delineamento experimental do processo de biorremediação ................................. 34 Tabela 4 – Delineamento experimental do processo de esterilização do solo.......................... 35

Tabela 5 – Caracterização da manoproteína utilizada no ensaio de biorremediação ............... 39 Tabela 6 – Comparação da umidade para o solo estéril e não estéril ....................................... 41 Tabela 7 –Biodegradação de biodiesel em solo não estéril aos 60 dias de ensaio ................... 44 Tabela 8 – Retenção de contaminante em solo estéril .............................................................. 45

Tabela 9 – Influência dos microrganismos na biodegradação de resíduos oleosos.................. 47

11

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 12 2 DESENVOLVIMENTO .................................................................................................... 15

2.1 Revisão Bibliográfica ................................................................................................ 15

2.1.1 Biorremediação ..................................................................................................... 15 2.1.2 Fatores que interferem no processo de biorremediação ....................................... 18

2.1.2.1 Nutrição ....................................................................................................... 19 2.1.2.2 pH ................................................................................................................ 20 2.1.2.3 Temperatura ................................................................................................ 20

2.1.2.4 Umidade ...................................................................................................... 21 2.1.2.5 Potencial Redox........................................................................................... 21

2.1.3 Técnicas de biorremediação ................................................................................. 22

2.1.3.1 Atenuação natural monitorada .................................................................... 22 2.1.3.2 Bioaumentação ............................................................................................ 23 2.1.3.3 Bioestimulação ............................................................................................ 24

2.1.3.3.1.1 Bioestimulação utilizando biossurfactantes ......................................... 25

2.1.3.3.1.2 Bioestimulação utilizando nutrientes ................................................... 25 2.1.4 Biodiesel ............................................................................................................... 26

2.1.5 Processo de adsorção em solos ............................................................................. 27 2.1.6 Leveduras.............................................................................................................. 29

2.1.6.1 Saccharomyces cerevisiae ........................................................................... 29 2.1.7 Manoproteínas ...................................................................................................... 30

2.2 Métodos e materiais ................................................................................................... 32 2.2.1 Métodos e técnicas................................................................................................ 32 2.2.2 Solo ....................................................................................................................... 32

2.2.3 Bioestimulantes .................................................................................................... 33 2.2.3.1 Manoproteínas ............................................................................................. 33

2.2.4 Microrganismos utilizados para a biorremediação ............................................... 34 2.2.4.1 Levedura ...................................................................................................... 34

2.2.5 Contaminante ........................................................................................................ 34

2.2.6 Delineamento Experimental ................................................................................. 34

2.2.7 Processo de Biorremediação ................................................................................. 35 2.2.7.1 Umidade ...................................................................................................... 35 2.2.7.2 Evolução de CO2 ........................................................................................ 35 2.2.7.3 Óleos e graxas ............................................................................................. 36

2.2.8 Caracterização da Manoproteína utilizada no experimento ................................. 37

2.2.8.1 Determinação de Umidade .......................................................................... 37 2.2.8.2 Determinação de Lipídios ........................................................................... 37 2.2.8.3 Determinação de Proteína ........................................................................... 38 2.2.8.4 Determinação de Resíduo Mineral Fixo (Cinzas) ....................................... 38

2.2.9 Tratamento dos dados ........................................................................................... 39

2.3 Resultados e discussões ............................................................................................. 39 2.3.1 Caracterização da Manoproteína utilizada no experimento ................................. 39

2.3.2 Umidade no ensaio de biorremediação ................................................................. 40 2.3.3 Atividade microbiana ........................................................................................... 42 2.3.4 Remoção do contaminante.................................................................................... 44

3 CONCLUSÕES ................................................................................................................. 48 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................... 49

12

1 INTRODUÇÃO

Devido ao alto consumo de combustíveis fósseis, sua durabilidade finita e o aumento

dos índices de poluição, o homem força-se a encontrar alternativas energéticas para seu

sustento.

O uso de biocombustíveis, em especial o biodiesel, se apresenta como uma solução de

grande aplicabilidade e é cada vez mais explorado, devido ao fato de sua produção ser mais

sustentável e viável em grande escala (MEYER, 2011).

O aumento do uso dessa alternativa energética faz crescer a demanda de produção,

consumo e transporte deste produto, aumentando as preocupações com as possíveis

contaminações de solos e águas superficiais (MARIANO, 2006).

Muitas técnicas de remediação podem ser utilizadas a fim de degradar o contaminante

do solo, e a biorremediação tem sua aplicação justificada por se tratar de uma tecnologia

alternativa e fundamentada em métodos naturais. As técnicas de biorremediação mais

estudadas atualmente incluem a bioestimulação, a bioaumentação e a atenuação natural

(CETESB, 2007).

A bioestilumação baseia-se no crescimento de microrganismos presentes no solo pela

inserção de estimulantes introduzidos no meio, como oxigênio e nutrientes. (CETESB, 2007).

Dentre o uso de bioestimulantes necessários a biorremediação, a biomassa de levedura é

estudada para ser empregada com a finalidade de conciliar o uso de biossurfactantes

eficientes, capazes de degradarem os compostos de uma maneira acelerada.

Dentre os tipos de biomassa microbiana que podem ser utilizados, as leveduras, em

especial a Saccharomyces cerevisiae, destacam-se como uma fonte vantajosa, devido a sua

baixa toxicidade e sua facilidade em ser obtida (ARAUJO; FREIRE, 2008).

A manoproteína extraída da Saccharomyces cerevisiae está presente na parede celular

da uma levedura, e é responsável pela porosidade da parede celular, limitando a

permeabilidade da parede celular. Podem atuar auxiliando nos processos de mobilização dos

resíduos oleosos pelos microrganismos ativos presentes no solo impactado (CID et. al, 1995 ).

Recentemente, trabalhos têm sido realizados no intuito de verificar a influência dos

processos físicos e químicos na adsorção de contaminantes em solos, visto que esses

processos influenciam na disponibilidade dos contaminantes para a realização da

biorremediação. Assim, torna-se importante também avaliar qual seria a influência da adição

dos bioestimulantes nos processos físicos e químicos de adsorção do contaminante no solo

impactado (CECCHIN, 2014).

13

Sendo assim, o problema da pesquisa foi delineado a fim de responder-se às seguintes

questões de pesquisa: O uso de biomassa de levedura ou das manoproteínas extraídas da

biomassa podem auxiliar os processos de biorremediação de resíduos oleosos em solos? A

adição dos bioestimulantes influência os processos de adsorção dos contaminantes no solo?

A biorremediação pode ser utilizada para a descontaminação do solo, pois promove

um tratamento adequado ao meio, apresentando baixo custo se comparado às outras técnicas

de biorremediação, sendo considerada destrutiva dos contaminantes e pode atingir

concentrações aceitáveis pela legislação de contaminantes no solo (ASSUNÇÃO e ROHLFS,

2012).

Por apresentar alto poder de manipulação genética e grande aplicabilidade,

principalmente em indústrias de alimentos, a levedura Saccharomyces cerevisiae apresenta-se

como uma alternativa à necessidade de produção de biossurfactantes visando à área

ambiental.

As manoproteínas possuem grande potencial de uso bioestimulante, pois apresentam

quantidades suficientes de nitrogênio e fósforo e ação biossurfactante já provada, fomentando

a investigação de seu potencial de biodegradar o meio (CID et al, 1995).

Poder mensurar e separar os efeitos biológicos dos físicos quando o contaminante está

presente no solo torna-se essencial para diagnosticar quais efeitos de remediação são de fato

causados pelo solo e quais são resultados efeitos da influência de microrganismos e

bioestimulantes adicionados ao meio.

Assim, a presente investigação justifica-se por buscar uma fonte de bioestimulação

para tratamento ambiental, através da utilização de sustâncias seguras ao meio ambiente,

avaliando a influência causada pelo solo, e podendo, futuramente, testar a sua eficiência em

processos de biorremediação de áreas contaminadas em larga escala.

Assim, o objetivo geral desta proposta foi a avaliação do uso de biomassa de levedura

e manoproteínas sobre a biorremediação de biodiesel em solos. Os objetivos específicos

foram:

a) avaliar o potencial de uso da biomassa inativa da levedura Saccharomyces

cerevisiae como bioestimulante em solos contaminados com resíduos oleosos;

b) avaliar o potencial de uso de manoproteínas extraídas da biomassa inativa da

levedura Saccharomyces cerevisiae como bioestimulante em solos contaminados

com resíduos oleosos;

c) comparar a degradação obtida por bioestimulação com a atenuação natural

monitorada;

14

d) verificar a influência dos bioestimulantes adicionados no processo de adsorção do

contaminante no solo.

15

2 DESENVOLVIMENTO

2.1 Revisão Bibliográfica

2.1.1 Biorremediação

As técnicas comumente utilizadas para a descontaminação de solos (escavação,

tratamento e disposição em aterros) são empregadas para efetuar a remediação de locais

contaminados, apesar de apresentarem elevados custos e a possibilidade de impactarem o

meio ambiente. Porém, estas mesmas técnicas também apresentam grande eficiência, curtos

prazos de operação e liberação da área para uso mais rápida (CETESB, 2007).

Bento et. al. (2005), cita que os processos biológicos são uma tecnologia em estudo

para a remoção de contaminantes e ressaltam-se por serem fundamentados em métodos

naturais e simples, com menos agressividade e maior adequação para o equilíbrio ecológico,

além do baixo custo proporcionado se comparado as demais alternativas.

Semple et. al. (2000), aponta o conceito de biorremediação como sendo o uso de

tratamentos biológicos para a limpeza de produtos químicos perigosos no meio. Os

microrganismos são amplamente utilizados devido a sua habilidade exclusiva de interação

química e física com uma grande variedade de moléculas sintéticas e naturais, levando a uma

mudança estrutural ou a degradação complete da molécula-alvo, biotransformando

parcialmente ou completamente organo-xenobióticos em uma biomassa estável e segura.

A meta final da biorremediação é a conversão dos resíduos em subprodutos inertes do

metabolismo dos microrganismos, como dióxido de carbono, gás metano e sais orgânicos

(CORSEUIL, 1994 apud SHMITZ, 2013).

De acordo com a CETESB, 2007, a biorremediação baseia-se na transformação ou

completa destruição de contaminantes orgânicos através da decomposição biológica, pela

ação de microrganismos (bactérias, fungos, leveduras e protozoários). Os microrganismos

degradam poluentes tóxicos para a obtenção de energia, em substâncias como o dióxido de

carbono, água, sais minerais e gases (principalmente metano). A biorremediação compreende

duas técnicas: a bioestimulação e a bioaumentação. Existem algumas vantagens e

desvantagens no uso desta técnica, e ambas estão descritas na Tabela 1.

16

Tabela 1 – Vantagens e desvantagens do uso das técnicas de biorremediação.

Vantagens Desvantagens

Microrganismos capazes de biodegradar

substâncias perigosas, não apenas

transferindo o contaminante de um meio para

outro.

Para os compartimentos água e ar, maior

dificuldade de ambientação dos

microrganismos.

Eficiente em meios homogêneos e arenosos. Limitações de escala para aplicação in situ.

Baixo custo se comparada a outras técnicas. Biodisponibilidade na zona saturada.

Tecnologia considerada destrutiva dos

contaminantes.

Possível colmatação do meio poroso devido

ao crescimento de biomassa.

Capaz de atingir concentrações aceitáveis

ambientalmente para o solo.

Possível formação de subprodutos tóxicos.

Fonte: CETESB, 2007, Adaptado.

Em alguns casos, os produtos da degradação são mais reativos que as transformações

anteriores, e podem, portanto, serem mineralizados. Enquanto outros produtos da degradação

podem ser mais suscetíveis a ligação com a material orgânica. Embora a completa degradação

do contaminante seja desejada, isto pode não ser possível em todos os casos. Entretanto, a

transformação em moléculas menos tóxicas pode ser um cenário mais provável (SEMPLE et

al., 2000).

As estratégias biológicas dependem das atividades metabólicas dos microrganismos do

local, otimização das condições in situ de crescimento e biodegradação. Os tratamentos ex

situ envolvem a remoção física do contaminante, podendo-se utilizar, por exemplo, lagoas e

reatores.

A grande maioria de composto biodegradáveis são os hidrocarbonetos derivados de

petróleo, preservantes de madeira, solventes halogenados e pesticidas. O contaminante deve

exercer a função de fonte de carbono para os microrganismos, sendo também necessário o

fornecimento de nutrientes como nitrogênio e fósforo, e um agente oxidante que funcione

como receptor de elétrons, além de outros nutrientes específicos para cada contaminante. O

fator crítico para se definir a empregabilidade da biorremediação no local contaminado é a

biodegradabilidade do contaminante (CETESB, 2007). A Tabela 2 apresenta alguns

contaminantes e sua relação com a biorremediação.

17

Tabela 2 – Contaminantes e sua relação com a biorremediação

Classe dos

Contaminantes

Frequência de

ocorrência

Evidência de

sucesso

Limitações

Gasolina e óleo

combustível

Muito frequente Fácil biorremediação

aeróbia e anaeróbia

Formação de fase

livre leve (LNAPL)

Poliaromáticos

(naftaleno,

antraceno)

Comum Biorremediação

aeróbia sob

condições específicas

Forte adsorção em

subsuperfície

Creosoto Pouco frequente Fácil biorremediação

aeróbia

Forte adsorção e

formação de fase

livre

Álcool, acetona e

éster

Comum Fácil biorremediação

aeróbia e anaeróbia

Éter Comum Biorremediação

aeróbia e anaeróbia

sob condições

específicas

Fonte: CETESB, 2007, Adaptado.

A biorremediação pode ser de dois tipos: in situ e ex situ. A in situ trata-se da

destruição do contaminante no próprio local, sem que haja a escavação do solo. A

biorremediação in situ é a única opção capaz de retirar os contaminantes adsorvidos no solo e

aquíferos, pois os microrganismos crescem aderidos às superfícies, removendo-os até níveis

aceitáveis pela legislação. É também a que gera menos custo com transporte e armazenamento

de material contaminado, e ainda a que gera menos distúrbios ambientais (MARIANO, 2006).

É menos impactante para o ambiente, se levado em consideração à escavação e o transporte

do solo contaminado.

A biorremediação ex situ define-se quando o solo e/ou água subterrânea são

removidos e tratados em um sistema separado, na própria área ou em uma instalação situada

em outro local. Possíveis interferências no processo ex situ são: características do material a

ser tratado, características e concentrações do contaminante presente (CETESB, 2007).

A escolha da melhor técnica de biorremediação a ser empregada depende de fatores

como: condições do meio (incluindo temperatura, umidade, estrutura, pH, teor de oxigênio,

teor de nutrientes, dentre outros), critérios econômicos, sociais e ambientais que influenciam

no desenvolvimento sustentável, e são de grande importância para a mitigação de impactos

negativos em casos de contaminação (ASSUNÇÃO e ROLFHS, 2012).

18

Essa técnica é utilizada por ser menos agressiva e mais adequada para a manutenção

do equilíbrio ecológico, aliando a isso o baixo custo quando comparada a alternativas de

remediação convencional, tais como bombeamento e tratamento e extração de vapor (BENTO

et al., 2005).

2.1.2 Fatores que interferem no processo de biorremediação

Como se sabe, a biorremediação depende de diversos aspectos que podem vir a

influenciar o processo, tais como: níveis de pH extremo, temperatura e/ou presença de metais

tóxicos que podem influenciar na atividade microbiana. O sucesso da biorremediação depende

de uma grande compreensão sobre o local contaminado (COOKSON, 1994).

Os principais itens requeridos para uma boa remediação estão expressos na pirâmide

que forma a base da biorremediação, apontada na Figura 1. Em ordem de importância,

primeiramente a presença de microrganismos com a capacidade de sintetizar enzimas que

possam degradar contaminantes é requerida. Além disto, muitos processos de degradação

envolvem processos de oxi-redução, e há a necessidade de um substrato ou contaminante

como fonte de energia. Quando este substrato é oxidado, seus elétrons são transferidos para

um aceptor de elétrons, como o oxigênio (fatores que compõe o segundo nível da pirâmide).

O terceiro nível aponta a necessidade de umidade e pH em níveis aceitáveis para o

crescimento microbiano. O quarto nível cita a importância de uma temperatura que não seja

extrema e a disponibilidade de nutrientes inorgânicos como nitrogênio, fósforo e alguns

metais.

Por fim, na base da pirâmide, encontram-se os três itens essenciais para a

sustentabilidade da biorremediação: ausência de elevados níveis de sustâncias que podem ser

tóxicas aos microrganismos, remoção de metabólitos que podem inibir algumas atividades

microbianas e a eliminação de predadores dos microrganismos responsáveis pela degradação

do contaminante.

19

Figura 1 – Pirâmide dos requisitos da biorremediação

Fonte: COOKSON, 1994, Adaptado.

2.1.2.1 Nutrição

Como apontam Corsesuil e Alvarez (1996), os microrganismos, de uma maneira geral,

necessitam de macronutrientes para a realização de diversas funções. Desta forma, podem-se

citar os mais relevantes: carbono, nitrogênio, fósforo, enxofre, cálcio, e magnésio. Necessita

ainda, de um conjunto de micronutrientes para a composição de determinadas funções

metabólicas, então os metais como Fe, Ni, Co, Mo e Zn são necessários para as atividades

enzimáticas. Os macros e micronutrientes participam da composição celular conforme menor

ou maior quantidade requerida (SIQUEIRA et al., 1994).

Dentre os macronutrientes mais importantes, estão o carbono (C), o nitrogênio (N) e o

fósforo (P). De acordo com Spinelli, 2005, o requerimento necessário para se converter 100%

dos hidrocarbonetos em biomassa microbiana é de 10:1 para o carbono e o nitrogênio (C: N) e

100:1 para carbono e fósforo (C: P).

O carbono é a principal fonte nutricional para a célula dos microrganismos, e

representa 47 % de sua massa seca. As fontes de carbono podem ser: aminoácidos, ácidos

graxos, açúcares e compostos aromáticos. Os microrganismos podem utilizar, como fonte de

carbono, hidrocarbonetos para energia e crescimento, e sua proliferação em solos. Se

degradados completamente pela população microbiana, os microrganismos irão produzir,

como produtos finais, dióxido de carbono (CO2), biomassa celular e água (SPINELLI, 2005).

O Nitrogênio é utilizado na formação de aminoácidos e enzimas e produção de ácidos

nucleicos (SPINELLI, 2005). Este elemento é absorvido em forma de amônia e nitrato por

20

microrganismos decompositores, e como nitrogênio atmosférico pelos fixadores deste

elemento. (SIQUEIRA et al., 1994).

O fósforo é necessário à sintetização de ATP e DNA, além de contribuir com funções

metabólicas e constituir ácidos nucléicos, fosfolipídios e ácidos tecóicos (SPINELLI, 2005).

Este se apresenta na natureza na forma de fosfatos orgânicos e inorgânicos, sendo os fosfatos

orgânicos (PO4-2), empregados no crescimento microbiano, e os inorgânicos sob a ação de

enzimas fosfotases (SIQUEIRA et al., 1994).

Em menores quantidades, também são requeridos: enxofre para formação de

aminoácidos, coezimas e vitaminas; Potássio para ativação de enzimas na síntese proteíca;

Cálcio para a estabilidade e estrutura da parede celular; e magnésio, para a estabilidade dos

ribossomos (CORSEUIL e ALVAREZ, 1996).

De acordo com Mariano (2006), é requerido pelos microrganismos para a degradação

principalmente nitrogênio e fósforo, a fim de incrementar a biomassa, tornando a

disponibilidade destes nutrientes um fator crítico para a biorremediação. Assim, pode-se

concluir que a concentração de nutrientes é um fator limitante da biodegradação.

A adição de nutrientes no solo, e também a correção da umidade e controle da aeração

são características altamente decisivas para acelerar o processo de biorremediação.

2.1.2.2 pH

Corseuil e Alvarez (1996), apontam que as enzimas e polímeros de aminoácidos

requerem um grau alto de protonação dos aminoácidos, e isto é controlado pelo pH. O valor

ótimo de pH encontra-se próximo a neutralidade, porém a vários tipos de microrganismos que

desempenham suas funções em pHs que variam de 5 a 9.

A faixa ideal para a promoção de biodegradação em solos está na faixa do neutro para

o levemente alcalino. Assim, a maioria dos estudos indica que o pH ótimo para a degradação

está entre 7 e 8, sendo que valores acima de 9,5 inibem a degradação (SPINELLI, 2005).

Cardoso (1992), aponta que o pH ideal para a ação dos microrganismos no solo deve

encontrar-se entre 5,5 e 8,5.

2.1.2.3 Temperatura

Este é um dos fatores ambientais que mais interferem e influenciam a atividade

microbiana. As baixas temperaturas acarretam na redução da permeabilidade celular,

21

dificultando a absorção de nutrientes e contaminantes. As temperaturas altas associam-se a

alta atividade enzimática e, consequentemente, maior biodegradação. Com temperaturas

diferentes dos valores ótimos, as proteínas, enzimas e ácidos nucleicos são inativados

(CORSEUIL e ALVAREZ, 1996).

Como as transformações biológicas são afetadas pela temperatura, à medida que esta

aumenta, a atividade enzimática também aumenta, até a desnaturação das enzimas. Em

contrapartida, quando as temperaturas baixam, a volatilização diminui, e aumentam a

solubilidade de hidrocarbonetos voláteis em água. De acordo com Spinelli (1994), a

temperatura ideal para a degradação de hidrocarbonetos varia de 18 a 30 ºC.

Cardoso (1992) mostra que o solo também sofre alterações diárias e sazonais na

temperatura, com grande influência nos horizontes superficiais, onde encontra-se a região de

maior atividade dos microrganismos.

2.1.2.4 Umidade

O controle da umidade é um fator importante para a degradação, pois é necessária para

controlar e manter os níveis ótimos para os microrganismos aeróbios, sendo então um agente

responsável pelas rápidas transformações microbianas. Está diretamente ligada a

biodegradação, pois interfere na dissolução de compostos residuais, tem ação dispersiva e

afeta na necessidade da microbiota de manter uma alta atividade de metabolismo. O excesso

de umidade limita o suprimento de oxigênio gasoso, sendo que estudos apontam que a

umidade ótima encontra-se entre 50 e 60%. Caso em excesso ou em falta reduzem a eficácia

da biorremediação (SPINELLI, 2005).

2.1.2.5 Potencial Redox

Segundo Mariano (2006), quando um composto orgânico é oxidado, ele perde elétrons

para um aceptor final de elétrons, que é reduzido (e ganha os elétrons).

O potencial redox é definido através de uma medida quantitativa de oxidação ou

redução que um meio se encontra, e pode ser simbolizado por Eh. Quando este encontra-se

acima de zero é interpretado como meio em oxidação. Quando menor que zero, o meio está

em redução. (SUTHERSAN, 2000 apud SCHMITZ, 2013).

Grande parte dos hidrocarbonetos de petróleo são biodegradados sob condições

anaeróbias. O oxigênio entra, então, como um co-substrato, necessário à enzima para que se

22

inicie o metabolismo dos hidrocarbonetos, utilizando-o, no final, como aceptor final de

elétrons para a geração de energia (YOUNG, 1984 apud SCHMITZ, 2013). O oxigênio é o

principal aceptor de elétrons na degradação de matéria orgânica, e contaminantes

(MESQUITA, 2004). Se ausente, o potencial redox torna-se um fator limitante na degradação

de contaminantes oleosos.

De acordo com CORSEUIL e ALVAREZ, (1996), existem outros vários compostos

que podem ser utilizados como aceptores de elétrons, como o nitrato, óxidos de ferro, sulfato,

dióxido de carbono e água. Os microrganismos seguem a seguinte sequência preferencial, que

reflete no decréscimo do potencial de oxidação: oxigênio>nitrato>óxidos de

ferro>sulfatos>dióxido de carbono.

2.1.3 Técnicas de biorremediação

2.1.3.1 Atenuação natural monitorada

A CETESB (2007) define a atenuação natural monitorada como sendo o uso dos

processos de atenuação que acontecem de forma natural no solo, com o único objetivo de

reduzir as concentrações de contaminação, toxicidade, massa e/ou volume até níveis

adequados à proteção da saúde do homem e do meio ambiente, dentro de um período razoável

de tempo. A remediação natural refere-se aos processos físicos, químicos e biológicos que

facilitam o processo de biorremediação de maneira global, com variado grau de eficiência

(MARIANO, 2006).

Para avaliar se a técnica está ocorrendo realmente na área, e se pode ser classificada

como um método viável de biorremediação, três principais evidências precisam ser

estabelecidas:

1. Dados históricos de qualidade do solo e água subterrânea apresentarem uma

tendência natural de decréscimo natural de descontaminação;

2. Os dados precisam apontar que processos de atenuação natural ocorrem na

área;

3. A comprovação de evidências diretas dos processos de atenuação natural

(indicadores microbiológicos, teores de oxigênio dissolvido, teores de sulfato,

dentre outros).

A grande vantagem do uso desta técnica como método de remediação é o custo, que é

significantemente mais baixo que o custo dos demais métodos, e devem ser feitas análises no

23

solo e na água, além de análises da concentração dos contaminantes em animais e vegetais

(ASSUNÇÃO e ROHLFS, 2012).

Porém, dentre as limitações podem ser citadas: grande quantidade de informações a

serem levantadas para demonstração da seguridade e viabilidade do processo ao longo do

tempo, longos períodos de tempo para que a remediação seja efetiva, presença de

contaminantes resistentes à biodegradação, entre outros (CETESB, 2007).

Dados obtidos em diversas pesquisas comprovam que a técnica limita o deslocamento

dos contaminantes, diminuindo a contaminação ambiental. A remediação natural não é uma

técnica de “nenhuma ação de tratamento”, mas uma forma de redução de riscos à saúde

humana e ao meio ambiente, através do monitoramento da pluma de contaminação,

certificando-se que os pontos receptores (pontos de abastecimento de água, rios, lagos) não

serão contaminados (MARIANO, 2006).

De acordo com Batista, 2004, o processo de atenuação natural de um poluente

orgânico do solo, pode ocorrer de maneira contínua devido ao processo de adaptação natural

da microbiota nativa presente no solo impactado. Esses microrganismos passam a fazer uso

do poluente como fonte de carbono, ocasionando uma redução de sua concentração ao longo

do tempo.

Principalmente bactérias, fungos e leveduras possuem a capacidade de degradar esses

compostos, mas também está é apresentada por diversos gêneros microbianos (SCHMITZ,

2013).

2.1.3.2 Bioaumentação

A baixa taxa de degradação de determinados contaminantes no solo pode ser resultado

de microrganismos inexistentes ou em número reduzido no solo que possuam a habilidade de

degradar compostos. Nestes casos, a bioaumentação, torna-se uma prática recomendada

(JACQUES et al., 2010).

Em alguns locais, onde a contagem de microrganismos indígenos (ou autóctones) foi

considerada insuficiente para a biodegradação de contaminantes em questão, a aplicação de

microrganismos não indígenos (alóctones) poderá ser considerada. Quando bem empregada,

pode acelerar a completa biodegradação do contaminante. (CETESB, 2007).

No entanto, devem-se considerar alguns aspectos: completa caracterização do local

contaminado, para a adequação da melhor técnica de remediação; o produto biotecnológico

deverá ser previamente avaliado e aprovado pelo órgão ambiental competente; sua

24

caracterização, eficiência e toxicidade devem ser apresentadas, e os microrganismos aplicados

não devem interferir com as espécies locais e nos processos biogeoquímicos naturais

(CETESB, 2007).

A junção desta técnica com a bioestimulação é sugerida em diversos trabalhos, pois

pode reduzir o tempo da biorremediação, tornando-se uma vantagem para esse consórcio de

tratamentos (ASSUNÇÃO e ROHLFS, 2012).

2.1.3.3 Bioestimulação

A CETESB (2007) classifica a técnica de bioestimulação como sendo o crescimento

dos microrganismos naturais presentes no local contaminado, estimulado através de

introdução de: oxigênio, nutrientes, substâncias para a correção do pH do meio e receptores

de elétrons específicos para a degradação do ambiente contaminado. Quanto maior for a

população de microrganismos presente na área a ser remediada, mas rápido e eficiente será o

processo de biorremediação.

O processo de bioestimulação introduz nutrientes adicionais na forma de fertilizantes

orgânicos e inorgânicos no sistema contaminado, o que deve aumentar a população

microbiana. Os microrganismos presentes podem ou não utilizar os hidrocarbonetos da

contaminação como fonte de alimento e energia. Entretanto, já se sabe que os hidrocarbonetos

são mais rapidamente degradados em comparação à atenuação natural, devido principalmente

ao aumento no número de microrganismos causado pelos altos níveis de nutrientes (SARKAR

et. al., 2005).

Caso ocorra um limite nas taxas de biodegradação, derivada da dificuldade dos

microrganismos nativos em degradar os poluentes, deve-se avaliar as necessidades físico-

químicas para a atividade microbiana, buscando a adição de agentes externos estimulantes,

como nutrientes, biossurfactantes e oxigênio (ASSUNÇÃO e ROHLFS, 2012).

Como aponta Mariano, 2006, estratégias de bioestimulação podem ocorrer,

envolvendo a adição de agentes estimulantes, como nutrientes, oxigênio e biossurfactantes.

Os microrganismos necessitam, principalmente, de nitrogênio e fósforo para incremento de

biomassa. A composição de um bioestimulante microbiano pode ser fonte de macro e

micronutrientes nos processos de bioestimulação.

25

2.1.3.3.1.1 Bioestimulação utilizando biossurfactantes

Atualmente, sabe-se que biossurfactantes aumentam a emulsificação e a solubilização

de derivados de petróleo, o que favorece o crescimento dos microrganismos neste meio, visto

que as linhagens de microrganismos que utilizam hidrocarbonetos produzem maiores

quantidades de biossurfactantes que outras linhagens crescidas em substratos solúveis em

água (LIN, 2011). Os microrganismos aeróbios são os principais produtores de

biossurfactantes através da utilização de fonte de carbono (BENTO et al, 2005).

Os biossurfactantes apresentam diversas propriedades, dentre elas: adsorção, formação

de micelas, formação de macro e micro emulsões, ação espumante, solubilidade e detergencia.

Eles possuem a capacidade de diminuir as tensões superficiais e/ou interfacial entre gases,

líquidos e sólidos, o que favorece a biodegradação dos poluentes (GOUVEIA et al., 2003).

Segundo Araujo; Freire (2013), os biossurfactantes são definidos como:

“Uma das principais classes de surfactantes naturais, sendo classificados de acordo

com a sua composição química e sua origem microbiana, diferentemente dos sur-

factantes sintetizados quimicamente, que são classificados de acordo com seus

grupos polares.”

De acordo com Kosaric (1988) apud Colla e Costa (2003), as moléculas com

características surfactantes são produzidas quando fornecidos hidrocarbonetos como substrato

aos microrganismos. Assim, os microrganismos assimilam estes compostos, que geralmente

são insolúveis em meio aquoso. Ocorre então a formação das moléculas que constituirão as

partes hidrofóbicas e hidrofílicas do biossurfactante, envolvendo mecanismos de biossíntese

de ácidos graxos, carboidratos e derivados.

2.1.3.3.1.2 Bioestimulação utilizando nutrientes

Hidrocarbonetos servem como fonte de carbono para microrganismos, apresentando-se

como um elemento vital para o crescimento e desenvolvimento destes. Entretanto, outros

macro e micronutrientes também são requeridos (ASSUNÇÃO; ROHLFS, 2012). Devido ao

crescimento da população microbiana, que ocorre pela adição nutricional, os hidrocarbonetos

26

são, supostamente, degradados mais rapidamente na bioestimulação do que na atenuação

natural monitorada (SARKAR et al., 2005).

Conforme aponta Batista (2005), dentre todos os macronutrientes requeridos, o

nitrogênio e o fósforo são considerados fatores limitantes na degradação de microrganismos, e

seu uso deve ser feito após um estudo preliminar que define as melhores fontes possíveis de

nutrientes e sua relação C:N:P (Carbono, Nitrogênio e Fósforo respectivamente), pois cada

ambiente apresenta características e deficiências diferentes, o que pode influenciar na

disponibilidade destes nutrientes aos microrganismos.

Sarkar et al. (2005), mostra que muitos tipos de nutrientes, como fertilizantes

inorgânicos (ureia, serragem, lodo, dentre outros), podem ser utilizados na bioestimulação.

Chaud et al. (2008) indicaram que a parede celular da levedura Saccharomyces

cerevisiae apresenta teores de nitrogênio de 18%. Por este elevado percentual, a levedura

pode ser utilizada como um estimulante natural no solo, visto que este mesmo elemento seria

introduzido de forma sintética no meio.

2.1.4 Biodiesel

Novas fontes renováveis de energia são importantes no quadro atual, pois é apontada

uma possível escassez das reservas de petróleo. A localização geográfica da exploração do

petróleo dá-se em zonas de conflito, impactando no preço e na regularidade de fornecimento.

O fato das mudanças climáticas com as emissões de gases de efeito estufa ser oriundo de

atividades humanas faz com que o mundo contemporâneo parta para uma busca de fontes de

energia com possibilidade de renovação e que assegurem o desenvolvimento sustentável

(SEBRAE, 2006).

A produção de um biocombustível alternativo ao óleo diesel tem sido muito

pesquisada nos últimos anos. Os principais óleos testados foram os derivados de: macaúba,

pinhão-manso, indaiá, buriti, mamona, soja, babaçu, dentre outros.

O biodiesel é definido como um derivado do monoalquil éster de ácidos graxos de

cadeia longa, que tem como origem fontes de energia renováveis, como óleos vegetais ou

gordura animal.

O biodiesel possui as seguintes características: é virtualmente livre de enxofre e

aromáticos; tem alto número de cetano; possui teor médio de oxigênio (em torno de 11%);

possui maior viscosidade e maior ponto de fulgor que o diesel convencional; possui nicho de

mercado específico; no caso do biodiesel de óleo de fritura, se caracteriza por um grande

27

apelo ambiental; e tem preço de mercado relativamente superior ao diesel comercial. Todavia,

se o processo de recuperação e aproveitamentos do subproduto do processamento do biodiesel

(glicerina e catalisador), for considerado, a produção pode ser realizada a um preço

competitivo com o preço comercial do óleo diesel (NETO; ROSSI, 1999).

Pode ser obtido de matérias primas vegetais ou animais. As matérias-primas vegetais

podem ser: soja, mamona, canola, palma, girassol e amendoim, entre outros. As de origem

animal são obtidas de sebo bovino, suíno e aves. Uma nova alternativa são os óleos utilizados

em frituras.

O SEBRAE (2006) aponta que existem duas tecnologias que são aplicadas para a

obtenção de biodiesel: a tecnologia de transesterificação e a tecnologia de craqueamento. A

tecnologia de produção que mais predomina é a de transesterificação metílica, onde os óleos

são misturados com o metanol que, associados a um catalisador, produz biodiesel.

A transesterificação é o processo de separação do glicerol do óleo vegetal, pois

aproximadamente 20% de uma molécula de óleo vegetal é formada por glicerina, pois a

glicerina deixa o óleo muito denso e viscoso. Neste procedimento, a glicerina é removida do

óleo vegetal, deixando o óleo fino e com a viscosidade reduzida. O craqueamento está em

processo de desenvolvimento tecnológico no Brasil.

Diversos fatores contribuem para a biodegradação do biodiesel: presença de ácidos

graxos, ausência de moléculas aromáticas, propriedades higroscópicas e disponibilidade de

ligações éster de alta energia (PASSMAN et. al., 2005).

2.1.5 Processo de adsorção em solos

O solo contaminado está sujeito a um processo de intemperização natural, onde não

envolvem-se apenas processos biólogos, mas também físicos e químicos que são responsáveis

pela redução da concentração de substâncias no solo, tais como: lixiviação, volatilização,

adsorção, etc. (Batista, 2005).

Cecchin (2014) aponta que o tipo de solo e seu tipo de argila apresentam potenciais de

reatividade com o meio, o que pode tornar a biodisponibilidade de sais e/ou contaminantes

maior ou menor, sendo este fator dependente da CTC de cada solo.

Tan (1998), resalta que as maiores interações entre o contaminante e o solo são através

da sorção, complexação e precipitação. Se no meio poroso do solo, os contaminantes

movimentam-se entre os meios fluídos do solo (ar e água), fazendo com que estas fases

28

acabem tendo importância nos processos de transporte dos contaminantes e na capacidade de

retenção destes compostos pelo solo (CORRER, 2008).

A capacidade de sorção dos microporos presentes no solo é extramente elevada, já que

a sorção de compostos nesse meio é um mecanismo de preenchimento de saliências, e não de

cobertura de superfícies (CECCHIN, 2014).

Os processos de adsorção dos minerais que formam o solo dependem do tamanho dos

poros que existem em sua estrutura, e também do diâmetro da molécula que será adsorvida. É

definida como adsorção a retenção de sólidos, líquidos e gases nas superfícies livres dos solos

(ZYTNER, 1994).

A sorção pode ser considerada como um dos principais fatores de atenuação natural

dos contaminantes no solo, através da retardação da pluma de contaminação, fazendo com que

os toxicantes presentes no solo permaneçam retidos na superfície do sólido, através de reações

físico-químicas (CECCHIN, 2014). Esta pode sofrer influência pelo grau de interação entre o

adsorvente, representado pelo argilomineral, e o adsorbato que está presente no meio fluído,

representado pelos contaminantes e nutrientes.

Trabalhos mostram que é possível observar que contaminantes orgânicos possuem

maior afinidade com superfícies orgânicas do solo, ficando as superfícies minerais em

segundo plano. Os fatores que podem afetar a capacidade de adsorção de argilominerais são:

área superficial disponível, capacidade de troca de cátions, estado de hidratação do mineral e

acidez superficial (YARON et. al., 2012).

Os processos de biorremediação podem ser diretamente afetados por fatores abióticos

(componentes do solo – minerais e orgânicos), influenciados pelo processo de sorção. Assim,

sabe-se que a interação do solo com o contaminante afeta a efetividade do processo de

biorremediação, mas que contribuem para a redução da toxicidade que os compostos possam

exercer no meio.

Apesar da ação dos microrganismos ser capaz de promover uma desorção destes

compostos que encontram-se sorvidos, essa função ocorre apenas nas regiões expostas da

partícula mineral. Assim, embora se tenha nutrientes e/ou contaminantes presentes na

estrutura do solo, uma significante parcela destes não encontra-se disponível para os

microrganismos a utilizarem (CECCHIN, 2014).

29

2.1.6 Leveduras

Costa et. al. (2010) afirmam que as leveduras tratam-se de fungos unicelulares de alta

empregabilidade industrial, que reproduzem-se de forma vegetativa através de brotação ou

cissiparidade. São classificadas em três diferentes itens, subdivididos por seu meio de

reprodução: os Ascomycetos, os Basideomycetos e Fungos Imperfeitos (GABBARDO, 2009),

podendo viver em uma vasta condição ambiental e utilizar diversas substâncias como fonte de

nutrientes.

De acordo com Guimarães, 2005, as leveduras podem ser de forma oval, esférica ou

elíptica. Não possuem flagelo, portanto são imóveis. Seu tamanho varia conforme a espécie,

nutrição, idade e outros fatores. Dependem principalmente de fontes de carbono para seu

desenvolvimento, sendo os carboidratos a maior fonte relevante. Glicose, frutose e manose

são exemplos de açúcares simples que também podem ser assimilados como forma de

nutriente.

Segundo Gabbardo, 2009, a parede celular das leveduras representam de 15 à 25% da

massa seca da célula, sendo de origem polissacarídica e proteica. A organização da parede

celular proporciona a célula uma grande capacidade protetora e, devido a sua formação

macromolecular, a forma da própria célula. A parece celular da levedura é constituída

principalmente de β-glucanos e manoproteínas. Para a S. Cerevisiae em específico, os β-

glucanos representam até 60% da massa seca da parede celular. Manoproteínas representam

cerca de 25 à 50% da parede desta levedura.

Sua grande vantagem está em seu status GRAS (generally regarded as safe) – o que

significa que não representam riscos toxicológicos e de patogenicidade, podendo ser aplicados

em indústrias farmacêuticas e de alimentos.

Exemplos destes organismos podem ser Yarrowia lipolytica, Saccharomyces

cerevisiae e Kluyveromyces lactis.

2.1.6.1 Saccharomyces cerevisiae

Segundo Costa et. al. (2010), a Saccharomyces cerevisiae, especificamente, é a que

maior apresenta valor comercial e industrial, por tratar-se de agentes de transformação

utilizados em indústrias de bebidas fermentadas (cervejarias), de panificação e destilarias de

etanol, possuírem alta capacidade de desenvolvimento em diferentes substratos e estarem

facilmente disponíveis, facilidade de obtenção e multiplicação, possibilidade de cultivo

30

independente do ambiente, pequena exigência de água e área e formação de produtos de

grande valor nutritivo (DEL RIO 2005, apud OURA 1995).

A grande quantidade de biomassa residual gerada demonstra a necessidade de estudos

para que estes resíduos tenham reaproveitamento, originando novos compostos ou produtos.

Como exemplo da aplicação do resíduo desta levedura, Costa et al. (2010), utilizaram

a biomassa residual de indústria de cervejaria, para a extração de manoproteínas. As

condições ótimas de extração foram de 9 h à 95°C, para suspensão de 10% da parede celular.

O extrato obtido apresentou alto teor de proteínas, carboidratos e uma alta concentração de

nutrientes, e boas propriedades emulsificantes, tornando-se uma opção a ser utilizado por

indústrias farmacêuticas. Os bioemusificantes obtidos de Saccharomyces Cerevisiae

apresentam a porção proteíca como a responsável pelas propriedades emulsificantes, e os

carboidratos de cadeias curtas aumentam a solubilidade do composto e atribuem estabilidade

a emulsão.

Segundo Gabbardo (2009) os polissacarídeos produzidos especificamente pelo gênero

Saccharmyces são os glucanos e as manoproteínas. As manoproteínas são liberadas pela

levedura ao longo do processo de autólise e/ou fermentação alcoólica.

A Saccharomyces cerevisiae pode hoje ser considerado o eucariótico mais estudado,

devido a sua grande importância em processos biológicos que a envolvem, como por

exemplo, a produção de cerveja, vinho, combustíveis de fontes renováveis (AQUARONE et

al. 2001, apud GUIMARÃES, 2005) e a sua fácil manipulação genética.

Hoje, esta levedura é responsável pelos principais produtos de processos

fermentativos, podendo gerar até 60 milhões de toneladas de cerveja, 30 milhões de toneladas

de vinho e 600.000 toneladas de fermento de pão.

Barriga et al. (1999) buscaram a produção de um bioemulsificante a partir de

Saccharomyces cerevisiae, objetivando a utilização em indústrias alimentícias e de

cosméticos, utilizando a levedura residual de cervejarias e vinícolas. O bioemulsificante é

uma manoproteína solúvel em água, e facilmente extraída da parede celular, sendo sua

principal composição proteínas e carboidratos.

2.1.7 Manoproteínas

A fim de garantir a integridade das leveduras, a parede celular tem grande importância,

sendo constituída de três principais grupos de polímeros: manoproteínas, β-glucana e quitina.

31

É formado também por proteínas e lipídeos, presentes em menores quantidades. (CID et. al,

1995).

De acordo com Liu (2008), as manoproteínas são polímeros formados por

glicoproteínas, proteínas covalentemente ligados a carboidratos, principalmente a manose e

glicose em menor quantidade, correspondendo a 40% da massa seca da parede celular. Essa

molécula representa unidades de manopiranosil, com ligações α-1, 2-α-1 e α-1,6, em

associação com grupos fosfatos (FREIMUND et al, 2003) e resulta em cargas negativas na

superfície da célula, o que torna a porção responsável pelas propriedades hidrofílicas da

parede (KLIS et al, 2002).

Existem duas classes de manoproteínas: aquelas que possuem somente uma função

estrutural, sendo as mais abundantes macromoléculas da parede celular de leveduras, que

compõem-se de cerca de 10 % de proteínas e 90% de carboidratos, intercalados com uma rede

de glucana, que forma a camada externa da parede celular. A outra classe possui função

enzimática, contendo de 30 à 50 % de proteínas e o restante de carboidratos, estando

localizadas principalmente no espaço periplasmático, entre a membrana plasmática e a parece

celular (BARRIGA et al., 1999).

Como aponta Kóllar et. al. (2008), são importantes para a permeabilidade da parede,

pois limitam o acesso de enzimas estranhas à célula, atuando como um filtro, sendo de grande

importância para a permeabilidade da parede celular.

Podem atuar como bioemulsificantes, pois a presença de polímeros hidrofílicos de

manose ligados a proteína atribuem as manoproteínas uma estrutura comum para agentes

emulsificantes e tenso ativos eficazes, sendo solúveis em água e podendo ser extraídas em

altos níveis.

De acordo com Barriga et al. (1999), a melhor propriedade emulsificante da

manoproteína acontece quando a molécula contém uma maior quantidade de proteínas em

relação à carboidratos, embora este último também é responsável pela solubilidade do

composto e estabilidade da emulsão.

Suas propriedades imunoestimulantes e biossurfactantes vêm sendo resaltadas, o que a

torna atrativa para aplicação na indústria. Como a maioria das leveduras das quais as

manoproteínas são extraídas são empregadas em processos de alimentos e na indústria de

cosméticos, a emulsão é esperada não ser tóxica, podendo então ter sua aplicação utilizada em

produtos naturais e seguros ao meio ambiente. Consequentemente, o desenvolvimento de

metodologias de extração de manoproteínas a partir de leveduras descartadas em processos

32

biotecnológicos, como fermentações, por exemplo, é de suma importância. (DIKIT et al,

2009).

Além do potencial emulsificante já apresentando, as manoproteínas são facilmente

produzidas devido a grande disponibilidade de matéria prima e baixo custo, como as

leveduras descartadas como subproduto de cervejarias e vinícolas (DARPOSSOLO, 2010).

Os métodos que se utilizam para a extração de manoproteínas da parede da S.

cerevisiae e podem ser extraídas por métodos enzimáticos ou químicos. Os métodos químicos

utilizam sistema de autoclavagem em presença de álcalis ou em solução tampão citrato em pH

7. Os métodos enzimáticos liberam manoproteínas por digestão dos glucanos. (RIBÉREAU-

GAYON et al, 2003).

2.2 Métodos e materiais

2.2.1 Métodos e técnicas

O projeto seguiu o organograma apresentado na Figura 2.

Figura 2 – Organograma experimental para o trabalho de conclusão de curso

2.2.2 Solo

O solo utilizado para a realização dos experimentos foi coletado próximo ao prédio

Centro Tecnológico de Engenharia Civil, Ambiental e Arquitetura da Universidade de Passo

33

Fundo (CETEC/UPF), em uma trincheira de profundidade de 1,2 metros. Foram necessários

350 gramas de solo para cada uma das 20 amostras utilizadas nas análises, totalizando 7,0

quilos de solo coletado.

O solo utilizado no experimento é classificado pedologicamente como Latossolo

Vermelho distrófico húmico (STRECK, 2008) e geotecnicamente como argila de alta

plasticidade (PRIETTO, 2010). Apresenta pH ácido, baixo teor de matéria orgânica e baixa

CTC, e em geral possuem baixa permeabilidade. Os Latossolos apresentam boa estruturação e

grande quantidade de macroporos, permitindo permeabilidade de água e ar. (REGINATTO,

2012). Outras características geotécnicas estão apontadas na Figura 3 abaixo:

Figura 3 – Caracterização do solo utilizado nos experimentos.

Fonte: PRIETTO (2010).

O solo coletado possui uma umidade média de 28,41%. Esta umidade foi ajustada para

30% com água destilada e em seguida adicionou-se 5% de contaminante (em relação à massa

de solo seco).

2.2.3 Bioestimulantes

2.2.3.1 Manoproteínas

A manoproteína utilizada no experimento foi extraída da levedura Saccharomyces

cerevisiae através de processo de centrifugação de células, que posteriormente foram

34

suspendidas a 20% (peso úmido por volume) em solução de citrato de sódio 0,1 mol/L e

metabissulfito de potássio 0,02 mol/L em pH 7. A mistura foi autoclavada por 2 h a 121 ºC e

centrifugada a 5000 rpm por 10 min a temperatura ambiente. Para o preparo dos

biossurfactantes, 3 volumes de etanol 95% contendo 1% de ácido acético (v/v) foram

adicionados ao sobrenadante por 16 h a 4ºC. O precipitado foi coletado por centrifugação a

10000 rpm, secada e estocada a temperatura ambiente.

2.2.4 Microrganismos utilizados para a biorremediação

2.2.4.1 Levedura

O material utilizado foi a levedura Saccharomyces cerevisiae em sua forma inativa,

obtida comercialmente (fermento para a produção de pães da marca Saft-Instant).

2.2.5 Contaminante

O solo foi contaminado com 5% de biodiesel.

2.2.6 Delineamento Experimental

Os experimentos foram realizados no Laboratório de Ensino de Engenharia Ambiental

da Universidade de Passo Fundo, utilizando 8 frascos hermeticamente fechados contendo 350

g de solo contaminado com Biodiesel, e com umidade inicial de 35%, realizados em

duplicata, conforme delineamento experimental demonstrado na Tabela 3.

Tabela 3 – Delineamento experimental do processo de biorremediação

Tratamentos Técnica de Biorremediação Contaminante

1 Bioest. biomassa S. cerevisiae Biodiesel

2 Bioest. Manoproteína Biodiesel

3 Atenuação Natural Biodiesel

4 Controle -

Os experimentos realizados foram comparados com o delineamento experimental da

Tabela 4, onde 12 frascos contendo 300 gramas de solo foram esterilizados a fim de investigar

se o solo, sem atuação biológica, promove a redução da contaminação através de processos

35

físicos e/ou químicos. Os ensaios foram realizados em duplicata, e análises de teor umidade e

óleos e graxas foram realizados.

Tabela 4 – Delineamento experimental do processo de esterilização do solo

Tratamentos Técnica de Biorremediação Contaminante Esterilização

1 Bioest. biomassa S. cerevisiae Biodiesel 120 ºC por 20 min.

2 Bioest. Manoproteína Biodiesel 120 ºC por 20 min.

3 Atenuação Natural Biodiesel 120 ºC por 20 min.

4 Controle - 120 ºC por 20 min.

2.2.7 Processo de Biorremediação

2.2.7.1 Umidade

A umidade do solo utilizado foi avaliada nos tempos 0, 30 dias e 60 dias para o

processo de biorremediação e para o solo estéril, de acordo com a NBR 6457 (ABNT, 1986) e

de acordo com a equação 1 abaixo:

100.)()sec(

)sec()((%)

cápsulaosolocápsula

osolocápsulasoloúmidocápsulaUmidade

(1)

2.2.7.2 Evolução de CO2

A determinação da evolução de CO2 nos experimentos baseou-se na metodologia

adaptada do respirometro de Bartha, conforme NBR – 14.283 - Resíduos em solos –

Determinação da Biodegradação pelo método Respirométrico (ABNT, 1999) e não foi

realizada para os frascos esterilizados.

Nos frascos adicionou-se um béquer de 50 mL, contendo 30 mL de solução de NaOH

0,5 mol/L. A cada 3 dias foi retirado uma alíquota de 10 mL deste béquer e, juntamente com

10 mL de BaCl2 (0,2 mol/L) e 2 gotas de indicador fenolftaleína. Esta solução foi titulada com

HCl padronizado (0,1 mol/L) para o cálculo da evolução de CO2. Após a análise, novamente

foi adicionado os 30 mL de NaOH aos frascos, e estes em seguida, fechados.

O cálculo tornou-se possível, pois o CO2 resultante da biodegradação reage com o

NaOH do interior do frasco, formando Na2CO3 (equação 2). A mistura de Na2CO3 e excesso

de NaOH é adicionada a solução de BaCl2 0,1 N, ocorrendo a reação do Na2CO3 e do BaCl2

36

formando o precipitado BaCO3, sequestrando o carbonato e garantindo que o HCl reaja

apenas com o NaOH, permitindo o cálculo da quantidade CO2 produzido, de acordo com a

equação 3. (COSTA, 2009 apud CDECESARO, 2013).

2NaOH + CO2 → Na2CO3 + H2O (2)

NaOH + HCl → NaCl + H2O (3)

O volume de HCl 0,1 mol/L gasto na titulação do NaOH 0,5 mol/L torna possível

saber, por esquiometria, a quantidade de CO2 gerada pelos microrganismos do solo em cada

um dos tempos determinados, comparando-os com o volume gasto para titular o branco

(NaOH sem presença de solo no interior dos frascos), conforme equação 4 abaixo:

)(2 mgCOC = 21.(6..).( VVfMVB ) (4)

Onde:

B= Volume de HCl 0,1 mol/L gasto no branco (mL)

V = Volume de HCl 0,1 mol/L gasto na amostra (mL)

M = Concentração real do HCl (mol/L)

6 = Massa atômica do C(12) dividido pelo número de mols de CO2 que reagem com o NaOH

V1 = Volume de NaOH usado na captura de CO2 (mL)

V2 = Volume de NaOH usado na titulação (mL)

F = fator de correção do HCl

O cálculo da evolução de CO2 foi apresentado através da relação de CO2 evoluído por

quilo de solo.

2.2.7.3 Óleos e graxas

A análise foi realizada utilizando-se a metodologia de extração pelo aparelho Soxhlet,

no tempo de 60 dias, sendo utilizado para determinar o percentual de contaminante reduzido

pelos microrganismos e quanto será removido pelo solo esterilizado. O cálculo do teor

residual e da porcentagem de degradação foi realizado conforme equação 5:

37

Teor residual (%) = 100.0

12

P

PP (5)

Onde:

Po = Quantidade de amostra de solo em peso seco utilizada na análise (g)

P1 = Peso do balão (g)

P2 = Peso do balão mais a mistura extraída do solo contaminado (g)

Para o resultado na forma de degradação utilizou-se a equação 6:

Degradação (%) = 100.%

%%

inicial

finalinicial

OG

OGOG (6)

Onde:

OG inicial = contaminação inicial de Óleos e Graxas

OG final = contaminação final de Óleos e Graxas

2.2.8 Caracterização da Manoproteína utilizada no experimento

2.2.8.1 Determinação de Umidade

Em uma cápsula previamente tarada (sem umidade), pesou-se 5 gramas de amostra

homogeneizada. Levou-se à estufa a 105 oC para dessecar o material até peso constante, ou

seja, quando duas pesagens consecutivas não apresentarem diferença de peso.

A umidade, em %, foi dada por:

100.)(

)()((%)

P

pPUmidade

(7)

Onde:

P= Massa do alimento (g)

p = Massa do alimento seco (g)

2.2.8.2 Determinação de Lipídios

Pesou-se 5 g de material, transferindo-o para o cartucho de soxhlet e cobrindo a

amostra no cartucho com algodão. Extraiu-se em aparelho de soxhlet com éter etílico,

38

utilizando balão de fundo chato (250 mL) previamente dessecado e tarado.

O teor de lipídios foi dado por:

100.100/,0

12

P

PPggLipídios

(8)

Onde:

P2 = Peso do balão com lipídios (g)

P1 = Peso do balão (g)

P0 = Quantidade de amostra (g)

2.2.8.3 Determinação de Proteína

Pesou-se 0,5 g de amostra em papel livre de nitrogênio, transferindo-o com o papel

para o frasco de digestão. Adicionou-se catalisador (sulfato de potássio e sulfato de cobre).

Adicionou-se 20 mL de ácido sulfúrico concentrado e foi realizada a digestão. Em seguida, a

amostra foi destilada e titulada.

As proteínas foram calculadas por:

P

FFVVggproteínas

CBA )14,0...(100/,

) (9)

Onde:

Va = Volume de HCl 0,1 N gasto na titulação da amostra (mL)

Vb = Volume HCl 0,1 N gasto na titulação do branco (mL)

Fc = Fator de correção do HCl 0,1 N

F = 6,25

2.2.8.4 Determinação de Resíduo Mineral Fixo (Cinzas)

Pesou-se em cadinho calcinado e tarado, 3 g de amostra. Iniciou-se a incineração em

bico de Bunsen. Quando o material estava completamente carbonizado, transferiu-se o

cadinho para a mufla a 550ºC deixando-o por um período suficiente para total destruição da

matéria orgânica. O material foi colocado no dessecador, e em seguida pesado.

As cinzas foram calculadas por:

P

Aggcinzas

100.100/, (10)

39

Onde:

A = Massa de cinzas (g)

P = Massa da amostra (g)

2.2.9 Tratamento dos dados

Os dados referentes à evolução de CO2, umidade, remoção de óleos e graxas e fator de

conversão foram analisados utilizando-se o programa Excel.

2.3 Resultados e discussões

2.3.1 Caracterização da Manoproteína utilizada no experimento

A Tabela 5 mostra os resultados obtidos para a caracterização prévia da manoproteína

extraída da levedura S. Cerevisiae utilizada como bioestimulante no ensaio de biorremediação

em questão.

Tabela 5 – Caracterização da manoproteína utilizada no ensaio de biorremediação

Caracterização Valores (%)

Umidade 3,19 ± 0,10

Proteínas 42,69 ± 1,19

Cinzas 4,67 ± 0,39

Lipídios 32,73 ± 2,29

Carboidratos 16,72 ± 0,00

Os resultados de caracterização aproximam-se dos obtidos por Costa et. al. (2012), os

quais estudaram a extração e caracterização de manoproteínas de leveduras de descarte em

cervejarias, obtendo as seguintes características: 51,39% de proteínas, 25,89% de

carboidratos, distribuídos entre manose e glicose. Os resultados evidenciaram o potencial

bioemulsificante e comprovaram a viabilidade da utlização deste descarte para obtenção de

compostos com propriedades industriais relevantes.

Existe uma classe de manoproteínas que possui função enzimática, contendo de 30 a

50% de proteínas, estando estas localizadas principalmente no espaço periplasmático, entre a

membrana plasmática e a parede celular (BARRIGA et al., 1999).

Os valores obtidos para o ensaio caracteriza a manoproteína, por seu percentual

proteico, como manoproteínas de função enzimática.

40

Assim, a manoproteína obtida pela levedura S. Cerevisiae é classificada como um

biossurfactante polimérico, conforme mostra DESAI; BANAT (1997).

2.3.2 Umidade no ensaio de biorremediação

Com a umidade inicial ajustada para 35%, esta não apresentou grandes variações de um

modo geral. Sua grande redução do tempo 0 para o tempo de 30 dias pode ser explicada

devido à manipulação dos frascos realizada a cada 2 dias durante todo o ensaio para a coleta

de amostras.

Ambas as réplicas dos controles não apresentaram grande variância entre os valores,

ficando ambas, ao final do experimento, entre 18 e 19% A variação presente da umidade no

tempo de 30 dias para os 60 dias pode indicar a presença de um erro experimental. As

réplicas da atenuação natural com a adição de biodiesel apresentaram teores de umidade entre

18 e 20%, mostrando pouca variabilidade nos valores. Os experimentos que levam a adição de

biomassa ficaram próximos a 20%, e os de manoproteína, entre 24 e 25%. A Figura 4

apresenta os valores de umidade obtidos nos ensaios de biorremediação.

Figura 4 – Teor de umidade do ensaio de biorremediação

O teor de umidade oscilou bastante nos frascos esterilizados, fator que pode ser

atribuído à variabilidade que pode existir entre os frascos, que pode ter ocorrido na montagem

dos experimentos. A atenuação natural, ao final de 60 dias, apresentou valores em torno de

24%, a biorremediação com biomassa, de 25% e a bioestimulação com manoproteínas, 26%.

41

A análise no tempo de 30 dias não foi possível de ser realizada para a biomassa, devido

a uma falha na esterilização do experimento. Os teores de umidade do controle oscilaram de

tal forma, que pode-se observar falha experimental em ambas análises. A Figura 5 indica os

teores de umidade obtidos.

Figura 5 – Teor de umidade para o solo esterilizado

A Tabela 6 aponta os valores de umidade para o tempo de 60 dias de ensaio, para os

solos que foram e que não foram esterilizados.

Tabela 6 – Comparação da umidade para o solo estéril e não estéril

EXPERIMENTO Solo não estéril (%) Solo esterilizado (%)

Controle 19,26 37,43

At. Natural + Biodiesel 19,38 24,54

Bioest. + Biomassa 20,01 25,65

Bioest. + Manoproteína 24,61 26,41

Com esta comparação, é notável a perda de umidade para o solo não esterilizado, em

virtude de este ser o mesmo frasco utilizado para a análise da atividade respirométrica

microbiana. Os teores de umidade tornam-se mais altos nos experimentos estéreis, porém não

se igualam a umidade inicial adicionada, mostrando que a perda de umidade também ocorre,

mas em velocidade reduzida, se comparada com o experimento não estéril, que sofreu

manipulação, facilitando a perda de água no meio. Como os frascos em que se encontravam as

amostras estéreis estavam hermeticamente fechados, isto justifica o teor de umidade mais alto

encontrado.

42

2.3.3 Atividade microbiana

Quando há formação de CO2, e esta é emitida para a atmosfera, presume-se que a

biodegradação do substrato seja igual ao CO2 emitido (MARIANO, 2006). A Figura 6 abaixo

informa os resultados de evolução de CO2 obtidos nos 60 dias de ensaio.

Figura 6 – Atividade microbiana durante os 60 dias de ensaio

Pode-se observar que a manoproteína e a biomassa apresentaram os maiores valores de

produção de CO2, sendo possível observar que a curva apresentou maior ascendência nos

primeiros 28 dias de ensaio, para os experimentos com a adição de manoproteína e biomassa.

Percebe-se que até o período final dos 60 dias de ensaio, os microrganismos ainda possuem

atividade de degradação, pois não nota-se a entrada na fase estacionária de crescimento. Isto

pode ser concluído através da visualização do gráfico na Figura 6, que indica ainda

crescimento exponencial. Os experimentos de atenuação natural não demonstraram valores de

evolução significativos, fato que já era esperado, principalmente em virtude de que a

atenuação natural não contempla a adição de microrganismos.

A Figura 7 apresenta os máximos valores de evolução de CO2 obtidos no ensaio.

43

Figura 7 - Valores máximos obtidos no ensaio de atividade microbiana

Observando a Figura 7, pode-se constatar que o máximo valor de carbono acumulado

foi verificado na bioestimulação com a manoproteína, onde se obteve o maior valor (8547,26

mg C-CO2), seguido pela bioaumentação utilizando a biomassa da levedura Saccharomyces

cerevisiae , onde obteve-se valores de7652,25 mg C-CO2. A atenuação natural obteve valores

muito reduzidos de carbono acumulado (852,736 mg C-CO2), demonstrando que a adição de

bioestimulantes e microrganismos foi de extrema importância para a degradação do

contaminante em questão.

O alto valor de carbono obtido pode ser justificado pela adição de biodiesel, pois este é

um composto de origem vegetal, podendo ser mais facilmente assimilado pelos

microrganismos. Para o maior valor utilizando a técnica de bioestimulação com

manoproteína, isso se deve ao fato de que a manoproteína constitui-se de um polímero

emulsificante previamente extraído da célula da levedura, o que pode acelerar a assimilação

deste composto no meio.

Comparando-se as técnicas, percebe-se que a bioestimulação com a levedura

Saccharomyces cerevisiae e a bioestimulação com manoproteína apresentaram valores de

evolução bem maiores se comparando com a atenuação natural. Isto indica que a adição de

microrganismos e a presença de uma fonte nutritiva no meio é um fator chave para o sucesso

da biorremediação (MARIANO, 2006).

Oliveira (2008), realizou um ensaio de biorremediação com biodiesel de origem animal,

utilizando a levedura Candida viswanathii em um solo arenoso, atingindo resultados de

44

biodegradação de até 55%, quando utilizada uma capacidade de campo de 70%, de acordo

com a NBR 14.283/99.

Decesaro (2013) utilizou como bioestimulante em um ensaio de biorremediação a

ficocianina, obtendo os maiores valores de carbono acumulados com a ficocianina (2997,37

mg C-CO2), seguida da biomassa inativa da microalga S. platensis (2882,90 mg C-CO2). Para

o mesmo contaminante, o comportamento da atividade respirométrica é similar neste

experimento, pois há maior valor de carbono acumulado na bioestimulação com

manoproteína, seguida da bioestimulação com a levedura.

2.3.4 Remoção do contaminante

A Tabela 7 apresenta os valores obtidos para a biodegradação no ensaio onde os frascos

não foram esterilizados, e houve ação dos microrganismos através Do metabolismo

microbiano.

Tabela 7 - Biodegradação de biodiesel em solo não estéril aos 60 dias de ensaio

Técnica + Contaminante % biodegradação

Bioest. Manoproteínas + Biodiesel 50,04 ± 4,23

63,69 ± 1,76

Bioest. Biomassa + Biodiesel 91,74 ± 4,08

90,55 ± 1,53

At. Natural 24,86 ± 0,63

23,49 ± 0,97

Através da Tabela 7 pode-se perceber a biodegradação de 90% do contaminante

utilizando a biomassa da levedura Saccharomyces cerevisiae, e um percentual de

biodegradação de aproximadamente de 60% com a utilização das manoproteínas extraídas. A

atenuação natural resultou em aproximadamente 25% de degradação. A Figura 8 representa

os percentuais de degradação, ao tempo final do ensaio (60 dias).

45

Figura 8 – Biodegradação obtida no tempo 60 dias, para as técnicas de biorremediação

adotadas.

A Tabela 8 apresenta o percentual de biodiesel retido no solo obtido ao final dos 60

dias de análise para o solo esterilizado.

Tabela 8 – Retenção de contaminante em solo estéril

Técnica + Contaminante % retenção

Bioest. Manoproteínas + Biodiesel 14,94 ± 1,07

Bioest. Biomassa + Biodiesel 10,08 ± 0,16

At. Natural + Biodiesel 20,83 ± 0,69

Pode-se analisar a remoção de um pequeno percentual de biodiesel. Como a influência

da ação dos microrganismos presentes nesta análise é nula, pode-se concluir que o

contaminante fica adsorvido no solo, e que a adição destes afeta a adsorção do contaminante,

visto que quando presente no meio, a remoção de biodiesel ocorreu em níveis menores

(14,94% e 10,08%, respectivamente). Assim, pode-se afirmar que o contaminante também

pode ficar retido, em pequena parte, na célula microbiana. A Figura 9 apresenta o percentual

de retenção de biodiesel ao final do ensaio.

46

Figura 9 – Retenção do contaminante obtida no tempo 60 dias, para as técnicas de remedição

adotadas.

A Figura 10 apresenta o percentual de retenção (adsorção) do biodiesel em solo estéril

e a máxima biodegradação obtida em solo não estéril, para que se possa comprar a influência

da presença de microrganismos em solo estéril.

Figura 10 – Máximos valores obtidos para a retenção do contaminante e biodegradação em

solos.

Como os índices de retenção de biodiesel em solo estéril foram de 10 a 20%, deve-se

desconsiderar este percentual, antes tomado como ação dos microrganismos, um percentual de

biodegradação. Este valor deve sim ser atribuído à adsorção do solo utilizado nos ensaios,

provando que há significativa interação entre as partículas do solo e do contaminante.

47

A Tabela 9 mostra a diferença entre os valores de biodegradação para os dois casos

utilizados no ensaio, mostrando a efetiva influência na biodegradação de resíduos oleosos por

microrganismos para o solo argiloso que foi utilizado no experimento.

Tabela 9 – Influência dos microrganismos na biodegradação de resíduos oleosos

Técnica + Contaminante Efetiva biodegradação (%)

At. Natural + Biodiesel 3,34

Biorr. Biomassa + Biodiesel 81,07

Bioest. Manoproteína + Biodiesel 41,93

Com a atividade microbiológica sob o solo a biodegradação de resíduos oleosos é

favorecida. Esta apresenta-se maior onde há inserção de biomassa da levedura

Saccharomyces cerevisiae e quando manoproteinas estão presentes no meio.

A técnica de atenuação natural também apresentou influênica na remoção dos

contaminantes, indicando que a influencia da umidade e dos microrganismos presentes no

próprio solo também são fatores limitantes para a degradação.

De acordo com Cecchin (2014), os bioestimulantes influenciam diretamente na

capacidade de interação do solo com o contaminante, reduzindo a retenção desta partícula. A

adição de microrganismos gera uma competição com o biodiesel a fim de buscar a interação

com as partículas do solo. Desta forma, justifica-se que a atenuação natural demonstrou uma

maior retenção de biodiesel. A presença de nutrientes e microrganismos no solo promovem

um comportamento diferenciado na adsorção do contaminante no solo.

48

3 CONCLUSÕES

Os solos contaminados com biodiesel apresentaram biorremediação diante das

técnicas empregadas, sendo a mais eficiente a biorremediação com biomassa da

levedura S. cerevisiae;

O uso da manoproteína como bioestimulação pode ser utilizada como técnica de

biorremediação para solos contaminados com biodiesel, chegando seus índices de

degradação a atingirem 63%, durante um período de 60 dias.

A degradação obtida pela atenuação natural monitorada mostrou-se menos

eficiente do que a degradação apresentada pela bioestimulação com o uso de

manoproteínas, obtendo-se uma diferença superior a 30%, demonstrando que o

uso de bioestimulação é mais eficaz para a remoção de biodiesel;

Os bioestimulantes atuam positivamente no solo, aumentando a taxa de

degradação do contaminante visto que pouco contaminante fica adsorvido no solo

quando presente microrganismos ativos no meio.

49

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