bioquimica levaduras

7/31/2019 bioquimica levaduras

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Jornadas Cientficas 99Grupos de Investigacin Enolgica

Zaragoza, 17-19 de mayo de 1999

Aspectos bioqumicosy microbiolgicos

del vino


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as toxinas killerdisminuyen el gradienteelectroqumico de la membrana plas-mtica de las levaduras sensibles, inte-

Utilizacin de compuestos nitrogenadosen mostos garnacha inoculados con cepas killerde S. cerevisiae

D. Torrea Goi y C. Ancn Azpilicueta

Lrrumpiendo el transporte acoplado de proto-nes y aminocidos.1 El objetivo de este traba-

jo es estudiar la utilizacin de aminocidos enmostos garnacha, inoculados con dos cepaskiller (K2) de S. cerevisiae (D47 y K1M). Laimplantacin de dichas cepas se verific porPCR, siguiendo el mtodo de Lavalle et al.(1994).2 Los resultados se comparan con unmosto fermentado con sus levaduras autc-tonas (muestra control). El anlisis de los

aminocidos libres se realiz por HPLC, si-guiendo el mtodo Pico-Tag.3

En el primer 25 % de azcares fermenta-dos, los aminocidos se consumen en granproporcin en las tres muestras (tabla 1). Del25 % al 50 % de azcares fermentados, los

Departamento de Qumica Aplicada, Universidad Pblica de Navarra, Pamplona

aminocidos se siguen consumiendo, aunquealgunos se excretan en las muestras sembra-das con las levaduras killer(tabla 1). Del 50al 75 % de azcares fermentados (tabla 2),hay una tendencia a la excrecin de amino-cidos, sobre todo en la muestra D47. En lamuestra K1M, se consumen la mayora deestos compuestos; esta cepa, en un mediosinttico, present una demanda de nitrgenomuy superior a la de la cepa D47 (datos nopublicados), lo que podra explicar la diferen-cia entre ambas muestras. En la ltima fasefermentativa (75-100 % de azcares fermen-

tados) (tabla 2) se produce excrecin deaminocidos al medio como consecuencia dela accin txica del etanol.4 Dicha excrecinfue muy superior en las muestras sembradascon las levaduras D47 y K1M; en estasmuestras, al efecto txico del etanol sobre la

Tabla 1 Concentracin de aminocidos (Aa) en el mosto y su utilizacin en la primera mitadde fermentacin por distintas cepas

Mosto inicial 0-25 % de azcares consumidos 25-50 % de azcares consumidos

Aa (mg/L) Control D47 K1M Control D47 K1M

His 33 2 26 2 26 2 24 2 -3 1 4,8 0,4

Arg 384 6 376 6 349 6 381 6 5 3 25 1

Thr 15 3 13 3 13 3 14 3 1,3 0,1 1,0 0,1 -0,3 0,2

Ala 56 3 53 3 52 3 48 3 0,9 0,8 -4 2 5,6 0,3

Asp 17 3 14 3 13 3 15 3 2 1 1,8 0,1

Glu 64 2 57 3 54 2 48 2 4 3 2,7 0,4 8,0 0,2

-: excrecin; : no presenta consumo ni excrecin. Los resultados se presentan con su desviacin estndar


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Tabla 2 Utilizacin de aminocidos (Aa) en la segunda mitad de fermentacin por distintas cepas

50-75 % de azcares consumidos 75-100 % de azcares consumidos

Aa (mg/L) Control D47 K1M Control D47 K1M

His 3 2 7 1 3,5 0,4 2,1 0,6 -3,2 0,4 -3,0 0,3

Arg 1,6 0,2 -9,6 0,6 -11 1

Thr -0,7 0,2 -1,3 0,1 -1,0 0,4 -0,70,3 -2,1 0,4 -3,0 0,6

Ala -2 1 -5 1 -11 1 -10 1

Asp -1,8 0,1 1,1 0,2 0,5 0,3 -2,5 0,1 -3,7 0,4Glu -9 1 -18 1 1,4 0,2 5,4 0,9 3,2 0,6 -8,4 0,3

-: excrecin; : no presenta consumo ni excrecin. Los resultados se presentan con su desviacin estndar

membrana de las clulas habra que sumarla liberacin de aminocidos de levadurassensibles daadas por la toxina killer. Portodo ello, se puede concluir que los vinos ob-tenidos a partir de muestras donde las leva-duras killer se sembraron y predominaron,presentaron menor estabilidad microbiol-gica.

Bibliografa1. De la Pea P., Barros F., Gascn S., Lazo P.S., Ra-

mos S.: J Biol Chem1981; 256: 10420-10425.2. Lavalle F., Salvas Y., Lamy S., Thomas D.Y., Degr

R., Dulau L.: Am J Enol Vitic1994; 45: 86-91.3. Cohen S.A., Meys M., Tarvin T.L.: The Pico-Tag

Method. A manual of advanced tecniques for amino

acid analysis, Millipore Corp, Bedford, 1989.4. Ingram L.O., Dombek K.M., Osman Y.A.: Trends

Biotechnol1986; 4: 40-44.


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n la elaboracin del cava tienen lugardos fermentaciones alcohlicas sucesi-vas y el envejecimiento del vino en la

Seleccin de cepas de levadura para realizarla segunda fermentacin en la elaboracinde vinos de cava

A. Martnez-Rodrguez y A.V. Carrascosa

Instituto de Fermentaciones Industriales, CSIC, Madrid ([email protected])

Ebotella con las levaduras. Las condiciones en

las que se desarrolla la segunda fermenta-cin determinan las caractersticas que de-ben reunir las levaduras que hay que utilizarpara obtener un producto de ptima calidad.

En este trabajo se sugiere una metodolo-ga que consideramos adecuada para selec-cionar cepas de levadura que lleven a cabocon xito la segunda fermentacin y el enve-

jecimiento en botellas, uti lizando criteriosenolgicos especficos que deben cumplir las

levaduras que participan en la segunda fer-mentacin e incorporando al sistema de se-leccin la capacidad de autlisis de las leva-duras en un sistema modelo.

El primer criterio de seleccin es el estudiodel poder fermentativo en un medio sintticoque presenta una composicin similar al vinobase de la segunda fermentacin (25 g/L desacarosa en un medio de 10o alcohlicos, apH 3 e incubado a 16 oC).

El grupo de cepas que cumple este primerrequisito se somete a las siguientes pruebasde seleccin: produccin de acidez voltil, re-sistencia al SO2, formacin de SH2, capaci-dad floculante y capacidad autoltica medida

por la liberacin al medio de aminocidos yprotenas despus de 24 horas de incubacinen un sistema modelo. El anlisis conjunto delos resultados obtenidos permite hacer una

segunda seleccin de las cepas que mejor seadaptan a los criterios de esta vinificacin.Para confirmar la identidad de las cepas

se lleva a cabo un estudio de los patrones dedigestin del DNA mitocondrial frente a ungrupo de enzimas de restriccin diferentes(Nucleic Acids Res1990;18:1657).

Esta sistemtica la hemos seguido en ellaboratorio para seleccionar una cepa ade-cuada para realizar la segunda fermentacin

de vinos de cava. Se parti de 35 cepas dela coleccin del Instituto de FermentacionesIndustriales que a prioripoda suponerse queeran adecuadas para este fin. En la primeraseleccin quedaron 13 cepas. stas se so-metieron al segundo grupo de criterios de se-leccin superndolo cuatro cepas. El patrndel DNA mitocondrial nos indic que dos deellas eran la misma cepa por lo que quedarontres, con las que se han realizado vinificacio-

nes en bodega para llevar a cabo un estudioms profundo de los cambios que se produ-cen en la segunda fermentacin y de la libe-racin de compuestos que tiene lugar duran-te la autlisis de las levaduras.


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Aplicacin de la SPE a la extraccin de OTA

D. Jornet, O. Busto y J. Guasch

a presencia de ocratoxina A en los vinosha suscitado un inters creciente en losltimos aos debido a sus propiedades

Departamento de Qumica Analtica y Qumica Orgnica, Unidad de Enologa (CeRTA), Facultad de Enologa deTarragona, Universitat Rovira i Virgili, Tarragona ([email protected])Este trabajo ha sido financiado por la Comisin Interministerial de Ciencia y Tecnologa (CICYT, proyecto ALI97-0765)

toxicolgicas y carcingenas. Hasta este mo-

mento, solamente se ha detectado en con-centraciones inferiores a 5 ug/L, lmite mxi-mo admitido para los cereales y sus deriva-dos, de acuerdo con el Codex Alimentarius.

La tcnica analtica ms empleada para sudeterminacin es la RP-HPLC, aunque elmtodo oficial propuesto por la AOAC estbasado en la cromatografa en capa fina. Enestudios recientes, se ha propuesto un mto-do en el cual la OTA se extrae del vino me-

diante tolueno y, tras un tratamiento de cleanup relativamente complejo, se cuantifica porHPLC. El mtodo ha sido reconocido por laOIV como un mtodo satisfactorio bajo unpunto de vista analtico, aunque implica lanecesidad de seguir unas condiciones estric-tamente controladas.

En el estudio realizado se utiliza un mto-do de HPLC precedido de una SPE que hapermitido el clean up y la concentracin de

las muestras, pudiendo determinarse concen-traciones de OTA en vino a niveles de con-centracin inferiores a 5 ug/L. La deteccin seha realizado fluorimtricamente ( exc=330 nm,

em =470 nm).Las muestras de vinos blancos, rosados ytintos han sido extradas directamente con uncartucho de octadecilsilano y concentradas,en una segunda etapa, bajo corriente de ni-trgeno. En estas condiciones, la OTA, quese aade a los vinos a una dosis de concen-tracin de 3 ug/L, se concentra un mnimo de100 veces.

Se ha optimizado el mtodo de trabajo

probando diferentes matrices y volmenes demuestra. Se ha comprobado la linealidad dela respuesta en el intervalo de concentracinhabitual en los vinos y las recuperacioneshan sido superiores al 80 % para todos losvinos analizados. El lmite de deteccin hasido de 50 ug/L (S/N = 3).

El mtodo optimizado es suficientementerpido y su reproducibilidad aceptable al nivelde concentracin estudiado.


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La fermentacin malolctica es un proce-so bacteriano deseable y determinanteen la definicin de las caractersticas

rea de Tecnologa de los Alimentos, Facultad de Ciencias Qumicas, Universidad de Castilla-La Mancha,Ciudad Real

Cambios en la composicin de los vinos cencibeldebidos a la fermentacin malolctica

M.C. Daz-Maroto Hidalgo, E. Garca Romero, I. Hermosn Gutirrezy M.D. Cabezudo Ibez

sensoriales de los vinos, sobre todo de los

tintos. Por ello es importante su conocimientoy control.Han sido estudiados 13 vinos tintos de la

variedad cencibel, obtenidos en la planta pilo-to de la Universidad de Castilla-La Mancha(Ciudad Real). Terminada la fermentacin al-cohlica, a seis de ellos se les adicion bac-terias lcticas comerciales liofilizadas (Viniflo-ra OENOS, Leuconostoc oenosDSM 7008),dejando los restantes como muestras de con-

trol. Adems de las determinaciones conven-cionales, se han analizado los compuestosvoltiles mayoritarios y minoritarios por cro-matografa de gases (CG), y los cidos org-nicos fijos y los antocianos por HPLC.

Las concentraciones del cido lctico, elcido mlico y el lactato de etilo han sufrido

los cambios esperados. Adems, los cidosctrico y fumrico han sido metabolizados porlas bacterias lcticas utilizadas.

La concentracin de acetaldehdo disminu-

ye de forma drstica, pues interviene en laruta metablica de las bacterias lcticas hete-rofermentativas, como es el caso de Leuco-nostoc oenos. Tambin disminuye la concen-tracin del piruvato de etilo, debido probable-mente a las esterasas extracelulares que pro-ducen Leuconostoc oenos; adems, el piru-vato formado puede entrar en distintas rutasmetablicas citadas anteriormente, y favore-cer de esta forma la reaccin.

Por ltimo, se observa un aumento de losantocianos presentes en el vino, sobre todode los derivados no acilados, cifrndose des-de un 40 % para el 3-monoglucsido de mal-vidol, hasta un 128 % para el 3-monoglucsi-do de peonidol.


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Lgenes diversos de los cidos grasos (proce-dentes de la uva o fermentativos), el perfil delos mostos difiere del de los vinos, tanto porsu naturaleza como por sus concentraciones.

As, los steres de etilo son siempre minorita-rios respecto a la cantidad de cidos grasoslibres. La fraccin esterificada en los mostoses prcticamente inexistente y, en cambio, enlos vinos puede representar hasta un 30 %del total. Por otra parte, en los mostos el96 % (~ 7 ppm) de los cidos grasos son decadena larga ( de 16 a 18 tomos de carbo-no), mientras que en los vinos el 95 % (~ 18ppm) son de cadena corta (de 6, 8 y 10 to-

mos de carbono). En el caso de los vinos, seha observado tambin que la distribucin por-centual de los cidos grasos de diferente lon-gitud de la cadena carbonada es la mismapara la fraccin libre y la esterificada. Asimis-mo, estos primeros datos de cidos grasosde vinos base monovarietales apuntan la po-sibilidad de caracterizaciones varietales.

cidos grasos libres y esterificadosen mostos y vinos base parala elaboracin de cava

S. Francioli, M. Gallart, E. Lpez-Tamames y S. Buxaderas

os cidos grasos se encuentran enmostos y vinos tanto en forma libre co-mo esterificada, mayoritariamente como

steres de etilo. Ambas formas se han deter-

minado utilizando un nico mtodo de croma-tografa de gases (CG) y, en consecuencia,en el mismo cromatograma. Adems se hansolventado los problemas habituales de estetipo de determinaciones (volatilidad variable,concentraciones dispares, interferencias deotros componentes, etc.).

El mtodo se ha aplicado para el estudiode la evolucin de cidos grasos y sus ste-res durante la vinificacin de cuatro varieda-

des de uva blanca (macabeo, xarello, pare-llada y chardonnay) empleadas en la elabora-cin del cava. Para ello, durante tres vendi-mias consecutivas se han tomado muestrasen cuatro puntos del proceso de obtencin, aescala industrial, de los vinos base mono-varietales.

Se ha comprobado que, debido a los or-

Departamento de Nutricin y Bromatologa (CeRTA), Universidad de Barcelona, Barcelona


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Influencia del etanol y del cido decanoico sobrela actividad H+-ATPasa y la incorporacinde aminocidos por Saccharomyces cerevisiae

J. Fuguet, F. Fort, N. Ferrer, Ll. Arola y F. Zamora

Departamento de Bioqumica y Biotecnologa (CeRTA), Facultad de Enologa de Tarragona, Universidad Rovira iVirgili, Tarragona ([email protected])Este trabajo ha sido financiado por la CICYT (proyectos ALI-95-0887-C04-01 y ALI 98-0534)

as paradas de fermentacin alcohlicaantes del completo consumo de los az-cares fermentables son uno de los prin-

cipales problemas de la enologa actual. Es-tas paradas de fermentacin comportan un

alto de riesgo de desarrollo de bacterias lc-ticas heterofermentativas que pueden meta-bolizar las hexosas presentes en el medio eincrementar drsticamente la acidez voltildel vino.

La bibliografa existente sobre las paradasde fermentacin seala que las altas concen-traciones de etanol y la presencia de cidosgrasos de cadena corta liberados por las pro-pias levaduras, podran ser sus principalescausas.

El principal objetivo de este trabajo fue elde estudiar la influencia del etanol y del cidodecanoico sobre algunos de los sistemas detransporte de nutrientes (actividad H+-ATPasay captacin de aminocidos) a travs de lamembrana plasmtica de Saccharomycescerevisiae.

La determinacin de la actividad H+-

ATPasa y de la velocidad de incorporacin deaminocidos fueron realizada en levaduras(Levuline CHP; GLO) durante la fase tumul-tuosa de la fermentacin (tercer da).

Para la determinacin de la actividad H+-ATPasa, las levaduras eran tratadas con liti-casa con el propsito de obtener esferoblas-

tos, los cuales eran sometidos posteriormen-te a un choque osmtico. Tras la purificacinde las membrana se determin la actividadH+-ATPasa mediante la medida de la veloci-dad de hidrlisis del ATP y del flujo de proto-

nes a travs de la membrana plasmtica.La determinacin de la incorporacin de

aminocidos fue realizada mediante la utiliza-cin de un anlogo estructural de los amino-cidos no metabolizable, el cido 2-aminoiso-butrico (2-AIB) marcado con carbono-14, elcual es transportado al interior de la clulamediante la permeasa general de aminoci-dos.

Los resultados obtenidos muestran que eletanol provoca una fuerte inhibicin de la ac-tividad H+-ATPasa y del flujo de protones atravs de la membrana, mientras que el ci-do decanoico produce un incremente de suactividad.

La disminucin de la actividad H+-ATPasaprovocada por la presencia de etanol indicaque, a medida que transcurre la fermentacinalcohlica, las levaduras presentarn mayo-

res dificultades para mantener el pH intrace-lular y, por tanto, todos los sistemas de trans-porte activo (symport con protones) estarnseriamente comprometidos. El incremento dela actividad H+-ATPasa inducido por la pre-sencia de cido decanoico podra estar rela-cionada con la necesidad de mantener el pH


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intracelular en condiciones que inducen suacidificacin.

Por otra parte, tanto la presencia de etanolcomo de cido decanoico provocaron unaclara inhibicin de la incorporacin de 2-AIB,lo que indicara que el transporte de losaminocidos, necesarios para la multiplica-

cin celular, estara seriamente afectado porestas condiciones. Todo ello indicara querealmente las altas concentraciones de etanoly la presencia de cidos grasos de cadenacorta pueden realmente condicionar el co-rrecto desarrollo de la fermentacin alcohli-ca .


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Ecombinacin, se evalu en funcin de la velo-cidad de acetificacin y el rendimiento. Serealizaron arbitrariamente 14 experimentos yse calcularon la velocidad de acetificacin y elrendimiento. Se propuso una ecuacin de re-gresin lineal mltiple que se resuelve con el

programa estadstico CSS-Statistica.

Optimizacin de un fermentador de laboratoriopara la elaboracin de vinagre de vino

W. Tesfaye, M.L. Morales-Gmez, M.C. Garca-Parrilla y A.M. Troncoso

Departamento de Nutricin y Bromatologa, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla, Sevilla([email protected])

l objetivo del presente trabajo consisteen aumentar el rendimiento y la veloci-dad de acetificacin para obtener vina-

gres de vino con alto grado actico en menortiempo. Para ello, se estudian las variablesque intervienen en el proceso: concentracin

inicial de etanol, velocidad de agitacin, volu-men de carga, proporcin decarga, velocidad de carga,temperatura y suministro deaire.

El estudio se realiz conun fermentador a escala delaboratorio de B. Braun Bio-tech S.A. con un volumen de5 L de capacidad provisto de control de tem-

peratura, pH, presin parcial de oxgeno y ve-locidad de agitacin.

Durante el proceso de acetificacin semantuvieron constantes los siguientes par-metros: a) concentracin inicial de etanol, quese fij a 10o en los casos en que los sustratosvnicos presentaran un grado alcohlico supe-rior diluyendo con agua destilada; b) el sumi-nistro de aire se mantuvo entre 100-200 L/h(0,33-0,98 vvm), y c) la temperatura se regu-

l a 30 oC.Se han seleccionado tres variables: veloci-

dad de agitacin, volumen de carga y propor-cin de carga observndose como afectan alproceso de acetificacin. Para ello se aplicel diseo factorial a dos niveles (tabla 1). Elefecto de cada variable, as como la posible

Resultados

Del diseo experimental a dos niveles paratres variables se obtuvieron los siguientes re-sultados: la variable crtica para obtener unmejor rendimiento es la proporcin de carga,y para conseguir una buena velocidad deacetificacin la agitacin ha demostrado serla variable ms importante.

BibliografaCSS-Statistica: Complete Statistical System Statsoft,

Inc.Tulsa OK 74104, 1991.Gonzlez A.G.: Two level factorial experimental

designs based on multiple linear regression models:a tutorial digest illustrated by case studies, AnalChim Acta1998; 360: 227-241.

Nieto J.: Algunos aspectos de la tecnologa de la fer-mentacin actica. El vinagre de vino, Llaguo C.,Polo M.C. (eds.), Consejo Superior de Investigacio-nes cientficas, Madrid, 1991: 69-103.

Tabla 1 Representacin de las tres variables a dos niveles

Factores Niveles

Sin codificar Codif. Sin codificar Codif.

Agitacin (x1) 250 rpm -1 450 rpm +1

Volumen de carga (x2) 3400 mL -1 5000 mL +1

Proporcin de carga (x3) 1:1 vino/vinagre -1 2:1 vino/vinagre +1


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Sla variedad garnacha negra, correspondiente

a la vendimia de 1998, en la finca experimen-tal Mas dels Frares, en Constant, de la Fa-cultad de Enologa de Tarragona. Con ello sepretenda, adems de la puesta a punto delos mtodos identificativos con DNA, verificarpor un lado cules eran las bacterias lcticasresponsables de la fermentacin malolcticaen esta vinificacin y, por otro, cul era la po-sible proliferacin de bacterias acticas enestas condiciones, as como la identificacin

de las mismas.La fermentacin alcohlica se llev a cabo

en paralelo en dos depsitos de vinificacin ysin control de temperatura, uno de forma es-pontnea y otro inoculado con Saccharo-myces cerevisiae(L1118). A continuacin, sinadicin de sulfuroso, se dej que se llevara acabo la fermentacin malolctica espont-neamente, siendo el contenido inicial en L-mlico de 2 g/L. Durante el transcurso de di-

cha fermentacin (10-20 das) se tomaronmuestras para cuantificar y aislar los dos ti-pos de bacterias, lcticas en placas de MRS(suplementado con mlico y zumo de toma-te), y acticas en placas con medio de Drys-dale y Fleet (1985) modificado. Para cadauno de los dos tipos de bacterias y de cada

Unidad de Enologa, Centro de Referencia de Tecnologa de Alimentos,Departamento de Bioqumica y Biotecnologa, Universidad Rovira i Virgili, Tarragona

Seguimiento e identificacin de bacterias lcticasy acticas mediante mtodos moleculares

C. Reguant, A. Ruiz, M. Poblet, N. Rozs, V. Garcia, M. Constant,J.M. Guillamn, A. Bordons y A. Mas

e han aislado e identificado cepas debacterias lcticas y acticas despus deuna fermentacin alcohlica en tinto de

muestra, se tomaron unas 20 colonias aisla-das para ser identificadas.

Las bacterias lcticas han sido identifica-das mediante extraccin de su DNA genmi-

co, seguida de amplificacin con PCR me-diante dos cebadores (oligonucletidos de 24bases) complementarios de regiones espec-ficas del gen del enzima malolctico de Oe-nococcus oeni, obtenindose en la electrofo-resis una banda de amplificado caractersticode esta especie. Se ha observado un creci-miento ostensible de la poblacin de lcticas(hasta 108 por mL) solamente en el vino quehaba sido previamente inoculado con leva-

dura. Se ha comprobado que la gran mayorade aislamientos de bacterias lcticas de estasfermentaciones eran Oenococcus oeni. Paracomprobar si la fermentacin malolctica fuellevada a cabo por una sola cepa o por va-rias, se est procediendo en la actualidad a laidentificacin a nivel de cepas, mediante am-plificacin con PCR de regiones inespecficas(RAPD) con diversos cebadores aleatorios de10 nucletidos.

Las bacterias acticas han sido identifica-das tambin a nivel de especie, de entre losdiversos Acetobacter, Gluconoacetobacter yGluconobacter, mediante extraccin de suDNA genmico, seguida de amplificacin conPCR mediante cebadores complementariosde regiones especficas del fragmento 16S


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del rDNA, con tratamiento posterior conenzimas de restriccin. Con ello se han obte-nido unos perfiles RFLP de amplificados, ca-ractersticos de las diferentes especies debacterias acticas. Se ha observado que lapoblacin de acticas aumenta considerable-mente durante la fermentacin malolctica

para caer al final de sta. Al principio de la

misma la poblacin de acticas tiene espe-cies representantes de los tres gneros. Encambio, durante la fermentacin malolctica yal final de sta, la especie mayoritaria y casinica ha sido Acetobacter aceti, con coloniasespordicas de Acetobacter pasteurianusyGluconobacter oxydans.


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Efecto de la proteasa de Oenococcusoenisobrelas protenas de vinos blancos y tintos

M.C. Manca de Nadra,* V. Moreno-Arribas,** E. Pueyo,**M.E. Faras* y M.C. Polo**

deficiente en compuestos nitrogenados. Laactuacin de estos enzimas puede aportar alvino los aminocidos necesarios para el cre-cimiento de las bacterias lcticas.

El objetivo del trabajo es conocer el efecto

de la actividad protesica de la cepa Oenoco-cccus oeniX2L sobre las protenas de vinosblancos y tintos. Los ensayos se han realiza-do con los sobrenadantes de un cultivo librede clulas como solucin del enzima, y lasprotenas obtenidas por dilisis y posteriorliofilizacin de los vinos, como sustratos. Sehan realizado ensayos comparativos antes ydespus de la accin de la proteasa compro-bndose la liberacin de aminocidos y depptidos por HPLC. Adems, se ha realizadola identificacin parcial de algunos de lospptidos liberados, mediante el anlisis es-pectral. Los primeros resultados de este estu-dio ya han sido publicados (Manca de Nadraet al., 1997 y 1999).

BibliografaCorrea-Gorospe et al.: Food Chem1991; 41: 135-146.Manca de Nadra et al.: FEMS Microbiol. Letters1997;

150: 135-139 .Manca de Nadra et al.: FEMS Microbiol Letters 1999

(en prensa).Rolln et al.: World J Microbiol Biotechnol 1993; 9:

587-589.Rolln et al.: World J Microbiol Biotechnol 1995; 11:

153-155.Waters et al.:J Agric Food Chem1996; 44: 3-5.

* Facultad de Bioqumica, Qumica y Farmacia, Universidad Nacional de Tucumn y Centro de Referencias paraLactobacilos (CERELA), Tucumn, Argentina**Instituto de Fermentaciones Industriales, CSIC, Madrid

as protenas del vino proceden en sumayora de la uva. Se eliminan en partede una forma espontnea durante la ela-

boracin por insolubilizarse a medida queavanza la fermentacin y aumenta el grado

alcohlico y por formar complejos con loscompuestos fenlicos, especialmente en elcaso de los vinos tintos. Aunque estn nor-malmente en el vino en concentraciones muypequeas, generalmente del orden de variosmg/L, pueden ocasionar turbidez en los vi-nos. Tambin se ha descrito que forman par-te de los inhibidores de la precipitacin tartri-ca (Correa-Gorospe et al., 1991) dificultandola eliminacin del bitartrato potsico del vino,por lo que es necesario eliminarlas. Lasenzimas que existen en el mercado no ac-tan sobre estas protenas, sin que conozca-mos totalmente las causas. Waters et al.(1996) atribuyen la causa de dicha resistenciaal hecho de ser protenas de resistencia apatgenos de la planta, con secuencias ho-mlogas a taumatina y quitinasa.

Rolln et al. (1993 y 1995) han aislado ce-

pas de Leuconostoc oenos (Oenococcusoen) que producen dos proteasas extracelu-lares. Esta actividad tiene un gran inters envinificacin no slo por el hecho antes men-cionado, sino porque la fermentacin malo-lctica se produce generalmente despus dela fermentacin alcohlica, cuando el vino es


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La fermentacin alcohlica espontneadel mosto de uva es un proceso llevadoa cabo por la accin de levaduras perte-

Centro de Investigacin y Desarrollo Agrario de La Rioja (CIDA)* Universidad de La Rioja, Logroo

Ecologa de la fermentacin alcohlica espontneadurante varios aos consecutivos.Influencia en la cintica fermentativa

P. Santamara, A.R. Gutirrez A.R.,* Epifanio, R. Lpez y P. Garijo

necientes a diferentes gneros y especies.

Las levaduras de bajo poder fermentativocrecen durante las etapas iniciales de las fer-mentaciones; cuando la concentracin deetanol se incrementa, las levaduras ms tole-rantes a este compuesto pertenecientes algenero Saccharomycescompletan la fermen-tacin. Dentro del gnero Saccharomycesexiste una gran diversidad gentica. Para es-tudiar esta diversidad se han utilizado diver-sas tcnicas de biologa molecular.

En los ltimos aos se han llevado a cabogran cantidad de trabajos encaminados a es-tudiar si la fermentacin alcohlica espont-nea se lleva a cabo por un nmero alto o bajode clones distintos de Saccharomyces y siestos clones se mantienen en el ecosistemade la bodega de un ao a otro.

En el presente trabajo se ha estudiado laecologa de la fermentacin alcohlica espon-tnea en la bodega experimental del CIDAdurante cinco aos consecutivos (vendimias1994-1998). Para ello se han tomado mues-tras de 42 depsitos de elaboracin de vinosblancos. Los aislamientos de levaduras serealizaron en tres etapas: mosto, fermenta-cin tumultuosa y fin de fermentacin. Laidentificacin de los aislados se realiz utili-

zando el anlisis de restriccin del DNAmitocondrial.

El anlisis de restriccin del DNA mitocon-drial de los aislados procedentes de los mos-

tos mostr la ausencia de levaduras pertene-cientes al gnero Saccharomyces en estaetapa. Por el contrario, todas las colonias delas etapas fermentativas pertenecan a estegnero, salvo algunos aislados obtenidos en1997.

Los patrones de restriccin del DNA mito-condrial de los 840 aislados estudiados reve-laron 73 perfiles diferentes, que correspondena diferentes cepas de Saccharomyces cerevi-

siae. El nmero de cepas diferentes detecta-das para cada ao y su frecuencia de apari-cin varan en funcin de la campaa estu-diada.

Al comparar los patrones obtenidos en loscinco aos se observ que algunos de ellosestaban presentes en aos consecutivos, pe-ro su presencia vara notablemente de unao a otro. Estos resultados nos llevan a pen-sar sobre la existencia de un conjunto declones propios del ecosistema de cada bode-ga, cuya participacin en la fermentacin vie-ne determinada por su capacidad de adapta-cin a las condiciones en que se llevan acabo las vinificaciones (caractersticas delmosto en cada campaa, tecnologa emplea-da en las elaboraciones, etc.).


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En los cinco aos del estudio, cuatro tuvie-ron fermentaciones normales; la excepcinfue la campaa de 1997. Este ao fue proble-mtico en varias regiones vitivincolas espa-olas, donde se detectaron numerosas para-das de fermentacin. En todos los depsitossometidos a muestra este ao los vinos que-

daron dulces y con una acidez voltil muyelevada. Esta inusual situacin tambin sereflej en los datos microbiolgicos obteni-

dos; la poblacin de bacterias acticas en elmosto de partida fue muy superior al resto delos aos y adems levaduras no Saccharo-myces fueron las cepas dominantes durantela fermentacin tumultuosa con una presen-cia del 50 %.As, en este caso concreto, eldesequilibrio en la poblacin microbiolgica

inicial y la falta de cepas del genero Saccha-romycesexplicaran las disfunciones detecta-das en estas fermentaciones.


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L

Aislamiento e identificacin por mtodosmoleculares de la poblacin levaduriformepresente en mostos

B. Esteve-Zarzoso, *

,

** F. Uruburu* y A. Querol**

* Coleccin Espaola de Cultivos Tipo, Edificio de Investigacin Jeroni Muoz, Universidad de Valencia, Burjassot,Valencia** Instituto de Agroqumica y Tecnologa de Alimentos, CSIC, Burjassot, Valencia ([email protected])

a transformacin del mosto de uva envino es el resultado de la accin sucesi-va de diferentes especies de microorga-

nismos, en la que las levaduras juegan un

papel primordial, predominando al final de lafermentacin cepas de la especie Saccharo-mycescerevisiae. Durante los primeros esta-dios de la fermentacin se aslan otras espe-cies de levaduras que pueden aportar carac-tersticas organolpticas deseables a los vi-nos, estas especies que nosotros denomina-mos no Saccharomyces, se aslan principal-mente de fermentaciones espontneas, sien-do difcilmente aisladas de fermentaciones

inoculadas.Los mtodos de identificacin basados en

la asimilacin y fermentacin de distintoscompuestos carbonados y nitrogenados per-miten actualmente una identificacin lenta delas especies de levaduras, adems de dar unresultado no muy fiable. Sin embargo, la me-todologa descrita por Esteve-Zarzoso et al.(1999) para identificar especies de levaduraspermite una rpida y fiable identificacin de

las mismas. Esta tcnica consiste en la am-plificacin por PCR y restriccin de la reginribosomal ITS-5,8S. Utilizando esta metodolo-ga se han podido identificar la mayor parte

de las 2591 colonias de levaduras que se ais-laron durante la vendimia de 1997 en las bo-degas Gonzalez-Byass de Jerez de la Fron-tera (Cdiz). Los aislamientos se realizaron

tanto de fermentaciones espontneas comoinoculadas, y en dos medios de cultivo dife-rentes. Uno de los medios utilizados es elagar lisina, descrito para aislar especies delevaduras no Saccharomyces, y el otro mediode aislamiento fue agar YPD, como mediogeneral de aislamiento de levaduras.

De esta forma se pudo observar la presen-cia de una gran variedad de especies de le-vaduras durante las primeras fases de la fer-

mentacin, como especies pertenecientes alos gneros Candida, Hanseniaspora, Issat-chenkia, Zygosaccharomyces, entre otros.Dichas especies fueron reemplazadas por ce-pas de la especie Saccharomycescerevisiaeen el transcurso de la fermentacin, dominan-do al final de la misma. Cabe destacar quemediante esta tecnologa se han aislado eidentificado cepas de levaduras de las espe-cies Candidaalbicans, C. sorbosa, Kluyvero-

mycespolysporus, Yarrowialipolyticay Zygo-ascushellenicusque nunca se haba descritosu aislamiento de este ambiente.


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Sistemas moleculares de identificaciny tipificacin de Lactobacillusheterofermentativospresentes en el vino

G. Lluesma, A. Rodas, I. Pardo y S. Ferrer

bodegas de las denominaciones de origenUtiel-Requena y Jumilla. De ellas, 91 pertene-can a especies heterofermentativas obliga-das, de las cuales se identificaron 43 como

Lactobacillus hilgardii, 12 como Lactobacillusbuchneriy 36 como Lactobacillus brevis, si-guiendo los criterios del libro The Prokaryotes(vol. II, 2 ed.).

Tras poner a punto la tcnica de extraccinde DNA en discos de agarosa, se llev acabo el anlisis de estas cepas medianteRFLP-PFGE con el enzima SfiI, y el anlisisde bandas generadas por RAPDS utilizandopara ello el cebador 17R. Los resultados ob-

tenidos muestran en general una buena co-rrelacin con la identificacin fenotpica de lastres especies. Sin embargo, se ha observadocon ambas tcnicas que las cepas identifica-das fenotpicamente como L. brevismuestrantres grupos diferentes de patrones de macro-rrestriccin y RAPDS. En algn caso estosperfiles son muy parecidos a los que presen-tan cepas identificadas como L. hilgardii. Estomuestra que existe cierta confusin entre

ambas especies, por lo que es necesario pro-fundizar mediante otras tcnicas molecularespara la correcta separacin de ambas.

Departamento de Microbiologa, Facultad de Biologa, Universidad de Valencia, Burssajot, Valencia([email protected])Este trabajo ha sido financiado por la CIYT (proyecto ALI97-1077-C02-01)

actobacillus es uno de los gneros debacterias lcticas que pueden desarro-llarse durante el proceso de elaboracin

del vino. Dentro de dicho gnero existen es-

pecies homofermentativas, heterofermenta-tivas facultativas y heterofermentativas obli-gadas. En algunos casos, Lactobacilluspue-de alterar las caractersticas organolpticasde los vinos, de ah la importancia de detec-tar la presencia de estas bacterias de una for-ma rpida y fiable con la finalidad de tomarmedidas para evitar sus efectos perjudiciales.

Los objetivos de este trabajo son: 1) desa-rrollar sistemas moleculares de identificacin

y tipificacin de las especies de Lactobacilluspresentes en el vino; 2) comparar estas tc-nicas y seleccionar la ms adecuada para ta-les fines; 3) utilizar estas tcnicas para llevara cabo el seguimiento de poblaciones natura-les en vinificaciones. Las tcnicas inicialmen-te elegidas para cumplir estos objetivos hansido RAPDS, anlisis de fragmentos demacrorrestriccin mediante electroforesis encampo pulsante (RFLP-PFGE) y desarrollo

de cebadores especficos.Durante la vendimia de 1997-1998 se ais-

laron 181 cepas de Lactobacillusa partir devinos y mostos procedentes de diferentes


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Ptadas de mostos y vino durante la vendimia1997-1998. Las muestras fueron tomadas endistintas bodegas de las denominaciones deorigen Utiel-Requena y Jumilla. Dichas cepasse identificaron segn los criterios expuestos

en el Bergeys Manual of Determinative Bac-teriology(9 ed.) y el Bergeys Manual of Sys-tematic Bacteriology(9 ed.), utilizando comocontroles las cepas tipo de las siguientes es-pecies de Pediococcuspreviamente descritasen el vino: P. acidilactici(CECT 98), P. parvu-lus (CECT 813), P. damnosus(DSM 20331),P. inopinatus(DSM 20285)y P. pentosaceus(CECT 923).

El resultado de la identificacin fenotpica anivel de especie de los 114 Pediococcusmostr que tres cepas presentaban el perfilfenotpico de P. pentosaceus y 111 cepaspresentaban el perfil fenotpico de P. par-vulus.

Para llevar a cabo la identificacin y tipi-ficacin molecular se puso a punto la extrac-cin de DNA en bloque de agarosa, consi-guiendo minimizar el tiempo de lisis celular y

obtener un elevado rendimiento de DNA degran pureza. Tras analizar varios oligonucle-tidos hemos seleccionado uno de ellos, deno-minado 16R, como ms adecuado para laidentificacin a nivel de especie. Se ha reali-zado tipificacin intraespecfica medianteRAPDS con el oligonucletido 17R y RFLP-

Departamento de Microbiologa, Facultad de Biologa, Universidad de Valencia, Burjasssot, Valencia([email protected])Este trabajo ha sido financiado por la CICYT (proyecto ALI97-1077-C02-01)

Sistemas moleculares de identificaciny tipificacin de Pediococcusdel vino

A. Rodas, G. Lluesma, I. Pardo y S. Ferrer

ediococcuses uno de los gneros debacterias lcticas que puede desarro-llarse durante la elaboracin del vino. El

gnero Pediococcusincluye diferentes espe-cies, pero en el vino fundamentalmente se

presentan Pediococcus parvulusy Pedioco-ccus pentosaceus.

La presencia de Pediococcus puede serpotencialmente peligrosa para la industriaenolgica al producir alteraciones en el sabor(produccin de elevadas cantidades dediacetilo) y en la viscosidad (produccin depolisacridos). Por lo tanto, es necesario dis-poner de tcnicas de identificacin rpida quepermitan detectar su presencia en vino con elfin de poner medidas para evitar sus efectosperjudiciales en el mismo.

Los objetivos de este trabajo son analizarla capacidad de distintas tcnicas molecula-res para identificar y tipificar las especies dePediococcuspresentes en el vino. Las tcni-cas seleccionadas son RAPDS, oligonucle-tidos especficos del rDNA 16S y macrorres-triccin mediante electroforesis de campo

pulsante (RFLP-PFGE). Una vez selecciona-das aquellas metodologas ms adecuadasse realizarn estudios ecolgicos sobre lapresencia y evolucin de los Pediococcusdu-rante la vinificacin.

En este trabajo se aislaron 114 cepas dePediococcusa partir de 32 muestras recolec-


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PFGE con los enzimas SfiI, NotI y SmaI.Debido a los tamaos de fragmentos genera-dos por dichos enzimas, se requiri la puestaa punto de las condiciones adecuadas deelectroforesis en campo pulsante. Tras elanlisis de estos fragmentos hemos observa-

do que el enzima SfiI es ms discriminativoque los otros dos enzimas.

En la actualidad estamos trabajando en eldiseo de cebadores especficos para la de-teccin directa de las especies presentes enel vino.


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Anlisis estadstico del efecto del desfangadosobre la cintica fermentativade mostos blancos

F. Varela, F. Caldern, M.C. Gonzlez, B. Colomo y J.A. Surez Lepe

gados a temperatura ambiente, no se obser-van diferencias, en relacin a la turbidez, delos mostos desfangados en fro y los obteni-dos mediante tratamientos dinmicos, aun-

que estos ltimos presentan la ventaja derealizarse en pocas horas frente a la 48 ne-cesarias para los desfangados estticos.

El desfangado reduce la poblacin de le-vaduras presente en los mostos, los trata-mientos enzimticos y dinmicos son los quemayor influencia ejercen sobre la poblacinde levaduras.

En relacin a las concentraciones de ci-dos grasos los resultados indican que las

burbas son ms ricas que los mostos; eldesfangado produce un descenso en la com-posicin de cidos grasos del mosto en todoslos tratamientos, el desfangado mediante flo-tacin es el que mayor prdida de cidosgrasos induce. El cido graso que se encuen-tra en mayor concentracin es el cido oleico,de los cidos grasos saturados el palmticoes el principal.

El tratamiento de desfangado provoca unaumento en la duracin de la fermentacin,las fermentaciones ms largas para los trata-mientos dinmicos, intermedias para losdesfangados en fro y cortas para el desfan-gado a temperatura ambiente.

En relacin al anlisis estadstico de com-ponentes principales se observan altas corre-

Departamento de Tecnologa de Alimentos, Escuela Tcnica Superior de Ingenieros Agrnomos,Universidad Politcnica de Madrid, Madrid ([email protected])

a elaboracin de vinos blancos de cali-dad ha de realizarse a partir de un mostolimpio, un mosto que haya sufrido el pro-

ceso de desfangado, tratamiento que consis-

te en provocar una clarificacin del mosto an-tes de la fermentacin, con el fin de eliminarlas partculas susceptibles de comunicar aro-mas desagradables al vino. El efecto favora-ble del desfangado es puesto en evidenciapor la superioridad organolptica de los vinosobtenidos a partir de mostos desfangados,principalmente en el carcter aromtico; ade-ms, los vinos obtenidos a partir de mostosdesfangados son ms estables, sobre todo

frente a fenmenos oxidativos.Frente a estos efectos positivos del des-

fangado, los mostos sometidos a este trata-miento sufren ciertos problemas relacionadoscon el proceso fermentativo, como son losarranques tardos, las ralentizaciones de lafermentacin o las paradas de sta. Estosproblemas se atribuyen al empobrecimientoqumico y microbiolgico causado por eldesfangado.

El trabajo que se presenta evala el efectode diez tcnicas de desfangado, estticas ydinmicas sobre la poblacin de levaduras, lacomposicin en cidos grasos y la cinticafermentativa de los mostos obtenidos.

Se observa cmo los mostos tratados me-diante fro son ms limpios que los desfan-


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laciones entre limpidez con poblacin de le-vaduras, turbidez con cidos grasos y pobla-cin de levaduras con cidos grasos. Se ob-serva cmo la duracin de la fermentacin esms larga cuando la clarificacin del mostoes ms efectiva, esto es, cuando la turbidezes ms baja.

Tambin se observa cmo los diferentesmostos aparecen agrupados en diferentes

clusterssegn el tratamiento de desfangadoa que ha sido sometido el mosto, as los tra-tamientos dinmicos forman un cluster, losenzimticos otro grupo, mientras que eldesfangado a temperatura ambiente se com-porta de forma intermedia entre el mosto nodesfangado y los mostos desfangados me-

diante fro.


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Participacin de los hongos filamentososen el gusto a corcho: biosntesis y degradacinde compuestos organoclorados in vitro

E. Navascus, F. Caldern, B. Colomo, J.A. Surez y C. Garca Vallejo*

Departamento de Tecnologa de Alimentos, Escuela Tcnica Superior de Ingenieros Agrnomos,Universidad Politcnica de Madrid, Madrid* Instituto Nacional de Investigaciones Agrarias, Madrid

que participan directamente en la produccinde la anomala sensorial, observando que to-das ellas lo hacen en mayor o menor medida.Existen diferencias cuantitativas en funcin

de la especie, siendo Penicillium purpuro-genum, especialmente activo. Se detectanigualmente diferencias intraespecficas, rela-cionadas con el grado de alteracin de los vi-nos y corchos de partida, as como de la si-tuacin del hongo en el cuerpo del tapn decorcho. En cualquier caso, las pautas de de-gradacin de clorofenoles y sntesis decloroanisoles a lo largo del tiempo son comu-nes para todas las especies. Por ltimo se

demuestra que la biosntesis de cloroanisolespor hongos filamentosos puede llevarse acabo a partir de otros sustratos clorados dis-tintos de los clorofenoles, como son ciertosdetergentes de uso comn en bodega yfitosanitarios (lindano) que presentan cloro ensu composicin. La formacin de cloroaniso-les se interpreta como la respuesta del hongofrente a un metabolito txico como el cloro. Elhecho de que la presencia de corcho en los

sistemas de cultivo potencie la biosntesis deorganoclorados parece deberse a la cesinde su estructura aromtica, en la que quedanenglobadas las molculas de cloro.

a alteracin sensorial de vinos conocidacomo gusto a corcho o gusto a ta-pn se debe a derivados organoclora-

dos de la familia de los cloroanisoles, particu-

larmente al 2,4,6 tricloroanisol (TCA) (Buseret al., 1982; Amon et al., 1989; Duncan,1995). Estos compuestos producen, en con-centraciones pequeas (del orden de ng/L),sensaciones olfativas muy marcadas, gene-ralmente englobadas dentro del trmino mo-hoso, terroso o relacionados (humedad, cue-va, pozo). El problema parece derivar de lapresencia de fenoles clorados, que son trans-formados en cloroanisoles mucho ms volti-

les y odorferos por ciertas especies de hon-gos filamentosos (Curtis et al. 1975; Tindaleet al, 1989).

En este estudio se indujo la biosntesis de2,4,6-tricloroanisol (TCA), 2,3,4,6 tetraclo-roanisol (TeCA) y pentacloroanisol (PCA) apartir de los clorofenoles 2,4,6-triclorofenol(TCF), 2,4,6 tetraclorofenol (TeCF) y pentaclo-rofenol (PCF) en sistemas modelo in vitroporespecies de Penicillium, Aspergillus, Clados-

porium, Trichoderma, Rhizopusy Monilia, ais-lados de vinos y tapones correspondientes,afectados por gusto a corcho. Se pretendila bsqueda de aquella especie o especies


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A

Vas metablicas de utilizacin de argininapor bacterias lcticas. Produccin de aminas

M.E. Arena y M.C. Manca de Nadra

Universidad Nacional de Tucumn y CERELA, Tucumn, Argentina ([email protected])

nen capacidad para degradar arginina. Sinembargo, otra cepa de Oenococcusoenitie-ne informacin para utilizar citrulina, dandocomo productos ornitina CO2 y NH3.

Como el sistema ADI es un camino queconduce a la sntesis de ATP, las bacteriasque lo poseen tienen ventajas para desarro-llar en medios nutricionalmente pobres. Estacapacidad es de especial importancia enmedio vino con microflora lctica mixta. Alcompartir el mismo nicho ecolgico se produ-cen interacciones y de las potencialidades decada uno de ellos depender la simbiosispositiva o negativa establecida.

Por la capacidad decarboxilante sobre losaminocidos arginina y ornitina, demostra-mos que arginina conduce a la sntesis deagmatina y ornitina a la de putrescina. Agma-tina puede ser enzimticamente convertidaen putrescina.

Lactobacillus plantarumN8 produce am-bas aminas bigenas a partir de ornitina. Lacepa N4 slo produce putrescina, pero enmayor cantidad. Lactobacillus hilgardiiprodu-

ce agmatina a partir de arginina y ornitina.Los resultados hasta el presente indican

que se debe conocer la actividad metablicade los microorganismos respecto a la utiliza-cin de arginina, en los ambientes naturalesen los cuales desarrollan, para predecir laposibilidad de sntesis de compuestos txicospara el hombre y actuar en consecuencia.

rginina es uno de los aminocidos quese encuentra en mayor proporcin envinos y jugos de frutas, y puede ser de-

gradado por bacterias lcticas. El conoci-

miento de las vas metablicas para su utili-zacin es de especial inters, principalmenteen lo referente a la produccin de aminas.Las bacterias lcticas juegan un papel funda-mental en la elaboracin de alimentos fer-mentados y las aminas bigenas pueden seragentes causales de intoxicaciones alimen-tarias.

En cepas de Lactobacillus plantarumaisla-das de jugo de naranja y en cepas de Oeno-

coccus oeni, Pediococcus pentosaceus yLactobacillus hilgardii, aisladas de vinos, in-vestigamos el o los caminos que utilizan paracatabolizar arginina: sistema arginina dihidro-lasa (ADI), sistema arginasa-ureasa y/o argi-nina descarboxilasa.

En ninguno de los microorganismos se de-tect el sistema arginasa-ureasa. Con respec-to al sistema ADI, dos cepas de Lb plantarum,N4 y N8, producen los metabolitos interme-

dios de este camino, citrulina y ornitina enconcentraciones dependientes de la cepa.

De los gneros de bacterias lcticas de in-ters enolgico, en Lactobacillus hilgardiiseevidenci la degradacin de arginina a CO2,NH3 yornitina, detectndose citrulina comocompuesto intermedio. Pediococcus pentosa-ceusy una cepa de Oenococcus oenino tie-


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D

Oenococcus oeni:

degradacin de protenas

M.E. Faras y M.C. Manca de Nadra

Universidad Nacional de Tucumn y CERELA, Tucumn, Argentina ([email protected])

ruro), inhibidor de serina proteasa, no afectaal enzima.

El enzima producido al final de la fase decrecimiento exponencial es inhibido por Ca2+

y estimulado por Mg2+

. La actividad proteolti-ca en clulas enteras se detecta solamenteen presencia de Ca2+, indicando que estecatin podra mantener unida la proteasa a laclula. El cido mlico, en un rango de con-centracin de 2 a 4 g/L estimula la sntesis delas proteasas y a concentraciones superioreslas inhibe. El cido ctrico (0,1 a 0,5 g/L), esti-mula la produccin de ambos enzimas.

Clulas no proliferantes de Oenococcus

oeni, en condiciones de estrs nutricional yenergtico, producen una proteasa extracelu-lar despus de 2 horas de incubacin a 30 oC.A su vez, SO2 (60 mg/L) + etanol (8 %) estimulansu produccin. Purificada a homogeneidad, elenzima nativo tiene un peso molecular aproxi-mado de 33,5 kDa. La protena est formadapor dos subunidades idnticas de 17 kDa.

Bibliografa

Rolln G.C, Faras M.E., Manca de Nadra M.C.: WorldJ Microbiol Biotechnol1993; 9: 587-589.Rolln G.C, Faras M.E., Manca de Nadra M.C.: World

J Microbiol Biotechnol1995; 11: 153-155.Faras M.E., Rolln G.C., Manca de Nadra M.C.: J Appl

Bacteriol1996; 81: 398-402.Rolln G.C., Faras M.E., Strasser de Saad A.M., Man-

ca de Nadra M.C.: J Appl Bacteriol 1998; 85: 219-223.

Faras M.E., Manca de Nadra M.C.: Microbiol Alim Nutr1998; 16: 101-105.

urante el proceso de vinificacin, losmicroorganismos que intervienen en ladesacidificacin de los vinos estn suje-

tos a condiciones ambientales desfavorables.

Una cepa de Oenococcus oeniaislada de vi-no argentino tiene elevado potencial malolc-tico y demostramos, por primera vez, que po-see un sistema proteoltico que se expresaen diferentes condiciones de cultivo. Las pro-teasas liberan aminocidos esenciales parael crecimiento de los microorganismos y pue-den jugar un importante papel al degradar lasprotenas, evitando su precipitacin. Ambaspropiedades son beneficiosas durante la ela-

boracin de los vinos.El sistema est integrado por dos activida-

des exoprotesicas, expresadas en los mo-mentos de mayor estrs para el crecimientobacteriano: inicio y final de fase exponencial.Los enzimas tienen diferentes ptimos de pHy temperatura, para la produccin y actividad.Son inhibidas completamente por cistena ybeta-mercaptoetanol y parcialmente por ditio-treitol, indicando que uniones disulfuro estn

implicadas en sus actividades. EDTA y ome-ga-fenantrolina, inhibidores de metaloprotea-sas; iodoacetamida y p-hidroximercuribenzo-ato, reactivos covalentes de grupos sulfhidri-los, no afectan las actividades enzimticassugiriendo que un ion metal no es requerido yque grupos sulfhidrilos no estn involucradosen el sitio activo. PMSF (fenilmetilsulfonilfluo-


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S

Influencia de la contaminacin por Botrytis cinereaen la calidad de vinospara la elaboracin de cava

M. Quintana, S. Francioli, C. Andrs, E. Lpez-Tamames,S. Buxaderas y M.C. de la Torre

Departamento de Nutricin y Bromatologa (CeRTA), Universidad de Barcelona, Barcelona

e ha estudiado la calidad de vinos desti-nados a la elaboracin de cava cuyauva presentaba una infestacin espont-

nea por Botrytis cinerea. Para ello, se han

considerado distintos tipos de vinos de la va-riedad xarello procedentes de uva afectada,en mayor o menor medida, por el hongo. Elgrado de infestacin se ha establecido de for-ma visual por la observacin del porcentajede superficie daada, estipulndose diferen-tes lotes de uva que se han vinificado parale-lamente a escala industrial (control, botritico15 % y muy botrtico > 35 %).

En los mostos y vinos se han determinado

parmetros generales y especficos de Botry-

tis, as como aromas y potencial espumantecomo parmetros de calidad.

Los resultados ponen de manifiesto que amedida que aumenta el grado de infestacin

de la uva, en los vinos hay una prdida depotencial espumante y aparecen compuestosde oxidacin, lo que evidencia el metabolismooxidativo del hongo y la consecuente prdidade calidad. Asimismo, estos primeros datosde mostos y vinos resultantes de uva con dis-tintos niveles de contaminacin botrticaapuntan la posibilidad de controlar vinos pro-cedentes de uva infestada mediante la deter-minacin del cido glucnico, el glicerol y el

benzaldehdo.


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tinta. Para le elaboracin de rosados estnadmitidas las variedades pinot noir y trepat.

En este trabajo se revisan las investigacio-nes que se han llevado a cabo sobre los

mostos y los vinos base de las variedadesautorizadas para la elaboracin del cava, so-bre los vinos de cava y sobre los cambiosque se producen durante la segunda fermen-tacin y el envejecimiento con las levaduras,extrayendo las conclusiones de estos traba-

jos. Los temas se abordan por grupos decompuestos. Tambin se dedica atencin alos estudios que se han realizado sobre losaspectos microbiolgicos de la elaboracin

del cava.


Anlisis global del conocimiento actualdel vino de cava

M.C. Polo, E. Pueyo, V. Moreno-Arribas,A. Martnez-Rodrguez y M.A. del Pozo

De acuerdo con la legislacin espaolaactual, se denominan cavasa los vinosespumosos de calidad producidos por

fermentacin en botella segn el mtodo tra-

dicional, en una regin determinada. Paraoptar a la denominacin cava, el vino debeestar en contacto con las levaduras de la se-gunda fermentacin un mnimo de nuevemeses. La legislacin determina ademsque las variedades de uva autorizadas parala obtencin de vinos destinados a la elabo-racin de cavas son: macabeo, xarello, pare-llada, subirat (malvasa riojana) y chardonnay,como variedades de uva blanca, y garnacha

tinta y monastrell, como variedades de uva


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S

Estudio de las actividades enzimticas con intersenolgico en levaduras no Saccharomyces

M. Fernndez, J. beda y A. Briones

Departamento de Qumica Analtica y Tecnologa de Alimentos, Universidad de Castilla-La Mancha, Ciudad Real

antes de empezar la fermentacin y de mos-

tos al inicio de la misma, en bodegas acogi-das a la DO La Mancha.Para conocer si cada uno de los 182 aisla-

dos mostraba las actividades proteoltica,poligalacturonsica y beta-glucosidsica, serealizaron ensayos en placa con los sustratosdiferenciales adecuados para cada caso (ca-sena y gelatina, cido poligalacturnico yarbutina). Con objeto de que los resultadosde las actividades enzimticas se pudieran

comparar entre las levaduras a estudiar, lossustratos se inocularon con el mismo nmerode clulas. Se encontr que casi el 80 % delas levaduras espontneas posean algn en-zima de inters biotecnolgico.

Una vez conocidas las actividades enzi-mticas de los aislados, se caracterizarongenticamente 69 de ellos, que posean algu-na actividad de forma pronunciada y 11 sinninguna escogidos al azar, mediante PCR/

RFLP, para ello se les extrajo el DNA, se am-plific la regin ITS y se someti a restriccincon el enzima Hinf I, obtenindose 13 perfilesmoleculares diferentes.

e estudiaron las actividades enzimticasde inters en enologa de 182 levadurasno Saccharomycesaisladas de mostos

Los aislados pertenecientes a cada perfilse identificaron mediante las galeras APIATB32C y otras pruebas de taxonoma clsi-ca recomendadas por el manual de Barnett et

al.(1990) para levaduras vnicas.El enzima beta-glucosidasa estuvo muyrelacionado con la especie Metschnikowiapulcherrima, mientras que la actividad poliga-lacturonsica fue frecuente en la mayora delas especies identificadas. La actividad pro-teoltica se observ en Pichia membrana-efaciensy en Metschnikowia pulcherrima.

Todos los perfiles genticos posean aisla-dos con alguna de las actividades estudia-

das, excepto Debaryomyces hansenii.La caracterizacin gentica mostr que

puede haber diferenciacin intraespecfica enPichia membranaefaciens, porque para lamisma especie se obtuvieron seis perfilesmoleculares distintos con alguna banda derestriccin en comn.

El polimorfismo obtenido mediante PCR/RFLP manifest gran coincidencia con las ca-ractersticas fenotpicas y permiti nombrar co-

rrectamente aquellas especies en las que hu-bo discrepancia por los mtodos clsicos.


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Desarrollo de marcadores molecularesen cepas de Saccharomyces cerevisiaebasados en microsatlites

I. Martnez, F.J. Gallego,* M.A. Prez y P. Hidalgo

Instituto Madrileo de Investigacin Agraria y Alimentaria, Alcal de Henares, Madrid* Departamento de Mejora Gentica y Biotecnologa, CIT-INIA, Madrid.

tener perfiles genticos de cepas de S. cere-visiae. ste incluye la localizacin de secuen-cias repetidas en la base de datos del DNAgenmico de S. cerevisiae, la bsqueda de

cebadores para amplificar mediante PCR al-guna de esas secuencias, la amplificacincon los primeros elegidos y el anlisis de lavariabilidad obtenida en las cepas.

Concretamente, la utilizacin del microsa-tlite SCTAT1 localizado en el cromosoma XIIIha servido como marcador molecular paracaracterizar y diferenciar nueve cepas deS. cerevisiaeen estudio. En ellas se han ob-servado cinco genotipos homocigotos con un

solo tamao de alelo y cuatro heterocigotoscon dos alelos de distinto tamao. El nmerode secuencias TAT repetidas se situ entre18 y 45.

Consecuentemente, la utilizacin de mi-crosatlites amplificados mediante PCRconstituye una potente herramienta para ana-lizar el genoma de las levaduras de esta es-pecie.

a caracterizacin e identificacin rpida,precisa y poco laboriosa de cepas deSaccharomyces cerevisiae, especie de

notable importancia en el proceso de vinifica-

cin, constituye en la actualidad un aspectorelevante cada vez ms demandado por in-vestigadores del campo enolgico y profesio-nales del moderno sector vitivincola.

Con este fin, en los ltimos aos se handesarrollado diversos mtodos entre los quese encuentran los fundamentados en el anli-sis del polimorfismo del DNA celular, como elanlisis de restriccin del DNA genmico ymitocondrial (RFLP), cariotipos moleculares

por electroforesis en campo pulsante y hue-lla gentica del DNA.

La aplicacin de modernas tcnicas debiologa molecular basadas en la reaccin encadena de la polimerasa (PCR) para la tipifi-cacin de levaduras vnicas han representa-do un gran avance en relacin con las utiliza-das previamente.

En el presente trabajo de desarrolla unnuevo mtodo rpido, sencillo y fiable para ob-


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Separacin y cuantificacin por HPLCde lpidos liberados durante la autlisisde levaduras vnicas

A. Martnez-Rodrguez, B. Bartolom, G. Santa-Mara,M.C. Polo y E. Pueyo


a autlisis de las levaduras que se produ-ce de forma espontnea en las elabora-ciones que conllevan un prolongado tiem-

po de envejecimiento con las levaduras, como

es el caso de los vinos espumosos elaboradospor el mtodo champenoisey de los vinos surlieque se elaboran en algunas regiones fran-cesas, confiere a estos vinos unas caracters-ticas peculiares que los diferencian de otros.

Entre los compuestos de las levadurasque se liberan al vino durante la autlisis seencuentran los lpidos. La escasez de mto-dos analticos que permitan separar y cuanti-ficar de forma fiable esta compleja fraccin,

que se encuentra en el vino en concentracio-nes del orden de microgramos o a lo sumo demiligramos, ha hecho que hasta el momentoactual exista un gran desconocimiento sobreeste grupo de compuestos.

El objetivo de este trabajo es la puesta apunto de un mtodo de anlisis de lpidos porHPLC, as como el estudio de la liberacin alvino de los lpidos de las levaduras. Debido aque la autlisis de las levaduras en el vino

tarda varios meses en producirse o al menosen ser detectable analticamente, se ha reali-zado una induccin de la autlisis en un me-dio vnico modelo. Los autolizados se han

extrado con cloroformo:metanol (2:1, v/v).Para la separacin de las distintas familias delpidos, se ha adaptado a la separacin de loslpidos presentes en las levaduras, el mtodo

propuesto por Christie y Urbin (J High ResolChromatogr 1995; 18: 97-100) que empleauna columna YMC PVA-Sil. La deteccin seha realizado con un detector de dispersin deluz. Se ha determinado la concentracin desteres de esterol, triacilgliceroles, esteroles,1,3-diacilgliceroles, cidos grasos libres, 1,2-diacilgliceroles, 2-monoacilgliceroles y 1-mo-noacilgliceroles. Se ha comprobado que lascurvas de calibrado de los lpidos se ajustan

a un modelo polinomial de tercer grado, ob-tenindose coeficientes de determinacinmayores de 0,94 en todos los casos con unerror estndar de la prediccin menor del 6 %para seis de las ocho clases de lpidos cuan-tificadas. La repetibilidad del proceso de ex-traccin (n = 3) medida por la desviacinestndar relativa es del 3 al 7 %.

Se ha observado una liberacin de lpidosen los primeros momentos de la autlisis y

una disminucin posterior lo que podra indi-car la solubilizacin de enzimas procedentesde las levaduras que degradan a los lpidosliberados.


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Lproduccin de acetato de etilo con las levadu-ras H. subpelliculosa, T. delbrueckiiy K. mar-xianusy 24 horas para la de acetato de isoa-milo con K. apiculata, H. subpelliculosa y

K. marxianus). La levadura tpica fermentado-ra produjo mayores cantidades de acetato deisoamilo que el resto de las levaduras utiliza-das en los estadios finales de la fermentacin.

La sntesis de acetatos llevada a cabo porlas esterasas slo se mostr activa para lasntesis de acetato de etilo. Esta actividad sedetect en las primeras horas de fermenta-cin en K. apiculata, K. marxianusy P. mem-branaefaciens, mientras que en C. guillier-

mondiiy T. delbrueckii fue al final de la mis-ma. No hubo deteccin de esta actividad enH. subpelliculosa y S. cerevisiae raza cere-visiae.

En todas las levaduras utilizadas se obser-varon sntesis de acetato de etilo y acetato deisoamilo por el enzima AATasa, siendo suscinticas distintas en cada levadura.

El acetato de etilo se acumul en el mediodurante toda la fermentacin excepto con

K. marxianusdonde disminuy al final. La es-pecie ms productora fue K. apiculata.

El acetato de isoamilo se acumul en elmedio durante toda la fermentacin conS. cerevisiaeraza cerevisiae, C. guilliermondiiy P. membranaefaciens y descendi al finalde la misma con K. marxian us, H. subpellicu-l T d lb kii

Enzimas implicados en la biosntesisde acetatos con diferenteslevaduras enolgicas

M.C. Plata, M.C. Milln, E. Valero, J.C. Mauricio y J.M. Ortega

os acetatos, tales como el acetato deetilo y el acetato de isoamilo, son com-puestos importantes en el aroma del

vino. Estos steres son sintetizados por las

levaduras durante la fermentacin a travsde dos enzimas, la alcohol acetiltransferasa(AATasa, EC 2.3.1.84) y las esterasas (EC3.1.1.1).

La sucesin de levaduras en una fermen-tacin alcohlica de mosto de uva natural esun hecho comprobado. En este trabajo se haestudiado la contribucin de diferentes leva-duras enolgicas al aporte de este grupo desustancias en el aroma del vino. Las levadu-

ras utilizadas fueron las que se encuentrannormalmente en la primera fase de fermenta-ciones industriales llevadas a cabo en la zonade DO Montilla-Moriles: Pichia membranaefaciens, Candida guilliermondii, Hansenulasubpelliculosa, Kluyveromyces marxianus,Kloeckera apiculatay Torulaspora delbrueckii.Como levadura tpica fermentadora se utilizSaccharomyces cerevisiae raza cerevisiae(E-1). Las experiencias se realizaron en un

mosto sinttico para eliminar el posible efectoque acarrean las diferentes vendimias en lacomposicin del mosto.

Las levaduras de primera fase de fermen-tacin produjeron mayor cantidad de estosacetatos en las primeras horas de desarrollodel proceso fermentativo (seis horas para la

bioquimica levaduras

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