BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Semestre 2010-2
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BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Semestre 2010-2
ProfesorasM. En C. María del Carmen Parra González (Edificio E lab105)
[email protected] Dra. Carmina Montiel Pacheco (Edificio E lab 102)
ALGUNAS COSAS A CONSIDERAR
HORARIO
LUNES 15:00-19:00 h
MIÉRCOLES 15:00-17:00 h
Tiempo límite de entrada 15:10
Evaluación prevía (cada clase) 15:10 hRetroalimentación 15:25 h
Trabajo de laboratorio e informe (reporte científico)
INDIVIDUAL (bitácora) EQUIPO para entregar
Introducción
Hipótesis
Objetivo general o particular
Métodos (Diagrama de Flujo)
Cuadro de registro de datos
y observaciones
Tratamiento de datos (cálculos)
Cuadro de resultados y/o gráficas y figuras
Análisis de resultados
Discusión
Resumen de la introducción
Hipótesis integrada
Tratamiento de datos (cálculos)
Cuadro de resultados (UNIDADES)
Análisis de resultados
Discusión
Trabajo de laboratorio e informe
INDIVIDUAL (bitácora) EQUIPO para entregar
Referencias (revistas, libros, web)
Cuestionario
Borrador del reporte
Referencias (revistas, libros, web)
Cuestionario
Reporte en forma de póster 2 cuartillas máximo
CURVA PATRON Y MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS
Son métodos cuantitativos de análisis químico que utilizan la luz para medir la concentración de las sustancias químicas.
Espectrofotométria de absorción visible (Colorimetría)Absorción ultravioleta (UV)Infrarroja
ESPECTROFOTOMETRÍA
Radiación Efecto Técnica Espectroscópica
Información Obtenida
UV- VIS Transiciones electrónicas entre los orbitales atómicos y moleculares
Espectroscopía ultravioleta-visible
Existencia de cromóforos y/o conjugación en la molécula a las absorciones observadas
Espectrofotómetro
Tungsteno (visible)Deuterio (UV)
LEY DE LAMBERT Y BEER
Establece que la absorbancia es proporcional al número de moléculas absorbentespor las que pasa la luz.
A = ε*C*bA = absorbanciaC= concentraciónb=longitud de la celda
ε= coeficiente de extinción o absortividad molar?
Es una propiedad intrínseca de los compuestos. Es una medida de absorción de luz de las especies químicas a una determinada longitud de onda
Unidades
ε=M-1cm-1
Coeficiente de extinción o absortividad molar
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNA
Los métodos más usuales son:
-Absorción en el ultravioleta.
-Reacción del Biuret.
-Método de Lowry.
-Método de Bradford.
•Es un método no destructivo.
•El intervalo de concentración que se puede determinar depende del contenido de los aminoácidos Tyr y Trp, y oscila entre 0,05 y 2 mg/ml.
•La presencia de sustancias absorbentes a 280 nm conduce a interferencias.
Absorción en el ultravioleta
Las características más importantes de la reacción son:
La reacción del Biuret se aplica, a partir de los tetrapéptidos, a todos los péptidos y proteínas.Su intervalo de determinación es de 1 a 6 mg/ml.No depende de la composición de aminoácidos.Algunos compuestos (NH4+, Tris, etc.) dan la reacción.
Complejo proteína-Cu(II) (Proteína en solución
alcalina)
Método de Biuret
+ NH3
Coloración violeta-púrpura (540nm)
Esta coloración se atribuye a la reducción del ácido fosfomolíbdico/fosfotúngstico a azul deheteropolimolibdeno de composición no definida, por medio de los residuos tirosilos, triptofanilos, y en menor grado, cisteinilos e histidilos de las proteínas que forman el complejo con el Cu2+.La intensidad de la coloración varía con la composición de aminoácidos de la proteína.Es más sensible que el ensayo del biuret. El intervalo es de 0,1-1 mg/ml.Presenta muchas interferencias.
Método de LOWRYREACCIÓN DE BIURET + REACTIVO DE FOLIN-CIOCALTEU
(750 nm)
•El rango de determinación de proteína es de 1-10 mg/ml (ensayo micro) y de 0,5 -1,4 mg/ml (ensayo estándar).•La intensidad de absorción depende del contenido de aminoácidos básicos y aromáticos.
Método de BRADFORD
MÉTODO VENTAJAS DESVENTAJAS
Método de Absorción No se pierden las muestras Interfieren compuestos que absorben en el UV
MÉTODOS COLORIMÉTRICOSBiurtet Específico para proteínas,
muestra pocas interferencias es barato
Poca sensibilidad 1 a 6 mg/mL
Lowry Tiene bastante sensibilidadde 0,1-1 mg/mL.
No todas las proteínas reaccionan igual. Muestra interferencias con detergentes no iónicos, sulfato de amonio
Bradford Muy sensible0,5 -1,4 mg/mL
Muestra interferencias con detergentes
Es un marco de referencia que se construye de cantidades conocidas de una sustancia (por ejemplo la albúmina sérica bovina) que se utiliza para determinar la cantidad de proteínas presente en una muestra incógnita.
Curva Patrón
BSA (µg)BSA (µg)
A750nm
A280nm
PRECISIÓN Y EXACTITUD
• La precisión se refiere a cuánto concuerdan dos o más mediciones de una misma cantidad.
• Ej.Todos los lanzamientos de las flechas concuerdan en un punto que no es la posición exacta
• Hay precisión en los lanzamientos pero no exactitud.
Precisión
Exac
titud
Alta Baja
Alta
Baja
PRECISIÓN Y EXACTITUD
• La exactitud indica cuán cerca está una medición del valor real de la cantidad medida.
• Ej.Todas las flechas alcanzan el centro que es la posición exacta de los lanzamientos..
• Hay exactitud y precisión en el lanzamiento
Precisión
Exac
titud
Alta
Alta
Baja
Baja
PRECISIÓN Y EXACTITUD
Estudiante 1 Estudiante 2 Estudiante 3
2,65 2,87 3,01
2,76 2,86 3,00
2,68 2,87 2,99
Se solicitó a tres estudiantes determinar la masa de un cilindro de aluminio cuya masa real es de 3,00 g.