Biomedyczny przegląd naukowy. Tom 2 · 2016-06-01 · Analiza zjawiska biofilmu – mechanizmy...

Biomedyczny przegląd

naukowy. Tom 2

Biomedyczny przegląd

naukowy. Tom 2

Redakcja:

Beata Zdunek

Agata Pietraszek

Lublin 2016

Recenzenci:

prof. dr hab. Marta Misiuk-Hojło

prof. dr hab. Małgorzata Sobieszczańska

dr hab. n. farm. inż. Monika Anna Olszewska, prof. nadzw. UM

dr hab. n. med. Barbara Mackiewicz

dr hab. n. med. Katarzyna Nowomiejska

dr hab. Anna Rymuszka

dr Agnieszka Kuźniar

dr Anna Pytlak

dr Ewa Rojczyk

dr Stanisław Adamiak

dr Michał Dzik

dr inż. Beata Świeczko-Żurek

dr inż. Jarosław Zubrzycki

dr n. o zdr. Mariola Janiszewska

dr n. med. Dorota Żołnierczuk-Kieliszek

dr n. med. Barbara Rajtar

Wszystkie opublikowane rozdziały otrzymały pozytywne recenzje.

Skład i łamanie:

Ilona Żuchowska

Projekt okładki:

Marcin Szklarczyk

© Copyright by Wydawnictwo Naukowe TYGIEL sp. z o. o.

ISBN 978-83-65598-09-7

Wydawca:

Wydawnictwo Naukowe TYGIEL sp. z o. o.

ul. Głowackiego 35/341, 20-060 Lublin

www.wydawnictwo-tygiel.pl

Spis treści

Żaneta Anna Mierzejewska Analiza zjawiska biofilmu

– mechanizmy powstawania, wpływ na organizm i implanty ............................ 7

Alicja Janicka, Anna Cwynar, Blanka Ziomkowska, Joanna Sikora,

Emilia Siemińska

Antybiotykooporność – poważny problem dzisiejszej cywilizacji .................. 18

Joanna Woźniak, Natalia Dereń, Edyta Simińska

Mechanizmy wnikania koronawirusów do komórek gospodarza ..................... 27

Maciej Gawroński, Arkadiusz Goede, Tomasz Wandtke

Wirusy onkolityczne jako potencjalna alternatywa

w leczeniu nowotworów złośliwych ................................................................... 35

Monika Dyńda

Wykorzystanie bakterii jako wektorów w terapii przeciwnowotworowej ...... 47

Anna Posmysz

Zastosowanie krwi pępowinowej w medycynie czyli o możliwościach

terapeutycznych komórek macierzystych pobranych z krwi pępowinowej ... 66

Małgorzata Waldowska, Wioleta Kowalska, Justyna Woś

Fenotypowe i funkcjonalne zróżnicowanie populacji komórek NKT .............. 77

Martyna Bednarczyk, Urszula Mazurek, Małgorzata Muc-Wierzgoń

Profil ekspresji genów zaangażowanych w autofagię w różnicowaniu

komórek raka jelita grubego ................................................................................ 94

Dominika Lach

Terapie przeciwzapalne – nowy cel

w leczeniu ostrych zespołów wieńcowych ....................................................... 112

Karolina Kątska, Jan Ostrowski, Ewa Kosior-Jarecka

Zaburzenia ze strony narządu wzroku w przebiegu oponiaków ..................... 121

Anna Łabejszo, Tomasz Wandtke, Maciej Gawroński

Alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych

– immunopatogeneza i leczenie......................................................................... 131

Adrian Dubicki

Metody leczenia deformacji czaszki u dzieci. Rodzaje kasków

korekcyjnych oraz metody ich wykonywania ................................................. 141

Adrian Dubicki, Żaneta Anna Mierzejewska

Ocena deformacji i metody pomiaru czaszki u dzieci .................................... 161

Alicja Janicka, Anna Cwynar, Blanka Ziomkowska, Tomasz Wybranowski

Fluorescencyjna spektroskopia czasowo-rozdzielcza.

Proste narzędzie diagnostyczne ......................................................................... 179

Alicja Janicka, Anna Cwynar, Blanka Ziomkowska, Joanna Sikora

Fotoluminescencja – proste narzędzie analizy wpływu pH

na aktywność przeciwnowotworową pochodnych kamptotecyny .................. 192

Arkadiusz Goede, Maciej Gawroński, Tomasz Wandtke

Technika DNA origami – potencjalne zastosowania ....................................... 204

Małgorzata Sieradzka, Joanna Kołodziejczyk-Czepas, Paweł Nowak

Nowe kierunki w badaniach biomedycznych kwasów

hydroksycynamonowych ................................................................................... 223

Aleksandra Kruk, Agnieszka Gadomska-Gajadhur, Paweł Ruśkowski

Wpływ prekursorów porów na morfologię membran półprzepuszczalnych

przeznaczonych do hodowli komórkowych ..................................................... 254

Bartosz Sikora, Aleksandra Skubis, Małgorzata Kimsa

Ekspresja markerów molekularnych ABCG2 oraz P63 w świńskich

epitelialnych komórkach macierzystych rąbka rogówki ................................. 265

Magdalena Antonowicz, Anita Kajzer, Magdalena Grygiel-Pradelok

Dobór własności mechanicznych elementów stabilizatora zewnętrznego

do leczenia kurzej klatki piersiowej .................................................................. 277

Żaneta Anna Mierzejewska

Wieloaspektowa analiza problematyki związanej

z mechanizmami niszczenia implantów ........................................................... 293


Przyczyny mechanicznego niszczenia implantów

wytwarzanych tradycyjnymi technologiami ..................................................... 308


Projekt indywidualnego implantu kości biodrowej .......................................... 325

Magdalena Grygiel-Pradelok, Janusz Szewczenko, Wojciech Kajzer,

Magdalena Antonowicz

Ocena wpływu biodegradowalnej warstwy polimerowej (PLGA)

na korozję podłoża ze stopów tytanu ................................................................ 344

Adrian Dubicki

Współcześnie stosowane metody przywrócenia utraconych

w wyniku schorzeń i uszkodzeń funkcji miednicy .......................................... 357

Indeks autorów ................................................................................................... 378

7

Żaneta Anna Mierzejewska1

Analiza zjawiska biofilmu

– mechanizmy powstawania,

wpływ na organizm i implanty

1. Wstęp/Wprowadzenie

Biofilm to złożona struktura biologiczna, wielokomórkowy twór złożony

z drobnoustrojów jednego lub wielu gatunków mikroorganizmów, otoczony

warstwą zewnątrzkomórkowych polisacharydów [1]. W jego skład wchodzić

mogą bakterie, grzyby, glony i pierwotniaki. Biofilm powstaje w wyniku

rozrastania się form drobnoustrojów, które przyjmują uporządkowaną,

skomplikowaną strukturę złożoną z mikrokoloni bakteryjnych [2].

Mikrokolonie poprzedzielane są siecią otwartych kanalików, w których

krążąca ciecz jest odpowiedzialna za dostarczanie tlenu, substancji

odżywczych oraz usuwanie zbędnych produktów przemiany materii. Dzięki

temu nawet głębiej położone warstwy komórek mają zapewnione warunki do

życia i rozwoju[1].

Biofilm wpływa na wiele aspektów naszego życia, dlatego takie ważne jest

jego dokładne poznanie. Mikroorganizmy wchodzące w jego skład

charakteryzują się inwazyjnością, przyczyniają się do rozwoju wielu infekcji,

powstaje również na implantach biomedycznych, prowadząc do rozwoju

różnego typu stanów zapalnych, również w warunkach szpitalnych. Są one

oporne na działanie wysokiej temperatury, środków dezynfekujących

i antyseptycznych, surfaktantów oraz antybiotyków [3].

Do biomateriałów szczególnie podatnych na formowanie się biofilmu

zalicza się: sztuczne serce, protezy stawów, soczewki kontaktowe, zastawki

serca, cewniki, szwy, protezy naczyń krwionośnych, spirale domaciczne,

rozrusznik serca oraz implanty metaliczne [4]. W przypadku tych ostatnich

biofilmu może powodować powstawanie szczególnie uciążliwych i niebez-

piecznych stanów zapalnych, które zapoczątkowują procesy resorpcji tkanki

kostnej wokół implantu. Zmniejszenie stabilizacji wszczepu prowadzi do jego

obluzowania, uszkodzenia otaczającej go tkanki kostnej, a w konsekwencji

zniszczenia jej struktury i złamania kości lub implantu [4‚6].

1 [email protected], Katedra Inżynierii Materiałowej i Biomedycznej,

Wydział Mechaniczny, Politechnika Białostocka


8

2. Cel pracy

Ze względu na duży wpływ biofilmu na życia człowieka oraz jego

otoczenie, bardzo ważne jest dokładne poznanie mechanizmów

formowania się oraz funkcjonowania tej struktury. Dotychczas badania

były prowadzone przede wszystkim w zawiesinach komórkowych, które

zawierały pojedyncze komórki mikroorganizmów [2]. Niestety komórki

swobodnie żyjące zasadniczo różnią się od komórek tworzących biofilm. Z

tego powodu powinno się skupić na badaniu komórek w kontekście

biofilmu jako całości. W tym celu należy przede wszystkim ulepszyć

techniki pozyskiwania oraz pomiaru tej struktury. Obecnie stosowane

metody są niestety mało efektywne. Należy również rozwijać modele

systemowe, które można wykorzystać do analizy biofilmu. Powinny one

umożliwiać uzyskanie powtarzalnych oraz dokładnych wyników. Istotne

jest także poznanie czynników indukujących i wpływających na tworzenie

się biofilmu [6].

3. Budowa biofilmu

Powstawanie biofilmu jest procesem wielostopniowym, uwarunko-

wanym właściwościami tworzących go mikroorganizmów oraz budową

i właściwościami kolonizowanych materiałów lub organizmów (rys.1) [7].

Szczególną rolę w procesie adhezji odgrywają wytwarzane przez mikro-

organizmy tworzące biofilm polimery zewnątrzkomórkowe, lipopoli-

sacharydy i białka ich ściany komórkowej. Kolonizację ułatwia także

struktura powierzchni oraz wszelkie jej uszkodzenia i chropowatości [8].

Adhezja komórek mikroorganizmów jest procesem wieloetapowym [9].

Początkowo przemieszczanie się komórek w kierunku zasiedlanej powierzchni

regulują oddziaływania fizyczne związane z działaniem sił hydrodyna-

micznych, grawitacyjnych, termodynamicznych oraz sił van der Waalsa [10].

Dużą rolę w procesie kolonizacji powierzchni przez bakterie odgrywają

ich struktury zewnętrzne, takie jak fimbrie czy rzęski [11]. Ruchliwość

bakterii wynikająca natomiast z posiadania przez nie rzęsek sprawia, że

łatwiej docierają one do powierzchni, a następnie po jej osiągnięciu

wędrują w poszukiwaniu innych drobnoustrojów, dążąc do wytworzenia

nowej mikrokoloni lub powiększenia już istniejącej [12]. Adhezja ma

charakter nieodwracalny, dochodzi bowiem do wytworzenia specyficznych

wiązań między zasiedlaną powierzchnią a występującymi na powierzchni

komórkami [13].

Podstawową rolę w tym procesie odgrywają polimery zewnątrz-

komórkowe (EPS) tworzące tzw. glikokaliks [12‚14], który umożliwia

adhezję komórek do takich powierzchni, jak tworzywa sztuczne czy metale

[15]. Adhezja nieodwracalna umożliwi wytworzenie mikrokoloni i dojrze-

Analiza zjawiska biofilmu – mechanizmy powstawania, wpływ na organizm i implanty

9

wanie biofilmu. Następuje namnażanie drobnoustrojów i ich stopniowe

różnicowanie. W ich komórkach dochodzi do aktywacji lub hamowania

ekspresji niektórych genów [16].

Bakterie bytujące we wnętrzu biofilmu narażone są na ograniczenie

dostępu tlenu, z tego też względu zmienia się ich metabolizm – wzrasta

aktywność beztlenowych szlaków metabolicznych, zahamowaniu ulega też

synteza niektórych enzymów oraz toksyn [17]. Dzięki tym zjawiskom

komórki bakterii wchodzące w skład biofilmu wykazują odmienne cechy

niż komórki żyjące w postaci wolnej [16]. Dojrzała forma biofilmu otoczona

jest grubą warstwą glikokaliksu, do którego adsorbowane są substancje

mineralne, związki organiczne i komórki innych drobnoustrojów [18].

W ostatnim etapie rozwoju biofilm osiąga tzw. krytyczną grubość

i stopniowo przestaje utrzymywać istniejącą formę. Następuje wówczas

migracja komórek z peryferyjnych części dojrzałego biofilmu do otoczenia

[18-19]. Przyczyną tego zjawiska może być wyczerpanie składników

pokarmowych lub problemy ich przepływu w obrębie biofilmu.

Rysunek 1. Etapy rozwoju biofilmu [20]

3.1. Cechy biofilmu

Charakterystyczne dla biofilmów jest to, iż występuje w nich mieszanina

stanów metabolicznych. Bakterie na obrzeżach wykazują przejawy życia

np. wzrost, natomiast komórki położone w głębszych warstwach znajdują się

w stanie anabiozy (są żywe, ale „uśpione”). W obrębie biofilmu występuje

zróżnicowane środowisko chemiczne oraz ograniczony dostęp do składników

odżywczych (odmienne stężenie tlenu w warstwach), co jest główną przyczyną


10

zmian w metabolizmie komórek bakteryjnych (rys.2). Ze względu na to

komórki genetycznie identyczne mogą zachowywać się i wyglądać zupełnie

inaczej [17].

Miejscowe warunki wpływają także na wytwarzanie przez bakterie wielu

toksyn i innych substancji wywołujących objawy choroby. Mechanizmy

obronne uruchamiane przez układ odpornościowy nie potrafią pokonać

biofilmu. Często nawet antybiotykom nie udaje się pokonać lepkiej substancji

polisacharydowej i przedostać się do ich wnętrza, co zapewniają im zmienne

warunki środowiska oraz zróżnicowanie gatunkowego komórek tworzących

biofilm. Przykładowo penicylina penetrująca Biofilm jest rozkładana przez

beta-laktamazy, degradujące antybiotyk szybciej niż jest on w stanie

przedostać się do głębszych warstw biofilmu [13].

Rysunek 2. Zróżnicowanie aktywności metabolicznych w obrębie biofilmu [21]

4. Biofilm a organizm ludzki

W chwili obecnej uważa się, że 60 do 80% zakażeń z którymi spotyka się

człowiek jest związane z tworzeniem biofilmów. Są to infekcje dotyczące np.

implantów z tworzyw sztucznych, ale także odpowiadają za skutki m.in.

zapaleniach ucha środkowego, zakażeniach dróg moczowych, zakażeniach

dróg oddechowych w przebiegu mukowiscydozy itp. [13]

Infekcje związane z biofilmem mają zwykle charakter przewlekły,

niejednokrotnie groźny dla życia, a bakterie tworzące biofilm są szczególnie

odporne na działanie antybiotyków, jak i na mechanizmy odpornościowe

człowieka [17]. Nośnikiem informacji są związki chemiczne, które – po


11

przekroczeniu krytycznego stężenia – mogą powodować tworzenie się bądź

rozpraszanie biofilmu, wydzielanie czynników zjadliwości oraz synchro-

nizować aktywność całego biofilmu w kierunku korzystnym dla drobno-

ustrojów [18].

4.1. Miejsca występowania biofilmu

Zakażenie organizmu ludzkiego prowadzi do wielu niebezpiecznych

komplikacji. Pomimo, iż protezy naczyniowe, zastawki serca czy protezy

ortopedyczne ulegają zakażeniu dość rzadko, to jednak pojawienie się

zakażenia może wymagać usunięcia protezy, amputacji kończyny lub

spowodować śmierć pacjenta [22].

Biofilm powstający na zanieczyszczonych plastikowych implantach

(np. zastawki serca) jest prawie niemożliwy do usunięcia przy pomocy

antybiotyków. Dodatkowo, tworzywo sztuczne zniechęca migrację neutro-

filów i makrofagów, które zwykle stanowią ochronę przed bakteriami [22].

Może to prowadzić do powstania zapalenia wsierdzia i uwolnienia bakterii

do krwiobiegu, powodując miejscowe uszkodzenie serca. Bakterie

odpowiedzialne za takie zakażenia to w szczególności S. epidermidis, S.

aureus i Enterococcus sp. [23]Przylegają one do tworzywa, powodując

powstawanie w nim zagłębień i szczelin. W wyniku tego konieczne jest

chirurgiczne usunięcie implantu. Biofilm jest także przyczyną chorób

szpitalnych spowodowanych mikroflorą pacjenta lub personelu (powstają

w cewnikach i powodują kłopotliwe zakażenia, bardzo trudne do wyle-

czenia)[17‚19, 23]

Ponadto bakterie tworzące biofilmy skórne mogą dostać się przez rurki

i igły kroplówek do krwiobiegu i wywołać infekcje zagrażające życiu.

Podając substancje bezpośrednio do krwiobiegu, omija się naturalny

system niespecyficznej obrony skóry [24].

Producenci sprzętu medycznego zaczęli impregnować cewniki i rurki

środkami przeciwbakteryjnymi takimi jak srebro czy antybiotyki w nadziei,

że bakterie przestaną tworzyć błony biologiczne. Niestety, S. epidermidis

uodparnia się bardzo szybko na nowo stosowane antybiotyki [24‚26].

4.2. Zakażenia biomateriałów

Zastosowanie implantów znacznie wzrosło w ciągu ubiegłych 20 lat.

Szacuje się ze liczba wszczepów medycznych rośnie rocznie w granicach

od 7% – 15% [25]. Materiały używane na wszczepy medyczne nazywane

są biomateriałami i są one definiowane jako materiały używane do

konstrukcji urządzeń medycznych charakteryzujące się biozgodnością

(obojętność fizyczna i chemiczna w stosunku do otaczających tkanek),

biofunkcjonalnością (właściwości danego materiału zoptymalizowane pod


12

kątem funkcji jaką mają zastępować w organizmie) oraz stałością (nie-

zmienność wymiarów i kształtu podczas sterylizacji) [26].

Stosowanie biomateriałów jest często związane z występowaniem

infekcji bakteryjnych (Tabela nr. 1). Szacuje się, że jest to 1%-2% dla

implantów ortopedycznych, natomiast dla cewników stosowanych do

odprowadzania moczu 100%, dlatego ich stosowanie powinno być

krótkotrwałe [27].

Takie infekcje mają bardzo poważne konsekwencje, w szczególności

przy głęboko położonych tkankach i implantach naczyniowych, gdzie

jedynym sposobem ratunku jest amputacja, a w wielu przypadkach

zakażenie jest przyczyną śmierci pacjenta. Jak wynika z tabeli wiele

rodzajów implantów wykazuje niski zakres infekcji, ale każda z nich wiąże

się z poważnymi skutkami, dlatego proces kolonizacji implantów przez

bakterie wymaga lepszego zrozumienia.

Wielkości opisujące ilość infekcji na implantach spowodowanych

występowaniem biofilmu podane są w tabeli poniżej:

Tabela 1 Procentowy zakres infekcji na różnych biomateriałach [25]

Rodzaj implantu Materiał Zakres

infekcji

[%]

Cewniki moczowe Silikon, Poliuretan, Polietylen 7-10

Implanty

ortopedyczne

Tytan, Stal, Polietylen, Kobalt,

Chrom

1-4

Implanty piersi Silikon 5

Stenty Teflon, silikon, poliuretan, polietylen 1-5

Szkła

kontaktowe

PMMA 0.05-0.2

Sztuczne

naczynia

krwionośne

Fluoropolimery, Dacron, poliuretan

0.5-1

Zastawki serca Tkanki naturalne, węgiel, stal 1-12

5. Profilaktyka zakażeń

Celem profilaktyki antybiotykowej w przypadku zabiegów wszcze-

pienia materiału sztucznego jest zminimalizowanie ryzyka kontaminacji

bakteryjnej w okresie okołooperacyjnym i we wczesnym etapie gojenia

rany [28]. W tym celu stosowane są antybiotyki o szerokim spektrum

działania. Ich zastosowanie zmniejsza ryzyko śródoperacyjnej i wczesnej


13

pooperacyjnej drogi infekcji [28, 29]. Profilaktyka antybiotykowa w chirurgii

kostnej stosowana jest zarówno w przypadku zabiegów przeprowadzanych

w trybie planowym jak i tych, które z racji zaistniałych okoliczności muszą

być przeprowadzone w trybie dyżurowym.

Zgodnie z zaleceniami The Sanford Guide of Antimicrobial Therapy

z 2010 roku [30], profilaktyka antybiotykowa w przypadku wszczepienia

endoprotezy stawu powinna zostać wdrożona nie mniej niż 30 minut przed

zabiegiem operacyjnym. Dodatkową profilaktykę stosuje się u pacjentów

ze stwierdzonym nosicielstwem szczepów MRSA (methicillin-resistant

Staphylococcus aureus) lub na oddziałach ze stwierdzonym wzmożonym

ryzykiem wystąpienia zakażeń szpitalnych.

W przypadku wszczepienia implantu dentystycznego zagadnienie

celowości stosowania profilaktyki antybiotykowej było przedmiotem

dyskusji wśród wielu badaczy [29]. Zabiegi implantologiczne zostały

zakwalifikowane jako zabiegi czyste skażone, wśród których ryzyko

zakażenia miejsca operowanego jest oceniane na mniej niż 10% [31]. Przed

wykonaniem zabiegu obowiązuje przeprowadzenie pełnej sanacji jamy

ustnej, czyli eliminację wszelkich ognisk infekcji [1, 8].

Osobnym zagadnieniem jest profilaktyka antybakteryjna zakażeń

w traumatologii narządu ruchu. Uważa się, że o profilaktyce można mówić

wówczas, gdy wdrożenie leku nastąpiło do 6 h od urazu, gdy rana nie jest

zakażona [32, 33]. W badaniach in vitro zaobserwowano, że obecność

antybiotyku może zmniejszać adhezję komórek bakteryjnych do po-

wierzchni implantu i tym samym opóźnić proces formowania biofilmu

bakteryjnego [30‚32].

5.1. Przykłady biofilmów na powierzchniach wyrobów

medycznych

Biofilmy mogą powstawać w wielu miejscach, gdzie może dojść do

poważnych infekcji. Poniżej zostały przedstawione trzy przykłady miejsc

występowania biofilmów i ich wpływ na zdrowie człowieka (rys.3) [8].

Stosowanie cewników wiąże się z niebezpieczeństwem zakażeń

pochodzenia cewnikowego. W następstwie złożonych procesów na

powierzchni cewnika powstaje biofilm, którego istotnym elementem są

drobnoustroje. Najczęściej są to gronkowce charakteryzujące się bardzo

wysoką opornością w stosunku do większości antybiotyków [11].

Zakażenia mogą rozwijać się lokalnie- w miejscu wprowadzenia

cewnika lub też rozprzestrzeniać się drogą krwi; z użyciem cewników

wiąże się występowanie septycznego zakrzepowego zapalenia żył,

zapalenia wsierdzia, ropnia płuca, ropnia mózgu oraz zapalenia szpiku

kostnego i gałki ocznej [21].


14

W protezach żółciowych powikłania obejmują najczęściej niedrożność

protezy plastikowej w skutek powstania bakteryjnego biofilmu, tworzącego

się na wewnętrznej powierzchni. Następstwem jest zapalenie dróg

żółciowych i żółtaczka. Przypuszcza się ze adherencja protein i bakterii do

wewnętrznej ściany protezy tworząca biofilm inicjuje jej zablokowanie.

Bakterie dostają się do światła dróg żółciowych najprawdopodobniej już

podczas wkładania protezy, a także refluksu treści dwunastniczej do dróg

żółciowych już po jej założeniu. Powoduje to przylegnie kolejnych kolonii

bakteryjnych wraz z kryształkami cholesterolu, tworząc szkielet włókien

będący przyczyna powolnego zamykania światła protezy [11‚15].

Rysunek 3. Biofilm na a) protezie żółciowej [34], b) panewce implantu stawu biodrowego [35],

c) szkliwie [36], d) implancie piersi [37]

6. Podsumowanie

Obecnie nie istnieje jeden sprawdzony protokół postępowania

diagnostycznego w przypadku zakażeń wynikających z obecności biofilmu.

We wszystkich przypadkach o ostatecznym rozpoznaniu decyduje wystąpienie

charakterystycznych objawów klinicznych wraz z odpowiednimi wynikami

analiz laboratoryjnych krwi, badań mikrobiologicznych, histopatologicznych

oraz diagnostyki obrazowej [2, 33]. Leczenie zakażeń jest trudne, długotrwałe

a) b)

c) d)


15

i często kończy się niepowodzeniem w wyniku, którego implant należy usunąć

i zastosować inny algorytm postępowania leczniczego. Występowanie zakażeń

znacznie wydłuża okres hospitalizacji chorego, generuje koszty, przyczynia się

do obniżenia jakości jego życia a często nawet i śmierci pacjenta [38].

Praca zrealizowana przy wsparciu finansowym Wydziału Mechanicznego

Politechniki Białostockiej w ramach projektu „Rozwój młodych naukowców

i uczestników studiów doktoranckich‖ nr MB/WM/14/2014.

Literatura

1. Paduch D., Niedzielski J., Materiały biomedyczne. Część I: Pojęcie filmu

biologicznego (biofilmu) i fizykochemiczne podstawy przyczepności substancji

organicznych do biomateriałów, Chirurgia Polska, (2005)

2. Sałek A., Powstawanie biofilmu w warunkach przemysłowych. Cz.1.

Mechanizm formowania biofilmu i jego struktura, Przemysł Fermentacyjny

i Owocowo-Warzywny, 6 (2008)

3. Bartoszewicz M., Rygiel A., Biofilm jako podstawowy mechanizm zakażenia

miejsca operowanego, Chirurgia Polska, (2006)

4. Donlan R. M., Biofi lms: Microbial life on surfaces, Emerging Infectious

Disease, vol. 8 (2002), s. 136-151

5. Monds R. D., O´tool G. A., The developmental model of microbial biofi lms:

Ten years of a paradigm up for review, Trends Microbiol, 17 (2009), s. 73-87

6. Chmiel A., Biotechnologia podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne, PWN

(1991)

7. Libudzisz Z., Kowal K., Żakowska Z., Mikrobiologia techniczna, tom I,

Mikroorganizmy i środowiska ich występowania, PWN (2001)

8. Czaczyk K., Wojciechowska K., Tworzenie biofilmów bakteryjnych – istota

zjawiska i mechanizmy oddziaływań, Biotechnologia, 3,62 (2003), s. 180-192

9. Marshall K. C., Adsorption and adhesion process in microbial growth at

interfaces, Advances in Colloid Interface Science, vol. 25, 1(1986), s. 59-86

10. Czaczyk K., Czynniki warunkujące adhezję drobnoustrojów do powierzchni

abiotycznych, Postępy Mikrobiologii, vol. 43, 3(2004), s. 267-283

11. Rijnaarts H. M., Norde W., Bouwer E. J., Lyklema J., Zehnder J. B., Bacterial

adhesion under static and dynamic conditions, Applied and Environmental

Microbiology, vol. 59 (1993), s. 3255-3265

12. Thi T. T. Le, Prigent-Combaret C., Dorel C., Lejeune P., First stages of biofi

lm formation: characterization and quantifi cation of bacterial functions involved

in colonization process, Methods in Enzymology, vol. 336(2001), s. 152-159

13. Percival S. L., Malic S., Cruz H., Williams D. W., Introduction to biofi lms,

Biofi lms and Veterinary Medicine, vol. 6 (2011), s. 41-68

14. Pitts B., Fluorescence Microscopy to Assess Microbial Activity and

Antimicrobial Performance in Biofilms, Biotechnologia, 3(2003), s. 180-192

15. Flemming H. C., Wingender J., Relevance of microbial extracellular

polymeric substances (EPSs) – Part I: Structural and ecological aspects,

Water Science and Technology, vol. 43(2001), s. 1-8


16

16. Costerton J. W., Lewandowski Z., DeBeer D., Caldwell D. E.,. Korber D. R,

James G., Biofilms, the customized microniche, Journal of Bacteriology, vol.

176 (1994), s. 2137-2142

17. Costerton J. W., Lewandowski Z., Caldwell D. E., Korber D. R., Lappin-Scott

H. M., Microbial biofilms, Annual Review of Microbiology, vol. 49 (1995),

s. 711-745

18. Chandra J., Zhou G., Channoum M. A., Fungal biofi lms and actimycotics,

Current Drug Targets, 8(2005), s. 887-894

19. Liu Y., Tay J. H., Detachment forces and their infl uence on the structure

and metabolic behavior of biofilms, Journal of Microbiology

and Biotechnology, vol. 17(2001), s. 111-117

20. https://pl.wikipedia.org/wiki/Biofilm [12.10.2015]

21. http://bioinfo.mol.edu.pl/articles/Buchala05 [12.10.2015]

22. Pokrowiecki R., Tyski S., Zaleska M., Problematyka Zakażeń

Okołowszczepowych, POST. MIKROBIOL., 53, 2 (2014), s. 123-134

23. Amarasinghe J. J., Scannapieco F. A., Haase E. M., Transcriptional

and translational analysis of biofilm determinants of Aggregatibacter

actinomycetemcomitans in response to environmental perturbation, Infect.

Immun. 77(2009), s. 2896-2907

24. Arciola C. R., Campoccia D., Gamberini S., Baldassarri L., Montanaro L.,

Prevalence of cna, fnbB adhesins genes among Staphylococcus aureus isolates

from orthopedic infections asossciated to different types of implants, FEMS

Microbiol. Lett. 246 (2005), s. 81-86

25. Lebeaux, D., Chauhan, A., Rendueles, O., Beloin, C., From in vitro to in vivo

Models of Bacterial Biofilm-Related Infections, Pathogens, 2 (2013), s. 288-

356

26. Barei D. P., Nork S. E., Mills W. J., Henley M. B., Benirschke S. K.

Complications associated with internal fixation of high-energy bicondylar

tibial plateau fractures utilizing a two-incision technique, J. Orthop. Trauma,

18 (2004), s. 649-657

27. Trends in Microbiology, vol. 17, 2 (2009), s. 73-87

28. Resnik R. R, Misch C. E., Biofilms in dentistry, (w) Contemporary Implant

Dentistry, red. Misch C.E., Abbas H.A. (2008), s. 495

29. Esposito M., Grusovin M. G., Loli V., Coulthard P., Worthington H. V., Does

antibiotic prophylaxis at implant placement decrease early implant failures?

A Cochrane systematic review, Eur. J. Oral. Implantol. 3(2010), s. 101-110

30. Gilbert D. N., Moellering R. C., Eliopoulos G. M., Chambers H. F., Saag M.

S., The Sanford Guide to Antimicrobial Therapy 2010, 40th ed. Sperryville,

VA: Antimicrobial Therapy (2010)

31. Resnik R. R, Misch C. E., Pharmacology in Implant Dentistry, (w)

Contemporary Implant Dentistry, red. Misch C. E., Abbas H. A. (2008), s. 468

32. Trampuz A., Zimmerli W., Antimicrobial agents in orthopaedic surgery,

Drugs, 66 (2006), s. 1089-1105

33. Trampuz A., Zimmerli W., Diagnosis and treatment of infections associated

with fracture-fixation devices, Injury, Int.J. Care Injured. 37, (2006), s. 59-66

34. http://polimery.am.wroc.pl/2006/301.pdf [12.10.2015]


17

35. http://ec.europa.eu/research/health/infectious-diseases/antimicrobial-drug

resistance/projects/087_en.html [12.10.2015]

36. http://www.iab.kit.edu/microbio/489.php [12.10.2015]

37. http://www.talroudnerplasticsurgery.com/breast-plastic-surgery/breast-

implant-failure-due-to-capsular-contracture-caused-by-biofilm/ [12.10.2015]

38. Fang G., Keks T. F., Getry L. O., Harris A. A., Rivera N., Gett K., Fuchs P.

C., Gustafson M., Wong E. S., Goetz A., Wagner M. M., Yu V. L., Prosthetic

Valle endocarditis resulting from nosocomial bacteremia. A prospective,

multicenter study, Ann. Intern. Med. 119, (1993), s. 560-567

Analiza zjawiska biofilmu – mechanizmy powstawania, wpływ

na organizm i implanty

Zadaniem implantów umieszczanych w organizmie ludzkim jest pełnienie funkcji zastępowanych

tkanek. Często zabiegi wszczepiania implantów wiążą się ze zwiększeniem komfortu pacjenta,

jednak nie są one pozbawione ryzyka. Szacuje się, że blisko 70% operacji wszczepiania implan-

tów wiąże się z zakażeniami spowodowanymi występowaniem biofilmu. Infekcje związane

z biofilmem mają charakter przewlekły, niejednokrotnie groźny dla życia ludzkiego, przy czym

bakterie go tworzące są odporne na antybiotyki. Biofilm występując na powierzchniach

biomateriałów może powodować korozję oraz wpływać na ich właściwości mechaniczne.

Dlatego tak ważne jest poznanie mechanizmów powstawania biofilmów oraz znalezienie

skutecznych środków umożliwiających jego zwalczanie bez konieczności chirurgicznej inge-

rencji w organizm ludzki.

Analysis of the biofilm phenomenon – formation mechanisms, effects

on the body and implants

The task of implants placed in the human body is replacing the function of tissues. Common

treatments are associated with increased patient comfort, but they are not without risk. It is

estimated that nearly 70% of implant surgeries associated with infections caused by the

occurrence of biofilm. Biofilm infections are chronic, often life-threatening, while bacteria

forming it are resistant to antibiotics. The biofilm present on the surfaces of biomaterials can

cause corrosion and affect their mechanical properties. Therefore, it is important to understand the

mechanisms of biofilms and to find effective means to combat it without surgical intervention

in the human body.

18

Alicja Janicka1, Anna Cwynar

2, Blanka Ziomkowska

3, Joanna Sikora

4, Emilia

Siemińska5

Antybiotykooporność

– poważny problem dzisiejszej cywilizacji

1. Wprowadzenie

Pierwszym krokiem w kierunku leczenia chorób bakteryjnych zarówno

ludzi jak i zwierząt było odkrycie penicyliny 28 września 1928r. przez

Aleksandra Fleminga. Penicylina miała okazać się panaceum na wszystkie

zakażenia bakteryjne. Po tym nowatorskim odkryciu powoli nakręcało się

koło napędowe, prowadzące do wyszukiwania i tworzenia coraz to

nowszych naturalnych i półsyntetycznych antybiotyków. Był to okres

przełomowy w medycynie, oddający w ręce lekarzy potężną broń do walki

z drobnoustrojami, które stanowiły przyczynę chorób i śmierci wielu ludzi

i zwierząt. W tamtym okresie mogłoby się wydawać, że lekom przeciw-

drobnoustrojowym nic nie zagrozi. W latach 60. XX wieku uważano nawet,

że zakażenia bakteryjne przeszły w niepamięć i że zwalczono je na zawsze.

W późniejszym okresie jednak, zaczęto zauważać, że istnieją szczepy

bakterii wykazujące oporność na antybiotykoterapię, przez co leczenie

chorób przez nie wywołanych stało się problemem ówczesnych lat i trwa

do dnia dzisiejszego [1, 2, 23].

Gronkowce oporne na metycylinę, enterokoki oporne na wankomycynę,

a także pneumokoki oporne na penicyliny to tylko nieliczne przykłady

bakterii (grupa Gram-dodatnich), które stanowią coraz to większy problem

w lecznictwie, ze względu na fakt, że wiele z nich może być opornych

jednocześnie na antybiotyki jak i chemioterapeutyki [3]. Z biegiem czasu

i z postępami w pracach mających na celu odkrycie medykamentu, który

miałby uporać się z drobnoustrojami wykazującymi oporność na

dotychczasowe leczenie, okazało się że takim „antybiotykiem ostatniej

1 [email protected], Collegium Medicum w Bydgoszczy, Wydział Farmaceutyczny,

Studenckie Koło Naukowe Biofizyki przy Zakładzie Biofizyki 2 [email protected], Collegium Medicum w Bydgoszczy, Wydział Farmaceutyczny, Katedra

i Zakład Patobiochemii i Chemii Klinicznej

3 [email protected], Collegium Medicum w Bydgoszczy, Wydział Farmaceutyczny, Katedra

i Zakład Biofizyki 4 [email protected], Wydział Lekarski, Katedra Farmakologii i Terapii 5 [email protected], Wydział farmaceutyczny, Studenckie Koło Naukowe Chemii

Analitycznej

Antybiotykooporność – poważny problem dzisiejszej cywilizacji

19

szansy” jest wankomycyna. Jednak i ten antybiotyk jest nieskuteczny w walce

z infekcjami wywołanymi przez szczepy gronkowców i paciorkowców.

Szczególnie niebezpiecznymi szczepami bakterii zwłaszcza dla pacjentów

w trakcie leczenia szpitalnego, a także tych z zaburzeniami czynności

immunologicznych są zakażenia Staphylococcusaureus opornym na leczenie

metycyliną (MRSA – MethycillinResistantStaphylococcusaureus) [4].

Najważniejszym punktem w terapii chorób bakteryjnych, powinna być jak

najwcześniejsza identyfikacja tego drobnoustroju oraz ustalenie jego

wrażliwości na leki. Ma to wpływ na wywołanie pozytywnego efektu

terapeutycznego. Pominięcie tego istotnego kroku i stosowania leków

o szerokim spektrum działania jest jednym z powodów nabywania przez

drobnoustroje antybiotykoodporności [5].

2. Cel pracy

Celem pracy jest omówienie problemuantybiotykoodporności drobno-

ustrojów, mechanizmów prowadzących do wytworzenia przez bakterie

oporności oraz ewentualnych działań mających na celu zniwelowanie

niniejszego zagrożenia dla dobra przyszłości cywilizacji.

3. Omówienie

3.1. Przyczyny prowadzące do powstania oporności bakterii na

terapię antybiotykową

Standardowo wyróżnia się antybiotykooporność wrodzoną oraz nabytą.

Oporność na antybiotyki wrodzona, jak sama nazwa wskazuje jest naturalna

i charakteryzuje się niewrażliwością niektórych bakterii na poszczególne

antybiotyki. Jest to zjawisko, które obserwuje się u większości bakterii Gram-

ujemnych, opornych na działanie penicylin pochodzenia naturalnego. Jest ono

spowodowane budową komórki drobnoustroju i poprzez to np. niemożliwe jest

wnikanie antybiotyku do wnętrza komórki bakteryjnej i oddziaływanie na nią.

Bakterie z opornością nabytą posiadają umiejętność przystosowania się do

środowiska w celu przeżycia w panujących warunkach. Jednym z takich

efektów przystosowawczych są mutacje bakterii pojawiające się

z częstotliwością 1 na 10-8-10

-9 podziałów chromosomalnych. W wyniku tych

przemian dochodzi do współzawodnictwa z innymi bakteriami, migracją czy

też zmianą środowiska, a to z kolei prowadzi do nabycia przez drobnoustroje

niewrażliwości na działanie antybiotykoterapii. W obecnej dobie, kiedy to

antybiotyki są szeroko stosowane także w sektorze rolno-spożywczym,

bakterie oporne na ich działanie, rozwijają się również poprzez spożywanie

przez ludzi produktów spożywczych pochodzenia zwierzęcego. U tych

zwierząt wdrożone zostało leczenie antybiotykami i nie zachowano po tej

Alicja Janicka, Anna Cwynar, Blanka Ziomkowska, Joanna Sikora, Emilia Siemińska

20

terapii okresu między zakończeniem podawania antybiotyków, a ubojem

zwierzęcia [6, 7, 8, 24].

To właśnie stosowanie w życiu codziennym antybiotyków i nieprze-

strzeganie okresów karencji jest głównym z powodów zwiększenia się ilości

patogenów opornych na działanie leków. Bardzo duże zagrożenie stanowią

doniesienia, mówiące o tym, że bakterie posiadające status bezpiecznych dla

człowieka (bakterie fermentacji mlekowej), mogą posiadać geny

odpowiedzialne za antybiotykooporność, które są w stanie przenieść się na

mikroorganizmy patogenne, poprzez m.in. transfer genów dzięki ruchomym

elementom DNA. Dodatkowym zagrożeniem może okazać się fakt, że np.

bakterie z rodzaju Lactobacillus, należące do grupy probiotyków, mogą

wytworzyć w swoich komórkach więcej niż jeden mechanizm antybiotyko-

odporności. Dlatego też bardzo istotnym krokiem jest poddanie bakterii

probiotycznych szerokim badaniom pod względem oporności na antybiotyki

oraz możliwości przenoszenia przez nie genów oporności poprzez transfer.

W dniu dzisiejszym po długoletniej, często syzyfowej, a także nadgorliwej

walce z bakteriami naukowcy z całego świata obawiają się, że może dojść do

sytuacji, gdzie oporność bakterii będzie tak duża, iż nie będą one wykazywać

wrażliwości na żadne antybiotyki [24, 25].

3.2. Mechanizmy prowadzące do nabywania

antybiotykoodporności przez komórki bakteryjne

Mutacja oraz horyzontalny transfer genów to dwa główne mechanizmy

nabywania przez drobnoustroje oporności [29]. Jeden z wymienionych

mechanizmów nabierania przez bakterie oporności na działanie anty-

biotyków – pionowy transfer genów, polega na tym, że bakterie obecne

w organizmie wrażliwe na antybiotykoterapię zostają w procesie leczenia

wyeliminowane, ustępując jednocześnie miejsca bakteriom opornym na

działanie tego medykamentu. Tak się dzieje w przypadku np. szczepu

Escherichia coli, kiedy to podczas leczenia streptomycyną jedna komórka

na ok 10-9

staje się oporna na ten antybiotyk. Mogłoby się wydawać, że

taka zmiana i uodpornienie się tak niewielkiej ilości bakterii nie powinno

mieć większego znaczenia dla organizmu. Biorąc jednak pod uwagę

szybkość z jaką bakterie się namnażają skala nowopowstałych

drobnoustrojów opornych jest ogromna [9‚11, 26, 29].

Bardzo niebezpieczną drogą prowadzącą do szerzenia się antybiotyko-

oporności jest kontakt zwierząt zdrowych ze zwierzętami, paszą czy

środowiskiem zakażonym opornymi bakteriami. Innymi słowy duży wpływ

na szerzenie się antybiotykooporności ma łańcuch żywieniowy. Człowiek

może zostać zarażony poprzez spożywanie pokarmów odzwierzęcych

(np. mleko, mięso), ale także poprzez bliski kontakt ze zwierzętami


21

(np. pies może zarazić człowieka gronkowcem opornym na metycylinę).

Bakterie poprzez umiejętność modyfikacji cząsteczki antybiotyku, potrafią

zmienić cel jego działania po czym przy pomocy pompy wypływowej

(zwiększa się wypływ antybiotyku, który już dostał się do wnętrza bakterii

dzięki tak zwanemu systemowi efflux(ang. efflux pumps of multi-drug

resistance) usunąć antybiotyk z własnej komórki. Jest to mechanizm dzięki

któremu, bakterie stają się niewrażliwe na działania antybiotyków. Są także

w stanie zakłócić wchłanianie antybiotyku przez ścianę komórkową

bakterii, zmienić jej strukturę oraz strukturę białek (poryn) jako kanałów,

które umożliwiają antybiotykom penetracje wnętrza bakterii Gram-

ujemnych w przypadku grupy aminoglikozydów [12, 13,15, 16, 24].

Poziome przenoszenie genów oporności z komórki bakteryjnej opornej,

na komórki bakteryjne wrażliwe w procesach transformacji, transdukcji

oraz koniugacji to kolejny mechanizm nabywania przez bakterie oporności.

Transformacja polega na przejęciu materiału genetycznego ze środowiska

zewnętrznego przez bakterię, najczęściej z pozostałości po martwej

bakterii. Koniugacja zachodzi w trakcie kontaktu bakterii i przekazaniu

sobie DNA w postaci plazmidu. Do transdukcji natomiast przyczyniają się

bakteriofagi, które przenoszą DNA między bakteriami najczęściej tego

samego rodzaju. Główną rolę w przenoszeniu genów oporności między

bakteriami odgrywają wspomniane już plazmidy, często także transpozony

oraz integrony rozmieszczone zarówno na plazmidach jak i w chromo-

somach, dla których charakterystyczną cechą jest zdolność dodawania

i usuwania kodujących sekwencji z ruchomej kasety [9, 10, 11, 26, 29].

Enzymatyczna inaktywacja antybiotyku przez enzymy produkowane

przez bakterie oporne to kolejny bardzo niebezpieczny mechanizm

antybiotykoodporności. Najszerzej poznanymi (ze względu na częstość

używania antybiotyków β-laktamowych) enzymami są β-laktamazy. Ich

mechanizm działania polega na niszczeniu aktywności antybiotyku poprzez

hydrolizowanie wiązania między węglem a azotem (C-N), który jest

zlokalizowany w pierścieniu β-laktamowym antybiotyków z tej grupy

(np. penicyliny, karbapenemy, cefalosporyny). Przykładem bakterii posia-

dającej takie właściwości jest Pseudomonas aeruginosa, czyli pałeczka

ropy błękitnej [14, 26, 29].

4. Możliwości postępowania w terapiach chorób z udziałem

bakterii opornych na działanie antybiotyków

Jedną ze strategii postępowania z antybiotykoopornością bakterii jest

poszukiwanie nowych antybiotyków, mających wykazywać niszczące

działanie na oporne szczepy. Często antybiotyki z grupy β-laktamów łączy

się w preparatach z kwasem klawulanowym, sulbaktamem, czy też


22

tazobaktamem, które mają spełniać rolę ochronną, poprzez umiejętność

hamowania produkcji enzymów – β-laktamaz [17, 26].

Cekropiny oraz sapecyny należą do polipeptydów kationowych

pozyskiwanych z owadów. Stwarzają one także możliwość alternatywnego

wykorzystania ich w terapii chorób bakteryjnych. Ich dodatkowym atutem

jest absolutny brak oddziaływania na organizm człowieka jak i zwierzęcia,

przez co nie wywołują skutków ubocznych [23].

W związku z coraz szerzej występującym zjawiskiem antybiotyko-

odporności podejmuje się także wdrożenie alternatywy dla antybiotyków

w postaci terapii przy pomocy bakteriofagów. Fagi działają wybiórczo na

konkretne gatunki bakterii, nie uszkadzając naturalnej flory bakterii

potrzebnych organizmowi (np. bakterie jelitowe). Między bakteriami,

a fagami nie obserwuje się oporności krzyżowej, dzięki czemu

w przypadku oporności na fagi dodatkowo można zastosować antybiotyk,

ponieważ wytworzenie mechanizmu obronnego bakterii równocześnie na

faga i antybiotyk jest niskie. Możliwe jest także wytworzenie super-

bakteriofaga, charakteryzującego się zdolnością do niszczenia jednocześnie

przynajmniej kilku szczepów lub gatunków bakterii. Jednak jak każda

metoda i ta posiada swoje ograniczenia do których zalicza się m.in. ewentu-

alną replikacje fagów w leczonym organizmie i możliwość negatywnego

oddziaływania na komórki zainfekowane bakteryjnie np. szczepienia mogą

nie przynosić efektu uodparniającego [4, 18, 19, 20, 21, 22].

5. Podsumowanie

Antybiotyki często określane mianem „cudownych leków” są substan-

cjami chemicznymi, które zabijają lub hamują wzrost bakterii poprzez,

zahamowanie syntezy ścian komórkowych bakterii, lub hamowanie

produkcji białek, RNA czy DNA.

Po odkryciu przez Fleminga penicyliny i jej dobroczynnych właściwości

w początkowym okresie wydawało się, że już niewielkie jej dawki są

w stanie zwalczyć infekcje bakteryjne, jednak w miarę upływu czasu efekty

nie były już tak spektakularne. Wtedy już, był to jeden z pierwszych

przykładów antybiotykoodporności jako reakcji obronnej bakterii na

działanie penicyliny, jako leku podawanego do organizmu w celu

zwalczenia infekcji. To ważne spostrzeżenie ze względu na fakt, że

zjawisko nabywania oporności jest procesem w pełni naturalnym i tak jak

w przypadku penicyliny, produkowanej głównie przez grzyby w celu

ochrony przed bakteriami nie powinno wzbudzać większego zdziwienia,

a raczej być przedmiotem badań nad uczynieniem oporności łatwiejszej do

kontrolowania [27, 28].


23

Niestety w głównej mierze to właśnie człowiek przyczynił się do

powstania zjawiska antybiotykoodporności, bez umiejętności pełnej jej

kontroli, poprzez nadużywanie tych leków w różnych sektorach zarówno

medycznym pacjent-lekarz, jak i w sektorze rolnym. Przykładów można by

wymieniać wiele np. intuicyjne podparte na doświadczeniu lekarza

przepisywanie antybiotyku, bez wykonania antybiogramu, nawet jeśli

objawy występujące u chorego są efektem działania wirusów. Kolejnym

przykładem jest odstawienie przez pacjentów leku niedługo po ustąpieniu

objawów choroby takich jak gorączka lub też zbyt niskie stężenie stoso-

wanego medykamentu (niemożliwe jest osiągnięcie stężenia terapeu-

tycznego leku) co utrudnia pozbycie się bakterii i wytwarza u nich

oporność. W sektorze rolniczym natomiast największym problem jest

nadużywanie antybiotyków nie tyle w celu terapeutycznym, ale co przera-

żające, aż 80% jest wykorzystywana w celu profilaktycznym. Podawanie

antybiotyków zwierzętom hodowlanym powoduje ich szybki wzrost

i osiągnięcie znacznie większej masy, co z kolei przekłada się na zwięk-

szoną produkcje mięsa, a co za tym idzie – wyższe dochody [30, 31, 32].

W walce z opornością bakterii na antybiotyk w celu zapobiegnięcia

powstania „superbakterii”, wymagane są działania w skali globalnej. Mowa

tu o racjonalnym gospodarowaniu antybiotykami, to znaczy używaniu ich

jako substancji leczniczych w terapii ludzi i zwierząt, zminimalizowanie

ich użycia w sektorze rolniczym i całkowite wykluczenie ich używania jako

dodatku do pasz w celu np. przyspieszonego wzrostu masy ciała zwierząt. Już

te zabiegi znacząco zminimalizowałyby szerzenie się oporności bakterii na

antybiotyki co mogłoby zaowocować lepszym zdrowiem oraz wyelimino-

waniem zagrożenia jakim może stać się wyczerpanie możliwości leczenia

chorób o podłożu bakteryjnym [30].

W związku z nadużywaniem stosowania antybiotyków, zrodziła się

potrzeba promowania wiedzy na temat tych leków. Pierwszy na świecie

Światowy Tydzień Wiedzy o Antybiotykach, organizowany przez WHO,

odbył się między 16, a 22 listopada 2015 roku. Walka z antybiotykoopornością

jest priorytetowym zagadnieniem dla m.in. Światowej Organizacji Zdrowia,

Komisji Europejskiej, FDA, czy też dla Parlamentu Europejskiego.


24

Literatura

1. Angulo F. J., Nunnerz. A., Bair H. D. Ł., Antimicrobial resistance in zoonotic

enteric pathogens, Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epis. 23 (2004), 485-496

2. WHO,Containing of antimicrobial resistance: review of literature and report

of a WHO workshop on the development of a global strategy for the

containment of antimicrobial resistance, 4-5 February 1999, Geneva, WHO

Geneva, pp. 1-34

3. Tacconelli E., De Angelis G., Cataldo M.A., Pozzi E., Cauda R., Does

antibiotic exposure increase the risk of methicillin-resistant Staphylococcus

aureus (MRSA) isolation? A systematic review and meta-analysis. J.

Antimicrob. Chemother. 61 (2008), 26-38

4. Srinivasan A., Dick J. D., Perl T. M., Vancomycin resistance of staphylococci,

Clin. Mirobiol. Rev. 15, (2002), 430-438

5. Barza M., Trawers K., Excess infections due to antimicrobial resistance

to attributable infections, Clin. Infect. Dis. 34, (2002), 5126-5130

6. Denamur E., Matic I., Evolution of mutation rates in bacteria, Mol. Microbiol.

60, (2006), 820-827

7. Albrich W. C., Monnet D. L., Harbarth S., Antibiotic selection pressure

and resistance in Streptococcus pneumoniae and Streptococcus pyogenes,

Emerg. Infect. Dis. 10, (2004), 514-517

8. Szczypta K., AntybiotykoopornośćStreptococcuspyogenes, Diagnostyka

laboratoryjna, Laboratorium 3-4, (2015), 35-3

9. Martínez J. L., Antibiotics and antibiotic resistance genes in natural

environments, Science131, (2008), 365-367

10. Tsubokura M., Matsumoto A., Otsuki K., Animas S. B., Sanekata T., Drug

resistance and conjugative R plasmids in Escherichia coli strains isolated

from migratory waterfowl, J. Wildlife Dis. 31, (1995), 352-357

11. Alekshun M., Levy S. B., Molecular mechanisms of antibacterial multidrug

resistance, Cell128, (2007), 1037-1050

12. Mathew A. G., Cissell R., Liamthong S., Antibiotic resistance in bacteria

associated with food animals: a United States perspective of livestock

production, Foodborne Pathog. Dis. 4, (2007), 115-133

13. Damborg P., Top J., Hendrickx A. P., Dawson S., Willems R. J., Guardabassi

L., Dogs are a reservoir of ampicillin-resistant Enterococcus faecium lineages

associated with human infections, Appl. Environ. Microbiol. 75, (2009), 2360-

2365

14. Savjani J. K., Gajjar A. K., Savjan, K. T., Mechanisms of resistance: useful

tool to design antibacterial agents for drug – resistant bacteria, MiniRevews.

Med. Chemistry 9, (2009), 194-205

15. Bruin de M. A., Riley L. W., Does vancomycin prescribing intevention affect

vancomycinresistant enterococcus infection and colonization in hospitals?

A systematic review, BMC Infect. Dis. 10, (2007), 7-24

16. Li X., Nikadio H., Efflux-mediated drug resistance in bacteria: an update,

Drug 69, (2009), 1555-1623


25

17. Singh G., Kapoor I. P., Pandey S. K., Singh U. K., Singh R. K., Studies

on essential oils: part 10; Antibacterial activity of volatile oils of some spices,

Phytother. Res. 16, (2002), 680-682

18. Cao J., Sun Y., Berglindh T., Mellgard B., Li Z, Mardh B., Mardh S.,

Helicobacter pyloriantigen- binding fragments expressed on the filamentous

M13 phage bacterial growth, Biochem.Biophys. Acta 1474, (2000), 107-113

19. Carlton M., Phage therapy: past history and present prospects, Arch.

Immunol. Ther. Exp.47, (1999), 267-274

20. Boyd E. F., Davis B. M., Hochhut B., Bacteriophage – bacteriophage

interactions in the evolution of pathogenic bacteria, Trends Microbiol.

9, (2001), 137-144

21. Mathur M. D., Vidhani S., Mehndiratta P. L., Bacteriophage therapy: an

alternative to conventional antibiotics, J. Ass. Physicians 51, (2003), 593-596

22. Weber-Dąbrowska M., Mulczyk M., Górski A., Bacteriphage therapy of

bacterial infections: an update of our Institute‘s experiments, Arch. Immunol.

Ther. Exp. 48, (2000), 547-551

23. Gliński Z., Kostro K., Chełmiński M., Polipeptydy przeciwdrobnoustrojowe

owadów alternatywą w leczeniu zakażeń zwierząt, ludzi i roślin, Życie Wet.

81, (2006), 31-35

24. Rzepkowska A., Zielińska D., Kołożyn-Krajewska D., Antybiotykooporność

bakterii z rodzaju Lactobacillus pochodzących z żywności, jako kryterium

stawiane probiotykom, Zeszyty problemowe postępów nauk rolniczych 578,

(2014), 99-110

25. WHO, Antimicrobial resistance: global report on surveillance, WHO Library

Cataloguingin-Publication Data, (2014), 1-256

26. Wolska K., Kot B., Piechota M., Frankowska A., Oporność

Pseudomonasaeruginosa na antybiotyki, Post.Hig. Med. Dośw.; 67, (2013),

1300-1311

27. Purdom G., Antibiotic Resistance of Bacteria: An example of Evolution in

Action?,Answers, 2:3, (2007), 74-76

28. Todar K., Bacterial Resistance to Antibiotics, Lectures in Microbiology, 2009

29. Marciniak P., Oporność bakterii na antybiotyki, Gazeta farmaceutyczna. 12,

(2008), 30-32

30. Hryniewicz W., Grzesiowski P., Narodowy Program Ochrony Antybiotyków

w Polsce, Chrońmy antybiotyki, 2005

31. Khachatourians G. G., Agricultural use of antibiotics and the evolution and

transfer of antibiotic-resistant bacteria, Canadian MedicalAssociation. 159,

(1998), 1129-1136

32. Wise R., Hart T., Cars O., Streulens M., Helmuth R., Huovinen P., Sprenger

M., Antimicrobial resistance is a major threat to public health, 317, (1998),

609-610


26


Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) poziom antybiotykooporności zarówno

w Państwach Unii Europejskiej jak i poza nią jest ogromnym problemem zdrowotnym

społeczeństwa i dotyczy coraz to większej liczby osób. Antybiotykooporność stanowi bardzo

poważne zagrożenie zdrowotne na całym świecie – zwłaszcza oporność na tak zwane antybiotyki

ostatniej szansy. Tworzenie nowych antybiotyków jest procesem długotrwałym i pracochłonnym.

Przy obecnym nadużywaniu ich, może okazać się, że leczenie najprostszych zakażeń krwi, skóry

czy dróg oddechowych będzie nieskuteczne, a infekcje te staną się śmiertelne. Istotnym krokiem

w walce z drobnoustrojami jest zarówno uświadomienie społeczeństwa o zagrożeniach płynących

z nadużywania antybiotyków, jak i poznanie mechanizmów rozwoju oporności przez bakterie

i opracowanie skutecznych strategii w walce z nimi.

Antibiotic resistance – a serious problem of modern civilization

According to the World Health Organization (WHO) the level of antibiotic resistance in

European Union Countries and beyond is a huge health problem of a population and affects more

and more people. Antibiotic resistance is a serious risk for health for whole world – especially

resistance to antibiotics known as antibiotics of last resort. Creation of new antibiotics is a process

that takes time and is very laborious. With the current situation of abusing the antibiotics it may

occur that the simplest treatment of blood infections, skin or respiratory system is ineffective, and

the infections become fatal. A very important step in the fight against microorganisms is both

educate the public about the danger of overuse of antibiotics, as well as understand the

mechanisms of the development of resistance by bacteria and develop effective strategies to

combat them.

27

Joanna Woźniak1, Natalia Dereń

2, Edyta Simińska

3

Mechanizmy wnikania koronawirusów

do komórek gospodarza

1. Wstęp

Koronawirusy (ang. Coronaviruses, CoVs) należą do wirusów RNA.

Pochodzą z podrodziny Coronavirinae, a wraz z Torovirinae należą do

dużej rodziny Coronaviridae, rzędu Nidovirales. Podrodzina Coronavirinae

została podzielona na podstawie cech genetycznych na różnerodzaje: alfa-,

beta- gamma, a także delta-koronawirusy, przy czym do gatunków

zakażających ludzkie organizmy należą alfa- i beta-koronawirusy [1].

Koronawirusy należą do jednych z największych wirusów RNA pod

względem długości genomu oraz wielkości wirionu. Jego wielkość waha

się od 80 do 120nm. Wirusowe RNA od strony końca 5’zajmuje gen

kodujący 4-5 białek strukturalnych, 15-16 niestrukturalnychoraz 1-8 białek

dodatkowych [2]. Wielkość genomu koronawirusów waha od 26,2 do 31,7

kb oraz zawiera od 6 do 10 otwartych ramek odczytu (ang. open

readingframe, ORF). Pierwsza ORF (ORF1a / b) koduje białka replikazy

i zawiera w przybliżeniu 2/3 genomu CoV. Pozostała 1/3 zawiera cztery

geny białek strukturalnych: białko S (białko odpowiedzialne za interakcję

z receptorem na powierzchni komórek, tzw. „Spike”), białko E (białko

otoczki), białko M (białko błonowe, zwane również białkiem macierzy)

oraz białko N (białko nukleokapsydu). Białka M i E są odpowiedzialne za

składanie wirusa, podczas gdy białko S pozwala na wniknięcie wirusa do

komórki gospodarza, tym samym pełniąc kluczową rolę z punktu widzenia

niniejszej publikacji.Ostatnie białko – N – jest odpowiedzialne za mody-

fikację procesów komórkowych oraz bierze udział w replikacji kapsydu

wirusowego RNA. Ponadto, niektóre z koronawirusówmogą także zawierać

w genomie kodowane dodatkowe białka, HE (hemaglutynina-esteraza),

a więc białka wirusowe, któresą znane jako białka odpowiedzialne za

interakcję wirusów z komórką gospodarza [3]. Celem niniejszej pracy jest

[email protected], Zakład Genoterapii, Uniwersytet Mikołaja Kopernika Collegium

Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy, wydział lekarski [email protected], Katedra Położnictwa, Zakład Medycyny Rozrodu

i Andrologii,Uniwersytet Mikołaja Kopernika Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera

w Bydgoszczy, wydział nauk o zdrowiu [email protected], Katedra i Zakład Toksykologii, Uniwersytet Mikołaja Kopernika

Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy, wydział farmaceutyczny


28

przedstawienie mechanizmów wnikania koronawirusów przez błonę

komórkową gospodarza.

2. Ludzkie koronawirusy – charakterystyka ogólna

Koronawirusy są w stanie zainfekować wiele różnych gatunków ptaków

i ssaków. Infekcje CoVsdotyczą zwłaszcza układu oddechowego

i pokarmowego wśród ssaków i ptaków. W niewielu przypadkach

omawiane wirusy są przyczyną zapalenia wątroby i różnych chorób

neurologicznych [4]. Podczas, gdy pierwsze wzmianki o koronawirusach

sięgają 1930 roku [5], zyskały one sławę w 2003 roku jakoprzyczyna

zespołu ostrej ciężkiej niewydolności oddechowej (ang. severe acute

respiratory syndrome, SARS) [6]. Wirus wywołujący SARS, SARS-CoVto

ludzki koronawirus o pojedynczej dodatniej nici RNA, o genomie wiel-

kości 27-31kb i ogonem poli-A na końcu 3'. W latach 2002-2003 SARS-

CoV spowodował prawie 8000 zakażeń, a wskaźnik śmiertelności wyniósł

aż 10% [7].

Wysoce niebezpieczny jest także koronawirusMERS (ang. middleeast

respiratory syndrome – CoronaVirus, MERS-CoV), który został po raz

pierwszy zidentyfikowany w Arabii Saudyjskiej w 2012 roku. Najnowsze

doniesienia Światowej Organizacji Zdrowia (ang. World Health Organization,

WHO) z 4 grudnia 2015 roku podają że dotychczas odnotowano 1621

laboratoryjne potwierdzonych przypadków zakażenia wirusem MERS,

o śmiertelności wynoszącej blisko36%. Było to odpowiednio 584 zgonów

związanych z MERS-CoV [8]. Dlatego też badania nad koronawirusamimogą

mieć istotny wpływ nie tylko na wskaźniki zdrowotne, ale także ekonomiczne.

2.1. Białko S jako główny czynnik odpowiedzialny za wnikanie

koronawirusa przez błonę komórki

Białko S odgrywa niezwykle istotną rolę w procesie wnikania

koronawirusa do komórki gospodarza, ponieważ wchodzi w interakcje

z białkami gospodarza na błonie komórkowej. Dochodzi następnie do

wnikania wirusowego nukleokapsydu, co spowodowane jest konformacją

białka S [9].

Białko S to białko transmembranoweklasy I o typowym rozmiarze

w zakresie od 1160 do 1400 aminokwasów. Zawiera on 21-35 miejsc

N-glikozylacji. Białka S koronawirusów mają tendencję do wiązania się

wtrimery na powierzchni wirionu. To właśnie z tego powodu koronawirusy

zyskały nazwę rodziny. Przedrostek „korona” (łac. corona), nawiązuje do ich

charakterystycznego wyglądu pod mikroskopem elektronowym [10].

Jako jedno z białek klasy I, białko S składa się z trzech segmentów:

zewnętrznego, transmembranowego i krótkiego ogona wewnątrzkomórkowego

Mechanizmy wnikania koronawirusów do komórek gospodarza

29

[11]. Segment zewnętrzny białka S zawiera 2 domeny: S1 (N-końcowa), która

jest odpowiedzialna za wiązanie z receptorem, a następnie wnikanie przez

błonę komórkową, a także S2 (C-końcową), stanowiącą najbardziej

konserwatywny region białka S. Podjednostka S2 składa się z domen

uczestniczących w fuzji błon: peptydu fuzyjnego (ang. fusion peptide, FP),

hydrofobowych domen-1 i -2 (ang. heptadrepeat domains HR1, HR2)

i domeny transbłonowej (ang. transmembrane domain, TM) [10]. Powszechnie

domeny białka S pozostają połączone w przypadku alfa- i większości z beta-

koronawirusów. Jednakże w przypadku gamma-, a także w u niektórych

betakoronawirusach białko S jest przecinane pomiędzy tymi domenami.

Domena S1 składa się z dwóch niezależnych subdomen: N-końcowej (S1-

NTD) oraz C-końcowej (S1-CTD). Obie posiadają zdolność wiązania

cząsteczek, takich jak cukry lub domeny wiążące receptory (ang. receptor

binding domains, RBD) [9].

Casaisi wsp. wykazali znaczenie białka S w przypadku tropizmu

komórkowego. Postanowili użyć rekombinowanego wirusa zakaźnego

zapalenia oskrzeli, szczep Beaudette, (ang. infectious bronchitis virus, IBV),

członka rodzinyCoronaviridae, który replikuje się głównie w drogach

oddechowych, a także w komórkach nabłonkowych nerek. Typowa dla

szczepów IBV jest infekcja tylko komórek zarodków kurzych. Postanowili

więc wyprodukować rekombinowaną wersję wirusa,rIBV, w którym zastąpili

białko S szczepu Beaudette na odpowiadający mu gen kodujący białko S ze

szczepu IBV M41-CK. Szczep IBV Beaudette jest w stanie rozmnażać się

w komórkach CK, CEF, BHK-21, a także w Vero. W przeciwieństwie do IBV

Beaudette, IBV M41-CK może rozmnażać tylko w komórkach CK. Różnice te

dały możliwość badania mechanizmu tropizmu komórkowego. W rezultacie,

otrzymany BeauR-M41 posiadał taki sam tropizm komórkowy jaki

występował w przypadku IBV M41-CK. To doświadczenie wykazało, że

białka S są z pewnością odpowiedzialne za tropizm komórkowy [12].

2.2. Białko N jako cząsteczka wirulencji

Białko nukleokapsydu jest białkiem wiążącym RNA, które wchodzi

w interakcję z białkiem M podczas składania wirionów. Jest także zaanga-

żowanew tworzeniu kapsydu wirusa i odgrywa ważną rolę w replikacji

[13]. Białko N wiąże się przede wszystkim zarówno z mRNA genomowym

i subgenomowym oraz z mikrotubulami. Ponadto białko N wykazuje

aktywność L RNazy, będąc antagonistą interferonu typu I (IFN) [14].

Białko nukleokapsydu składa się z dwóch domen: N-końcowej

(N-NTD) oraz C-końcowej (N-CTD). Posiada również 3 konserwatywne

regiony (I, II, III), które są odłączane w regionach A i B. Region II jest

odpowiedzialny za wiązanie RNA, natomiast region III odgrywa ważną


30

rolę w wiązaniu białka M [13]. Domenę NTD rozpoczyna konserwatywny

region I, natomiast zakończona jest regionem II. Natomiast domena CTD

znajduje się wewnątrz konserwatywnego regionu II i kończy się tuż przed

obszarem B [15].

Cowely i wsp. postanowili zbadać rolę białka N w chorobie wywołanej

przez wirus zapalenia wątroby u myszy (ang. Mouse hepatitis virus,MHV)

wśród szczepów A59 i JHS. Badania były oparte na fakcie, że prawie 95%

sekwencji aminokwasowych w białkach N tych szczepów jest identyczne.

Badacze użyli dwóch chimerycznych wirusów, między którymi dokonano

wymiany białek nukleokapsydu między szczepami A59 i JHS. W rezultacie

nie zaobserwowano żadnych zmian morfologicznych w porównaniu ze

szczepem dzikim. Jednakże zaobserwowano istotne zmiany dotyczące

wirulencji, ponieważ zauważono istotne statystycznie różnicepodczas

replikacji wirusów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Co

ciekawe,znacznie większą ekspresję antygenu w mózgu zauważono

w przypadku, gdy zastosowano chimerę A59 z białkiem N pochodzącym ze

szczepu JHS [16].

2.3. Receptory koronawirusów

Pierwszym etapem infekcji komórki gospodarza jest rozpoznanie

receptora przez wirus. Jak opisano powyżej, białko S jest odpowiedzialne

za wiązanie do swoistego receptora na powierzchni komórki, a następnie

fuzjędo komórki gospodarza [10, 17]. W kolejnym ważnym etapie infekcji

biorą udział RBD oraz receptory.

Koronawirusy są zdolne do wiązania wielu różnych receptorów.

Inhibitory enzymu konwertującego angiotensynę 2 (ang. angiotensin

converting enzyme 2, ACE-2), to charakterystyczny receptor dla ludzkiego

wirusa wywołującego SARS [18]. ACE-2 reguluje funkcje układu

sercowo-naczyniowego [19, 20].

Kolejnym receptorem jest aminopeptydaza N (APN), znana również

jako CD13.Jest to ektopeptydaza, której działanie zależne jest od cynku. W

efekcie APN odpowiedzialna jest za odczepianie białek od N-końca

peptydu. APN to białko transbłonowe typu II, z którym związane jest wiele

funkcji, takich jak odczuwanie bólu, regulacja ciśnienia krwi, ale

równieżangiogeneza, chemotaksja oraz adhezja komórek [21]. Do

rozpoznawania APN zdolne są dwa CoVs: TGEV (ang. transmissible

gastroenteritis virus), który infekuje komórki jelita cienkiego i dróg

oddechowych, oraz PRCoV (ang. porcine respiratory CoronaVirus) [22].

Molekuła adhezji komórkowej antygenu karcynoembrionalnego 1, (ang.

carcino embryonic antigen-related cell adhesion molecule 1, CEACAM1)

jest cząsteczką adhezji komórkowej, która występuje na leukocytach,


31

nabłonka i śródbłonka. Jest ona odpowiedzialna za apoptozę, rozwój naczyń,

a także indukcję odpowiedzi immunologicznej [23].

Dipeptydylopeptydaza-4 (DPP4), będąca egzoproteazą, odgrywa ważną

rolę w procesach fizjologicznych poprzez usuwanie aminokwasów

z N-końcaz wielu peptydów, w tym hormonów, neuropeptydów, chemokin

i mitogennych czynników wzrostu [23].

Niektóre koronawirusy, na przykład atenuowany wirus zakaźnego

zapalenia oskrzeli ptaków (ang. infectious bronchitis virus, IBV), wiążą

cukry, które odgrywają istotną rolę w rozmaitych procesach biologicznych,

takich jak interakcje międzykomórkowe czy w przypadku procesów

związanych z regulacją układu odpornościowego [24].

Niestety powyższe przykłady nie potrafią odpowiedzieć na pytanie

którekoronawirusy są w stanie rozpoznać jakie specyficzne receptory. Nie

znaleziono dotychczas reguły dotyczącej sposobów rozpoznania swoistych

receptorów. Podobne CoVs z tych samych rodzajów potrafią rozpoznawać

różne receptory, np. MERS-CoV i SARS-CoV należą do beta-korona-

wirusów, ale ich S1CTDs wiążą odpowiednio DPP4 i ACE-2 [25, 26].

Z drugiej strony, niektóre CoVs z różnych rodzajów, są zdolne do

rozpoznawania tego samego receptora, np NL63-CoV należy do alfa-

koronawirusów, natomiast SARS-CoV należy do beta-koronawirusów.

Jednakże ich S1-CTDs wiążą ACE-2 [27].

2.4. Mechanizmy wnikaniakoronawirusów do komórek

gospodarza

Po związaniu ze specyficznymi receptorami wirusy dochodzą do etapu

fuzji z błoną gospodarza, aby następnie dostarczyć swój genom do komórki

gospodarza.

Istnieją dwie główne drogi infekcji. Pierwszy z nich, pH-niezależny,

zachodzi w przypadku wirusów, otoczonych błoną lipidową, która zawiera

białko fuzyjne. W tym mechanizmie dochodzi do tzw. fuzji otoczki

lipidowej z błoną komórkową komórki docelowej, dzięki czemu wirus

wnika do jej wnętrza. Jednakże, wiele koronawirusówwybieradrugi

z mechanizmów – endocytozę – jako sposób na wniknięcie do komórki

gospodarza. W tym procesie kluczowy etap odbywa się w endosomach,

a cały proces uzależniony jest od niskiego pH. Równie istotne są reakcje

redoks, a także aktywności proteolityczne, aby doszło do zmian

w konformacji białek wirusowych, które w konsekwencji doprowadzą do

fuzji osłonki wirusa i błony komórkowej gospodarza. Taki mechanizm

umożliwia ścisłą kontrolę nad fuzją poprzez ochronę miejsca cięcia przed

przedwczesną proteoliząumożliwiając efektywną reakcję dopiero po

związaniu się z receptorem na komórkach docelowych [28].


32

Komórkowa endocytozamoże odbywać się zarówno na szlaku klatryno-

zależnym, kaweolozależnym, jak i również niezależnym od klatryny lub

kaweoli. Wiele badań wykazało natomiast, że wirusy mogą wykorzystać

więcej niż jedną drogę wejścia do komórki gospodarza [29].

3. Podsumowanie

Koronawirusy są jednymi z największych wirusów RNA, które

wykształciły różne mechanizmy wnikania do komórek gospodarza.

Najbardziej kluczową molekułą w tym procesie wydaje się być białko S.

Niemniej istotne jest również białko N, stanowiące cząsteczkę, która

odpowiada za wirulencję. Po rozpoznaniu swoistego receptora przez wirus

następuje fuzja z błoną gospodarza, a następnie dostarczenie genomu

wirusa do komórki gospodarza. Najczęściej odbywa się do na zasadzie

endocytozy klatryno- lub kaweolozależnej, jak i również niezależnej od

klatrynylub kaweoli. Poznanie szczegółowych mechanizmów wnikania

koronawierusów do komórek gospodarza wydaje się kluczowe w celu

projektowania przyszłych strategii skierowanymi przeciwko CoVs.

Literatura

1. Hamre D., Procknow J. J., A new virus isolated from the human

respiratorytract, Proc SocExpBiol Med., 121: (1966), s. 190-193

2. Perlman S., Netland J., Coronaviruses post-SARS: update on replication

and pathogenesis, Nat Rev Microbiol 7: (2009), s. 439-450

3. Enjuanes L.,Almazan F., Sola I., Zuniga S., Biochemical aspects

of coronavirus replication andvirus-host interaction, Annu. Rev. Microbiol,

60: (2006), s. 211-230.

4. Weiss S. R., Navas-Martin S., Coronavirus pathogenesis and the emerging

pathogen severe acute respiratory syndrome coronavirus, Microbiol. Mol.

Biol. Rev., 69: (2005), s. 635-664

5. Hudson C. B., Beaudette F. R. Infection of the cloaca with the virus

of infectious bronchitis, Science, 76:(1932), s. 34

6. Peiris J. S., Guan Y., Yuen K. Y., Severe acute respiratory syndrome,

Nat Med., 10: (2004), s. 88-97

7. Ziebuhr J., Molecular biology of severe acute respiratory

syndromecoronavirus, Curr. Opin. Microbiol., 7: (2004), s. 412-419

8. http://www.who.int/csr/don/4-december-2015-mers-saudi-arabia/en/

– (04.12.2015)

9. Belouzard S., MilletJ. K., LicitraB. N., Whittaker G. R., Mechanisms

of Coronavirus Cell Entry Mediated by the Viral Spike Protein, Viruses 4:

(2012), s.1011-1033

10. Bosch B. J.,Van der Zee R., de Haan C. A., Rottier P. J., The coronavirus

spike protein is a class I virus fusion protein: Structural and functional

characterization of the fusion core complex, J. Virol.,77: (2003), s. 8801-8811


33

11. Li F., Berardi M., Li W. H., Farzan M., Dormitzer P. R., Harrison S.

C.,Conformational states of the severe acute respiratory syndrome

coronavirus spike protein ectodomain, J.Virol., 80: (2006), s. 6794-6800

12. Casais R., Dove B., Cavanagh D., Britton P., Recombinant Avian Infectious

Bronchitis Virus Expressing a Heterologous Spike Gene Demonstrates that the

Spike Protein Is a Determinant of Cell Tropism, J. Virol., : (2003), s. 9084-9089

13. Hurst K .R., Kuo L., Koetzner C .A., Ye R., Hsue B., Masters P. S., A major

determinant for membrane protein interaction localizes to thecarboxy-

terminal domain of the mouse coronavirus nucleocapsid protein, J. Virol.,

79: (2005), s. 13285-13297

14. Ye Y., Hauns K., Langland J. O., Jacobs B. L., Hogue B. G.,Mouse

hepatitis coronavirus A59 nucleocapsid protein is a type I interferon

antagonist, J. Virol., 81: (2007), s. 2554-2563

15. Saikatendu K. S., Joseph J. S., Subramanian V., Neuman B. W., Buchmeier

M. J., Stevens R. C., Kuhn P., Ribonucleocapsid formation of severe acute

respiratory syndrome coronavirus through molecular action of the N-terminal

domain of N protein, J. Virol., 81:(2007), s. 3913-3921

16. Cowley T. J., Long S. Y., Weiss S. R, The Murine Coronavirus Nucleocapsid

Gene Is a Determinant of Virulence, J. Virol., (2010), s. 1752-1763

17. Spaan W., Cavanagh D., Horzinek M. C., Coronaviruses: structure and

genome expression, J. Virol., 69: (1988), s. 2939-2952

18. Towler P., Staker B., Prasad S. G., Menon S., Tang J., Parsons T., Ryan D.,

Fisher M., Williams D., Dales N. A., Patane M. A., Pantoliano M. W., ACE2

X-ray structures reveal a large hinge-bending motion important for inhibitor

binding and catalysis, J. Biol. Chem., 279: (2004), s. 17996-18007

19. Keidar S., Kaplan M., Gamliel-Lazarovich A., ACE2 of the heart: from

angiotensin I to angiotensin (1-7), Cardiovasc. Res., 73: (2007), s. 463-469

20. Boehm M., Nabel E. G., Angiotensin-converting enzyme 2–a new cardiac

regulator, N. Engl., J. Med., 347: (2002), s. 1795-1797.

21. Mina-Osorio P.,The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to

target, Trends Mol. Med., 14: (2008), s. 361-371

22. Schultze B., Krempl C., Ballesteros M. L., Shaw L., Schauer R., Enjuanes L.,

Herrler G., Transmissible gastroenteritis coronavirus, but not the related

porcine respiratory coronavirus, has a sialic acid (N-glycolylneuraminic acid)

binding activity, J. Virol.,70: (1996), s. 5634-5637

23. Tan K., Zelus B .D., Meijers R., Liu J. H, Bergelson J. M, Duke N., Zhang

R.,Joachimiak A., Holmes K. V., Wang J. H., Crystal structure of murine

sCEACAM1a[1 ,4]: a coronavirus receptor in the CEA family, EMBO J.,

21(9): (2002), s. 2076-2086

24. Ghazarian H., Idoni B., Oppenheimer S., A glycobiology review:

Carbohydrates, lectins and implications in cancer therapeutics,

ActaHistochemica, 113:(2011),s. 236-247

25. Raj V. S., Mou H., Smits S. L., Dekkers D. H., Müller M. A., Dijkman R.,

Muth D., Demmers J. A., Zaki A., Fouchier R. A., Thiel V., Drosten C.,

Rottier P. J., Osterhaus A. D., Bosch B. J., Haagmans B. L.,Dipeptidyl


34

peptidase 4 is a functional receptor for the emerging human coronavirus-

EMC,Nature,14: (2013),s. 251-254

26. Mou H., Raj V. S., Van Kuppeveld F. J., Rottier P. J., Haagmans B. L., Bosch

B. J., The receptor binding domain of the new Middle East respiratory

syndrome coronavirus maps to a 231-residue region in the spike protein that

efficiently elicits neutralizing antibodies, J.Virol.,87: (2013), s. 9379-9383

27. Lin H. X., Feng Y., Wong G., Wang L., Li B., Zhao X., Li Y., Smaill F.,

Zhang C.,Identification of residues in the receptor-binding domain (RBD)

of the spike protein of human coronavirus NL63 that are critical for the RBD-

ACE2 receptor interaction, J. Virol.,89: (2008), s. 1015-1024

28. Burkard C., Verheije M. H., Wicht O., Van Kasteren S. I., Van Kuppeveld F.

J., Haagmans B. L., Pelkmans L., Rottier P. J., Bosch B. J., De HaanC.

A.,Coronavirus cell entry occurs through the endo-/lysosomal pathway

in a proteolysis-dependent manner,PLoSPathog.,6: (2014), s. 1004502

29. Wang H., Yang P., Liu K., Guo F., Zhang Y., Zhang G., Jiang C., SARS

coronavirus entry into host cells through a novel clathrin- and caveolae-

independent endocytic pathway, Cell Res., 18: (2008), s. 290-301


Pierwsze doniesienia o koronawirusach sięgają lat 60’tych XIX wieku. Koronawirusy

(ang. Coronaviruses, CoVs) należą do jednych z większych wirusów RNA pod względem

wirionu oraz genomu, którego wielkość waha się od 80 do 120nm. Najbardziej znanym

koronawirusem jest SARS-CoV, który na przełomielat 2002-2003 spowodował prawie 8 tysięcy

zakażeń, ze wskaźnikiem śmiertelności blisko 10%. Kolejnym równie niebezpiecznym wirusem

jest MERS, którym dotychczas zostało zarażone ponad 1,5 tysiąca osób ze wskaźnikiem

śmiertelności o ok.36%. Białko S odgrywa niezwykle ważną rolę w procesie wnikania

koronawirusa do komórki gospodarza. Infekcja wywoływana jest przez składowe wirusa, które

wchodzą w interakcję z białkami gospodarza na błonie komórkowej. Dochodzi następnie do

wiązania ze swoistym receptorem, a następnie do wnikania wirusowego nukleokapsydu.

Zrozumienie mechanizmów rozpoznawania receptora przez CoVs wydaje się być kluczowe dla

badań nad lekami skierowanymi przeciwko koronawirusom.

Mechanisms of coronaviruses entry into host cells

The first report of the coronavirus is from 1960. Coronaviruses (CoVs) are RNA viruses, whose

size ranges from 80 to 120nm. The best known coronavirus is SARS-CoV, which infects in 2002-

2003 almost 8,000 people, with a mortality rate up to 10%. Another dangerous virus is MERS,

which has infected more than 1,500 people with a mortality rate of approximately 36%. The S

protein plays an extremely important role in the fusion of the coronavirus into the host cell. The

infection is caused by a virus components that interact with proteins of the host cell membrane.

Subsequently it leads to bind with a specific receptor, and finally to the fusion of the viral

nucleocapsid. Understanding the mechanisms of receptor recognition by CoVs seems to be

essential for the studies about drugs directed against coronaviruses.

35

Maciej Gawroński1, Arkadiusz Goede

2, Tomasz Wandtke-

3

Wirusy onkolityczne

jako potencjalna alternatywa

w leczeniu nowotworów złośliwych

1. Wstęp

Choroby nowotworowe stanowią obecnie jedno z największych zagrożeń

dla zdrowia człowieka w wysoce rozwiniętych krajach Europy i w Stanach

Zjednoczonych. Głównymi przyczynami takiego stanu rzeczy są: ciągle

wydłużający się średni czas życia, zarówno wśród kobiet, jak i mężczyzn,

postępujące zanieczyszczenie środowiska naturalnego substancjami

o potencjale kancerogennym, zwiększona ekspozycja na promieniowanie

jonizujące, dieta ubogo-resztkowa, bogata w tłuszcze nasycone i kancerogenne

produkty powstające w wyniku termicznej obróbki pokarmu, jak również

niepohamowane spożycie napojów alkoholowych, konsumpcja produktów

tytoniowych (głownie papierosów, cygar, cygaretek, palenie fajki, zażywanie

tabaki i żucie liści tytoniowych) i niewystarczająca aktywność fizyczna. Części

z wymienionych powyżej czynników można oczywiście uniknąć prowadząc

tzw. „zdrowy styl życia”, nie zmienia to jednak faktu, iż ekspozycja na

kancerogeny środowiskowe i promieniowanie jonizujące z roku na rok jest

coraz większa, a dłuższy średni czas życia, będący paradoksalnie rezultatem

postępu w medycynie i naukach pokrewnych, sprzyja akumulacji mutacji

somatycznych, a co za tym idzie przekłada się na zwiększoną częstotliwość

zachorowań na nowotwory w wysoce rozwiniętych, zachodnich spo-

łeczeństwach [1].

Dlatego też profilaktyka i leczenie chorób nowotworowych są obecnie

jednym z największych wyzwań, przed jakimi stoi współczesna medycyna.

Szczególnie duży nacisk kładzie się na badania naukowe, których celem jest

opracowanie nowych, bardzo często spersonalizowanych, technik

terapeutycznych, które wykorzystując najnowsze zdobycze biologii mole-

1 [email protected], Studenckie Koło Naukowe Terapii Genowej, Zakład Genoterapii,

Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Collegium Medicum im. Ludwika

Rydygiera w Bydgoszczy, http://www.cm.umk.pl [email protected], Zakład Genoterapii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja

Kopernika, Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy, http://www.cm.umk.pl 3 [email protected]; Zakład Genoterapii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja

Kopernika, Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy, http://www.cm.umk.pl


36

kularnej, genetyki, biochemii, bioinformatyki, metabolomiki, czy też

inżynierii tkankowej i genetycznej, stanowiłyby alternatywę dla obecnie

stosowanych metod leczenia nowotworów złośliwych. Jest to niezwykle

istotne, gdyż standardowe terapie bardzo często okazują się mało

skuteczne, wykazują niską specyficzność względem komórek nowo-

tworowych, a także generują szereg skutków ubocznych, do których

możemy zaliczyć między innymi: indukowanie nowotworów wtórnych,

bezpłodność, zaburzenia w funkcjonowaniu układu immunologicznego,

a w konsekwencji częste zakażenia bakteryjne i wirusowe, zaburzenia

w funkcjonowaniu narządów (np. nefropatia, niewydolność mięśnia

sercowego), wymioty, utratę włosów. Wymienione wyżej skutki uboczne

mogą być równie groźne dla życia i zdrowia pacjenta, co choroba nowo-

tworowa, którą próbuje się wyleczyć. Co więcej, ich leczenie generuje

dodatkowe koszty, co ma istotne znaczenie w skali systemów ochrony

zdrowia danego kraju [2].

Nie dziwi zatem fakt, iż przy poszukiwaniu nowych metod walki

z nowotworami, naukowcy sięgają po rozwiązania kontrowersyjne

i nieszablonowe. Takim właśnie podejściem jest wykorzystanie tzw.

wirusów onkolitycznych, które zostaną pokrótce omówione w niniejszej

pracy.

2. Wirusy onkolityczne

U podstaw idei wykorzystania wirusów jako narzędzia do niszczenia

komórek nowotworowych leży ich ewolucyjnie nabyta zdolność do

infekowania komórek eukariotycznych, namnażania się w nich, jak również

zdolność do ich lizy, która umożliwia rozprzestrzenianie się cząsteczek

wirusa w zainfekowanej tkance. Jednakże główną przeszkodą, jaka stała na

drodze wykorzystania tych cech wirusów w celach terapeutycznych był

fakt, iż wirusy infekują zarówno komórki zdrowe, jak i komórki zmienione

nowotworowo, a zatem nie wykazują specyficzności lizy zainfekowanych

komórek [3].

Rozwiązanie tego problemu nadeszło wraz z rozwojem technik

inżynierii genetycznej, dzięki którym udało się poznać funkcję i sekwencję

genów tworzących genom poszczególnych wirusów. Szczególnie istotnym,

z punktu widzenia przyszłych zastosowań wirusów onkolitycznych, było

poznanie molekularnych mechanizmów stojących za procesem ich

replikacji w komórkach eukariotycznych, jak również mechanizmów

warunkujących proces infekowania i lizy komórek. Dzięki genetycznym

modyfikacjom poszczególnych genów stworzono pierwsze wirusy

onkolityczne (OV, ang. oncolitic viruses), czyli takie, które mogą nam-

nażać się jedynie w komórkach zmienionych nowotworowo [3, 4].

Wirusy onkolityczne jako potencjalna alternatywa w leczeniu nowotworów złośliwych

37

Takie właściwości omawianych cząsteczek można uzyskać na kilka

sposobów. Pierwszym z nich jest usunięcie genów koniecznych do

replikacji wirusa w prawidłowych komórkach. Zazwyczaj geny te

odpowiedzialne są za inaktywację genów supresorowych, które hamują

cykl komórkowy (np. gen p53, czy RB), lub warunkują syntezę substratów

niezbędnych do replikacji wirusa. Modyfikacje genetyczne obejmujące

usunięcie z genomu wyżej wymienionych genów skutkują tym, iż

zmodyfikowany wirus zdolny jest do namnażania się jedynie w komórkach

posiadających jakiś defekt genetyczny (np. brak aktywności białka p53

stwierdza się w większości komórek nowotworowych) [4, 5].

Drugim sposobem jest podmiana promotora genu wirusowego

promotorem tkankowo specyficznym. W tym przypadku wirus jest zdolny

do namnażania się tylko w komórkach tkanek, w których występują

odpowiednie czynniki transkrypcyjne. Szczególną odmianą tej metody jest

wykorzystanie promotorów, które ulegają aktywacji tylko i wyłącznie

w komórkach charakteryzujących się odpowiednim stanem. Doskonałym

przykładem takiej strategii jest wykorzystanie promotora dla czynnika

drugiego indukowanego stanem hipoksji (HIF-2, ang. hipoxia inducible

factor-2), dzięki któremu cząsteczki wirusa mogą replikować się tylko

w komórkach niedotlenionych, a właśnie do takich należą komórki

nowotworowe [4‚7].

Trzecia metoda opiera się na modyfikacji genów odpowiedzialnych za

zdolność do infekowania komórek w taki sposób, by cząsteczki wirusa

wykazywały znacznie większy tropizm do komórek nowotworowych, niż

do komórek prawidłowych. Ma to szczególne znaczenie w przypadku

wirusów, które mogą infekować komórki różnych tkanek, a chcemy je

wykorzystać jedynie do niszczenia komórek nowotworowych wywo-

dzących się z jednej z nich [8].

Wartym odnotowania jest także fakt, iż modyfikacje genetyczne

wirusów onkolitycznych nie ograniczają się jedynie do genów odpo-

wiedzialnych za infekcję, replikację i lizę komórek nowotworowych.

Bardzo często do genomu wirusowego wprowadzane są tzw. „geny samo-

bójcze”. Zazwyczaj są to geny kodujące enzymy, które standardowo nie

występują w docelowej tkance. Posiadają one zdolność do enzymatycznego

przekształcania bezpiecznych, nieaktywnych substancji, zwanych

prolekami, do form cytotoksycznych. Dzięki tej modyfikacji komórki

nowotworowe nabywają nową cechę, dzięki której po ogólnoustrojowym

podaniu bezpiecznego proleku, efekt cytotoksyczny zostaje ograniczony

jedynie do komórek zainfekowanych wirusem onkolitycznym. Takie

podejście pozwala na uniknięcie ogólnoustrojowych skutków ubocznych,

charakterystycznych dla standardowych terapii. Do najczęściej wyko-

rzystywanych genów samobójczych należą: gen kinazy tymidynowej (TK,


38

ang. thymidine kinase), deaminaza cytozyny (CDA, ang. cytosine

deaminase), fosforybozylotransferaza uracylu (UPRT, ang. uracil

phosphoribosyltransferase), fosforylaza nukleozydu purynowego (PNP,

ang. purine nucleoside phosphorylase), czy też geny cytochromu p450

(np. CYP2B1 warunkujący przemiany cyklofosfamidu) [9‚12].

W ten sposób, dzięki modyfikacjom genetycznym otrzymuje się cząsteczki,

które nie tylko w sposób selektywny infekują komórki nowotworowe,

namnażają się w nich i doprowadzają do ich lizy, ale także uwrażliwiają

zainfekowane komórki na standardowo stosowane chemioterapeutyki takie jak

5-fluorouracyl, cyklofosfamid, czy 2-fluoroadenina i gancyklowir. Co więcej,

komórki nowotworowe po infekcji wirusem onkolitycznym zaczynają

eksprymować na swojej powierzchni cząsteczki głównego układu zgodności

tkankowej klasy I (MHC I, ang. major histocompatibility complex class I),

przez co wracają pod nadzór układu immunologicznego – mogą zostać roz-

poznane przez limfocyty cytotoksyczne CD8+ (Tc) i usunięte z organizmu [13].

Łatwość z jaką można manipulować genomem wirusowym sprawiła, iż

badacze opracowali szereg wirusów onkolitycznych, które bazowały na

wirusach różnego typu. Obecnie, do najczęściej stosowanych OV należą

adenenowirusy, zmodyfikowane wirusy opryszczki, rabdowirusy, reowirusy,

czy też wirus odry. W dalszej części pracy pokrótce omówione zostaną

poszczególne wirusy onkolityczne, należące do wyżej wymienionych grup.

2.1. Adenowirusy

Do najczęściej stosowanych wirusów onkolitycznych należą zmodyfiko-

wane genetycznie adenowirusy. Są to relatywnie małe cząsteczki,

o symetrii ikosaedralnej, zawierające podwójną nić DNA o długości około

36 tysięcy par zasad. Powstało wiele różnych modyfikacji adenowirusów,

które pozwoliły na uzyskanie specyficzności względem komórek nowo-

tworowych. Pierwszym przykładem jest wirus ONYX-015, występujący

także pod nazwami dl1520 lub CI-1042, w którym dokonano delecji genu

E1B. Produkt białkowy tego genu jest odpowiedzialny za inaktywację

białka p53 w prawidłowych komórkach, dzięki czemu, podczas infekcji

wirusowej cykl komórkowy nie zostaje zatrzymany, a sam wirus może

replikować. Pozbawienie wirusa genu E1B sprawia, iż może on replikować

jedynie w komórkach z nieaktywnym białkiem p53, a jak powszechnie

wiadomo zaburzenia w funkcjonowaniu tego białka należą do jednych

z najczęstszych defektów genetycznych, jakie znajduje się w komórkach

nowotworowych. Badania kliniczne II fazy potwierdziły bezpieczeństwo

stosowania tego wirusa w przypadku nowotworów głowy i szyi,

w szczególności zauważono całkowitą remisję choroby u 10% chorych

poddanych leczeniu, natomiast u 62% badanych udało się zahamować


39

rozwój choroby [14]. Co więcej, wykazano efekt synergii w przypadku

zastosowania terapii wirusowej w połączeniu z radioterapią. Połączenie to

skutkowało znaczącym zmniejszeniem tkanki guzów litych w porównaniu

do zastosowania pojedynczej terapii wirusem lub samej radioterapii [15].

Wykazano także podobną synergię dla połączenia terapii wirusowej

z wykorzystaniem ONYX-015 i chemioterapii [16] Wyniki te sprawiły, iż

obecnie ONYX-015 trafił do III fazy badań klinicznych w leczeniu

nowotworów głowy i szyi.

Jednakże wykorzystanie omawianego wyżej wirusa onkolitycznego,

z racji wprowadzonych modyfikacji, zostało ograniczone do komórek

z nieaktywnym białkiem p53, a co za tym idzie, nie może być on

zastosowany do leczenia komórek nowotworowych z funkcjonującym p53,

ale z zaburzeniami w funkcjonowaniu innych genów. Dlatego tez

stworzono inne wirusy, które zostały pozbawione innego genu warun-

kującego replikację, mianowicie E1A, odpowiedzialnego za inaktywację

białka RB. Ad5Delta24 jest takim wirusem, znalazł on zastosowanie

w leczeniu glejaków, gdzie jego zastosowanie iv vivo skutkowało zna-

czącym zmniejszeniem masy guzów [17]. Natomiast w przypadku wirusa

AxdAdB-3 dokonano delecji zarówno genu E1A, jak i E1B, co przełożyło

się na jego wysoką skuteczność w leczeniu nowotworów posiadających

mutacje zarówno w genie p53, jak i RB, takich jak rak woreczka

żółciowego czy rak trzustki. Co więcej, taka modyfikacja skutkuje

znacznym spadkiem toksyczności tego wirusa względem komórek

prawidłowych, w porównaniu z wirusem ONYX-015 [18, 19]. W podobny

sposób stworzono więcej wirusów zdolnych do namnażania się

w komórkach z defektywnym RB np. wirusy Ar6pAE2fF i Ar6pAE2fE3F,

m. in. z nieaktywnym promotorem dla E1A [20].

Innym przykładem zastosowania zmodyfikowanych adenowirusów są

próby leczenia raka prostaty, który jest atrakcyjnym celem dla takiej terapii

ze względu na łatwy dostęp do zmienionej nowotworowo tkanki, którą

można nastrzyknąć roztworem zawierającym wysokie stężenie cząsteczek

wirusa. Doskonałym przykładem takiego postępowania jest wirus CV787,

w którym promotor dla genu E1B wymieniono na promotor specyficznego

antygenu prostaty (PSA, ang. prostate specific antygen), natomiast

promotor genu E1A został wymieniony na promotor PSRP (ang. prostate-

specific rat probasin promoter). Dzięki tym modyfikacjom wirus może

replikować jedynie w komórkach raka prostaty. Co więcej, terapia

wirusowa z jego zastosowaniem wykazuje synergię z chemioterapią

docetakselem i paklitakselem. W związku z tym wirus CV787 trafił do II

fazy badań klinicznych leczenia nowotworu prostaty [21, 22].

Innymi przykładami użycia nowotworowo specyficznych promotorów

jest adenowirus TRAD, w którym geny E1A i E1B podpięto pod gen


40

ludzkiej telomerazy – enzymu, który jest aktywny w większości komórek

nowotworowych. Podobne strategie wykorzystano w przypadku adeno-

wirusów skierowanych przeciwko komórkom czerniaka, raka wątrobo-

komórkowego, raka piersi [7], czy raka jajnika opornego na chemioterapię

(wektor Ad5/3MDR1E1) [23].

2.2. Wirus opryszczki (Herpes Simplex Virus)

HSV jest wirusem równie często stosowanym w terapii wirusowej, jak

adenowirusy, przy czym posiada pewną przewagę ze względu na znacznie

większy rozmiar cząsteczki dwuniciowego DNA (około 150 kpz), co sprawia,

iż w większym stopniu można modyfikować jego genom. Główne

modyfikacje tego wirusa polegają na wyeliminowaniu jego zdolności do

namnażania się w komórkach prawidłowych. Obejmują one delecję genu dla

reduktazy rybonukleotydów, genu kinazy tymidynowej, czy też czynnika

wirulencji γ134.5. Reduktaza rybonukleotydów odgrywa kluczową rolę

w syntezie deoksyrybonukleotydów, koniecznych do syntezy DNA – jej

wysoki poziom jest charakterystyczny dla komórek szybko proliferujących,

jest jej zaś mniej w komórkach w stanie spoczynku. Usunięcie genu UL39

kodującego dużą podjednostkę reduktazy rybonukleotydów powoduje, iż tak

zmodyfikowany wirus może replikować jedynie w komórkach dzielących się,

a do takich należą komórki nowotworowe. Brak genu kinazy tymidynowej

uzależnia replikację wirusa od obecności tego enzymu w genomie infekowanej

komórki, a obecność ta jest również charakterystyczna dla komórek dzielących

się. Te cechy, w połączeniu z naturalnym neurotropizmem sprawiły, iż tak

zmodyfikowane wirusy znalazły zastosowanie w próbach leczenia

nowotworów mózgu, gdyż prawidłowe neurony, jako komórki niedzielące się,

są oszczędzane przez tak zaprojektowane OV, natomiast komórki zmienione

nowotworowo, dzielące się, ulegają zniszczeniu [24‚27].

Stworzono także szereg wirusów zawierających w swojej budowie geny,

których celem, oprócz lizy komórek nowotworowych, była stymulacja układu

immunologicznego. Zawierały one m.in. gen dla czynnika stymulującego

tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) [28], geny

interleukiny 2 i 12 [29, 30] – efektem działania tych cytokin jest wywołanie

polaryzacji immunologicznej w stronę odpowiedzi komórkowej, kluczowej

z punktu widzenia terapii antynowotworowej.

Ciekawym przykładem ogromnych modyfikacji, jakich można dokonać

w wirusie opryszczki jest wirus rRp450. Posiada on delecję genu UL39, jak

również szczurzy gen cytochromu P450, dzięki czemu jest on zdolny do

enzymatycznej aktywacji cyklofosfamidu do formy cytotoksycznej, co

przekłada się na uwrażliwienie komórek na ten lek i lepszy efekt

terapeutyczny [31]. Co więcej, w tym przypadku wirus posiada gen kinazy


41

tymidynowej, przez co zainfekowane komórki są również uwrażliwione na

gancyklowir. Warto także zaznaczyć, iż podanie gancyklowiru i jego

aktywacja w zainfekowanych komórkach skutkuje ich apoptozą, a co za

tym idzie hamuje replikacje wirusa. Zatem podanie gancyklowiru można

uważać za tzw. ”hamulec bezpieczeństwa” w razie niekontrolowanego

rozprzestrzeniania się wirusa w organizmie, a także poprzez jego podanie

uzyskuje się silną synergię działania z cyklofosfamidem, jak i samym

działaniem litycznym wirusa [32]. Wykazano skuteczność terapii

wirusowej z wykorzystaniem rRp450 w próbach leczenia raka okrężnicy

i wątroby [33, 34].

2.3. Reowirusy

Wirusy te są od niedawna w polu zainteresowania terapii onkolitycznej,

gdyż swoje właściwości lityczne wykazują jedynie w komórkach

z nadaktywnym białkiem Ras, odpowiedzialnym za przekazywanie

sygnałów z receptorów na powierzchni komórek (np. EGFR, receptor dla

naskórkowego czynnika wzrostu, ang. epidermal growth factor receptor)

do jądra komórkowego [35]. W komórkach prawidłowych dwuniciowy

RNA, który stanowi materiał genetyczny reowirusów, aktywuje kinazę

PKR, która w efekcie blokuje czynnik eIF2α (ang. eukaryotic initiation

factor 2α), konieczny do replikacji wirusa. Jednakże w komórkach

z nadekspresją Ras, aktywność omawianej wyżej kinazy jest zahamowana,

a co za tym idzie możliwe jest wejście wirusa w fazę lityczną.

Zastosowanie reowirusów wydaje się bardzo atrakcyjne, gdyż około 30%

nowotworów posiada nadaktywność białka Ras, a także zaburzenia

w funkcjonowaniu układu EGF/EGFR [36].

Wykazano onkolityczną aktywność reowirusów w przypadku modelu

nowotworu pęcherza moczowego. Co więcej, wirusy te trafiły do badań

klinicznych I fazy (glejaki) [37] i II fazy (przerzuty mięsaków tkanek

miękkich do płuc) [38]. Podejmuje się także próby ich wykorzystania

w leczeniu raka jajnika, jelita grubego, czerniaków, czy medulloblastomy

[39, 40, 41].

3. Podsumowanie

Wirusy onkolityczne to potężne i wysoce wyrafinowane narzędzie do

walki z nowotworami. Dzięki dogłębnemu poznaniu genomów wirusowych

i zrozumieniu molekularnych mechanizmów, jakie stoją za procesami

replikacji poszczególnych wirusów, możliwym stało się modyfikowanie ich

genów w taki sposób, by uzyskać niezwykle specyficzne cząsteczki, zdolne

do selektywnego niszczenia komórek nowotworowych. Ich główną zaletą

jest fakt, iż w przeciwieństwie do standardowych strategii terapeutycznych,


42

generują znacznie mniejsze skutki uboczne, a w połączeniu z wspom-

nianymi strategiami wykazują efekt synergii, co znacząco podnosi

skuteczność leczenia. Ich wykorzystanie jest także relatywnie tanią metodą,

gdyż o ile same badania prowadzące do stworzenia wirusa onkolitycznego

są bardzo kosztowne, o tyle jego późniejsza synteza generuje niewielkie

koszty. Warto także nadmienić, iż zastosowanie wirusów onkolitycznych

jest metodą bezpieczną, gdyż ich aktywność ogranicza się do komórek

nowotworowych. Co więcej w przypadku nadmiernego rozprzestrzenienia

się w organizmie, cząsteczki wirusów są naturalnie usuwane przez komórki

układu immunologicznego. Ponadto w razie konieczności możliwym jest

podanie pacjentowi leków anty-wirusowych, które zapobiegną ich

nadmiernemu rozprzestrzenianiu się. Z drugiej strony aktywność układu

immunologicznego pełni rolę „obosiecznego miecza’ i może zmniejszać

aktywność omawianych cząsteczek. Dlatego też duża część z obecnie

prowadzonych badań skupia się na polepszeniu specyficzności wirusów

onkolitycznych, obniżeniu ich immunogenności, jeszcze większej poprawie

bezpieczeństwa stosowania, wzmocnieniu efektu onkolitycznego, jak

również na wprowadzaniu dodatkowych modyfikacji, zwiększających ich

potencjał terapeutyczny. Warto także nadmienić, iż wiele z omawianych

w niniejszej pracy wirusów trafiło do II, a nawet do III fazy badań

klinicznych, tak więc wydaje się, iż w niedalekiej przyszłości mogą one

stać się uzupełnieniem rutynowego postępowania terapeutycznego

w leczeniu nowotworów złośliwych, a w dalszej perspektywie być może

zastąpić standardowo stosowane strategie leczenia.

Literatura

1. Kułakowski A., Skowrońska-Gardas A., Onkologia Podręcznik dla studentów

medycyny, Wydawnictwo Lekarskie PZWL., (2003),s. 10-150

2. Meder J., Podstawy onkologii klinicznej, Centrum Medyczne Kształcenia

Podyplomowego., (2011), s. 5-260

3. He S., Li P., Chen C. H., Bakst R. L., Chernichenko N., Yu Y.A, et al.

Effective oncolytic vaccinia therapy for human sarcomas, Journal of Surgical

Research., 2 (2012), s.53-60

4. Wong H. H., Lemoine N. R., Wang Y., Oncolytic viruses for cancer therapy:

Overcoming the obstacles, Viruses., 2 (2010), s. 78-106

5. Prestwich R. J., Errington F., Harrington K. J., Pandha H. S., Selby P.,

Melcher A., Oncolytic viruses: do they have a role in anti-cancer therapy?,

Clinical Medicine. Oncology., 2 (2008), s. 83-96

6. Russell S. J., Peng K. W., Bell J. C., Oncolytic virotherapy, Nature

Biotechnology., 7 (2012), s. 658-670

7. Zeyaullah M., Patro M., Ahmad I., Ibraheem K., Sultan P., Nehal M., et al.,

Oncolytic viruses in the treatment of cancer: a review of current strategies,

Pathology and Oncology Research., 4 (2012), s.771-781


43

8. Verheije M. H., Rottier P. J. Retargeting of viruses to generate oncolytic

agents, Advances in Virology 2012 (2012),

http://dx.doi.org/10.1155/2012/798526

9. Thirukkumaran C. M., Morris D. G. Oncolytic virotherapy for multiple

myeloma: past, present, and future, Bone Marrow Research., 2011 (2011),

http://dx.doi.org/10.1155/2011/632948

10. Tai C .K., Wang W., Lai Y. H., Logg C. R., Parker W. B., Li Y. F., Hong J. S.,

Sorscher E. J., Chen T. C., Kasahara N. Enhanced efficiency of prodrug

activation therapy by tumor-selective replicating retrovirus vectors armed

with the escherichia coli purine nucleoside phosphorylase gene, Cancer Gene

Therapy., 17 (2010), s. 614-623

11. Bharara S., Sorscher E. J., Gillespie G. Y., Lindsey J. R., Hong J. S., Curlee K.

V., Allan P. W., Gadi V. K., Alexander S. A., Secrist J. A, Parker W. B.,

Waud W. R., Antibiotic-Mediated Chemoprotection Enhances Adaptation

of E. coli PNP for Herpes Simplex Virus-Based Glioma Therapy, Human Gene

Therapy., 3 (2005), s. 339-347

12. Wei M. X., Tamiya T., Chase M., Boviatsis E. J., Chang T. K., Kowall N. W.,

Hochberg F. H., Waxman D. J., Breakefield X. O., Chiocca E. A.,

Experimental tumor therapy in mice using the cyclophosphamide-activating

cytochrome P450 2B1 gene, Human Gene Therapy., 8 (1994), s. 969-78

13. Mahoney D. J, Stojdl D. F. Molecular pathways: multimodal cancer-killing

mechanisms employed by oncolytic vesiculoviruses, Clinical Cancer Research.,

19 (2013), s.758-763

14. Nemunaitis J., Khuri F., Ganly I., Arseneau J., Posner M., Vokes E., Kuhn J.,

McCarty T., Landers S., Blackburn A., Romel L., Randlev B., Kaye S., Kirn

D. Phase II trial of intratumoral administration of ONYX-015, a replication-

selective adenovirus, in patients with refractory head and neck cancer, Journal

of Clinical Oncology., 2 (2001), s. 289-29

15. Kenneth R. Rogulski K. R., Freytag S. O., Zhang K., Gilbert J. D., Paielli D.

L., Kim J. H., Heise C. C., Kirn D. H., In Vivo Antitumor Activity of ONYX-

015 Is Influenced by p53 Status and Is Augmented by Radiotherapy, Cancer

Research., 60 (2000), s.1193-119

16. Galanis E., Okuno S. H., Nascimento A. G., et al., Phase I-II trial of ONYX-

015 in combination with MAP chemotherapy in patients with advanced

sarcomas, Gene Therapy., 5 (2005), s.437-445

17. Juan-Fueyo J., Gomez-Manzano C., Alemany R., Lee P. S. Y., McDonnell T.

J., MitliangaP., Shi Y., Levin V. A., Yung A. W. K., Kyritsis A. P. A mutant

oncolytic adenovirus targeting the Rb pathway produces anti-glioma effect in

vivo, Oncogene., 1 (2000), s. 2-12

18. Fukuda K., Abei M., Ugai H., et al., E1A, E1B double-restricted adenovirus

for oncolytic gene therapy of gallbladder cancer, Cancer Research., 63 (2003),

s. 4434-4440

19. Sunamura M., Hamada H., Motoi F., et al., Oncolytic virotherapy as a novel

strategy for pancreatic cancer, Pancreas., 3 (2004), s. 326-329

20. Jakubczak J. L., Ryan P., Gorziglia M., et al. An oncolytic adenovirus selective

for retinoblastoma tumor suppressor protein pathway-defective tumors:


44

dependence on E1A, the E2F-1 promoter, and viral replication for selectivity

and efficacy, Cancer Research., 63 (2003), s. 1490-1499

21. Yu D. C., Chen Y., Seng M., Dilley J., Henderson D. R. The addition

of adenovirus type 5 region E3 enables calydon virus 787 to eliminate distant

prostate tumor xenografts, Cancer Research., 59 (2000), s. 4000-4003

22. Yu D. C, Chan Y., Dilley J., et al., Antitumor synergy of CV787, a prostate

cancer-specific adenovirus, and paclitaxel and docetaxel, Cancer Research.,

61 (2001), s. 517-25

23. Gooding L. R., Regulation of TNF-mediated cell death and inflammation by

human adenoviruses, Infectious Agents and Diseases., 3 (1994), s. 106-115

24. Shen Y., Nemunaitis J. Herpes simplex virus 1 (HSV-1) for cancer treatment,

Cancer Gene Therapy., 11 (2006), s. 975-992

25. Mineta T., Rabkin S. D., Martuza R. L., Treatment of malignant gliomas using

ganciclovir-hypersensitive, ribonucleotide reductase-deficient herpes simplex

viral mutant, Cancer Research.,54 (1994), s. 3963-3966

26. Langelier Y., Champoux L., Hamel M., et al., The R1 subunit of herpes

simplex virus ribonucleotide reductase is a good substrate for host cell protein

kinases but is not itself a protein kinase, The Journal of Biological Chemistry.,

3 (1998),s. 1435-1443

27. Sanders P. G., Wilkie N. M.,. Davison A. J., Thymidine kinase deletion

mutants of herpes simplex virus type 1, Journal of General Virology.,

63 (1982), s. 277-295

28. Wong R. J., Patel S. G., Kim S. H. etal., Cytokine gene transfer enhances

herpes oncolytic therapy in murine squamous cell carcinoma, Human Gene

Therapy., 3 (2001), s. 253-265

29. Carew J. F., Kooby D. A., Halterman M. W., Kim S. H., Federoff H. J., Fong

Y., A novel approach to cancer therapy using an oncolytic herpes virus to

package amplicons containing cytokine genes, Molecular Therapy., 3 (2001),

s. 250-256

30. Toda M., Martuza R .L, Kojima H., Rabkin S. D., In situ cancer vaccination:

an IL-12 defective vector/replicationcompetent herpes simplex virus

combination induces local and systemic antitumor activity, Journal

of Immunology., 9 (1998), s.4457-4464

31. Pawlik T. M., Nakamura H., Yoon S. S., et al., Oncolysis of diffuse

hepatocellular carcinoma by intravascular administration of a replication-

competent, genetically engineered herpesvirus, Cancer Research., 60 (2000),

s. 2790-2795

32. Yoon S. S., Carroll N. M., Chiocca E. A., Tanabe K. K. Cancer gene therapy

using a replicationcompetent herpes simplex virus type 1 vector, Annals

of Surgery., 3 (1998), s. 366-374

33. Aghi M., Chou T. C., Suling K., Breakefield X. O., Chiocca E. A. Multimodal

cancer treatment mediated by a replicating oncolytic virus that delivers the

oxazaphosphorine/rat cytochrome P450 2B1 and ganciclovir/herpes simplex

virus thymidine kinase gene therapies, Cancer Research., 59 (1999), s. 3861-3865


45

34. Pawlik T. M., Nakamura H., Mullen J. T., et al., Prodrug bioactivation and oncolysis of diffuse liver metastases by a herpes simplex virus 1 mutant that expresses the CYP2B1 transgene, Cancer., 5 (2002), s. 1171-1181

35. Coffey M. C., Strong J. E., Forsyth P. A., Lee P. W. K. Reovirus therapy of tumors with activated Ras pathway, Science., 5392 (1998), s. 1332-1334

36. Bos J .L., Ras Oncogenes in human cancer: a review, Cancer Research., 49 (1989), s. 4682-4689

37. Forsyth P., Rold G., George D., et al., A phase I trial of intratumoral administration of reovirus in patients with histologically confirmed recurrent malignant gliomas, Molecular Therapy., 3 (2008), s. 627-632

38. Soefje S. A., Sarantopoulos J., Sankhala K. K., et al., A phase II study of intravenous reolysin (wild-type reovirus) in the treatment of patients with bone and soft tissue sarcomas metastatic to the lung, Journal of Clinical Oncology., 26 (2008), supplement, abstract 10568

39. Hirasawa K., Nishikawa S. G., Norman K. L., Alain T., Kossakowska A., Lee P. W. Oncolytic reovirus against ovarian and colon cancer, Cancer Research 62 (2002), s. 1696-1701

40. Jansen B., Schlagbauer-Wadl H., Kahr H., et al., Novel Ras antagonist blocks human melanoma growth, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America., 24.(1999), s. 14019-14024

41. Yang W. Q., Senger D., Muzik H., et al., Reovirus prolongs survival and reduces the frequency of spinal and leptomeningeal metastases from medulloblastoma. Cancer Research 63 (2003), s. 3162-3172

Wirusy onkolityczne jako potencjalna alternatywa w leczeniu

nowotworów złośliwych

Dynamiczny rozwój medycyny, biologii molekularnej i inżynierii genetycznej nie rozwiązał jak

dotąd problemu zachorowań na nowotwory złośliwe, które są jednym z największych wyzwań

współczesnej nauki. Co więcej, obecnie stosowane terapie leczenia nowotworów bardzo często

zawodzą i wiążą się z szeregiem niepożądanych skutków ubocznych. Dlatego też poszukuje się

innowacyjnych metod leczenia nowotworów, które stanowiłyby uzupełnienie i bezpieczną

alternatywę dla obecnie stosowanych strategii. Dlatego szczególnym zainteresowaniem cieszy się

wykorzystanie wirusów onkolitycznych, czyli wirusów zmodyfikowanych genetycznie, które

selektywnie infekują i wybiórczo mnożą się w komórkach nowotworowych. Charakteryzują się

wysokim tropizmem do komórek nowotworowych, szybkim tempem proliferacji, a także

zdolnością do lizy zainfekowanych komórek, a ich użycie stymuluje antynowotworową odpo-

wiedź układu immunologicznego. Cząsteczki zmodyfikowanych wirusów mogą także stanowić

nośnik dla leków antynowotworowych, czy też genów samobójczych i terapeutycznych.

Wykorzystano je w próbach klinicznych leczenia raka okrężnicy, szyjki macicy, jajnika, wątroby

i trzustki. Wykazano także synergizm terapii wirusami onkolitycznymi i chemioterapii.

Stworzono także wektory na bazie wirusa opryszczki (HSV), namnażające się tylko w komór-

kach nerwowych np. wektor rRp450, który znalazły zastosowanie w leczeniu nowotworów

mózgu.

Wirusy onkolityczne to różnorodna grupa wirusów, które selektywnie infekują i niszczą komórki

nowotworowe przy jednoczesnym oszczędzaniu komórek prawidłowych. Ich prosta budowa

pozwala na niemal dowolną modyfikację ich genomu. Dzięki unikalnym właściwościom

i relatywnie niskim kosztom produkcji wektory te wydają się atrakcyjnym narzędziem

terapeutycznym i potencjalnie mogą w przyszłości stanowić alternatywę dla obecnie stosowanych

metod.


46

Oncolytic viruses as potential alternative in the treatment of malignant

tumorsitle in English

The dynamic development of medicine, molecular biology and genetic engineering has not

solved the problem of cancer diseases, which are one of the greatest challenges of modern

science. Furthermore currently used anti-cancer therapies are often ineffective and are associated

with a number of undesirable side effects. Therefore, there is an urgent need to find innovative

cancer treatments that would be a complement and safe alternative to currently used therapeutic

strategies. That is why there is particular interest in using oncolytic viruses – genetically modified

vectors, that selectively infect and multiply only in cancer cells. They are characterized by a high

tropism for cancer cells, high proliferation rate and the ability to lyse infected cells. Moreover,

their usage stimulates anti-tumor immune response. Modified viral vectors may also act as

a transporter of anticancer drugs or suicide and therapeutic genes.

They were used in clinical trials in treatment of colon, cervical, ovarian, liver and pancreas

cancer. Synergy between viral therapy and chemotherapy has also been shown. Vectors based on

herpes simplex virus (HSV), capable to proliferate only in nerve cells such as vector rRp450 were

created and are currently used in the treatment of brain tumors.

Oncolytic viruses are diverse group of viruses that selectively infect and destroy cancer cells

while saving normal cells. Due to their simple construction it is possible to modify their genome

in almost any way. Due to unique properties and relatively low production costs, these vectors

appear to be an attractive therapeutic tool and a potential alternative to currently used methods in

the future.

47

Monika Dyńda1

Wykorzystanie bakterii jako wektorów

w terapii przeciwnowotworowej

1. Wprowadzenie

Celem pracy jest przeglądowe przedstawienie zastosowań wybranych

drobnoustrojów i ich szczepów w terapii przeciwnowotworowej ze szczegól-

nym uwzględnieniem prób leczenia guzów litych.

Schorzenia nowotworowe są jednymi z najczęstszych ludzkich

przypadłości, których występowanie zazwyczaj nie jest uwarunkowane

wiekiem. Istnieją natomiast dowody na korelację występowania różnego typu

mutacji spontanicznych oraz indukowanych działaniem mechanicznych

i chemicznych czynników mutagennych a rozwojem komórek nowo-

tworowych.

Aktualnie stosowane terapie przeciwnowotworowe są bardzo wynisz-

czające dla organizmu ludzkiego. Zalicza się do nich chemioterapię, czyli

stosowanie cytostatyków działających degradująco nie tylko na komórki

nowotworowe, ale i na pozostałe zdrowe, radioterapię i/lub immunoterapię.

Cechą wspólną tych wszystkich metod jest brak specyficzności wobec samego

nowotworu, niszczone są wszystkie komórki, w tym odpornościowe.

Konsekwencją jest zazwyczaj zniszczenie flory bakteryjnej organizmu oraz

pozbawienie go bariery ochronnej w postaci aktywnego układu odpor-

nościowego i ogólne osłabienie organizmu.

Jednym z nowszych kierunków badań jest zastosowanie bakterioterapii,

czyli wykorzystanie określonych gatunków bakterii w celu niszczenia

nowotworów. W ostatnich kilku latach obiecujące wyniki badań uzyskano na

modelach zwierzęcych, podczas eksperymentalnej terapii bakteriami z rodzaju

Clostridium,Listeria, Pseudomonas czy Salmonella. Pozytywne skutki

uzyskano zarówno przy samodzielnym stosowaniu szczepów bakteryjnych

w różnych postaciach, jak i przy ich współdziałaniu z terapiami standar-

dowymi.

1 [email protected], Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki

Monika Dyńda

48

1.1. Obiecujące perspektywy wykorzystania bakterii w terapii

antynowotworowej

Uczeni starają się znaleźć nowe, innowacyjne metody w walce z nowotworem odznaczające się mniejszą inwazyjnością wobec organizmu oraz podobną, a nawet lepszą skutecznością niż w przypadku chemio- czy radioterapii. W tym celu zaczęto badać zależność między środowiskiem rozwoju komórek nowotworowych, a miejscem bytowania niektórych z bakterii. Bakterie żyjące w warunkach beztlenowych lub względnie beztlenowych, takie jak Clostridium, czy Salmonella są zdolne do zasiedlania obszarów, w których rozwijają się guzy lite, wykazując jednocześnie lizę tych komórek [22]. Mikroorganizmy modyfikuje się genetycznie, aby zwiększyć ich powinowactwo do kumulowania się w obrębie nowotworu lub w sposób, który umożliwia im przenoszenie odpowiedniego antygenu, który będzie stymulował przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną. Są to tak zwane szczepionki przeciw-nowotworowe, których celem jest stymulacja limfocytów T cytoto-ksycznych skierowanych przeciwko komórkom nowotworowym poprzez prezentację antygenów przez komórki dendrytyczne kompleksom MHC-I. Ogólnie, immunoterapia przeciwnowotworowa polega na ponownej aktywacji mechanizmów obronnych organizmu oraz skierowaniu ich przeciwko komórkom nowotworowym, co jest m.in inicjowane przez dostarczenie odpowiednich antygenów oraz ich efektywne zaprezentowanie komórkom żernym i limfocytom T [8].

Antynowotworowe działanie bakterii odkrył nowojorski chirurg William Coley pod koniec XIX wieku po przeprowadzonej operacji usunięcia mięsaka u jednej ze swoich pacjentek. Przypadkowo doszło do zakażenia bakteriami Streptococcus pyogenes, które wywołały wysoką gorączkę, czyli aktywowały układ odpornościowy, co w konsekwencji spowodowało remisję choroby.

Coley postanowił zbadać dokładniej tę metodę terapii, dlatego zaczął podawać swoim pacjentom S. pyogenes. Pojawiły się jednak problemy w postaci słabej stymulacji układu odpornościowego, wystąpienia zbyt silnej reakcji zapalnej czy wystąpienia zakażeń śmiertelnych. Coley użył więc dwóch szczepów nieżywych bakterii S. pyogenes i Serratia marcescens, a taką szczepionkę nazwano toksynami Coley’a. Jeden z pacjentów z poważnym stadium choroby, z nieoperacyjnym mięsakiem został poddany terapii wyżej wymienionymi toksynami po czym zaobserwowano u niego całkowitą remisję choroby.

Po śmierci Coley’a naukowcy prowadzili dalsze badania, jednak szybko ich zaprzestano ze względu na brak pozytywnych wyników ekspery-mentów, oraz rozwój innych, skutecznych metod terapeutycznych jak chemioterapia i radioterapia [9].

Wykorzystanie bakterii jako wektorów w terapii przeciwnowotworowej

49

1.2. Metabolizm komórek nowotworowych

Komórki nowotworowe powstają w wyniku nagromadzenia w organizmie

różnego rodzaju mutacji oraz pod wpływem czynników epigenetycznych.

Takie „ingerencje” genetyczne prowadzą do powstania zmian metabolicznych

w poszczególnych komórkach, które w sumie generują powstanie odmiennego

mikrośrodowiska niż istniejące wśród komórek zdrowych.

Jednym z procesów zachodzących podczas transformacji nowotworowej

jest formowanie się tworów przypominających naczynia krwionośne. Procesy,

w wyniku których powstają, to angiogeneza oraz mimikra waskulogenna [18].

Pierwszy z nich odpowiada za tworzenie się naczyń z tych już obecnych

w organizmie, natomiast drugi proces odpowiada za tworzenie sieci naczynio-

podobnej, która jest znacznie mniej różnicowana niż naczynia krwionośne

organizmu, a krew płynie w nich znacznie wolniej.

Obecność naczyń krwionośnych, zarówno tych nowopowstałych jak i tych,

w obrębie której nowotwór usytuował się, zapewnia komórkom nowo-

tworowym dostęp do tlenu oraz jego rozprzestrzenianie się w organizmie [19].

Oba procesy przebiegają jednak powolnie co sprawia, że komórki przez długi

czas są niedotlenione, co prowadzi do stymulacji tworzenia nowych naczyń

oraz syntezy ATP podczas procesu glikolizy, który jest jednym z systemów

adaptacji komórek do beztlenowego środowiska. Komórki nowotworowe

potrzebują energii w postaci adenozynotrójfosforanu, aby przeżyć i wytworzyć

nową sieć prymitywnych naczyń krwionośnych, które ponownie doprowadzą

do niedotlenienia. Wnioskując, jeżeli komórki przeprowadzają proces

glikolizy, niezbędne do ich przeżycia są cząsteczki glukozy. Przystosowaniem

komórek do beztlenowych warunków jest również ekspresja niektórych genów

w tych warunkach, których produkty zwiększają inwazyjność nowotworu.

Naukowcy starają się jak najdokładniej poznać mechanizmy powstawania

oraz bytowania komórek nowotworowych ponieważ dzięki temu możliwe jest

opracowywanie nowych metod terapeutycznych. Jednymi z obiecujących

metod są terapie z użyciem niektórych gatunków bakterii, u których wykryto

powinowactwo do gromadzenia się w okolicach lub wewnątrz nowotworu

dzięki obecności beztlenowego środowiska oraz wykorzystanie ich jako

wektorów szczepionkowych zawierających odpowiednie antygeny

stymulujące układ immunologiczny. Informacje na ten temat zostaną

omówione w dalszych rozdziałach.

Monika Dyńda

50

2. Charakterystyka wybranych drobnoustrojów wykorzystanych

w terapii przeciwnowotworowej

2.1. Clostridium novyi-NT

Bakterie z rodzaju Clostridium należą do rodziny Clostridiaceae i liczą

obecnie 203 gatunki, przy czym tylko kilka z nich wywiera toksyczny wpływ

na organizm człowieka. Są to Gram-dodatnie-laseczki wytwarzające spory.

Clostridium to przeważnie bezwzględne beztlenowce. Są to organizmy

wytwarzające silne egzotoksyny jak np. neurotoksyny powodujące tężec.

Toksyny Clostridium są aktywnymi biologicznie białkami o charakterze

antygenowym, czyli stymulującym wytwarzanie przeciwciał w organizmie

gospodarza.

Najbardziej niebezpieczną, powodującą objawy kliniczne jest alfa-toksyna

wywołująca miejscową nekrozę tkanek poprzez stworzenie beztlenowego

środowiska w obrębie danej tkanki spowodowanego obumieraniem naczyń

krwionośnych [2].

Mimo swojej toksyczności, bakterie Clostridium, a raczej ich spory, zostały

wykorzystane w eksperymentalnych terapiach bakteryjnych nowotworów.

Techniki biologii molekularnej pozwoliły na uzyskanie nietoksycznego

szczepu – Clostridium novyi-NT od słów „non toxic” poprzez wyeliminowanie

genu, którego ekspresja powodowała wydzielanie egzotoksyny alfa [10, 15].

Rysunek1. Obraz mikroskopowy spor Clostridium novyi-NT [15]


51

Do celów terapeutycznych wykorzystano również cykl życiowy

Clostridium, a dokładniej ich bezwzględną beztlenowość, która umożliwia

zasiedlanie przez bakterie wnętrza guzów litych.

W przeprowadzonych doświadczeniach, które zostaną przedstawione

w tym podrozdziale spory podawano do organizmu poprzez ich wstrzyknięcie,

gdzie po określonym czasie kiełkowały rozpoczynając działanie terapeutyczne.

Brak genu odpowiedzialnego za syntezę alfa-toksyn powoduje, że układ

immunologiczny nie reaguje gwałtownie, jego aktywność uwidacznia się

dopiero po zasiedleniu bakterii w obszarze nowotworu. Badania nad

wykorzystaniem Clostridium w leczeniu nowotworów wykazały ich korzystne

działanie, przejawiające się toksycznym działaniem bakterii na komórki

rakowe. Beztlenowe warunki mikrośrodowiska nowotworu sprawiają, że

bakterie gromadzą się w zmienionym chorobowo miejscu, następnie czynniki

wydzielane przez komórki nowotworowe aktywują bakterie do działania

litycznego, w wyniku czego Clostridium namnaża się i powoduje nekrozę

pobliskich komórek czyli nowotworu.

Rysunek2. Mechanizm działania antynowotworowego bakterii jest uzależniony

od mikrośrodowiska nowotworu. Kiedy Clostridium wnikają do organizmu, wytwarzają spory,

które lokalizują się wewnątrz litego guza, czyli w miejscu występowania środowiska

beztlenowego. Wewnątrz guza następuje kiełkowanie spor i wytworzenie toksyn, które działają

nekrotycznie na komórki nowotworowe [14]

Monika Dyńda

52

Jednym z badań w modelu zwierzęcym, jakie przeprowadzono, było

wyznakowanie komórek rakowych lucyferazą. Powszechnie lucyferaza jest

traktowana jako wskaźnik wzrostu nowotworu, dlatego spadek jej aktywności

oznacza nekrozę komórek rakowych. Następnie bezpośrednio w okolice

komórek nowotworowych podano przetrwalniki zmodyfikowanego szczepu

Clostridium. Po ich wykiełkowaniu, które nastąpiło po 24 godzinach

zaobserwowano spadek aktywności lucyferazy, co jest przejawem lizy

komórek nowotworowych [20, 17].

Badania przeprowadzono też na szczurach z rakiem mózgu (glejak

wielopostaciowy), którego terapia jest mocno utrudniona a samo wycięcie

guza powoduje naruszenie zdrowych tkanek i niekiedy prowadzi do

upośledzenia funkcjonowania całego organizmu. Po podaniu C. novyi-NT

zaobserwowano remisję choroby, jednak efektem ubocznym było powstanie

obrzęku w mózgu. Nie uznano tego faktu za wadę terapii, ponieważ leczenie

obrzęku mózgu jest zdecydowanie łatwiejsze niż eliminacja samego

nowotworu [17].

Dowód na gromadzenie się C. novyi-NT wewnątrz guza potwierdziły

badania, które opisano w artykule z 2004 roku, gdzie zastosowano model

nowotworu rozprzestrzeniający się w wątrobie i jamie opłucnej królików

powodujący śmierć po około ośmiu tygodniach. Zwierzęta zaszczepiano

zawiesiną komórek nowotworowych a po jego rozwoju, szczepiono

bakteriami. Po 4 dniach od podania C. novyi króliki uśmiercano, oraz

wycinano zmiany nowotworowe poddając je opracowaniu histopatolo-

gicznemu [1].


53

Rysunek 3. Na zdjęciach przedstawiono przekrój poprzeczny guza u królika kontrolnego oraz

zaczepionego C. novyi-NT. Zdjęcia a i b przedstawiają przekrój tkanki guza w powiększeniu 40x,

wybarwionej hematoksyliną&eozyną oraz obszar nekrotyczny oznaczony literą N. A- to grupa

kontrolna, b – organizm zaszczepiony C. novyi-NT. C- powiększenie 400x pokazuje wybarwione

na fioletowo, wyraźnie widoczne jądra komórek guza oraz składniki cytoplazmy w obszarze

nekrotycznym. D – w przypadku C. novyi-NT obraz nekrotyczny jest ujednolicony, niemożliwe

jest wyodrębnienie jąder i poszczególnych składników nowotworu. Zdjęcia e i f przedstawiają ten

sam preparat w powiększeniu 1000x wybarwiony zielenią Pico. Na zdjęciu f widoczne są

wybarwione na zielono formy wegetatywne C. novyi-NT [1]

Wyniki badań są obiecujące, jednak należy wziąć pod uwagę fakt, że taka

terapia może nie być do końca bezpieczna, ponieważ bakterie w organizmie

mogą odpowiednio zmutować i zacząć ponownie produkować toksyny. Są to

jedne z niebezpieczeństw terapii, które musi zostać szczegółowo poznane

i wyeliminowane. Trudno również ustalić czy C. novyi-NT zachowają

aktywność terapeutyczną w obszarach tlenowych guza.

Monika Dyńda

54

2.2. Listeria monocytogenes

W terapiach antynowotworowych bakteriami Listerianie wykorzystuje się

pojedynczych właściwości czynników wirulencji, lecz cały cykl rozwojowy

bakterii,używając w tym celu najczęściej żywych, atenuowanych szczepionek

bakteryjnych.

Działanie szczepionki jest oparte na cyklu życiowym L. monocytogenes

i polega na wywoływaniu w organizmie silnej odpowiedzi immunologicznej,

która zostanie później skierowana przeciwko komórkom nowotworowym.

Bakterie wchodzące w skład szczepionki zostają wzbogacone o antygen

specyficzny dla danej odmiany nowotworu. Listeria przeprowadzają swój

naturalny cykl życiowy, czyli wnikają do komórek, a antygeny nowotworowe

podlegając silnej ekspresji są prezentowane kolejno cząsteczkom MHC klasy

pierwszej i drugiej. Następnie limfocyty T odbierają sygnał od antygenów, po

czym zostaje uruchomiona silna odpowiedź immunologiczna skierowana

przeciwko komórkom nowotworowym [3].


55

Rysunek4. Indukcja odpowiedzi immunologicznej przez L. monocytogenes poprzez stymulowane

rozpoznanie antygenu przez komórki dendrytyczne oraz współdziałaniu MHC klasy I i II

z jednoczesną aktywacją cytotoksycznych limfocytów T, które atakują komórki nowotworowe

[3]

L. monocytogenes wnikają do organizmu drogą pokarmową, a dokładniej

przez komórki nabłonka jelitowego. Bakterie te wykorzystują do tego komórki

M, do których wiążą się z udziałem adhezyn-internaliny A, co pozwala na

bezpośrednie wnikanie bakterii przez nabłonek. Po przekroczeniu bariery

w postaci nabłonka i śluzu, Listeria rozpoczyna penetrację komórek

gospodarza poprzez proces fagocytozy. Po wydostaniu się z fagosomu,

bakterie poruszają się w cytoplazmie komórki wytwarzając specjalną strukturę,

Monika Dyńda

56

tzw. „kometę listeryjną” na biegunach komórki, w której skład wchodzą

filamenty aktynowe, które uległy polimeryzacji po zadziałaniu produktu

bakterii – białka ActA. Bakterie przechodzą następnie do sąsiedniej komórki,

gdzie zostają otoczone przez podwójną błonę fosfolipidową, z której ponownie

się wydostają przy pomocy produkowanych enzymów (fosfolipaz).

Cały proces penetracji komórek gospodarza przez L. monocytogenes

odbywa się z pobudzeniem układu immunologicznego, w tym zachodzących

z udziałem antygenów zgodności tkankowej klasy pierwszej i drugiej. Rozwój

L. monocytogenes następuje wewnątrz komórek prezentujących antygen,

którymi są monocyty, makrofagi i komórki dendrytyczne. Bakterie prezentują

swoje antygeny (trawione w lizosomie białka i toksyny) cząsteczkom MHC

klas I i II i tym samym stymulują do odpowiedzi limfocyty T pomocnicze

i cytotoksyczne (CD4+ CD8+), co w przypadku nowotworów jest zjawiskiem

pozytywnym, ponieważ specyfikacja nowotworu powoduje zahamowanie

aktywności limfocytów T regulatorowych oraz cząsteczek MDCs. Taka

stymulacja odpowiedzi immunologicznej znalazła zastosowanie przy produkcji

wektorów szczepionkowych, które byłyby wykorzystywane jako środek

terapeutyczny chorób, gdzie ważna jest wtórna indukcja układu

odpornościowego [21].

Najnowsze badania przeprowadzone z użyciem L. monocytogenes

dotyczyły skonstruowania oraz wykorzystania wektora szczepionkowego

w terapii raka szyjki macicy, poprzez stymulację i skierowanie odpowiedzi

immunologicznej przeciwko komórkom nowotworowym.

Działanie szczepionki opisano w artykułach w 2008 roku, gdzie badania

przeprowadzono na pacjentkach z zaawansowanym stadium raka szyjki

macicy. Produkt poddawany badaniom to Lovaxin-C czyli rekombinowane,

żywe, atenuowaneL. monocytogenes zawierające specyficzny dla nowotworu

antygen oraz pozbawioną hemolitycznych właściwości listeriolizynę O [16].

Przełomowym wynikiem badań okazała się nie tylko skuteczność szczepionki,

ale również jej bezpieczeństwo wobec ludzkiego organizmu. Po trzech

miesiącach kuracji zaobserwowano uwstecznienie objawów chorobowych

u siedmiu z 15 pacjentek, u których chemioterapia oraz radioterapia nie

przyniosły efektów.

Kobietom poddawanym terapii szacowano około pół roku życia, włączono

je więc w fazę kliniczną pierwszą i drugą. W odstępie trzech tygodni

otrzymywały one szczepionkę. Do trzech miesięcy terapia przebiegała

bezproblemowo w porównaniu do standardowych metod. Jedynymi efektami

ubocznymi były gorączka, dreszcze i nudności. Po tym czasie, u pięciu

pacjentek choroba postąpiła, natomiast u siedmiu stan ustabilizował się. Jedna

z pacjentek, która była w IV stadium zaawansowania choroby została

poddana chemioterapii, w wyniku czego po dwóch latach guz całkowicie

zanikł [12].


57

2.3. Pseudomonas aeruginosa

Najbardziej intensywne badania prowadzone są obecnie na jednym

z niedawno zmodyfikowanych szczepów Pseudomonas o symbolu BN10. Jest

to szczep Gram-ujemny, tlenowy z jedną wicią, nie formujący spor, zdolny do

produkcji związków powierzchniowo czynnych, m. in.ramnolipidów

należących do biosurfaktantów. Ramnolipidy mają glikolipidową budowę,

a w ich w skład wchodzi ramnoza tworząc hydrofilową główkę oraz kwas

beta-hydroksydekanowy formujący hydrofobowy ogon związku. Bakterie

Pseudomonas charakteryzuje synteza oraz wydzielanie na zewnątrz tych

związków. Z wyżej wymienionego szczepu udało się wyizolować na żelu

krzemionkowym dwa rodzajeramnolipidów – RL-1 i RL-2, które zbadano

metodą rezonansu magnetycznego i spektrometrii masowej (NMR-MS).

Działanie poszczególnych związków badano m.in. na liniach komórkowych

białaczki promielocytarnej (HL-60). Mechanizmem działania ramnolipidów

jest wprowadzanie zmian morfologicznych w komórkach fagocytów

i komórek niefagocytujących poprzez reorganizację cytoszkieletu w wyniku

czego następuje różnicowanie keratynocytów i fibroblastów. Działanie

przeciwnowotworowe obserwowano w przypadku RL-1, który spowodował

zahamowanie żywotności komórek nowotworowych nawet w 50% już przy

niskich stężeniach. W komórkach eksponowanych na RL-1 obserwowano

zmiany kondensacji chromatyny, fragmentację organelli czy zmianę struktury

cytoplazmy [5].

Monika Dyńda

58

Rysunek 5. Wpływ różnych ilości stężeń RL-1 i RL-2 na żywotność komórek nowotworowych

białaczki promielocytarnej i ostrej białaczki limfoblastycznej typu B [5]

Bakterie P. aeruginosa mają również zastosowanie jako wektor

szczepionkowy. Ogólna zasada działania tego typu szczepionek polega na

indukcji komórek układu odpornościowego oraz ukierunkowaniu aktywności

komórek żernych i stymulacji odpowiedzi humoralnej przeciwko czynnikom

chorobotwórczym, które wcześniej przez organizm nie zostały rozpoznane. W

tym celu najczęściej wprowadza się do DNA bakterii odpowiednie geny

kodujące określone białka, które ulegają ekspresji w organizmie gospodarza

i stymulują odpowiedź immunologiczną dzięki lepszemu zaprezentowaniu

komórkom żernym swoistego antygenu.

W artykule z 2006 roku, autorstwa Epaulard’a i Toussaint’a [7], została

opisana szczepionka zawierająca zmodyfikowane szczepy P. aeruginosa.

Szczepionka, której bazą była albumina o zwiększonej przyswajalności,

składała się z zawiesiny bakterii P. aeruginosa oraz mysich komórek

dendrytycznych i limfocytów T. Do badań użyto myszy, u których

indukowano nowotwór o typie czerniaka, którym wszczepiono podskórnie,

w miejsce gdzie rozwijał się nowotwór terapeutyczną mieszaninę. Działanie

substancji obserwowano po 5 i 12 dniach od implantacji nowotworu, gdzie

zaobserwowano remisję choroby u 6 myszy.


59

Inne zastosowanie bakterii Pseudomonas przedstawiono w badaniach

przeprowadzonych zaledwie rok temu. Naukowcy wykorzystali szczepy tych

bakterii do stymulacji aktywności cytotoksycznej komórek działających

przeciwko komórkom nowotworowym. Mowa o krwi pępowinowej

(CB – Cord Blood), która stanowi bogate źródło komórek krwiotwórczych oraz

NK indukowanych cytokinami (CIK). Są to komórki efektorowe, które

wykazują aktywność antynowotworową zarówno w eksperymentach in vitro

jak i in vivo w odniesieniu do odmian złośliwych nowotworu. Ich głównym

zadaniem jest ekspresja limfocytów T oraz komórek dendrytycznych i tym

samym wywołanie efektu cyto-toksycznego wobec komórek nowotworowych.

W przeprowadzonym eksperymencie wykazano, że komórki CIK indukowane

szczepem Pseudomonas indukują wydzielanie prozapalnych cytokin jak IFN-

gamma oraz wzmagają ekspresję receptorów TLR2, TLR4, TLR6, co powo-

duje zwiększenie stopnia cytotoksyczności wobec komórek rakowych [24].

Rysunek6. Wykres przedstawiający wzrost komórek nowotworowych poddanych wpływowi

komórek CIK. Komorki nowotworowe potraktowane komórkami CIK przedstawione są na

wykresie jako linie A, B i C (najmniejszy wzrost komórek), pozostałe krzywe przedstawiają

wyniki wzrostu nowotworu bez CIK. H to kontrola [23]

Monika Dyńda

60

2.4. Salmonella typhimurium

Bakterie z rodzaju Salmonella są ruchliwymi, orzęsionymi, Gram-

ujemnymi pałeczkami. Nie wytwarzają toksyn, jak ma to miejsce w przypadku

Clostridium, Pseudomonas czy Listeria. Niepożądanym immunostymulatorem

jest jedynie lipopolisacharyd występujący w błonie zewnętrznej, który

nadmiernie indukuje odpowiedź organizmu w momencie lizy komórki

bakteryjnej, co może prowadzić do szoku toksycznego [13].

Pierwszym i najczęściej wykorzystywanym do badań jest szczep o obni-

żonej toksyczności VNP20009, w którym usunięto gen Purl potrzebny do

syntezy puryn oraz msbB czego efektem była zmniejszona indukcja TNF-α

przez LPS w organizmie gospodarza. Efekt ten zapobiega szokowi

septycznemu [6].

Autorzy jednego z artykułów z 2010 roku przedstawiają wyniki badań na

temat szczepu VNP20009, z których wynika, że wśród 31 pacjentów

z czerniakiem złośliwym, tylko u trzech stwierdzono kolonizację guza przez

bakterie. Jedną z możliwych odpowiedzi dlaczego tak się dzieje jest stopień

wrażliwości układu odpornościowego danego pacjenta na szczep VNP20009,

który próbuje usunąć go z organizmu. Podczas podawania S. typhimurium

myszom z rakiem okrężnicy zauważono duży napływ krwi do wnętrza guza,

co doprowadziło do nekrozy centralnej części nowotworu, tam gdzie bakterie

proliferowały. Efekt ten został wykryty dzięki wysokiemu stężeniu cytokin

w organizmie, które efekt ten powodowały. W martwiczych obszarach guza

bakterie są zdolne do bardzo intensywnego rozwoju. Stwierdzono więc, że

niepowodzenie poprzednich badań było spowodowane zbyt małą indukcją

uwalniania TNF-α, co jest niezbędne do efektywnej inwazji i niszczenia

nowotworu. Dlatego kolejnym krokiem było zmodyfikowanie szczepu

S. typhimurium w taki sposób, aby był wystarczająco wirulentny wobec guzów

przy jednocześnie zmniejszonych efektach ubocznych [11]. Podanie dożylnie

dużej ilości bakterii nie wywołuje niepożądanych efektów u ludzi i jest dobrze

tolerowane przez organizm, dlatego szczep VNP jest postrzegany jako

stosunkowo bezpieczny wektor szczepionkowy [4].

Obiecujące badania z wykorzystaniem bakterii Salmonella przeprowadzili

polscy naukowcy z Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie. Badania

dotyczyły zmodyfikowania szczepu VNP w taki sposób, aby uzyskany wektor

szczepionkowy wykazywał jak największe powinowactwo oraz toksyczność

wobec komórek nowotworowych. Efekt taki próbowano uzyskać poprzez

wymuszenie opóźnionej nadekspresji białka SipB w miejscach zmienionych

chorobowo. Białko to jest kodowane przez pierwszą wyspę patogenności

i odpowiada za indukcję apoptozy komórkowej, oraz usunięcie genu Trg

odpowiedzialnego za chemotaksję bakterii w obszary o zwiększonym

stężeniu glukozy. Nagromadzenie glukozy występuje w zewnętrznej części


61

guzów litych, dlatego usunięcie tego genu zwiększało powinowactwo

gromadzenie się szczepu wewnątrz guza [4].

Próbowano znaleźć sposób w jaki bakterie mogłyby skuteczniej dotrzeć do

komórek nowotworowych. Wykorzystano różnego rodzaju receptory, które

w wyniku chemotkasji przyciągnęłyby S. typhimurium do specyficznych

regionów guza.

Szczep VNP zmodyfikowano tak, aby produkował fragment przeciwciała,

który wiązałby antygen karcynoembrionalny (CEA) na powierzchni komórek

nowotworowych. Dzięki oddziaływaniu przeciwciała z CEA bakteria

pozostaje w guzie nowotworowym, zakaża niektóre komórki nowotworowe

i wywołuje ich śmierć. Natomiast opóźniona nadekspresjagenu sipB potęguje

ten efekt [4].

Do zweryfikowania skuteczności terapeutycznie zmodyfikowanego

szczepu użyto myszy, którym wszczepiono podskórnie komórki nowotworów

czerniaka i gruczolaka oraz czekano na jego rozwój. Zmodyfikowane bakterie

Salmonella, czyli szczep VNP20009 z wbudowaną sekwencją 6xHis-sipB

podawano w miejsce, gdzie rozwijał się nowotwór. Wyniki pokazały

jednoznacznie, że bakterie ze wstawką hamują rozwój nowotworu

w większym stopniu niż zastosowanie dzikiego szczepu VNP20009. U 80%

myszy zakażonych nowotworem zaobserwowano całkowite wyeliminowanie

choroby w wyniku zastosowania szczepu Salmonella z genem sipB, natomiast

przy zastosowaniu bakterii bez wstawki, efekt ten wystąpił jedynie u 20%

myszy. Pozytywne wyniki dotyczą linii komórkowych gruczolakoraka

MC38CEA i nowotworów płuc, w przypadku których zaobserwowano

zahamowanie rozwoju komórek nowotworowych w porównaniu z grupą

kontrolną [4].

Podstawową wadą zmodyfikowanego szczepu VNP20009 była słaba

inwazyjność względem komórek MC38CEA oraz ich niska przeżywalność in

vivo. Było to spowodowane nagła ekspresją genu sipB. Aby wyeliminować

niepożądane efekty, wprowadzono do plazmidu wstawkę składającą się

z promotora PsifB, histydyny oraz białka sipB, który miał za zadanie

indukować opóźnioną ekspresję genu kodującego białko sipB. Przesunięta

w czasie ekspresja, czyli zachodząca już wewnątrz komórki bakteryjnej

pozwoliła na zwiększenie przeżywalności szczepu oraz inwazyjności

zakażanych komórek eukariotycznych.

Nowopowstałego szczepu użyto ponownie stosując wybrane modele

nowotworowe u myszy. W przypadku zwierząt z gruczolakorakiem

(MC38CEA), po podaniu bakterii już w ósmym dniu zaobserwowano

zmniejszenie guzów, natomiast cztery dni później guzy były niemożliwe do

zmierzenia. W ciągu miesiąca eliminacja nowotworu nastąpiła u trzech myszy.

W przypadku czerniaka zlokalizowanego w płucach, lepsze efekty zaobser-

Monika Dyńda

62

wowano przy zastosowaniu szczepu VNP/SipB niż samego VNP. U dwóch

osobników nastąpiła całkowita eliminacja nowotworu [4].

Rysunek 7. Efekty terapii nowotworowej przebiegającej z zastosowaniem zmodyfikowanych

szczepów bakteryjnych Salmonella. Najlepsze efekty terapeutyczne uzyskano stosując szczep

VNP/sipB [4].

W 2009 roku szczep VNP/SipB, proces jego otrzymywania oraz

wykorzystanie jako wektora szczepionkowego zgłoszono do Urzędu

Patentowego. Wynalazek został opatentowany na początku 2013 roku.

Aktualnie trwają dalsze badania nad ulepszeniem i wykorzystaniem bakterii

Salmonella oraz opisanego wektora VNP/sipB w leczeniu przeciw-

nowotworowym.


63

3. Podsumowanie

Mimo dużego postępu w opracowywaniu nowych leków o działaniu

przeciwnowotworowym, skuteczność klasycznych terapii jest wciąż

niezadowalająca. Dlatego też naukowcy na całym świecie poszukują

alternatywnych sposobów leczenia pozbawionych większości skutków

ubocznych. Wszystkie te metody, mają swoje zalety oraz wady, ale próby

ich zastosowania w przyszłości mogą przynieść oczekiwane skutki. Jednym

z nowszych kierunków badań jest zastosowanie bakterioterapii, czyli

wykorzystanie określonych gatunków bakterii w celu niszczenia nowo-

tworów. Wiele prób klinicznych przyniosło pozytywne skutki leczenia,

dlatego warto analizować i ulepszać te metody terapii przeciw-

nowotworowej.

Literatura

1. Agrawal N., Bettegowda Ch., Cheong I., Geschwind J. F., Drake Ch. G.,

Hipkiss E. L., Tatsumi M., Dang L. H., Diaz L. A., Pomper M., Abusedera M.,

Wahl R. L., Kinzler K. W., Zhou S., Huso D.L., Vogelstein B., Bacteriolytic

therapy can generate a potent immune response against experimental tumors,

PNAS, 101 (2004), s. 15172-15177.

2. Boyd N., Walker P., Thomson R., The prevention of experimental Clostridium

novyi gas gangrene in high-velocity missile wounds by passive immunisation,

J Med. Microbiol., 5 (1972), s. 459-465

3. Brockstedt D., Dubensky T., Promises and challenges for the development

of Listeria monocytogenes – based immuno therapies, ExpertRev. Vaccines,

7 (2008), s. 1069-1084

4. Chorobik P., Opracowanie metody zwiększenia efektywności bakterii Salmonella

typhimurium w terapii przeciwnowotworowej poprzez nadekspresję endogennego

białka SipB, Kraków, Uniwersytet Jagielloński, (2010)

5. Christova N., Tuleva B., Kril A., Georgieva M., Konstantinov S., Terzlyski I.,

Nikolova B., Stoineva I., Chemicalstructure and in vitro antitumoractivity

of rhamnolipids from Pseudomonasaeruginosa BN10, Appl. Biochem.

Biotechnol., 170 (2013), s. 676-689

6. El-Bahy A. A., Abou-Aisha K., Noaman E., Mahran L. G., Regression

of murineehrlichascites carcinoma using tumor-targeting Salmonella

VNP20009 – comparison with the effect of the anticancerdrugdoxorubicin.

Advances in cancer, Research&Treatment, (2012)

7. Epaulard O. 1, Toussaint B., Quenee L., Derouazi M., Bosco N., Villiers Ch.,

Le Berre R., Guery B., Filopon D., Crombez L., Marche P., Polack B., Anti-

tumor immunotherapy via antigendelivery from a live attenuated genetically

engineered Pseudomonas aeruginosa type III secretion system-based vector,

Nature, 14 (2006), s. 656-661

8. Epaulard O. 1, Toussaint B., Quenee L., Derouazi M., Bosco N., Villiers Ch.,

Le Berre R., Guery B., Filopon D., Crombez L., Marche P., Polack B., Anti-

tumor immunotherapy via antigendelivery from a live attenuated genetically

Monika Dyńda

64

engineered Pseudomonas aeruginosa type III secretion system-based vector,

Nature, 14 (2008), s. 656-661

9. Hoption C. S. A, Netten J. P, Netten C., Dr William Coley and tumor regression:

a place in history or in the future, Postgrad Med. J, 79 (2003), s. 672-680

10. http://www.hopkinsmedicine.org/neurology_neurosurgery/centers_clinics/spin

e/clinical_trials/chordoma_study_announcement.pdf

11. Leschner S., Weiss S., 2010 Salmonella – allies in the fight against cancer,

J Mol Med. 88 (2010), s. 763-773

12. Lowry F., Live Listeria vaccine proves safe against end-stagecervical

ca in humantrial. Ob. Gyn. News, 15 (2008), s. 2

13. Mizerski W., Bednarczuk B., Kawalec M. Słownik bakterii [w:] Salmonella.

Adamantan, Łódź, (2008)

14. Olson, West Virginia University,

www2.hsc.wvu.edu/som/physio/ppts/FIS%201-

Intro%20to%20bacteriology%20Olson%202006.ppt

15. Plomp M., McCaffery M., Cheong I., Huang X., Bettegowda Ch., Kinzler K.,

Zhou S., Vogelstein B., Malkin A., Spore coat architecture of Clostridium

novyi NT spores, J. Bacteriol. 189 (2007), s. 6457-6468

16. Radulovic S., Brankovic-Magic M., Malisic E., Jankovic R., Dobricic J.,

Plesinac-Karapandzic V., Maciag P. C., Rothman J., Therapeutic cancer

vaccines in cervical cancer: phase I study of Lovaxin-C,J B.U.ON. 14 (2009),

s. 165

17. Staedtke V., Bai R., Kinzler K., Zhou S., Vogelstein B., Riggins G., The

genetically engineered Clostridium novyi-NT is effecacious in the treatment

of intracranial glioblastomas, Neuro-Oncology, 16 (2014), s. 79-95

18. Szala S., Komórki mikrośrodowiska nowotworowego: cel terapii przeciw-

nowotworowej, Nowotwory Journal of Oncology, 57 (2007), s. 633-645

19. Szala S., Jarosz M. 2011. Nowotworowe naczynia krwionośne,

PostepyHigMedDosw, 65: 437-446

20. Tiffen J. C., BaileyCh. G., Ng C., Rasko J., Holst J., Luciferaseexpression

and bioluminescencedoes not affect tumor cellgrowth in vitro or in vivo,

Molec. Cancer, 9 (2010), s. 299-307

21. Wiki.biol.uw.edu.pl

22. Yu H., Bacteria-mediated disease therapy, ApplMicrobiolBiotechnol,

92 (2011), s. 1107-1113

23. Zhang L., Hou Y., Zhang J., Hu J., Zhang K., Cytotoxicity of cytokine-induced

killer cells targeted by a bispecific antibody to gastric cancer cells, Oncol.

Lett., 5 (2013), s. 1826-1832

24. Zhang Z., Wang L. P., Zhao X. L., Wang F., Huang L., Wang M., Chen X. F.,

Li H., Zhang Y., Pseudomonas aeruginosa injection enhanced antitumor

cytotoxicity of cytokine-induced killer cells derived from cordblood, Biomed

Pharmacother, 68 (2014), s. 1057-1063


65

Wykorzystanie bakterii i ich wektorów w terapii przeciwnowotworowej

Współcześnie, jednymi z oporniejszych terapii jest leczenie chorób nowotworowych, dlatego

naukowcy starają się opracować jak najskuteczniejsze metody w zwalczaniu komórek nowo-

tworowych. Szerokim spektrum badań zostały poddane bakterie jak na przykład Clostridium

novyi, Listeriamonocytogenes, Pseudomonasaeruginosa czy Salmonella typhimurium, gdzie

wykorzystano ich specyficzny cykl życiowy w opracowywaniu skutecznych terapii przeciw-

nowotworowych. W przypadku C. novyizrekombinowano pozbawiony toksyczności szczep,

który jako bezwzględny beztlenowiec namnaża się w beztlenowym mikrośrodowisku guzów

litych. Natomiast L. monocytogenes została użyta do skonstruowania szczepionki z żywymi,

atenuowanymi bakteriami, które mają za zadanie wzbudzać odpowiedź humoralną organizmu

i skierować ją przeciwko komórkom nowotworowym. Szczepionka była testowana między

innymi u kobiet w zaawansowanym stadium raka szyjki macicy. Podobne działanie wykazuje P.

aeruginosa, która działa immunostymulująco na organizm gospodarza. Zastosowanie w terapii

nowotworowej znalazł również specjalnie zmodyfikowany szczep BN10, który wydziela

ramnolipidy działające toksycznie na komórki białaczki promielocytarnej. Obiecujące wyniki

badań uzyskano również w przypadku S. typhimurium, a konkretnie szczepu VNP20009, który

wykazuje nekrotyczne działanie w przypadku czerniaka złośliwego oraz szczep VNP/SipB

skonstruowany przez polskich naukowców, który przyniósł pozytywne efekty u myszy

z gruczolakiem, a nawet całkowitą eliminację nowotworu.

Anti-tumor therapies with application of bacteriaand theirvectors

Nowadays, cancer therapy is very challenging treatment so scientists are trying to discover the

most effective way to kill cancer cells. Bacteria like Clostridium novyi, Listeria monocytogenes,

Pseudomonas aeruginosa or Salmonella typhimurium were widely examined and surveys were

focused on use their lifecycle in cancer therapy. During examination of C. novyi new recombinant

strain was created and this strain was deprived of toxic features. This strain as obligate anaerobe

was able to proliferate in anaerobic microenvironment of solid tumors. On the other hand

L. monocytogenes was used to create vaccine. This vaccine contained alive, attenuated bacteria

and the aim of this vaccine was to activate humoral immune response against cancer cells. This

treatment was tested among women with late stadium of cervical cancer. Similar action can be

observed in therapy with P. aeruginosa, which has immunostimulating influence on human

organism. The strain of P.aeruginosa BN10 is also used in cancer therapy. This strain excrete

ramnolipids, which can be toxic to promyelocytic leukemia cells. The examination of

S. typhimurium ended with some promising results especially examination of strain called

VNP20009. This strain was observed to cause necrosis of malignant melanoma cells. Another

examined strain VNP/SipB, which was created by Polish scientists was tested on mice and it was

effective in lung adenoma, even some mice fully recovered from this type of cancer

66

Anna Posmysz1

Zastosowanie krwi pępowinowej w medycynie

czyli o możliwościach terapeutycznych

komórek macierzystych

pobranych z krwi pępowinowej

1. Wstęp

Praca ta ma charakter przeglądowy. Na podstawie dostępnych publikacji

w bazie PubMed oraz na stronach Polskiej Akademii Nauk dokonano

usystematyzowania wiedzy na temat możliwości zastosowania krwi

pępowinowej w leczeniu różnych jednostek chorobowych. Temat komórek

macierzystych i ich wykorzystania w terapii chorób neurodegeneracyjnych,

po zawałach serca i mózgu, medycynie sportowej czy nawet onkologii jest

bardzo często poruszany w środowiskach naukowych i medycznych.

Ponieważ krew pępowinowa jest odpadem medycznym, warto jest

rozważyć jej zdeponowanie w bankach krwi pępowinowej czyli dokonanie

tzw. bankowania. Aktualny stan wiedzy pozwala sformułować wnioski, że

komórki macierzyste obecne w krwi pępowinowej wykazują duże

możliwości różnicowania się w różnorodne typy komórek trzech listków

zarodkowych. Ponadto, łatwiej je wyizolować niż np. ze szpiku kostnego.

Mogą być stosowane w leczeniu nie tylko najbliższych nam osób, ale także

ludzi zupełnie niespokrewnionych np. chorych na białaczkę, pacjentów po

zawałach sercach, udarach mózgu i nowotworach będących zmorą

współczesnego świata. Użycie tych komórek nie wymaga tak

skomplikowanych zabiegów jak w przypadku poszukiwań dawcy szpiku

kostnego, a tym samym leczenie może odbyć się szybciej, niż w sytuacji

gdy dopiero poszukuje się odpowiedniego dawcy szpiku do przeszczepu.

Jak wiadomo, im szybciej podejmie się terapię chorego, tym lepsze są dla

niego rokowania.

1 [email protected], studia doktoranckie, Katedra Nauk Fizjologiczno-Medycznych,

Zakład Fizjologii, Akademia Wychowania Fizycznego im. Jerzego Kukuczki w Katowicach,

www.awf.katowice.pl


czyli o możliwościach terapeutycznych komórek macierzystych pobranych z krwi pępowinowej

67

2. Wprowadzenie

Komórki macierzyste (SC) to takie komórki, które charakteryzują się

dużymi możliwościami samoodnowy oraz zdolnością do wielokierunkowego

różnicowania się. Rozróżniamy trzy ich rodzaje: embrionalne, zarodkowe

i somatyczne. Wymienione typy komórek macierzystych wykazują

zróżnicowany potencjał. Komórki węzła zarodkowego są totipotencjalne,

zarodkowe – pluripotencjalne, płodowe oraz somatyczne czyli te występujące

w organizmie po urodzeniu –multipotencjalne [1, 2]. Wśród somatycznych SC

wyróżnić można dwa podtypy: hematopoetyczne SC (HSC) oraz mezen-

chymalne SC (MSC). Zarówno HSC jak i MSC są multipotencjalne. W tabeli

nr 1 zestawiono najważniejsze cechy wyżej wymienionych komórek w celu

porównawczym.

2.1. Embrionalne komórki macierzyste

Embrionalne komórki macierzyste (ES) w porównaniu z pozostałymi

SC są najbardziej plastyczne – mają zdolność do przekształcania się

w dowolny rodzaj komórek [1]. Komórki macierzyste ulegają podziałom

symetrycznym (ES) lub asymetrycznym (płodowe SC, somatyczne SC).

Somatyczne SC są obecne w znacznie większej liczbie typów tkanek

i odpowiadają za odbudowywanie i regenerację organów i tkanek przez

całe nasze życie. Na rycinie nr 1 przedstawiono graficznie pochodzenie

ludzkich komórek macierzystych [3].

Rys. 1. Pochodzenie i właściwości ludzkich komórek macierzystych wg Jezierskiej-Woźniak [3]

Anna Posmysz

68

2.2. Różnicowanie komórek macierzystych i ich nisza

Cecha nazywana różnicowaniem to nic innego jak zdolność komórki do

zmiany fenotypu pod wpływem ekspresji, której ulegają geny związane

z daną czynnością komórki. SC wcale nie dzielą się tak często, w dodatku

do podziału potrzebują odpowiedniego bodźca. Przykład takiego zjawiska

świetnie ukazuje znane wielu sportowcom dyscyplin wytrzymałościowych

zwiększone wytwarzanie czerwonych krwinek w organizmie człowieka

przez szpik kostny w warunkach hipoksji tlenowej podczas przebywania

i trenowania na wysokości ponad 1500 m n.p.m. Drugi popularny przykład

to złuszczanie się naskórka. Powszechnie wiadomo, że naskórek często

ulega uszkodzeniu i gdyby nie komórki macierzyste, jego samoodnawianie

się nie byłoby możliwe. Komórki macierzyste są regulowane przez tzw.

niszę czyli mikrośrodowisko fizjologiczne o specyficznych właści-

wościach. To właśnie ona wysyła określone sygnały, które mają wpływ na

powstawanie wewnętrznych sygnałów między komórkami macierzystymi

i tym samym decyduje o przeznaczeniu komórki oraz reguluje proliferację

komórkową [4, 5].

Tab. nr 1. Charakterystyka cech komórek macierzystych – opracowanie własne

Totipotencjalne Pluripotencjalne Multipotencjalne Unipotencjalne

Zdolne do

różnicowania

się w dowolny

rodzaj

komórek

budujących

organy

dorosłego

osobnika,

a także do

komórek

tworzących

łożysko.

Komórki

totipotencjalne

to zygota

i blastomery

Zdolne do

różnicowania się

w dowolny typ

komórek

somatycznych,

z wyłączeniem

komórek trofoblastu.

Pluripotencjalne

komórki macierzyste,

które pochodzą

z wczesnego stadium

zarodkowego

(kilkudniowa

blastocysta) dają

początek wszystkim

rodzajom komórek.

Do komórek

pluripotencjalnych

zalicza się również

dorosłe komórki

macierzyste szpiku

kostnego

Zdolne do

różnicowania się

w różne typy

komórek,

zazwyczaj

jednak typy te

mają podobne

właściwości

i pochodzenie

embrionalne. Do

tej grupy

komórek zalicza

się między

innymi komórki

macierzyste

pochodzące

z krwi

pępowinowej

Zdolne do

różnicowania się

tylko i wyłącznie

w jeden typ

komórek.

Komórki

macierzyste

wykazujące

tą zdolność

nazywa się także

prekursorowymi.

Komórki

unipotentne to

np. keratynocyty



69

2.3. Przeszczepy komórek macierzystych

Po przeszczepieniu komórki macierzyste namnażają się. Prawie nigdy nie

atakują komórek biorcy i nie dochodzi do odrzucenia przeszczepu. Jest to

szczególne istotne przy ratowaniu chorych na białaczki. Komórki macierzyste

z krwi pępowinowej nie są nośnikiem chorób nowotworowych, które mogą się

rozwijać w trakcie życia człowieka np. na skutek oddziaływania środowiska

lub pod wpływem zaburzonej ekspresji genów [6]. Świadczy to o bezpie-

czeństwie ich stosowania, które to cały czas jest udowadniane w badaniach

naukowych na całym świecie. Najwięcej komórek macierzystych znajduje się

w ludzkich embrionach, ale pozyskiwanie ich z płodów, np. w wyniku aborcji,

nie może być akceptowane bez zastrzeżeń.

Drugim, alternatywnym źródłem może być krew pępowinowa pobierana

z pępowiny. Do niedawna była ona niszczona w szpitalach wraz z łożyskiem

czyli stanowiła tzw. odpad medyczny. Ponieważ pobieranie krwi pępowinowej

tuż po porodzie nie wiąże się z żadnym ryzykiem dla matki czy noworodka,

powinno się rozważyć bankowanie krwi pępowinowej. Jednak przecho-

wywanie krwi w tzw. bankach krwi pępowinowej wiąże się z pewnymi

kosztami.

2.4. Bankowanie krwi pępowinowej

Jak pisze w swoim artykule Pilonis, nie wszyscy uważają bankowanie krwi

pępowinowej za coś wspaniałego i potrzebnego. Autorka opisuje postawę

Profesora Wiesława Wiktora Jędrzejczaka z Warszawskiego Uniwersytetu

Medycznego, który nie uważa, by bankowanie krwi pępowinowej przez banki

komercyjne wiązało się z takimi korzyściami, jakie przedstawiane są rodzicom

nowonarodzonych dzieci. Profesor podkreśla potencjał wykorzystania SC

z krwi pępowinowej w autoprzeszczepach i terapii medycznej, lecz nie do

końca zgadza się z polityką komercyjnych banków krwi [7].

Innym Znanym naukowcem opisywanym przez Pilonis w tym samym

artykule jest Profesor Ryszard Poręba, prezes Polskiego Towarzystwa

Ginekologii. Stoi on na stanowisku, że zainteresowane kobiety spodziewające

się dzieci, które pytają o bankowanie krwi, powinny mieć dostęp do wszelkich

sprawdzonych i rzetelnych informacji na ten temat [7].

Profesor Jędrzejczak sam dokonał przeszczepu komórek macierzystych

choremu na białaczkę i nie jest wrogiem jego stosowania, zwłaszcza że bardzo

często trudno jest znaleźć dawcę szpiku [7]. Pilonis przytacza słowa

Jędrzejczaka – Wykonano już kilka tysięcy takich przeszczepień i połowa z nich

się powiodła. Chodzi jednak o krew innego dziecka, a nie krew samego

chorego. W 1/4 przypadków bowiem we krwi pępowinowej już znajdują się

komórki nowotworowe, mimo że nie ma klinicznych objawów białaczki. Poza

tym, wskutek reakcji przeszczepu przeciw nowotworowi, obca krew daje lepszy

Anna Posmysz

70

efekt terapeutyczny. Prowadzi się wiele prac badawczych dotyczących

wykorzystania komórek macierzystych do odbudowy uszkodzonych tkanek. Nie

są to jednak nawet badania kliniczne, nie mówiąc o wykorzystywaniu tej

technologii jako metody leczenia. Wyniki wykonanych dotąd pojedynczych

przeszczepów autologicznych krwi pępowinowej nie zostały udokumentowane

w czasopismach naukowych. Opisane zostało w 2007 r. tylko 1 udane przesz-

czepienie autologiczne, ale w przypadku ostrej białaczki limfoblastycznej, co

oznacza, że może nastąpić jej nawrót – komentuje Jędrzejczak [7]. Pilonis

stwierdza, że wszyscy znani jej eksperci są zgodni, że krew pępowinowa

w przeszczepach allogenicznych może uratować życie pacjentom, dla których

nie można znaleźć odpowiedniego dawcy szpiku. Dotyczy to około 40%

chorych [7]. Profesor Jędrzejczak zaznacza, że całe piękno krwi pępowinowej

tkwi w tym, że zgodność cech może wynosić 4 na 6, podczas gdy do

przeszczepu szpiku konieczne jest 9 na 10. Ponadto, jest ona dostępna

błyskawicznie, a dawcy szpiku się szuka, co trwa często długo [7]. Polskie

Ministerstwo Zdrowia nie stosuje specjalnych działań promujących

bankowanie krwi pępowinowej ani nie finansuje takich zabiegów, gdyż uważa,

że potrzeba znacznie więcej badań naukowych na ten temat [7]. Jednocześnie

daje wolność obywatelom w tym temacie, więc mogą oni swobodnie zawierać

transakcje komercyjne [7]. 12 października 2010 roku został przyjęty przez

Radę Ministrów tzw. Program Wieloletni: Narodowy Program Rozwoju

Medycyny Transplantacyjnej na lata 2011-2020. W programie tym przewi-

dziany jest rozwój allogenicznego bankowania komórek krwiotwórczych krwi

pępowinowej w celach publicznych [7].

3. Naukowe uzasadnienie bankowania krwi pępowinowej i jej

zastosowania w terapii medycznej

3.1. Badania chińskich naukowców dotyczące leczenia SAA

Lin Na Xie i Fang Zhou z Chin przeprowadzili eksperyment, w który

zaangażowali pacjentów chorych na ciężką niedokrwistość aplastyczną

(SAA). Wszystko przebiegało za zgodą pacjentów i odpowiednich komisji

bioetycznych. Pacjentów z ciężką postacią SAA poddawali zwiększonemu

leczeniu immunosupresyjnemu (IST). Następnie dokonywali transfuzji

krwi pępowinowej (UCB). W rezultacie wykazali oni wysoką wydajność

leczenia SAA przy pomocy transfuzji krwi pępowinowej, a także dowiedli

niskiego ryzyka nawrotów tej choroby. Wspomagane leczenie immuno-

supresyjne jakie zastosowali to nic innego jak popularny cyklofosfamid

w niskich dawkach i tzw. antymiocytowe globuliny [8].

Innym, równie ciekawym i spektakularnym eksperymentem tego zespołu

naukowego było badanie przeprowadzone na dwóch pacjentach z SAA.



71

Tym razem także zaaplikowali chorym leczenie IST i przetoczyli krew

pępowinową. Badacze skupili się na obserwacji oznak powikłania

nazywanego powszechnie przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD).

Badanie trwało dwa lata i przez ten dwuletni okres obserwacji nie

zauważyli objawów GVHD. Nie było także żadnych nawrotów [8].

3.2. Eksperymenty z MSC

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) po raz pierwszy zidenty-

fikowano w szpiku kostnym [9]. Wykazano, że MSC mogą działać przeciw-

zapalnie i immunoregulująco oraz naprawczo w uszkodzeniach płuc

i chorobach serca [10]. Szpik kostny (BM) to główne źródło MSC. Niestety,

liczne badania wykazały, że wraz z wiekiem obniża się liczba MSC w szpiku,

a pobór tych komórek ze szpiku kostnego jest inwazyjny [10, 11].

W 2004 roku naukowiec Wang wraz ze swoim zespołem, wykazali, że

ludzka krew pępowinowa (UCB) jest bogata w MSC [12]. Te komórki

posiadały charakterystyczne dla MSC markery i tak samo jak MSC

z innych tkanek i z BM były zdolne do indukcji różnicowania. Aktualnie

komórki macierzyste MSC są stosowane na szeroka skalę w modelowaniu

doświadczalnym przeróżnych chorób np. neurodegeneracyjnych, urazów

rdzenia kręgowego, uszkodzenia płuc, nadciśnienia płucnego i innych [13, 14].

Próbowano użyć MSCs indukowanych z krwi pępowinowej w celu

leczenia stanów przedrzucawkowych u ciężarnych [15]. W tym celu

ludzkie pępowiny pozbierano ze szpitali położniczych. Wszystko odbywało

się wg odpowiednich procedur etycznych i za zgodą komisji bioetycznej na

te badania oraz za zgodą pisemną darczyńców. Następnie pępowiny były

cięte na kawałki o grubości 3 mm i przenoszone na odpowiednio

przygotowane pożywki, które w swym składzie zawierały 10 % płodowej

surowicy bydlęcej (FBS), penicylinę oraz streptomycynę. Następnie tkanki

były umieszczane w specjalnej mieszaninie z hialuronidazy, kolagenazy

i dyspazy w temperaturze 37 stopni. Potem następowało odwirowywanie

i umieszczenie w pożywce, a następnie komórki trawiono trypsyna

i pasażowano. Komórki od piątej do ósmej generacji poddano cytometrii

przepływowej w celu identyfikacji i wykorzystano je do indukcji oraz

transplantacji.

Badacze w opisywanym doświadczeniu przeprowadzili różnicowanie

osteogenne i adipogenne, używając do tego odpowiednich pożywek. I tak

do osteogenezy używano pożywki DMEM – F12, którą odpowiednio

zmodyfikowano poprzez uzupełnienie 10% PBS i innymi substancjami.

Natomiast do adipogenezy użyto pożywki DMF, także zmodyfikowanej.

Wykonano również próbę kontrolną. Po upływie niecałych 4 tygodni

zauważono, że komórki macierzyste z krwi pępowinowej uległy zarówno

Anna Posmysz

72

osteogenezie, jak i adipogenzie. Zauważono złogi wapnia w osteocytach oraz

wakuole z lipidami w adipocytach. Dodatkowo wykonywano odpowiednie

barwienie indukowanych adipocytów poprzez zastosowanie tzw. oil red O,

natomiast osteocyty wybarwiono czerwienią alizarynową. Dzięki cytometrii

przepływowej autorzy określili obecność bądź brak fenotypowych antygenów

powierzchniowych charakterystycznych dla MSC. Wykazali także przydatną

rolę MSC w leczeniu stanów przedrzucawkowych [15].

Tab. nr 2. Zestawienie antygenów powierzchniowych w komórkach wyhodowanych

w doświadczeniu

Antygeny powierzchniowe obecne Antygeny powierzchniowe, których

nie wykryto

aCD105 CD19

CD73 CD45

CD90 CD11b

HLA-DR

CD34

Źródło: wyniki Fu L, Liu Y, Zhang D, Xie J, Guan H, Shang T [15]

3.3. 3.3 Badania kliniczne

W Korei wykorzystano krew pępowinową do wykonania doświadczenia

transplantacji komórek macierzystych z krwi pępowinowej i terapii

komórkowej w leczeniu schorzeń u ludzi [16].

W swoim artykule badacz Young-Ho Lee podaje, że w Korei pobieranie

i gromadzenie krwi pępowinowej jest regulowane przez odpowiednie ustawy

i wytyczne. Zebrana krew pępowinowa (CB) jest poddawana obróbce tzn.

wirowaniu w specjalnym, sterylnym urządzeniu [8]. Tak jak i na całym

świecie, w Korei istnieją banki krwi pępowinowej publiczne i prywatne.

Badacze stwierdzają, że CB jest dobrym źródłem do terapii komórkowej

pacjentów cierpiących na różne jednostki chorobowe. Wskazują jednocześnie,

że pomimo coraz większej ilości banków prywatnych i publicznych, wskaźnik

wykorzystania CB pozostaje wciąż niski.

Naukowiec na podstawie analizy różnych publikacji stwierdził, że krew

pępowinowa może być źródłem komórek macierzystych używanych dla

ratowania życia i pomaga ona w regeneracji różnych tkanek. Uważa

jednocześnie, że istnieje potrzeba prowadzenia dalszych badań i informuje, że

krew pępowinowa jest bankowana na całym świecie w prywatnych bankach

krwi, a stosowanie komórek krwi z pępowiny, która właściwie stanowi odpad

medyczny, jest jak najbardziej etyczne. Poniżej zamieszczono schemat



73

z publikacji Young-Ho Lee, który w klarowny sposób ilustruje możliwości

zastosowania krwi pępowinowej w medycynie [16].

Rys. 2. Możliwości różnicowania HSC i MSC znajdujących się w krwi pępowinowej

Źródło: Clinical utilization of cord blood over human health: experience of stem cell

transplantation and cell therapy using cord blood in Korea [16]

3.4. Polskie jednostki badawcze

Polscy naukowcy wyhodowali ludzkie komórki nerwowe z krwi

pępowinowej w 2002 roku. Wyhodowano trzy różne typy komórek

nerwowych wchodzących w skład ludzkiego mózgu. Mogą się one okazać

przydatne w leczeniu uszkodzeń powstałych po udarze oraz w chorobie

Parkinsona. Dokonał tego zespół badaczy w składzie: Leonora Bużańska,

Barbara Zabłocka, Krystyna Domańska-Janik z Centrum Medycyny

Doświadczalnej i Klinicznej PAN w Warszawie oraz Eugeniusz Machaj,

Zygmunt Pojda z Zakładu Hematologii Eksperymentalnej Centrum

Onkologii w Warszawie [17, 18].

4. Podsumowanie

Badania kliniczne prowadzone na całym świecie, również w Polsce,

potwierdzają zasadność bankowania krwi pępowinowej. Krew ta wraz

z pępowiną stanowi tzw. odpad medyczny. Należałoby informować

zainteresowane osoby o korzyściach płynących z bankowania krwi

pępowinowej i możliwościach jej wykorzystania w przyszłości.

Aktualnie za pomocą terapii komórkami macierzystymi leczy się

kilkadziesiąt jednostek chorobowych. Wśród nich są nowotwory takie jak

np. białaczka, rak piersi i nerki. Choroby neurodegeneracyjne, cukrzycę,

Anna Posmysz

74

choroby krwi, zaburzenia układu odpornościowego i wiele chorób

uwarunkowanych genetycznie także leczy się przy użyciu komórek

macierzystych. Planuje się dalsze badania naukowe nad zastosowaniem

komórek macierzystych z krwi pępowinowej np. w leczeniu choroby

Parkinsona czy Alzheimera.

Istnieje potrzeba informowania społeczeństwa o możliwościach

wykorzystania krwi pępowinowej w przyszłości, jednakże nie powinny to

być informacje przejaskrawione oraz niesprawdzone lecz takie, które

opierają się na badaniach naukowych.

Literatura

1. Klimanskaya I, Chung Y, Becker S, Lu S. J, Lanza R, 2006, Human

embryonic stem cell lines derived from single blastomeres, Nature 444: 481-

485

2. Tsonis P. A. 2002, Regenerative biology: the emerging field of tissue repair

and restoration, Differentation 70: 397-409

3. Jezierska-Woźniak K, Nosarzewska D, Tutas A, Mikołajczyk A, Okliński M,

Jurkowski K.,2010, Wykorzystanie tkanki tłuszczowej jako źródła

mezenchymalnych komórek macierzystych, Postepy Hig Med Dosw, 64:326-32

4. Nilson S. K, Simons P. J., 2004, Transplantable stem cells: home to specific

niches.Curr Opin Hmatol, 11: 102-106

5. Li L., Xie T., 2005, Stem cell niche: structure and function. Annu Rev Cell

Dev Biol, 21: 605-631

6. Cohen Y., Nagler A., 2004, Umbilical cord blood transplantation--how, when

and for whom? Blood Rev, Sep;18(3):167-79

7. Pilonis H., 2010, Pępowinowy marketing. Służba Zdrowia, e-book nr 93-100,

13 grudzień

8. Xie L. N., Zhou F., 2015, Unexpected unrelated umbilical cord blood stem

cell engraft in two patients with severe aplastic anemia that received

immunosuppressive treatment: A case report and literature review,

Department of Hematology, The General Hospital of Jinan Military, Jinan,

Shandong 250031, P.R. China 9. Friedenstein A. J, Piatetzky-Shapiro II, Petrakova K. V., Osteogenesis in

transplants of bone marrow cells. 1966. J Embryol Exp Morphol 16:381-390 10. Mueller S. M., Glowacki J., 2001, Age-related decline in the osteogenic

potential of human bone marrow cells cultured in three-dimensional collagen

sponges, J Cell Biochem 82:583-590. doi: 10.1002/jcb.1174

11. Kode J. A., Mukherjee S., Joglekar M. V., Hardikar A. A., 2009,

Mesenchymal stem cells: Immunobiology and role in immunomodulation

and tissue regeneration, Cytotherapy 11:377-391. doi:

10.1080/14653240903080367

12. Wang H. S., Hung S. C., Peng S. T., et al., 2004, Mesenchymal stem cells in

the Wharton's jelly of the human umbilical cord, Stem Cells 22:1330-1337.

doi: 10.1634/stemcells.2004-0013



75

13. Pullamsetti S. S, Schermuly R., Ghofrani A., et al., 2014, Novel and emerging

therapies for pulmonary hypertension, Am J Respir Crit Care Med 189:394-

400. doi: 10.1164/rccm.201308-1543PP

14. Moodley Y., Atienza D., Manuelpillai U., et al., Human umbilical cord

mesenchymal stem cells reduce fibrosis of bleomycin-induced lung injury,

Am J Pathol. 2009;175:303-313. doi: 10.2353/ajpath.2009.080629

15. Fu L., Liu Y., Zhang D., Xie J., Guan H., Shang T., 2015, Beneficial effect

of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells on an endotoxin-

induced rat model of preeclampsia, Exp Ther Med Nov;10(5):1851-1856.

Epub 2015 Sep 11

16. Lee Y.-H., 2014, Clinical utilization of cord blood over human health:

experience of stem cell transplantation and cell therapy using cord blood

in Korea, Korean J Pediatr Mar; 57(3): 110-116. Published online 2014 Mar

31. doi: 10.3345/kjp.2014.57.3.110 17. Bużańska L., Zychowicz M., Sarnowska A., Domańska-Janik K., 2013,

Bioengineering of neural stem cell niche, Postępy Biochem 59 (2): 175-86

Rev. Polish

18. Grabowska I., Streminska W., Janczyk-Ilach K., Machaj E. K., Pojda

Z., Hoser G., Kawiak J., Moraczewski J., Ciemerych M. A., Brzoska E., 2013,

Myogenic potential of mesenchymal stem cells – the case of adhesive fraction

of human umbilical cord blood cells. Curr Stem Cell Res Ther Jan; 8(1): 82-90

Zastosowanie krwi pępowinowej w medycynie czyli o możliwościach

terapeutycznych komórek macierzystych pobranych z krwi

pępowinowej

Dokonano przeglądu najnowszych badań dotyczących użycia komórek macierzystych

pochodzących z krwi pępowinowej. W tym celu posłużono się bazą PubMed oraz informacjami

podawanymi przez Polską Akademię Nauk. Istnieją badania naukowe, które dowodzą, że

przeszczepy komórek macierzystych pochodzących z krwi pępowinowej są bardzo bezpieczne

i prawie nigdy nie atakują komórek biorcy – nawet przy braku pokrewieństwa między biorcą

i dawcą. Komórki macierzyste z krwi pępowinowej nie są nośnikami chorób. Ponadto, pozys-

kanie ich z krwi pępowinowej nie wiąże się z ryzykiem ani dla płodu ani dla matki. Przemawia to

za bezpieczeństwem ich stosowania i daje im przewagę nad komórkami macierzystymi

uzyskiwanymi z innych źródeł. Zespoły naukowe na całym świecie badają skuteczność terapii

z zastosowaniem komórek macierzystych krwi pępowinowej. Przykładowo, badacze z Chin

wielokrotnie potwierdzili skuteczność leczenia chorych z ciężką niedokrwistością aplastyczną.

Inny zespół zastosował te komórki w leczeniu stanów przedrzucawkowych u ciężarnych.

W Polsce również bada się możliwości terapeutyczne komórek macierzystych z krwi

pępowinowej. Komórki macierzyste są pomocne w terapii wielu chorób np. cukrzycy, białaczki,

nowotworów i chorób neurodegeneracyjnych. Ponieważ krew pępowinowa jest odpadem

medycznym, warto rozważać jej zdeponowanie w tzw. bankach krwi pępowinowej, gdyż

w przyszłości może zostać ona wykorzystana do leczenia.

Anna Posmysz

76

Application of umbilical cord blood in medicine – therapeutic

possibilities of stem cells derived from umbilical cord blood

We made a review of recent studies on the use of stem cells derived from umbilical cord blood.

For this purpose, the PubMed database and some information given by The Polish Academy

of Science were used. There are many scientific publications, which show that transplants of stem

cells derived from umbilical cord blood are very safe, also almost never attack the recipients’

cells, even in the absence of consanguinity between the recipient and the donor. Stem cells from

umbilical cord blood are not disease vehicles. Moreover, their acquisition from umbilical cord

blood is associated neither with problems for child nor for mother. That facts speaks in favor

of the safety of the usage of stem cells and gives them an advantage over stem cells derived from

other sources. Scientific teams all over the world are studying the efficacy of therapy with the use

of stem cells from umbilical cord blood. For example, researchers from China have repeatedly

confirmed the effectiveness of the treatment of patients with severe aplastic anemia. Another

team, applied these cells in the treatment of pre-eclampsia in pregnant women. In Poland, the

therapeutic possibilities of stem cells from umbilical cord blood are also tested. Stem cells are

helpful in therapy of many diseases, for example: diabetes, leukemia, cancer and neuro-

degenerative diseases. Because cord blood is a medical waste, its deposit should be considered in

the so called umbilical cord blood banks, because it may be used in the future for medical therapy.

77

Małgorzata Waldowska1, Wioleta Kowalska

2, Justyna Woś

3

Fenotypowe i funkcjonalne zróżnicowanie

populacji komórek NKT

1. Wstęp

Komórki NKT (naturalkiller T cells)stanowią niewielką subpopulację

limfocytów T. Pomimo swojej małej liczebności, odgrywają istotną rolę

w regulacji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, pojawiając się jako

jedne z pierwszych w miejscu infekcji czy zapalenia [1]. W wyniku

odpowiedniej stymulacji antygenem, limfocyty te potrafią szybko uwalniać

cytokiny i wpływać na funkcje komórek dendrytycznych, komórek NK

(naturalkillers), limfocytów B, a także limfocytów T CD4+ i CD8+,

determinując kierunek i jakość odpowiedzi nabytej [2, 3].

Nazwa tej populacji limfocytów nawiązuje do pierwotnie zaobserwo-

wanej, jednoczesnej ekspresji pewnych markerów charakterystycznych dla

komórek NK oraz limfocytów T. Podobnie jak inne subpopulacje

limfocytów T, komórki NKT posiadają na swojej powierzchni receptory

TCR (T cell receptor). Umożliwiają one konwencjonalnym limfocytom

Trozpoznawanie antygenów peptydowych związanych z cząsteczkami

MHC klasy I lub II, zaśkomórkom NKT warunkują odpowiedz wobec

własnych i obcych antygenów o charakterze lipidowym i glikolipidowym

[4, 5].Cechy współdzielone z komórkami NK to obecność typowych dla

nich receptorów, zwłaszcza CD161 (u myszy CD161c znany jako NK1.1)

[6, 7], a także zdolność do udziału w bezpośredniej odpowiedzi cyto-

toksycznej poprzez wytwarzanie perforyny i granzymów [7]. W świetle

aktualnej wiedzy, powyższa definicja komórek NKT zdaje się być niewys-

tarczająca i niepełna. Obecnie uznaje się, iż ekspresja wspomnianych

markerów komórek NK nie jest warunkiem koniecznym do określenia

komórek jako NKT [4]. Wszakże wiele konwencjonalnych limfocytów T

zwiększa ekspresję tych markerów (włączając CD161/NK1.1) przy

aktywacji. Pewna część komórek NKT w ogóle nie wykazuje ich obecności

na swojej powierzchni [7, 8], podczas gdy na innych ich ekspresja ulega [email protected], Katedra i Zakład immunologii Klinicznej, II Wydział

Lekarski z Oddziałem Anglojęzycznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, www.umlub.pl, [email protected], Katedra i Zakład immunologii Klinicznej, II Wydział Lekarski

z Oddziałem Anglojęzycznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, www.umlub.pl [email protected], Katedra i Zakład Immunologii Klinicznej, II Wydział Lekarski

z Oddziałem Anglojęzycznym, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, www.umlub.pl


78

zmianom w zależności od stopnia dojrzałości, aktywacji, a u myszy

również podłoża genetycznego [9, 10]. Sięgając 25 lat wstecz do począt-

kowych doniesień dotyczących limfocytów T rozpoznających lipidy

[11‚13], wiedza na temat biologii i właściwości komórek NKT uległa

znacznemu pogłębieniu. Dlatego konieczne stało się uaktualnienie

i uporządkowanieich nomenklatury.

Przedstawiona w niniejszym artykule klasyfikacja komórek NKT opiera

się na rodzaju używanych łańcuchów TCR, a także rodzaju cząsteczki

prezentującej rozpoznawane antygeny.Biorąc pod uwagę powyższe

kryteria, wśród komórek NKT wyróżniamy trzysubpopulacje przedsta-

wione w tabeli 1. Dwie pierwsze subpopulacje posiadają ‘kanoniczne’

receptory TCR i rozpoznają antygeny prezentowane przez niepolimorficzne

cząsteczki MHC klasy I- podobne. Z historycznego punktu widzenia,

termin kanoniczny lub niezmienny TCR odnosi się do komórek NKT, które

posiadają łańcuch Vα24Jα18 u ludzi (Vα14Jα18 u myszy).Stąd takie

komórki NKT określa się jako invariant NKT (iNKT) [14, 15]. Udowod-

niono, że rozpoznają one antygeny prezentowane przez cząsteczki CD1d

[16].Na łamach Science, w 1995 roku ukazała się praca o odkryciu nowego

genu powiązanego z cząsteczką MHC, MR1 [17]. Dopiero w 2003 roku

zidentyfikowano grupę komórek, która wiąże się ze wspomnianymi

cząsteczkami. Nazwano jemNKT lubkomórkami MAIT (mucosa-associated

invariant T cells) [13]. Podobnie jakiNKT, ich receptory TCR są częściowo

niezmienne; zawierają łańcuch Vα19 połączony z Jα33 segmentem u ludzi

(Vα7.2Jα33 u myszy) [18, 19]. Zatem iNKT oraz mNKT można zakwali-

fikować do grupycanonicalcNKT. Trzecia grupa komórek NKT, określana

jako variant NKT (vNKT), obejmuje limfocyty T CD1d-reaktywne, ale

korzystające z heterogennego kanonu łańcuchów tworzących receptory TCR.

2. Komórki cNKT

2.1. KomórkiiNKT

Najlepiej poznaną grupą limfocytów NKT są komórki typu I, znane

również jako invariant NKT [20]. Lepsze zrozumienie biologii tych komórek

stało się możliwe dzięki odkryciu przez zespół Kawano w 1997 roku α-

galaktozyloceramidu (α-GalCer) [14].Ten syntetyczny glikolipid otrzymywany

z gąbek morskich Agelasmauritianus, efektywnie aktywuje komórki iNKT.

Tak jak inne antygeny lipidowe czyglikolipidowe, α-GalCer wiążesię

z cząsteczkami CD1d (niepolimorficznymi glikoproteinami strukturalnie

podobnymi do MHC) [21], które są obecne w zwiększonej ilości na

powierzchni komórek APC, takich jak komórki dendrytyczne [22].Dopiero tak

utworzone kompleksy są rozpoznawane przezniezmienne receptory TCR

Fenotypowe i funkcjonalne zróżnicowanie populacji komórek NKT

79

zarównomysich, jak i ludzkich komórekiNKT [23]. Zastosowanie kompleksów

CD1d/α-GalCer związanych z odpowiednim fluorochromem stanowi dobrą

metodę identyfikacji komórek iNKT [24]. Komórki NKT typu I używają

ograniczonej puli genów do rearanżacji swoich receptorów TCR. Ich

wyjątkowy receptor TCR składa się z łańcuchaα (Vα24Jα18 u ludzi,

Vα14Jα18 u myszy) powiązanego z łańcuchem β (Vβ11 u ludzi, Vβ8.2, Vβ7,

Vβ2 u myszy) [9, 25]. Kolejną typową cechą tej populacji komórek jest

ekspresja markerów,które współdzielą z komórkami NK, np. CD161 u ludzi

(NK1.1 homologicznie u myszy) [26] [Tabela 1]. Właściwie większość

limfocytów T NK1.1+ u myszy C57BL/6 stanowią omawianą subpopulację

komórek NKT [8, 27], podczas gdy u ludzi, subpopulacja komórek

Vα24/Vβ11 stanowi mniejszość spośródodsetka limfocytów T CD161+ [28].

Należy zaznaczyć, że większość komórek NKTopuszczając grasicę nie posiada

markera NK1.1 na swojej powierzchni. Zyskują go dopiero na obwodzie,

stając się wówczas w pełni dojrzałe [29]. Komórki iNKT zdają się być wysoce

autoreaktywne nawet w stanie spoczynku; wykazują fenotyp komórek

aktywowanych/pamięciz obecnością na swojej powierzchni charakte-

rystycznych markerów aktywacji: CD69, CD44, CD122, oraz w mniejszym

stopniu CD62L – markera komórek dziewiczych, które przemieszczają się do

węzłów chłonnych [30].

Obecność koreceptorów CD4 i CD8 na powierzchni limfocytówiNKT,

dzieli je na komórki CD4+CD8

-występujące w znacznej większości (90%

u myszy), i pozostałe CD4-CD8

-doublenegative(DN). Zaobserwowano, iż

tylko u ludzi występuje dodatkowo subpopulacja CD4-CD8

+(CD8αα

+

i CD8αβ+)[7, 31]. Zarówno CD4

+ jak i CD4

- iNKTsą odnajdywane u miejscach

występowania innych limfocytów T, jednakże częstość ich występowania

waha się znacznie w różnych tkankach. Najliczniej mysie komórki

Vα14Jα18NKT zasiedlają wątrobę (10-40% limfocytów wątroby), natomiast

są również obecne w szpiku kostnym, płucach, tarczycy, śledzionie, węzłach

chłonnych, jelitach, czy we krwi obwodowej [27, 32].U ludzi,dystrybucja

komórek Vα24Jα18 NKT w tkankach zdaje się być podobna jak u myszy.

Jednakczęstośćich występowania u ludzi jest znacznie obniżona, choć

odnotowuje się znaczne różnice osobnicze. Badania zespołu Kenna wykazały,

że ludzka wątroba zawiera wyraźnie mniej komórek Vα24Jα18 (<1%),

w porównaniu z tą samą tkanką u myszy [33]. Komórki iNKT stanowią

0,01-0,1% ludzkich komórek mononuklearnych krwi obwodowej, chociaż

u pewnych osób obserwowano wartości przewyższające 3% [34, 35].

Ta szczególna populacja limfocytów T, mimo korzystania z ograniczonego

repertuaru receptorów TCR, wykazuje szeroki i zróżnicowany zakres

działania. Uważa się, iż komórki NKT typu I odgrywają kluczową rolę

w rozwoju miejscowej i uogólnionej odpowiedzi immunologicznej.

Potrafią modulować reakcje organizmu w wielu schorzeniach obejmu-


80

jących nowotwory, choroby autoimmunizacyjne, infekcje czy alergie

[36‚40]. Za pomocą swoich receptorów TCR, rozpoznają one antygeny

lipidowe zarówno prawidłowych komórek naszego organizmu, jak

i antygeny drobnoustrojów i komórek nowotworowych [14, 41, 42].

Stymulując komórki iNKT antygenem (α-GalCer), zauważono gwałtowny

(w ciągu kilku godzin) wzrost produkcji IL-4 i IFN-γ [9]. Późniejsze

badania wykazały, że tak szybkie uwalnianie wspomnianych cytokin, które

nota bene stały się znakiem rozpoznawczym komórek iNKT, jest związane

ze stałą ekspresją mRNA [43]. Jednak to nie jedyne cytokinyprodukowane

przez komórki iNKT. Dotychczas udowodniono uwalnianie przez nie

również IL-2, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17, IL-21, czynnika

martwicy nowotworów (TNF),transformującego czynnika wzrostu

β(TGFβ), czychemokin, takich jak białko zapalne makrofagów (MIP-1α)

czy RANTES. Komórki iNKT są także źródłem hematopoetycznych

czynników wzrostu, np. czynnika stymulującego tworzenie kolonii

granulocytów i makrofagów (GM-CSF) [9, 44, 45].Wśród wymienionych

cytokin znajdują się te charakterystyczne dla limfocytów Th1, jak i Th2

[14]. Zatem paradoksalnie komórki iNKT mogą uczestniczyć zarówno

w reakcjach prozapalnych jak i przeciwzapalnych [8]. Uwolnione cytokiny

wpływają na szereg komórek uczestniczących w odpowiedzi immunolo-

gicznej: komórki dendrytyczne, neutrofile, makrofagi, limfocyty Tγδ,

konwencjonalne komórki T, limfocyty B, komórki NK, czy komórki NKT

typu II. Rola immunoregulacyjna komórek iNKT wydaje się być kluczową

dla ich działania [46]. Wielokierunkowy wpływ tej niezwykłej populacji

limfocytów T, próbuje się tłumaczyć istnieniem subpopulacji, różnych pod

kątem funkcjonalnym i fenotypowym.

2.1.1. Zróżnicowanie komórekiNKT

Ludzkie komórki CD4+ i CD4

-iNKTcharakteryzują się różnym profilem

wydzielanych cytokin. DN oraz CD8+CD4

- są fenotypowo i funkcjonalnie

zbliżone, wykazując dominującą składową typu Th1 (IFN-γ) wśród

uwalnianych cytokin, podczas gdy komórki CD4+ generują zarówno

cytokiny typu Th1, jak i Th2 (IFN-γ, TNF, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13) [47].

Funkcjonalne różnice pomiędzy subpopulacjami CD4+ i DN iNKT

u myszy rysują się mniej wyraźnie [48]. W literaturze znajdują się donie-

sienia o lokalizacji komórek NKT CD4+ o profilu typu Th2 w płucach i ich

potencjalnej roli w rozwoju astmy [49]. Ponieważ komórki iNKT zasied-

lające różne tkanki i narządy, mogą wykazywać różnice w ekspresji

markerów powierzchniowych i profilu wydzielanych cytokin, trudno jest

jednoznacznie określić ich funkcje. Zgodnie z wynikami opublikowanymi

w 2003 roku przez Crowe’a i współpracownikówna modelu mysim,


81

komórki CD4- NKT wątroby promują odrzucanie nowotworu, natomiast

inne subpopulacje komórek NKT wywodzące się z tarczycy, śledziony, czy

komórki CD4+ NKT wątrobynie wykazują podobnych właściwości

ochronnych [50]. Według Kenna i współpracowników, komórki Vα24Jα11

pochodzące z ludzkiej wątroby są źródłem cytokin typu Th1 (IFN i TNF),

ale nie Th2 (IL-4). Wykazali oni także znaczne obniżenie ilości tych

komórek u pacjentów z nowotworem wątroby, co sugeruje ich potencjalne

działanie przeciwnowotworowe in vivo [33].

W oparciu o preferencję do produkcji poszczególnych cytokin oraz

ekspresję określonych czynników transkrypcyjnych, komórki iNKT zostały

podzielone na subpopulacje, które przywodzą na myśl podział

obserwowany wśród konwencjonalnych limfocytów T. Odnosi się to

zwłaszcza do komórek NKT1, NKT2 i NKT17, wykazujących ekspresję

czynników transkrypcyjnych regulujących linie limfocytów Th1, Th2 oraz

Th17 (odpowiednio T-bet, GATA3 i RORγt) [9, 51] [Rys.1]. Wymienione

subpopulacje powstają naturalnie i znajdują się w grasicy. Dodatkowe

subpopulacje NKTfh oraz FoxP3+iNKT, różnicują się pod wpływem

ekspozycji na antygen[44, 45, 52]. Niedawno odkryto również komórki

iNKT obdarzone funkcją regulatorową, nazwane komórkami NKT10 [53, 54]

[Rys.1]. Wobec takich doniesień, zamiast klasycznego modelu ‘0-1-2-3’

rozwoju komórek iNKT opartego na ekspresji markerów powierzchniowych,

zaproponowano alternatywny model różnicowania ich linii, uwzględniający

ekspresję czynników transkrypcyjnych. Zaobserwowano, iż komórki T-

bethigh

NKT1 są zdolne do produkcji dużych ilości IFN-γ, kluczowego dla

ich zaangażowania w odpowiedź przeciwwirusową czy przeciwnowotwo-

rową [51]. Stanowią dominującą subpopulację komórek iNKT wątroby

i śledziony modelu C57BL/6 myszy [55]. Subpopulacje GATA3high

NKT2

i RORγt+ NKT17 są rzadkie w modelu B6 myszy, ale dominują w innych

szczepach [56]. NKT2 przeważają w płucach; zdają się odgrywać istotną

rolę w schorzeniach, których patogeneza związana jest z przewagą

limfocytów typu Th2 poprzez wydzielane cytokiny: IL-4, IL-9, IL-10 czy

IL-13 [52]. Aktualnie duże zainteresowanie wzbudzają komórki NKT17,

będące źródłem IL-17A. Cytokina ta posiada silne właściwości prozapalne,

indukując uwalnianie IL-6 oraz TNF-α; rekrutuje także neutrofile do

miejsca rozwijającej się reakcji zapalnej.Komórki NKT17 są przede

wszystkim odnajdywane w obwodowych węzłach chłonnych, skórze

i płucach [44, 45]. Zaobserwowano również występowanie komórek iNKT

z ekspresją czynnika transkrypcyjnego FoxP3+, które zachowują się

podobnie do regulatorowych limfocytów T, hamując proliferację innych

limfocytów T [57].Dwie prace, opublikowane w Nature Immunology [58]

oraz w Journal of Immunology [59] w 2012 roku wskazują na niewielką

subpopulację komórek iNKT, która tworzy stabilne i długotrwałeinterakcje


82

z limfocytami B i indukuje powstawanie wczesnych ośrodków rozmna-

żania. W realizacji tego celu, ludzkie i mysie komórki NKTfh wydzielają

IL-21. Do ich powstania niezbędna jest ekspresja czynnika transkryp-

cyjnego Bcl-6 [58]. Niedawno pojawiły się również doniesienia o istnieniu

komórek NKT10, wykazujących ekspresję czynnika E4BP4. Poprzez

uwalnianie IL-10, subpopulacja ta może osłabiać odpowiedź przeciw-

nowotworową, a także chronić przed rozwojem chorób autoimmunolo-

gicznych (wykazano na mysim modelu stwardnienia rozsianego EAE

– experimental autoimmune encephalomyelitis) [53, 54, 60].

2.2. Komórki mNKT

Druga populacja kanonicznych komórek NKT została znacznie słabiej

poznana. Komórki mNKT (mucosal NKT), bo o nich mowa, wykazują

ekspresję niezmiennego łańcucha α receptora TCR, wykorzystując

najczęściej rearanżacjeVα19Jα33 (u myszy) lub Vα7.2Jα33 (u ludzi).

Łańcuch ten jest sparowany z łańcuchem β, powstającym w wyniku

rearanżacji ograniczonej puli genów (Vβ13, Vβ2 u ludzi, Vβ8.2, Vβ6

u myszy) [Tabela 1] [61, 62].Obserwacja, że komórki MAIT w ogóle nie

występują w obwodowych tkankach myszy wolnych od zarazków,

zasugerowała wpływ mikroflory na utrzymanie i rozwój tych komórek na

obwodzie [13]. Chociaż preferencyjnie komórki te gromadzą się w błonach

śluzowych jelit czy płuc [63], zlokalizowano je również we krwi, węzłach

chłonnych, wątrobie, śledzionie czy szpiku kostnym [19, 61]. Stąd komórki

mNKT zwykło się też nazywać komórkami MAIT (mucosal-associated

invariant T cells).

Komórki mNKT powstają w grasicy, gdzie podobnie do limfocytów

iNKT, przechodzą selekcję pozytywną. Ten etapdojrzewania, wiąże się

z ekspresjącząsteczek MR1 (MHC-related protein 1) [64]. W przeci-

wieństwie do komórek iNKT, komórki MAIT dojrzewają całkowicie

dopiero na obwodzie,zyskując profil komórek pamięci i funkcje efektorowe

[64, 65]. Udowodniono, iż myszy pozbawione ekspresji MR1 nie posiadają

komórek MAIT [13]. MR1 stanowi niepolimorficzną cząsteczkę MHC

klasy I, o wysokim stopniu homologii pomiędzy ludźmi a myszami [66].

Uważa się, że działa ona jako cząsteczka prezentująca antygeny [67].

Większość limfocytów mNKT jest podwójnie ujemnych (CD4-CD8

-).

Chociaż u myszy nie występują populacje CD8α+, niektóre komórki Vα7.2

NKT posiadają ekspresję CD8[ 61]. Komórki te wykazują również obecność

markerów komórek NK, NK1.1 u myszy i CD161 u ludzi [19].

Podobnie jak iNKT, komórki mNKTsą zdolne do gwałtownego

uwalniania różnych cytokin, takich jak IL-4, IL-5, IL-10, IL-17 czy IFN-γ

[13, 19, 68]. Potrafią migrować do miejsc rozwoju reakcji zapalnej, gdzie


83

poprzez wspomniane cytokiny wpływają na jej przebieg. Zaobserwowano

gromadzenie się ich w obrębie centralnego układu nerwowego oraz

w płynie mózgowo-rdzeniowym u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym

[69]. W 2006 roku ten sam zespół przedstawił wyniki dokumentujące

ochronną rolę komórek Vα19Jα33 NKT w przebiegu EAE. Ich przewaga

łagodziła chorobę, natomiast niedobór pogarszał [70]. W badaniach

obserwowano również nasilenie aktywności komórek mNKT w odpo-

wiedzi na zakażenia bakteryjne i grzybicze. Niewątpliwe znaczenie odgrywa

tutaj ich preferencyjna lokalizacja w obrębie błon śluzowych [71, 72].

Jednak przez długi czas, identyfikacja konkretnych antygenów prezento-

wanych przez cząsteczki MR1, nastręczała trudności. Dopiero publikacja

zespołu Kjer-Nielsen’az2012 roku, wskazująca na metabolity witaminy B2

pełniące rolę antygenów komórek MAIT, okazała się przełomową.

Zaobserwowano, że drobnoustroje pozbawione możliwości produkowania

ryboflawiny (np. Streptococcus pyogenes czy Enterococcus faecalis) nie

indukują aktywacji komórek mNKT w sposób zależny od MR1 [73].Jako

że stymulacja komórek mNKT może zachodzić również bez pośrednictwa

TCR/MR1 poprzez IL-12 oraz IL-18, zakłada się immunoregulatorowe

działanie komórek mNKT również wobec bakterii i wirusów niesyntetyzu-

jących ryboflawiny [74].

3. NKT typ II

Komórki NKT typu II należą do CD1d-zależnych limfocytów T, jednak

w odróżnieniu od komórek typu I, nie odpowiadają na α-GalCer. Dlatego

bliższe poznanie tej subpopulacji stało się znacznie trudniejsze w porów-

naniu z iNKT. Ostatnie badania ukazują reaktywność tych komórek wobec

sulfatydu. Jednak zastosowanie tetrametrów sulfatyd/CD1d do identyfikacji

komórek NKT typu II nie jest powszechne, z uwagi na małą stabilność

wspomnianych tetramerów i wysokie barwienie tła [75].Wiedza zdobywana

o tych komórkach, opiera się przede wszystkim na badaniachprowadzonych na

mysich modelach modyfikowanych genetycznie. Myszy CD1d-nie posiadają

komórek NKT typu I i II, podczas gdy myszy Jα18-mają jedynie NKT typu I

[76]. Informacja o istnieniu omawianej populacji pojawiła się w literaturze po

raz pierwszy w 1995 roku [77], charakteryzując ją jako nieposiadającą

ekspresji niezmiennego łańcucha Vα14Jα18. Repertuar receptorów TCR

z których korzystają komórki NKT typu II jest zróżnicowany, stąd nazywane

są one także variant albo diverse NKT (vNKT lub dNKT) (Tabela 1). Należy

zaznaczyć, żeniektóre subpopulacje mysich dNKTwykazujączęsto ekspresję

Vα3.2Jα9 i Vα8 [78].Podobnie jak komórki NKT typu I, typ II obejmuje

populacje NK1.1+ i NK1.1

- [79].Wiele z nich wykazuje fenotyp komórek


84

aktywowanych lub pamięci z obecnością CD44high

, CD69+, CD122

+ na

swojej powierzchni [80].

Wydaje się, że komórki NKT typu II reagują głównie z własnymi

antygenami lipidowymi, choć mogą również rozpoznawać podobne

strukturalnie lipidy pochodzące z mikroorganizmów.Rozpoznanie przez ich

receptory TCR kompleksu ligand/CD1d, jest główną drogą prowadzącą do ich

aktywacji. Komórki NKT typu I dodatkowo mogą być pobudzane cytokinami,

obecnymi w podwyższonych stężeniach np. w czasie zapalenia [81]. Badania

wykazały, że stymulacja komórek NKT typu II, prowadzi do produkcji szeregu

cytokin, włącznie z IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-10, IL-17, GM-CSF, a także

perforyny. Cecha ta pozwala im pełnić funkcje immunoregulatorowe.

Podobieństwa do komórek iNKT dotyczą także stałej ekspresji mRNA dla IL-4,

autoreaktywności, czy ekspresji czynnika transkrypcji PLZF [82]. Ponadto,

podobnie jak komórki NKT typu I, typ II może również posiadać

funkcjonalnie różne subpopulacje, a zatem niezwykle ważne jest określenie

korelacji stopnia funkcjonalnego zróżnicowania ze specyfiką rozpoznawanych

antygenów [55].

4. Rysunki

Rysunek 1. Model subpopulacji wyodrębnionych w ramach komórek iNKT, uwzgledniający

ekspresję odpowiednich czynników transkrypcyjnych i uwalniane cytokiny

Źródło: Opracowanie własne na podstawie [51, 54]


85

5. Tabele

Tabela 1. Populacja komórek NKT i ich subpopulacje

mNKT (Vα19i

NKT,

Vα7.2i NKT,lub

komórki MAIT)

iNKT (Vα14i NKT,

Vα24iNKT, NKT

typ I, lub klasyczne

NKT)

Komórki vNKT

(NKT typ

II,dNKT, lub

nieklasyczne

NKT)

TCRα

Vα19Jα33 (M)

Vα7.2Jα33 (H)

Vα14-Jα18 (M)

Vα24-Jα18 (H)

Różne, niekiedy

Vα8, Vα3.2Jα9

(M)

Różne (H)

TCRβ

Vβ8.1/8.2, Vβ6 (M)

Vβ13, Vβ2 (H)

Vβ8.2, Vβ7, lub

Vβ2 (M)

Vβ11 (H)

Różne, niekiedy

Vβ8 (M)

Restrykcja MR1 CD1d CD1d

Reaktywność αManCer αGalCer sulfatyd

Obecność

koreceptorów

DN, CD4+ (M)

DN, CD4+, CD8α+

(H)

CD4+, DN (M)

CD4+, DN, CD8α+

(H)

CD4+, DN

Obecność

receptora

komórek NK

NK1.1 (M)

CD161 (H)

NK1.1 (M)

CD161 (H)

NK1.1

Fenotyp na

obwodzie

Komórek

aktywowanych/

pamięci

Komórek

aktywowanych/

pamięci

Komórek

aktywowanych/

pamięci


86

Źródło: Opracowanie własne na podstawie [13,55, 61, 68, 83] Skróty: cNKT (canonical natural

killer T), iNKT (invariant NKT), mNKT (mucosal NKT), vNKT (variant NKT), dNKT (diverse

NKT), MAIT (mucosal associated invariant T cells), DN (double negative), αManCer(α-

mannosylceramide), αGal-Cer (α-galactosylceramide), MHC (major histocompatibility complex),

TCR (T cell antigen receptor)

6. Podsumowanie

Komórki NKT stanowią niezwykłą populację limfocytów T, występującą

zarówno u myszy, jak i u ludzi. Ich immunologiczny potencjał, pozwala

patrzeć z optymizmem na wykorzystanie ich w przyszłości jako efektywnych

narzędzi we wzmacnianiu odpowiedzi przeciwnowotworowej. Kroki, jakie

zostały poczynione w sferze bliższego poznania populacji komórek NKT,

pozwoliły na wyodrębnienie różnych subpopulacji tych komórek,

przedstawionych w tej pracy. Niemniej niezbędne są dalsze badania,

poświęcone głębszemu poznaniu subpopulacji komórek NKT typu I (NKT1,

NKT2, NKT17, NKT10, NKTreg, NKTfh), komórek mNKT, czy NKT typu

II, oraz ich interakcji z innymi komórkami naszego układu immunologicznego.

Literatura

1. Godfrey D. I., Hammond K. J., Poulton L. D., Smyth M. J., Baxter A. G., NKT

cells: facts, functions and fallacies, Immunology Today, 21 (2000), s.573-583

2. Taniguchi M., Seino K., Nakayama T., The NKT cell system: bridging innate

and acquired immunity, NatureImmunology, 4 (2003), s. 1164-1165

3. Kitamura H., Iwakabe K., Yahata T., Nishimura S., Ohta A., Ohmi Y., Sato

M., Takeda K., Okumura K., Van Kaer L.,The natural killer T (NKT) cell

ligand alpha-galactosylceramide demonstrates its immunopotentiating effect

by inducing interleukin (IL)-12 production by dendritic cells and IL-12

receptor expression on NKTcells, The Journal of experimentalmedicine,

189 (1999), s.1121-1128

4. Terabe M., BerzofskyJ. A., The Role of NKT Cells in Tumor Immunity,

Advances in cancer research, 101 (2008), s. 277-348

5. Beckman E. M., Porcelli S. A., Morita C. T., Behar S. M., Furlong S. T.,

Brenner M. B., Recognition of a lipid antigen by CD1-restricted alpha beta+

T cells, Nature, 372 (1994), s. 691-694.

Lokalizacja

w stanie

spoczynku

Blaszka właściwa

płuc, wątroba

Śledziona, wątroba,

tarczyca, szpik

kostny, węzły

chłonne, krew

obwodowa, tk.

tłuszczowa, skóra,

błona śluzowa jelit

i płuc

Wątroba,

śledziona


87

6. Bendelac A., Rivera M. N., Park S., Roark J. H., Mouse CD1-specific NK1 T

cells: development, specificity, and function, Annual Review of Immunology,

15 (1997), s. 535-562

7. Godfrey D. I., MacDonald H. R., Kronenberg M., Smyth M. J., Van Kaer L., NKT

cells: what‘s in a name?, Nature Reviews Immunology, 4 (2004), s. 231-237

8. Godfrey D. I., Kronenberg M., Going both ways: Immune regulation via

CD1d-dependent NKT cells, The Journal of Clinical Investigation, 114 (2004),

s. 1379-1388 9. Matsuda J. L., Mallevaey T., Scott-Browne J., Gapin L., CD1d-restricted

iNKT cells, the ―Swiss-Army knife‖ of the immune system, Current Opinion

in Immunology, 20(2008), s. 358-368

10. Terabe M., Berzofsky J. A., NKT cells in immunoregulation of tumor immunity:

a new immunoregulatory axis, Trends in Immunology, 28(2007), s. 491-496

11. Porcelli S., Brenner M. B., Greenstein J. L., Balk S. P., Terhorst C., Bleicher

P. A., Recognition of cluster of differentiation 1 antigens by human CD4-CD8-

cytolytic T lymphocytes, Nature,341(1989), s. 447-50

12. Porcelli S., Morita C. T., Brenner M. B., CD1b restricts the response of human

CD4-8- T lymphocytes to a microbial antigen, Nature,360 (1992), s. 593-597

13. Treiner E., Duban L., Bahram S., Radosavljevic M., Wanner V., Tilloy F.,

Affaticati P., Gilfillan S., Lantz O., Selection of evolutionarily conserved

mucosal-associated invariant T cells by MR1,Nature, 422(2003), s. 164-9

14. Kawano T., Cui J., Koezuka Y., Toura I., Kaneko Y., Motoki K., Ueno H.,

Nakagawa R., Sato H., Kondo E., Koseki H., Taniguchiet M., CD1d-restricted

and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides,

Science, 278 (1997), s. 1626-1629

15. Dellabona P., Casorati G., Friedli B., Angman L., Sallusto F., Tunnacliffe A.,

Roosneek E., Lanzavecchia A., In vivo persistence of expanded clones specific

for bacterial antigens within the human T cell receptor alpha/beta CD4-8-

subset, The Journal of Experimental Medicine, 177 (1993), s. 1763-1771

16. Bendelac A., Lantz O., Quimby M. E., Yewdell J. W., Bennink J. R.,

Brutkiewicz R. R., CD1 recognition by mouse NK1+ T lymphocytes, Science,

268 (1995), s. 863-865 17. Hashimoto K., Hirai M., Kurosawa Y., A gene outside the human MHC

related to classical HLA class I genes, Science, 269 (1995), s. 693-695 18. Treiner E., Lantz O., CD1d- and MR1-restricted invariant T cells: of mice

and men, Current Opinion in Immunology,18 (2006), s.519-526

19. Kawachi I., Maldonado J., Strader C., Gilfillan S., MR1-restricted Vα19i

mucosal-associated invariant T cells are innate T cells in the gut lamina

propria that provide a rapid and diverse cytokine response, The Journal

of Immunology,176 (2006), s.1618-1627

20. Mallevaey T., Selvanantham T., Strategy of lipid recognition by invariant natural

killer T cells: ‗one for all and all for one‘, Immunology, 136 (2012), s. 273-282 21. Porcelli S. A., Segelke B. W., Sugita M., Wilson I. A., Brenner M. B., The

CD1 family of lipid antigen-presenting molecules, Immunology Today, 19

(1998), s. 362-368


88

22. Nieda M., Nicol A., Koezuka Y., Kikuchi A., Takahashi T., Nakamura H.,

Furukawa H., Yabe T., Ishikawa Y., Tadokoro K., Juji T., Activation

of humanVα24 NKT cells by alpha-glycosylceramide in a CD1d-restricted

and Vα24 TCR-mediated manner, HumanImmunology, 60 (1999), s. 10-19

23. Sidobre S., Naidenko O. V., Sim B. C., Gascoigne N. R., Garcia K. C.,

Kronenberg M., The V alpha 14 NKT cell TCR exhibits high-affinity binding

to a glycolipid/CD1d complex, The Journal of Immunology, 169 (2002),

s. 1340-1348

24. Benlagha K., Weiss A., Beavis A., Teyton L., Bendelac A., In vivo

identification of glycolipid antigen-specific T cells using fluorescent CD1d

tetramers, The Journal of Experimental Medicine,191 (2000), s. 1895-1903

25. Lantz O., Bendelac A., An invariant T cell receptor alpha chain is used by

a unique subset of major histocompatibility complex class I-specific CD4+

and CD4-8- T cells in mice and humans, The Journal of Experimental

Medicine, 180 (1994), s. 1097-1106

26. Kronenberg M., Toward an understanding of NKT cell biology: progress and

paradoxes, Annual Review of Immunology, 23 (2005), s. 877-900

27. Eberl G., Lees R., Smiley S. T., Taniguchi M., Grusby M. J., MacDonald H.

R., Tissue-specific segregation of CD1d-dependent and CD1d-independent

NKT cells,The Journal of Immunology, 162(1999), s. 6410-6419

28. IshihiraS., Nieda M., Kitayama J., Osada T., Yabe T., Ishikawa Y., Nagawa

H., Muto T., Juji T., CD8+NKR-P1A+ T cells preferentially accumulate in

human liver, European Journal of Immunology, 29 (1999), s. 2406-2413

29. McNab F. W., Pellicci D. G., Filed K., Besra G., Smyth M. J., Godfrey D. I.,

Berzins S. P., Peripheral NK1.1 NKT cells are mature and functionally

distinct from their thymic counterparts, Journal of Immunology, 179 (2007),

s. 6630-6637

30. Bendelac A., Matzinger P., Seder R. A., Paul W. E., Schwartz R. H.,

Activation events during thymic selection, The Journal of Experimental

Medicine, 175 (1992), s. 731-742

31. Gadola S. D., Dulphy N., Salio M., Cerundolo V., Valpha24-Jalpha C-

independent, Cd1d-restricted recognition of alpha-galactosylceramide

by human CD4(+) an CD8alpha(+) T lymphocytes, Journal of Immunology,

168 (2002), s. 5514-5520

32. Bendelac A., Rivera M. N., Park S. H., Roark J. H., Mouse CD1-specific NK1

T cells: development, specificity, and function, Annual Review of

Immunology, 15 (1997), s. 535-562

33. Kenna T., Mason L. G., Porcelli S. A., Koezuka Y., Hegarty J. E., O’Farrelly

C., Doherty D. G., NKT cells from normal and tumor-bearing human livers

are phenotypically and functionally distinct from murine NKT cells, The

Journal of Immunology, 171 (2003), s. 1775-1779

34. Lee P. T., Putnam A., Benlagha K., Teyton L., Gottlieb P. A., Bendelac A.,

Testing the NKT cell hypothesis of human IDDM pathogenesis, The Journal

of Clinical Investigation, 110 (2002), s. 793-800

35. Slauenwhite D., Johnston B., Regulation of NKT cell localization

in homeostasis and infection, Frontiers in Immunology, 6 (2015), 255


89

36. Bendelac A., Savage P. B., Teyton L., The biology of NKT cells, Annual

Review of Immunology, 25 (2007), s. 297-336

37. Umetsu D. T., Dekruyff R. H., Natural killer T cells are important in the

pathogenesis of asthma: the many pathways to asthma, The Journal of Allergy

and Clinical Immunology, 125 (2010), s. 975-979

38. Tupin E., Kinjo Y., Kronenberg M., The unique role of natural killer T cells

in the response to microorganisms, Nature reviewsImmunology, 5 (2007), s.

405-417

39. Smyth M. J., Crowe N. Y., Pellicci D. G., Kyparissoudis K., Kelly J. M.,

Takeda K., Yagita H., Godfrey D. I., Sequentialproduction of interferon-

gamma by NK1.1(+) T cells and natural killer cells is essential for the

antimetastatic effect of alpha-galactosylceramide, Blood, 99 (2002), s. 1259-

1266

40. Paget C., Trottein F., Role of type 1 natural killer T cells in pulmonary

immunity, Mucosal Immunology, 6 (2013), s. 1054-1067

41. Fais F., Tenca C., Cimino G., Coletti V., Zanardi S., Bagnara D., Saverino D.,

Zarcone D., De Rossi G., Ciccone E., Grossi C. E., CD1d expression on B-

precursor acute lymphoblastic leukemia subsets with poor prognosis,

Leukemia, 19 (2005), s. 551-556

42. Song L., Asgharzadeh S., Salo J., Engell K., Wu H., Sposto R., Ara T.,

Silverman A. M., DeClerck Y. A., Seeger R. C., MetelitsaL. S., Vα24-

invariant NKT cells mediate antitumor activity via killing of tumor-associated

macrophages, The Journal of clinical investigation, 119 (2009), s. 1524-1536

43. Stetson D. B., Mohrs M., Reinhardt R. L., Baron J. L., Wang Z. E., Gapin

L., Kronenberg M., Locksley R. M., Constitutive cytokine mRNAs mark

natural killer (NK) and NK T cells poised for rapid effector function, The

Journal of Experimental Medicine, 198 (2003), s.1069-1076

44. Coquet J. M., Chakravart S., Kyparissoudis K., McNab F. W., Pitt L. A.,

McKenzie B. S., Berzins S. P., Smyth M. J., Godfrey D. I., Diverse cytokine

production by NKT cell subsets and identification of an IL-17–producing

CD4−NK1.1

− NKT cell population, Proceedings of the National Academy

of Sciences of the United States of America, 105 (2008), s. 11287-11292

45. Michel M. L., Keller A. C., Paget C., Fujio M., Trottein F., Savage P. B.,

Wong C. H., Schneider E., Dy M., Leite-de-Moraes M. C., Identification

of an IL-17-producing NK1.1-iNKT cell population involved in airway

neutrophilia, The Journal of Experimental Medicine, 204 (2007), s. 995-1001

46. Smyth M. J., Godfrey D. I., NKT cells and tumor immunity – a double-edged

sword,Nature Immunology, 1 (2000), s. 459-460

47. Gumperz J. E., Miyake S., Yamamura T., Brenner M. B., Functionally distinct

subsets of CD1d-restricted natural killer T cells revealed by CD1d tetramer

staining, The Journal of Experimental Medicine, 195 (2002), s. 625-36

48. Godfrey D. I., Stankovic S., Baxter A. G.Rasing the NKT cell family, Nature

Immunology, 11 (2010), s. 533-555

49. Akbari O., Stock P., Meyer E., Kronenberg M., Sidobre S., Nakayama

T.,Grusby M. J., DeKruyff R. H., Umetsu D.T., Essential role of NKT cells


90

producing IL-4 and IL-13 in the development of allergen-induced airway

hyperreactivity, Nature Medicine, 9 (2003), s. 582-588

50. Crowe N. Y., Coquet J. M., Berzins S. P., Kyparissoudis K., Keating R.,

Pellicci D. G., Hayakawa Y., Godfrey D. I., Smyth M. J., Differential

antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo,The Journal

of Experimental Medicine,202(2005), s. 1279-1288

51. Lee Y. J., Holzapfel K. L., Zhu J., Jameson S. C., Hogquist K. A., Steady state

production of IL-4 modulates immunity in different strains and is determined

by lineage diversity of iNKT cells, Nature Immunology, 14(2013),

10.1038/ni.2731

52. Watarai H., Sekine-Kondo E., Shigeura T., Motomura Y., Yasuda T., Satoh

R., Yoshida H., Kubo M., Kawamoto H., Koseki H., Taniguchi M.,

Development and function of invariantnaturalkiller T cells producing T(h)2-

and T(h)17-cytokines, PLoS Biology, 10(2012), e1001255

53. Sag D., Krause P., Hedrick C. C., Kronenberg M., Wingender G., IL-10-

producing NKT10 cells are a distinct regulatory invariant NKT cell subset,

The Journal of Clinical Investigation, 124 (2014), s. 3725-40

54. Wingender G., Sag D.,Kronenberg M., NKT10 cells: a novel iNKT cell

subset,Oncotarget, 6 (2015), s. 26552-26553

55. Macho-Fernandez E., Brigl M., The extended family of CD1drestricted NKT

cells: sifting through a mixed bag of TCRs, antigens, and functions, Frontiers

in Immunology, 6 (2015), 362

56. Constantinides M. G., Bendelac A., Transcriptional regulation of the NKT cell

lineage, Current Opinion in Immunology, 25 (2013), s. 161-167

57. Moreira-Teixeira L., Resende M., Devergne O., Herbeuval J. P., Hermine O.,

Schneider E., Dy M., Cordeiro-da-Silva A., Leite-de-Moraes M. C., Rapamycin

combined with TGF-beta converts human invariant NKT cells into suppressive

Foxp3+ regulatory cells, Journal of Immunology, 188 (2012), s. 624-631

58. Chang P. P., Barral P., Fitch J., Pratama A., Ma C. S., Kallies A., Hogan J. J.,

Cerundolo V., Tangye S. G., Bittman R., Nutt S. L., Brink R., Godfrey D. I.,

Batista F. D., Vinuesa C. G., Identification of Bcl-6-dependent follicular

helper NKT cells that provide cognate help for B cell responses,Nature

Immunology, 13 (2012), s. 35-43

59. Tonti E., Fedeli M., Napolitano A., Iannacone M., von Andrian U. H., Guidotti

L. G., Abrignani S., Casorati G., Dellabona P., Follicular helper NKT cells

induce limited B cell responses and germinal center formation in the absence

of CD4(+) T cell help,Journal of Immunology, 188 (2012), s. 3217-3222

60. Lynch L., Michelet X., Zhang S., Brennan P. J., Moseman A., Lester C.,

Regulatory iNKT cells lack expression of the transcription factor PLZF and

control the homeostasis of T cells and macrophages in adipose tissue, Nature

Immunology, 16 (2014), s. 85-95

61. Tilloy F., Treiner E., Park S. H., Garcia C., Lemonnier F., de la Salle H.,

Bendelac A., Bonneville M., Lantz O., An invariant T cell receptor α chain

defines a novel TAP-independent major histocompatibility complex class

Ib-restricted α/β T cell subpopulation in mammals,The Journal

of Experimental Medicine, 189 (1999), s. 1907-1921


91

62. Reantragoon R., Kjer-Nielsen L., Patel O., Chen Z., Illing P.T., Bhati M.,

Kostenko L., Bharadwaj M., Meehan B., Hansen T. H., Godfrey D. I.,

Rossjohn J., McCluskey J., Structural insight into MR1-mediated recognition

of the mucosal associated invariant T cell receptor,The Journal of

Experimental Medicine,209 (2012), s. 761-774

63. Dusseaux M., Martin E., Serriari N., Peguillet I., Premel V., Louis D.,Milder

M., Le Bourhis L., Soudais C., Treiner E., Lantz O., Human MAIT cells are

xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells, Blood,

117 (2011), s. 1250-1259

64. Seach N., Guerri L., Le Bourhis L., Mburu Y., Cui Y., Bessoles S., Soudais

C., Lantz O., Double-positive thymocytes select mucosal-associated invariant

T cells,Journal of Immunology, 191(2013), s. 6002-6009

65. UssherJ. E., Klenerman P., Willberg C. B., Mucosal-Associated Invariant

T-Cells: New Players in Anti-Bacterial Immunity, Frontiers Immunology,

5 (2014), 450

66. Szabo P. A., Anantha R. V., Shaler C. R., McCormick J. K., Haeryfar S. M.

M., CD1d- and MR1-restricted T cells in sepsis, Frontiers in Immunology,

6 (2015), 401

67. Miley M. J., Truscott S. M., Yu Y. Y., Gilfillan S., Fremont D. H., Hansen T. H.,

Lybarger L., Biochemical features of the MHC-related protein 1 consistent with

an immunological function, Journal of Immunology, 170 (2003), s. 6090-6098

68. Wingender G., Kronenberg M., Role of NKT cells in the digestive system. IV.

The role of canonical natural killer T cells in mucosal immunity and

inflammation, American Journal of Physiology- Gastrointestinal and Liver

Physiology, 294 (2008), G1-G8

69. Illes Z., Shimamura M., Newcombe J., Oka N., Yamamura T., Accumulation

of Vα7.2-Jα33 invariant T cells in human autoimmune inflammatory lesions

in the nervous system, International Immunology, 16 (2004), s. 223-230

70. Croxford J. L., Miyake S., Huang Y. Y., Shimamura M., Yamamura T.,

Invariant V(α)19i T cells regulate autoimmune inflammation, Nature

Immunology, 7 (2006), s. 987-994

71. Gold M. C., Cerri S., Smyk-Pearson S., Cansler M. E., Vogt T. M., Delepine

J., Winata E., Swarbrick G. M., Chua W. J., Yu Y. Y., Lantz O., Cook M. S.,

Null M. D., Jacoby D. B., Harriff M. J., Lewinsohn D. A., Hansen T. H.,

Lewinsohn D. M., Human mucosal associated invariant T cells detect

bacterially infected cells,PLoS Biology,8 (2010), e1000407

72. Chua W. J., Truscott S. M., Eickhoff C. S., Blazevic A., Hoft D. F., Hansen T.

H., Polyclonal mucosa-associated invariant T cells have unique innate functions

in bacterial infection, Infection and Immunity, 80 (2012), s. 3256-3267

73. Kjer-Nielsen L., Patel O., Corbett A. J., Le Nours J., Meehan B., Liu L., Bhati

M., Chen Z., Kostenko L., Reantragoon R., Williamson N. A., Purcell A. W.,

Dudek N. L., McConville M. J., O'Hair R. A., Khairallah G. N., Godfrey D. I.,

Fairlie D. P., Rossjohn J., McCluskey J., MR1 presents microbial vitamin B

metabolites to MAIT cells, Nature, 491 (2012), s. 717-723


92

74. Salio M., Cerundolo V., Regulation of Lipid Specific and Vitamin Specific

Non-MHC Restricted T Cells by Antigen Presenting Cells and Their

Therapeutic Potentials, Frontiers in Immunology, 6 (2015), 388

75. Blomqvist M., Rhost S., Teneberg S.,Löfbom L., Osterbye T., Brigl M.,

Månsson J. E., Cardell S. L., Multiple tissue-specific isoforms of sulfatide

activate CD1d-restricted type II NKT cells, European Journal of Immunology,

39(2009), s. 1726-1735

76. Chen Y. H., Chiu N. M., Mandal M., Wang N., Wang C. R., Impaired NK1+ T

cell development and early IL-4 production in CD1- deficient mice, Immunity,

6 (1997), s. 459-467

77. Cardell S., Tangri S., Chan S., Kronenberg M., Benoist C., Mathis D., CD1-

restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient

mice, The Journal of Experimental Medicine, 182 (1995), s. 993-1004

78. Park S. H., Weiss A., BenlaghaK., Kyin T., Teyton L., Bendelac A., The

mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell

receptor families,The Journal of Experimental Medicine, 193(2001), s. 893-904

79. Chiu Y. H., Jayawardena J., Weiss A., Lee D., Park S. H., Dautry-Varsat A.,

Bendelac A., Distinct subsets of CD1d-restricted T cells recognize self-

antigens loaded in different cellular compartments, The Journal of

Experimental Medicine, 189(1999), s. 103-10

80. Weng X., Liao C. M., Bagchi S., Cardell S. L., Stein P. L., Wang C. R.,

The adaptor protein SAP regulates Type II NKT cell development, cytokine

production and cytotoxicity against lymphoma, European Journal

of Immunology, 44 (2014), s. 3646-3657

81. Marrero I., Ware R., Kumar V., Type II NKT cells in inflammation,

autoimmunity, microbial immunity, and cancer,Frontiers in Immunology,

6 (2015), 00316

82. Zhao J., Weng X., Bagchi S., Wang C. R., Polyclonal type II natural killer

T cells require PLZF and SAP for their development and contribute to CpG-

mediated antitumor response, Proceedings in the National Academy

of Sciences U S A, 111 (2014), s. 2674-2679

83. Takahashi T., Chiba S., Nieda M., Azuma T., Ishihara S., Shibata Y., Juji T.,

Hirai H., Cutting edge: analysis of human V alpha 24+CD8+ NK T cells

activated by alpha-galactosylceramide-pulsed monocyte-derived dendritic

cells, The Journal of Immunology, 168 (2002), s. 3140-3144


93


Komórki NKT stanowią istotną grupę komórek uczestniczących w modulowaniu odpowiedzi

immunologicznej. Łączą cechy komórek NK (naturalkiller) oraz limfocytów T. Tak jak komórki

NK, z łatwością odpowiadają na stymulację antygenem i uwalniają liczne cytokiny i chemokiny,

wpływając w ten sposób na inne komórki układu immunologicznego. Ponadto, wykazują one

również cechy konwencjonalnych limfocytów T, posiadając na swojej powierzchni receptory

TCR. Klasycznie komórki NKT dzieli się na dwie główne grupy: komórki NKT typu I i typu II.

Jednak ostatnie badania wskazują na głębszą kompleksowość w tej materii i istnienie różnych

subpopulacji w obrębie komórek NKT, z ekspresją odpowiednich czynników transkrypcyjnych

iunikalnym profilem uwalnianych cytokin. Pozwala to na częściowe wyjaśnienie funkcjonalnych

różnic przypisywanych komórkom NKT. W artykule dokonujemy podsumowania aktualnej

wiedzy dotyczącej subpopulacji komórek NKT.

Phenotypic and functional heterogeneity of NKT population

Natural killer T (NKT) cells are an important mediator of immune responses. They possess

features of NK (natural killer) cells and T lymphocytes. Like innately functioning NK cells, they

swiftly respond to antigen stimulation and produce multiple cytokines and chemokines, to

influence other elements of the immune system. But they also share features with conventional

T lymphocytes by expressing T cell receptors (TCR). NKT cells have been divided into two

major subsets, including type I and type II. However, recent studies revealed the existence

of distinct lineages of NKT cells with a unique profile of secreted cytokines and transcription

factors. It can therefore explain the remarkable versatility of functions, assigned NKT cells. Here,

we summarize the actual knowledge concerning NKT subpopulations.

94

Martyna Bednarczyk1, Urszula Mazurek

2, Małgorzata Muc-Wierzgoń

1

Profil ekspresji genów

zaangażowanych w autofagię

w różnicowaniu komórek raka jelita grubego

1. Wstęp

Autofagia, inaczej samotrawienie, oznacza wysoce zachowawczy

filogenetycznie mechanizm, dzięki któremu degradowane są wszystkie

uszkodzone białka oraz organelle komórkowe. Występuje u wszystkich

organizmów eukariotycznych. Istniejące dowody wskazują, że autofagia

odpowiada za regulację różnych funkcji komórkowych, obejmujących

wzrost, różnicowanie, odpowiedź na niedobór składników odżywczych

oraz stres oksydacyjny, a także śmierć komórki [1, 2, 3, 4]. Cechą

charakterystyczną tego procesu jest to, że nie jest jedynie synonimem

śmierci komórki, w przeciwieństwie do apoptozy. Niedawno podkreślono,

że może również być mechanizmem adaptacyjnym, umożliwiającym

przeżycie komórki w niekorzystnych warunkach, na przykład podczas

niedotlenienia lub niedoboru składników odżywczych [2, 5]. Uważa się, że

wadliwy szlak autofagii lub błędy w genach związanych z autofagią leżą

u podstaw patogenezy wielu chorób, w tym chorób neurodegeneracyjnych,

chorób płuc lub nowotworów [6, 7].

W zależności od sposobu dostarczenia białka do lizosomu, wyróżniamy

cztery rodzaje autofagii: swoistą (na przykład mitofagię, lipofagię,

peksofagię, rybofagię), mikroautfagię, makroautofagię oraz autofagię

zależną od białek opiekuńczych (chaperonów) [2, 8]. Mikroautofagia jest

nieselektywnym procesem, podczas którego białko przeznaczone do

degradacji zostaje bezpośrednio wchłonięte do lizosomu, gdzie dochodzi do

jego hydrolizy. Jest to najmniej popularny rodzaj autofagii, który do końca

jeszcze nie został poznany, a jego rola w procesie nowotworzenia do tej

pory jest niewyjaśniona [2, 9, 10]. Autofagia zależno od chaperonów różni

się od pozostałych rodzajów obecnością w białkach substratowych

pentapeptydu Lys – Phe – Glu – Arg – Gln (KFERQ), pełniącego funkcję

sekwencji kierującej do lizosomy [11]. Motyw ten obecny jest w około

[email protected], Katedra i Oddział Kliniczny Chorób Wewnętrznych,

Wydział Zdrowia Publicznego w Bytomiu, Śląski Uniwersytet Medyczny [email protected], Katedra i Zakład Biologii Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny

z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu, Śląski Uniwersytet Medyczny

Profil ekspresji genów zaangażowanych w autofagię


95

30% białek cytozolowych. Białko szoku cieplnego HSP70 wiąże się

z substratem, następnie sekwencja KFERQ rozpoznawana jest przez

receptor LAMP2A obecny w błonie lizosomalnej. Białko substratowe

dostaje się do wnętrza lizosomu, gdzie ulega degradacji [2, 6, 12, 13].

Podczas makroautofagii zniszczeniu ulegają znacznie większe struktury niż

w przypadku poprzednich procesów. Jest to najczęściej występująca forma

autofagii. Degradacja białek zachodzi za pośrednictwem specjalnej

struktury, autofagosomu. Proces regulowany jest przez produkty genów

Atg, zidentyfikowanych po raz pierwszy u drożdży. Najważniejszymi

białkami uczestniczącymi w tym procesie są: kompleks kinazy ULK1/2,

białko błonowe Atg9, kompleks kinazy PI3K – III oraz ubikwitynopodobne

systemy sprzęgania Atg12 i Atg9 [2,9, 10, 14].

W procesie autofagii wyróżniamy cztery podstawowe fazy: inicjację,

elongację fagoforu, dojrzewanie autofagosomu, jego fuzję z lizosomem

oraz degradację zawartości. W przebieg tych faz zaangażowanych jest

ponad 30 genów [4].

Autofagia indukowana jest przede wszystkim niedoborem składników

odżywczych lub podczas niedotlenienia [15]. W inicjacji tego procesu

uczestniczy kinaza ULK1, białko FIP200, mAtg13 (nośnik sygnału do

rozpoczęcia autofagii) oraz Atg101. Ten etap kontrolowany jest przede

wszystkim aktywnością kinazy mTOR (ssaczy cel dla rapamycyny).

Podczas aktywacji mTOR autofagia ulega zahamowaniu [8, 12, 16].

Mechanizm autofagii rozpoczyna się od wstępnego formowania

fagoforu (nukleacja) oraz jego stopniowego wydłużania na kształt litery C.

Fagofor powstaje w wyniku fuzji wielu pęcherzyków pochodzących

z retikulum endoplazmatycznego. W ten etap zaangażowana jest kinaza 3-

fosfatydyloinozytolu (PI3K-III), Beklina 1 oraz kinaza serynowa p150.

Ważną rolę odgrywa tu również białko Atg9, dostarczające składników

lipidowych koniecznych do powstania błony fagosomu. Atg9 oddziałuje

z białkiem Atg2, dzięki czemu możliwe jest utworzenie błony izolującej [2,

8, 16]. Białka antyapoptotyczne BCL-2 oraz BCL-XL hamują aktywność

kompleksu Beklina1 : PI3K : p150 [4].

Dalszym etapem jest elongacja (wydłużanie fagoforu), gdzie

uczestniczą dwa ubikwitynopodobne kompleksy białek: Atg12-Atg5 oraz

LC3-II-fostatydyloetanoloamina (LC3-II-PE). W tworzenie pierwszego

systemu koniugacyjnego (Atg12-Atg5) zaangażowane są cztery białka:

Atg5, 7, 10 i 12. Białko Atg12 wiąże się kowalencyjnie z Atg5. W

następnym etapie powstały kompleks Atg12-Atg5 wiąże się z białkiem

Atg16L, zachodzi multimeryzacja i utworzony zostaje tetramer Atg12-

Atg5-Atg16L uczestniczący w elongacji fagoforu. Naukowcy twierdzą, że

ten kompleks bierze udział w jego zakrzywieniu. W momencie powstania

dojrzałego autofagosomu, białko Atg16L oddysocjowuje, co świadczy


96

o tym, że nie może stanowić markera procesu autofagii. Następie dochodzi

do aktywacji drugiego ubikwitynopodobnego kompleksu LC3-II-PE. LC3

jest białkiem związanym z mikrotubulami, znajduje się w cytozolu

i syntetyzowane jest jako prekursor pro-LC3. Forma pro-LC3 w wyniku

cięcia przez Atg4 ulega przemianie do LC3-I, do którego przyłącza się

białko Atg7, Atg3 oraz powstały niedawno kompleks Atg12-Atg5-Atg16L.

W kolejnym etapie LC3-I przyłącza lipofilną fosfatydyloetanoloaminę (PE)

i przekształca się w formę LC3-II. W następstwie tych zdarzeń z fagoforu

powstaje autofagosom. LC3-II uznaje się za wiarygodny marker autofagii,

ponieważ jego stężenie jest proporcjonalne do liczby powstałych

autofagosomów. W ostatnim etapie błona autofagosomu ulega fuzji

z lizosomom, powstaje autofagolizosom, w którym dochodzi do trawienia

białek przeznaczonych do degradacji, dzięki obecności enzymów

lizosomalnych [2, 8, 12].

Rysunek 1 przedstawia schemat przebiegu autofagii.

Rysunek 1. Przebieg autofagii [2]

Od dawna wiadomo, że autofagia bierze udział w patogenezie chorób

nowotworowych, w tym raka jelita grubego [5]. W warunkach fizjolo-

gicznych, jeśli występuje odpowiedni poziom składników odżywczych, jest

obecna w większości tkanek, wpływając na utrzymanie homeostazy komór-

kowej. Uszkodzone białka i organelle ulegają degradacji. W przypadku,

kiedy zmniejsza się poziom autofagii, komórki tracą zdolność do usuwania

materiałów i zaczynają akumulować cytotoksyczne składniki, co w efekcie

może prowadzić do onkogenezy [2].

Uważa się, że ma dwojaki wpływ na rozwój choroby nowotworowej,

korzystny, jak i niekorzystny. Pozytywnym skutkiem jest to, że działa

supresorowo na guz ograniczając wielkość komórek rakowych i usuwając

uszkodzone białka mogące wzmagać proces mutagenny. Natomiast za

negatywne działanie uznaje się to, że autofagia może przyczyniać się do



97

przeżycia komórek rakowych nawet w środowisku ubogim w składniki

odżywcze [17].

Rola autofagii w kancerogenezie nie została jeszcze dokładnie poznana

i może zależeć od wielu czynników, na przykład od stopnia zaawansowania

choroby lub od mutacji genów obecnych w określonym typie nowotworu

[4, 18]. Poza tym niektórzy badacze donoszą, że zahamowanie autofagii

hamuje rozwój nowotworów, a co za tym idzie może być skutecznym

sposobem leczenia raka jelita grubego. Drugim istotnym faktem jest to, że

lizosomy przyczyniają się do rozwoju lekooporności komórek nowo-

tworowych i blokują proces autofagii [5, 19]. Ponadto we wczesnym

stadium choroby autofagia może przyczyniać się do hamowania

przerzutów, dzięki indukcji reakcji zapalnej. Zapobiega również inicjacji

nowotworu. Natomiast w późnym stadium sprzyja progresji lub

powstawaniu przerzutów, poprzez zwiększenie przeżywalności komórek

w warunkach niedotlenienia lub braku składników odżywczych [2, 20].

Aktualne metody leczenia raka jelita grubego obejmują chirurgię,

radioterapię oraz chemioterapię. Rodzaj leczenia zależy od stopnia

zaawansowania choroby. Prowadzone są nadal badania nad opracowaniem

nowych metod leczenia, z naciskiem na metody molekularne [21]. Jednym

z najbardziej obiecujących celów terapeutycznych ostatnich lat, wydaje się

być proces autofagii. Chociaż rola autofagii w rozwoju nowotworów jest

tematem kontrowersyjnym, wiadomo, że w przypadku raka jelita grubego,

wzrasta jej aktywność. Zaobserwowano wzrost ekspresji genów LC3

i BECN1 w komórkach guzów w porównaniu z tkankami niezmienionymi

chorobowo [22]. Wstępne badania genetyczne sugerują, że Beclina 1 działa

jako supresor guzów, a jej delecja prowadzi do powstawania

spontanicznych nowotworów. Chociaż Beclina 1 i LC3 są ważnymi

mediatorami autofagii, inne cząsteczki oraz szlaki sygnalizacyjne, również

wymagają zbadania w celu określenia ich roli w procesie autofagii (np.

p53, PI3K / Akt / mTOR) [17].

2. Cel pracy

Celem niniejszego badania było zbadanie ekspresji genów zaangażo-

wanych w autofagię w różnicowaniu komórek raka jelita grubego z wyko-

rzystanie mikromacierzy oligonukleotydowych HGU-133A.

3. Materiały i metody

Aktywność transkrypcyjną genów związanych z autofagią wyznaczano

w wycinkach raka jelita grubego oraz jelita prawidłowego. Podczas zabiegu

operacyjnego uzyskano materiał obejmujący tkankę guza oraz margines

wynoszący 5 cm. Margines był oceniony makroskopowo i histopatolo-


98

gicznie jako jelito zdrowe. Do analizy molekularnej typowano 123 wycinki

jelita grubego, z czego 40 na podstawie analizy histopatologicznej oceniono

jako jelito prawidłowe (kontrola), a pozostałe jako gruczolakoraka w różnych

stopniach zaawansowania (CSI – 11, CSII – 25, CSIII – 32, CSIV – 15).

3.1. Ekstrakcja RNA

Pierwszym etapem badania było przeprowadzenie ekstrakcji całkowitego

RNA. Dostarczony materiał poddano homogenizacji z wykorzystaniem

homogenizatora Polytron (Kinematyka, AG, Szwajcaria). Następnie

wyizolowanao całkowite RNA za pomocą odczynnika TRIzol® (Invitrogen

Life Technologies, Kalifornia, USA), zgodnie instrukcją producenta.

Ostatnim etapem było oczyszczenie wyizolowanego RNA na kolu-

mienkach zestawu RNeasy Mini Kit firmy Qiagen w połączeniu z trawieniem

DNazą I.

3.2. Ocena jakościowa i ilościowa całkowitego RNA

Po wyizolowaniu RNA, jednym z pierwszych wykonywanych etapów

jest analiza ilościowa, czyli określenie stężenia RNA. W tym celu

wykorzystano spektrofotometr GeneQuant II. Stężenie RNA wyznacza się

na podstawie pomiaru absorbancji światła UV przy długości fali 260 nm.

Analiza ilościowa polega na przeprowadzeniu elektroforezy w 1% żelu

agarozowym wybarwionym bromkiem etydyny.

3.3. Mikromacierze oligonukleotydowe

Aktywność transkrypcyjna genów związanych z autofagią została

wyznaczona techniką mikromacierzy HG-U133A (Affymetrix).

Do zsyntetyzowania dwuniciowego cDNA, wykorzystano jako matrycę

8 μg RNA (SuperScript Choice system; Invitrogen Life Technologies, CA,

USA). Syntezę biotynylowanego cRNA przeprowadzono z użyciem

BioArray HighYield RNA Transcript Labeling Kit (Enzo Life Sciences,

New York, USA). W celu przeprowadzenia fragmentacji cRNA

zastosowano Sample Cleanup Module Kit (Qiagen GmbH, Germany).

Płukanie, barwienie kompleksem streptawidyna-fikoerytryna i skanowanie

mikromacierzy w skanerze GeneArray (Agilent) wykonywano zgodnie

z zaleceniami Affymetrix Gene Expression Analysis Technical Manual.

3.4. Analiza statystyczna

Analiza otrzymanych wyników prowadzona jest z wykorzystaniem

Infrastruktury PL-Grid (http://www.plgrid.pl/). W analizie statystycznej

zastosowano poziom istotności statystycznej wynoszący p(α) < 0,05. Dla

każdego analizowanego parametru wyznaczono najważniejsze elementy



99

statystyki opisowej: średnią, medianę, wartość minimalną i maksymalną,

odchylenie standardowe oraz kwartyl górny (75%) i dolny (25%).

Zróżnicowanie ekspresji genów określono za pomocą testu jedno-

czynnikowej ANOVA. Następnie wykonano test bardziej precyzyjny, post

hoc TUKEYA.

4. Wyniki

4.1. Grupowanie hierarchiczne transkryptomów

Ocenę stopnia zróżnicowania transkryptomów rozpoczęto od porównania

zgodności grupowania wycinków w zależności od stopnia zaawansowania raka

jelita grubego wyznaczonego na podstawie analizy histopatologicznej,

klinicznej oraz molekularnej. W tym celu przeprowadzono grupowanie

hierarchiczne, z miarą Czebyszewa.

Transkryptomy zostały podzielone na cztery grupy, dwie charakterystyczne

dla raka jelita grubego – w niskim stopniu zaawansowania (NSZ) oraz

w wysokim stopniu zaawansowania (WSZ) oraz dwie grupy kontrolne

(K i K2). Grupa K2 wykazuje podobieństwo do raka w wysokim stopniu

zaawansowania, chociaż jest to wycinek jelita oceniony histopatologicznie

i makroskopowo jako tkanka prawidłowa.

Rysunek 2. Dendrogram obrazujący wyniki grupowania hierarchicznego profili

znormalizowanego poziomu sygnałów fluorescencji 22283 ID mRNA w transkryptomach

wyznaczonych metodą mikromacierzy oligonukleotydowych HGU 133A [opracowanie własne]


100

4.2. Ocena stopnia zróżnicowania pomiędzy grupami

transkryptomów genów związanych z autofagią

Analizę stopnia zróżnicowania transkryptomów rozpoczęto od statystyki

opisowej rozkładu sygnału fluorescencji mRNA transkryptów w poszcze-

gólnych grupach (rys. 3). Na osi x zaznaczono dwie kontrole (K i K2) oraz

hodowlę komórek raka jelita grubego o wysokim stopniu zaawansowania

(WSZ) i niskim stopniu zaawansowania (NSZ). Na tej podstawie można

stwierdzić, że kontrola jest zbliżona do próbek badanych. We wszystkich

grupach wartości mediany występują na zbliżonym poziomie, lecz są

zauważalne różnice w wartościach rozstępu kwartylowego oraz war-

tościach oddalonych.

Rysunek 3. Statystyki opisowe przedstawiające rozkład sygnału fluorescencji mRNA w grupach

transkryptomów kontroli [K i K2] oraz komórek raka jelita grubego o niskim stopniu

zaawansowania [NSZ] i wysokim stopniu zaawansowania [WSZ] [opracowanie własne]

4.3. „Mapa gorąca” trankryptów genów związanych z autofagią

Kolejnym etapem było wyznaczenie za pomocą Infrastruktury PL-Grid

(http://www.plgrid.pl/) „map gorąca” (heatmap). „Mapy gorąca” umoż-

liwiają porównanie aktywności transkrypcyjnej badanych genów w odnie-

sieniu do średniej aktywności transkrypcyjnej komórek jelita grubego

(barwa żółta). Poniższa rycina przedstawia „mapę gorącą” obrazującą



101

zróżnicowanie profilu stężeń mRNA genów związanych z autofagią

ulegających nadekspresji w raku jelita grubego. Wzrost ekspresji danego

genu koreluje ze zmianą barwy w kierunku odcieni czerwieni, natomiast

spadek aktywności transkrypcyjnej oznacza zmianę barwy w kierunku

odcieni niebieskiego. Na podstawie poniższej „mapy gorąca” stwierdzono,

że poziom mRNA badanego białka jest wyższy w wycinkach raka

w porównaniu do kontroli, natomiast nie zależy od stopnia zaawansowania

klinicznego.

Rysunek 4. Mapa intensywności sygnałów fluorescencji 26 ID mRNA genów związanych

z autofagią w grupach tran skryptów jelita grubego (kolor niebieski – najniższe wartości, kolor

czerwony najwyższe wartości sygnałów fluorescencji rejestrowanych w analizowanych

mikromacierzach [opracowanie własne]


102

4.4. Ocena stopnia zróżnicowania ilościowego pomiędzy grupami

transkryptomów genów związanych z autofagią testem

jednoczynnikowej ANOVA

Kolejnym etapem było przeprowadzenie dalszej analizy wyników,

w celu oceny statystycznej znamienności obserwowanych zmian na

poziomie profilu stężeń ID mRNA genów związanych z autofagią

w zależności od stopnia zaawansowania gruczolakoraka jelita grubego.

Przeprowadzono test jednoczynnikowej ANOVA z korekcją Benjamini-

Hochberga, który miał na celu jednoczesne porównanie wszystkich

analizowanych grup transkryptomów w odniesieniu do prób kontrolnych K

i K2 (tab. 1).

Tabela 1. Test jednoczynnikowej ANOVA przedstawiający liczbę ID mRNA genow związanych

z autofagią różnicujących transkryptomy gruczolakoraka jelita grubego w wysokim oraz niskim

stopniu zaawansowania [opracowanie własne]

Liczba mRNA różnicujących K vs NSZ vs WSZ

wartość p p < 0,05 p < 0,02 p < 0,01 p < 0,005 p <0,001

różnicujące 207 26 20 13 11 3

Z przedstawionej analizy statystycznej ANOVA wynika, że spośród grupy

207 mRNA genów związanych z autofagią, w przypadku 26 ID mRNA

występują znaczne różnice w intensywności fluorescencji dla wartości

p < 0,05. Z czego wynika, ze 26 mRNA różnicuje wycinki gruczolakoraka od

kontroli K1. Podczas zaostrzenia kryteriów różnicowania, zwiększono siłę

różnicowania poprzez zmianę wartości p z 0,05 na 0,001, obserwowano

stopniowe zmniejszanie liczby mRNA różnicujących poszczególne grupy

transkryptów.

Test ANOVA wykonuje się celem określenia różnic poziomu ID mRNA

w analizowanych grupach transkryptomów. Pierwszą częścią są różnice

między porównywanymi grupami mRNA: NSZ, WSZ, K 2 w porównaniu do

K1, natomiast drugą grupę stanowią różnice między wynikami wewnątrz

analizowanych grup mRNA (błąd losowy).

Dlatego w kolejnym etapie analizy statystycznej przeprowadzono test

wielokrotnych porównań post – hoc (po fakcie) – test Tukeya z poprawką

Benjamini-Hochberga (tab. 2). Wykonuje się go jako kolejny krok analizy

wariancji. Jest on bardziej precyzyjny niż test ANOVA. Jego zadaniem jest

określenie, jaka liczba ID mRNA różnicuje analizowane grupy trans-

kryptomów między sobą. Test ten jest wykorzystywany tylko dla wybranej

grupy ID mRNA dopiero, jeśli na podstawie testu ANOVA zostanie

stwierdzony brak równości między średnimi.



103

Tabela 2. Test post – hoc Tukeya, który wskazuje liczbę reprezentatywnych ID mRNA

różnicujących poszczególne grupy transkryptomów. Kolorem czarnym jest zaznaczona liczba 26

ID mRNA wyznaczona za pomocą testu ANOVA, które różnicowały analizowane grupy

transkryptomów. Kolorem czerwonym – liczbę ID mRNA reprezentatywnych dla różnicowania

badanych grup transkryptomów przy założeniu, p < 0,05. Kolorem niebieskim – liczbę ID mRNA

niereprezentatywnych w różnicowaniu porównywanych grup [opracowanie własne]

Grupa

transkryptomów K2 K NSZ WSZ

K2 26 4 13 18

K 22 26 5 12

NSZ 13 21 26 7

WSZ 8 14 19 26

Podczas analizy średnich sygnałów fluorescencji w grupach K2, NSZ i WSZ w porównaniu do K1, stwierdzono, że z grupy 26 ID mRNA wytypowano przy wartości p < 0,05, dla K2 vs K1 – 4 ID mRNA, dla NSZ vs K1 – 5 ID mRNA oraz dla WSZ vs K1 – 12 ID mRNA.

Kolejnym etapem była ocena specyficzności ID mRNA w różnicowaniu grup transkryptomów gruczolakoraka jelita grubego o niskim i wysokim stopniu zaawansowania w odniesieniu do kontroli K1. W tym celu posłużono się diagramem VENNA (ryc. 5). Uzyskane wyniki świadczą o tym, że z grupy 26 ID mRNA wytypowanych jako różnicujące wycinki raka jelita grubego o niskim stopniu zaawansowania od kontroli, nie ma żadnych genów specyficznych tylko dla NSZ. W przypadku różnicowania raka jelita grubego o wysokim stopniu zaawansowania od kontroli, specyficznych jest 8 genów: dwa ID dla receptora BECN1 oraz po jednym dla TMEM59, NBR1, PSEN1, VTI1B, DRAM1 i SH3BP4.

Rysunek 5. Diagram Venna grupujący mRNA wytypowane testem post-hoc – Tukeya

z poprawką Benjamini-Hochberga – po teście jednoczynnikowym ANOVA, w zależności od

specyficzności różnicowania grup transkryptomów jelita grubego [opracowanie własne]


104

Tabela 3. Legenda do diagramu Venna wskazującego specyficzność ID mRNA w różnicowaniu

grup transkryptomów K2, NSZ i WSZ w odniesieniu do kontroli K1, wyznaczonych na

podstawie analizy wariancji i testu post-hoc – Tukeya z poprawką Benjamini-Hochberga

[opracowanie własne]

Grupy

porównywanych

transkryptomów

mRNA różnicujące

Liczba ID Symbol Wartość p

NSZ vs K1 – 5 ID mRNA

NSZ vs K1 0

NSZ vs K1NSZ

vs WSZ 3

201471_s_at SQSTM1 0.0013664293

202723_s_at FOXO1 4.2396536E-5

207829_s_at BNIP1 7.935236E-5

NSZ vs K1WSZ

vs K1 2

209018_s_at PINK1 3.3543853E-5

209019_s_at PINK1 7.000239E-8

NSZ vs K1WSZ

vs K1NSZ vs

WSZ

0

WSZ vs K1 – 12 ID mRNA

WSZ vs K1

8

200620_at TMEM59 0.0026670145

201383_s_at NBR1 0.0012132392

207782_s_at PSEN1 4.188373E-4

208945_s_at BECN1 4.977536E-7

208946_s_at BECN1 7.3220895E-4

209452_s_at VTI1B 2.458908E-4

218627_at DRAM1 9.152737E-5

222258_s_at SH3BP4 2.3106563E-4

WSZ vs K1NSZ

vs K1 2

209018_s_at PINK1 3.3543853E-5

209019_s_at PINK1 7.000239E-8

WSZ vs K1NSZ

vs WSZ 2

201553_s_at LAMP1 2.6293748E-4

212312_at BCL2L1 2.975771E-6

NSZ vs

K1WSZvs

K1NSZ vs WSZ

0



105

NSZ vs WSZ – 7 ID mRNA

NSZ vs WSZ 2 201552_at LAMP1 0.006088007

221874_at KIAA1324 0.0020695326

NSZ vs WSZ

WSZ vs K1 2

201553_s_at LAMP1 2.6293748E-4

212312_at BCL2L1 2.975771E-6

NSZ vs WZS

NSZ vs K1 3

201471_s_at SQSTM1 0.0013664293

202723_s_at FOXO1 4.2396536E-5

207829_s_at BNIP1 7.935236E-5

NSZ vs

K1WSZvs

K1NSZ vs WSZ

0

Grupa NSZ różni się od grupy WSZ 7 IDmRNA, mimo tego, że

obydwie grupy w ocenie histopatologicznej stanowią wycinki raka jelita

grubego. Wynik analizy Tukeya wskazuje również, że obydwie kontrole

z pośród 26 ID mRNA wytypowanych jednoczynnikowym testem

ANOVA, różnią się istotnie od siebie 4 ID mRNA.

5. Dyskusja

Nowotwór jelita grubego jest jedną z najczęstszych przyczyn śmierci na

świecie [23]. Najnowsze badania wykazały, że jest to wieloetapowa

choroba genetyczna. Jednak czynniki środowiskowe mogą również

wspierać rozwój tej choroby [24, 25]. Pomimo postępu w diagnostyce,

badaniach oraz leczeniu, przyczyny choroby nie zostały jeszcze dokładnie

poznane [26]. Rak jelita grubego jest wynikiem postępujących

genetycznych i epigenetycznych zmian, które powodują przekształcenie

prawidłowego nabłonka okrężnicy w gruczolakoraka jelita grubego [27].

Badania z ostatnich lat w dużej mierze koncentrują się na biologii

molekularnej choroby. Podstawowym celem prowadzonych badań jest nie

tylko szukanie sposobów zapobiegania nowotworom oraz wczesne

wykrywanie, ale również poznanie skutecznych metod walki z chorobą.

Celem naukowców jest wprowadzenie terapii działającej bezpośrednio na

guz. Jednak brakuje wciąż wiedzy na temat kancerogenezy na poziomie

molekularnym [26].

Najnowszym stosowanym sposobem leczenia przerzutów raka jelita

grubego jest hamowanie szlaku EGFR w celu zablokowania wzrostu guza

i proliferacji komórek. Jednak naukowcy nadal poszukują alternatywnych

metod leczenia. Ostatnio uważa się, że autofagia może być odpowiednim

celem terapeutycznym w leczeniu nowotworów, ponieważ powoduje


106

oporność guzów na chemioterapię [23]. Wśród czynników zaangażo-

wanych w etiologię tej choroby, duże znaczenie ma autofagia. Dokładny

mechanizm prowadzący do autofagii w raku nie jest jeszcze dokładnie

poznany. Wiadomo tylko, że proces ten pełni podwójną rolę w nowo-

tworach. Z jednej strony może chronić komórki przed transformacją

nowotworową poprzez usunięcie uszkodzonych organelli, zagregowanych

białek czy zmniejszenie reaktywnych form tlenu. Z drugiej strony autofagia

powoduje przeżycie komórek guza ułatwiając im dostęp do składników

odżywczych, hamuje śmierć komórek oraz zwiększa odporność na leki [20].

Nowotwór jest wynikiem zmian zachodzących w materiale gene-

tycznym, czego następstwem są zaburzenia w ścieżkach metabolicznych.

Białkowe produkty zmienionych genów wpływają na procesy zachodzące

w komórkach nowotworowych, takie jak proliferacja, różnicowanie,

apoptoza i angiogeneza. Te białka mogą być markerami nowotworowymi,

przydatnymi w przypadku diagnostyki choroby. W celu oznaczania

obecności markerów nowotworowych konieczne jest wykonanie badań

molekularnych [28].

Mikromacierze oligonukleotydowe stanowią ostatnio bardzo popularną

technikę analizy ekspresji genów [29]. Dzięki nim można ocenić jedno-

razowo dużą ilość genów oraz istnieje możliwość określenia ich profilu

ekspresji genów charakterystycznego dla danego typu nowotworu [30].

W tym przypadku badano profil ekspresji genów związanych z autofagią.

Wytypowanie genów, które zmieniają swoją aktywność w gruczo-

lakoraku jelita grubego w porównaniu do jelita zdrowego, może mieć

zastosowanie w diagnostyce klinicznej oraz terapii tego nowotworu

(opracowanie nowych, skutecznych leków). Brak zmian w ekspresji genów

w stosunku do kontroli może oznaczać, że te geny nie uczestniczą

w rozwoju choroby [31].

W niniejszym baniu wykorzystano mikromacierze oligonukleotydowe

HG-U133A (Affymetrix), dzięki którym oceniono profil ekspresji genów

charakterystycznych dla autofagii. Metodę tę cechuje bardzo wysoka

czułość i dokładność. W bazie danych Affymetrix znajduje się 207 sond dla

mRNA genów związanych z autofagią.

Do przeprowadzenia niniejszego badania wyselekcjonowano 26 ID

mRNA genów związanych z autofagią a kolejnym krokiem było wykonanie

analizy porównawczej K2, NSZ i WSZ w odniesieniu do kontroli K1.

Wstępną ocenę zróżnicowania poszczególnych grup transkryptomów

przeprowadzono na podstawie intensywności sygnałów fluorescencji

w postaci „map gorąca”. Następnie znamienność statystyczną obserwo-

wanych różnic oceniono wykonując jednoczynnikowy test ANOVA oraz

test post hoc Tukeya wskazującego ID mRNA różnicujące K2, NSZ i WSZ

od kontroli K1.



107

Przeprowadzono analizę porównawczą transkryptomów genów (207 ID

mRNA) biorących udział w autofagii i uzyskano wynik, wskazujący, że

profil stężenia mRNA w wycinkach jelita grubego zmienia się w zależności

od stopnia zaawansowania gruczolakoraka jelita grubego. Próbując

odnaleźć geny uczestniczące w autofagii nie wykryto żadnych genów

specyficznie różnicujących wycinki raka w grupie NSZ od K. W przypadku

pacjentów z rakiem jelita grubego w wysokim stopniu zaawansowania

(WSZ) proces chorobowy uległ znacznemu postępowi. Zmiany, które

zaobserwowano w NSZ są już nieobecne, natomiast obserwujemy 8 genów

specyficznie różnicujących WSZ: TMEM59, NBR1, PSEN1, VTI1B,

DRAM1, SH3BP4 oraz 2 ID dla BECN1.

Dokładna funkcja białka TMEM59 nie jest poznana, wiadomo, że

uczestniczy w makroautofagii. Znajduje się w błonie aparatu Golgiego

i hamuje glikozylację białka APP w aparacie Golgiego (ang. amyloid

precursor protein) oraz zmniejsza poziom APP na powierzchni komórki.

Ponadto TMEM59 powoduje aktywację LC3, co potwierdza jego

proapoptotyczne zdolności [32, 33]. Z kolei białko NBR1 zaangażowane

jest w autofagię, głównie mitofagię [34]. Głównym zadaniem PSEN1 jest

udział w produkcji β-amyloidu, co przyczynia się do rozwoju choroby

Alzheimera. Bierze również udział w rozwoju nowotworów oraz oporności

na chemioterapię, jednak proces ten nie jest do końca poznany [35]. Duże

znaczenie w powstawaniu nowotworów ma białko DRAM1, które bierze

udział w indukcji autofagii i apoptozy zależnej od TP53 [36]. Białko

SH3BP4 pełni funkcję hamowania GTPazy Rag i jest również negatywnym

regulatorem szlaku sygnalizacyjnego mTORC1, co przyczynia się do roz-

woju wielu typów nowotworów [37]. Z pośród wymienionych genów

największe znaczenie w autofagii ma białko BECN1 (Beclina 1).

Uczestniczy w początkowej fazie autofagii – w formowaniu fagoforu [2].

Ponadto bierze udział w oporności na chemioterapię [38]. Na temat roli

genu VTI1B w rozwoju nowotworów, nie znaleziono informacji

w piśmiennictwie. Udowodniono w niniejszym badaniu, jak ważną rolę

odgrywa autofagia w procesie nowotworzenia.

Podsumowując, badania na poziomie molekularnym przyczynią się do

opracowania nowych metod diagnostyki, terapii oraz nieinwazyjnych

metod wykrywania wczesnych postaci nowotworów jelita grubego.

Poznanie genów zaangażowanych w autofagię oraz ścieżek sygnałowych

biorących udział w najwcześniejszych etapach choroby, może przyczynić

się do opracowania leków kontrolujących lub zapobiegających dalszemu

rozwojowi choroby [39]. Obecnie prowadzone są intensywne badania nad

opracowaniem nowych metod terapii, polegające na aktywacji autofagii,

np. w wyniku indukcji stresu ER, hamowana szlaku mTOR lub aktywacji

AMPK w różnych typach nowotworu [18].


108

6. Wnioski

Badanie ekspresji genów techniką mikromacierzy oligonukleotydowych

w gruczolakoraku jelita grubego, stanowi cenną metodę uzupełniającą

diagnostykę wczesnej postaci nowotworu.

Zmiany molekularne wyprzedzają zmiany fenotypowe. Świadczy o tym

fakt, że w grupie kontrolnej K2 mogą znajdować się już komórki

nowotworowe.

Zaobserwowane różnice ekspresji genów związanych z autofagią

w badanej grupie chorych z gruczolakorakiem jelita grubego w porównaniu

z wycinkami jelita zdrowego, mogą wskazywać na istotną rolę wyodręb-

nionych genów w patogenezie tego nowotworu.

Literatura

1. Badadani M., Autophagy Mechanism, Regulation, Functions, and Disorders,

Cell Biology, (2012), s. 1-11

2. Dereń-Wagemann I., Kiełbiński M., Kuliczkowski K., Autofagia – proces

o dwóch obliczach, Acta Hematologica Polonica, 44 (2013), s. 383-391

3. Kost A., Kasprowska D., Łabuzek K. i in., Autofagia w niedokrwieniu mózgu,

Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 65 (2011), s. 524-533

4. Świderek E., Strządał L., Autofagia i białko BNIP3 w nowotworach, Postępy

Higieny i Medycyny Doświadczalnej., 67 (2013), s. 363-370

5. Niedźwiedzka-Rystwej P. Deptuła W., Autofagia – ważne zjawisko

odpornościowe, Postępy Biologii Komórki, 36 (3) (2009), s. 455-464

6. Ghavami S., Shojaei S., Yeganeh B. et al., Autophagy and apoptosis

dysfunction in neurodegenerative disorders, Progress in Neurobiology,

112 (2014), s. 24-49

7. Fujita Y., Araya J., Ito S. et al., Suppression of autophagy by extracellular

vesicles promotes myofibroblast differentiation in COPD pathogenesis,

Journal of Extracellular Vesicles, 4 (2015), s. 1-12

8. Lisak N., Totoń E., Rybczyńska M., Autofagia, nowe perspektywy w terapii

przeciwnowotworowej, Postępy Medycyny i Higieny Doświadczalnej,

68 (2014), s. 925-935

9. Dumit V., Dengjel J., Autophagosomal Protein Dynamics and Influenza Virus

Infection, Frontiers in Immunology, 3 (43) (2012), s. 1-10

10. Zielniok K., Gajewska M., Znaczenie autofagii w procesie nowotworzenia,

Życie Weterynaryjne, 90 (9) (2015), s. 565-569

11. Qi L., Zhang XD., Wu Ch. et al., The role of chaperone-mediated autophagy

in huntingtin degradation, PLoS ONE, 7 (10) (2012), s. 1-16

12. Polewska J., Autofagia – mechanism molekularny, apoptoza i nowotwory,

Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 66 (2012), s. 921-936

13. Kiffin R., Christian Ch., Knecht E. et al., Activation of chaperone-mediated

autophagy during oxidative stress, Molecular Biology of the Cells, 15 (2004),

4829-4840



109

14. Muntz Ch., Antigen processing by macroautophagy for MHC presentation, Frontiers in Immunology, 2 (42) (2011), s. 1-7

15. Eskelinen E. Saftig P., Autophagy A lysosomal degradation pathway with a central role in health and disease, Biochemica et Biophysica Acta, 1793 (2009), s. 664-6

16. Yang Z., Klionsky D., Mammalian autophagy core molecular machinery and signaling regulation, Current Opinion in Cell Biology., 22 (2) (2010), s. 1-14

17. Hasima N., Ozpolat B., Regulation of autophagy by polyphenolic compounds as a potential therapeutic strategy for cancer, Cell Death and Disease, 509 (2014), s. 1-13

18. Kania E., Pająk B., Orzechowski A., Calcium homeostasis and ER stress in control of autophagy in cancer cells, BioMed Research International, (2015), s. 1-12

19. Sakitani K., Hirata Y., Hikiba Y. et al., Inhibition of autophagy exerts anti-colon cancer effects via apoptosis induced by p53 activation and ER stress, BMC Cancer, 15 (795) 2015, s. 1-14

20. Burada F., Nicoli E. R., Ciurea M. E. et al., Autophagy in colorectal cancer An important switch from physiology to pathology, World Journal of Gastrointestinal Oncology, 7 (11) (2015), s. 271-284

21. Grossi A., Peserico A., Tezil T. et al., p38α MAPK pathway a key factor in colorectal cancer therapy and chemoresistance, World Journal of Gastroenterology, 20 (29) 2014, s. 9744-9758

22. Groulx J. F., Khalfaoui T., Benoit Y. D., Autophagy is active in normal colon mucosa, Autophagy, 8 (6) (2012), 893-902

23. Alvces S., Castro L., Fernandes M. S. et al., Colorectal cancer-related mutant KRAS alleles function as positive regulators of autophagy, Oncotarget, 6 (31) 2015, s. 30787-30802

24. Arnold C. N., Goel A., Blum H. E., Molecular pathogenesis of colorectal cancer implications for molecular diagnosis, Cancer, 104 (10) 2005, s. 2035-2047

25. Tye H., Jenkins B. J., Tying the knot between cytokine and toll – like receptor signaling in gastrointestinal tract cancer, Cancer Science, 104 (9) 2013, s. 1139-1145

26. Grande-Pulido E., Riquelme-Oliveira A., Ballesteros-Bargues J. et. al., Molecular Biology of colorectal cancer, Research Signpost. 2 (2011), s. 569-579

27. Kheirelseid E., Miller N., Chang K. H. et al., Clinical applications of gene expression in colorectal cancer, Journal of Gastrointestinal Oncology, 4 (2) (2013), s. 144-157

28. Siedlecki J., Diagnostyka molekularna nowotworów, Postępy Nauk medycznych, 2 (2011), s. 88-93

29. Wang M., Crager M., Pugazhenthi S., Modulation of apoptosis pathways by oxidative stress and autophagy in β cells, Experimental Diabetes Research, (2012), s. 1-14

30. Jęda A., Witek A., Janikowska G. i in., Profil ekspresji genów związanych z układem histaminergicznym wyznaczony techniką mikromacierzy oligonukleotydowych HG-U133A u kobiet z gluczorakorakiem endometrium, Ginekologia Polska, 85 (2014), s. 172-179

31. Kazula A., Wykorzystanie mikromacierzy DNA w terapii i diagnostyce, Genetyka, 65 (3) (2009), s. 229-238


110

32. Zhang L., Ju X., Cheng Y. et al., Identifying Tmem59 related gene regulatory network of mouse neural stem cell from a compendium of expression profiles, BMC System Biology, 5 (152) (2011), s. 1 -12

33. Boada-Romero E., Letek M., Fleischer A., et al., TMEM59 defines a novel ATG16L1-binding motif that promotes local activation of LC3, The EMBO Journal, 32 (2013), s. 566-582

34. Shi J., Fung G., Zhang J., et al., NBR1 is dispensable for PARK2-mediated mitophagy regardless of the presence or absence of SQSTM1, Cell Death and Disease, 6 (2015), s. 1-9

35. Sassi C., Guerreiro R., Gibbs R., et al., Investigating the role of rare coding variability in Mendelian dementia genes (APP, PSEN1, PSEN2, GRN, MAPT, and PRNP) in late-onset Alzheimer's disease, Neurobiology of Aging, 35 (12) (2014), s. 2881-2887

36. Guan JJ., Zhang XD., Sun W., et al., DRAM1 regulates apoptosis through increasing protein levels and lysosomal localization of BAX, Cell Death and Disease, 6 (2015), s. 1-12

37. Kim Y., Stone M., Hwang TH., et al., SH3BP4 is a negative regulator of amino acid-Rag GTPase-mTORC1 signaling, Molecular Cell., 46 (6) (2012), s. 1-25

38. Ying H., Qu D., Liu Ch., et al., Chemoresistance is associated with Beclin-1 and PTEN expression in epithelial ovarian cancers, Oncology Letters, 9 (2015), s. 1759-1763

39. Markowitz S., Bertagnolli M., Molecular origins of cancer: Molecular basis of colorectal cancer, The New England Journal of medicine, 361 (25) (2009), s. 2449-2460

Profil ekspresji genów zaangażowanych w autofagię w różnicowaniu

komórek raka jelita grubego

Autofagocytoza, to proces biologiczny polegający na kontrolowanym rozkładzie cząsteczek,

fragmentów komórki, organelli komórkowych w celu pozyskania dodatkowego źródła energii.

Wyróżniamy trzy rodzaje autofagii: mikroautofagię, autofagię związaną z chaperonami (białkami

opiekuńczymi) oraz makroautofagię.

Celem badania było zbadanie profilu ekspresji genów związanych z autofagią w różnico-

waniu komórek raka jelita grubego.

Analiza profilu ekspresji genów była wykonywana przy użyciu mikromacierzy of HG-U133A

(Affymetrix, Santa Clara, CA). Wyznaczanie genów różnicujących przeprowadzono

z wykorzystaniem Infrastruktury PL-Grid (http://www.plgrid.pl/).

Podczas analizy średnich sygnałów fluorescencji w grupach K2, NSZ i WSZ w porównaniu do

K1, stwierdzono, że z grupy 26 ID mRNA wytypowano przy wartości p < 0,05, dla K2 vs K1 – 4 ID

mRNA, dla NSZ vs K1 – 5 ID mRNA oraz dla WSZ vs K1 – 12 ID mRNA.

Z analizy diagramu Venna wynika, że z grupy 26 ID mRNA wytypowanych jako różnicujące

wycinki raka jelita grubego o niskim stopniu zaawansowania od kontroli, nie ma żadnych genów

specyficznych tylko dla NSZ. W przypadku różnicowania raka jelita grubego o wysokim stopniu

zaawansowania od kontroli, specyficznych jest 8 genów: dwa ID dla receptora BECN1 oraz po

jednym dla TMEM59, NBR1, PSEN1, VTI1B, DRAM1 i SH3BP4.

Wnioski: Zmiany molekularne wyprzedzają zmiany fenotypowe. Ekspresja genów związanych

z autofagią zależy od stopnia zaawansowania gruczolakoraka



111

The expression profile of genes involved in autophagy in the

differentiation of colon adenocarcinoma

Autophagy is a biological process which plays role in cellular homeostasis by eliminating aged,

damaged or malfunctioning organelles and damaged or misfolded proteins. There are three types

of autophagy: microautophagy, macroautophagy and chaperone – related autophagy.

The aim of this study was to compare the expression profile of genes involved in autophagy in the

differentiation of colon adenocarcinoma.

The analysis of the expression profile of genes was performed using oligonucleotide microarrays

of HG-U133A (Affymetrix, Santa Clara, CA). Appointment of differentiating genes was

performed with the use of PL-Grid Infrastructure (http://www.plgrid.pl/).

The results showed that of the group 26 ID mRNA were chosen at p <0.05 for C2 vs C1 – 4 ID

mRNA, for LCS vs C1 – 5 ID mRNA and for HCS vs C1 – 12 ID mRNA.

The analysis of a Venn diagram shows that from 26 ID mRNA selected as a differential

of colorectal cancer LCS vs C1, there is no specific genes only LCS. In the case of the

differentiation of colorectal cancer HCS vs C1 – specific genes is 8, two ID for BECN1 receptor

and one for TMEM59, NBR1, PSEN1, VTI1B, DRAM1 and SH3BP4.

Conclusions: Molecular changes occur before phenotypic changes. Expression of genes involved

in autophagy depend on the clinical stage of adenocarcinoma.

112

Dominika Lach1

Terapie przeciwzapalne – nowy cel

w leczeniu ostrych zespołów wieńcowych

1. Wstęp

Według danych Światowej Organizacji Zdrowia (WHO, ang. World Health Organization) choroby układu krążenia, w tym choroba niedokrwienna serca, stanowią najczęstszą przyczynę zgonów na świecie. Co więcej, z powodu zwiększającego się wraz z wiekiem ryzyka wystą-pienia tych zespołów chorobowych i starzenia się populacji na świecie, odnotowuje się ciągły wzrost liczby zgonów [1, 2]. Choroba niedokrwienna serca jest zespołem objawów, a ostry zespół wieńcowy (OZW) jej szczególnie niebezpieczną konsekwencją. W zależności od obserwowanych objawów klinicznych, zmian elektrokardiograficznych i badań bioche-micznych OZW dzielimy na: ostry zespół wieńcowy z uniesieniem odcinka ST (STEMI, ang. ST-segment Elevation Myocardial Infarction) – ostry zawał mięśnia sercowego z uniesieniem odcinka ST lub ostry zespół wieńcowy bez uniesienia odcinka ST (NSTE-ACS, ang. non-ST-Segment Elevation Acute Coronary Syndromes). Ponadto wśród NSTE-ACS wyróżnia się: zawał mięśnia sercowego bez uniesienia odcinka ST (NSTEMI, ang. non-ST-segment Elevation Myocardial Infarction) oraz niestabilną dławicę piersiową (UA, ang. Unstable Angina) [3]. Patofizjo-logia OZW, niezależnie od szerokiego spectrum manifestacji klinicznej, związana jest zawsze z erozją i/lub pęknięciem blaszki miażdżycowej, która prowadzi do zakrzepicy wewnątrz tętnicy wieńcowej, nagle zmniejszającej lub całkowicie uniemożliwiającej prawidłowy przepływ krwi, m. in. w wyniku aktywacji kaskady krzepnięcia i aktywacji płytek krwi. Pomimo ciągłego unowocześniania standardów leczenia interwen-cyjnego i farmakologicznego w OZW, nawracające niedokrwienia mięśnia sercowego i śmiertelność pacjentów z powodu powikłań niedokrwiennych pozostają na wysokim poziomie [4]. Z tego względu nadal potrzebne jest opracowywanie bardziej skutecznych metod zapobiegania i leczenia OZW. W tym celu konieczne jest lepsze poznanie molekularnych mechanizmów OZW. Najnowsze badania wskazują na istotną rolę aktywnych procesów zapalnych w patofizjologii OZW [5, 6]. Celem niniejszej pracy jest przed-

[email protected], Katedra Biochemii Ogólnej, Wydział Biologii i Ochrony

Środowiska, Uniwersytet Łódzki, www.biol.uni.lodz.pl

Terapie przeciwzapalne – nowy cel w leczeniu ostrych zespołów wieńcowych

113

stawienie najnowszych danych na temat potencjalnych terapii przeciw-zapalnych u pacjentów z OZW.

2. Procesy zapalne w OZW

W obrębie zmian miażdżycowych, których erozja lub pęknięcie prowadzące do niedotlenienia mięśnia sercowego, skutkuje wystąpieniem OZW, toczy się przewlekły stan zapalny. W tętnicach wieńcowych objętych zmianami miażdżycowymi dochodzi do zaburzeń interakcji między-komórkowych pomiędzy śródbłonkiem naczyń, komórkami zapalnymi i chemokinami [7]. Zaburzenia te doprowadzają do destabilizacji, erozji i ostatecznie pęknięcia blaszki miażdżycowej. Do głównych czynników inicjujących i nasilających stan zapalny w tętnicach wieńcowych pacjentów z OZW należą mediatory zapalenia, takie jak: interleukiny (IL-1 i IL-6), białko C-reaktywne (CRP, ang. C Reactive Protein), cząsteczki adhezyjne, czynnik martwicy nowotworu (TNF-α, ang. Tumor Necrosis Factor-α) oraz metalo-proteinazy [7]. Ponadto, spowodowane działaniem mediatorów prozapalnych, nagromadzenie i aktywacja makrofagów, leukocytów oraz płytek krwi w miejscu powstania blaszki miażdżycowej również istotnie wpływa na proces jej destabilizacji, erozji i pękania [8]. W tabeli 1. przedstawiono udział mediatorów prozapalnych w rozwoju zmian miażdżycowych doprowa-dzających do rozwoju OZW.

Tab. 1 Udział wybranych mediatorów stanu zapalnego w rozwoju zmian miażdżycowych [7, 8]

Mediator

prozapalny

Miejsce

wytwarzania

Funkcja Rola

VCAM-1 śródbłonek ligand integryny

VLA-4

adhezja leukocytów,

rekrutacja monocytów

ICAM-1 śródbłonek,

limfocyty T i B,

komórki

dendrytyczne

ligand integryny

LFA-1

adhezja leukocytów,

rekrutacja monocytów

IL-6 monocyty,

makrofagi

cytokina, ligand

CD126

aktywacja limfocytów

T, stymulacja

transformacji

limfocytów B,

hamowanie

wydzielania TNF-α

TNF-α głównie

makrofagi

cytokina, ligand

TNF-R

stymulacja

makrofagów,

rekrutacja neutrofilów

Metalo -

proteinazy

m.in. śródbłonek,

płytki krwi,

makrofagi

enzymy

degradujące

kolagen

destabilizacja blaszki

miażdżycowej,

synteza cytokin

prozapalnych

Dominika Lach

114

W wyniku pęknięcia blaszki miażdżycowej przebiegającego pod postacią

odczynu zapalnego, również dochodzi do zaburzeń interakcji między-

komórkowych. Istotne znaczenie dla zaangażowania się mechanizmów

immunologicznych w obszarze zawału ma uszkodzenie błony komórkowej

kardiomiocytów spowodowane niedokrwieniem. Ponadto do zwiększenia

przepuszczalności sarkolemy przyczynia się podwyższona ilość wolnych

rodników (nadtlenkowego i wodorotlenowego) gromadzących się w niedo-

krwionym mięśniu sercowym przy równoczesnym zmniejszeniu poziomu ich

inaktywatorów. Powierzchnia komórek mięśnia sercowego zmienia się

również poprzez ekspresję cząsteczek adhezyjnych, co skutkuje reakcją

komórek immunologicznie kompetentnych odpowiedzialnych za rozwój

i utrzymanie procesu zapalnego [9].

Na komórkach endotelium dochodzi do ekspresji m.in. cząsteczki adhezji

komórkowej płytkowo-śródbłonkowej 1 (PECAM-1, ang. Platelet Endothelial

Cell Adhesion Molecule-1), która umożliwia przechodzenie leukocytów

pomiędzy komórkami śródbłonka. Zablokowanie powierzchniowej ekspozycji

PECAM-1 może zapobiec pozawałowemu uszkodzeniu mięśnia sercowego

poprzez potencjalne zahamowanie migracji neutrofili [10]. W następstwie

niedokrwienia dochodzi również do zmiany stężeń cząstek adhezyjnych

rozpuszczalnych w osoczu. Zwiększa się ekspresja rozpuszczalnych form

cząsteczek adhezji komórkowej naczyń 1 (VCAM-1, ang. Vascular Adhesion

Molecule-1) oraz cząsteczek adhezji międzykomórkowej 1 (ICAM-1, ang.

Intercellular Adhesion Molecule-1), a u pacjentów z UA rośnie stężenie

cząsteczki biorącej udział w adhezji m.in. neutrofili do śródbłonka naczyń

– selektyny – E (CD62E) [10, 11].

Powstanie nacieku zapalnego w niedokrwiennym miokardium i aktywacja

wędrujących komórek zapalnych związana jest z pobudzeniem sieci

cytokinowej, która pomimo licznych publikacji nie jest do końca poznana.

U pacjentów po przebytym zawale mięśnia sercowego dochodzi do

zwiększenia stężenia w osoczu cytokin prozapalnych (IL-1, IL-6, TNF-α).

Działanie prozapalne cytokin w OZW związane jest z aktywacją cząsteczek

adhezyjnych, wpływem na zwiększenie przepuszczalność śródbłonka,

mobilizacją komórek monocytów i leukocytów oraz odkładaniem w ścianach

naczyń cząsteczek lipidów [12].

Naciek komórek zapalnych w obrębie zawału aktywowany jest również

przez chemotaktyczne oddziaływania składowych układu dopełniacza

skierowane na te komórki [13]. Zaburzenia interakcji międzykomórkowych w

postaci odczynu zapalnego wywołanego niedokrwieniem są istotą procesów

zachodzących podczas zawału mięśnia sercowego [14].


115

3. Terapie przeciwzapalne w OZW

Stosowane obecnie leki przeciwzapalne należące do niespecyficznych

inhibitorów zapalenia prowadzą do niepożądanych zmian w obrębie zawału

mięśnia sercowego, takich jak powiększenie obszaru zawału oraz powik-

łania spowodowane niedostatecznym uformowaniem blizny pozawałowej

[15]. Postęp w terapii przeciwzapalnej OZW mogłoby stanowić specy-

ficzne hamowanie procesów zapalnych. Lepsze poznanie udziału procesów

pro – i przeciwzapalnych w patomechanizmie OZW zaowocowało w ostat-

nim czasie wzrostem liczby badań nad potencjalnymi terapiami przeciw-

zapalnymi. Zachodzące u pacjentów z OZW procesy zapalne mogą

stanowić cel działania dla nowych kierunków terapii. Nowe leki

przeciwzapalne stanowiące potencjalny efekt poszukiwań skutecznej terapii

OZW różnią się zarówno mechanizmem, jak i obszarem działania i mogą

wykazywać działanie uogólnione lub też działać bardziej specyficznie [16].

W tabeli 2. przedstawiono zestawienie potencjalnych leków przeciw-

zapalnych, będących przedmiotem szczegółowych badań u pacjentów

z OZW.

Tab. 2 Potencjalne cele terapii przeciwzaplnych w OZW [16]

Lek Mechanizm

działania

Faza badań

klinicznych Wyniki

Kolchicyna

uogólnione

działanie

przeciwzapalne

II

Zmniejsza ryzyko

wystąpienia

ponownego zawału;

wpływa na

zmniejszenie obszaru

zawału mięśnia

sercowego

VT-111a inhibitor proteazy

serynowej I

Obniżenie poziomu

troponiny

w porównaniu do

placebo; dopuszczony

do dalszych badań

Losmapimod

inhibitor kinazy

p38 MAPK

III Ocena wpływu na

poziom troponiny

Daraplapid inhibitor

fosfolipazy A2 III

Brak istotnych różnic

w porównaniu do

placebo

Gevokizumab inhibitor IL-1β Badania

przedkliniczne W trakcie badań

Kanakinumab inhibitor IL-1β W trakcie II W trakcie badań

Dominika Lach

116

3.1. Kolchicyna

Do leków wykazujących uogólnione działanie na układ immuno-

logiczny należy kolchicyna, która jest stosowana od lat głównie u osób

z dną moczanową. Kolchicyna jest alkaloidem wykazującym szereg

właściwości przeciwzapalnych. Poprzez wiązanie się z mikrotubulami

tworzącymi wrzeciono kariokinetyczne, hamuje podziały komórkowe.

Ponadto modyfikuje funkcje komórek układu immunologicznego

wpływając na ich zdolność do fagocytozy, mobilizacji, degranulacji

zawartości wewnątrzkomórkowych lizosomów oraz adhezji do śródbłonka

naczyń krwionośnych [17]. Lek ten obecnie poddawany jest II fazie badań

klinicznych (LoDoCo, ang. Low Dose Colchicine for Secondary Prevention

of Cardiovascular Disease) w grupie pacjentów z OZW. Podczas tych 3-

letnich randomizowanych badań wykazano, że jej przyjmowanie w dawce

0,5 g na dobę zmniejsza ryzyko wystąpienia ponownego zawału mięśnia

sercowego i powikłań OZW w porównaniu z placebo i może również

wpływać na zmniejszenie obszaru zawału mięśnia sercowego [18].

3.2. Inhibitor proteazy serynowej – VT-111a

Inhibitor proteazy serynowej, – VT-111a działa poprzez wiązanie się

z receptorem urokinazowego aktywatora plazminogenu (uPAR, ang.

urokinase-type Plasminogen Activator Receptor), który uczestniczy w pro-

cesach zapalnych. Ten potencjalny lek w terapii przeciwzapalnej OZW

powoduje obniżenie poziomu troponiny we krwi po 24 godzinach w po-

równaniu do placebo. Pozytywne wyniki I fazy badań pozwoliły na

dopuszczenie go do dalszych testów klinicznych [19].

3.3. Inhibitor kinazy p38 MAPK – losmapimod

Losmapimod, będący inhibitorem kinazy p38 aktywowanej mitogenami

(MAPK, ang. Mitogen Activated Kinases), która jest zaangażowana

w regulację odpowiedzi zapalnej, cyklu komórkowego, apoptozy i różnico-

wanie się komórek, został poddany ocenie w badaniach klinicznych II fazy

u pacjentów z OZW. Badania nad losmapimodem prowadzono w porównaniu

z grupą kontrolną przyjmującą placebo. Wykazano, że stężenie białka C-

reaktywnego w 72 godzinie po podaniu leku było mniejsze w grupie pacjentów

przyjmujących losmapimod w porównaniu z placebo, a po 12 tygodniach na

porównywalnym poziomie [20]. Obecnie trwają zakrojone na szeroką skalę

badania kliniczne III fazy mające ocenić wpływ losmapimodu na stężenie

troponiny u pacjentów z OZW w porównaniu z chorymi przyjmującymi

placebo [21].


117

3.4. Inhibitor fosfolipazy A2 – darapladip

Fosfolipaza A2 jest enzymem hydrolizującym cząsteczki fosfolipidów.

Darapladip to lipoproteina wiążąca się z fosfolipazą A2, która jest

zaangażowana w rozwój blaszki miażdżycowej ponieważ procesy hydrolizy

fosfolipidów prowadzą m. in. do powstania potencjalnie aterogennych

frakcji lipidów oraz do zwiększenia ekspozycji śródbłonka naczyń

krwionośnych na działanie stresu oksydacyjnego [22]. Jednakże randomi-

zowane badania kliniczne pacjentów z OZW nie wykazały istotnych różnic

w porównaniu z placebo [23].

3.5. Inhibitory interleukiny IL-1β – gevokizumab i kanakinumab

Gevokizumab i kanakinumab są przeciwciałami monoklonalnymi

skierowanymi przeciwko IL-1 beta (IL-1β), która odrywa dużą rolę w pro-

cesach prozapalnych w OZW, patogenezie miażdżycy, a także wielu innych

chorobach o podłożu zapalnym. Cytokina ta obok TNF-α i IL-6 odgrywa

istotną rolę w kluczowej ścieżce sygnałowej procesów zapalnych [24, 25]

Gevokizumab poddawano ocenie w badaniach przedklinicznych na

modelu szczurzym miażdżycy. Wykazano, iż może on istotnie hamować

procesy zapalne toczące się w obrębie zmian miażdżycowych. W celu

sprawdzenia jego potencjalnych możliwości hamowania procesów

zapalnych w tętnicach wieńcowych u pacjentów z OZW postanowiono

przeprowadzić pilotażowe badania kliniczne II fazy [26].

Natomiast kanakinumab, zatwierdzony w leczeniu rzadkich schorzeń

o podłożu zapalnym, został poddany badaniom klinicznym II fazy (The

CANTOS trial) na grupie pacjentów z OZW również w celu sprawdzenia

wpływu na zmniejszenie stanu zapalnego w obrębie zmian miażdżycowych

tętnic wieńcowych [27].

4. Podsumowanie

Ostry zespół wieńcowy stanowi jedną z najczęstszych przyczyn zgonów

na świecie. Pomimo ciągłego unowocześniania standardów leczenia OZW,

nawracające epizody niedokrwienia mięśnia sercowego i śmiertelność

pacjentów są nadal bardzo częste. Z tego względu potrzebne jest

opracowanie bardziej skutecznych metod zapobiegania i leczenia OZW.

W tym celu konieczne jest dokładniejsze poznanie molekularnych

mechanizmów prowadzących do rozwoju OZW. Patofizjologia OZW

polega na erozji i/lub pęknięciu blaszki miażdżycowej, co prowadzi do

zaczopowania tętnicy wieńcowej. Najnowsze badania wskazują również na

istotną rolę aktywnych procesów zapalnych w patomechanizmach OZW.

Lepsze poznanie udziału procesów pro – i przeciwzapalnych w pato-

mechanizmie OZW zaowocowało w ostatnich latach wzrostem liczby

Dominika Lach

118

badań nad potencjalnymi terapiami przeciwzapalnymi. Prowadzone

aktualnie duże wieloośrodkowe badania klinicznie pozwolą zweryfikować

skuteczność i bezpieczeństwo potencjalnych terapii przeciwzapalnych.

Literatura

1. http://www.who.int

2. Centres for Disease Control and Prevention. Deaths: Final Data for 2013,

Natl Vital Stat Rep 2013

3. Kumar A., Cannon C. P., Acute Coronary Syndromes: Diagnosis and

Management, Part I., Mayo Clinical Proc 2009; 84, s. 917-938

4. Smolina K., Wright F. L., Rayner M., Goldacre M. J., Long-term survival and

recurrence after acute myocardial infarction in England 2004 to 2010, Circ

Cardiovasc Qual Outcomes 2012; 5, s. 532-40

5. Libby P., Tabas I., Fredman G., Fisher E. A., Inflammation and its resolution

as determinants of acute coronary syndromes, Circ Res 2014; 114, s.1867-79

6. Falk E., Nakano M., Bentzon J. F., Finn A. V., Virmani R., Update on acute

coronary syndromes: the pathologists view, European Heart of Journal 2013;

34, s.719-28

7. Pasqui A. L., Di Renzo M., Pro-inflammatory/anti-inflammatory cytokine

imbalance in acute coronary syndromes, Clin Exp Med 2006; 6, s. 3844

8. Bonetti P. O., Lerman L. O., Endothelian dysfunction – a marker of

atherosclerotic risk, Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003; 23, s. 168-175

9. Ishibashi T., Kijama M., Yokoyama K., Expresion of cytokine and adhesion

molecule mRNA in atherectomy specimens from patients with coronary artery

disease, Jpn Circ J 1999; 63, s. 249-254

10. Murohara T., Delyani J. A., Albelda S. M., Lefer A. M., Blockade of endothelial

cell adhesion molecule-1 protects against myocardial ischemia and reperfusion

injury in cats, Journal of Immunology 1996; 156, s. 3550-1557

11. Wallen N.H., Elevated serum intercellular adhesion molecule-1 and vascular

adhesion molecule-1 among patients with stable angina pectoris who suffer

cardiovascular death or nonfatal myocardial infarction, European Heart

of Journal 1999; s. 20: 1039-1043

12. Marciniak A., Rokownicze znaczenie osoczowego stężenia Il-1, Il-6, Il-8 oraz

CRP w zawale serca, Pol Arch Med Wewn 2003; 109, s. 15-22

13. Lucchesi B. R., Kilgore K. S., Complements inhibitors in myocardial

ischemia/reperfusion injury, Immunopharmacology 1997; 38, s. 27-42

14. Niessen H. W., Lagrand W. K., Visser C. A., Meijer C. J., Hack C. E.,

Upregulation of ICAM-1 on cardiomyocytes in jeopardized human

myocardium during infraction, Cardiovascular Research 1999; 41, s. 603-610

15. Young M. J., Rickard A. J., Mineralocorticoid receptors in the heart: lessons

from cell selective transgenic animals, Journal of Endocrinology, 2015; 224,

s.1-13

16. Ridker P. M., Luscher T. F., Anti-inflammatory therapies for cardiovascular

disease, Eur Heart J 2014; 35, s. 1782-91


119

17. Nuki G., Colchicine: its mechanism of action and efficacy in crystal-induced

inflammation, Current Rheumatology Rep 2008; 10, s. 218-27

18. Nidorf S. M., Eikelboom J. W., Budgeon C. A., Thompson P. L., Low-dose

colchicine for secondary prevention of cardiovascular disease, Journal of the

American College of Cardiology 2013; 61, s. 404-10

19. Tardif J. C., L’Allier P. L., Gregoire J., Ibrahim R., McFadden G., Kostuk W.,

Knudtson M., Labinaz M., Waksman R., Pepine C. J., Macaulay C., Guertin

M. C., A randomized controlled, phase 2 trial of the viral serpin Serp-1 in

patients with acute coronary syndromes undergoing percutaneous coronary

intervention, Circulation Cardiovascular Interventions 2010; 3, s. 543-8

20. Newby L. K., Marber M. S., Melloni C., Sarov-Blat L., Aberle L. H., Aylward

P. E., Cai G., de Winter R. J., Hamm C. W., Heitner J. F., Kim R., Lerman A.,

Patel M. R., Tanguay J. F., Lepore J. J., Al-Khalidi H. R., Sprecher D. L., Granger

C. B.; SOLSTICE Investigators., Losmapimod, a novel p38 mitogen activated

protein kinase inhibitor, in non-ST-segment elevation myocardial infarction:

a randomized phase 2 trial, The Lancet 2014; 384 (9949) s. 1187-95

21. GlaxoSmithKline. A Phase 3 clinical outcomes study to compare the incidence

of major adverse cardiovascular events in subjects presenting with acute

coronary syndrome treated with losmapimod compared to placebo

(LATITUDE-TIMI 60), ClinicalTrials.gov Identifier: NCT02145468

22. Rosenson R. S., Stafforini D. M., Modulation of oxidative stress,

inflammation, and atherosclerosis by lipoprotein-associated phospholipase

A2, J Lipid Res, 2012; 53, s. 1767-82

23. O’Donoghue M. L., Braunwald E., White H. D., Lukas M. A., Tarka E., Steg

P. G., Hochman J. S., Bode C., Maggioni A. P., Im K., Shannon J. B., Davies

R. Y., Murphy S. A., Crugnale S. E., Wiviott S. D., Bonaca M. P., Watson D.

F., Weaver W. D., Serruys P. W., Cannon C. P,, SOLID-TIMI 52

Investigators, Steen D. L., Effect of darapladib on major coronary events after

an acute coronary syndrome: the SOLID-TIMI 52 randomized clinical trial,

JAMA 2014; 312, s. 1006-15

24. Dinarello C. A., Interleukin-1 in the pathogenesis and treatment

of inflammatory diseases, Blood 2011; 117, s. 3720-32

25. Ridker P.M., Howard C.P., Walter V., Everett B., Libby P., Hensen J., Thuren

T., Effects of interleukin-1b inhibition with canakinumab on IL-6, fibrinogen,

and hsCRP: A Randomized placebo controlled trial, Journal of American

College of Cardiology 2012; 59(13s1):E1539

26. Roubille F., Busseuil D., Shi Y., Nachar W., Mihalache-Avram T., Mecteau

M., Gillis M. A., Brand G., Theberge-Julien G., Brodeur M. R., Kernaleguen

A. E., Gombos M., Rheaume E., The interleukin-1beta modulator

gevokizumab reduces neointimal proliferation and improves

reendothelialization in a rat carotid denudation model, Atherosclerosis 2014;

236, s. 277-85

27. Novartis Pharmaceuticals. Cardiovascular risk reduction study (reduction

in recurrent major CV disease events) (CANTOS), ClinicalTrials.gov

Identifier: NCT01327846; 2011

Dominika Lach

120

Terapie przeciwzapalne – nowy cel w leczeniu ostrych zespołów

wieńcowych

Choroba niedokrwienna serca jest zespołem objawów chorobowych stanowiących najczęstszą

przyczynę zgonów na świecie. Szczególnie niebezpieczną jej konsekwencją jest ostry zespół

wieńcowy (OZW) charakteryzujący się znacznym ograniczeniem lub ustaniem przepływu krwi w

tętnicach wieńcowych. Pomimo ciągłego unowocześniania standardów leczenia interwencyjnego

i farmakologicznego, nawracające niedokrwienia mięśnia sercowego i śmiertelność pacjentów

pozostają na wysokim poziomie. Z tego względu potrzebne jest opracowanie bardziej sku-

tecznych metod zapobiegania i leczenia OZW. W tym celu konieczne jest lepsze poznanie

molekularnych mechanizmów OZW. Patofizjologia OZW najczęściej polega na erozji i pękaniu

blaszki miażdżycowej, co prowadzi do zaczopowania tętnicy wieńcowej. Najnowsze badania

wskazują na istotną rolę aktywnych procesów zapalnych w patofizjologii OZW. Leki przeciw-

zapalne stanowiące potencjalny efekt poszukiwania terapii OZW różnią się zarówno mecha-

nizmem, jak i obszarem działania i mogą wykazywać działanie uogólnione (kolchicyna) lub też

działać bardziej specyficznie (VT-111a, losmapimod, daraplapid, gevokizumab, kanakinumab).

Celem niniejszej pracy jest przedstawienie najnowszych danych na temat potencjalnych terapii

przeciwzapalnych u pacjentów z OZW.

Anti-inflammatory therapies – a new target for the treatment of acute

coronary syndromes

Ischemic heart disease (IHS) is a syndrome of symptoms which are the most common cause of

death in the world. The especially dangerous consequence of IHS is acute coronary syndrome

(ACS) that is characterized by a significant reduction or cessation of blood flow in the coronary

arteries. Despite the continuous upgrading of standards of interventional and pharmacological

treatment in ACS, recurrent myocardial ischemia and mortality of patients remain at a high level.

For this reason, there is still a need to develop more effective methods of prevention and

treatment of ACS. For this purpose, a better understanding of the molecular mechanisms of ACS

is necessary. Pathophysiology of ACS usually consists of erosion and rupture of atherosclerotic

plaques, leading to coronary artery obstruction. Recent studies point to the important role of

active inflammatory processes in the pathophysiology of ACS. Anti-inflammatory drugs, which

are being searched for effective therapy of ACS, are different due to the mechanism or activity

area, and may have general (colchicine) or specific (VT-111a, losmapimod, daraplapid,

gevokizumab and canacinumab) action. The aim of this study is to present the latest data on the

potential anti-inflammatory therapy in patients with ACS.

121

Karolina Kątska1, Jan Ostrowski

2, Ewa Kosior-Jarecka

3

Zaburzenia ze strony narządu wzroku

w przebiegu oponiaków

1. Wstęp

Oponiaki należą do najczęstszych guzów mózgu, które stwierdza się

u osób dorosłych. Stanowią około 20% pierwotnych nowotworów

wewnątrzczaszkowych, wykazują zazwyczaj łagodny charakter. Obserwo-

wane są zwykle u pacjentów w 4. i 5. dekadzie życia, dwukrotnie częściej

u kobiet niż u mężczyzn. Oponiaki są guzami pochodzenia łączno-

tkankowego, rozwijającymi się z komórek kosmków pajęczynówki. Guzy

te są wyraźnie odgraniczone od otaczającej je tkanki mózgowej, nie

powodują jej naciekania, lecz jedynie ucisk [1]. Zaburzenia ze strony

narządu wzroku stanowią częstą i niejednokrotnie pierwszą manifestację

kliniczną oponiaków. Objawy oczne są najbardziej wyrażone w oponiakach

wywodzących się z następujących struktur tj. osłonek nerwu wzrokowego,

rynienki węchowej, guzka siodła tureckiego (oponiaki nadsiodłowe) oraz

skrzydła kości klinowej. Guzy te mogą powodować ucisk nerwu

wzrokowego i w konsekwencji jego zanik. Do częstych objawów

oponiaków należą m.in. zaburzenia ostrości wzroku, ubytki w polu

widzenia ale także dwojenie, wytrzeszcz czy zaburzenia widzenia barw.

2. Cel pracy

Celem niniejszej pracy było omówienie wybranych rodzajów opo-

niaków wykazujących istotne klinicznie objawy oczne na podstawie

przeglądu aktualnego piśmiennictwa. Z uwagi na możliwość penetracji tej

grupy oponiaków w obręb tkanek oczodołowych u pacjentów dotkniętych

tymi schorzeniami może dochodzić do zaburzeń widzenia i innych

objawów dotyczących narządu wzroku. Z tego względu zasadne wydało się

zwrócenie uwagi na te, nie tak rzadkie, patologie wewnątrzczaszkowe.

[email protected], Studenckie Koło Naukowe przy Katedrze Okulistyki Uniwersytetu

Medycznego w Lublinie 2) [email protected], Studenckie Koło Naukowe przy Katedrze Okulistyki Uniwersytetu

Medycznego w Lublinie [email protected], Klinika Diagnostyki i Mikrochirurgii Jaskry Katedry Okulistyki

Uniwersyetu Medycznego w Lublinie


122

3. Charakterystyka wybranych oponiaków

Niektóre guzy wewnątrzczaszkowe powodują postępujące deficyty

widzenia oraz ubytki w polu widzenia w ciągu tygodni lub miesięcy zanim

zostanie postawiona ostateczna diagnoza [2]. Początkowe objawy są często

niewłaściwie interpretowane zarówno przez samych pacjentów jak

i lekarzy, co powoduje opóźnienie w rozpoczęciu odpowiednich badań [3].

Należy zwrócić uwagę na fakt, że w wielu przypadkach okulista jest

pierwszym lekarzem, do którego zgłasza sie pacjent, zanim trafi do

właściwego specjalisty [3].

3.1. Oponiak osłonek nerwu wzrokowego

Oponiak osłonek nerwu wzrokowego (ONSM – Optic Nerve Sheath

Meningioma) jest łagodnym guzem występującym w obrębie oczodołu,

czasem wrastającym do przestrzeni wewnątrzczaszkowej. Stanowi 1-2%

wszystkich oponiaków. Zachorowania są częstsze u kobiet (5:1) w średnim

wieku (30-40 lat), rzadziej dzieci [4]. ONSM jest rzadkim nowotworem

wywodzącym się z komórek pajęczynówki nerwu wzrokowego (II). Opona

pajęcza otacza nerw II w odcinku wewnątrzoczodołowym i w kanale

wzrokowym, występowanie ONSM stwierdza się częściej w pierwszej

lokalizacji (92%). Pierwotnie zlokalizowane w przednim dole czaszki

oponiaki naciekające odcinek wewnątrzczaszkowy nerwu i wkraczające do

oczodołu określane są niekiedy jako wtórne ONSM [6]. OSNMs są to guzy

które wywodzą się z komórek kosmków pajęczynówki i mogą rozwinąć się

w każdej lokalizacji wzdłuż całego przebiegu osłonki nerwu. Guzy te

wykazują charakter wzrostu typowy dla oponiaków, następujący drogą

najmniejszego oporu. Zajęcie przez oponiaki otaczającej opony twardej,

tkanek, mięśni i kości oczodołu jest rzadkie aczkolwiek takie przypadki

były notowane. Wraz ze swoim rozwojem, nowotwór ten upośledza funkcje

nerwu wzrokowego, głównie poprzez wywoływanie efektu masy na

naczynia zaopatrujące oponę miękką, co wywołuje zmiany o charakterze

niedokrwiennym oraz zaburza transport aksonalny. Ponadto ONSMs rosną

otaczając nerw II na jego obwodzie co powoduje oddzielenie struktur

nerwu od jego zaopatrzenia w krew. Ten charakter wzrostu sprawia, że

guzy te stają się często niemożliwe do usunięcia bez istotnego naruszenia

struktury nerwu II [7]. Klasyczna triada objawów obejmuje: zanik nerwu

wzrokowego, spadek ostrości widzenia i obecność naczynia wzrokowo-

rzęskowego krążenia obocznego [4, 7]. Jednakże jednoczesne wystąpienie

wszystkich trzech objawów u jednego pacjenta jest rzadkie [9]. Naj-

częstszym objawem występującym u pacjentów z ONSM (obecny w około

96% przypadkach) jest bezbolesny, przewlekły spadek ostrości widzenia

lub ubytki w polu widzenia które mogą utrzymywać się przez okres od

Zaburzenia ze strony narządu wzroku w przebiegu oponiaków

123

1-5 lat zanim pacjent zgłosi się do lekarza. Spośród rzadziej spotykanych

objawów obserwuje się wytrzeszcz, dwojenie, względny defekt aferentnej

drogi odruchu źrenicznego oraz zaburzenie widzenia barw [4]. Do innych

niespecyficznych dolegliwości należą ból zlokalizowany w oczodole i bóle

głowy, które to objawy były obserwowane u 2-50% pacjentów z ONSM

[7]. Badanie dna oka praktycznie zawsze ukazuje patologiczny wygląd

tarczy nerwu wzrokowego, na który może się składać jej obrzęk i różnego

stopnia zanik nerwu wzrokowego, co może wskazywać na neuropatię

uciskową nerwu II [8]. Do obrzęku tarczy nerwu wzrokowego dochodzi

zazwyczaj gdy guz otacza lub powoduje ucisk odcinka wewnątrz-

oczodołowego nerwu [8]. Trudności diagnostyczne polegają na różnico-

waniu ONSM z glejakami n.II. Diagnostyki różnicowej wymagają również

sarkoidoza, chłoniak, hemangiopericytoma, oczodołowa schwannoma,

demielinizacyjne zapalenie nerwu II, przerzuty nowotworowe [4].

Rysunek 1. Oponiak nerwu wzrokowego. U góry: wczesny ucisk nerwu wzrokowego; u dołu:

wytrzeszcz jako późny objaw (rycina zaadaptowana z [9])

Najważniejszym badaniem, które pozwala na rozpoznanie oponiaka jest

tomografia komputerowa (TK) oczodołów, która wykazuje cylindryczne

pogrubienie nerwu wzrokowego, a w 20% przypadków także obecność

patologicznych zwapnień w obrębie guza. Patognomoniczną cechą jest

obecność zwapnień w TK, które mogą dawać obraz „szyn tramwajowych”,

tzn. cewkowatego wzmocnienia echogennego zwapnień w pochewkach n.

II. Alternatywnym badaniem jest rezonans magnetyczny (MR), który jest

szczególnie przydatny w ocenie wewnątrzczaszkowej ekspansji guza [4,

10]. Postępowanie w przypadku oponiaków nerwu wzrokowego powinno

być indywidualnie dobrane dla każdego pacjenta. U osób w średnim wieku,

z powoli rosnącym guzem, gdzie rokowanie jest dobre, wystarczy obser-


124

wacja. Jeśli stwierdza się postęp zmian, przy zachowanej zadowalającej

ostrości wzroku, postępowaniem z wyboru jest nowoczesna trójwymiarowa

radioterapia, polegająca na stosowaniu odpowiednio dawkowanej wiązki

promieni, celowanej na pochewki nerwu wzrokowego. U młodszych

pacjentów, z tendencją do rozrostu zmiany, należy usunąć ją chirurgicznie,

oszczędzając gałkę oczną. W przypadku bardziej agresywnego przebiegu,

najpierw usuwa się dostępną masę guza, a następnie stosuje się

radioterapię. Oponiak nerwu wzrokowego to zmiana łagodna, rośnie

powoli i rokowanie jest zazwyczaj dobre. Duży odsetek oponiaków można

bezpiecznie obserwować przez wiele lat. Guzy o ciężkim przebiegu,

penetrujące wewnątrzczaszkowo, mogą stanowić zagrożenie nawet dla

życia chorego, na szczęście są to zmiany niezwykle rzadkie. Rokowanie

w przypadku oponiaka nerwu wzrokowego jest dużo gorsze u dzieci niż

u dorosłych [10].

3.2. Oponiaki wewnątrzczaszkowe

Oponiaki podstawy przedniego dołu czaszki są guzami wewnątrz-

czaszkowymi powodującymi istotne zaburzenia ze strony narządu wzroku.

Jest to niejednorodna grupa, obejmująca guzy szeroko rozmieszczone na

podstawie przedniego dołu czaszki, począwszy od oponiaków rynienki

węchowej, poprzez oponiaki mające swój przyczep na łęku klinowym, aż

do oponiaków okolicy guzka siodła tureckiego. Ta grupa nowotworów,

z uwagi na różnorodność miejsca przyczepu oponowego, cechuje się

różnym charakterem wzrostu w stosunku do nerwów wzrokowych i naczyń

podstawy czaszki, a przez to odmiennością objawów i różnym przebiegiem

choroby u chorych z oponiakami zlokalizowanymi odpowiednio w przed-

niej i tylnej części podstawy przedniego dołu czaszki. Niezależnie jednak

od ścisłej lokalizacji oponiaki podstawy przedniego dołu czaszki mogą

powodować zaburzenia widzenia, które często są głównym objawem

klinicznym i których ustąpienie po leczeniu operacyjnym w pierwszym

rzędzie decyduje o powrocie pacjenta do pełni zdrowia [13].


125

Rysunek 1. Ucisk wewnątrzczaszkowy odcinka nerwu wzrokowego przez oponiaki oraz

ubytki w polu widzenia spowodowane uciskiem oponiaka guzka siodła tureckiego (rycina

zaadaptowana z [11])

3.2.1. Oponiaki rynienki węchowej

Oponiak rynienki węchowej należy do grupy oponiaków wewnątrz-

czaszkowych. Częstość występowania tego nowotworu sięga 8-14%

wszystkich guzów pochodzenia oponowego. Oponiaki te są najczęściej

obustronne i asymetryczne. Rozrastają się zazwyczaj w obrębie środkowej

części przedniego dołu czaszki, między grzebieniem kogucim, znajdującym

się w centralnej części kości sitowej, a szwem czołowo-klinowym [1]. Jest

to anatomicznie najsłabsza część pokrywy czaszki, dlatego nowotwór

szybko penetruje do podstawy czaszki oraz oczodółu, zatok przynosowych

i jamy nosa. Oponiaki rynienki węchowej rosną wolno i, zanim pojawią się

pierwsze cechy wzrostu ciśnienia wewnątrzczaszkowego, osiągają zaz-

wyczaj dość duże rozmiary. Przez większość czasu pozostają nieme

klinicznie [12]. Zaburzenia ze strony narządu wzroku pod postacią

pogorszenia ostrości wzroku oraz ubytków w polu widzenia stanowią

istotny i często pierwszy zauważalny przez pacjentów objaw rozwijającego

się guza. Objawy oczne występują najczęściej w zaawansowanych

postaciach nowotworu, gdy masa guza uciska od góry i spycha ku tyłowi

skrzyżowanie nerwów wzrokowych lub też na skutek nadciśnienia

wewnątrzczaszkowego powstaje obrzęk tarcz nerwów wzrokowych i cechy

ich wtórnego zaniku. Triada objawów charakterystycznych dla oponiaka

rynienki węchowej określana jest jako zespół Fostera-Kennedy’ego.

W jego skład wchodzą zaburzenia węchu po stronie nowotworu, zanik


126

tarczy n.II po tej samej stronie i tarcza zastoinowa po stronie przeciwnej.

W czasie powolnego rozwoju nowotwory te stopniowo uciskają płaty

czołowe, powoduje to zaburzenia osobowości i funkcji poznawczych,

związane z uszkodzeniem tej okolicy mózgu [1]. Według wielu

retrospektywnie opisywanych przypadków, najczęstszym objawem okazuje

się być ból głowy. Dolegliwość ta jest zazwyczaj zgłaszana wówczas gdy

guz osiągnie duże rozmiary. Natomiast osłabienie węchu, często

stwierdzane w badaniu neurologicznym juz po przyjęciu chorego do

szpitala, rzadko bywa objawem zwracającym uwagę pacjenta i prowa-

dzącym do postawienia właściwego rozpoznania [3].

3.2.2. Oponiaki nadsiodłowe

Oponiaki nadsiodłowe wyrastają najczęściej z okolicy guzka siodła

tureckiego i płaszczyzny klinowej- mogą również mieć swój początek

w przeponie siodła tureckiego, rosnąc zarówno do wnętrza siodła jak i ku

górze [14]. Stanowią one około 3-10% oponiaków wewnątrzczaszkowych

[15]. Pierwszym objawem klinicznym w przypadku guzów o tej lokalizacji

są zaburzenia wzrokowe, rozpoczynające się ograniczeniem pola widzenia

[14]. Wynika to z faktu, że oponiaki wyrastające z guzka siodła tureckiego

już we wczesnym etapie wzrostu wnikają pod skrzyżowanie nerwów

wzrokowych i unosząc je ku górze, powodują krytyczne napięcie zarówno

skrzyżowania jak i nerwów wzrokowych. Wielu autorów podkreśla

dominującą w obrazie klinicznym tych oponiaków stosunkowo szybką,

często niezauważalną dla pacjenta utratę widzenia [13]. Najczęściej

postępująca utrata widzenia ma charakter niesymetryczny, czasem

rozpoczyna się od niedowidzenia połowiczego dwuskroniowego, pier-

wotnego lub wtórnego zaniku tarcz nn. wzrokowych, czasem zespołu

Foster-Kennedy’ego. Oponiaki nadsiodłowe uciskają jeden bądź oba nn.

wzrokowe wraz ze skrzyżowaniem ku tyłowi, najczęściej nie naciekając

tętnicy szyjnej wewnętrznej. Duże guzy mogą przemieszczać skrzyżowanie

nn. wzrokowych zarówno ku dołowi, jak i ku górze, rozpychając na boki

tętnice szyjne i odsuwając od skrzyżowania kompleks obu tętnic przednich.

Rzadziej występujące objawy stanowią bóle głowy, a w dalszej kolejności

zaburzenia psychiczne, zniesienie węchu, napady padaczkowe, podwójne

widzenie, ból oka i zaburzenia hormonalne [15].

3.2.3. Oponiaki skrzydła kości klinowej

Oponiaki położone wzdłuż skrzydła kości klinowej stanowią około

18%. Guzy te są zlokalizowane w pobliżu istotnych struktur nerwowych

i naczyniowych tj. nerw wzrokowy, zatoka jamista, tętnica szyjna

wewnętrzna oraz tętnice środkowe mózgu. W skutek tego, odpowiadają one


127

za wysoki odsetek zachorowań i przypadków śmiertelnych. Wśród

objawów tych nowotworów wymienia się bóle głowy, utratę widzenia,

epizody niedokrwienne oraz podwójne widzenie wynikające z porażenia

jednego lub więcej mięśni zewnętrznych gałki ocznej [16]. Oponiaki

skrzydła kości klinowej, w zależności od kształtu, sklasyfikowano na

nowotwory typu „guzowatego”, przybierające kulisty kształt oraz oponiaki

typu pełzającego „en plaque”. Oponiaki kuliste to guzy obrastające

i przemieszczające w różnym stopniu tętnice wewnątrzczaszkowe i nerwy

czaszkowe, mające swój przyczep oponowy. Guzy rosnące w sposób

pełzający, płaskie, wnikają do kości przez kanały Haversa, powodując jej

przebudowę. Oponiaki „en plaque” naciekają kości podstawy czaszki

i części twarzowej czaszki, nierzadko doprowadzając do znacznego

zniekształcenia twarzy, przez przebudowę kości i zaburzenia w odpływie

żylnym [14]. Spośród oponiaków o guzowatym typie wzrostu, ze względu

na miejsce przyczepu i odmienną symptomatologię, wyodrębniono

oponiaki przyśrodkowej, środkowej i zewnętrznej części skrzydła

mniejszego kości klinowej. Oponiaki 1/3 przyśrodkowej części najczęściej

poza jednostronną utratą wzroku powodują powoli narastającą

oftalmoplegię, połączoną z wytrzeszczem gałki ocznej (spowodowanym

utrudnieniem odpływu żylnego z oczodołu), a w końcu zajęcie I gałęzi

nerwu trójdzielnego, spowodowane uciskiem bocznej ściany zatoki.

Oponiaki zlokalizowane w części środkowej często rozrastają się do

znacznych rozmiarów, powodując dominujące objawy wzmożonego

ciśnienia śródczaszkowego w postaci bólów głowy, wymiotów i obrzęku

tarcz nn. wzrokowych. Zaburzenia w polu widzenia, zniesienie węchu po

stronie guza i napady padaczkowe z aurą wzrokową i węchową pojawiają

się zazwyczaj w późnym okresie choroby. Kuliste oponiaki zewnętrznej

części skrzydła mniejszego kości klinowej powodują objawy patologicznej

masy w okolicy skroniowej bądź czołowej w przeciwieństwie do

oponiaków „en plaque”. Te ostatnie objawiają się najczęściej zniekształ-

ceniem okolicy skroniowej, powolnym narastaniem wytrzeszczu gałki

ocznej, spowodowanym pogrubieniem kości, wrastaniem guza do wnętrza

oczodołu, utrudnieniem odpływu żylnego czy odpływu chłonki z oczodołu

i wreszcie narastającymi zaburzeniami w polu widzenia [14].

4. Diagnostyka i leczenie

Rozpoznanie oponiaka ustala się na podstawie obrazu klinicznego oraz

charakterystycznych zmian widocznych w tomografii komputerowej

i rezonansie magnetycznym. Objawy okulistyczne mogą stanowić

niejednokrotnie pierwsze symptomy obecności guza a zaobserwowanie

szybkiej progresji spadku ostrości widzenia i dołączanie się objawów


128

dodatkowych powinno skłonić lekarza okulistę do uwzględnienia patologii

wewnątrzczaszkowej w diagnostyce różnicowej.

Najskuteczniejszym sposobem leczenia oponiaków jest ich całkowita

resekcja chirurgiczna. Często jest ona jednak trudna do wykonania ze

względu na naciekanie przez komórki nowotworowe naczyń tętniczych

mózgu, nerwów wzrokowych oraz kości przedniego dołu czaszki. Coraz

częściej więc wykorzystuje się techniki mikrochirurgiczne. Leczenie

oponiaków bywa wspomagane radioterapią oraz embolizacją patolo-

gicznych naczyń guza. Decyzja o podjęciu interwencji chirurgicznej zależy

od wielu czynników, między innymi od stopnia wizualizacji guza, jego

rozmiarów i zachowania okolicznych struktur nerwowych i naczyniowych

oraz ryzyka rozwoju powikłań. O skuteczności leczenia oponiaków świadczy

brak nawrotu choroby. Częstość nawrotów zależy przede wszystkim od tego,

jak szybko dokonano resekcji i czy była ona kompletna [10].

Istnieje zgodność, że decydującymi czynnikami wpływającymi na

wyniki leczenia są przede wszystkim wielkość guza oraz ostrość widzenia

przed operacją. W sposób znamienny poprawę widzenia rokują także brak

zaniku nerwu wzrokowego na dnie oka i zachowana ostrość wzroku

powyżej 0,3. Nawet w przypadkach śladowo zachowanej funkcji wzroku

i obecności zaniku nerwu wzrokowego na dnie oka w ok. 20% przypadków

można liczyć na istotną poprawę widzenia po leczeniu operacyjnym.

Stwierdzenie ślepoty przed operacją nie rokuje poprawy po leczeniu

operacyjnym [13].

5. Podsumowanie

Oponiaki należą do jednych z najczęściej występujących guzów mózgu,

stwierdzanych u osób dorosłych. Zaburzenia ze strony narządu wzroku są

istotne klinicznie i niejednokrotnie stanowią pierwsze objawy rozras-

tającego się guza. Objawy oczne są najczęściej stwierdzane w oponiakach

osłonek nerwu wzrokowego oraz oponiakach wewnątrzczaszkowych

tj. rynienki węchowej, guzka siodła tureckiego (oponiaki nadsiodłowe) oraz

skrzydła kości klinowej. Należy zwrócić uwagę, iż okulista może być

lekarzem do którego w pierwszej kolejności zgłosi się pacjent z opo-

niakiem manifestującym się objawami zarówno neurologicznymi jak

i okulistycznymi. Zaburzenia neurookulistyczne powinny być uważnie

monitorowane ażeby uniknąć opóźnienia w kwestii postawienia diagnozy

patologii wewnątrzczaszkowej [3]. Najbardziej przydatne w diagnostyce

oponiaków, oprócz obrazu klinicznego są badania obrazowe, głównie TK

i MR. Całkowita chirurgiczna resekcja guza stanowi w większości

przypadków jedyną trwale skuteczną metodę leczenia.


129

Literatura

1. Napora K. J., Obuchowska I., Mariak Z., Objawy okulistyczne w przebiegu

oponiaka rynienki węchowej, OKULISTYKA, 4 (2011), s. 105-107

2. Aui-aree N., Phruanchroen C., Oearsakul T., Hirunpat S., Sangthong R., Three

years experience of suprasellar tumors in neuro-ophthalmology clinic, Journal

of the Medical Association of Thailand, 7 (2010), s. 818-23

3. Jung J. J., Warren F. A., Kahanowicz R., Bilateral visual loss due to a giant

olfactory meningioma, Clinical Ophthalmology, 6 (2012), s. 339-342

4. Chipczyńska B., Grałek M., Trzebicka A., Hautz W., Kanigowska K.,

Klimczak-Ślączka D., Obustronny oponiak osłonek nerwu wzrokowego (ONSM)-

problemy diagnostyczne i lecznicze, Klinika Oczna, 4-6 (2006), s. 202-205

5. Sefi-Yurdakul N., Visual findings as primary manifestations in patients with

intracranial tumors, International Journal of Ophthalmology 8 (2015), s. 800-803

6. Dutton J. J., Optic nerve sheath meningiomas, Survey of Ophthalmology,

37 (1992), s. 167-183

7. Eddleman C. S., Liu J. K., Optic nerve sheath meningioma: current diagnosis

and treatment, Neurosurgical Focus, 23 (2007), s. 1-7

8. Miller N. R., Primary tumours of the optic nerve and its sheath, Eye 18

(2004), s. 1026-1037

9. Kański J. J., red. wyd. pol. Zagórski Z. Okulistyka Kliniczna, 1 (1997), s.50

10. http://okulistyka.mp.pl/chorobyoczu/neurookulistykaizez/83020,oponiak-

nerwu-wzrokowego

11. Kański J. J., Bowling B., red. wyd. pol.: Szaflik J., Izdebska J. Okulistyka

kliniczna, 4 (2013), s.106-107

12. Tuna H., Bozkurt M., Ayten M., Erdogan A., Deda H., Olfactory groove

meningiomas, Journal of Clinical Neuroscience, 6 (2005), s. 664-8

13. Nowak A., Marchel A., Leczenie operacyjne oponiaków podstawy przedniego

dołu czaszki, Neurologia I Neurochirurgia Polska, 40 (2006), s. 484-492

14. Ząbek M., Zarys neurochirurgii, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 1 (1999),

s. 56-70

15. Chi J. H., Mcdermott M. W., Tuberculum SellaeMeningiomas, Neurosurgical

Focus, 14 (2003)

16. Chaichana K. L., Jackson C., Patel A., Miller N. R., Subramanian P., Lim M.,

Gallia G., Olivi A., Weingart J., Brem H., Quiones-Hinojosa A., Predictors

of Visual Outcome Following Surgical Resection of Medial Sphenoid Wing

Meningiomas, Journal of Neurological Surgery, 73 (2012), s. 321-326

17. Lindsay K. W, Bone I., Neurologia i Neurochirurgia. Elsevier Urban&Partner,

Wrocław, 1 (2004), s. 321-323


130


Oponiaki należą do najczęstszych guzów mózgu, które stwierdza się u osób dorosłych.

Zachorowania są częstsze u kobiet w średnim wieku. W wielu przypadkach objawy oponiaków

pochodzące z narządu wzroku pojawiają się jako pierwsze, co może być przydatne w postawieniu

właściwej diagnozy. Manifestacja oczna stanowi istotny element obrazu klinicznego wielu

spośród tych chorób, a w szczególności oponiaka osłonek nerwu wzrokowego oraz oponiaków

przedniego dołu czaszki tj. oponiak rynienki węchowej, guzka siodła tureckiego oraz skrzydła

kości klinowej. Do najczęstszych objawów należą zaburzenia ostrości wzroku, ubytki w polu

widzenia, dwojenie czy też wytrzeszcz. Guzy te mogą powodować ucisk nerwu wzrokowego

a nawet jego zanik. Diagnostyka opiera się na obrazie klinicznym oraz badaniach obrazowych.

Najskuteczniejszym sposobem leczenia oponiaków jest ich całkowita resekcja chirurgiczna.

Ocular disorders in the course of meningiomas

Meningiomas are the most common tumors of the brain that are found in adults. The disease most

often develops in middle-aged women. In many cases, ocular symptoms of meningiomas appear

first, which might be useful for a diagnosis. Ocular manifestation is an important part of the

clinical picture of many of these diseases, especially optic nerve sheath meningioma and anterior

cranial fossa meningiomas, ie. olfactory groove meningioma, tuberculum sella and sphenoid

wing. The most common symptoms include deterioration of vision acuity, visual field defects,

diplopia or proptosis. These tumors can cause compression of the optic nerve and even its

atrophy. Diagnosis is based on clinical presentation and imaging studies. The most effective

treatment for meningiomas is their complete surgical resection.

131

Anna Łabejszo1, Tomasz Wandtke

2, Maciej Gawroński

3

Alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych

– immunopatogeneza i leczenie

1. Wprowadzenie, pojęcia wstępne

Niniejsza praca ma na celu przegląd informacji o obecnym stanie

wiedzy dotyczącej alergicznego zapalenia pęcherzyków płucnych, a także

prezentację metod leczenia tejże choroby oraz przybliżenie nowych

perspektyw terapeutycznych.

Alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych (AZPP, HP – hypersensitivity

pneumonitis) to choroba, rozwijająca się u osób wcześniej narażonych

ekspozycją na antygen, u których doprowadziło to do rozwoju uczulenia. Jest

to schorzenie o charakterze ziarniniakowym, a skłonności do zapadania na tę

chorobę są indywidualną predyspozycją [1, 2]. Nie istnieją jednoznaczne

kryteria do rozpoznania choroby. Uważa się, że u osób narażonych na

ekspozycję na czynniki środowiskowe, warunki klimatyczne, pyły pochodzące

z przemysłu rolno-spożywczego, a także pora roku mają wpływ na częstsze

występowanie tego schorzenia [3, 4]. W związku z różnorodnością czynników

uczulających wyróżniamy wiele rodzajów alergicznego zapalenia

pęcherzyków płucnych, m.in.:

płuco farmera – charakteryzujące się występowaniem w organizmie

pacjenta precypityn, czyli rodzaju przeciwciał surowicy krwi

powodujących wytrącanie się (tzw. precypitację) z roztworu

rozpuszczalnego antygenu, w tym przypadku są nim termofilne

promieniowce. Na podstawie badańimmunofluorescencyjnych

wycinków płuc stwierdza się obecność precypityn w przegrodach

międzypęcherzykowych i w ścianie oskrzeli. Choroba ta najczęściej

występuje u mężczyzn w wieku 40-50 lat. U osób z ostrą postacią

choroby okresem, w którym odnotowuje się szczyt zachorowań to

koniec lata i zimy, czyli najbardziej intensywne okresy pracy

w rolnictwie. Diagnozę schorzenia często utrudniają podobne objawy

[email protected], Zakład Genoterapii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja

Kopernika Collegium Medicum im. Ludwika Rydgiera w Bydgoszczy [email protected], Zakład Genoterapii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja

Kopernika Collegium Medicum im. Ludwika Rydgiera w Bydgoszczy [email protected]


132

jak w przypadku innych chorób układu oddechowego: astmy,

przewlekłej obturacyjnej choroby płuc [5, 19];

płuco hodowców ptaków – w przypadku tej choroby jednym z anty-

genów jest mucyna, wydzielana do przewodu pokarmowego zwierząt

i wydalana z odchodami. Schorzenie dotyka najczęściej hodowców

gołębi, kur, kaczek, papug, gęsi oraz ptaków dzikich. Istotnym

czynnikiem rozwoju choroby jest bezpośredni kontakt z ptactwem.

Badacze stwierdzili, iż progresja choroby jest skorelowana ze

stężeniem przeciwciał IgG1 oraz IgG3, a jak wiadomo IgG to klasa

immunoglobulin o istotnym znaczeniu w walce z patogenami

wnikającymi do organizmu. Ich stężenie w surowicy jest największe

w porównaniu z przeciwciałami innych klas [6, 7, 20];

choroba hodowców grzybów – reakcję alergiczną mogą wywoływać

tak jak w przypadku płuca farmera promieniowce termofilne.

Wysoka temperatura i wilgotność to warunki, w jakich hoduje się

grzyby, a to sprzyja rozwojowi promieniowców. Pyły unoszące się

przy uprawie wywołują u osób wrażliwych reakcję alergiczną

prowadzącą do rozwinięcia stanu chorobowego;

płuco robotników produkujących środki piorące – przyczyną scho-

rzenia jest reakcja alergiczna, jaką wywołują antygeny laseczki

siennej (Bacillus subtilis). Mimo doniesień naukowych wskazu-

jących na związek między bakterią, a występowaniem choroby nie

udało się wyizolować swoistych przeciwciał;

izocyjanianowe HP – przyczyną schorzenia jest reakcja na pełno-

wartościowy antygen powstały z połączenia izocyjanianu (haptenu)

i białek wydzieliny dróg oddechowych [2, 6].

Według najnowszych danych można wyróżnić około 200 antygenów

powodujących HP. W tabeli zestawiono najczęstsze antygeny i odpo-

wiadające im typy alergicznego zapalenia pęcherzyków płucnych [9].

Alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych – immunopatogeneza i leczenie

133

Tabela 1. Czynniki wywołujące AZPP [9]

Antygen Źródło Choroba

Micropolysporafaeni

Systemy nawilżające

powietrze,

klimatyzatory

Płuco nawilżaczowe

Izocyjaniany, cynk Farby, plastik Płuco pracowników

przemysłu chemicznego

Pyrethrum Pestycydy

AZPP wywołane

środkami

owadobójczymi

Białko sierści zwierząt

futerkowych Futra Płuco kuśnierzy

Białka surowicy, skóry,

sierści, odchodów

zwierząt laboratoryjnych

Zwierzęta laboratoryjne Płuco pracowników

laboratoriów

Białka surowicy, piór,

odchodów ptaków

Surowica, pióra,

odchody gołębi, papug,

kaczek, indyków

Płuco hodowcy ptaków

Mycobacteriumspecies

Płyny stosowane do

chłodzenia metalu

w przemyśle

metalowym

Płuco pracowników

przemysłu

metalowego

Mycobacteriumavium Woda w basenach,

jaccuzi, itp. hot tub lung

Penicillium sp. Sery Płuco serowarów

Trichosporoncutaneus Środowisko domowe

Japońskie letnie

zapalenie pęcherzyków

płucnych

Promieniowce

termofilne,

Saccharopolyspora

Spleśniałe siano Płuco farmera

Źródło: [9]

Podział AZPP na postać ostrą, podostrą i przewlekłą, poddaje się

dyskusji dlatego obecnie przyjmuje się wyróżnienie typów:

ostry postępujący – charakterystyczne są objawy wymagające

hospita-lizacji, które występują niedługo po ekspozycji na antygen

(2-9 godzin);

ostry przerywany – objawy pojawiają się po ekspozycji, ale nie są

tak nasilone jak w postaci ostrej postępującej, pomiędzy epizodami

wyniki badań chorego są w normie i nie pojawiają się objawy;

subkliniczny – charakteryzuje się obecnością przeciwciał skiero-

wanych przeciw antygenom, nie występują objawy, natomiast przy


134

ciągłej ekspozycji na czynnik uczulający może dojść do rozwoju

postaci przewlekłej;

przewlekły postępujący – może przebiegać z początku w utajeniu,

lub rozwija się z nawracających ostrych epizodów, charakterystyczna

jest zwiększająca się duszność wysiłkowa, kaszel, co może

doprowadzić do włóknienia płuc [18].

Częstość zachorowań w Polsce na alergiczne zapalenie pęcherzyków

płucnych wynosi 10/100 tys. i jest trzecią pod tym względem chorobą

śródmiąższową w Polsce [8].

2. Immunopatogeneza

Przyczyną alergicznego zapalenia pęcherzyków płucnych jest powtarzająca

się ekspozycja na daną cząstkę immunologiczną, która wywołuje reakcję

alergiczną. Istotnym jest fakt, że cząstki te mają wielkość poniżej 5 µm

przedostają się do dolnych dróg oddechowych, a konkretnie wnikają do

pęcherzyków płucnych i organizm nie jest w stanie ich usunąć. Czy rozwinie

się dalej choroba decydują o tym czynniki takie, jak: predyspozycja osobnicza,

odpowiednie stężenie alergenów czy też współistnienie kofaktorów, którymi

mogą być infekcje grzybicze, wirusowe. W HP mamy do czynienia z typem III

i IV reakcji immunologicznej. Typ III wiąże się z produkcją przeciwciał klasy

IgG oraz IgM. Precypityny (przeciwciała) tworzą z antygenami, które

przedostały się z pęcherzyków płucnych do krwi kompleksy immunologiczne

[10]. Ich obecność nie została potwierdzona wynikami badań, biopsja płuc

wykazuje tylko nacieki granulocytów i limfocytów [11]. Powstałe kompleksy

immunologiczne uruchamiają układ dopełniacza. Ten natomiast stymuluje

aktywację makrofagów (komórek żernych), stanowiących znaczący element

w obronie organizmu. Makrofagi zaczynają wydzielać szereg chemokin

i cytokin: interleukinę 8 (IL-8),czynnik martwicy guza α (TNF-α) oraz

interleukinę 6 (IL-6),makrofagowe białko hamujące (MIP-1). Ich zadaniem

jest wzmaganie procesu zapalnego, a dodatkowo powodują napływ

makrofagów i neutrofili do śródmiąższu. Makrofagi wydzielają też

w większych ilościach czynnik tworzenia kolonii granulocytów i makrofagów

(GM-CSF) oraz lizozym, kolagenzę, elastazę i rodniki tlenowe odpowiedzialne

za uszkodzenia pęcherzyków płucnych. Jest to pierwszy etap odpowiedzi na

antygen [12]. Jednak ważniejszą rolę w immunopatogenezie alergicznego

zapalenia pęcherzyków płucnych odgrywa reakcja typu późnego (typ IV),

w której zaangażowane są limfocyty T. Liczba aktywnych limfocytów wzrasta

i może osiągnąć nawet do 70% ogólnej liczby komórek odzyskanych z płynu

z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego. W dużym stopniu wzrasta poziom

limfocytów CD8+ (cytotoksycznych), a w mniejszym CD4+ (pomoc-

niczych). W proces tworzenia ziarniniaków szczególnie zaangażowane są


135

limfocyty CD4+, inaczej Th. Jedna subpopulacja tych limfocytów- Th1

uwalnia interferon γ (INFγ) i IL-2, a druga Th2- szereg interleukin : 4, 5, 10

[2]. Postuluje się, że przewaga limfocytów CD8+ jest związana z aktywną

fazą choroby, natomiast przewaga komórek CD4+ świadczy o postępu-

jącym procesie włóknienia [12]. Niezwykle ważnym elementem pato-

genezy jest podłoże genetyczne stanu zapalnego. Mianowicie badacze

sugerują, iż geny kodujące układ zgodności tkankowej o zwiększonej

częstości występowania alleli HLA – DQB1 oraz HLA – DR B1 koreluje

z przebiegiem reakcji zapalnej u chorych hodowców gołębi [11]. Na uwagę

zasługuje również interleukina 10, której niedobór powoduje, że aktywność

komórek Th1 nie jest hamowana, czego konsekwencją jest ciągle

wzrastające lub utrzymujące się na wysokim poziomie stężenie interferonu

γ. W konsekwencji prowadzi to do rozwoju zapalnej reakcji ziarninia-

kowej [2]. Wysoki odsetek limfocytów jest związany nie tylko z nad-

miernym ich napływem do pęcherzyków płucnych, ale także z zaburzonym

procesem zaprogramowanej śmierci komórki, czyli apoptozy [13]. To

zjawisko ma miejsce nie tylko w AZPP, ale jest istotnym elementem

patogenezy innych chorób śródmiąższowych, takich jak sarkoidoza,

samoistne włóknienie płuc, czy nieswoiste śródmiąższowe zapalenie płuc.

Na uwagę zasługują także komórki NK– natural killers, bowiem w ostrym

przebiegu AZPP komórki NK występują w zwiększonych ilościach

w stosunku do liczby u osób zdrowych [2].

Interesującym wydaje się fakt, że osoby palące mniej są narażone na

rozwój AZPP, być może dlatego, że cechują się niższym stężeniem

przeciwciał klasy IgG, które są skierowane przeciw antygenom. Naukowcy

tłumaczą to występowaniem w dymie tytoniowym substancji mających

supresyjny wpływ na odpowiedź immunologiczną prowadzącą do

wytwarzania interleukiny 1 i TNFα i rozwoju stanu zapalnego [2].

3. Metody badań i wykrywania

Alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych diagnozuje się na podstawie

badania radiologicznego klatki piersiowej, badania czynnościowego,

laboratoryjnego, płukania oskrzelowo-pęcherzykowego oraz badania histo-

logicznego. W niniejszej pracy uwaga zostanie skupiona na metodach dających

informację o obrazie immunologicznym. W celu prawidłowego rozpoznania

choroby w pierwszej kolejności zbierany jest wyczerpujący wywiad. Ważną

informacją wymagającą uwzględnienia jest fakt czy pacjent ma kontakt

z cząstkami pochodzenia organicznego o rozmiarach pozwalających

przemieszczenie do dolnych dróg oddechowych [2]. Badanie radiologiczne klatki piersiowej jest zazwyczaj pierwszym

krokiem w ocenie pacjenta z podejrzeniem AZPP. Podobnie jak w innych chorobach śródmiąższowych ukazuje niespecyficzne wyniki, szczególnie


136

w typie ostrym i podostrym [21]. Z uwagi jednak na niedoskonałość podziału na postać ostrą, podostrą i przewlekłą Ismail proponuje podział na cztery typy. W postaci podostrej w środkowych i dolnych obszarach płuc obserwuje się zacienienia guzkowe słabo odgraniczone, a w postaci przewlekłej ogniska zagęszczeń miąższowych mają charakter nieregularny, płuca mają zmniejszoną objętość. Znacznie istotniejszą rolę w diagnozo-waniu zmian w płucach ma tomografia komputerowa klatki piersiowej (HRCT). Metoda ta jest znacznie bardziej czuła niż RTG. Dzięki tej metodzie diagnostycznej można wykryć zmiany odpowiadające poszcze-gólnym obrazom histopatologicznym [9].

Badania laboratoryjnego nie wykonuje się rutynowo z powodu zbyt małej ilości danych, które pozwalałyby na rozpoznanie AZPP. Jeśli już jest przeprowadzane to analizie poddawana jest krew, w której po wywołaniu alergenem odpowiedzi można zaobserwować nowo wykształcone granulocyty obojętnochłonne, a także zjawisko eozynofilii. Mogą również wystąpić zwiększone stężenia lizozymu i enzymu przekształcającego angiotensynę (ACE). Enzym ten jest odpowiedzialny za konwersję angiotensyny I do angiotensyny II, która wykazuje właściwości powodujące kurczenie naczyń krwionośnych. Spośród chorych istnieje grupa, u której we krwi można wykryć przeciwciała skierowane przeciw antygenom wywołującym AZPP [9,17].Zaobserwować można podwyższone stężenia immunoglobulin IgM i IgG, czasem także obecność białka C-reaktywnego, czynnika reuma-toidalnego (RF) [15]. Jednak nie upoważnia to do rozpoznania choroby [4,9,18]. Bardziej pomocnym, ale niewyrokującym okazuje się być płukanie oskrzelowo pęcherzykowe (bronchoalveolarlavage, BAL), dzięki któremu można uzyskać obraz różnych populacji komórkowych. Kilka godzin od pobrania materiału BAL po ekspozycji na alergen zwiększa się ilość populacji granulocytów obojętnochłonnych, potem ten poziom się obniża. Jednak w ciągu następnych godzin wzrasta frakcja limfocytów i utrzymuje się nawet kilka lat przy braku ponownego kontaktu z alergenem. W większości badań obserwowana jest limfocytoza na poziomie powyżej 50% ogólnej liczby komórek w płynie z BAL. W populacji limfocytów przeważają Tc, czyli limfocyty cytotoksyczne CD8+ (stosunek limfocytów CD4/CD8 w większości przypadków wynosi poniżej 1) [2]. Można również w niektórych przypadkach dostrzec zwiększony odsetek komórek plazmatycznych, tucznych i eozynofilii [4]. Badanie histologiczne dostarcza nam więcej informacji. W fazie ostrej alergicznego zapalenia pęcherzyków płucnych, już w niewielkim czasie po ekspozycji na alergen stwierdza się obecność nacieków neutrofilów i eozynofilóww oskrzelikach, pęcherzykach płucnych i wokół naczyń krwionośnych. W miarę upływu czasu uwidaczniają się nie tylko nacieki zapalne, ale formują się też ziarniniaki. Jeśli ekspozycja na alergen nie jest kontynuowana ziarniniaki mogą ulec wchłonieniu, ale naciek z komórek zapalnych pozostaje [4].


137

4. Leczenie

Do działań profilaktycznych przede wszystkim zalicza się unikanie

ekspozycji na alergeny wywołujące chorobę poprzez zmianę środowiska.

Jeśli nie jest to możliwe, to w miarę możliwości wymagane jest stosowanie

masek ochronnych, filtrów, odzieży ochronnej, czy też opracowanie

technologii mających na celu zapobieganie wilgoceniu siana i rozwojowi

grzybów [9]. Z reguły przy ostrym przebiegu HP to wystarczy by objawy

choroby uległy cofnięciu. W celu przyspieszenia reemisji choroby stosuje

się leczenie glikokortykosteroidami (GCS) w dawce 0,5 mg//kg m.c. do

czasu ustąpienia objawów spowodowanych ekspozycją na antygen.

A następnie w okresie około 6 tygodni odstawia się leki.Kortykoterapia

może być wskazana w przypadku pacjentów z typem podostrym

postępującym i przewlekłym jednak nie wydaje się by miała wpływ na

długotrwały wynik [21]. Aby zapobiec dalszemu włóknieniu stosuje się

próby leczenia skojarzonego- GCS z lekami immunosupresyjnymi, np.

zazatiopryną wykazującą działanie cytotoksyczne [4, 16]. W jednym

z badań przeprowadzonych na myszach naukowcy próbowali zneutra-

lizować interleukinę (IL-17), która jak wiadomo, wzmaga proces zapalny,

stosując poliklonalne przeciwciała skierowane przeciw IL-17. Dzięki

zmniejszeniu aktywności tej cytokiny HP miało łagodniejszy przebieg.

Dane te podkreślają istotną rolę IL-17 w czasie progresji choroby.

Potrzebne są jednak dalsze badania [14].

5. Podsumowanie

Alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych jest chorobą spowodowaną

przez reakcję immunologiczną na antygeny środowiskowe, którymi mogą

być, np. pyły, zanieczyszczenia środowiska, grzyby, bakterie. Ze względu

na rodzaj antygenu wyróżniamy wiele odmian tej choroby. Objawami

charakterystycznymi są m.in. duszność, kaszel, gorączka. Patogeneza

choroby wiąże się z III i IV typem reakcji immunologicznej, w których

istotną rolę odgrywają przeciwciała klasy IgG i IgM. Przeciwciała tworzą

z antygenem kompleksy immunologiczne, które uruchamiają kaskadę

zdarzeń prowadzącą do rozwinięcia stanu zapalnego, a następnie procesu

włóknienia. Jednoznaczna przyczyna, dlaczego alergeny będące w środo-

wisku wzmagają odpowiedź immunologiczną nie jest znana. AZPP

diagnozuje się na podstawie badania radiologicznego, tomografii

komputerowej klatki piersiowej, adodatkowych cennych informacji

dostarcza badanie histopatologiczne i BAL. Charakterystyczna jest limfo-

cytoza na poziomie powyżej 50% ogólnej liczby komórek odzyskanych

z BAL. W populacji limfocytów przeważa frakcja tych o charakterze

cytotoksycznym. Brak obecnie standardu w postępowaniu leczniczym


138

AZPP. Stosuje się terapię glikokortykosteroidami, lecz u niektórych osób

schorzenie przechodzi w fazę przewlekłą z włóknieniem, w którym

leczenie jest często nieskutecznei zmniejszenie objawów klinicznych

jest krótkotrwałe. Podejmowane są próby leczeniaskojarzonego – GCS

z lekami immunosupresyjnymi, np. z azatiopryną. Przy tak wąskim

zakresie stosowanych terapii wydaje się być koniecznym poznawanie

i rozważanie zagadnień związanych z mechanizmami immunologicznymi

i podłożem genetycznym choroby w celu opracowania lepszych metod

leczenia skierowanych na przeciwdziałanie przyczynom, a nie tylko

niwelowaniu objawów.

Literatura

1. Bourke S. J., Dalphin J. C., Boyd G., Hypersensitivity pneumonitis: current

concepts, European Respiratory Journal, 18, (2001), s. 81-92

2. Wiatr E., Rowińska-Zakrzewska E., Pirożyński M., Choroby śródmiąższowe

płuc, α-medicapress, (2012), s. 124-133

3. Selman M., Hypersensitivity pneumonitis, Interstitial lung diseases, (2003),

s. 452-484

4. Diego C. P., Cullinan P., Extrinsic allergic alveolitis. European Respiratory

Monograph, 46 (2009), s. 112-125

5. Monakare S., Haahtela T., Farmer‘s lung – a 5 yr. follow-up of eighty-six

patients, Clinical & Experimental Allergy,17 (1987), s. 143-51

6. Gołąb J., Jakóbisiak M., Lasek W.,Stokłosa T., Imunnologia, Wydawnictwo

Naukowe PWN, (2013), s. 129-137

7. Rose C., Lara A., Hypersensitivity pneumonitis, Murray&Nadel’s Textbook

of Respiratory Medicine, (2010), s. 1587-1601

8. Rowińska-Zakrzewska E., Bestry I., Alergiczne zapalenie pęcherzyków

płucnych, Choroby Wewnętrzne, (2005), s. 580-583.

9. Lewandowska K., Alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych, Postępy Nauk

Medycznych, 4 (2011), s. 274-285

10. Woda B. A., Hypersensitivity pneumonitis an immunopathology review,

Archives of Pathology & Laboratory Medicine, 132 (2008), s. 204-205

11. Mcsharry C., Anderson K., Bourke S. J., Boyd G., Takes your breath away

– the immunology of allergic alveolitis,Clinical & Experimental Immunology,

128 (2002), s. 3-9

12. Lacasse Y., Assayag E., Cormier Y., Myths and controversies in

hypersensitivity pneumonitis, Seminars in Respiratory and Critical Care

Medicine, 29 (2008), s. 631-642

13. Girard M., Lacasse Y., Cormier Y., Hypersensitivity pneumonitis, Allergy,

64(2009), s. 322-334

14. Amrita D. J., Daniel J. F., Sameer R. O., Glenda T., Kevin R. F., Fernando J.

M., Cory M. H.,: Interleukin-17–mediated Immunopathogenesis in

Experimental Hypersensitivity Pneumonitis, American Journal Of Respiratory

And Critical Care Medicine, 179 (2009) s. 705-716


139

15. Selman M., Mejia M., Pardo A., Hypersensitivity pneumonitis, Intersitial

pulmonary and bronchiolar disorders, (2008), s. 267-288

16. Navarro C., Meja M., Gaxiola M., Mendoza F., Carrillo G., Selman M.,

Hypersensitivity pneumonitis, Treatments in Respiratory Medicine, 5 (2006),

s. 167-179

17. Richerson H. B., Bernstein I. L., Fink J. N. et al., Guidlines for the clinical

evaluation of hypersensitivity pneumonitis: report of the Subcomittee on

Hypersensitivity Pneumonitis, The Journal Of Allergy And Clinical

Immunology, 84 (1989), s. 839-844

18. Ismail T., Mcsharry C., Boyd G., Extrinsic allergic alveolitis, Respirology,

11 (2006),s. 262-268

19. Kirkhorn S. R., Garry V. F., Agricultural Lung Diseases, Environmental

Health Perspectives, 108 (2000), s. 705-712

20. Hanak V., Golbin J. M., Ryu J. H., Causes and presenting features in 85

consecutive patients with hypersensitivity pneumonitis, Mayo Clinic

proceedings, 82 (2007), s. 812-816

21. Spagnolo P., Rossi G., Cavazza A., Bonifazi M., Paladini I., Bonella F.,

Sverzellati N., Costabel U., Hypersensitivity Pneumonitis: A Comprehensive

Review, J Investig Allergol Clin Immunol., 25(4), 2015, s. 237-250

Alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych- immunopatogeneza

i leczenie

Alergiczne zapalenie pęcherzyków płucnych (HP) to choroba ziarniniakowa miąższu płuc

i oskrzelików, której przyczyną jest reakcja alergiczna na ciągłe lub powtarzane narażenie na

antygeny środowiskowe, którymi mogą być pyły przemysłu rolniczego i spożywczego, białka

bakterii, roślin i zwierząt, grzyby lub też cząstki nieorganiczne, takie jak izocyjaniany. Objawami

towarzyszącymi chorobie są: gorączka, kaszel, duszność, ból głowy, narastająca duszność

wysiłkowa. Wyróżniamy wiele odmian tej choroby, m.in. płuco farmera, płuco kuśnierzy, czy

płuco hodowców ptaków.Proces zapalny zaczyna się od odpowiedzi układu immunologicznego

w postaci reakcji nadwrażliwości typu III (kompleksy immunologiczne), a następnie (z punktu

widzenia całej patogenezy) ważniejszego etapu, czyli reakcji typu IV (reakcja komórkowa typu

późnego). Jeśli proces ten nie zostanie zahamowany z czasem postępuje włóknienie. Przy

stawianiu diagnozy bierze się pod uwagę wynik badania histologicznego, radiologicznego klatki

piersiowej, badania czynnościowego, laboratoryjnego, płukania oskrzelowo-pęcherzykowego.

Podwyższone stężenie przeciwciał klasy IgG i IgM, limfocytoza z przeważającą ilością

limfocytów cytotoksycznych to charakterystyczne cechy AZPP. Obserwuje się też obecność

ziarniniaków oraz cechy zapalenia oskrzelików i śródmiąższowego włóknienia. W płynie

z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego przeważają limfocyty, które mogą stanowić nawet około

70% składu komórkowego płynu. Najskuteczniejszym działaniem jakie można podjąć by

zapobiegać rozwojowi choroby to zaprzestanie ekspozycji na antygen powodujący reakcję

alergiczną. W ciężkich i przewlekłych przypadkach stosuje się terapię kortykosteroidową,

leczenie skojarzone- GCS z lekami immunosupresyjnymi. Naukowcy próbują opracowywać

coraz to nowe metody leczenia, czego przykładem są badania nad interleukiną 17.


140

Hypersensitivity pneumonitis- immunopathogenesis and treatment

Hypersensitivity pneumonitis (HP) is an inflammatory disease of the lung parenchyma and

bronchioles, caused by continuous, repeated exposure to environmental antigens, such asdusts

ofagricultural industry and nutritional industry, bacterial proteins, plants and animals, fungi or

inorganic particles, such as isocyanates. The symptoms associated with the disease include fever,

cough, shortness of breath, headache, progressive dyspnoea.There are several variations of this

disease, including farmer's lung, furriers’ lung, or bird breeders’ lung. Theinflammatory process

begins with the type IIIimmune response (creation of immune complexes), and subsequently by

the type IV reaction (delayed cell response), which is more important step from the point of view

of the whole pathogenesis. If this process is not stopped, in time the fibrosis will progress. The

diagnosis takes into account the results of histologic examination, chest X-ray, functional testing,

laboratory testing, bronchoalveolar lavage, but the most important is HRCT of lung.

Characteristics of HP are: increased concentration of IgG and IgM, lymphocytosis with prevalent

amount of cytotoxic lymphocytes. The presence of granulomas and features of bronchiolitis and

interstitial fibrosis is also observed. In bronchoalveolar lavage fluid prevalent lymphocytes are

observed, they may constitute up about 70% of the cellular composition of this fluid.The most

effective action that patients can uptake to prevent development of the disease is eradicate

exposure to the antigen, which cause an allergic reaction. In severe or chronic cases corticosteroid

therapy, or combinated therapy with GCS andimmunosuppressants is necessary. Scientists are

trying to develop new, more effective methods of treatment, for example by studying role of

interleukin 17 in inflammation processes.

141

Adrian Dubicki1

Metody leczenia deformacji czaszki u dzieci.

Rodzaje kasków korekcyjnych

oraz metody ich wykonywania

1. Wstęp

Przed wiekami odmienność w budowie ciała, a szczególnie w kształcie

głowy, była wyznacznikiem statusu społecznego, cechą rozpoznawczą danej

kultury lub talizmanem. Z tego powodu czaszka była często poddawana

celowym deformacjom. Większość współczesnego społeczeństwa unika

takiego wyróżniania się i dąży do idealnego wyglądu. Dlatego gdy dojdzie do

zniekształcenia czaszki u dziecka, rodzice ze względów zdrowotnych, jak

i estetycznych coraz częściej decydują się na leczenie.

Połączenie wiedzy medycznej z techniczną pozwala na szybkie i dokładne

postawienie diagnozy oraz rozpoczęcie leczenia prowadzącego do

przywrócenia prawidłowego kształtu czaszki dziecka. Czas w przypadku tego

schorzenia ma zasadniczy wpływ. Zbyt późne stwierdzenie deformacji może

ograniczyć możliwość wykorzystania nieinwazyjnych, nieoperacyjnych metod

korekcji, a nawet doprowadzić do uszkodzeń neurologicznych wywołanych

zwiększonym ciśnieniem śródczaszkowym.

Współczesna medycyna wypracowała metody korekcji deformacji – od

inwazyjnych operacji chirurgicznych do nieinwazyjnych ortez, zwanych

kaskami korekcyjnymi, które szczegółowo opisano w niniejszej pracy. Wzrost

zainteresowania leczeniem schorzeń czaszki stanowi inspirację do tworzenia

nowych metod terapii.

2. Cel pracy

Zamysłem niniejszej pracy jest usystematyzowanie wiedzy z zakresu

metod leczenia deformacji czaszki u dzieci. W pracy szczególną uwagę

poświęcono kaskom korekcyjnym, które stają się coraz częściej stosowaną

metodą leczenia deformacji ułożeniowych czaszki.

[email protected], Katedra Inżynierii Materiałowej i Biomedycznej, Wydział

Mechaniczny, Politechnika Białostocka, www.pb.edu.pl

Adrian Dubicki

142

3. Rodzaje deformacji

Powstanie deformacji związane jest z zaburzeniami wzrostu płaskich kości

czaszki. Rozwijające się mózgowie powoduje wzrost ciśnienia

śródczaszkowego co sprawia, że łączące poszczególne kości czaszki szwy

ulegają rozciągnięciu. Gdy możliwość swobodnego wzrostu kości we

wszystkich kierunkach jest zaburzona, dochodzi do powstania deformacji [1].

Gdy przyczyną deformacji jest przedwczesne zamknięcie czy zrośnięcie się

pojedynczego lub kilku szwów czaszkowych, mamy do czynienia

z kraniosynostozą. Takie schorzenie występuje u jednego na 2500 żywo

urodzonych dzieci. W zależności od tego który szew uległ przedwczesnemu

zrośnięciu, głowa przybiera konkretny kształt. Nazwy rodzajów

kraniosynostoz tworzone są na podstawie wyglądu czaszki. Możemy więc

wyróżnić łódkogłowie, krótkogłowie, trójkątnogłowie i skośnogłowie.

Leczenie tego rodzaju deformacji wymaga najczęściej interwencji

chirurgicznej [2].

Przyczyną deformacji może być również długotrwały zewnętrzny ucisk na

daną okolicę czaszki. Ciągle rosnące, miękkie kości ulegają zniekształceniu,

gdyż uniemożliwiony jest rozwój mózgowia w danym, uciskanym kierunku.

Tutaj wyróżniamy deformacje ułożeniowe takie jak łódkogłowie, krótkogłowie

oraz skośnogłowie. W większości wypadków nie zagrażają one powikłaniom

neurologicznym ani rozwojowym u dziecka. Wiążą się głównie z aspektem

estetycznym [1, 3].

4. Metody leczenia

Leczenie deformacji czaszki w każdym przypadku wymaga

indywidualnego podejścia. Pierwszym i niezbędnym krokiem jest dokładna

diagnoza wskazująca przyczynę powstania deformacji oraz jej zaawansowanie.

Pozwala ona obrać odpowiednią ścieżkę leczenia lub jego zaniechanie.

Podstawową metodą w przypadku stwierdzenia kraniosynostoz jest zabieg

chirurgiczny. Głównym jego celem jest rozcięcie skostniałych szwów.

Tradycyjne operacje wiążą się z dużym ryzykiem i obecnie stosowane są

w ciężkich przypadkach kraniosynostozy. Gdy zrośnięciu uległ pojedynczy

szew, możliwe jest wykonanie zabiegu przy użyciu endoskopu. Głównym

celem jest zmniejszenie ciśnienia śródczaszkowego oraz dodatkowo poprawa

estetyki kształtu głowy [4, 5].

Gdy przyczyna deformacji nie wynika z synostozy szwów ważny jest

poziom zaawansowania deformacji. Gdy zniekształcenie jest lekkie, lekarze

zalecają metodę odpowiedniego pozycjonowania dziecka. Pomaga ona

w korekcji małych deformacji, ale jej skuteczność objawia się głównie wtedy

gdy stosowana jest do zapobiegania powstaniu zniekształceń głowy.

W bardziej zaawansowanych przypadkach stosuje się zaopatrzenie orto-


Rodzaje kasków korekcyjnych oraz metody ich wykonywania

143

pedyczne. Specjalnie dopasowane kaski lub opaski pomagają w korygo-

waniu kształtu głowy nawet już u raczkujących czy zaczynających chodzić

dzieci. Wywoływane przez nie naciski w miejscach zniekształcenia

uniemożliwiają dalsze ich postępowanie i stopniową poprawę geometrii

czaszki [6].

Wzrost liczby przypadków takich deformacji powoduje powstawanie

coraz to nowych metod leczenia. Stosowane są specjalne poduszki

odpowiednio układające głowę dziecka. Jedną z metod jest też powstała

w USA chiropraktyka. Nie zdobyła ona jednak uznania wśród lekarzy.

Nową, będącą w fazie testów klinicznych terapią jest leczenie farma-

kologiczne. Gdy istnieje ryzyko genetycznych kraniosynostoz, to (aby im

zapobiec) ciężarnej kobiecie podawany jest lek. Hamuje on aktywność

zaangażowanego w rozwój zrostów szwów enzymu ERK, który regulo-

wany jest przez zmutowane geny FGF. Przed takim leczeniem należy

jednak wykonać szereg skomplikowanych badań genetycznych aby

sprawdzić mutacje tych genów. Niestety takie leczenie jest zapobiegawcze

i musi rozpocząć się jeszcze w życiu płodowym [7].

4.1. Zabiegi chirurgiczne

Interwencja chirurgiczna najczęściej stosowana jest w przypadku

deformacji wywołanej kraniosynostozą. W zależności od ilości zrośniętych

szwów, zabieg może być wykonany inwazyjnie lub mało inwazyjnie przy

użyciu endoskopu. Głównym celem tego zabiegu jest zmniejszenie

ciśnienia wewnątrzczaszkowego oraz poprawa efektu estetycznego. Zabiegi

powinny być wykonywane jak najwcześniej, najlepiej do ukończenia 1

roku życia. Kości dziecka są wtedy miękkie i nie doprowadza się do

powikłań neurologicznych. Ich późniejsze przeprowadzenie prawdo-

podobnie uniemożliwia zastosowanie endoskopu [8].

4.1.1. Operacje klasyczne

Kiedyś podstawowym (dziś stosowanym tylko w skomplikowanych

przypadkach deformacji czaszki) rodzajem zabiegu była operacja

klasyczna. Polega ona na wycięciu kostnych pasków wraz ze zrośniętymi

szwami i dopasowaniu sąsiadujących kości w czaszce. Jest zabiegiem

poważnym, wiążącym się z dużym ryzykiem poprzez podanie znieczulenia

oraz dużą utratę krwi. Pomimo tego częstotliwość komplikacji utrzymuje

się na poziomie ok. 2%, co czyni ten rodzaj leczenia bezpiecznym. Ma to

związek ze stosowaniem coraz to nowocześniejszych technik wspoma-

gających planowanie operacji [9, 10].

Często stosowana jest przez chirurgów metoda „π”. Polega ona na

rozcięciu zrośniętego, poprzecznego szwu oraz przecięciu kości po obu

Adrian Dubicki

144

stronach podłużnego szwu (rys. 1). Rozcięcia czaszki kształtem przypo-

minają gracką literę π, która stała się nazwą tej metody. Powstały jej liczne

modyfikacje, zależne od rodzaju deformacji [10].

Rysunek 1. Model głowy z łódkogłowiem przed zabiegiem (po lewej) i po wykonaniu nacięć π [10]

Inną metodą w bardziej zaawansowanych przypadkach jest podzielenie

czaszki półksiężycowatymi nacięciami na segmenty. Są one odpowiednio

docinane, dopasowywane i (jeżeli zachodzi taka potrzeba) zamieniane

między sobą (rys. 2), tak aby uzyskać jak najlepszy efekt zabiegu [10].

Rysunek 2. Schemat korekcji metodą całkowitej rekonstrukcji – segmentacja łódkogłowia [10]



145

W przypadku zrostu większości szwów czaszka może zostać ponacinana

aby umożliwić jej rozrost (rys. 3). W tym przypadku coraz częściej

używane jest oprogramowanie komputerowe pomagające uzyskać modele

bryłowe i numeryczne umożliwiające przeprowadzenie analiz i otrzymanie

wizualizacji efektów leczenia [9].

Rysunek 3. Nacięcia czaszki podczas klasycznej operacji [9]

Po takich zabiegach często w celu ochrony czaszki stosuje się specjalne

kaski. Zostały one opisane w rozdziale 4.2.1.

4.1.2. Zabiegi endoskopowe

Przeprowadzenie zabiegu przy użyciu endoskopu najczęściej stosowane

jest u dzieci do 6 miesiąca życia, u których występują izolowane

kraniosynostozy (skostnienia jednego szwu). Wprowadzany podskórnie

endoskop z odpowiednią końcówką rozcina skostniałe szwy umożliwiając

normalny wzrost czaszki. Po ich rozcięciu (w zależności od przypadku),

kości mogą zostać od siebie oddalone za pomocą specjalnych płytek (rys.

4A). Po takim zabiegu zaleca się stosowanie specjalnych kasków

modelujących czaszkę, aby podczas wzrostu przybrała ona prawidłową

geometrię [11].

Adrian Dubicki

146

Rysunek 4. Zabiegi endoskopowe: A – metoda rozcięcia szwów, B – metoda nacięcia czaszki

[11]

Inną techniką stosowaną przy operacjach endoskopowych jest nacięcie

czaszki w takich miejscach, aby podczas wzrostu kości czaszki naturalnie

przybierały odpowiedni kształt (rys. 4B). W tym przypadku wzrost czaszki

odbywa się podobnie jak u zdrowego dziecka i nie jest potrzebne

stosowanie ortez modelujących [11].

Zabieg endoskopowy jest bardziej korzystny od klasycznej operacji. Jest

to zabieg mało inwazyjny, dzięki czemu zmniejsza się ryzyko powikłań.

Poprzez zmniejszenie miejsca cięcia poprawia się również efekt

kosmetyczny. Dodatkowo jego wykonanie jest możliwe w pierwszych

miesiącach życia, dzięki czemu unika się zwiększenia ciśnienia

śródczaszkowego i powikłań neurologicznych oraz uzyskuje lepszą

korekcję czaszki [8].

Rysunek 5. Zabieg usunięcia synostozy szwów przy użyciu endoskopu [12]

Współcześnie operacje przy użyciu endoskopu cieszą się coraz większą

popularnością, co skutkuje szybkim rozwojem tej techniki, zarówno

poprzez nowe pola wykorzystania w leczeniu, jak i w coraz nowo-

cześniejszych modelach endoskopów pojawiających się na rynku.



147

4.2. Aparaty stosowane w leczeniu

Zabiegi operacyjne nie są jedyną metodą korekcji deformacji. Coraz

większą popularnością zarówno wśród pacjentów, jak i lekarzy cieszą się

różnego rodzaju aparaty m.in. ortezy czy wyciągi kostne. Są one mało lub

nieinwazyjne, a tym samym bezpieczniejsze od operacji, które stosowane

są tylko w bardzo zaawansowanych przypadkach, głównie przy kranio-

synostozach.

W niektórych przypadkach, po operacji rozcięcia szwów czy też

modelowania kości czaszki, aby zabezpieczyć głowę i zachować

odpowiednie efekty operacji lub wymodelować odpowiedni kształt czaszki

stosuje się specjalne kaski ochronno-modelujące [5].

Innym rodzajem aparatów są kaski korekcyjne. Stosowane głównie przy

deformacjach ułożeniowych, pozwalają na bezpieczną korekcję powstałych

zniekształceń i uzyskanie odpowiedniej geometrii główki dziecka. Ważne

jest odpowiednio szybkie zastosowanie tej terapii, aby odbyła się ona

w trakcie okresu wzmożonego rozwoju mózgowia [3, 13].

W przypadku leczenia twarzoczaszki stosowane są głównie wyciągi

twarzowo-czaszkowe. Ich zastosowanie poprzedzone jest rozcięciem kości

w miejscach które mają być wydłużone, co pobudza je do zrostu. Następnie

w obu częściach rozciętej kości umieszczane są specjalne płytki połączone

cylindrem dystrakcyjnym. Poprzez powolne zwiększanie odległości (o ok.

1 mm dziennie) za pomocą cylindra, rozciągnięciu ulega pierwotna

kostnina powstająca w miejscu przecięcia oraz okoliczne tkanki – nerwy,

naczynia krwionośne, skóra i mięśnie. Proces ten nosi nazwę osteogenezy

dystrakcyjnej. Metoda ta umożliwia dosyć szybkie oraz zgodne z zamie-

rzeniem wydłużenie kości [14].

4.2.1. Kaski ochronno-modelujące [5, 15]

Po operacyjnym leczeniu deformacji czaszki, rozcięciu lub wycięciu

szwów często niezbędne jest zastosowanie kasków. Jak sama nazwa

wskazuje pełnią one rolę ochronną oraz modelują odpowiedni kształt

czaszki.

Kask ochronno-modelujący jest elementem leczenia kraniosynostoz za

pomocą zabiegu operacyjnego. Po jego wykonaniu lekarz może zlecić

zamówienie uniwersalnego lub przygotowanie indywidualnie dopaso-

wanego kasku. Wybór zależy głównie od rodzaju zabiegu chirurgicznego,

jego efektów oraz stopnia deformacji. Jeśli podczas operacji dokonano

wycięcia kliku szwów i rekonstrukcji czaszki, zalecane jest zazwyczaj

wykonanie indywidualnie dopasowanego kasku, ponieważ musi być on

używany przez dziecko nawet przez 12 miesięcy. W przypadku rozcięcia

pojedynczego szwu, dokonywanego głównie podczas zabiegu przy użyciu

Adrian Dubicki

148

endoskopu, ingerencja w kości czaszki nie jest zbyt wielka, więc może być

zastosowany kask uniwersalny. Posiada on specjalne peloty które

umieszcza się w odpowiednich, wskazanych przez lekarza miejscach tak

aby dopasować kask do głowy dziecka i aby spełniał on swoje funkcje.

Rysunek 6. Uniwersalny kask ochronno-modelujący z pelotami używany również do ochrony

głowy przy atakach epilepsji [16]

Zaopatrzenie dziecka w taki kask możliwe jest po 7-14 dniach od

operacji. Wówczas zmniejszeniu ulegają obrzęki pooperacyjne i możliwe

staje się odpowiednie dopasowanie uniwersalnego kasku lub określenie

wymiarów potrzebnych do wykonania indywidualnie dopasowanego.

Kaski wykonywane są zazwyczaj z termoplastycznych materiałów

– polipropylenu lub poliwęglanu, w uniwersalnych rozmiarach lub na

podstawie pobranych miar od konkretnego pacjenta. Mogą być one

przezroczyste lub specjalnie zabarwiane i z nadrukami aby uatrakcyjnić ich

stosowanie z myślą o dzieciach.

Budowa kasków jest różna i zależy zarówno od zapotrzebowania

pacjenta, jak i od firmy go wykonującej. Najczęściej spotykane są kaski

jednolite, składające się z jednej, ciągłej warstwy materiału, z otworami

wentylacyjnymi oraz czasami z nacięciem umożliwiającym nakładanie

kasku (rys. 6). Gdy kask posiada rozcięcie, niezbędne jest dodanie

elementu łączącego obie krawędzie, którym najczęściej jest rzep. Niekiedy

takie kaski posiadają dodatkowo materiałowy pasek na podbródek

pomagający utrzymać się ortezie w odpowiednim położeniu. Innym

rodzajem jest kask składający się z dwóch części materiału (rys. 7). Jedna

część nakładana jest na głowę dziecka (najczęściej na jej tylną

powierzchnię), a druga na przeciwną stronę, dodatkowo zachodząc

wypustkami na pierwszą. Taki typ kasku również wyposażany jest w rzep



149

utrzymujący go w odpowiednim miejscu. Jego zakładanie jest jednak

łatwiejsze niż kasku z rozcięciem.

Rysunek 7. Kask ochronno-modelujący wykonany dla konkretnego pacjenta [5]

Noszenie takiego kasku wiąże się z utrudnieniem wymiany ciepła głowy

z otoczeniem i ze wzrostem temperatury. W tym celu kaski mają specjalne

otwory wentylacyjne, umieszczane w miejscach, w których nie występuje

zbyt duży kontakt z powierzchnią głowy. W przypadku dosyć luźnych

kasków uniwersalnych takie rozwiązanie jest wystarczające, lecz przy

dopasowanych kaskach należy obserwować dziecko czy nie występują

u niego objawy przegrzania.

4.2.2. Kaski korekcyjne

Coraz większą popularnością w leczeniu ułożeniowej deformacji

czaszki, cieszy się terapia kaskami korekcyjnymi. Chociaż powstała

w drugiej połowie XX wieku, dopiero obecnie zyskuje coraz większe grono

zwolenników zarówno wśród lekarzy, jak i pacjentów. Prawdopodobnie

jest to związane z satysfakcjonującymi wynikami w leczeniu dzieci

uzyskanymi w czasie akcji przeciwko SIDS oraz z obecnym dążeniem

ludzi do idealnego wyglądu [17, 18].

Terapia kaskiem korekcyjnym wykorzystuje naturalny wzrost głowy

dziecka. Wewnętrzna powierzchnia kasku jest odpowiednio konstruowana

na podstawie kształtu głowy, dlatego muszą one być wykonywane

indywidualnie. Głównym celem kasku jest zablokowanie możliwości

Adrian Dubicki

150

wzrostu czaszki w miejscach prawidłowo rozwiniętych. W tych miejscach

orteza styka się z powierzchnią głowy uniemożliwiając ich dalszy wzrost

i pogłębianie się deformacji. Przeciwnie dzieje się w miejscach gdzie

występuje zniekształcenie. Są one celowo odbarczone poprzez pozos-

tawienie wolnej przestrzeni, dzięki czemu umożliwiony jest dalszy wzrost

czaszki w tych rejonach i zmniejszanie się spłaszczenia [17, 19].

Ze względu na wykorzystanie w tej metodzie wzrostu czaszki,

niemożliwe jest korzystanie z niej gdy takowego wzrostu nie ma. Z tego

powodu terapia kaskowa ma ograniczenia związane z wiekiem dziecka.

Wzrost czaszki jest dość intensywny do ukończenia 1 roku życia. Jest to

najbardziej odpowiedni czas na rozpoczęcie i ukończenie terapii. Jej rozpo-

częcie zalecane jest po wyczerpaniu innych metod np. pozycjonowania czy

metod fizjoterapeutycznych, przeważnie już po ukończeniu 4-5 miesiąca

życia. Im wcześniej rozpocznie się korekcja czaszki tym szybszy będzie

w jej trakcie wzrost, a więc i krócej potrwa leczenie [17, 19]. Szacunkowy

czas terapii przedstawiony został w tabeli poniżej.

Tabela 1. Szacunkowy czas trwania terapii w zależności od wieku jej rozpoczęcia [17]

Wiek dziecka gdy rozpoczęto terapię Długość leczenia

3-5 miesięcy 2-4 miesięcy



10 miesięcy 6-9 miesięcy

Im później rozpoczyna się terapię tym dłużej trwa leczenie. Późne

rozpoczęcie leczenia może powodować również nieuzyskanie pełnej

korekcji. Za ostateczny czas kiedy terapia może się rozpocząć uważa się

1,5 roku życia. Po tym czasie efekty leczenia są mało zauważalne,

a leczenie trwa bardzo długo [18].

Przeciwskazaniem do zastosowania terapii kaskowej może być

kraniosynostoza. Z tego powodu na pierwszej wizycie dziecko powinno

być poddane dokładnej diagnozie z określeniem przyczyny powstania

deformacji. Również wodogłowie czy nieprawidłowości w rozwoju mózgu

i wzrost ciśnienia śródczaszkowego uniemożliwiają wdrożenie terapii

kaskowej. Dzieci powyżej 18 roku życia również nie powinny być

poddawane leczeniu tą metodą. Ma to związek z jej małą skutecznością,

gdyż w tym wieku głowa nie rośnie już wystarczająco szybko oraz często

do tego czasu zrośnięciu ulegają już szwy czaszkowe [20].



151

Na początku terapii, w jej pierwszych dniach należy zwracać szczególną

uwagę na podrażnienia skóry oraz w szczególnych przypadkach na

przegrzanie. Co 4 godziny należy zdejmować kask i sprawdzać czy na

skórze nie występują otarcia i zaczerwienienia. Gdy takie wystąpią, należy

odczekać 30 minut i jeżeli po tym czasie nie ustąpią oznacza to

konieczność wykonania poprawek kasku. W takiej sytuacji należy

skontaktować się z lekarzem prowadzącym lub protetykiem w celu

naniesienia korekty. Jeżeli podrażnienia nie będą występować przez kolejne

trzy dni, kontrole należy przeprowadzać co 12 godzin. Nie zwalnia to

jednak z wizyt kontrolnych, które w zależności od wieku dziecka,

zaawansowania terapii oraz deformacji powinny odbywać się co 2 do 6

tygodni [20].

W trakcie terapii ważne jest utrzymanie odpowiedniej czystości kasku.

Dziecko powinno w nim spędzać 23 godziny na dobę, więc czyszczenie

takiego kasku najlepiej wykonywać w trakcie kąpieli dziecka. Najlepszym

sposobem jest przetarcie wnętrza kasku alkoholem lub jakimś preparatem

antybakteryjnym po czym przemycie go wodą [20].

Prawidłowo prowadzone leczenie deformacji za pomocą kasków nie

powoduje poważnych komplikacji. Głównym problemem jest utrzymanie

kasku w czystości oraz związane z tym występowanie podrażnień

skórnych. Z powodu bezpośredniego stykania się skóry z wyściółką kasku

może powstać kontaktowe zapalenie skóry. Zbyt wysoka temperatura może

wywołać przegrzanie, a dodatkowo występujący pot – wysypkę cieplną czy

potówki. Nieprawidłowe dopasowanie kasku może skutkować powstaniem

otarć lub skaleczeń. Należy w takiej sytuacji skontaktować się z lekarzem

prowadzącym w celu dokonania poprawek. Nieprawidłowo wykonany kask

może powodować nadmierne ciśnienie śródczaszkowe i wywołane nim

powikłania neurologiczne lub pogorszenie geometrii głowy. Takie sytuacje

zdarzają się jednak bardzo rzadko. Aby uniknąć takich problemów

zaopatrzenia się w kask należy dokonywać w renomowanych placówkach

z dużym doświadczeniem [20].

5. Rodzaje kasków korekcyjnych

Wszystkie kaski działają na tej samej zasadzie – ograniczania wzrostu

w prawidłowo ukształtowanych miejscach przy równoczesnym umoż-

liwieniu go w miejscach zdeformowanych. Mimo to istnieją różne wersje

kasków w zależności od firmy je produkującej oraz od rodzaju deformacji.

Najczęściej spotyka się kaski w całości pokrywające powierzchnię głowy

oraz takie z wycięciem na jej górnej powierzchni.

Adrian Dubicki

152

Rysunek 8. Dziecko podczas przymiarki kasku z wyciętą górną częścią [17]

Kaski z wyciętą górną powierzchnią (rys. 8), którą nie poddaje się

korekcji są również często nazywane opaskami korekcyjnymi. Głównym

producentem na terenie Europy jest Cranioform. Obejmują one tylko

miejsce wymagające korekcji. Takie rozwiązanie jest korzystne ze względu

na zmniejszenie ilości potrzebnego materiału, a więc i zmniejszenie ciężaru

kasku oraz kosztów jego wykonania. Inną ważną korzyścią jest zwiększenie

powierzchni niezaburzonej wymiany ciepła z otoczeniem. W przypadku

takiego kasku często nie stosuje się dodatkowych otworów wentyla-

cyjnych. Opaski przeważnie posiadają wycięcia na małżowiny uszne, przez

co nie utrudniają komunikacji z dzieckiem i nie powodują niepotrzebnych

ucisków [17].

Pierwszą firmą, która na terytorium Polski wprowadziła terapię

kaskową było V!GO. Oferuje ona typowe kaski, które w przeciwieństwie

do wcześniej omawianych opasek nie posiadają wycięcia na górnej

powierzchni (rys. 9). Niewprowadzenie takiego rozwiązania tłumaczone

jest ryzykiem wzrostu czaszki w kierunku wycięcia i przybraniem przez nią

stożkowego kształtu. Wymusza to zastosowanie licznych otworów, aby

umożliwić wymianę ciepła. Dodatkowo kask nie posiada wycięć przy

uszach aby ułatwić utrzymanie się go w prawidłowym położeniu. Firma

wprowadziła możliwość wyboru tekstury, aby urozmaicić wygląd kasku

i zachęcić dziecko do korzystania z niego [19].



153

Rysunek 9. Kask korekcyjny obejmujący całą powierzchnię głowy [19]

Niektóre zakłady produkcyjne oferują kaski wykonane z przezro-

czystych tworzyw. Jedną z nich jest firma KidCap działająca w USA. Ich

zaletą jest możliwość ciągłej obserwacji skóry dziecka i reagowanie

w przypadku powstania uczulenia, wysypki czy otarć (rys. 10). Kask ten

w przeciwieństwie do poprzednio przedstawionych nie posiada na całej

swej powierzchni wyściółki. Jest ona umieszczona tylko przy łącznikach.

Styka się on bezpośrednio swą formującą częścią z głową dziecka.

Dodatkowo wyposażony jest w polimerowe łączniki, które reagują

(rozciągając się) na zmiany kształtu głowy[18].

Rysunek 10. Przezroczyste kaski umożliwiające obserwację skóry głowy [18]

Adrian Dubicki

154

5.1. Budowa oraz materiały używane do produkcji kasków

Budowa kasków jest z reguły podobna. Zewnętrzna, twarda część

wykonana jest z tworzywa sztucznego. Do najczęściej używanych należy

poliwęglan (PC), polipropylen (PP), kopolimer estrowy (PETG) oraz

rzadziej z polietylen, głównie ten o wysokiej gęstości (PE-HD). Ta warstwa

materiału ma za zadanie powstrzymanie dalszego wzrostu czaszki

w wybranych rejonach. Z tego powodu materiał powinien mieć wysoką

sztywność i być odporny na odkształcenia. Dodatkowo, głównie w przy-

padku bezpośredniego kontaktu ze skórą, powinien być zgodny biolo-

gicznie i nie powodować reakcji alergicznych (hipoalergiczny). Ważna jest

również odporność na działanie czynników mechanicznych, termicznych

oraz na wilgotność. Dodatkowo tworzywo powinno w łatwy sposób

odbierać ciepło i wymieniać je z otoczeniem [17, 18, 19].

Wewnętrzna warstwa wykonywana jest najczęściej ze spienionego

kopolimeru etylu i octanu winylu (EVA), spienionego polietylenu (PE)

oraz firmowego tworzywa Aliplast. Wyściółka kasku nie powinna chłonąć

wilgoci – potu, co mogło by powodować rozwój bakterii oraz powstanie

nieprzyjemnego zapachu. Dodatkowo musi być dosyć twarda, nie powinna

zbytnio odkształcać się pod wpływem ścisku, co mogłoby pogarszać

wyniki leczenia. Podobnie jak w przypadku zewnętrznej części, wyściółka

powinna umożliwiać wymianę ciepła. Ważna jest również jej biozgodność

oraz hipoalergiczność. Wewnętrzna część kasku składa się przede

wszystkim z kilku warstw materiału. Umożliwia to odpowiednie

dopasowanie kasku i doszlifowanie w trakcie leczenia wynikające ze

zmieniającego się kształtu głowy oraz jej wzrostu. Ponadto, materiał

wyściółki służy do amortyzacji [17, 18, 19].

Większość kasków posiada rozcięcia umożliwiające nakładanie go na

głowę. Po nałożeniu takiego kasku konieczne jest unieruchomienie takiego

przecięcia, aby unieruchomić kask na właściwym miejscu. Do tego celu

stosowane są najczęściej rzepy. Umożliwiają one każdorazowe dopaso-

wanie kasku do kształtu i rozmiaru głowy. Ważna jest również (w pewnym

stopniu) podatność tego połączenia, w przypadku gdyby głowa została za

mocno ściśnięta [17, 18, 19].

Większość kasków (prócz wcześniej wspomnianych opasek korek-

cyjnych) posiada dodatkowe otwory. Służą one do polepszenia wentylacji,

wymiany ciepła oraz odprowadzenia wilgoci. Jest to bardzo ważne w celu

uniknięcia przegrzania głowy czy powstania podrażnień i uczuleń skórnych

[18, 19].



155

5.2. Wykonywanie kasków

Proces wykonania kasków nie różni się zbytnio od standardowego

postępowania w przypadku tworzenia lejów protezowych czy ortez.

Pierwszym etapem jest konsultacja z lekarzem, który zdiagnozuje pacjenta

określając przyczyny powstania deformacji, jej zaawansowanie oraz podejmie

decyzję o leczeniu i jego przebiegu. Kolejnym krokiem jest wykonanie modelu

głowy dziecka, który posłuży do dalszego wykonania kasku. W tym przypadku

istnieją dwie metody. Pierwsza bazuje na wykonaniu negatywu i pozytywu

przy użyciu masy gipsowej. Druga wykorzystuje nowe technologie, które

umożliwiają digitalizację powierzchni głowy, obróbkę obrazu i tworzenie jej

modelu za pomocą oprogramowania komputerowego [17, 21]. Obie ścieżki

produkcji przedstawiono w poniższej tabeli.

Tabela 2. Porównanie metod (etapów) produkcji kasków korekcyjnych [17, 21]

Metoda tradycyjna Nr.

etapu Metoda cyfrowa

Nałożenie folii ochronnej na

powierzchnię głowy 1

Nałożenie na powierzchnię

głowy trykotu umożliwiającego

poprawienie dokładności

otrzymanych zdjęć 3D

Nałożenie uprzednio

namoczonych opasek gipsowych

na głowę; oczekiwanie na

utwardzenie gipsu

2

Wykonanie zdjęć 3D i wczytanie

ich do oprogramowania

komputerowego

Rozcięcie negatywu gipsowego

i zdjęcie z głowy pacjenta 3

Opracowanie wirtualnego

modelu głowy dziecka

o prawidłowej geometrii,

dodanie naddatków

Przygotowanie negatywu:

połączenie rozcięcia, pokrycie

wewnętrznej części negatywu

warstwą umożliwiającą

późniejsze oddzielenie negatywu

i pozytywu

4

Wykonanie modelu głowy

dziecka przy użyciu frezarki

sterowanej numerycznie

Przygotowanie masy gipsowej

i zalanie nią negatywu,

umocowanie metalowego pręta

5 Przygotowanie i rozgrzanie

materiału termoplastycznego

Rozcięcie negatywu, wyjęcie

pozytywu 6

Formowanie kasku na podstawie

pozytywu przy użyciu pompy

próżniowej

Adrian Dubicki

156

Dodanie naddatków,

ukształtowanie powierzchni

pozytywu, która posłuży do

wykonania kasku

(należy pamiętać o naddatku na

całej powierzchni na wyściółkę

kasku)

7 Usunięcie nadmiaru materiału

i pozytywu z wnętrza kasku

Przygotowanie i rozgrzanie

materiału termoplastycznego 8 Dodanie wyściółki

Formowanie kasku na podstawie

pozytywu przy użyciu pompy

próżniowej

9 Obróbka wykańczająca, dodanie

klamer, rzepów

Usunięcie nadmiaru materiału

i pozytywu z wnętrza kasku 10

Dodanie wyściółki 11

Obróbka wykańczająca, dodanie

klamer, rzepów 12

Metody z wykorzystaniem masy gipsowej coraz częściej wypierane są

przez o wiele szybsze, bardziej ekonomiczne i czystsze metody komputerowe.

Największą ich zaletą jest szybkość zarówno przy pomiarach, jak i wykonaniu

pozytywu. Zrobienie zdjęć może trwać nawet tylko ok. 1,5 ms, co jest bardzo

korzystne mając na względzie żwawość dzieci. Pozwala to również na

skrócenie czasu wizyty, a często również i strachu dziecka [17, 18, 21].

Rysunek 11. Tworzenie negatywu za pomocą opasek gipsowych [22]



157

W obu metodach wykorzystywane są materiały termoplastyczne.

Zrezygnowano w nich z użycia laminatów. Prawdopodobnie ma to związek

z dużą ilością laminatu jaka potrzebna by była do wytworzenia takiego kasku,

trudnością w jego równomiernym rozprowadzeniu, więc i w zachowaniu

równomiernej siły nacisku na czaszkę. Kask wykonany z żywic musiałby

utwardzać się przez kilka godzin, podczas których wydzielane by było ciepło.

Rysunek 12. Komputerowy model głowy dziecka [17]

Po uformowaniu tworzywa termoplastycznego według pozytywu

dokonuje się jego obróbki. Usuwane są niepotrzebne fragmenty tworzywa,

wykonywane nacięcia umożliwiające nakładanie ortezy, nadawany jest

odpowiedni kształt krawędziom oraz ma miejsce ich zaokrąglanie. W

większości przypadków dodaje się wyściółkę. Ważnym elementem jest

również wykonanie otworów wentylacyjnych w odpowiednich miejscach

oraz klamr i rzepów mocujących [17, 21, 22].

Rysunek 13. Pozytyw gipsowy wykonany przy pomocy frezarki CNC [17]

Adrian Dubicki

158

Taki kask trafia do pacjenta w celu przymiarki oraz ewentualnych

poprawek. W pierwszych dniach korzystania z terapii kaskowej należy

zwracać uwagę na ewentualne podrażnienia skórne czy otarcia. Każdy taki

przypadek sugeruje nieodpowiednie dopasowanie kasku i konieczność

doszlifowania wyściółki [20].

6. Podsumowanie

Rozwój i udoskonalanie metod korekcji czaszki napędzane są coraz

większą dbałością o zdrowie i wygląd. Są one również możliwe dzięki

wykorzystaniu przez medycynę rozwijającej się techniki. Połączenie

wiedzy medycznej z techniczną skutkuje uzyskaniem zadowalających

efektów leczenia, przy jednoczesnym zapewnieniu jak największego

komfortu oraz bezpieczeństwa w trakcie terapii.

Indywidualne podejście do pacjenta umożliwia wdrożenie skutecznej

i bezpiecznej terapii. Przyczynia się do tego rozwój diagnostyki

i wykorzystanie metod komputerowych.

Od przyczyny powstania deformacji oraz jej stopnia zależy wybór

odpowiedniej terapii. Wśród zabiegów operacyjnych, popularne staje się

wykorzystanie endoskopii. Deformacje niezaawansowane coraz częściej

korygowane są indywidualnie wykonanymi kaskami. Metody pomiarów

oraz produkcji takich ortez są stale rozwijane.

Rozwój techniki i medycyny będzie skutkował powstaniem coraz

nowszych metod korekcji oraz rozwojem już istniejących.

Literatura

1. Bochenek A., Reicher M., Anatomia człowieka. Tom I, Warszawa:

Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 2009, s. 298-436

2. Aleck K., Craniosynostosis Syndromes in the Genomic Era. Phoenix: XI

Seminars in Pediatric Neurology, Elsevier, 2004, strony 256-26

3. Biggs W. S., Diagnosis and management of positional head deformity,

Michigan: American Family Physician, 2003, zeszyt 67, strony:1953-1956

4. Laskowska-Ziętek A., Misiuk-Hojło M., Przedwczesne zarośnięcie szwów

czaszkowych – aspekty okulisty-czne i stomatologiczne, Wrocław: Dental and

Medical Problems, 2007, zeszyt 44, strony 242-246, ISSN 1644-387X

5. Kaufman A. B., Muszynski C. A., Matthews A., Etter N., The Circle of

Sagittal Synostosis Surgery, Milwaukee: Elsevier, XI Seminars in Pediatric

Neurology, 2004, strony 243-248

6. Halberg A., Graham J. M., Gomez M., Earl D. L., Management of

Deformational Plagiocephaly: Repositioning Versus Orthotic Theraphy, Los

Angeles: Elsevier, The Journal of Pediatrics, 2005, strony 258-262

7. Jak zapobiegać i leczyć przedwczesny zrost kości czaszki [online], PAP – Nauka

w Polsce, www.naukawpolsce.pap.pl/ aktualnosci/ news, 65110, jak-zapobiegac-

i-leczyc-przedwczesny-zrost-kosci-czaszki.html [dostęp: 24 XII 2013 r.]



159

8. Larysz D., Przedwczesne zarośnięcie szwów czaszkowych – kraniosynostoza

[online],http://www.nzozkangur.pl/artykuly,przedwczesne_zarosniecie_szwow_

czaszkowych_kraniosynostoza.html [dostęp: 24 XII 2013 r.]

9. Gzik M., Tejszerska D., Wolański W., Gzik-Zroska B., Komputerowe

wspomaganie planowania zabiegu korekcji trigonocefalii u dzieci, Gliwice:

Modelowanie Inżynierskie, 2009, zeszyt 38, strony 51-56, ISSN 1896-771X

10. Wolański W., Larysz D., Gzik M., Kawlewska E., Komputerowe metody

wspomagania leczenia kraniosynostozy, Gliwice: Modelowanie Inżynierskie,

2011, zeszyt 41, strony 437-444, ISSN 1896-771X

11. Wolański W., Larysz D., Gzik M., Inżynierskie wspomaganie endoskopowych

zabiegów neurochirurgicznych, Gliwice: Modelowanie Inżynierskie, 2011,

zeszyt 41, strony 429-436, ISSN 1896-771X

12. Medim – Instrumenty mistrzów, Nowość w ofercie Karl Storz [online],

http://www.medim.pl/aktualnosci. php?nID=109 [dostęp 26 XII 2013r.]

13. Co to jest "plagiocefalia ułożeniowa"(positional plagiocephaly)? [online] , http://www. mamopedia.pl/10-11-mies/zdrowie/plagiocefalia-ulozeniowa

[dostęp: 15 XII 2013r.]

14. Kulewicz M., Osteogeneza dystrakcyjna w chirurgii ortognatycznej,

Warszawa: Fundacja Multis Multum, 2001, Acta Clinica, Tom 1, Numer 3,

strony 117-128

15. Murad G. J. A., Clayman M., Seagle M. B., White S., Perkins L. A., Pincus D.

W.: Endoscopic-assisted repair of craniosynostosi, Gainesville: Neurosurgical

Focus, 2005, Tom 19, strony 1-10

16. Danmar Clear Helmet[online], http://www.adaptivespecialties.com/danmar-clear-

helmet.aspx [dostęp 26 XII 2013 r.]

17. Cranioform babies head correction [online], Cranioform Group,

http://www.cranioform.de/pl.html [dostęp: 26 XII 2013 r.]

18. KidCap. Innovative design, complete car, optimal results [online].:

http://www.helmettherapy.com/ [dostęp: 26 XII 2013 r.]

19. Kaski korekcyjne [online], V!GO-Ortho Polska.: http://www.vigo-

ortho.pl/kaski_korekcyjne,9.html [dostęp: 26 XII 2013 r.]

20. Cranial molding helmet information and wearing instructions [online], Orthotic

Solutions, http://www.orthoticsolutions.com/cranial.html [dostęp: 26 XII 2013 r.]

21. Jak robi się protezy [online], http://www.amputacja.pl/index.php [dostęp:

30 XII 2013 r.]

22. Cranial Molding Helmets [online], Atlantic Prosthetics & Orthotics,

http://www.unchospitalpando.com /Site/Cranial_Molding_Helmets.html

[dostęp: 30 XII 2013r.]

Adrian Dubicki

160

Metody leczenia deformacji czaszki u dzieci. Rodzaje kasków

korekcyjnych oraz metody ich wykonywania

Deformacje czaszki u dzieci są coraz częściej dostrzeganym i leczonym schorzeniem. W zależ-

ności od przyczyn powstania zniekształcenia należy wprowadzić odpowiednie postępowanie

korygujące.

Współczesna medycyna coraz chętniej korzysta z nowinek technologicznych, wykorzystując

postępy w leczeniu deformacji. Przypadki deformacji wywołanych kraniosynostozą, coraz

częściej korygowane są przy wykorzystaniu endoskopów, wypierając tradycyjne zabiegi chirur-

giczne. Opracowana została również nieinwazyjna metoda leczenia deformacji ułożeniowych

– kaskami korekcyjnymi. Do niedawna korekcja tego rodzaju deformacji była lekceważona.

Obecnie rozwijane są metody pomiarów, metody oceny poziomu deformacji oraz sposobu

produkcji kasków korekcyjnych.

Treatment methods of the skull malformations in children. The types

of corrective helmets and methods of their execution

The skull malformations in children are being increasingly recognized and treated diseases.

Depending on the causes of malformation, appropriate corrective procedure must be introduced.

Contemporary medicine is increasingly willing to use the technological innovations, using the

advances in the treatment of malformations. Cases of malformations triggered by

craniosynostosis, are more and more frequently corrected using endoscopes displacing traditional

surgery. Non-invasive method for the treatment of positional malformations has also been

developed – with corrective helmets. Until recently, correction of this type of malformation was

neglected. Currently, measurement methods, methods to assess the level of malformation and

helmets production are being developed.

161

Adrian Dubicki1, Żaneta Anna Mierzejewska

2

Ocena deformacji

i metody pomiaru czaszki u dzieci

1. Wstęp

Oznaką zdrowia człowieka, zarówno fizycznego jak i psychicznego jest

jego wygląd zewnętrzny. Jest on również ważnym elementem postrzegania

go w społeczeństwie przez innych ludzi. W szczególności ważny jest

wygląd głowy, głównie ze względu na jej pierwszoplanową rolę

w komunikacji werbalnej i niewerbalnej.

Pojawienie się wszelkich nieprawidłowości w kształcie czaszki może

świadczyć o wadach genetycznych, nieprawidłowym rozwoju kości

czaszki, lub niewłaściwej pielęgnacji. W każdym z tych przypadków ważna

jest dokładna diagnostyka i poznanie przyczyny ich powstawania.

Współczesna technika pozwala na coraz szybsze i dokładniejsze

rozpoznanie problemu oraz opracowanie postępowania naprawczego.

2. Cel pracy

Zamysłem tej pracy jest usystematyzowanie wiedzy w zakresie

najczęściej występujących deformacji czaszki, z przypisaniem ich do

przyczyn powstania. Niniejsze opracowanie ukazuje również obecnie

stosowane w takich przypadkach metody diagnostyczne oraz sposób oceny

stopnia zniekształceń.

3. Rodzaje deformacji czaszki oraz przyczyny ich powstawania

Płaskie kości czaszki rosną w trzech kierunkach. Grubościowy wzrost

przebiega od ich wewnętrznej strony, a przyrost na długość i szerokość

rozpoczyna się przy ograniczonych elastycznymi szwami brzegach kości.

Rozwijające się mózgowie, poprzez wywoływane ciśnienie śródczaszkowe,

powoduje rozciąganie się szwów determinując wzrost kości czaszki.

Jakiekolwiek zaburzenia związane ze szwami, objawiające się najczęściej

w ich za wczesnym kostnieniu, powoduje niesymetryczny, nierównomierny

rozrost kości czaszki w jednym kierunku i powstanie deformacji [1]. [email protected], Katedra Inżynierii Materiałowej i Biomedycznej, Wydział

Mechaniczny, Politechnika Białostocka, www.pb.edu.pl [email protected], Katedra Inżynierii Materiałowej i Biomedycznej,

Wydział Mechaniczny, Politechnika Białostocka, www.pb.edu.pl


162

Takie ograniczenie możliwości wzrostu może być spowodowane

również częstym i długotrwałym uciskiem na daną okolicę czaszki.

Wówczas prócz uniemożliwienia rozrostu może dojść do zniekształcenia

miękkich kości. Powstanie takich deformacji może wiązać się również

z krzywicą i wywołanym utrzymującym się zmiękczeniem kośćca czaszki [1].

3.1. Kraniosynostoza

Kraniosynostoza jest wadą wrodzoną polegającą na przedwczesnym

zamknięciu, zrośnięciu się szwu lub szwów czaszkowych, prowadzących

do zmian w kształcie głowy – powstaniu deformacji. Do zrośnięcia szwów

może dojść nie tylko po narodzinach, ale nawet już w życiu płodowym [2,

3]. Kraniosynostoza jest dość częstym przypadkiem. Występuje u jednego

na 2500 żywo urodzonych dzieci [2]. Zarówno pod względem etiol-

ogicznym jak i morfologicznym każdy przypadek kraniosynostozy jest

różny. Z tego powodu każda deformacja wymaga dokładnych badań

klinicznych [2]. W przypadku podejrzenia zrośnięcia szwów, czego oznaką

jest nienaturalny kształt głowy, konieczne jest wykonanie zdjęcia RTG lub

bardziej zaawansowanych badań takich jak tomografia komputerowa, która

jest niezbędna przy dalszym leczeniu schorzenia. Każde dziecko

z podejrzeniem kraniosynostozy powinno być skonsultowane przez

neurochirurga dziecięcego, a w szczególności te ze znacznymi defor-

macjami w prawidłowej geometrii czaszki [4].

Ocena deformacji i metody pomiaru czaszki u dzieci

163

Rysunek 1. Rodzaje kraniosynostoz [2]

Wygląd głowy przy kraniosynostozie zależny jest od tego, który szew

czaszkowy uległ przedwczesnemu zrośnięciu. Brak możliwości symetrycz-

nego wzrostu kości w kierunku wzdłużnym i poprzecznym oraz postę-

pujący wzrost mózgu powoduje niegeometryczny rozwój czaszki i powstanie

deformacji, które poprzez charakterystyczny wygląd pozwalają określić

skostniały szew. Wyróżniane są cztery zasadnicze rodzaje kraniosynostoz:

łódkogłowie (scaphocephaly);

krótkogłowie (brachycephaly);

trójkątnogłowie (trigonocephaly);

skośnogłowie (plagiocephaly).

W przypadku skośnogłowia wyróżnia się dodatkowo odmianę przednią

lub tylną, w zależności od tego, czy zrośnięciu uległ odpowiednio szew

wieńcowy czy węgłowy [4].

Na rysunku 1 zaprezentowane zostały szkice głównych rodzajów

kraniosynostoz wraz z umiejscowieniem skostniałych w danych przy-

padkach szwów.

Kraniosynostoza wymaga leczenia nie tylko z powodu wyglądu,

estetyki ale również powikłań neurologicznych związanych ze wzrostem

ciśnienia śródczaszkowego takich jak spadek przepływu krwi przez mózg,


164

prowadzące do niedotlenienia i w konsekwencji zaburzeń słuchu, wzroku

i upośledzenia umysłowego [2, 3].

3.1.1. Łódkogłowie (scaphocephaly)

Przyczyną łódkogłowia jest kościozrost, znajdującego się pomiędzy

kośćmi ciemieniowymi szwu strzałkowego. Biegnie on od przodu ku

tyłowi głowy, na środku górnej części czaszki. Brak możliwości wzrostu

w tym szwie powoduje zablokowanie rozwoju szerokościowego czaszki

(rys. 2a). Staje się ona nadmiernie długa w stosunku do małej szerokości.

Dodatkowo czoło jest uwypuklone ku przodowi, a potylica ku tyłowi

podkreślając jeszcze bardziej łódkowaty wygląd czaszki [1, 5]. Łódko-

głowie jest najczęściej występującą spośród wszystkich kraniosynostoz.

Diagnozuje się ją w 50% wszystkich przypadków deformacji [6].

3.1.2. Krótkogłowie (brachycephaly)

Przedwczesny zrost szwu wieńcowego, łączącego kości ciemieniowe

z czołową, powoduje powstanie deformacji zwanej krótkogłowiem.

Mózgowie ma ograniczoną przestrzeń i nie może rozwijać się w kierunku

długościowym – przednim i tylnym (rys. 2b). Rekompensowane jest to

wzrostem szerokościowym, w kierunku boków czaszki. Głowa staje się

przez to nienaturalnie szeroka, a często również i wysoka. Te schorzenie

występuje często jako dodatkowy objaw przy zespołach wad genetycznych

[1, 6]. Krótkogłowie jest drugą po łódkogłowiu, najczęściej występującą

formą kraniosynostozy. Szacuje się, że występuje w 22% wszystkich

przypadków [2].


165

Rysunek 2. Rozrost mózgowia a) przy łódkogłowiu, b) przy krótkogłowiu [6]

3.1.3. Trójkątnogłowie (trigonocephaly)

Trójkątnogłowie wiąże się z kościozrostem szwu czołowego, biegnącego

od czubka głowy, przez środek czoła w kierunku nosa. Normalnie szew ten

powinien zamknąć się do 2 roku życia. Jego przedwczesne zrośnięcie, często

już przed porodem powoduje nacisk mózgowia na czoło, które przybiera

klinowaty kształt [1, 5].

a) b)


166

Rysunek 3. Kształt czaszki przy trójkątnogłowiu [6]

Szew wieńcowy wyczuwalny, a czasami i widoczny jest w postaci

krawędzi kości. Gdy dojdzie do przedwczesnego zamknięcia, poprzez

działające ciśnienie śródczaszkowe, na powierzchni zewnętrznej szwu

powstaje grzbiet [6]. Prócz klinowatego zniekształcenia kości czołowej,

przy trójkątnogłowiu można zaobserwować dystopię oczodołów. Wada ta

stanowi od 5 do 10% przypadków kraniosynostoz [7].

3.1.4. Skośnogłowie (plagiocephaly)

Skośnogłowie może powstać przez przedwczesny zrost szwów, ale

i również przez wrodzoną asymetrię półkul mózgowych [1]. W zależności

od tego, czy skostnieniu uległ szew wieńcowy czy węgłowy rozróżnia się

odpowiednio skośnogłowie przednie lub tylne (rys. 4) [4].


167

Rysunek 4. Rozrost mózgowia przy skośnogłowiu przednim (a) oraz tylnym (b) [6]

Przednie skośnogłowie charakteryzuje się wzrostem czaszki po

przeciwnej stronie od zrośniętego szwu wieńcowego. Wzrost ten obejmuje

zarówno górną część czaszki jaki i jej podstawę. Powoduje to deformację

czoła, twarzy, uszu oraz nosa. Ucho po stronie zrośniętego szwu jest lekko

wysunięte do przodu. Czoło po przeciwnej od szwu stronie ulega

zniekształceniu, poprzez charakterystyczne wysunięcie kości czołowej ku

przodowi [2].

Skośnogłowie tylne wygląda podobnie jak przednie. Po przeciwnej

stronie od zrośniętego szwu węgłowego, wybrzuszeniu ulega kość czołowa

oraz część tylna czaszki. Ucho po stronie skostniałego szwu pozostaje

w prawidłowym położeniu lub jest lekko cofnięte. Schorzeniu towarzyszy

zniekształcenie twarzy, oczodołów. Zniekształceniu ulega również

podstawa czaszki przez co przybiera ona pochylony kształt [2].

Spośród wszystkich kraniosynostoz, skośnogłowie występuje naj-

rzadziej. Diagnozuje się je u ok. 2-4% dzieci z kraniosynostozą [2].

3.2. Deformacje ułożeniowe

Przyczyną deformacji nie zawsze jest zrost szwów czaszkowych. Może

do nich dochodzić również z powodu długotrwałego zewnętrznego ucisku

na daną okolicę czaszki. Miękkie kości ulegają wtedy zniekształceniu,

a uniemożliwiony w tym kierunku rozwój mózgowia skutkuje powstaniem

deformacji [1]. Takie zniekształcenia czaszki, którego przyczyną nie jest

kościozrost szwów, nazywane są deformacjami ułożeniowymi.

Radykalny wzrost liczby przypadków nastąpił między 1992, a 1999

rokiem. Spowodowane to było przez akcję Amerykańskiej Akademii

a) b)


168

Pediatrycznej (AAP) nazwanej „Back to Sleep‖. Kampania ta miała na celu

zachęcenie rodziców do układania dzieci na plecach, aby zapobiec tzw.

nagłej śmierci łóżeczkowej (SIDS – ang. Sudden Infant Death Syndrome).

Akcja przyniosła pozytywne skutki, liczba śmiertelnych przypadków

zmniejszyła się o ponad 50%, lecz skutkowało to nagłym zwiększeniem

(ok. 5-krotnym) przypadków deformacji czaszki. Częste przebywanie

dziecka na plecach, nie układanie w innej pozycji (na boku), powodowało

uciski na potylicę i jej spłaszczenie. Szacuje się że deformacja ułożeniowa

dotyka jedno na 60 dzieci [8].

Rysunek 5. Rodzaje deformacji ułożeniowych [9]

Podobnie jak w przypadku kraniosynostoz, rozróżnia się kilka rodzajów

deformacji ułożeniowych. Ich nazwy są ściśle związane z kształtem

zdeformowanej czaszki. W zależności od miejsca długotrwałego nacisku,

głowa przybiera inny kształt. Są one bardzo podobne do tych związanych z

kraniosynostozą, więc i przyjęto dla nich podobne nazwy (z dodatkiem

wskazującym na przyczynę – ułożeniowe). Do najczęściej występujących

deformacji ułożeniowych czaszki należą [9]:

łódkogłowie ułożeniowe (positional scaphocephaly);

krótkogłowie ułożeniowe (positional brachycephaly);

skośnogłowie ułożeniowe (positional plagiocephaly).

Na rysunku 5 zaprezentowane zostały fotografie oraz szkice najczęściej

występujących deformacji ułożeniowych.

Deformacja ułożeniowa w większości wypadków nie zagraża

powikłaniom neurologicznym ani rozwojowym u dziecka. Głównie wiąże

się ona z aspektem estetycznym. Ważna jest odpowiednia diagnoza

i odróżnienie deformacji ułożeniowych od zrostowej, ze względu na

odmienne leczenie obu tych przypadków.


169

Rysunek 6. Różnice pomiędzy skośnogłowiem ułożeniowymi a wywołanym kraniosynostozą [6]

Może w tym pomóc często wyczuwalny grzbiet występujący na

skostniałym szwie. W przypadku skośnogłowia dodatkowo pomocne

będzie położenie ucha (w deformacji ułożeniowej ucho po spłaszczonej

stronie jest widocznie przesunięte względem drugiego, w kraniosynostozie

przeciwnie – ucho po przeciwnej do spłaszczonej strony jest przesunięte)

oraz bardziej wysunięte z jednej strony czoło (podobnie jak w przypadku

uszu). Najlepsza oraz jednoznacznie określająca przyczynę deformacji

będzie diagnoza za pomocą zdjęć RTG lub tomografii komputerowej [8].


170

4. Ocena stopnia deformacji

Zaawansowanie deformacji ma duży wpływ przy podejmowaniu decyzji

co do rodzaju leczenia, określania czasu oraz prognozowania jego efektów.

Stopień zniekształcenia określany jest na podstawie przeprowadzonych

pomiarów, będących elementem diagnozy [10].

Jednym z pierwszych etapów diagnozy jest wykonanie pomiarów

czaszki. W większości przypadków dokonuje się to metodą stykową, czyli

za pomocą przyrządów stykających się z głową dziecka. Należą do nich

mały cyrkiel kabłąkowy, miarka obwodów głowy lub zwykła miarka

krawiecka. Często dopiero po stwierdzeniu deformacji dokonuje się

pomiarów bezstykowych za pomocą np. skanerów czy zdjęć 3D oraz

dokładnej analizy otrzymanych wyników.

Dla ocenienia stopnia deformacji przyjęte są specjalne wzory wypraco-

wane na podstawie uśrednionych proporcji czaszek o prawidłowej

geometrii. Krótkogłowie wraz z łódkogłowiem posiada wspólny wzór

pomagający określić stopień zniekształcenia czaszki. W przypadku

skośnogłowia dokonuje się porównania otrzymanych wartości [11].

4.1. Pomiary stopnia krótkogłowia i łódkogłowia [11]

Aby uzyskać prawidłowe wyniki konieczne jest odpowiednie określenie

skrajnych punktów, pomiędzy którymi mierzona będzie odległość.

Wyróżniamy cztery takie punkty (rys. 7):

A – umieszczony nieco powyżej, pomiędzy brwiami;

P – najdalej wysunięte miejsce na tylnej części głowy;

S oraz D – znajdujące się po obu stronach głowy, nieco powyżej uszu.

Rysunek 7. Umiejscowienie punktów pomiarowych [11]


171

Po zmierzeniu odległości pomiędzy tymi punktami należy podstawić je

do specjalnego wzoru (1), który pozwoli obliczyć tzw. Cephalic Index (CI).

CI(%)= (SD/AP)*100 (1)

Na podstawie indywidualnej wartości indeksu możemy obliczyć tzw.

Deformation Index (DI). Określa on w jakim stopniu pacjent odbiega od

standardowej wartości CI. Za standardowy, uśredniony wynik CI przyjęto

wartość 78%.

Tabela 1. Wzory do określania stopnia DI

Krótkogłowie (gdy CI > 78%) DI(%) = CI – 78%

Łódkogłowie (gdy CI < 78%) DI(%) = 78% – CI

Za prawidłową wartość CI uważa się przedział od 75 do 85%. Przedział

70-75% oraz od 85% do 90-95% świadczy o łagodnej, umiarkowanej

deformacji. Pozostałe wartości nie mieszczące się w powyższych prze-

działach oznaczają bardziej zaawansowane deformacje.

4.2. Pomiary stopnia skośnogłowia [11]

Do określenia stopnia zaawansowania skośnogłowia podobnie jak

w przypadku krótkogłowia i łódkogłowia potrzebne jest kreślenie położenia

punktów AP. Utworzą one linię podziałową pomiędzy dwoma półkulami.

Dodatkowo niezbędne jest określenie dłuższej przekątnej czaszki, której

miejsca styku utworzą punkty Ll oraz krótszej z początkowymi punktami

Rr. Ważny jest również kąt α pomiędzy przekątnymi a linią podziałową

(rys. 8).

Rysunek 8. Punkty oraz kąt przy pomiarze stopnia skośnogłowia [11]


172

Początkowo należy określić linie podziałową. Od punkt A znajdującego

się pomiędzy brwiami, należy poprowadzić prostopadłą względem czoła

linię, do punktu P. Jeżeli jest ono zdeformowane należy określić jak ta linia

przebiegałaby przy prawidłowej geometrii czaszki. Kolejnym krokiem jest

określenie najdłuższej przekątnej czaszki, wyznaczenie punktów L-l oraz

zmierzenie odległości między nimi. Dłuższa przekątna wraz z linią

podziałową przecina się pod kątem α. Pod takim samym kątem należy

zmierzyć odległość pomiędzy punktami R-r, tworzącymi krótszą przekątną.

Od otrzymanej wartości długości dłuższej przekątnej, należy odjąć

wartość krótszej. Różnica ta jest miarą potrzebną do określenia stopnia

deformacji (tabela 2).

Tabela 2. Miara skośnogłowia

Łagodne 1-9 mm

Umiarkowane 10-19 mm

Ciężkie powyżej 20 mm

Pomiarów potrzebnych do określenia zaawansowania skośnogłowia, jak

i krótkogłowia i łódkogłowia można dokonać zarówno przy wykorzystaniu

przyrządów stykowych i bezstykowych. Najczęściej używane i wykorzysty-

wane w medycynie przedstawione zostały w poniższych podrozdziałach.

5. Pomiary stykowe

Pomiary stykowe najczęściej stosowane do postawienia pierwszej

diagnozy, stwierdzenia czy u danego pacjenta występuje deformacja

czaszki. Dokonywane są przy pomocy prostych urządzeń bezpośrednio

pokazujących wartość mierzonej wielkości.

Jednym z takich urządzeń jest cyrkiel kabłąkowy. Zbudowany jest on

z dwóch ruchomych, wygiętych kabłąkowo ramion oraz prostopadle

umieszczonej do nich linijki. Na jej powierzchni umieszczona jest

podziałka umożliwiające odczytanie wartości pomiaru. Pozwala on na

mierzenie średnic np. kości, stóp czy głowy. Istnieją jego dwie odmiany

– duży i mały. Duży służy do pomiarów np. szerokości klatki piersiowej

czy bioder. Mała odmiana cyrkla (rys. 9) wykorzystywana jest przy

mierzeniu mniejszych średnic. Do pomiarów deformacji czaszki wyko-

rzystuje się odmianę małą cyrkla, gdyż jej wymiary mieszczą się

w zakresie pomiarowym tego rodzaju cyrkla [11].

Do pomiaru obwodu główki dziecka wykorzystywane są specjalne

miarki (rys. 10). Przybierają one różne formy. Mogą być zwijane do

specjalnego pojemnika lub wyglądać jak zwykła miarka krawiecka.


173

Rysunek 9. Cyrkiel kabłąkowy mały [11]

Do metod stykowych należy również zaliczyć skanery stykowe.

Umożliwiają one otrzymanie dokładnie odwzorowanej powierzchni głowy

w postaci cyfrowego modelu. Specjalne ramie pomiarowe sczytuje

położenie w przestrzeni po zetknięciu się z badanym obiektem. Niestety nie

mogą być one stosowane do bezpośredniego pomiaru głowy dziecka ze

względu na długi czas takiego pomiaru i konieczność unieruchomienia

badanego obiektu. Drugim powodem jest plastyczność tkanek, a ta metoda

może być wykorzystywana tylko przy twardych, nieodkształcalnych

obiektach [12].

Rysunek 10. Miarka do pomiaru obwodu głowy noworodków i niemowląt [13]


174

6. Pomiary bezstykowe

Bezstykowe metody pomiarowe wykorzystywane są głównie przy

dalszej diagnozie oraz planowaniu leczenia. Pomiar dokonywany jest bez

bezpośredniego kontaktu urządzenia z badaną powierzchnią. Do takiego

rodzaju urządzeń mogą więc również zostać zaliczone m.in. rezonans

magnetyczny lub tomografia komputerowa, wykorzystywane w diagnozie

do oceny poziomu skostnienia szwów oraz ewentualnych powikłań

neurologicznych [4, 12].

Bezstykowe pomiary najczęściej wykonywane są za pomocą skanerów,

głównie laserowych. Niestety nie wszystkie ich rodzaje dopuszczane są do

użytku w medycynie. Głównie ma to związek z zastosowanym

w urządzeniu rodzajem lasera i ryzykiem uszkodzenia wzroku [12].

Jednym z bezpiecznych, przeznaczonych do korzystania w medycynie

body skanerów jest ręczny, przenośny skaner Go!Scan 3D. Wykorzystuje

on biały laser o małej energii, bezpieczny dla wzroku. Wiązka światła pada

na powierzchnię skanowanego przedmiotu tworząc linię świetlną. Jej obraz

sczytywany jest przez detektor. W zależności od odległości pomiędzy

skanowaną powierzchnią a skanerem zmienia się kąt linii świetlnej. Po jego

przechwyceniu przez detektor, przy znanym położeniu źródła światła

i detektora oraz kąta odbicia linii, przy wykorzystaniu metody triangulacji,

obliczane jest położenie punktów tworzących powierzchnię. Zaletą tego

skanera jest szybkość uruchomienia (gotowy do użycia po 2 minutach) oraz

skanowania zarówno małych jak i dużych powierzchni. Skanowany obiekt

nie musi być sztywno przytwierdzony, nieruchomy. Może poruszać się

w trakcie skanowania (głównie obracać). Zadowalająca jest również jakość

skanowania. Pozwala ona na skanowanie różnych materiałów z dokład-

nością do 0,1 mm [14].

Innym często stosowanymi czytnikami są skanery prążkowe. Ich

działanie jest podobne jak wcześniej opisanych skanerów laserowych.

Różnicą jest rodzaj obrazu padającego na badaną powierzchnię. Zamiast

pojedynczej linii, obiekt jest oświetlany za pomocą rzutnika sekwencją

prążków o znanej grubości i gęstości. Wykorzystywany jest w tym

przypadku efekt prążków Moire’a [12].

Przykładem takich skanerów, często używanych w medycynie są m.in.

Gemini, MegaCapturor czy Cyclops. Są to skanery stacjonarne, które

umieszcza się na płaskiej powierzchni lub na statywie. Umożliwiają one nie

tylko skanowanie pojedynczych fragmentów, ale również całego ciała.

Skanery te dodatkowo pozwalają otrzymać bardzo realistyczny obraz wraz

z kolorem. Ich dokładność jest zależna od odległości pomiaru oraz

powierzchni. Im większa powierzchnia skanowania, tym mniejsza jest

dokładność skanu [14].


175

Często pomiary wykonywane są przy użyciu kilku ustawionych wokół

badanego obiektu i odpowiednio skalibrowanych aparatów fotograficznych

lub kamer. Taka technika nosi nazwę fotogrametrii [15, 16].

W tym samym momencie, wszystkie aparaty wykonują zdjęcia

badanego obiektu, a specjalny program komputerowy łączy je tworząc

trójwymiarowy model obiektu (rys. 11). Położenie poszczególnych punktów

określane jest na podstawie odległości i kątów z przynajmniej dwóch zdjęć.

Przy znanej skali, położeniu aparatów i katów możliwe jest określenie

rzeczywistej odległości pomiędzy punktami. Tak otrzymany obraz jest

dalej przetwarzany, w celu otrzymania modelu bryłowego, który może

zostać wykorzystany do dokładnego określenia deformacji oraz zaplano-

wania leczenia [15, 16].

Rysunek 11. Skanowanie przy użyciu zestawu kamer [15]

Istnieje wiele metod bezkontaktowego pomiaru (rys. 12). Są one bardzo

przydatne przy diagnozie (rys. 13) oraz planowaniu leczenia. W znaczny

sposób pomagają w zmniejszeniu do minimum czasu trwania często

stresującej dla dziecka diagnozy.


176

Rysunek 12. a) model głowy w trakcie pomiarów (widoczne wyświetlane na powierzchni modelu

sekwencje pasków), b) proces dopasowania chmur

Rysunek 13. Pomiar odległości pomiędzy punktami AP (długość) i SD (szerokość)

7. Podsumowanie

Deformacje czaszki, które niegdyś były często bagatelizowane, obecnie

są coraz sprawniej diagnozowane i leczone. Połączenie wiedzy medycznej

z techniczną pozwala na szybkie i dokładne postawienie diagnozy oraz

wdrożenie środków prowadzących do prawidłowego ukształtowania

czaszki u dziecka. Czas w przypadku tego schorzenia ma zasadniczy wpływ.

a)


177

Za późne stwierdzenie deformacji może w znaczny sposób ograniczyć

możliwość wykorzystania nieinwazyjnych, nieoperacyjnych metod

leczenia, a nawet doprowadzić do uszkodzeń neurologicznych, wywo-

łanych zwiększonym ciśnieniem śródczaszkowym.

Wykorzystanie w diagnostyce bezstykowych metod pomiarowych

pozwala na znaczne skrócenie czasu potrzebnego do określenia poziomu

zmian. zaprezentowane w pracy techniki cyfrowe umożliwiają w pewnym

stopniu zautomatyzowanie procesu stawiania diagnozy, gdyż poprzez

wykorzystanie odpowiednich programów komputerowych możemy

otrzymać bardzo dokładną analizę deformacji. Zaletą jest również bardzo

duża dokładność pomiarów, często nie osiągalna tradycyjnymi metodami.

Podziękowania

Praca zrealizowana przy wsparciu finansowym Wydziału Mechanicznego

Politechniki Białostockiej w ramach projektu „Rozwój młodych naukowców

i uczestników studiów doktoranckich‖ nr MB/WM/14/2014.

Literatura

1. Bochenek A., Reicher M., Anatomia człowieka. Tom I, Warszawa, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 2009, s. 298-436

2. Aleck K., Craniosynostosis Syndromes in the Genomic Era, Phoenix, XI Seminars in Pediatric Neurology, Elsevier, 2004, s. 256-26

3. Gzik M., Tejszerska D., Wolański W., Gzik-Zroska B., Komputerowe wspomaganie planowania zabiegu korekcji trigonocefalii u dzieci, Gliwice, Modelowanie Inżynierskie, 2009, zeszyt 38, s. 51-56

4. Wolański W., Larysz D., Gzik M., Kawlewska E., Komputerowe metody wspomagania leczenia kraniosynostozy, Gliwice, Modelowanie Inżynierskie, 2011, zeszyt 41, s.437-444

5. Polskie Centrum Medyczne Elobot., Kraniosynostoza [online], http://o.elobot.pl/ artykul/kraniosynostoza-anomalii-twarzoczaszki [dostęp: 8 XII 2013r]

6. Oregon Health & Science University., Craniofacial & Cleft Palate Program [online], http://www.ohsu.edu/xd/health/services/doernbecher/programs-services/ cleft-palate-craniofacial.cfm [dostęp: 8 XII 2013r.]

7. Laskowska-Ziętek A., Misiuk-Hojło M., Przedwczesne zarośnięcie szwów czaszkowych – aspekty okulistyczne i stomatologiczne, Wrocław, Dental and Medical Problems, 2007, zeszyt 44, s. 242-246

8. Biggs W. S., Diagnosis and management of positional head deformity, Michigan, American Family Physician, 2003, zeszyt 67, s.1953-1956

9. Co to jest "plagiocefalia ułożeniowa"(positional plagiocephaly)? [online] , http://www.mamopedia.pl/10-11-mies/zdrowie/plagiocefalia-ulozeniowa [dostęp: 15 XII 2013r.]

10. Larysz D., Ocena wyników leczenia izolowanych kraniosynostoz u dzieci z uwzględnieniem aspektów klinicznych, biomechanicznych oraz


178

neurorozwojowych – Suplement do rozprawy habilitacyjnej [online], http://leczeniekraniosynostoz.pl/ [dostęp: 12 XII 2013r.]

11. Measuring Plagiocephaly [online], MIMOS, http://www.plagiocephalyflathead.com/cart_mimos_CRANEO.php [dostęp: 1 I 2014r.]

12. CAD / CAM / CAE / MES [online] Design News Polska, http://www.designnews.pl/menu-gorne/kanaly-tematyczne/cad-cam-cae-mes/ [dostęp: 3 I 2014 r.]

13. Miarka do pomiaru obwodu głowy noworodków i niemowląt SECA 212 [online]. http://www.medysklep.pl/ index.php [dostęp: 1 I 2014r.]

14. CaspSystem Systemy wizyjne 3D [online]. http://www.pomiar3d.pl/ [dostęp:3 I 2014 r.]

15. Cranioform babies head correction [online]. Cranioform Group, http://www.cranioform.de/pl.html [dostęp: 26 XII 2013 r.]

16. Tokarczyk R., Fotogrametria cyfrowa w zastosowaniach medycznych do pomiaru ciała ludzkiego – przegląd i tendencje rozwojowe systemów pomiarowych [online], http://home.agh.edu.pl/~tokarcz/public/fot_med.pdf [dostęp 4 I 2014 r.]


Zewnętrzny wygląd człowieka jest oznaką jego zdrowia, zarówno fizycznego jak i psychicznego,

jest również ważnym elementem postrzegania w społeczeństwie przez innych ludzi.

Najistotniejsza jest płaszczyzna czołowa, głównie ze względu na zasadniczą rolę w komunikacji

werbalnej i niewerbalnej z ludźmi. Jeśli chodzi o zniekształcenia czaszki, rodzice z powodów

zdrowotnych i estetycznych coraz częściej decydują o leczeniu. Współczesna medycyna

rozwinęła metody korekty zdeformowanego ciała – od inwazyjnych zabiegów chirurgicznych do

bezinwazyjnych metod leczenia kaskami korekcyjnymi.

W pracy zaprezentowane zostały podstawowe, najczęściej spotykane rodzaje deformacji czaszki,

z uwzględnieniem przyczyn ich powstawania – przedwczesny zrost szwów czaszkowych lub

długotrwałe naciski na dany rejon głowy. Określenie przyczyny powstania zniekształceń

umożliwia wdrożenie odpowiedniego leczenia. Zależy ono również od stopnia deformacji, który

określany jest za pomocą opisanych w niniejszym opracowaniu wzorów. Rozwój techniki

umożliwia coraz szybsze i dokładniejsze przeprowadzenie pomiarów czaszki, a nawet ich analizę

w celu otrzymania gotowych zaleceń do korekcji.

Evaluation methods for measuring skull deformation in pediatric

patients

The external appearance of human is a sign of his health, both physically and mental and an

important element of perception in the community by other people. The most important in that

plane is the appearance of the head, mainly because of its essential role in verbal and nonverbal

communication with people. When it comes to distortion of the skull, parents due to health

reasons and for aesthetic increasingly decide on treatment. Modern medicine has developed

methods for correcting deformities – from invasive surgical procedures to non-invasive orthoses

called corrective helmets.

The increased interest in the treatment of diseases of the skull stimulates the creation of new

therapies. The development of technology creates enormous opportunities ranging from speeding

up diagnosis, by designing the helmet until his execution. The work has been shown and

described individually tailored course design helmet using the latest technical solutions.

179



3, Tomasz Wybranowski

4

Fluorescencyjna spektroskopia

czasowo-rozdzielcza.

Proste narzędzie diagnostyczne

1. Wprowadzenie

Metody spektroskopowe używane są od dawnych czasów, początkowo

(Newton, Kartezjusz) kiedy spektroskopia stawiała pierwsze kroki, nie

dostrzegano rozległości potencjału jaki stanowią metody spektroskopowe.

W dzisiejszych czasach badania przy użyciu światła są dość dobrze

poznaną sztuką badawczą, która jednak w dobie obecnej nauki ciągle

podlega modyfikacjom i ulepszeniom. Spektroskopia czasowo- rozdzielcza

jest szeroko stosowana w biochemii, fizyce, farmacji czy medycynie. Jej

największą zaletą jest prostota oraz z klinicznego punktu widzenia mała

inwazyjność i bezpieczeństwo. Jest to istotną cechą zarówno dla pacjenta

jak i lekarzy i naukowców. Jednym z najprostszych przykładów mało-

inwazyjności w zastosowaniu fluorescencyjnej spektroskopii czasowo-

rozdzielczej jest analiza osocza uzyskanego z krwi pełnej pacjenta.

2. Cel pracy

Celem niniejszej pracy jest przedstawienie spektroskopii jako

małoinwazyjnej, szybkiej oraz niewymagającej długiego czasu techniki,

która dzięki korelacji, jaka występuje między światłem a cząsteczkami,

może być używana m.in. do badania właściwości białek oraz wyko-

rzystywana przy diagnostyce różnego rodzaju schorzeń.

[email protected], Collegium Medicum w Bydgoszczy, Wydział Farmaceutyczny,

Studenckie Koło Naukowe Biofizyki przy Zakładzie Biofizyki 2 [email protected], Collegium Medicum w Bydgoszczy, Wydział Farmaceutyczny, Katedra

i Zakład Patobiochemii i Chemii Klinicznej 3 [email protected], Collegium Medicum w Bydgoszczy, Wydział Farmaceutyczny, Katedra

i Zakład Biofizyki 4 [email protected], Collegium Medicum w Bydgoszczy, Wydział

Farmaceutyczny, Katedra i Zakład Biofizyki


180

3. Omówienie

3.1. Ogólna charakterystyka białek

Białkami (inaczej proteiny lub polipeptydy) nazywamy wielko-

cząsteczkowe elementy budujące wszystkie organizmy żywe. Białka przede

wszystkim są produktami, które powstają poprzez połączenie się grup alfa-

karboksylowych z alfa-aminowymi, których spoiwem są wiązania

peptydowe. Praktycznie wszystkie białka składają się z połączenia w różnej

kombinacji 20 aminokwasów powszechnie występujących w przyrodzie,

których to łańcuchy boczne są odmienne. Te boczne łańcuchy tak zwane

reszty R różnią się między sobą kształtem, zdolnością do wytwarzania

wiązań wodorowych, ale także reaktywnością chemiczną, charakterem

hydrofobowym oraz wielkością i posiadanym ładunkiem elektrycznym [1].

W związku z tym, że białka są tworzone przez kombinację różnych

aminokwasów, logicznym wydaje się fakt, że w zależności od tych

składowych elementów, zmieniają się właściwości fizyczne i chemiczne

powstałych peptydów. Ogólna norma wagowa, pozwalająca stwierdzić czy

dana cząsteczka jest peptydem mówi, że za białko uznaje się cząsteczkę,

której łączna masa cząsteczkowa przekracza 10 kDa.

Białka mają budowę złożoną, a ponieważ są zbudowane często z wielu

aminokwasów, których reszty są mocno rozgałęzione, ich struktura jest

przestrzenna. Struktura pierwszorzędowa białek jest przydatna podczas

określania kolejno po sobie postępujących aminokwasów. Jednak oprócz

struktury pierwszorzędowej wyróżnić można jeszcze kolejne 3 poziomy

organizujące złożoną strukturę białek, które różnią się rodzajem

i stabilnością wiązania. Wiązania wodorowe są charakterystyczne

w strukturach drugorzędowych. Złożone łańcuchy białkowe mogą tworzyć

różne konstrukcje helisy polipeptydowej typu, alfa, beta – harmonijki, pętli,

a także wstęga – zwrot – wstęga. Boczne niepolarne łańcuchy

aminokwasów, występujące w trzeciorzędowej strukturze białka „chowają

się” wewnątrz makrocząsteczki w tak zwanym rdzeniu hydrofobowym.

Wewnątrz protein niezwykle istotną rolę, polegającą w głównej mierze na

stabilizacji konstrukcji białka odgrywają siły Van der Waalsa oraz mostki

dwusiarczkowe. Czwartorzędowa struktura określa białka składające się

z kilku łańcuchów polipeptydowych. Sposób upakowania białka zależy od

jego funkcji. Białka pełnią funkcje praktycznie we wszystkich procesach

zachodzących w organizmie począwszy od mechanicznego stabilizowania

tkanek oraz narządów jako funkcji strukturalnych, przez pełnienie roli

katalizatorów różnych reakcji do transportu różnych związków metali,

enzymów oraz innych substancji. Białka to także hormony, które regulują

procesy zachodzące wewnątrz organizmu. Dodatkowo jako np. przeciw-

Fluorescencyjna spektroskopia czasowo-rozdzielcza. Proste narzędzie diagnostyczne

181

ciała ochraniają przed czynnikami atakującymi organizm pełniąc funkcję

białek układu odpornościowego [1‚4].

3.2. Białka osocza

Osocze zwane także plazmą jest zasadniczym składnikiem krwi otrzy-

mywanym po odwirowaniu krwi pełnej w odpowiednich warunkach,

w którym zawieszone są komórkowe elementy morfotyczne krwi.

Całkowite stężenie białka u zdrowego człowieka w jego osoczu wynosi od

65 do 80 g/l. Osocze jest bogato białkowym supernatantem krwi pełnej,

bowiem znajduje się w nim nawet ponad 300 różnych białek, jednakże

najważniejsze są dwie grupy z rodziny immunoglobulin i albuminy,

odpowiedzialne za zmiany całkowitego stężenia protein. To właśnie białka

osocza odpowiadają za kontrolę zaopatrywania w płyny przestrzeni

pozanaczyniowych, regulują procesy homeostatyczne oraz regulują

krzepnięcie krwi, pełnią funkcje transportowe dla wielu substancji oraz

odpowiadają za ochronę organizmu przed czynnikami chorobotwórczymi.

Z powodu na przykład nadmiernej utraty białka przez nerki czy przewód

pokarmowy, upośledzonego jego wchłaniania czy też niedostatecznej

biosyntezy w osoczu może dojść do hipoproteinemi, która objawia się

poprzez zmniejszenie stężenia albuminy. Odwrotnym do hipoproteinemi

zjawiskiem patologicznym jest hiperproteinemia objawiająca się

podwyższoną syntezą immunoglobulin (podwyższona synteza albumin jest

praktycznie niespotykana), stąd właściwsza nazwa dla tego zjawiska to

hipergammaglobulinemia [4].

Białka osocza można rozdzielić za pomocą elektroforezy na 5 głównych

frakcji do których zaliczmy: albuminę, α1-globuliny, α2-globuliny,

β-globuliny oraz γ-globuliny. Wszystkie z tych frakcji pełnią różnorodne

funkcje. Skład poszczególnych frakcji białkowych w prawidłowych

warunkach po rozdziale elektroforetycznym przedstawia Tab. 1.


182

Tab. 1. Poszczególne frakcje białkowe po rozdziale elektroforetycznym surowicy. Źródło:

Dembińska-Kieć A., Naskalski J.: Diagnostyka laboratoryjna z elementami biochemii klinicznej

FRAKCJA STĘŻENIE BIAŁKA

(g/l)

ZAWARTOŚĆ

BIAŁKA (%)

Albumina 35-55 55,0-70,0

α1-globuliny 0,9-2,1 1,4-2,9

α2-globuliny 5,0-7,9 7,0-11,0

β-globuliny 8,0-13,0 5,7-7,9

γ-globuliny 9,0-16,0 5,7-7,9

Razem 65,0-82,0 100

W każdą z przedstawionych w powyższej tabeli frakcji wliczają się

konkretne białka. Jakie konkretnie białka należą do konkretnej grupy

przedstawia Tab. 2.


183

Tab. 2. Poszczególne białka tworzące frakcje po rozdziale elektroforetycznym. Źródło:

Diagnostyka laboratoryjna z elementami biochemii klinicznej. Dembińska-Kieć A., Naskalski J.

Elsevier Urban & Partner, Wrocław 2010.

Frakcja Białka

Albumina albumina

α1-globuliny α1-antytrypsyna, α1-kwaśna glikoproteina, α1-lipoproteina

(apoA, HDL)

α2-globuliny α2-makroglobulina, haptoglobina

β-globuliny Transferryna, betalipoproteina (apoB, LDL)

Β2-globuliny Frakcja C3 dopełniacza, immunoglobulina A,

immunoglobulina G

γ-globuliny Immunoglobuliny klasy A, G, M, białko C-reaktywne

3.2.1. Albumina

Głównym białkiem osocza, którego stężenie we krwi wynosi 40-52 g/l

(stanowi do 50-70% całościowej ilości białek surowicy) jest albumina [4].

Białko to jest syntezowane w wątrobie, a za jego degradację w organizmie

odpowiedzialne są komórki śródbłonka naczyń, mięśni i skóry, degeneracja

w wątrobie oraz nerkach zachodzi w mniejszej ilości [5]. Albumina pełni

w organizmach żywych wiele różnych funkcji. Jest odpowiedzialna m.in.

za utrzymanie prawidłowego ciśnienia osmotycznego krwi, jest zarazem

białkiem antyoksydacyjnym oraz buforującym, a jej cząsteczki są

swoistego rodzaju magazynem dla aminokwasów. Pełni także funkcje

transportujące będąc nośnikiem drobnocząsteczkowych metabolitów, prze-

nosi ona po wcześniejszym związaniu się kwasy tłuszczowe, bilirubinę,

hormony oraz co istotne jony różnych metali w tym wapnia, miedzi,

kobaltu czy niklu. Albumina jest stosunkowo dużym białkiem zbudo-

wanym z 585 reszt aminokwasowych, gdzie jedną z reszt jest tryptofan

Trp-214 [6]. Fragment N – końcowy albuminy jest najistotniejszym

obszarem z punktu widzenia wiązania się z nim jonów metali przejścio-

wych. Składa się on z czterech aminokwasów kwasu asparaginowego

– alaniny – histydyny – lizyny. To fragment szczególnie narażony

i wrażliwy na uszkodzenia. Wiele różnych czynników w tym zwiększony


184

stres oksydacyjny może wpływać na strukturę albuminy, która pod jego

wpływem może ulec zmianie [7, 8].

3.3. Fluorescencja

Zjawisko emisji fal świetlnych generowanych przez różnego rodzaju

cząsteczki to jedno z najczęściej stosowanych w badaniach biofizycznych

i biochemicznych metod badawczych wykorzystywanych w biologii

molekularnej. Terminem fluorescencji określa się emitowanie światła przez

wcześniej wzbudzoną cząsteczkę, która w tym czasie przechodzi

z najniższego poziomu oscylacyjnego S1 do stanu S0 podstawowego.

Cząsteczka absorbuje kwanty światła, w wyniku czego jest jej dostarczana

energia. Skutkiem takiego procesu jest wejście cząsteczki w stan wzbu-

dzony. Proces pobrania energii w postaci światła przez cząsteczkę zachodzi

bardzo szybko zachodząc w przeciągu około 10-15

s. Promieniowanie, które

emituje cząsteczka w procesie świecenia (fluorescencji), zanika praktycznie

natychmiast po odcięciu źródła promieniowania w szybkim czasie około

10-8

s [9]. Przechodzenie cząsteczek ze stanu podstawowego do

wzbudzonego i odwrotnie w sposób zarówno promienisty (z emisją

światła) jak i bezpromienisty) przedstawia diagram Jabłońskiego (Rys. 1.)

Rys. 1 Diagram Jabłońskiego, Źródło: Lakowicz J.R., Principles of Fluorescence Spectroscopy.,

Springer, USA 2006

Do przejścia cząsteczki na wyższy poziom oscylacyjno-wibracyjny

w stanie S1 albo S2 dochodzi poprzez absorpcję przez fluorofor kwantu

światła. Do najniższego poziomu energetycznego (stan poziomu

wibracyjnego S1) przechodzi większość molekuł w trakcie procesów

bezpromienistej konwersji wewnętrznej. Jest to czas rzędu 10-12

s. Energia

cząsteczki, która znajduje się w stanie singletowym S1 może także

rozproszyć energię w sposób promienisty. Do takich procesów zaliczamy


185

fluorescencję, fosforescencję oraz opóźnioną fluorescencję. Do procesów

bezpromienistych zalicza się konwersję wewnętrzną oraz konwersję

międzysystemową [9]. Przejście międzysystemowe zachodzi wówczas,

kiedy będąca w stanie wzbudzonym cząsteczka podda się konwersji do tak

zwanego stanu trypletowego T1. Taka sytuacja zachodzi wówczas, gdy

jedna molekuła zderzy się z inną.

Przejściem cząsteczki ze wzbudzonego stanu trypletowego (T1) do stanu

podstawowego S0, któremu towarzyszy emisja fotonu nazywa się

fosforescencją. Po takim przejściu czas zaniku może trwać długo po

przerwaniu emisji promieniowania wzbudzającego [10, 11].

Energia wytwarzana podczas fluorescencji jest znacznie niższa od tej,

którą początkowo cząsteczka absorbuje. Jest to wynikiem tego, że w trakcie

procesu część energii zostaje pochłonięta przez zjawiska konwersji

wewnętrznej. Takie zjawisko tłumaczy przesunięcie Stokes’a wskazujące

na to, że do utraty energii dochodzi wskutek przesunięcia się widma emisji

w stronę dłuższych fal w porównaniu do fal absorpcji. Istnieją jeszcze inne

procesy powodujące straty energetyczne zalicza się do nich relaksację

rozpuszczalnikową, wygaszanie fluorescencji, a także transfer energii.

Cząsteczka wraca do stanu początkowego po pewnym czasie (czasie życia

fluorescencji) oraz po tzw. wydajności kwantowej. Wydajność kwantowa

w zjawisku fluorescencji jest stosunkiem ilości fotonów jakie cząsteczka

wyemitowała w trakcie promienistego procesu przechodzenia ze stanu S1

do stanu S0 w porównaniu do liczby fotonów jakie ta sama cząsteczka

pochłonęła w momencie absorpcji. Czasem życia fluorescencji (fluorescence

lifetime, FLT), określa się natomiast średni czas, jaki cząsteczka pokonuje

w trakcie wzbudzenia do czasu zanim nastąpi jej powrót do stanu podsta-

wowego. Jeżeli cząsteczka w stanie wzbudzonym zderzy się w trakcie

przebywanej drogi z wygaszaczem, intensywność jej fluorescencji może

znacznie się obniżyć. W trakcie takiego „karambolu” na poziomie

molekularnym, energia z molekuły wzbudzonej przenosi się na wygaszacz

(np. cząsteczka tlenu, amina lub halogenek), który przejmując część energii

ze stanu podstawowego przechodzi w stan wzbudzony [9‚13].

3.3.1. Rezonansowy transfer energii

Rezonansowe przeniesienie energii (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET) to mechanizm podczas którego dochodzi do przeniesienia energii pomiędzy dwoma chromoforami. Cząsteczka, która została wzbudzona absorbując energię w postaci światła nazywa się donorem, natomiast molekuła wzbudzona w trakcie bezpromienistego procesu przekazania energii nazywamy akceptorem. Zajście tego mechanizmu jest zależne od odległości jaka dzieli akceptor od donora. Jeżeli cząsteczki znajdują się od siebie w granicach rzędu 2-10nm, a także jeżeli fala


186

emitowana przez molekuły donora nakładają się na siebie z falą absorpcyjną molekuły akceptora, donor przechodzi do podstawowego stanu elektronowego, a molekuła która jest akceptorem przechodzi w stan wzbudzenia. Czas życia donora zmniejsza się, a badacz obserwuje zmianę pasma emisji molekuły, która została wzbudzona na skutek w procesie absorpcji światła [14].

3.3.2. Fluorescencyjne właściwości białek

Związki biologiczne takie jak białka, czasami zawierają w swojej budowie fluorofory, czyli grupy wykazujące zdolność absorpcji energii o konkretnej długości fali zdolne później oddać tą energię w postaci sygnału świetlnego. Takie właściwości związków znalazły zastosowanie w badaniach nad fluorescencją, pełniąc funkcje sondy molekularnej lub znacznika fluorescencyjnego. W analizach klinicznych to pożądane cechy pomagające określić lokalizację obszaru patologicznego, który ma zostać poddany obserwacji. Dzięki znajomości maksimum absorpcji i emisji reszt aminokwasów fluorescencyjnych oraz np. znajomości wartości referen-cyjnych czasów życia fluorescencji można dzięki spektroskopii określić np. poziom uszkodzenia białek spowodowanych działaniem leków czy też np. nadmiernym wysiłkiem fizycznym [15]. Do grupy substancji, które posiadają zdolność emisji światła należą takie barwniki jak fluoresceina oraz rodamina, białka, barwniki pochodzenia roślinnego np. chlorofil i karotenoidy, poszczególne witaminy oraz hormony takie jak ryboflawina i kwas foliowy a także kwasy nukleinowe.

Właściwości fluorescencyjne protein wynikają z obecności w ich łańcuchu aromatycznych reszt aminokwasowych takich jak fenyloalanina, tyrozyna i tryptofan (Rys. 2.).

Rys. 2. Wzory strukturalne fenyloalaniny, tyrozyny oraz tryptofanu występujących

w białkach i będące chromoforami Źródło: [http://ztibsl.ch.pw.edu.pl/3wm/upl/1361989118.pdf]


187

Każdy z przedstawionych powyżej aminokwasów fluoryzuje z zakresie

fali bliskiemu nadfioletowi. Dla fenyloalaniny maksymalna absorpcja

wynosi 260nm, a emisja jest równa 282nm. Tyrozyna charakteryzuje się

nieco niższą energią, maksimum jej absorpcji wynosi 275nm a emisja

304nm. Widmo absorpcji dla tryptofanu sięga najdłuższych fal wynosząc

295nm, a emisji 353nm (Tab.3.) [9].

Tab.3. Maksimum absorpcji oraz maksimum emisji reszt aminokwasów fluorescencyjnych

Maksimum absorpcji Maksimum emisji

Fenyloalanina 260 nm 282 nm

Tyrozyna 275 nm 304 nm

Tryptofan 298 nm 353 nm

Reszta tryptofanowa odgrywa najważniejszą rolę w absorpcji,

a następnie fluorescencji emitowanej przez białka. Fluorescencja tyrozyny

jest wyciszana w procesie bezpromienistego przeniesienia energii (rezonan-

sowego) pomiędzy tyrozyną i tryptofanem. Fenyloalanina wykazuje się

bardzo niską wartością fluorescencji, która jest możliwa do zaobser-

wowania prawie wyłącznie w przypadku braku w łańcuchu polipepty-

dowym tyrozyny i tryptofanu.

Pierścień indolowi, który wbudowany jest w cząsteczkę tryptofanu,

odpowiada za jego fluorescencję. To właśnie od tego fragmentu zależą

właściwości fluorescencyjne chromoforu, a także ładunek sąsiednich reszt

aminokwasów oraz przestrzenna lokalizacja [16]. Jeżeli aminokwas

tryptofanu jest zlokalizowany na powierzchni białka maksimum emisji

światła jest takie jak prezentuje powyższa tabela 3. Jeżeli natomiast reszta

tryptofanowa położona jest wewnątrz cząsteczki białka, maksimum emisji

przesuwa się w kierunku krótszych fal [14, 15].

3.3.3. Spektroskopia czasowo-rozdzielcza

Stosowanie spektroskopii czasowo-rozdzielczej pozwala dokładnie

zmierzyć czas życia fluorescencji. Proces ten polega na wzbudzaniu

badanej próbki energią w postaci fotonów, a następnie rejestracji czasu

w którym dochodzi do zaniku fluorescencji [9]. Natężenia promienio-

wanego światła maleje wykładniczo wraz z upływem czasu. Ten mecha-

nizm opisywany jest wzorem:

I(t)=I0e –t/ô (1)


188

gdzie:

I0 – natężenie fluorescencji w chwili przerwania wzbudzenia;

η – średni czas życia fluorescencji, po tym czasie natężenie świecenia

próbki maleje e-krotnie;

I(t) – zanik intensywności fluorescencji [16].

3.3.4. Przykłady wykorzystania spektroskopii

Spektroskopia czasowo-rozdzielcza wykorzystywana jest między

innymi do określenia kinetyki dezaktywacji dzięki analizie widm absorbcji

np. kamptotetycyny, związku pochodzenia naturalnego o działaniu

przeciwnowotworowym. Aktywna przeciwnowotworowo w środowisku

alkalicznym laktonowa forma kamptotecyny, wiąże się z albuminą

w osoczu, a poprzez hydrolizę, stopniowo przechodzi w nieaktywną formę

karboksylową. W trakcie tego procesu dzięki obserwacji ewoluujących

widm (forma aktywna przechodzi w formę nieaktywną) możliwe jest

określenie kinetyki dezaktywacji związku [17, 18].

Metody spektroskopowe są także podstawą działania wielu urządzeń

laboratoryjnych. Zasadę ich działania wykorzystuje się m.in. przy analizie

albuminy modyfikowanej niedokrwieniem (IMA, ischemia modified

albumin) jako markera ostrego niedotlenienia mięśnia sercowego.

Praktycznie marker ten oznacza się przy użyciu spektroskopii w teście

wiązaniu kobaltu przez albuminę. Kiedy w surowicy zwiększa się poziom

IMA ilość niezwiązanego kobaltu także się zwiększa, przez co dochodzi do

powstania kompleksu z chromogenem – ditiotreitolem (DTT). Reakcja

barwna oceniana właśnie spektrofotomotrycznie nasila się proporcjonalnie

do stężenia IMA w surowicy. Analiza dokonywana jest przy długości fali

równej 470 nm, a wynik odczytywany jest w standardowych jednostkach

absorbancji [7, 19, 20].

Analiza spektroskopowa wykorzystywana jest także przy diagnostyce

chorób zwyrodnieniowych ośrodkowego układu nerwowego (tzw.

taupatie), które są związane z patologią białka tau. Do taupatii zalicza się

m.in. chorobę Alzheimera, otępienie czołowo-skroniowe, czy też

zwyrodnienie korowo-podstawne. Spektroskopia, którą wykorzystuje się do

badania taupatii jest w stanie wykazać swoiste zaburzenia metabolizmu,

które objawiają się spadkiem stężenia NAA zwłaszcza w stosunku do

stężenia białka kreatyny oraz wysokoenergetycznych związków fosforu.

Stężenie białka tau oceniane spektroskopowo, uznawane jest za marker we

wczesnej diagnostyce procesu zwyrodnieniowego w ośrodkowym układzie

nerwowym [21].

Spektroskopia wykorzystywana jest również w diagnostyce zmian

onkologicznych piersi. Dla przykładu spektroskopia Ramana, przy długości


189

fali 514 i 532nm, pozwala odróżnić tkanki o budowie prawidłowej od

tkanek ze zmianami nowotworowymi w zależności od charakterystycznych

drgań karotenoidów, białek, lipidów oraz wody. I tak, zakres drgań dla

lipidów oraz białek mieści się w przedziale 2800-3100cm-1

, pasma dla

cząsteczek wody to normy 3258, 3311, 3410cm-1

, a dla karotenoidów 1004,

1158, 1518cm-1

. Cząsteczki te uznaje się za markery, które pozwalają

(dzięki ustalonym wartościom) odróżnić komórki o budowie prawidłowej

od zmienionych nowotworowo. Dla przykładu uznaje się, że pasmo

3311cm-1

dla cząsteczek wody, jest typowe dla komórek nowotworowych

w ludzkim gruczole piersiowym. Wynika to z większej hydratacji komórek

nowotworowych od komórek niezmienionych. Odpowiednie ich

nawodnienie pobudza procesy dzielenia się, ekspresję onkogenu oraz

dezaktywuje te geny, które są odpowiedzialne za różnicowanie się

komórek. Bogata hydratacja tkanki nowotworowej hamuje także proces

apoptozy, oraz jest proporcjonalna do stopnia złośliwości nowotworu [22].

4. Podsumowanie

Autorzy pracy przedstawili unikalne właściwości białek, które dzięki

obecności aminokwasów takich jak fenyloalanina, tryptofan i tyrozyna

(chromofory) stanowią swoistego rodzaju markery, zdolne do wykrywania

uszkodzeń białek wywołanych przez np. leki, intensywny wysiłek fizyczny

czy też zanieczyszczone środowisko. Do takiej identyfikacji dochodzi na

skutek fotoluminescencji. Badana cząsteczka w pierwszym etapie pobiera

energię w postaci fotonów, a następnie oddaje energię, która mierzona jest

przez intensywność fluorescencji czyli intensywność emitowanego przez

nią światła. W zależności od wspomnianej intensywności świecenia

przedstawionego w postaci wykresu świadczy poziom uszkodzenia białka.

Podane właściwości białek, zwłaszcza białek osocza, sprawiają, że stanowi

ono doskonały materiał do badań. Dokładnie opisano zasadę zajścia

procesu fluorescencji, w wyniku której dochodzi do wejścia cząsteczki

w stan wzbudzony. Autorzy pracy starali się przedstawić spektroskopię

jako wygodną, szybką i niezagrażającą życiu metodę, na której działaniu

oparta jest praca wielu urządzeń diagnostycznych, pomagających

w rozpoznaniu różnego rodzaju schorzeń.


190

Literatura

1. Ponczek M. B., Wachowicz B., Oddziaływanie reaktywnych form tlenu i azotu

z białkami, Postępy Biochem., 2005, 51, 2, 140-145

2. Berg J., Tymoczko J., Stryer L., Biochemia, PWN, Warszawa 2007

3. Kłyszejko-Stefanowicz L., Ćwiczenia z Biochemii, PWN, Warszawa 1999

4. Dembińska-Kieć A., Naskalski J., Diagnostyka laboratoryjna z elementami

biochemii klinicznej, Elsevier Urban & Partner, Wrocław 2010

5. Gburek J., Gołąb K., Juszczyńska K., Nerkowy katabolizm albuminy – aktualne

poglądy i kontrowersje, Postępy Hig. Med. Dośw., 2011, 65, 668-677

6. Moriyama Y., Ohta D., Hachiya K., Mitsui Y., Takeda K., Fluorescence behavior

of tryptophan residues of bovine and human serum albumins in ionic surfactant

solutions: a comparative study of the two and one tryptophan(s) of bovine and

human albumins, Journal of Protein Chemistry, 1996, 15, 3, 256-272

7. Myszka W., Dudziak J., Torliński L., Albumina modyfikowana niedokrwieniem-

nowy marker biochemiczny niedokrwienia mięśnia sercowego – przegląd wyników

badań klinicznych, Now. Lek.,2006, 75, 2, 174-178

8. Kordecka M., Piwowar A., Płaskej E., Warwas M., Albumina modyfikowana

niedokrwieniem – specyficzny marker w diagnostyce kardiologicznej?, Wiad.

Lek., 2008, 61, (10-12), 263-268

9. Lakowicz J.R., Principles of Fluorescence Spectroscopy., Springer, USA 2006

10. Jóźwiak Z., Bartosz G., Biofizyka. Wybrane zagadnienia wraz z ćwiczeniami,

Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2005

11. Atkins P. W., Postawy chemii fizycznej, Wydawnictwo Naukowe PWN,

Warszawa 2009

12. Bartosz G., Druga twarz tlenu, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa

2003, 19-120

13. Kalisz O., Wolski T., Gerkowicz M., Smorawski M., Reaktywne formy tlenu

(RFT) oraz ich rola w patogenezie niektórych chorób, Annales Veterinaria,

2007, 62, 87-99

14. Suppan P., Chemia i światło, tł. J. Prochorow, Wydawnictwo naukowe PWN,

Warszawa 1997

15. Paszyc S., Podstawy fotochemii, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1992

16. Bryszewska M., Leyko W., Biofizyka dla biologów, Wydawnictwo Naukowe

PWN, Warszawa 1997

17. Kruszewski S., Ziomkowska B., Cyrankiewicz M., i in., Kinetyka dezaktywacji

kamptotecyny określana metodą analizy ewoluujących widm absorpcji,

Annales Academiae Medicae Bydgostiensis, 2004, 18/3, 53-57

18. Ziomkowska B., Kruszewski S., Siuda R., Cyrankiewicz R., Deactivation rate

of camptothecin determined by factor analysis of steady-state fluorescence and

absorption spectra, Optica Applicata, Vol. XXXVI, No.1,2006

19. Malczewska-Malec M., Kieć-Wilk B., Leszczyńska-Gołąbek I. i wsp.,

Albumina modyfikowana niedokrwieniem jako marker choroby

niedokrwiennej, Kardiologia Polska 2009; 67 (supl.6): 441-448

20. Birkner K., Hudzik B., Poloński L., Nowe potencjalne markery w chorobie

wieńcowej, Folia Cardiologica Excerpta 2011, 6;2, 144-151


191

21. Pokryszko-Dragan A., Zagrajek M. M., Słotwiński K., Taupatie – choroby

zwyrodnieniowe ośrodkowego układu nerwowego związane z patologią białka

tau, Postępy Hig. Med. Dośw., 2005;59: 386-391

22. Brożek-Płuska B., Metody spektroskopowe w diagnostyce zmian

nowotworowych ludzkiego gruczołu piersiowego, Zeszyty naukowe nr 1157,

Wydawnictwo Politechniki Łódzkiej, Łódź 2013

Fluorescencyjna spektroskopia czasowo-rozdzielcza. Proste narzędzie

diagnostyczne

Spektroskopia czasowo-rozdzielcza wykorzystywana była już od dawna. To prosta

i nieskomplikowana metoda, która opiera się na analizie światłem. W przyrodzie istnieje wiele

związków zdolnych do pobrania energii i oddania jej w postaci emisji światła. Do takich

związków zaliczyć można białka. To cecha wynikająca z obecności fenyloalaniny, tryptofanu

i tyrozyny, które stanowią swoistego rodzaju marker. Głównym białkiem osocza jest albumina,

która posiada w swoim składzie tryptofan. Badanie osocza metodą spektroskopową jest

małoinwazyjną metodą badawczą.

Time-resolved fluorescence of spectroscopy. A simple diagnostic tool

Time-resolved spectroscopy has been used for a long time. This is a simple and uncomplicated

method, which is based on the analysis of light. In the nature there are many compounds which

are able to absorb energy and emit it in the form of light emission. Proteins are an example of

such compounds. It is characteristic of the presence of phenylalanine, tryptophan and tyrosine,

which are a kind of marker. The main plasma protein is albumin, which also contains

a tryptophan. The study plasma spectroscopy method is minimally invasive research method.

192



3, Joanna Sikora

4

Fotoluminescencja – proste narzędzie analizy

wpływu pH na aktywność przeciwnowotworową

pochodnych kamptotecyny

1. Wprowadzenie

Co roku na nowotwory choruje oraz umiera coraz większa liczba osób.

Dzięki rozwojowi medycyny i technologii średnia długość życia

społeczeństwa wzrasta, a co za tym idzie rozwijający się i dłużej żyjący

człowiek, wykazuje się zwiększoną podatnością na choroby nowotworowe.

Czynniki takie jak zanieczyszczone środowisko, palenie tytoniu, ale także

niewłaściwa dieta oraz styl życia są przyczynami wzmożonej zachoro-

walności. W przeciągu 10-lecia począwszy od roku 2000, zarejestrowany

został spadek zgonów z powodu nowotworów tylko o 10%, podczas gdy

obniżenie śmiertelności z powodu chorób układu krążenia zmniejszono

o 30% [1]. Choroby nowotworowe są ogromnym problemem, ponieważ

mimo rozwoju medycyny oraz ciągłego udoskonalania technik ich

wykrywania są wciąż w dużej mierze uznawane za choroby nieuleczalne.

Grupy naukowców na świecie nieustannie opracowują nowe leki mogące

okazać się antidotum na choroby nowotworowe. Obecnie za jedną

z potencjalnych substancji uznawanych za antynowotworowe uznaje się

kamptotecynę wraz z jej pochodnymi. Właściwości związku wynikają

prawdopodobnie z mechanizmu jego działania, w trakcie którego dochodzi

do inhibicji topoizomerazy I [2].

2. Cel pracy

Celem niniejszej pracy jest zwrócenie uwagi czytelnika na możliwość

wykorzystania prostych metod spektroskopowych do analizy aktywności

przeciwnowotworowej związków kamptotecyny, których dobroczynne

właściwości są zależne od środowiska pH, w jakim się znajdują.

1 [email protected], Collegium Medicum w Bydgoszczy, Wydział Farmaceutyczny,

Studenckie Koło Naukowe Biofizyki przy Zakładzie Biofizyki [email protected], Collegium Medicum w Bydgoszczy, Wydział Farmaceutyczny, Katedra

i Zakład Patobiochemii i Chemii Klinicznej

[email protected], Collegium Medicum w Bydgoszczy, Wydział Farmaceutyczny, Katedra

i Zakład Biofizyki [email protected], Wydział Lekarski, Katedra Farmakologii i Terapii


na aktywność przeciwnowotworową pochodnych kamptotecyny

193

3. Omówienie

W obecnej dobie nauki oczywistym wydaje się fakt, że wartości pH

(potencjał wodorowy) w organizmie ludzkim są zmienne w zależności od

zajmowanego obszaru. Okazuje się jednak, że wiedza ta z medycznego

punktu widzenia może mieć ogromne znaczenie w leczeniu nowotworów.

Zdrowe komórki występujące w organizmie ludzkim posiadają pH

w granicach ok. 7,2. Podobnie jeżeli chodzi o krew. Wartość pH dla krwi

ludzkiej u zdrowego człowieka kształtuje się między 7,35 a 7,45.

Niemiecki biochemik Otto Heinrich Warburg dokonał ciekawego odkrycia.

Otóż wnętrze komórek nowotworowych posiada środowisko, którego punkt

pH wynosi ok. 6,8, a więc jest nieznacznie przesunięte w stronę środowiska

kwaśnego [2]. Taka zmiana we wnętrzu komórek nowotworowych

dokonuje się poprzez produkcję kwasu mlekowego, która jest wynikiem

niewłaściwie zachodzącego szlaku glikolizy oraz wysokiego poziomu

dwutlenku węgla. Wysokie stężenie CO2 wewnątrz komórek nowo-

tworowych jest spowodowane małym ich dotlenieniem, a więc także ich

słabym ukrwieniem. Wynikiem tych spostrzeżeń było odkrycie, że komórki

nowotworowe, którym zostanie stworzone środowisko alkaliczne nie są

zdolne do przetrwania w nim [3].

W niniejszej pracy fotoluminescencja została okrzyknięta mianem

narzędzia. Takie sformułowanie jest w pełni uzasadnione. Światło posiada

zdolność do oddziaływania z różnymi układami molekularnymi, także

z tkankami czy cząsteczkami np. we krwi czy osoczu. W wyniku tych

oddziaływań zachodzą takie procesy jak rozpraszanie, skupianie,

fotoluminescencja, absorpcja itd. Na podstawie unikatowego zachowania

światła po jego zetknięciu się z układem molekularnym, można uzyskać

informacje na temat różnego rodzaju właściwości badanego obszaru czy

związku [25].

3.1. Kamptotecyna

Kamptotecyna jest naturalnym roślinnym związkiem wywodzącym się

z drzewa Camptotheca acuminata (japońska nazwa to xi shu – drzewo

szczęścia).

Dobroczynne właściwości antynowotworowe kamptotecyny od

dawnych czasów wykorzystywali już Chińczycy między innymi w leczeniu

białaczki [4]. Kamptotecyna jest alkaloidem i została wyizolowana w 1966

r. podczas, gdy jej właściwości przeciwnowotworowe zostały potwierdzone

8 lat wcześniej przez Monroe E. Walla i Jonathana Hartwella.

Wyizolowany alkaloid używany był w leczeniu nowotworów przewodu

pokarmowego w latach 70-tych, jednak musiano zaprzestać tych praktyk

z powodu występujących biegunek oraz krwotocznego zapalenia pęcherza [5].


194

Z chemicznego punktu widzenia pięciocykliczną cząsteczkę kampto-

tecyny można podzielić na trzy części: część chinolinowa, indolizynowa,

a także część α-hydroksylaktonowa. Zależnie od środowiska w jakim

obecnie znajduje się cząsteczka, może dojść do zamknięcia lub otworzenia

się pierścienia α-hydroksylaktonowego (Rys. 1). W przyrodzie wyróżnia się

dwie formy kamptotecyny: laktonową – stabilną w środowisku kwaśnym,

gdzie wartości pH nie przekraczają 5,5 oraz formę karboksylową stabilną

w pH powyżej 9, w którą do przekształcenia dochodzi w środowisku

o wyższym pH. Pierwsza z wspomnianych warunkuje właściwości

przeciwnowotworowe związku, gdzie pierścień jest zamknięty. Forma

karboksylowa natomiast, do której przekształcenia dochodzi w wyniku

hydrolizy z formy laktonowej jest nieaktywną chemoterapeutyczną postacią

związku, w której pierścień ulega otworzeniu [6]. Mimo niestabilności

formy laktonowej i szybkiego jej przechodzenia w środowisku

fizjologicznym do formy karboksylowej działanie przeciwnowotworowe

kamptotecyny jest niepodważalne i w latach 80’ ponowiono badania nad

tworzeniem leków kamptotecynopochodnych, których celem jest

utworzenie kompleksu topoizomeraza I – DNA [7].

Rys. 1. Wzory strukturalne formy laktonowej i karboksylowej kamptotecyny [23]

3.2. Topoizomeraza I i jej inhibitory

Życie komórki oraz prawidłowe funkcjonowanie kwasu deoksyrybo-

nukleinowego jest zapewniane przez enzymy jądrowe czyli topoizomerazy.

Niezwykły mechanizm działania tych enzymów polega na wprowadzaniu

oraz usuwaniu tak zwanych superskrętów DNA. W topoizomerazie



195

występującej w organizmie ludzkim wyróżnia się 4 domeny otaczające

centralne zagłębienie, w której wnętrzu znajduje się reszta aminokwasu

tyrozyny (tyr 723). Rola tyrozyny polega na przecięciu DNA w reakcji

katalizowanej przez topo I [8]. Cząsteczka DNA wiąże się z wewnętrzną

częścią zagłębienia enzymu, w trakcie której grupa –OH tyr723 działa na

jedną z nici DNA z grupą fosforanową w wyniku czego dochodzi do

powstania wiązania fosfodiestrowego enzym-DNA. Rozcięta dzięki zajściu

tego procesu cząsteczka DNA uwalnia jedną z grup OH 5’, po czym dzięki

energii z superhelikalnych skrętów może dojść do skrętu nici wokół

nieprzeciętego łańcucha. Poprzez taką rotację DNA superskręty zostają

wyeliminowane. To właśnie topoizomeraza I stoi na straży szybkości

rotacji, dokładnie kontrolując w ten sposób zajście procesu, a kiedy już

aktywowana reszta tyrozynowa powraca do formy początkowej

topoizomeraza odłącza się od DNA [9].

Działanie inhibitorów topoizomerazy I, w tym kamptotecyny i jej

pochodnych, polega na wiązaniu się w kompleks DNA-topo I oraz jego

stabilizacji. Dzięki nim hamowana jest ponowna ligacja rozdzielonych już

nici jednak sam proces rozdzielania nie jest zakłócany, co w efekcie

doprowadza do nagromadzania się pęknięć w DNA. Te jednoniciowe

pęknięcia nie szkodzą samej komórce i są odwracalne o ile nie dojdzie

jednak do spotkania się widełek replikacyjnych z uszkodzoną nicią kwasu

deoksyrybonukleinowego. Jeżeli jednak takie zetknięcie nastąpi, dojdzie do

trwałego uszkodzenia obu nici DNA doprowadzając do śmierci komórki.

Na podstawie takiego działania inhibitorów topoizomerazy można

stwierdzić, że są one terapeutykami dla fazy S cyklu komórkowego pełniąc

rolę cytostatyczną w trakcie zachodzącej syntezy DNA [5].

3.3. Pochodne kamptotecyny wykorzystywane w lecznictwie

Topotekan to pochodna kamptotecyny rozpuszczalna w wodzię dzięki

przyłączeniu w pozycji 9-C grupy N,N-dimetyloaminometylowej (Rys. 2)

[10]. Topotekan jest wykorzystywany w leczniu m.in. raka jajnika,

drobnokomórkowego raka płuc, a także raka szyjki macicy [11]. Dużą

zaletą tego związku jako leku (np. Hycamtin w postaci chlorowodorku

topotekanu), jest jego nienagromadzanie się w organizmie człowieka dzięki

krótkiemu okresowi półtrwania. Niestety jak każdy lek tak i topotekan

powoduje skutki uboczne do których zalicza się m.in. gorączkę,

krwiomocz, wymioty, bięgunkę oraz neutropenię [12].


196

Rys. 2. Wzór strukturalny topotekanu [24]

Irinotekan (SN-38) jest kolejną pochodną kamptotecyny. W pozycji

C-10 grypy karbonylowej przyłączony jest fragment bispiperydynowy (Rys.

3). Enzym karboksyesterazy hydrolizuje grupę karboksypiperydynową do

powstania 7-etylo-10-karboksybispiperydyny SN-38 która jest aktywnym

metabolitem irynotekanu. Tak powstały związek wykazuje silne działanie

przeciwnowotworowe jako inhibitor topoizomerazy I [10]. Lek stosowany

jest w leczeniu nowotworów płuc (rak drobnokomórkowy i nie

drobnokomórkowy), okrężnicy i odbytnicy, ale także jako skuteczny

terapeutyk w leczeniu raka piersi, jajników, szyjki macicy nowotworach

złośliwych szyi i głowy oraz wielu innych [12]. Powstały SN-38 jest silnie

lipofilny, jego okres półtrwania jest dłuższy niż w postaci topotekanu

i aktualnie jest stosowany w terapii skojarzonej z cisplatyną [11].

Rys. 3. Wzór strukturalny irinotekanu [24]



197

3.4. Kamptotecyna a albumina

Albumina to przeważające ilościowo białko osocza (ok. 60%), jej

prawidłowe stężenie w organizmie ludzkim wynosi 34-47g/l, a masa

cząsteczkowa to ok. 69 kDa. Białko to charakteryzuje elipsoidalny kształt.

Taka cecha powoduje, że lepkość osocza nie zwiększa się przez co

transport białka w krwioobiegu jest łatwy. Dodatkowym atutem jest

znaczna ilość aminokwasów polarnych z hydrofilnymi grupami takimi jak

grupa hydroksylowa, tiolowa, aminowa i karboksylowa, dzięki czemu

albumina jest dobrze rozpuszczalna w wodzie i osoczu [13]. Głównym

organem, który syntezuje albuminę jest wątroba (ok. 8-14g białka na dobę).

Łącznie jest to w przybliżeniu 25% całej ilości albuminy. W początkowym

etapie reakcji dochodzi do syntezy tego białka jako preproteiny, dochodzi

do usunięcia peptydu sygnalnego w procesie jego przejścia do tak zwanych

cystern w szorstkiej siateczce śródplazmatycznej. W związku z tym, że to

właśnie wątroba jest głównym organem syntezy albumin wiele chorób

dotyczących tego organu charakteryzuje się ogólnym zmniejszeniem białka

w osoczu ludzkim [14].

Albumina zbudowana jest z 585 reszt aminokwasowych oraz zawiera

17 mostków disiarczkowych. Dzięki enzymom tnącym białka tzw.

proteazą, można wyodrębnić 3 główne domeny tego białka pełniące różne

funkcje. Zarówna pierwsza, druga jak i trzecia domena dzieli się na 2

części (poddomeny) co wyjaśnia możliwość wiązania się z albuminą wielu

różnych cząsteczek [15]. W organizmie ludzkim białko to w dużej mierze

jest białkiem transportowym, przenosząc między innymi jony wielu

różnych metali takich jak na przykład jony miedzy czy wapnia (połowa

Ca2+

znajdującego się w organizmie człowieka jest związanych z albu-

miną), ale również i z wolnymi kwasami tłuszczowymi wywodzących się

z adipocytów (komórek tłuszczowych) transportując je do różnych tkanek.

Albumina ma zdolność do wiązania wielu leków w tym do wiązania się

z kamptotecyną i jej pochodnymi, silnie wpływając przy tym na jej

skuteczność działania oraz farmakokinetykę [15]. Znając właściwości

kamptotecyny oraz działanie formy karboksylowej oraz laktonowej wiemy

już, że ta pierwsza ma większe powinowactwo do wiązania się

w fizjologicznych warunkach (chodzi tu o warunki pH) z albuminą niż

forma laktonowa co ma znaczenie w jej przeciwnowotworowym działaniu.

Mimo, że w warunkach in vitro badacze są w stanie w prosty sposób

doprowadzić do przejścia z formy karboksylowej do formy laktonowej i na

odwrót (zmiana warunków pH), w organizmie ludzkim proces ten jest

niemożliwy ze względu na to, że w osoczu w którym znajduje się

albumina, dochodzi tylko do procesu hydrolizy (Rys. 4.)


198

Rys.4. W warunkach fizjologicznych forma laktonowa przechodzi w formę karboksylową.

Wykres pokazuje jak we krwi zmniejsza się stężenie formy laktonowej [25]

Ze względu na niemożność zajścia w takich warunkach laktonizacji, jest

to proces nieodwracalny. Po mniej więcej 120 minutach od wprowadzenia

kamptotecyny w formie laktonowej do roztworu z albuminą, aktywna

przeciwnowotworowo jej postać w procesie hydrolizy zanika. Z powyższego

procesu można wywnioskować, że najistotniejsze dla długotrwałego

działania leku jest jak najdłuższe utrzymanie jego odpowiedniego stężenia

w organizmie pacjenta w postaci niezwiązanej z białkiem. Tylko to

gwarantuje farmakologiczną aktywność i działanie przeciwnowotworowe.

O ile w warunkach in vitro jest to stosunkowo proste ze względu na

operowanie zmianą pH, o tyle in vivo jest to utrudnione ze względu na

zachowanie homeostazy i pH fizjologicznego. To właśnie w związku z tym

poszukiwane były wcześniej wspomniane związki pochodne kamptotecyny

(topotekan, irinotekan), stabilne w warunkach fizjologicznych,

o zachowanych właściwościach przeciwnowotworowych, łatwo wiążące się

z obszarem zmienionym nowotworowo [6, 13, 22].



199

3.5. Fotoluminescencja

Czym jest fotoluminescencja najlepiej w sposób graficzny opisuje

schemat Jabłońskiego, przedstawiający procesy fizyczne zachodzące

w cząsteczce, która to oddziałuje z fotonami (Rys. 5.). Schemat w prosty

sposób demonstruje tak zwane stany elektronowe cząsteczki zarówno

trypletowe jak i singletowe oraz wskazuje przepływ energii z jednego do

drugiego i odwrotnie. Najczęściej schemat wykorzystuje się do

przeanalizowania fluorescencji oraz fosforescencji czyli tak zwanej

luminescencji [16].

Rys. 5. Diagram Jabłońskiego (wg Lakowicz 2006) [19]

Fluorochrom – jego mianem nazywamy cząsteczkę, która jest zdolna do

emitowania światła, po uprzednim pobraniu energii. W początkowym

stadium (to znaczy w stanie podstawowym) cząsteczka znajduje się

w stanie singletowym (na rysunku 5 oznaczony jako S0). Działająca na

cząsteczkę odpowiednio duża energia powoduje jej przejście na wyższy

stan, także singletowy. Foton jest absorbowany z bardzo dużą szybkością

rzędu nawet 10-15

s [16]. Istnieje reguła mówiąca o tym że elektrony mogą

przechodzić miedzy stanami, których multipletowość jest taka sama.

Diagram Jabłońskiego ma na celu łatwiejsze wyróżnienie oraz

zademonstrowanie zjawisk fizycznych, które przebiegają we wnętrzu

cząsteczki już po zaabsorbowaniu przez nią fotonów. W tym miejscu

należy zaznaczyć, że do takich procesów oprócz wymienionych powyżej

zjawisk fotoluminescencji czyli fosfore- i fluorescencji zalicza się także tak

zwane procesy bezpromieniste. Konwersja wewnętrzna to proces

bezpromienisty dotyczący zarówno przejść międzysystemowych czyli

przejścia między stanami o innej multipletowości, oraz przejść

elektronowych między stanami gdzie multipletowość jest taka sama [16].


200

Analizując diagram Jabłońskiego należy zwrócić uwagę na dwa terminy

dotyczących rodzajów fotoluminescencji. Fluorescencja wiąże się z przej-

ściem ze stanu S1 do S0, w trakcie czego dochodzi do „wyświecenia”.

W trakcie fosforescencji cząsteczka przechodzi ze stanu T1 do stanu S0.

Różnica występuje także w czasie opóźnienia świecenia od momentu

absorbancji fotonu. Dla fluorescencji jest to czas rzędu 10-8

s, gdzie

fosforescencja potrzebuje nawet do kilku sekund. Jest to związane z czasem

życia cząsteczki w stanie S i T [17, 18, 19].

3.6. Fluorescencja, a określanie właściwości kamptotecyny

Spektroskopowe pomiary czasu życia fluorescencji, pomiary zaników

anizotropii fluorescencji oraz analizy widm fluorescencji kamptotecyny są

bardzo istotne w badaniach właściwości nad aktywnością kamptotecyny

zależną od pH, w jakim się znajduje. Na podstawie wyników tych analiz

można dowiedzieć się, co dzieje się z cząsteczką w czasie życia stanu

wzbudzonego, po czym możliwe jest określenie miejsca, w jakim znajdują

się fluoryzujące cząsteczki i czy są one wolne czy związane oraz

określenie, jaki jest współczynnik powinowactwa kamptotecyny do białek

czy błon komórkowych.

Im większe powinowactwo pochodnych kamptotecyny do tkanki, tym

większe ich właściwości przeciwnowotworowe. Wynika to z faktu, że

w organizmie związki kamptotecyny w formie laktonowej (forma stabilna

w środowisku kwaśnym) ulegają hydrolizie do formy karboksylowej (pH

zasadowe), natomiast co ciekawe laktonowa forma, która uległa już

związaniu z błoną nie ulega przemianie do formy nieaktywnej nowo-

tworowo. Przed taką kumulacją cząsteczek aktywnych w tkance zmie-

nionej, może jednak dojść do trwałego związania się kamptotecyny z albu-

miną we krwi co spowoduje zmniejszenie się ilości formy laktonowej zanim

dotrze ona do miejsca docelowego, w którym ma się nagromadzić [19, 25].

4. Podsumowanie

Światło jest cennym narzędziem badawczym. Opisany przypadek jego

wykorzystania jest dobrym przykładem na używanie światła w badaniach

farmaceutyków. Zjawiska fotoluminescencji towarzyszące działaniu

światła są w stanie dostarczyć badaczowi istotnych informacji na temat

analizowanego związku czy tkanki, z których można wyczytać tak jak

w przypadku kamptotecyny zależność kamptotecyny od środowiska pH

w jakim się znajduje na jej działanie przeciwnowotworowe [25].

Z niniejszej pracy jasno wynika, że w pH oscylującym wokół 6,8

hydroliza aktywnej przeciwnowotworowo formy laktonowej kamptotecyny

zachodzi wolniej. Adams i in. [2] w swojej publikacji tłumaczą ten



201

wolniejszy proces uwodnienia cząsteczki w takich warunkach środo-

wiskowych jej budową. W pH powyżej 7 dochodzi do otworzenia się

pierścienia E, co jak już wiemy prowadzi do unieaktywnienia czynnej

antynowotworowo postaci związku. Istnieją liczne doniesienia wskazujące,

że hydroliza procesu zachodzi tym szybciej im wyższe jest pH [2],

a metody pomiaru fotoluminescencji są w stanie bardzo dokładnie (poprzez

np. pomiar widm absorbcji) określić m.in. czy w danym pH, pochodna

kamptotecyny jest aktywna przeciwnowotworowo oraz czy związała się

z obszarem patologicznym [6, 20, 21].

Literatura

1. Dane statystyczne dotyczące przyczyn zgonu, 2012,

http://ec.europa.eu/eurostat/statistics-

explained/index.php/Causes_of_death_statistics/pl, data wejścia na stronę

2. Adams D. J., Wahl M. L., Flowers J. L., Sen B., Colvin M., Dewhirst M. W.,

Manikumar G., Wani M. C., Camptothecin analogs with enhanced activity

against human breast cancer cells. II. Impact of the tumor pH gradient,

Cancer Chemother Pharmacol 2006; 57 145-154

3. Dr Otto Heinrich Warburg o głównej przyczynie powstawania nowotworów,

CudpH, http://cudph.pl/dr-otto-heinrich-warburg-o-glownej-przyczynie-

powstawania-nowotworow

4. Van Wyk B. E., Wink M., Rośliny lecznicze świata. Ilustrowany przewodnik,

MedPharm Polska, Wrocław 2008, 76

5. Brunton L. L. i in., Analogi kamptotecyny, Farmakologia Goodmana

i Gilmana, Tom II, Wydawnictwo Czelej, Lublin 2007, 1450-1453

6. Ziomkowska B., Kruszewski S., Cyrankiewicz M., Stolarska P., Siepielska A.,

Badanie oddziaływania kamptotecyny i 7-etylo-10-hydroksykamptotecyny

z białkami osocza metodą pomiaru anizotropii fluorescencji, Medical and

Biological Sciences, 2007, 21 (4) 127-132

7. Perry M. C., The chemotherapy source book, Williams & Wilkins, Baltimore

1996, 425

8. Berg J. M. i in., Topoizomerazy przygotowują podwójną helisę DNA do

rozplecenia, Biochemia, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2011, 794

9. Berg J. M. i in., Topoizomerazy typu I odpowiadają za relaksację struktur

superhelikalnych, Biochemia, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa

2011, 794-795

10. Cragg G. M. i in., Anticancer agents from natural products, CRC Press, Boca

Raton FL 2012, 6-16

11. Katzung B. G. i in., Farmakologia ogólna i kliniczna, Wydawnictwo Czelej,

Lublin 2012, 1096

12. Kostowski W., Herman Z. S., Inhibitory topoizomerazy, Farmakologia.

Podstawy farmakoterapii, Tom II, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa

2008, 423-425


202

13. Bańkowski E., Biochemia. Podręcznik dla studentów studiów licencjackich

i magisterskich, MedPharm Polska, Wrocław 2014, 36

14. Murray R. K. i in., Albumina jest głównym białkiem ludzkego osocza, Biochemia

Harpera, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2002, 924-925

15. Davidson V. L., Sittman D. B., Biochemia, Urban & Partner, Wrocław 2002, 44

16. Ślusarek G., Fluorescencja i fosforescencja, Biofizyka molekularna, Red.

Grajkowska B., Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2011, 464-465

17. Jaroszyk F., Zjawiska fizyczne zachodzące w cząsteczkach wzbudzonych.

Fotoluminescencja. Schemat Jabłońskiego, Biofizyka, Wydawnictwo

Lekarskie PZWL, Warszawa 2011, 783-786

18. Jóźwiak Z., Bartosz G., Polaryzacja fluorescencji, Biofizyka. Wybrane

zagadnienia wraz z ćwiczeniami, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa

2008, 136-137

19. Lakowicz J. R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, Kluwer Academic

/Plenum Publishers, New York 1999, 303-304

20. Mi Z., Burke T. G., Differential Interactions of Camptothecin Lactone and

Carboxylate Forms with Human Blood Components, Biochemistry, 1994, 33

10325-10336

21. Ziomkowska B., Cyrankiewicz M., Kruszewski S., Hydroxycamptothecin

Deactivation Rates and Binding to Model Membranes and HSA Determined by

Fluorescence Spectra Analysis, Combinatorial Chemistry & High Throughput

Screening, 2007, 10 (6) 459-465

22. Ziomkowska B., Kruszewski S., Siuda R., Cyrankiewicz M., Określenie

kinetyki dezaktywacji kamptotecyny metodą analizy ewolucji czasowej widm

absorbancji i fluorescencji, XIII Krajowa Konferencja Naukowa

"Biocybernetyka i inżynieria biomedyczna". Gdańsk, 10-13 IX 2003. T. 2.

Biopomiary. Red. A. Nowakowski, [B.m., 2003] s. 1156-1161

23. Ziomkowska B., Cyrankiewicz M., Kruszewski S., Determination of

Hydroxycamptothecin Affinities to Albumin and Membranes by Steady-State

Fluorescence Anisotropy Measurements, Combinatorial Chemistry & High

Troughput Screening 2007, 10, 486-492

24. Naumczuk B., Synteza I badanie właściwości chemicznych I biologicznych

potencjalnych inhibitorów topoizomerazy I oddziaływujących z oligomerami

DNA, Praca przedstawiona Radzie Naukowej Instytutu Chemii Organicznej

Polskiej Akademii Nauk w celu uzyskania stopnia doktora nauk chemicznych,

Warszawa 2015

25. Kruszewski S., Zastosowanie zjawisk fotoluminescencji w badaniach

farmaceutycznych oraz w diagnostyce i terapii przeciwnowotworowej, Wykład

wygłoszony podczas Ogólnopolskiego Dnia Nauki 2005, Wiadomości

Akademickie 19, 2005



203

Fotoluminescencja – proste narzędzie analizy wpływu pH na

aktywność przeciwnowotworową pochodnych kamptotecyny

Kamptotecyna jest alkaloidem pochodzącym z drzewa Camptotheca acuminata. Ta substancja

należy do inhibitorów topoizomerazy I. Kamptotecyna ze względu na działania niepożądane nie

jest wykorzystywana w lecznictwie bezpośrednio, ale za pomocą pochodnych takich jak

irynotekan czy topotekan. Działanie przeciwnowotworowe pochodnych kamptotecyny jest

zależne od pH, w jakim się znajdują. Dzięki fotoluminescencji, możliwe jest zbadanie aktywności

kamptotecyny.

Photoluminescence – a simple tool to analyze the impact of pH on the

antitumor activity of camptothecin derivatives

Camptothecin it is an alkaloid which is produced of the Camptotheca acuminate tree. This

substance belongs to the inhibitors of topoisomerase I. The Camptothecin has many adverse drug

reactions and is not used in therapeutics directly, but with using its derivatives such as irinotecan

and topotekan. The antitumor effect of camptothecin derivatives is dependent on the pH at which

they are located. By the photoluminescence, to research the activity of camptothecin it is possible.

204

Arkadiusz Goede1, Maciej Gawroński

2, Tomasz Wandtke

3

Technika DNA origami

– potencjalne zastosowania

1. Wprowadzenie

DNA przez wzgląd na swoje cechy takie jak: rozpoznawanie molekularne,

programowalność, prostota syntezy, zdolność do samoorganizacji, oraz

łatwość przewidzenia struktury w nanoskali, wydaje się być wspaniałą

molekułą umożliwiającą tworzenie złożonych struktur dwu i trój-

wymiarowych.

Nanotechnologia DNA wykorzystuje w dużej mierze zasadę samoistnego

łączenia się dwóch pojedynczych nici DNA w podwójną helisę za pomocą

wiązań między komplementarnymi parami zasad. Wiązanie się adeniny

wyłącznie z tyminą i cytozyny z guaniną pozwala na programowanie procesu

budowy struktur z DNA. Podwójna helisa DNA natywnie posiada liniową

nierozgałęzioną topologię umożliwiającą powstanie wyłącznie struktur

jednowymiarowych [1]. Jednakże porównując liniową, nierozgałęzioną

strukturę cząsteczki DNA z cząsteczką, która ma np. jedno rozgałęzienie

można zauważyć podobieństwo. Każda ze wspomnianych cząsteczek posiada

100% sparowanych komplementarnie ze sobą zasad. Jedyną różnicą jest

występowanie w rozgałęzionej cząsteczce dodatkowego ramienia, które może

mieć dowolną długość – (Rysunek 1).

Dodatkowe ramie nie wpływa jednak w żaden sposób na komple-

mentarność pomiędzy pierwszą a drugą nicią DNA, jednakże replikacja takiej

cząsteczki przez polimerazę DNA jest nieskuteczna. Rozgałęzione cząsteczki

DNA nie są tylko wytworem sztucznym. Rozgałęzione struktury kwasu

nukleinowego naturalnie występują i są używane, głównie jako nietrwałe

półprodukty w procesach replikacji, rekombinacji i naprawy.

1 [email protected], Zakład Genoterapii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja

Kopernika, Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy, http://www.cm.umk.pl 2 [email protected], Studenckie Koło Naukowe Terapii Genowej, Zakład Genoterapii,

Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Collegium Medicum im. Ludwika

Rydygiera w Bydgoszczy, http://www.cm.umk.pl 3 [email protected]; Zakład Genoterapii, Wydział Lekarski, Uniwersytet Mikołaja

Kopernika, Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy, http://www.cm.umk.pl

Technika DNA origami – potencjalne zastosowania

205

Rysunek 1. Porównanie natywnej dwuniciowej liniowej cząsteczki DNA (a) z cząsteczką DNA

rozgałęzioną (b) [2]

2. Początek nanotechnologii DNA – badania Seeman’a

Seeman jako pierwszy zdał sobie sprawę z możliwości wytworzenia

sztucznych punktów rozgałęzień DNA. Obserwacja DNA podczas jego

kopiowania w czasie podziału komórkowego była krokiem milowym dla

Seeman’a. Podczas powielania materiału genetycznego podwójna nić DNA

może się częściowo rozszczepić i przyłączyć komplementarnie do innej

nici DNA. W taki sposób naturalnie powstaje punkt rozgałęzienia,

a powstała cząsteczka nie wykazuje już liniowej topologii. Struktury

wytworzone podczas badań Seeman’a były raczej niewielkie. Budowa

nowych struktur wymagała żmudnego projektowania, a później syntezy

wszystkich składowych nici DNA. Ograniczenie stanowiło również

wykorzystanie syntezatorów DNA mogących produkować nici DNA

o długości dochodzącej tylko do setek par zasad. Jest to niestety

niewystarczające do wytworzenia dużych, wielowymiarowych i złożonych

struktur DNA [3].

Początkowe próby użycia molekuł DNA o pojedynczym punkcie

łączenia nie były udane. Problem stanowiła zbytnia elastyczność

komponentów DNA wykorzystywanych w budowie skomplikowanych

struktur. Pojedynczy punkt wiązania nie był wstanie zapewnić stabilnego


206

i silnego połączenia między cząsteczkami, uniemożliwiając tym samym

konstrukcję struktur wyższego rzędu [4]. Dopiero zastosowanie

wielorozgałęzionych łańcuchów pozwoliło osiągnąć wymaganą sztywność

i stabilność połączeń. Podwójnie rozgałęziony motyw po raz pierwszy

wykorzystano w 1993 roku i od tego czasu stał się motywem często

wykorzystywanym w nonotechnologii DNA. Złożone struktury DNA

często składają się z powtarzalnych komponentów utrzymywanych razem

dzięki lepkim końcom na każdym z nich [5-12].

3. Lepkie końce w nanotechnologii DNA

Lepkie końce wykorzystuje się do produkcji zrekombinowanych

liniowych cząsteczek DNA od prawie 35 lat [13]. Połączenie kohezji

lepkich końców z rozgałęzionymi cząsteczkami DNA, umożliwia

produkcję wielu złożonych struktur o różnej topologii przy stosunkowo

niewielkim wysiłku. Rozpoznanie jednej nici DNA przez inną nić jest

wykorzystywane w wielu typach nanotechnologii DNA i biologii

molekularnej. Szczególną cechą strukturalną nanotechnologii DNA jest to,

że wykorzystuje ona dobrze zdefiniowane struktury w miejscu łączenia się

dwóch helis DNA.

4. Powstawanie struktur rozgałęzionych

Kluczowym założeniem podczas analizy krystalicznej struktury 3D

cząsteczki DNA jest to, że kiedy dwie cząsteczki DNA są utrzymywane

razem przez lepkie końce, a znane są współrzędne w analizowanej

strukturze jednej z cząsteczek, to są znane również współrzędne drugiej. W

przypadku użycia innego systemu rozpoznawania biologicznego opartego

np. na oddziaływaniach przeciwciało-antygen, trzeba byłoby opracować

zależności przestrzenne dwóch partnerów w reakcji wiązania w każdej

parze. Wiele różnych lepkich końców posiada struktury, które są niemal

identyczne. Dlatego też w strukturalnej nanotechnologii DNA wyko-

rzystuje się również różne metody kohezji: kohezję PX, dzielenie się

krawędziami, kohezję boczną [14‚18]. Wytworzenie cząsteczek rozga-

łęzionego DNA przy wykorzystaniu systemu biologicznej, wzajemnej

wymiany nici nie jest trudne. Rysunek 2 przedstawia kilka motywów

uzyskanych w ten sposób, które okazały się ważne w strukturalnej

nanotechnologii DNA. Połączenie Holiday’a (ang. Holliday junction; HJ)

występuje naturalnie jako biologiczny półprodukt w rekombinacji

genetycznej. Powstaje na skutek pojedynczej wzajemnej wymiany między

podwójnymi helisami DNA. Podwójnie skrzyżowana cząsteczka (ang.

Double cross-over; DX) jest półproduktem pochodzącym z dwóch wymian

pomiędzy podwójnymi helisami podczas mejozy. Cząsteczka potrójnie


207

skrzyżowana (ang. Triple crossover; TX) generowana jest przez dwie

wzajemne wymiany pomiędzy helisą cząsteczki DX a inną podwójną helisą

DNA [19-22]. Dwie nici DNA tworzące podwójną helisę mają przeciwną

biegunowość względem siebie. Wymiana może odbywać się pomiędzy

nićmi tej samej biegunowości lub przeciwnej. HJ, DX i TX są wynikiem

wymiany między nićmi o przeciwnej polaryzacji. Cząsteczka PX

charakteryzuje się wymianą pomiędzy nićmi tej samej polaryzacji [23].

Wymiana w motywie PX występuje w każdym możliwym miejscu, gdzie

nici są zestawione ze sobą. Wariant JX2 pozbawiony jest dwóch połączeń

w środku, w porównaniu do cząsteczki PX. Wykorzystuje się go do

tworzenia wytrzymałych nanomechanicznych „urządzeń”. Opisane wyżej

cząsteczki: DX, TX, PX, JX2 należą do grupy motywów sztywnych

i wytrzymałych i zostały przedstawione na rysunku 2 [18, 24].

Rysunek 2. Przegląd wybranych motywów rozgałęzionych [2]

Rysunek 3 przedstawia pojedyncze miejsce rozgałęzienia HJ. Każde

z czterech podwójnych spiralnych ramion jest zakończone lepkim końcem.

Rysunek pokazuje cztery z tych skrzyżowań zmontowanych razem

w strukturę czworokąta poprzez łączenie się lepkich końców. Lepkie końce

oprócz występowania wewnątrz wspomnianej struktury, występują również

na jej zewnętrznej części, co umożliwia jej rozszerzenie o kolejne

podjednostki składowe w postać dwuwymiarowych tablic krystalicznych.

Dwuwymiarowość wspomnianych tablic jest tak naprawdę tylko umowna,

gdyż natura DNA w postaci podwójnej helisy tak naprawdę czyni je

systemem 3D, a nie systemem 2D. W ten sposób rozgałęzione cząsteczki

DNA zaopatrzone w lepkie końce mogą być połączone w obiekty 3D

i tworzyć struktury w postaci siatki.


208

Rysunek 3. Schemat tworzenia dwuwymiarowych tablic krystalicznych z czterech HJ [2]

Istnieje szereg enzymów, które mogą być stosowane podczas prac

z DNA: ligazy przyłączają kowalencyjnie lepkie końce; enzymy restryk-

cyjne, mogą być stosowane do tworzenia interesujących odcinków DNA

jak i do celów analitycznych; egzonukleazy mogą zostać użyte w celu

usuwania nieprawidłowych komponentów; topoizomerazy natomiast można

wykorzystać do diagnozowania problemów topologicznych [7, 13, 25‚27].

5. Minimalizacja symetrycznych sekwencji (ang. Sequence

symetry minimalization)

W inżynierii molekularnej ważne jest zaprojektowanie elementów, które

mają możliwość łączenia się tylko w jeden sposób, w celu wyeliminowania

możliwości powstawania dwóch lub więcej konkurencyjnych, niespecy-

ficznych produktów. Ważne jest również oszacowanie termodynamiki

w zależności od użytych sekwencji i wybrania najbardziej optymalnej dla

powstania zamierzonego produktu [28].

Rysunek 4 przedstawia czteroramienne skrzyżowanie DNA. Ramiona są

długie na 8 nukleotydów, więc każda z nici zawiera ich 16. 16 nukleotydów

dzieli się na szereg pokrywających się elementów (w tym przypadku 13

tetramerów). Każdy z tych elementów, takich jak sekwencja CGCA czy

GCAA jest unikalny. Ponadto każdy tetramer obejmujący „zakręt”

(np. sekwencja CTGA) nie posiada komplementarnej sekwencji (TCAG)

w żadnym miejscu rozgałęzionej cząsteczki. Dzięki takiemu zaprojektowaniu

sekwencji w całej cząsteczce jedyną konkurencję dla docelowych oktamerów

mogą stanowić trimery, takie jak sekwencja ATG. Wspomniane podejście

zakłada, że podwójne helisy są najkorzystniejszymi strukturami, które może


209

stworzyć DNA i że formowanie się podwójnej helisy doprowadzi do

pomyślnego utworzenia punktów odgałęzienia. Powodzenie tego sposobu

polega na kooperatywności tworzenia podwójnej helisy DNA.

Rysunek 4. Schemat czteroramiennej cząsteczki DNA [2]

Zbudowano jak dotąd kilka rozgałęzionych cząsteczek zawierających

trzy, cztery, pięć, sześć, osiem i dwanaście ramion. Z wielu badań wynika,

że kąt między ramionami wydaje się być elastyczny. W związku z tym

wcześniejsze konstrukcje były stałe pod względem topologii, a nieko-

niecznie pod względem ich trójwymiarowej struktury [29‚34].

6. Tablice DNA (ang. DNA arrays)

Po stworzeniu szeregu struktur rozgałęzionych, przedmiotem

zainteresowania stało się połączenie różnych gatunków struktur ze sobą.

Podczas budowy tablic DNA wymagana jest wysoka, strukturalna

integralność między poszczególnymi komponentami. Jak wspomniano

wyżej, pojedyncze skrzyżowanie, takie jak struktura HJ jest stosunkowo

elastyczne. Cząsteczki DX wykazują znacznie większą sztywność,

w porównaniu do podwójnej helisy DNA, czy cząsteczek HJ [8, 35].

Molekuły TX i PX wykazują podobne cechy pod względem sztywności co


210

DX. Właściwości te stały się podwaliną do użycia ich jako materiału

budulcowego w celu stworzenia tablic DNA [22, 36]. Tablice DNA

okazały się użyteczne jako rusztowanie podczas montażu urządzeń

nanomechanicznych. Przy użyciu komponentów DNA możliwe jest

wytworzenie swoistego rodzaju szablonów DNA, które zawierają

przewidywalne właściwości opierając się na kohezji lepkich końców

indywidualnych motywów. Szablony DNA można modyfikować poprzez

enzymatyczne dodanie lub usunięcie poszczególnych cech. Oprócz

tworzenia tablic z cząsteczek DX, możliwe jest również ich wytwarzanie

z periodycznych cząsteczek TX [22, 37]. Dwuwymiarowe struktury DNA

mogą również zostać zbudowane przy użyciu struktur DNA o wyglądzie

równoległoboków. Motywy te są wytwarzane przez połączenie czterech

HJ-podobnych rozgałęzień. W przeciwieństwie do DX, TX oraz cząsteczek

PX, dwie domeny cząstek HJ nie są równoległe do siebie [38‚40].

Zastosowanie cząsteczek DX pozwoliło na stworzenie różnych motywów,

w tym równoległoboków, czy trójkątów [41]. Tablice DNA, niebawem po

ich stworzeniu zostały zastosowane między innymi w celu stworzenia

rusztowania dla nanoczasteczek [42].

7. Tworzenie struktur 3D

Nanostruktury 3D powstają najczęściej przez składanie płaskich figur.

Innym sposobem montażu struktur trójwymiarowych jest tworzenie stosów

płaskich struktur. Jest to możliwe dzięki zastosowaniu miejscowo-

specyficznych sond w każdej warstwie, które selektywnie wiążą się

z konkretnym miejscem w innej warstwie.

Pierwszy obiekt trójwymiarowy zbudowany z DNA miał postać sześcianu,

w którym krawędzie składały się z podwójnych helis DNA, a wierzchołki

stanowiły punkty trójramiennych rozgałęzień. Każda z krawędzi sześcianu

powstaje poprzez dwukrotny obrót nici DNA ją tworzącej, co umożliwia

złożenie całej struktury z zachowaniem odpowiednich kątów pomiędzy jej

poszczególnymi elementami. W każdej krawędzi powstałej cząsteczki jest

obecne unikalne miejsce restrykcyjne. Dowodem zbudowania pożądanej

cząsteczki może być trawienie miejsc restrykcyjnych, doprowadzające do

zmian w budowie cząsteczki [26, 42].

Następną cząsteczką zbudowaną na bazie DNA był ścięty oktaedr.

Ośmiościan ścięty posiada 14 ścian. Sześć nici DNA odpowiada za tworzenie

ścian kwadratowych a osiem nici DNA za tworzenie ścian sześciokątnych. Z

każdego wierzchołka ośmiościanu ściętego wychodzą trzy krawędzie, jednak

cała struktura powstała poprzez wykorzystanie rozgałęzień czteroramiennych.

Dodatkowe helisy mogą być użyte do połączenia wielościanów w wersję


211

makrocząsteczki zeolitu A. W ciągu ostatnich kilku lat zbudowano ośmiościan

przy użyciu cząsteczek PX [25, 7, 15, 43].

Za strukturę wielowymiarowej cząsteczki zbudowanej z DNA odpowiadają

zastosowane węzły. Pół obrotu helisy DNA odpowiada jednemu węzłowi.

Węzły negatywne produkowane są na bazie konwencjonalnych prawo

skrętnych helis B-DNA, natomiast węzły pozytywne powstają z lewoskrętnych

helis Z-DNA. Rysunek 5A przedstawia węzeł negatywny, a rysunek 5C węzeł

pozytywny. Rycina 5B przedstawia strukturę złożoną z dwóch pozytywnych

i dwóch negatywnych węzłów. Wszystkie z tych węzłów zostały

wyprodukowane z jednej nici DNA, w zależności od zastosowanych

warunków ligacji [44, 45].

Rysunek 5D ilustruje pierścienie Borromean`a zbudowane z kombinacji

prawoskrętnego trójramiennego B-DNA połączonego z lewoskrętnym

trójramiennym Z-DNA. Pierścienie Borromean’a mają szczególną właściwość:

gdy dowolny pierścień w zestawie jest cięty, wszystkie pierścienie rozpadają

się. Jest to niezwykle trudna topologia do produkcji metodami

konwencjonalnymi, ale struktura ta jest stosunkowo łatwa do wykonania

z DNA [46, 47].

Rysunek 5. Schemat węzłów DNA: A – węzeł negatywny; C – węzeł pozytywny; B – struktura

złożona z dwóch pozytywnych i dwóch negatywnych węzłów; D – pierścienie Borromean’a [2]

8. Początek DNA origami – Badania Rothemund’a

Prekursorem techniki DNA origami był Rothemund (2006r.). Idea

wspomnianej metody jest bardzo prosta i opiera się na składaniu długiej

nici rusztowania w pożądany kształt. Kształt ten osiąga się wykorzystując


212

specjalnie zaprojektowane krótkie odcinki DNA w postaci spinek, czy

zszywek. Rothemund w swoim badaniu użył nici DNA genu bakteriofaga

M13mp18 o długości 7,249 pz. Wykorzystana przez niego cząsteczka DNA

była pojedynczą i kolistą nicią kwasu deoksyrybonukleinowego. Wybór tej

konkretnie cząsteczki był nieprzypadkowy. Genom bakteriofaga M13 był

dobrze poznany, a wykorzystana przez Rothemunda sekwencja wykazy-

wała niewielką strukturę drugorzędową. Krótkie 30 nukleotydowe odcinki

DNA, będące spinkami, zaprojektowano by były komplementarne do

dwóch różnych domen w nici będącej rusztowaniem. Połączenie domen

przez spinki utrzymuje i stabilizuje strukturę nici-rusztowania. Sukces

Rothemunda można zawdzięczyć wykorzystaniu stu-krotnego nadmiaru

każdej ze spinek DNA, minimalnej strukturze drugorzędowej M13 i selekcji

spinek w taki sposób, aby nie były względem siebie komplementarne [48, 49].

Obecnie w celu uzyskania dowolnego kształtu DNA origami, otrzymuje

się najpierw przybliżony kształt zewnętrzny. Następnie kształt ten jest

wypełniany cylindrami o średnicy równej średnicy spirali DNA i długości

równej całkowitej wielokrotności skoku linii śrubowej. Cylindry są

następnie łączone ze sobą w określonych punktach rozgałęzień. Należy

zauważyć, że punkty rozgałęzień muszą być oddalone od siebie o 1,5

obrotu, aby utrzymać płaskość całej struktury. Następnie nić rusztowania

jest „tkana” przez cylindry – (Rysunek 6).

Rysunek 6. Schemat metody DNA origami [48]

9. Problemy w technice DNA origami

Metody oparte na wykorzystaniu techniki DNA origami nadal posiadają szereg poważnych wad i niedogodności. Struktury DNA origami nie są stabilne w zmiennych warunkach i wymagają specjalnego traktowania. Drastyczny wpływ na strukturę DNA origami wywiera np. pH. W roztworach charakteryzujących się niskim pH może dojść do depurynacji, czyli hydrolizy zasady purynowej (adeniny lub guaniny) od reszty nukleotydu (deoksyrybozy i reszty fosforanowej). W wysokim pH natomiast wiązanie wodorowe pomiędzy nićmi DNA może ulec zniszczeniu. Podwyższona temperatura, czy organiczne rozpuszczalniki doprowadzają do denaturacji podwójnych nici


213

DNA. Deoksyrybonukleazy katalizują rekcję niszczenia nici DNA. Również jony obecne w roztworze mają silny wpływ na omawiane struktury DNA. Przy niskiej sile jonowej ww. struktury DNA ulegają rozkładowi, natomiast wysokie stężenia soli prowadzą do ich agregacji. Dodatkowo molekularne napięcia i siły mechaniczne mogą mieć negatywny wpływ w szczególności na długie i rozbudowane struktury. W związku z powyższym przechowywanie, jak i prace z wykorzystaniem próbek zawierających struktury DNA muszą być prowadzone bardzo ostrożnie i pod specjalnym nadzorem [50].

Najczęściej wykorzystywana w technice DNA origami sekwencja M13 o długości ok. 7000 par zasad posiada jednak pewne ograniczenia. Duże i bardzo skomplikowane projekty wymagają znacznie dłuższej nici tworzącej rusztowanie. Jedną z głównych przyczyn, dla których sekwencja M13 jest szeroko stosowana jest jej niski koszt, duża dostępność oraz brak struktury drugorzędowej. Istnieje więc potrzeba opracowania taniej procedury stworzenia pojedynczej, długiej nici DNA, z minimalną strukturą drugorzędową lub jej brakiem, w celu zastąpienia sekwencji M13[48, 49].

10. Nanotechnologia DNA – próby wykorzystywania

Struktura krystalicznej klatki zbudowana z DNA może posłużyć do orientowania w przestrzeni innych molekuł uwięzionych w jej wnętrzu. Siatki krystaliczne z DNA mogą zostać użyte w celu pozycjonowania i orientowania w przestrzeni elementów molekularnych z ogromną precyzją [51‚53].

Urządzenia oparte na DNA przyczyniają się do rozwoju robotyki w nanoskali jak również do stworzenia nowych inteligentnych materiałów, które np. odpowiadają na konkretne bodźce poprzez przemiany przestrzenne w ich strukturze.

10.1. Sondy na bazie DNA origami

Wykorzystując technikę DNA origami można zbudować prostokątną płytkę rusztowania, zawierającą zestaw lepkich sond komplementarnych do cząsteczek RNA. Mogą one posłużyć do ich wykrywania. Lepkie sondy mają postać wiszących łańcuchów i nie są widoczne podczas obrazowania w mikroskopii sił atomowych, jednak gdy RNA wiąże się z sondą, ich struktura ulega usztywnieniu i zostają uwidocznione w AFM (ang. atomic force microscope). Prostokątna płytka DNA z sondami posiada kilka osi symetrii. W związku z tym pewien region każdej płytki, (konkretnie, w lewym górnym rogu), zawiera kilka spinek, które wskazują orientacje płytki, i pozwalają określić dokładną lokalizację na płytce. Różne płytki posiadają unikalne sondy komplementarne do specyficznych sekwencji RNA, zatem RNA może wiązać się tylko do jednej płytki. Płytki są oznaczone kodami kreskowymi dla zmultipleksowanego wykrywania sekwencji RNA.


214

10.2. Mapowanie struktury białek

Shih po raz pierwszy wykorzystał nanotechnologię DNA do mapowania

struktury białka podczas spektroskopii magnetycznego rezonansu

jądrowego NMR (ang. nuclear magnetic resonance). Technika ta polega na

identyfikacji magnetycznej sygnatury atomów białek w stosunku do swoich

sąsiadów. Poprzez poznanie sąsiadów każdego atomu, możliwe jest

złożenie struktury ogólnej białka. Technika działa tylko dla niewielkich

rozmiarów białek, dla których uporządkowanie interakcji między sąsiadami

nie nastręcza zbyt wielu trudności. Modyfikacje standardowych NMR

dostarczyły naukowcom dodatkowych informacji pomocnych w rozwiązy-

waniu struktury białek. Zastosowanie ciekłych kryształów w roztworze

NMR częściowo rozwiązało problem szybkiej zmiany konformacji

badanych białek. Niestety ciekłe kryształy są wrażliwe na działanie

detergentów, niezbędnych w roztworze NMR podczas badania białek błon

komórkowych. W 2007r. Shih zastąpił ciekłe kryształy nanorurkami DNA

origami, które wykazują sporą odporność na działanie detergentów. Dzięki

zastosowaniu techniki DNA origami możliwe stało się rozwiązanie

struktury przezbłonowej domeny białka receptora komórek T, jak również

struktury białka błonowego UCP2, które pomaga regulować wydzielanie

insuliny w komórkach trzustki [54].

10.3. Badanie reakcji między cząsteczkami w czasie

rzeczywistym

Sugiyama jako pierwszy zaproponował wykorzystanie nanotechnologii

DNA w celu obserwacji białkowych katalizatorów w czasie rzeczywistym.

Przy użyciu DNA origami skonstruowano miniaturową „ramkę”, która

została rozpięta pomiędzy dwoma prawie identycznymi nićmi dwunicio-

wego DNA. Jej zastosowanie pozwoliło na stworzenie sztucznego

kompartymentu, do którego została ograniczona analizowana reakcja

enzymatyczna. Dietz i wsp. użyli DNA origami w celu stworzenia lepszego

narzędzia do obserwacji DNA i białek w procesie ich rozrywania, czy

oddzielania od siebie. W standardowej procedurze używa się laserów

molekularnych do uwięzienia plastikowych koralików w danym miejscu

w roztworze. Następnie do koralików dołącza się linkery umożliwiające

przyłączenie białek lub innych molekuł, które są akurat badane. Poprzez

regulowanie promienia lasera możliwe jest oddalanie i zbliżanie koralików

względem siebie, w celu zaobserwowania jak zmiany naprężeń wpływają

na właściwości badanego białka takie jak zdolność do fałdowania się.

Niestety technika oparta na wykorzystaniu koralików ma pewne

ograniczenia. W wielu przypadkach na łączniki musi być wywarta duża

siła, aby rozdzielić od siebie białka. Podczas gdy białko jest rozciągane,


215

łączniki odpływają od siebie, więc eksperyment nie może być odwrócony

ani powtórzony [55]. Zespół badawczy Dietz’a postanowił więc zastąpić

zwykłe łączniki sztywnymi prętami wykonanymi w technice origami DNA,

zawierającymi aż 18 spiralnych rurek. Początkowe próby wykazały, że

sztywne wiązki DNA są lepsze w przenoszeniu siły przemieszczającej na

rozdzielane molekuły, a co za tym idzie wymagana siła, którą należy

wywrzeć w celu rozdziału molekuł jest o połowę mniejsza. Sztywne

łączniki powinny również pozostawać w miejscu podczas przeprowadzania

eksperymentu, co stwarza możliwość jego odwrócenia [56].

10.4. Sensory pH

W ostatnim czasie opracowano nanomechaniczne urządzenia origami

DNA takie jak: DNA Origami szczypce czy DNA Origami kleszcze.

Powstały one z połączenia dwóch elementów podobnych do wydłużonych

walców o długości 170 nm, licząc od punktu ich podparcia. DNA Origami

Szczypce mogą zatem występować w trzech konformacjach: postać

otwartego krzyża, w której obie połączone jedynie w punkcie podparcia ze

sobą dźwignie tworzą kształt litery X; postać równoległa i antyrównoległa

zamknięta forma, w której dwa ramiona są ustawione horyzontalnie za

pomocą dwóch lub więcej mostków między ramionami. Dziewięć par sek-

wencji 12-nukleotydowych obecnych w strukturze szczypiec może dimery-

zować w czteroniciową, drugorzędową strukturę DNA podczas protono-

wania cytozyny. W takim wypadku następuje zmiana konformacji i przejście

z otwartej formy krzyża w zamkniętą formę równoległą. Taka zmiana formy

zależy od pH i jest bardzo łatwa do zaobserwowania stosując mikroskopię sił

atomowych (AFM). Pokazuje to potencjalne zastosowanie powyższego

systemu jako pojedynczych molekularnych czujników pH [57‚59].

10.5. Nanopory

Nanopory od niedawna wykorzystuje się w celu wykrywania,

oznaczania i określania fizycznych właściwości pojedynczych molekuł.

Nanopory stały się przedmiotem dużego zainteresowania w takich

dziedzinach jak sekwencjonowanie DNA [60]. Podstawowa koncepcja

wykrywania pojedynczej cząsteczki polega na zastosowaniu napięcia

przebiegającego przez dwa roztwory elektrolitów rozdzielonych strukturą

z nanoporami, oraz zmierzeniu powstałego prądu jonowego. Seminal

w 1990r. po raz pierwszy pokazał, że pojedyncze cząsteczki, takie jak

kwasy nukleinowe mogą być wykryte w ten sposób. W ciągu ostatnich

dwóch dekad nanopory zostały zastosowane do wykrywania wielu

cząsteczek biologicznych takich jak DNA, RNA i białka [61]. Badania nad

nanoporami można podzielić na te dotyczące stałych nanoporów


216

i nanoporów biologicznych. Stałe nanopory są całkowicie syntetyczne

i mogą być wytworzone za pomocą technik takich jak wiercenie jonowo

cienkich otworów w błonach izolacyjnych lub przeciąganie przez błonę

szklanych kapilar za pomocą lasera [62]. Nanopory biologiczne powstają

poprzez modyfikowanie dwuwarstwy lipidowej. Kluczowym aspektem

działania nanoporów zarówno stałych, jak i biologicznych, jest możliwość

uzyskania konkretnej struktury i właściwości pod względem geometrii

i powierzchni funkcjonalnej. Geometria determinuje sygnał pomiarów

i umożliwia selekcjonowanie na podstawie wielkości fizycznej.

Funkcjonalność powierzchni pozwala na osiągnięcie specyficzności

chemicznej w eksperymentach. Nanopory biologiczne są ograniczone do

badania małych molekuł, co najwyżej cząsteczek jednoniciowego DNA.

Natomiast średnica stałych nanoporów może zostać dostosowana do

badania większych molekuł w tym dsDNA i białek [63]. Nanopory

biologiczne znacząco wyprzedzają swoich stałych odpowiedników pod

względem funkcjonalności powierzchni. Inżynieria genetyczna nanoporów

biologicznych pozwala na precyzyjne pozycjonowanie grup chemicznych,

które wiążą się do analitów. W stałych nanoporach precyzyjne

pozycjonowanie pojedynczego miejsca wiążącego pozostaje niezwykle

trudne, dlatego DNA origami zdaje się być bardzo atrakcyjną techniką

formowania nanoporów. Szczególnie cenna jest możliwość budowy

trójwymiarowych konstrukcji, umożliwiających precyzyjną kontrolę

geometrii jak i funkcjonalności. Grupy funkcyjne, z zastosowaniem technik

DNA origami, mogą być umieszczone w konstrukcji z dokładnością do

kilku nanometrów [49].

10.6. Organizowanie nanocząsteczek

Nanocząstki plazmoniczne wykazują różne właściwości pochłaniania,

rozpraszania i sprzęgania, które są zależne od kształtów, rozmiarów

i odległości między cząstkami. Właściwości te są szeroko stosowane do

pomiarów, diagnozowania w leczeniu, obrazowaniu komórek i budowie

nanoelektroniki. Właściwość fototermiczna plazmonicznych nanocząsteczek

może być również stosowana w leczeniu raka. Właściwości optyczne

nanocząsteczek plazmoniczncyh silnie zależą od morfologii, składu

chemicznego oraz środowiska. Dlatego też dąży się do osiągnięcia

indywidualnych właściwości optycznych cząsteczek, gdzie każdy element

jest precyzyjnie rozmieszczony. DNA wydaje się być obiecującym

materiałem do organizowania funkcjonalnych nanoobiektów takich jak

nanocząsteczki metali. Organizowanie nanoczasteczek na tablicach DNA

origami polega na zastępowaniu standardowych zszywek DNA,

w strukturze DNA origami, modyfikowanymi nićmi DNA zawierającymi


217

nanoczasteczki. W taki sposób można precyzyjnie organizować nano-

czasteczki takie jak AuNSs, AuNRs i AgNPs [64].

10.7. Nanoroboty

Nanoroboty DNA należy postrzegać jako swoistego rodzaju trój-

wymiarowe kontenery zbudowane z DNA. Ich powierzchnie są w pełni

adresowalne, pozwalając na przyłączenie różnych ligandów, znaczników

dla bioobrazownia, przeciwciał, hormonów. Najważniejsze jest jednak to,

że nanoroboty mogą być używane do skutecznego dostarczania i uwal-

niania leków w konkretnym miejscu. Zwiększona specyficzność w dostar-

czaniu leków pozwala na rozwiązanie problemu ich toksyczności, gdyż lek

w założeniu ma trafiać wyłącznie w miejsce docelowe. Douglas ze swoim

zespołem badawczym zaproponował stworzenie nanorobotów DNA

mających możliwość wyszukiwania i niszczenia komórek nowotworowych.

Robot Douglas’a wyglądem przypomina wydrążony cylinder o długości 60

nanometrów i szerokości 25 nanomentrów. Zbudowany jest z origami DNA

i zamknięty poprzez aptamer zaprojektowany tak, aby wiązał się do

cząsteczek charakterystycznych dla komórek nowotworowych. Połączenie

się aptameru z cząsteczką na komórce nowotworowej powoduje uwolnienie

wyznakowanych fluorescencyjnie białek układu odpornościowego, które po

związaniu się z komórkami nowotworowymi indukują apoptozę. W testach

in vitro wykazano 40% skuteczność w zabijaniu komórek zmienionych

nowotworowo, co wydaje się być dobrym wynikiem [65‚68].

11. Podsumowanie

Technika DNA origami pozwala na stworzenie wysoce zaawansowanych

struktur, które znajdują zastosowanie w wielu gałęziach nauk biomedycznych.

Przełomowym etapem w rozwoju omawianej techniki było stworzenie

sztywnych struktur DX, które dały podwaliny do stworzenia trójwymiarowych

obiektów, wykorzystywanych do tworzenia nanonarzędzi, takich jak

nanoszczypce, będące w istocie czujnikiem pH. Ciekawą i atrakcyjną aplikacją

przestrzennych obiektów DNA jest pozycjonowanie poszczególnych molekuł

w przestrzeni z niezwykłą dokładnością, co jest szczególnie istotne

w badaniach nad funkcjonowaniem cząsteczek takich jak kwasy nukleinowe

i białka. W podobnym celu wykorzystano tablice DNA, a także utworzone

w technice DNA origami porowate nanostruktury, które charakteryzują się

znacznie większą specyficznością niż materiały standardowo stosowane

w takich analizach. Przy wykorzystaniu dwuwymiarowych płytek DNA,

wyposażonych w sondy molekularne stworzono również wysoce specyficzne

narzędzia do wykrywania i rozpoznawania pojedynczych cząsteczek kwasów

nukleinowych i innych cząsteczek, których zasada działania w dużej mierze


218

przypomina standardowo wykorzystywane mikromacierze DNA. Najcie-

kawszym, a zarazem najbardziej skomplikowanym przykładem wykorzystania

DNA origami, są nanoroboty DNA, które pozwalają na dostarczenie różnego

rodzaju biomolekuł, takich jak leki antynowotworowe, do zdefiniowanych

celów w postaci antygenów występujących na powierzchni komórek

nowotworowych. Budzą one ogromne zainteresowanie świata naukowego,

który upatruje w nich alternatywy dla obecnie stosowanych strategii

terapeutycznych, która pozwoliłaby na selektywne niszczenie komórek

nowotworowych, przy jednoczesnym uniknięciu poważnych, ogólno-

ustrojowych skutków ubocznych, jakie towarzyszą chemioterapii i radioterapii.

Literatura

1. Seeman N. C., In the nick of space: Generalized nucleic acid complementarity

and the development of DNA nanotechnology, Synlett., (2000), s. 1536-1548

2. Seeman N. C., An overview of structural DNA nanotechnology, Molecular

Biotechnology., 37 (2007), s. 246-257

3. Seeman N. C., Nucleic acid junctions and lattices, Journal of Theoretical Biology.,

99 (1982), s.237-247

4. Seeman N. C., DNA nanotechnology: novel DNA constructions, Annual Review

of Biophysics and Biomolecular Structure., 27 (1998), s. 225-248

5. Fu T. J., Seeman N. C., DNA double crossover structures, Biochemistry.,

32 (1993), s. 3211-3220

6. Chen J. H., Kallenbach N. R., Seeman N. C., A specific quadrilateral synthesized

from DNA branched junctions, Journal of the American Chemical Society.,

111 (1989), s. 6402-6407

7. Zhang Y., Seeman N. C., The construction of a DNA truncated octahedron,

Journal of the American Chemical Society., 116 (1994), s.1661-1669

8. Li X. J., Yang X. P., Qi J., Seeman N. C., Antiparallel DNA double crossover

molecules as components for nanoconstruction, Journal of the American Chemical

Society., 118 (1996), s. 6131-6140

9. LaBean T. H., Yan H., Kopatsch J., Liu F. R., Winfree E., Reif J. H., Seeman N.

C., The construction of DNA triple crossover molecules, Journal of the American

Chemical Society., 122 (2000), s.1848-1860

10. Winfree E., Liu F., Wenzler L.A ., Seeman N. C., Design and selfassembly of two-

dimensional DNA crystals, Nature., 394 (1998), s. 539-544

11. Liu Y., Lin C., Li H., Yan H., Aptamer directed self-assembly of proteins on

a DNA nanostructure, Angewandte Chemie International Edition., 44 (2005),

s. 4333-4338

12. Lin C., Liu Y., Rinker S., Yan H., DNA tile based self-assembly: building complex

nanoarchitectures, ChemPhysChem., 7 (2006), s. 1641-1647

13. Cohen S. N., Chang A. C. Y., Boyer H. W., Helling R. B., Construction

of biologically functional bacterial plasmids in vitro, Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America., 70 (1973), s. 3240-3244


219

14. Zhang X., Yan H., Shen Z., Seeman N. C., Paranemic cohesion of topologically-

closed DNA molecules, Journal of the American Chemical Society., 124 (2002),

s. 12940-12941

15. Shih W. M., Quispe J. D., Joyce G. F., A 1.7-kilobase single-stranded DNA that

folds into a nanoscale octahedron, Nature., 427 (2004), s. 618-621

16. Shen Z., Yan H., Wang T., Seeman N. C., Paranemic crossover DNA:

A generalized Holliday structure with applications in nanotechnology, Journal

of the American Chemical Society., 126 (2004), s. 1666-1674

17. Yan H., Seeman N. C., Edge-sharing motifs in DNA nanotechnology, Journal

of Supramolecular Chemistry., 1. (2003), s. 229-237

18. Kuzuya A., Wang R., Sha R., Seeman N.C., Sixhelix and eight-helix DNA

nanotubes assembled from half-tubes, NanoLetters., 6 (2007), s. 1757-1763

19. Holliday R., A mechanism for gene conversion in fungi, Genetical Research.,

5 (1964), s. 282-304

20. Fu T. J., Seeman N.C., DNA double crossover structures, Biochemistry.,

32 (1993), s. 3211-3220

21. Schwacha A., Kleckner N., Identification of double Holliday junctions as

intermediates in meiotic recombination, Cell., 83 (1995), s. 783-791

22. LaBean T., Yan H., Kopatsch J., Liu F., Winfree E., Reif J. H., Seeman N. C.,

The construction, analysis, ligation and self-assembly of DNA triple crossover

complexes, Journal of the American Chemical Society., 122 (2000), s.1848-1860

23. Seeman N. C., DNA nicks and nodes and nanotechnology, NanoLetters., 1 (2001),

s. 22-26

24. Mathieu F., Liao S., Mao C., Kopatsch J., Wang T., Seeman N. C., Six-helix

bundles designed from DNA, NanoLetters., 5 (2005), s. 661-665

25. Zhang Y., Seeman N. C., A solid-support methodology for the construction

of geometrical objects from DNA, Journal of the American Chemical Society.,

114 (1992), s. 2656-2663

26. Chen J., Seeman N. C., The synthesis from DNA of a molecule with the

connectivity of a cube, Nature., 350 (1991), s. 631-633

27. Qi J., Li X., Yang X., Seeman N. C., The ligation of triangles built from bulged

three-arm DNA branched junctions, Journal of the American Chemical Society.,

118 (1996), s. 6121-6130

28. Seeman N. C., Kallenbach N. R., Design of immobile nucleic acid junctions,

Biophysical Journal., 44 (1983), s. 201-209

29. Ma R. I., Kallenbach N. R., Sheardy R. D., Petrillo M. L., Seeman N. C., Three

arm nucleic acid junctions are flexible, Nucleic Acids Research., 14 (1986),

s. 9745-9753

30. Kallenbach N. R., Ma R. I., Seeman N. C., An immobile nucleic acid junction

constructed from oligonucleotides, Nature., 305 (1983), s. 829-831

31. Wang Y., Mueller J. E., Kemper B., Seeman N. C., The assembly and

characterization of 5-Arm and 6-Arm DNA junctions, Biochemistry., 30 (1991),

s. 5667-5674

32. Wang X., Seeman N. C., The assembly and characterization of 8-arm and 12-arm

DNA branched junctions, Journal of the American Chemical Society., 26 (2007),

s. 8169-8176


220

33. Petrillo M. L., Newton C. J., Cunningham R. P., Ma R. I., Kallenbach N. R.,

Seeman N. C., Ligation and flexibility of four-arm DNA junctions, Biopolymers.,

27 (1988), s. 1337-1352

34. Eis P. S., Millar D. P., Conformational distributions of a four-way DNA junction

revealed by time-resolved fluorescence resonance energy transfer, Biochemistry.,

32 (1993), s. 13852-13860

35. Sa-Ardyen P., Vologodskii A. V., Seeman N. C., The flexibility of DNA double

crossover molecules, Biophysical Journal., 84 (2003), s. 3829-3837

36. Yan H., Zhang X., Shen Z., Seeman N. C., A robust DNA mechanical device

controlled by hybridization topology, Nature., 415 (2002), s. 62-65

37. Liu F., Sha R., Seeman, N. C., Modifying the surface features of two-dimensional

DNA crystals, Journal of the American Chemical Society., 121 (1999), s. 917-922

38. Mao C., Sun W., Seeman, N. C., Designed twodimensional DNA Holliday

junction arrays visualized by atomic force microscopy, Journal of the American

Chemical Society., 121 (1999), s. 5437-5443

39. Sha R., Liu F., Millar D. P., Seeman N. C., Atomic force microscopy of parallel

DNA branched junction arrays, Chemical Biology., 7 (2000), s. 743-751

40. Sha R., Liu F., Seeman N. C., Atomic force measurement of the interdomain angle

in symmetric Holliday junctions, Biochemistry., 41 (2002), s. 5950-5955

41. Constantinou P. E., Wang T., Kopatsch, J., Israel L.B., Zhang X., Ding B.,

Sherman W. B., Wang X., Zheng J., Sha R., Seeman N. C., Double cohesion in

structural DNA nanotechnology, Organic & Biomolecular Chemistry., 4 (2006),

s. 3414-3419

42. Chen J., Seeman N. C., The electrophoretic properties of a DNA cube and its sub-

structure catenanes, Electrophoresis., 12 (1991), s. 607-611

43. Goodman R. P., Schaap I. A. T., Tardin C. F., Erben C. M., Berry R. M., Schmidt

C. F., Turberfield A. J., Rapid chiral assembly of rigid DNA building blocks from

molecular fabrication, Science., 310 (2005), s.1661-1664

44. Seeman N. C., The design of single-stranded nucleic acid knots, Molecular

Engineering., 2 (1992), s. 297-307

45. Du S. M., Stollar B. D., Seeman N. C., A synthetic DNA molecule in three knotted

topologies, Journal of the American Chemical Society., 117 (1995), s. 1194-200

46. Mao C., Sun W., Seeman N. C., Assembly of Borromean rings from DNA, Nature.,

386 (1997), s. 137-138

47. Chichak K. S., Cantrill S. J., Pease A. R., Chiu S. H., Cave G. W .V., Atwood J.

L., Stoddart J. F., Molecular Borromean rings, Science., 304 (2004), s. 1308-1312

48. Rothemund P., Design of DNA origami, (2005), s. 471-478

49. Rothemund P., Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns, Nature.,

440 (2006), s. 297-302

50. Zadegan R. M., Norton M. L., Structural DNA nanotechnology: from deign to

applications, International Journal of Molecular Sciences., 6 (2012), s. 7149-7162

51. Yan H., Park S. H., Ginkelstein G., Reif J. H., LaBean T. H., DNAtemplated self-

assembly of protein arrays and highly conductive nanowires, Science., 301 (2003),

s. 1882-1884


221

52. Deng Z. X., Tian Y., Lee S. H., Ribbe A. E., Mao C. D., DNA-encoded

selfassembly of gold nanoparticles into one-dimensional arrays, Angewandte

Chemie International Edition., 44 (2005), s. 3582-3585

53. Sharma J., Ke Y., Lin C., Chhabra R., Wang Q., Nangreave J., Liu Y., Yan H.,

DNA tile directed self-assembly of quantum dots into two-dimensional

nanopatterns, Angewandte Chemie International Edition., 47 (2008), s. 5157-5159

54. Douglas S. M., Chou J. J, Shih W. M., DNA-nanotube-induced alignment of

membrane proteins for NMR structure determination, Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America., 16 (2007), s. 6644-6648

55. Endo M., Katsuda Y., Hidaka K., Sugiyama H., Regulation of DNA methylation

using different tension of double strands constructed In a defined DNA

nanostructure, Journal of American Society., 5 (2010), s. 1592-1597

56. Kim D. M., Kilchherr F., Dietz H., Bathe M., Quantitative prediction of 3D

solution shape and flexibility of nucleic acid nanostructures, Nucleic Acids

Research., 7 (2012), s. 2862-2868

57. Kuzuya A., Sakai Y., Yamazaki T., Xu Y., Komiyama M., Nanomechanical DNA

Origami ―Single-Molecule Beacons‖ Directly Imaged by Atomic Force

Microscopy, Nature Communicates., 2 (2011), doi:10.1038/ncomms1452

58. Yamazaki T., Aiba Y., Yasuda K., Sakai Y., Yamanaka Y., Kuzuya A., Ohya Y.,

Komiyama M., Clear-Cut Observation of PNA Invasion Using Nanomechanical

DNA Origami Devices, Chemical Communications., 48 (2012), s. 11361-11363

59. Kuzuya A., Watanabe R., Hashizume M., Kaino M., Minamida S., Kameda K.,

Ohya Y., Precise Structure Control of Three-State Nanomechanical DNA Origami

Devices, Methods., 67 (2014), s. 250-255

60. Pennisi E., Search for pore-fection, Science., 336 (2012), s. 536-537

61. Wanunu M., Nanopores: a journey towards DNA sequencing, Physics of Life

Reviews., 9 (2012), s. 125-158

62. Bell N. A. W., Thacker V. V., Hernández-Ainsa S., Fuentes-Perez M. E., Moreno-

Herrero F., Liedl T., Keyser U. F., Multiplexed ionic current sensing with glass

nanopores, Lab on a Chip., 13 (2013), s. 1859-1862

63. Dekker C., Solid-state nanopores, Nature Nanotechnology., 2 (2007), s. 209-215

64. Liu Q., Song C., Wang Z. G., Li N., Ding B., Precise organization of metal

nanoparticles on DNA origami template, Methods., 67 (2014), s. 205-214

65. Douglas S. M., Dietz H., Liedl T., Hogberg B., Graf F., Shih W. M., Selfassembly

of DNA into nanoscale three-dimensional shapes, Nature., 459 (2010), s. 414-418

66. Andersen E. S., Dong M., Nielsen M. M., Jahn K., Subramani R., Mamdouh W.,

Golas M. M., Sander B., Stark H., Oliveira C. L., Self-assembly of a nanoscale

DNA box with a controllable lid, Nature., 459 (2009), s. 73-76

67. Moghimi S. M., Hunter A. C., Murray J. C., Nanomedicine: current status and

future prospects, FASEB Journal., 19 (2005), s. 311-330

68. Douglas S. M., Bachelet I., Church G. M., A logic-gated nanorobot for targeted

transport of molecular payloads, Science., 335 (2012), s.831-834


222


Technika DNA origami bazuje na zdolności cząsteczek DNA do formowania wieloniciowych

struktur przestrzennych, wynikającej z komplementarności zasad. Pozwala ona na uzyskanie

sztywnych obiektów 2D i 3D, które mogą zostać użyte do stworzenia wielu nanonarzędzi.

Szczególnie ważny jest motyw DX, który zapewnia sztywność i stabilność konstruktów DNA.

Dzięki odpowiedniemu zaprogramowaniu reakcji syntezy składowych elementów omawianych

struktur można stworzyć nano-szczypce działające jak wysoce czuły sensor pH. Siatki i tabliczki

wykonane w technice DNA origami pozwalają na niezwykle dokładne umiejscowienie

cząsteczek w przestrzeni, a także analizę ich funkcji. Ma to szczególne znaczenie w badaniach

nad właściwościami białek. Płytki stworzone za pomocą DNA origami posłużyły do stworzenia

niezwykle czułych mikromacierzy DNA, zdolnych do detekcji pojedynczych cząsteczek kwasów

nukleinowych. Najbardziej zaawansowaną formą tej techniki jest konstruowanie trójwymia-

rowych nanorobotów DNA, które potrafią rozpoznać komórki docelowe, na przykład komórki

nowotworowe i dostarczać do nich cząsteczki leków przeciwnowotworowych. Budzą one

ogromne nadzieje na wykorzystanie ich w przyszłości jako alternatywy dla obecnie stosowanych

strategii terapeutycznych.

DNA origami technique – potential aplications

DNA Origami technology is based on the ability of DNA molecules to form the multi-strand

spatial structures. Such ability arises from the rule of base complementarily. It allows to obtain

stiff 2D and 3D objects that can be used to create many nanodevices. Especially important is DX

motive which provides stiffness and stability of the DNA constructs. By appropriate

programming of synthesis reaction constituent elements of aforementioned structures can be

created to build nano-pliers that act as highly sensitive pH sensor. Lattices and arrays made in the

DNA origami technology allow for extremely accurate positioning of molecules in space, as well

as an enable analysis of their functions. It is particularly important in research on the properties of

proteins. Arrays that were developed by using the DNA origami technique were used to create

highly sensitive DNA microarrays capable of detecting single molecules of nucleic acids. The

most advanced form of this technique is the construction of three-dimensional DNA nanorobots

that can recognize the target cells such as cancer cells and deliver molecules of anticancer drugs

into them. It is hoped that their usage in the future will be an alternative to currently used

therapeutic strategies.

223

Małgorzata Sieradzka1, Joanna Kołodziejczyk-Czepas

2, Paweł Nowak

3

Nowe kierunki w badaniach biomedycznych

kwasów hydroksycynamonowych

New trends in biomedical research

on hydroxycinnamic acids

1. Wprowadzenie

Kwasy hydroksycynamonowe stanowią najliczniejszą grupę kwasów

fenolowych i fenylopropanoidów pochodzenia naturalnego. Są to wtórne

metabolity roślinne, powstające z fenyloalaniny lub tyrozyny, na szlaku

przemian kwasu szikimowego [1]. W roślinach występują głównie

w formie złożonej – glikozydów lub depsydów, w mniejszym natomiast

stopniu w postaci wolnej. Fenolokwasy w formie estrów z glukozą lub

kwasu chinowego obecne są przeważnie w owocach, a w ziarniakach zbóż

większość fenolokwasów związana jest z arabinoksylanami. Wolne kwasy

hydroksycynamonowe występują w tkankach roślinnych na ogół

w niewielkich ilościach [2]. W organizmach roślin fenolokwasy pełnią

funkcję ochronną [3], a ze względu na aktywność biologiczną wykazywaną

w organizmach zwierząt i człowieka związki te stanowią także przedmiot

wielu badań naukowych. Do niedawna, większość prac badawczych

dotyczących roślinnych kwasów fenolowych dotyczyła aktywności

przeciwutleniającej – wykazano m.in., że związki te posiadają zdolność

zmiatania wolnych rodników, chelatowania jonów metali, a także modulo-

wania aktywności enzymów i białek nieenzymatycznych [4]. W ostatnich

latach obserwuje się jednak znaczącerozszerzenie zakresu prac badawczych

dotyczących kwasów fenolowych [5], obejmujących ocenę ich właściwości

przeciwzapalnych i przeciwnowotworowych, a także syntezę nowych

pochodnych fenolokwasów oraz opracowywanie formulacji preparatów

[email protected], Katedra Biochemii Ogólnej, Wydział Biologii i Ochrony

Środowiska, Uniwersytet Łódzki, www.biol.uni.lodz.pl/biochogl [email protected], Katedra Biochemii Ogólnej, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska,

Uniwersytet Łódzki, www.biol.uni.lodz.pl/biochogl [email protected], Katedra Biochemii Ogólnej, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska,

Uniwersytet Łódzki, www.biol.uni.lodz.pl/biochogl


224

zawierających kwasy fenolowe, umożliwiających uzyskanie pożądanej

aktywności farmakologicznej tych związków.

2. Cel pracy

Przedmiotem prezentowanej pracy jest omówienie aktualnego stanu wiedzy

i najnowszych kierunków w badaniach biomedycznych, dotyczących

perspektyw wykorzystania biologicznej aktywności wybranych fenolokwasów

roślinnych z grupy kwasów hydroksycynamonowych (kwas kawowy,

kumarowy, chlorogenowy, ferulowy, rozmarynowy i synapinowy). Praca

obejmuje przegląd najnowszego piśmiennictwa (głównie z ostatnich 5 lat), ze

szczególnym uwzględnieniem najnowszych doniesień na temat właściwości

przeciwutleniających, przeciwzapalnych oraz przeciwnowotworowych

wymienionych kwasów fenolowych.

3. Charakterystyka kwasów hydroksycynamonowych

Kwasy hydroksycynamonowe stanowią grupę związków fenylopropa-

noidowych o ogólnym wzorze szkieletu węglowego C6-C3, syntetyzowanych

w procesie deaminacji fenyloalaniny lub tyrozyny [6, 2].

Głównymi przedstawicielami fenolokwasów hydroksycynamonowych są

kwasy: kawowy, kumarowy, ferulowy, synapinowy [4] oraz pochodne kwasu

kawowego: estry utworzone z kwasem chinowym (kwas chlorogenowy),

α-hydroksydihydrokawowym (kwas rozmarynowy) oraz ester fenetylowy

kwasu kawowego (CAPE, ang. caffeic acid phenethyl ester) (Ryc.1). Obecność

kwasów hydroksycynamonowych stwierdzono m.in. w zbożach, warzywach,

owocach, nasionach i orzechach, a także licznych produktach spożywczych,

np. napojach (Tabela 1).

Nowe kierunki w badaniach biomedycznych kwasów hydroksycynamonowych

225

Ryc. 1. Wzory strukturalne wybranych kwasów hydroksycynamonowych.

Tabela 1. Występowanie kwasów fenolowych w wybranych roślinach i produktach spożywczych

(kompilacja danych wg [4, 7]; zmodyfikowano)

Kwas Występowanie

kawowy

piwo, wino, jęczmień, owies, ryż, żyto, pszenica, jagody,

fasola, groszek, orzech laskowy, orzech włoski, len,

musztarda, krokosz, słonecznik, seler, ziemniaki, pomidory

kumarowy

piwo, wino, herbata, jęczmień, kukurydza, owies, ryż, żyto,

pszenica, jagody, winogrona, fasola, groszek, orzech laskowy,

orzechy pekan, orzech ziemny, orzech włoski, len, musztarda,

krokosz, słonecznik, seler, pomidory

ferulowy

piwo, wino, jęczmień, kukurydza, owies, ryż, żyto, pszenica,

jagody, fasola, groszek, orzech laskowy, orzech ziemny,

orzech włoski, len, musztarda, rzepak, krokosz, słonecznik,

seler, pomidory

synapinowy piwo, owies, żyto, pszenica, fasola, orzech laskowy, orzech

ziemny, orzech włoski, musztarda, rzepak

chlorogenowy kawa, wino, herbata, jęczmień, jabłka, gruszki, fasola,

migdały, słonecznik, seler, sałata, ziemniaki, pomidory

rozmarynowy melisa lekarska, rozmaryn lekarski, mięta pieprzowa

3.1. Aktywność przeciwutleniająca

Główne molekularne mechanizmy przeciwutleniającego działania kwasów

fenolowych obejmują przejęcie przez rodnik elektronu odłączonego od

fenolokwasu lub przekazanie przez fenolokwas atomu wodoru z utwo-


226

rzeniem stabilnych rodników fenoksylowych. Poza zmiataniem rodnikowych

i nierodnikowych reaktywnych form tlenu (RFT), związki te mogą wyka-

zywać działanie przeciwutleniające także poprzez chelatowanie jonów

metali przejściowych, hamowanie aktywności enzymów pro-oksydacyjnych,

a także modulację ekspresji genów, w tym wpływ na działanie szlaku

ARE/Nrf-2 (element odpowiedzi antyoksydacyjnej, ang. antioxidant

response element/czynnik transkrypcyjny Nrf-2, ang. nuclear erythroid 2-

related factor), aktywujący mechanizmy cytoprotekcyjne [6].

Właściwości przeciwutleniające kwasów fenolowych badane są obecnie

pod kątem zastosowania tych związków jako bioaktywnych składników

żywności funkcjonalnej oraz suplementów diety i innych nutraceutyków.

Wiedza na temat aktywności antyoksydacyjnej kwasów hydroksy-

cynamonowych, obserwowanej zarówno w układach in vitro, jak i in vivo

została kilka lat temu podsumowana m.in. w obszernej publikacji

poglądowej [4]. Również w ciągu ostatnich lat pojawiły się kolejne

doniesienia, potwierdzające aktywność przeciwutleniającą fenolokwasów

oraz opisujące mechanizmy tego działania w różnych układach

badawczych (dane zebrano w tabeli 2), a także porównawcze analizy

działania różnych fenolokwasów lub ich pochodnych. Na przykład, wyższą

aktywność przeciwutleniającą kwasu kawowego w porównaniu do

efektywności działania kwasu chlorogenowego (w zakresie stężeń 0,01-10

mM) wykazano w badaniach na zwierzęcym modelu niedokrwienia/

reperfuzji [45]. Najnowsze kierunki w badaniach dotyczących właściwości anty-

oksydacyjnych kwasów hydroksycynamonowych dotyczą syntezy nowych pochodnych tych związków, obejmujących połączenia ze związkami naturalnymi (np. biopolimerami), substancjami syntetycznymi, a także składnikami nieorganicznymi. Stwierdzono m.in., że kwas rozmarynowy w kompleksach z różnymi pochodnymi dekstryn wykazuje silniejszą zdolność redukującą (ocenianą testem redukcji jonów miedzi – CUPRAC, ang. cupric reducing antioxidant capacity) niż zastosowany samodzielnie [46]. Pochodne 4-winylowe kwasów hydroksycynamonowych (p-kumaro-wego, synapinowego, ferulowego oraz kawowego) wykazują wyższą

aktywność antyoksydacyjną (oznaczenia zmiatania DPPH oraz O2

), niż

same kwasy hydroksycynamonowe [47]. Badane są też możliwości zastosowania fenolokwasów w formie pochodnych chitozanu. Wyko-rzystanie chitozanu w tego typu badaniach wynika z faktu, że jest on jest biopolimerem oszerokim spektrum potencjalnego zastosowania w naukach biomedycznych, ze względu na zdolność tworzenia związków chelatowych, możliwość tworzenia żeli, nietoksyczność oraz biozgodność z organizmem ludzkim [48]. Utworzenie koniugatu kwasu ferulowego i chitozanu nadaje powstałej pochodnej silniejsze od substratów właściwości przeciw-rodnikowe, co wykazano na przykład przy zastosowaniu rodników


227

DPPH[49] i ABTS

+[50]. Natomiast badania porównawcze działania

antyoksydacyjnego chitozanu oraz jego koniugatów z kwasem ferulowym lub kawowym prowadzone w innych układach doświadczalnych in vitro wykazały, że największą zdolność przeciwutleniającą (zmiatanie rodników nadtlenkowych, rodnika hydroksylowego i nadtlenku wodoru oraz hamowanie peroksydacji lipidów) posiada chitozanowa pochodna kwasu kawowego, mniej efektywnym przeciwutleniaczem był koniugat kwasu ferulowego, a najsłabiej działał chitozan [51]. Aktywność przeciwutleniającą hydroksycynamonowych pochodnych chitozanu oceniano także w warunkach in vivo. Przez 42 dni myszom (przyjmującym 100 mg/kg/dzień D-galaktozy) podawano 200 mg/kg/dzień chitozanu, chitozanu skoniugowanego z kwasem kawowym lub pochodnej chitozanu z kwasem ferulowym. Zaobserwowano zwiększenie aktywności enzymów antyoksydacyjnych: dysmutazy ponadtlenkowej (SOD, ang. superoxide dismutase), katalazy (CAT, ang. catalase) oraz peroksydazy glutationowej (GPx, ang. glutathione peroxidase) oraz zmniejszenie poziomu dialdehydu malonowego (MDA, ang. malonyldialdehyde) zarówno w surowicy krwi, jak i próbkach wątroby myszy, które otrzymywały chitozan skoniugowany z kwasem kawowym lub kwasem ferulowym.

Dane dotyczące efektywności działania przeciwutleniającego różnych pochodnych fenolokwasowych są jednak niejednorodne. Chociaż głównymzałożeniem tworzenia pochodnych kwasów fenolowych lub opracowywania różnych formuł ich stosowania/podawania jest uzyskanie wzrostu aktywności przeciwutleniającej, w ostatnich latach pojawiły się także prace, sugerujące, że niektóre pochodne mogą być znacznie mniej efektywne niż związki wyjściowe. Wykazano m.in., że alkilowe estry kwasu kawowego

(metylowy, etylowy, propylowy i butylowy słabiej zmiatają rodniki DPPH,

ale wykazują większą zdolność redukcyjną (mierzoną w teście FRAP, ang. ferric reducing ability) niż kwas kawowy. Natomiast estry ferulowe

(metylowy, etylowy, propylowy i butylowy) słabiej zmiatają rodniki DPPH,

mają też mniejszą zdolność redukcyjną (FRAP) niż kwas ferulowy [52]. Wyższą aktywność redukującą i przeciwrodnikową w porównaniu do związku wyjściowego posiada natomiast acyloglukuronid kwasu ferulowego, ale inne pochodne fenolokwasowe, takie jak 4’-O-siarczany i 4’-O-glukuroniany kwasu kawowego i ferulowego mają słabsze właściwości przeciwutleniające niż same fenolokwasy [53]. Ponadto, wprawdzie w oznaczeniach zmiatania rodnika

DPPH i zdolności redukującej (FRAP) wykazano aktywność antyoksydacyjną

zarówno kwasu synapinowego, jak i jego alkilowego estru na podobnym poziomie efektywności działania [54], ale dostępne są też doniesienia, wskazujące, że alkilowe pochodne kwasu kawowego wykazują słabszą

zdolność zmiatania rodników DPPH niż kwas kawowy[55].


228

Tabela 2. Ocena właściwości antyoksydacyjnych wybranych fenolokwasów przy zastosowaniu

różnych modeli doświadczalnych

Kwas

fenolowy Badania in vitro Badania in vivo

kawowy

ograniczanie peroksydacji

lipidów, zmiatanie reaktywnych

form tlenu (NO, H2O2) oraz

redukcja kationorodnika ABTS+

– ale także efekt prooksydacyjny

w badaniach redukcji jonów

żelaza (przy stężeniach 5µM)

i zmiatania DPPH (przy

stężeniach 20 µM) [8]

hamowanie peroksydacji

lipidów przez CAPE w roztworze

kwasu linolowego, zmiatanie

wolnych rodników (ABTS+

,

DPPH, DMPD

+ oraz O2

) przez

CAPE. Ponadto, zdolność

redukcji jonów żelaza i miedzi

(test FRAP i CUPRAC),

chelatowanie jonów metali

przejściowych [9]

aktywność antyoksydacyjna

kwasu kawowego w ozna-

czeniach zmiatania ABTS+

oraz

pomiarach FRAP [10]

zdolność zmiatania rodników

DPPH oraz NO przez koniugat

kwasu kawowego

z chitooligosacharydem [11]

chelatowanie jonów metali,

przeciwdziałanie powstawaniu

rodników hydroksylowych

wytwarzanych w reakcji Fentona;

hamowanie powstawania

uszkodzeń wywołanych

działaniem produktów reakcji

Fentona (badania in vitro na

wątrobach szczurów [12]

hamujący efekt CAPE na

hamowanie generowania

wolnych rodników, ale

brak wpływu na

aktywność SOD

w badaniach na

homogenatach z kory

mózgowej myszy

z epilepsją [18]

hamowanie powstawania

rodnika 1-hydroksy-

etylowego w badaniach na

mikrosomach ze szczurzej

wątroby, prawdopodobnie

będące wynikiem chelato-

wania jonów metali [19]


lipidów (oznaczenia

poziomu MDA) oraz

aktywności SOD, CAT,

GPx przez CAPE

w badaniach z użyciem

homogenatów tkanki jąder

szczurów z zaburzeniami

czynności jąder indu-

kowanymi kadmem [20]

ograniczanie stresu

oksydacyjnego

(oznaczenia SOD i CAT

w homo-genacie

z hipokampu) u szczurów

z napadami padaczkowymi

induko-wanymi

pilokarpiną [21]

obniżenie całkowitego

potencjału oksydacyjnego

w tkance mózgowej

w badaniachna szczurach

z ostrym zatruciem

środkiem owadobójczym

(chloropiryfosem) [22]


229

aktywność SOD oraz tworzenie

RFT w komórkach nabłonkowych

ucha środkowego, w warunkach

stresu oksydacyjnego

indukowanego H2O2 [13]

zmiatanie DPPH oraz NO;

spadek tworzenia TBARS

w badaniach na fibroblastach

płucnych poddanych działaniu

H2O2[14]

zahamowanie powstawania

rodników 7-

karboksyheptylowych, zmiatanie 1O2[15]

hamowanie peroksydacji lipidów

przez CAPE (badania z użyciem

homogenatów komórek tarczycy

i wątroby szczurów [16]

hamowanie aktywności

cytochromu P450 w badaniach na

mikrosomach wątroby (hLMs)

[17]

kumarowy


lipidów (lipoprotein frakcji LDL),

zmiatanie rodników ABTS+

,

DPPH, O2

, OH; redukcja

i chelatowanie jonów żelaza [23]

zdolność zmiatania wolnych

rodników w następującej

efektywności działania: OH

OCH3>

OOH>

OOCH3[24]


230

ferulowy

aktywność antyoksydacyjna

w badaniach peroksydacji

lipidów (w badaniach na

frakcjach mikrosomalnych

wątroby myszy); zmiatanie

ABTS

oraz NO i H2O2

w badaniach in vitro na

śledzionie myszy, ale także

prooksydacyjne działanie

w badaniach redukcji żelaza

(dla stężeń 5 µM) i zmiatania

DPPH (dla stężeń 20 µM) [8]

wzrost aktywności SOD

i CAT oraz obniżenie poziomu

MDA w komórkach

embrionalnych nerki(linia

HEK293), traktowanych

H2O2[25]

hamowanie generowania RFT

ispadek stężenia MDA,

zwiększenie aktywności SOD

i GPx oraz obniżenie ekspresji

NADPH w szczurzych

komórkach mięśni gładkich

naczyń krwionośnych,

traktowanych H2O2[26]

hamowanie generowania OH,

NO oraz spadek poziomu

TBARS przez ferulan

izopentenylu [27]

przeciwdziałanie peroksydacji

lipidów w ludzkich

erytrocytach, w warunkach

stresu oksydacyjnego

wywołanego hiperglikemią [28]

cofnięcie

zmian/uszkodzeń

morfologicznych

wywołanych powstawaniem

amyloidu β, zależne od

neutralizacji RFT, wykazane

obserwacjami

mikroskopowymi na modelu

badawczym zarodków

jeżowca Paracentrotus

lividus[29]

zmniejszenie poziomu

MDA, wzrost poziomu

glutationu całkowitego oraz

zmniejszenie aktywności

GPx oraz SOD u szczurów

z sepsą [30]

synapinowy

obniżenie poziomu

peroksydacji lipidów

w kardiomioblastach

poddanych działaniu H2O2[31]


231

chlorogenowy

zmiatanie rodników ABTS+

i DPPH

, zdolność redukcji

jonów żelaza (FRAP) oraz

chelatowanie jonów metali

przejściowych przez izomery

kwasu chlorogenowego [32]

zmiatanie DPPH, O2

, OH

oraz wewnątrzkomórkowych

RFT w badaniach na linii

komórkowej HaCaT [33]


CYT450, obniżenie stężenia

MDA, spadek generowania

RFT oraz hamowanie ekspresji

NFκB (ang. nuclear factor-κB)

hepatocytach linii L-02,

traktowanych acetaminofenem

(paracetamolem) [34]


lipidów u szczurów

z niedokrwieniem/reperfuzją

wywołaną zamknięciem

mikrokrążenia w lewym

płacie wątroby [35]

inhibicja peroksydacji

lipidów (pomiar MDA)

w surowicy krwi oraz

wątrobie i tkance mózgowej

szczurów; przywrócenie

prawidłowego stężenia

globulin i albumin, współ-

czynnika albuminowo-

globulinowego, poziomu

serotoniny, noradrenaliny,

dopaminy w surowicy oraz

aktywności SOD i GPx

w krwi oraz wątrobie

myszy, którym podawano

metamfetaminę [36]

rozmarynowy

zmiatanie rodnika DPPH[37]

anty- i prooksydacyjna aktyw-

ność kwasu rozmary-nowego

w badaniach in vitro z użyciem

H2O2 oraz rodnika ABTS+

[38]


lipidów w badaniach na modelu

błony komórkowej [39]

spadek stężenia MDA oraz

zwiększenie całkowitej pojem-

ności antyoksydacyjnej (TAC,

ang. total antioxidant capacity)

u szczurów, u których stres

oksydacyjny powodowany był

ekspozycją na działanie pola

elektromagnetycznego [40]

zmiatanie rodnika DPPH[41]

hamowanie aktywności SOD,

CAT, GPx, GSH oraz GST (S-

transferaza glutationowa, ang.

glutathione-S-transferase) oraz

ekspresji NFκB u szczurów

z cukrzycą indukowaną

streptozotocyną [42]

spadek generowania

wolnych rodników, ale brak

wpływu na aktywność SOD

(w badaniach na

homogenatach z kory

mózgowej myszy

z epilepsją) [18]


SOD i CAT – badania

z użyciem homogenatów

tkanek z nerek lub wątroby

szczurów z cukrzycą

wywołaną streptozotocyną

[43]

obniżenie poziomu MDA,

a zwiększenie aktywności

SOD, CAT i GPx

w badaniach z użyciem

homogenatów z wątroby

i nerek starzejących się

myszy [44]


232

3.2. Aktywność przeciwzapalna

Najnowsza literatura dostarcza informacji na temat przeciwzapalnych

właściwości kwasów hydroksycynamonowych (tabela 3), a także

ekstraktów bogatych w kwasy hydroksycynamonowe. W badaniach tych

zwraca się uwagę przede wszystkim na aktywność kwasu rozmarynowego,

którego działanie może być porównywalne lub nawet silniejsze od

niektórych niesteroidowych leków przeciwzapalnych. Efektywność

przeciwzapalnego oraz immunomodulującego działania tego fenolokwasu

wynika głównie ze zdolności hamowania aktywności lipooksygenaz,

cyklooksygenaz oraz białek układu dopełniacza. Kwas rozmarynowy

badany jest obecnie zarówno pod kątem zastosowania leczniczego, jak

i profilaktycznego w postaci nutraceutyków [80]. Zainteresowanie

naukowców tym związkiem obejmuje doskonalenie metod jego produkcji,

tworzenie nowych, aktywnych farmakologicznie pochodnych [81], a także

badania naturalnych ekstraktów bogatych w ten związek. W ostatnich

latach, oceniano m.in. przeciwzapalną aktywność kwasu rozmarynowego

z Prunella vulgaris iThunbergia laurifolia. Ekstrakt z nadziemnych części

P. vulgaris zawierający kwas rozmarynowy hamuje produkcję prosta-

glandyny E2(PGE2 ang. prostaglandin E2) oraz tlenku azotu in vitro.

Ekstrakt ten hamował ponadto ekspresję genów dla cyklooksygenazy 2

(COX-2, ang. cyclooxygenase-2) oraz indukowalnej syntazy tlenku azotu

(iNOS, ang. inducible nitric oxide synthase) w komórkach stymulowanych

lipopolisacharydem bakteryjnym (LPS) [82].Natomiast kwas rozmarynowy

z liści T. laurifoliapodawany myszom drogą pokarmową w dawkach 50,

100 i 150 mg/kg wykazywał działanie przeciwzapalne in vivo, wyraźnie

hamując występowanie indukowanego PGE2obrzęku [83]. Silne działanie

przeciwzapalne mogą również wykazywać inne kwasy hydroksycynamonowe.

Badania działania farmakologicznego kwasu chlorogenowego zawartego

w ekstrakcie z części nadziemnych T. diversifoliawykazały, że ekstrakt (10, 50,

100 i 150 mg/kg) wykazuje wyższą aktywność przeciwzapalną niż niesteroi-

dowy lek przeciwzapalny (indometacyna, 10 mg/kg) w badaniach in vivo [84].

Naukowcy poszukują ponadto kolejnych związków o działaniu

terapeutycznym, opartych na strukturze kwasów hydroksycynamonowych.

W 2014 roku, zespół badawczy Park i wsp. [85] opublikował wyniki

wstępnych badań z zastosowaniem nowej pochodnej kwasu kawowego

(acetyl-caffeic acid–1-piperonylpiperazine), jako związku o działaniu

przeciwzapalnym. Doświadczenia na makrofagach poddawanych stymulacji

LPS-em wykazały, że badana pochodna hamuje aktywność iNOS, COX-2 oraz

syntezę interleukiny 6 i 1β. Ponadto, zaobserwowano supresję działania

czynnika transkrypcji NFκB oraz genów zależnych od NFκB.


233

W najnowszej literaturze, można także znaleźć wyniki badań

aktywności przeciwzapalnej nowych hybryd estru CAPE (CAPE-aspiryna

i CAPE-indometacyna). Stosując zwierzęcy model badawczy, wykazano,

że połączenie CAPE-aspiryna hamuje proces zapalny indukowany

paracentezą, którego nasilenie oceniano mierząc poziom TNF-α (ang.

tumor necrosis factor) oraz PGE2[86]. Również wyniki innych prac

badawczych, obejmujących analizę porównawczą aktywności przeciw-

zapalnej kwasu ferulowego, kumarynowego i ich pochodnych, prowadzone

na makrofagach (Raw 264.7) stymulowanych LPS-em wskazują, że

najsilniejszą aktywność przeciwzapalną (hamowanie ekspresji iNOS oraz

tworzenia NFκB) wykazuje diferuloiloputrescyna, następnie p-dikuma-

roiloputrescyna, kwas ferulowy i p-kumarynowy izolowane z otrąb

kukurydzianych [87].

Jednocześnie, należy także wspomnieć, że pojawiają się doniesienia na

temat prozapalnych właściwości kwasu chlorogenowego. W badaniach

in vivo (na szczurach) wykazano, że wysokie dawki kwasu chlorogenowego

(7 mg/kg)powodują zwiększoną adhezję leukocytów, tworzenie nadtlenków

i wyciek albuminy z naczyń krwionośnych. Ponadto, zaobserwowano

wzrost poziomu MDA,nasilenie aktywności mieloperoksydazy i uwalniania

cytokin prozapalnych oraz zwiększenie aktywności oksydazy NADPH,

SOD oraz CAT [88].


234

Tabela 3.Ocena właściwości przeciwzapalnych wybranych fenolokwasów przy zastosowaniu

różnych modeli doświadczalnych

Kwas Badania in vitro Badania in vivo

kawowy

hamowanie aktywacji

i ekspresji NFκB pod

wpływem działania TNF-α

w ludzkich keratynocytach

[56]

obniżenie poziomu IL-1β,

TNF-α oraz MCP-1 (ang.

monocyte chemoattractant

protein) w makrofagach,

w których stan zapalny

indukowano LPS-em [57]

przeciwzapalna aktywność

CAPE wykazana w badaniach

z użyciem ludzkich komórek

nabłonkowych z ucha

środkowego (hamowanie

ekspresji TNF-α i COX-2)

– stan zapalny indukowano

H2O2 [58]

hamowanie generowania

NO oraz PGE2

w makrofagach

stymulowanych LPS-em.

Hamowanie ekspresji TNF-α,

iNOS oraz COX-2 [59]

hamowanie produkcji NO,

IL-6 oraz IL-1β

w makrofagach pobudzanych

LPS-em [60]

działanie przeciwzapalne

w badaniach na szczurzym

modelu zapalenia opłucnej

wywołanej karagenem (66%

redukcja migracji białych

krwinek przy stężeniu

kwasu 5mg/kg i 92,9%-

10mg/kg) [61]

zmniejszenie poziomu

TNF-α i IL-1β u szczurów

po ostrym urazie rdzenia

kręgowego [62]

hamowanie aktywacji

i ekspresji NFκB

indukowanej przez TNF-α

w komórkach ludzkich

keratynocytów. Ponadto,

stwierdzono hamowanie

ekspresji TNF-α, iNOS oraz

COX-2 w badaniach na

myszach [63]

hamowanie wydzielania

IL-1β, IL-6 i TNF-α,

zmniejszenie ekspresji

iNOS, COX-2 i GFAP (ang.

glial fibrillary acidic

protein) oraz obniżenie

produkcji NO oraz PGE2

u myszy, którym podawano

1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-

tetrahydropirydynę [64]

kumarowy

hamowanie syntezy TNF-

α u szczurów z zapaleniem

stawów, wywołanym

adjuwantem [65]

zmniejszenie aktywności

enzymów lizosomalnych

oraz peroksydacji lipidów

u szczurów ze stanem

zapalnym indukowanym

moczanem sodu [66]


235

ferulowy

hamowanie ekspresji genów

dla NFκB i iNOS oraz

zmniejszenie produkcji TNF-

α, IL-6, IL-1β i NO

w szczurzych komórkach

mięśni gładkich, w których

stan

zapalnywywoływanoH2O2[26]

obniżenie poziomu TNF-α

i IL-1β u szczurów

z zapaleniem stawów,

indukowanym kolagenem

[67]

chlorogenowy

hamowanie translokacji

NFκB z cytoplazmy do jądra

komórkowegooraz

hamowanie ekspresji MCP-1

i IL-6 w komórkach

gwiaździstych wątroby (kom.

Browicza-Kupffera),

stymulowanych LPS-em [68]

hamowanie syntezy NO, IL-

1β, IL-6 oraz TNF-α oraz

ekspresji COX-2 i iNOS.

Hamowanie translokacji

NFκB w makrofagach

i komórkach mikgogleju

stymulowanych LPS-em [69]

hamowanie NO i PGE2 oraz

ekspresji iNOS i COX-2

w ludzkich chondrocytach

poddanych stymulacji

IL-1β [70]

Obniżenie poziomu TNF-α

i IL-6 oraz ekspresji genów

dla NFκB w komórkach

mikrogleju stymulowanych

HSV [71]

hamowanie adhezji

i migracji neutrofili

w badaniach na liniach

komórkowych śródbłonka

(ang. primary culture of

microvascular endothelial cell

– PMEC)w których stan

zapalny indukowano formylo-

leucyno-metionino-

fenyloalaniną [72]

obniżenie poziomu TNF-α

oraz aktywności COX-2

i iNOS w surowicy

u szczurów z niedo-

krwieniem/reperfuzją

spowodowanym

umieszczeniem klamry

uniemożliwiającej przepływ

krwi w płucach [35]

hamowanie ekspresji

białka zapalnego

makrofagów 2 oraz IL-1β

u myszy, u których stan

zapalny wywoływano

dekstranem siarczanu

sodu [73]


236

rozmarynowy

hamowanie syntezy NFκB

w neuronach stymulowanych

TNF-α [74]

hamowanie odpowiedzi

zapalnej zależnej od

niehistonowego białka

chromosomalnego HMGB1

(ang. high mobility group box

1 protein) i czynnika NFκB

w ludzkich komórkach

śródbłonka, w warunkach

stanu zapalnego

indukowanego cytokiną

HMGB1 (ang. high mobility

group box 1) [75]

obniżenie poziomu TNF-α,

IL-1β, Il-6, NO oraz ekspresji

NFκB u szczurów z cukrzycą,

wywołaną działaniem

streptozotocyny [76]

działanie przeciwzapalne

na szczurzym modelu

uszkodzenia płuc

indukowanego LPS-em

(spadek wydzielania cytokin

prozapalnych: TNF-α, IL-6

i IL-1) [77]

ograniczenie uszkodzeń

widocznych w obrazowaniu

histopatologicznym,

zmniejszenie obrzęku

mózgu, hamowanie

ekspresjiHMGB1 (ang.

high-mobility group box1)

i aktywności NFκB

u szczurów z cukrzycą,

u których indukowano stan

zapalny streptozotocyną

(Luan i wsp., 2013)

hamowanie migracji

leukocytów u myszy ze

stanem zapalnym

wywołanym LPS-em [75]

spadek aktywności

aminotransferaz ALAT

(ang. alanine

aminotransferase) i AspAT

(ang. aspartate

aminotransferase) oraz

stężenia MDA w surowicy

szczurów

z niedokrwieniem/reperfuzją

wywołanym założeniem

klamry blokującej przepływ

krwi w naczyniach

krwionośnych wątroby [78]

łagodzenie ostrego stanu

zapalnego trzustki,

indukowanego u myszy

taurocholanem sodu – kw.

rozmarynowy zastosowano

w dawce50 mg/kg masy

ciała [79]


237

3.3. Przeciwnowotworowe właściwości kwasów

hydroksycynamonowych

Dostępne są liczne prace oryginalne, wskazujące na chemoprewencyjne, antyproliferacyjne i anty-adhezyjne właściwości różnych kwasów fenolowych, a także prace poglądowe podsumowujące aktualny stan wiedzy (np. [89,90]). Molekularne mechanizmy działania tych związków pozostają jednak nie w pełni wyjaśnione, stąd też, w ostatnich latach obserwuje się liczne badania, prowadzone w oparciu o doświadczenia na różnych liniach komórkowych lub modelach zwierzęcych, mające na celu ustalenie głównych biochemicznych szlaków działania fenolokwasów (Tabela 4). Badania porównawcze pozwalają natomiast na uzyskanie szerszego obrazu efektywności działania przeciwnowotworowego kwasów hydroksycynamonowych. W pracach badawczych tego typu potwierdzono m.in. przeciwnowotworowe właściwości kwasu kawowego, p-kumarowego i ferulowego, wykorzystując model doświadczalny komórek raka płuca (A549) oraz linii komórek raka jelita grubego (HT29-D4). Wymienione fenolokwasy (50-200 μM) hamowały nie tylko proliferację komórek obu linii, ale także ich wiązanie się z różnymi białkami adhezyjnymi (lamininą 1, witronektyną i fibronektyną), co sugeruje, że związki te mogłyby działać na różnych etapach rozwoju choroby nowotworowej, hamując zarówno namnażanie komórek transformowanych, jak i ich adhezję [109]. Również w innych badaniach wykazano, że kwasy: kawowy, chlorogenowy i ferulowy (w zakresie stężeń ≥100 μM) mogą hamować proliferację oraz adhezję komórek A549, stymulowanych zastosowaniem estru forbolu (PMA, ang. phorbol-12-myristate-13-acetate). Biochemiczne mechanizmy obserwowanych efektów obejmują hamowanie szlaków przekazywania sygnału z udziałem kinaz MAPK, kinazy 3-fosfatydyloinozytolu (PI3K) oraz Akt, a także inaktywacji regulatorów transkrypcji, takich jak NF-κB (ang. nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), kompleksu AP-1 (ang. activator protein 1) oraz STAT (ang. signal transducer and activator of transcription 3) [110]. W przypadku kwasu kawowego, najnowsze badania wskazują, że dla przeciwnowotworowego działania tego związku in vitro i in vivo istotne znaczenie ma także zdolność hamowania podziałów macierzystych komórek nowotworowych (CSCs, ang. cancer stem cells). Molekularny mechanizm tego efektu obejmuje blokowanie przez kwas kawowy szlaków przekazywania sygnałów zależnych od czynnika TGFβ i receptora Smad2 [111].

Omawiając postęp w badaniach nad przeciwnowotworowym działaniem fenolokwasów należy jednak przede wszystkim wymienić syntezę nowych pochodnych różnych kwasów fenolowych w celu zwiększenia skuteczności ich działania farmakologicznego oraz ocenę działania tych pochodnych. Do niedawna, większość badań nad pochodnymi kwasów hydroksy-cynamonowych dotyczyła estru fenetylowego kwasu kawowego (CAPE),


238

stanowiącego jeden z bioaktywnych składników miodów i propolisu. Jako główny mechanizm działania biologicznego tego związku wskazuje się zdolność specyficznego hamowania czynnika transkrypcyjnego NF-κB. Z uwagi na zdolność NF-κB do hamowania apoptozy, indukcji proliferacji oraz nasilania procesu angiogenezy, czynnik ten odgrywa ważną rolę w onkogenezie i progresji zmian nowotworowych – dlatego też może stanowić cel działania terapii przeciwnowotworowych [112]. Obecnie, wśród najnowszych doniesień dotyczących pochodnych fenolokwasów również można znaleźć kolejne prace na temat przeciwnowotworowego działania CAPE (np. [113,114,115]), ale zauważalny jest wyraźny wzrost zainteresowania nowymi, syntetycznymi pochodnymi kwasów fenolowych, takimi jak np. heterocykliczne estry kwasu kawowego[116] lub połączenia z chitozananem. Wiadomo, że koniugaty kwas kawowy-chitooligosacharyd posiadają m.in. właściwości przeciwrodnikowe [117], ale ostatnio zwrócono również uwagę na fakt, że chitozanowe pochodne fenolokwasów mogą działać przeciwnowotworowo. W badaniach na linii komórkowej CT26 (raka jelita grubego) stwierdzono, że koniugaty kwasu kawowego i chitozanu (kw. kawowy przyłączony do grup aminowych chitozanu) charakteryzują się silniejszymi właściwościami anty-proliferacyjnymi i pro-apoptotycznymi niż chitozan. Opisywane pochodne ograniczały także inwazję komórek nowotworowych w testach z użyciem podłoża Matrigel

®

[118], stanowiącego zrekonstruowaną błonę podstawną. Ponadto, chitozan w połączeniu z kwasem kawowym może stanowić bazę do tworzenia nanocząsteczek służącychjako nośniki leków przeciwnowotworowych. Ostatnio badane jest m.in. zastosowanie samoorganizujących się nanocząsteczek zbudowanych z koniugatów chitozanu i kwasu kawowego oraz karboksymetylodekstranu i glikolu polietylenowego (CMD-PEG), jako formy precyzyjnego dostarczania doksorubicyny do komórek nowotworowych in vitro [119]. Stosując model eksperymentalny raka płuc (doświadczenia in vitro i in vivo) wykazano z kolei przeciwnowotworowe właściwości kwasu 4-O-(2″-O-acetylo-6″-O-p-kumaroilo-β-D-gluko-pira-nozylo)-p-kumarynowego [120]. Opublikowano także prace na temat właściwości przeciwnowotworowych kawoilo- i feruilopochodnych wani-lliny oraz metylowaniliny pochodzące z badań in vitro oraz in vivo. W testach in vitro wyraźny efekt cytotoksyczny stwierdzono w przypadku kilku pochodnych, natomiast w badaniach na myszach, najsilniejszym efektem przeciwnowotworowym charakteryzował się 5-nitro kawoilan adamantylu, zmniejszający wagę guzów o ok. 36,7% (przy zastosowaniu dawki 40 mg/kg masy ciała) [121].

Wśród najnowszych odkryć w dziedzinie potencjalnego zastosowania kwasu kawowego w terapii nowotworów warto również wspomnieć możliwość zastosowania tego związku w formie stałych nanocząstek lipidowych [122]. Ponadto, trwają badania nad przeciwnowotworowymi właściwościami nieorganicznych pochodnych kwasu ferulowego, o charak-


239

terze nanohybryd. W doświadczeniach na komórkach linii HeLa stwier-dzono, że takie pochodne wykazują dwukrotnie silniejszą aktywność przeciwproliferacyjną w porównaniu do samego fenolokwasu [123]. Z kolei kompleksy kwasu chlorogenowego i oksowanadu (Na[VO(kw.

chlorogenowy)(H2O)3]4H2O) są badane pod kątem zastosowania w leczeniu raka sutka. W warunkach in vitro wykazano selektywną cytotoksyczność tych związków w stosunku do komórek linii raka sutka (SKBR3) [124].

Inną możliwością terapeutycznego wykorzystania i wzmocnienia przeciwnowotworowego działania kwasów fenolowych jest opracowanie terapii opartych na synergistycznym działaniu tych związków z innymi substancjami lub lekami. Oddziaływania synergistyczne pomiędzy chemoterapeutykami przeciwnowotworowymi i naturalnymi związkami fenolowymi, a także synergizm przeciwnowotworowy między roślinnymi (poli)fenolami są obecnie intensywnie badane. Efekt taki wykazano dla wielu związków fenolowych lub ekstraktów bogatych w polifenole (w tym fenolokwasy), w badaniach z zastosowaniem cytostatyków przeciw-nowotworowych o różnych mechanizmach działania, takich jak np. doksorubicyna (antybiotyk antracyklinowy), tamoksyfen (modulator receptora estrogenowego),5-fluorouracyl (antymetabolit),docetaksel ipaklitaksel (taksany, inhibitory mitozy), czy winkrystyna (alkaloid, inhibitor mitozy) [125]. W przypadku zastosowania fenolokwasów jako wzmocnienia terapii przeciwnowotworowejoceniane są takżemożliwości ich stosowania w połączeniu z inhibitorami polimeraz poli-ADP-rybozy (PARP, ang.poly (ADP-ribose) polymerase). Ze względu na kluczową rolę PARP w procesach naprawy DNA, blokowanie ich aktywności w komórkach nowotworowych stanowi cel terapii nowotworów uwarun-kowanych niedoborem aktywności BRCA1/2, takich jak rak piersi czy jajnika. Zahamowanie aktywności PARP prowadzi zjawiska tzw. sztucznie wywołanej letalności (ang. synthetic lethality), stanowiącej podstawę działania leków z grupy inhibitorów PARP [126]. Ocena działania kombinacji kwasu ferulowego oraz ABT-888 (inhibitor PARP) wykazała, że kwas ferulowy uwrażliwia komórki raka sutka (linia MDA-MB-231) na działanie tego inhibitora PARP[127]. Ponadto, działanie kwasu ferulowego może być również wzmocnione poprzez podawanie go z kwasem acetylosalicylowym (aspiryna) w formie nanokapsułek pokrytych chitozanem. W doświadczeniach na liniach komórkowych raka trzustki wykazano, że połączenie kwasu ferulowego i aspiryny w formie takich nanokapsułek znacząco redukuje przeżywalność komórek linii MIA PaCa-2 oraz Panc-1, a in vivo ogranicza wzrost guzów u zwierząt objętych badaniem[128]. Synergistyczny efekt antyproliferacyjny zaobserwowano także stosując kwas ferulowy w połączeniu z δ-tokotrienolem (badania na komórkach linii DU-145, MCF-7 oraz PANC-1) [129].


240

Tabela 4. Ocena właściwości przeciwnowotworowych wybranych fenolokwasów przy zastoso-

waniu różnych modeli doświadczalnych

Kwas Badania in vitro Badania in vivo

ferulowy

radiouczulające działanie na

komórki raka szyki macicy

(linii HeLa oraz ME-180) [91]

efekt antyproliferacyjny

i hamowanie zdolności

tworzenia kolonii komórek

linii TT (raka rdzeniastego

tarczycy na skutek ekspresji

genu URG4/URGCP [92]

hamowanie cyklu

komórkowego w komórkach

raka prostaty linii PC-3 oraz

działanie proapoptotyczne

w komórkach linii LNCaP [93]

działanie antyangiogenne –

hamowanie odpowiedzi

komórkowej na czynnik

wzrostu fibroblastów 1 (FGF-

1, ang. basic fibroblast growth

factor 1); kwas ferulowy

wykazuje zdolność

hamowania/blokowania

funkcji receptora dla czynnika

FGF-1, powoduje

zahamowanie szlaków

przekazywania sygnału

z udziałem kinazy 3-

fosfatydyloinozytolu (PI3K)

oraz kinazy Akt [94]

zastosowanie kombinacji

kw. ferulowego oraz weli-

parybu (ABT-888) – inhibitora

receptorów PARP, zwiększa

wrażliwości komórek raka

sutka na działanie tego

inhibitora (linie MDA-MB-

231 oraz MCF-7) [95]

zaobserwowano spadek

przeżywalności i hamowanie

tworzenia kolonii komórek

linii MIA PaCa-2 trakto-

wanych kw. ferulowym [96]

hamowanie karcynogenezy

(zapobieganie tworzeniu

guza w badaniu na

zwierzętach) poprzez

modulowanie ekspresji

i aktywności

cyklooksygenazy 2, NF-B

oraz czynnika wzrostu

śródbłonka naczyń (VEGF,

ang. vascular endothelial

growth factor[97]

ochrona przed

hepatotoksycznością

diosbulbiny B

i wzmocnienie

przeciwnowotworowego jej

działania – badania na

myszach [98]

hamowanie angiogenezy

i wzrostu guzów

indukowanych u myszy

poprzez wprowadzenie

komórek linii czerniaka

B16F10 [94]


241

kawowy

hamowanie proliferacji

komórek włókniakomięsaka

(linia HT-1080) [99]

działanie proapoptotyczne

w komórkach białaczkowych

(linii HEL) [100]

o-kumarowy

efekt chemoprewencyjny

w doświadczeniach na

komórkach raka sutka (linia

MCF-7) [101]

p-kumarowy

działanie antyangiogenne

(linia ECV304) na skutek

hamowania szlaków przeka-

zywania sygnałów z udziałem

kinaz AKT i ERK [102]

hamowanie wzrostu

guzów, indukowanych

u myszy poprzez iniekcję

komórkami RENCA [102]

chlorogenowy

indukcja apoptozy

w komórkach białaczki U937

na skutek stymulacji wzrostu

ekspresji kaspazy 3, 7, 8 oraz

9, a także poprzez zmiany

(redukcję) potencjału błony

mitochondrialnej [103]

hamowanie proliferacji

i proapoptotyczne działanie na

komórki linii HL-60 (ostrej

białaczki promielocytowej)

[104]

efekt anty-angiogenny,

będący wynikiem inhibicji

szlaku przekazywania sygnału

z udziałem czynnika HIF-1α

(czynnika transkrypcyjnego

indukowany hipoksją) oraz

kinazy AKT [105]

wzmocnienie

przeciwnowotworowego

działania 5-fluorouracylu na

komórki raka

wątrobowokomórkowego

(linie HepG2 i Hep3B) [106]

rozmarynowy radiouczulające działanie na

komórki czerniaka (linia

B16F10) [107]

hamowanie indukowanej

7,12-

dimetylobenzo[a]antracenem

karcynogenezy komórek

skóry myszy [108]


242

4. Podsumowanie

W odróżnieniu od flawonoidów badanych bardzo intensywnie od ponad 25

lat, wzrost zainteresowania biologiczną aktywnością fenolokwasów roślinnych

stanowi stosunkowo nowe zagadnienie w naukach biomedycznych.

Szczególnie w ostatnich kilku latach obserwuje się znaczący postęp

i rozszerzenie zakresu prac badawczych tych związków oraz ich pochodnych.

Dostępna literatura dostarcza najwięcej danych dotyczących właści-

wościach kwasu kawowego (głównie aktywności antyoksydacyjnej) oraz

o jego naturalnej pochodnej – estru fenetylowego kwasu kawowego (CAPE)

potwierdzonych w badaniach in vitro jak i in vivo. Ponadto, znaleźć można

prace dotyczące działania antyoksydacyjnego, przeciwzapalnego oraz

przeciwnowotworowego kwasu ferulowego, chlorogenowego i rozmaryno-

wego. Najmniej poznanymi fenolokwasami pozostają nadal kwas kuma-

rynowy oraz synapinowy.

Główne kierunki badań dotyczących możliwego zastosowania

farmakologicznego fenolokwasów dotyczą przeciwzapalnej i przeciw-

nowotworowej aktywności różnych pochodnych kwasów hydroksy-

cynamonowych (m.in. koniugatów z naturalnymi biopolimerami, substancjami

syntetycznymi oraz składnikami nieorganicznymi), projektowanych w celu

zwiększenia efektywności potencjalnego działania leczniczego. Warto również

wspomnieć, że badania tego typu obejmują również opracowanie

odpowiednich formulacji preparatów fenolokwasowych, w tym użycie ich

w postaci nanocząstek lipidowych, a także, jako składników mieszanin

o synergistycznym efekcie terapeutycznym.

Literatura

1. Maeda H., Dudareva N., The Shikimate Pathway and Aromatic Amino Acid

Biosynthesis in Plants, The Annual Review of Plant Biology 63 (2010), s. 73-105

2. Gawlik-Dziki U., Fenolokwasy jako bioaktywne składniki żywności, Żywność.

Nauka. Technologia. Jakość 4 (2004), s. 29-40

3. Budryn G., Nebesny E., Fenolokwasy – ich właściwości, występowanie

w surowcach roślinnych, wchłanianie i przemiany metaboliczne, Bromatologia

i Chemia Toksykologiczna 2 (2006), s. 103-110

4. Shahidi F., Chandrasekara A., Hydroxycinnamates and their in vitro and

in vivo antioxidant activities, Phytochemistry Reviews 9 (2010), s. 147-170

5. Saibabu V., Fatima Z., Khan L. A, Hameed S,. Therapeutic Potential

of Dietary Phenolic Acids, Advances in Pharmacological Sciences 2015, doi:

doi:10.1155/2015/823539

6. Teixeira J., Gaspar A., Garrido E. M., Garrido J., Borges F., Hydroxycinnamic

Acid Antioxidants: An Electrochemical Overview (2013)

http://dx.doi.org/10.1155/2013/251754

7. Petersen M., Simmonds, Rosmarinic acid, Phytochemistry 62 (2003), s. 121-125


243

8. Maurya D. K., Devasagayam T. P. A., Antioxidant and prooxidant nature

of hydroxycinnamic acid derivatives ferulic and caffeic acids, Food and

Chemical Toxicology 48 (2010), s. 3369-3373

9. Gocer H., Gulcin I., Caffeic acid phenethyl ester (CAPE): correlation

of structure and antioxidant properties, International Journal of Food Sciences

and Nutrition, 62(8) (2011), s. 821-825

10. Jeong Ch-H., Jeong H. R., Choi G. N., Kim D-O., Lee U., Heo H. J.,

Neuroprotective and anti-oxidant effects of caffeic acid isolated from Erigeron

annuus leaf, Chinese Medicine 6:25 (2011) s. 1-9

11. Eom T-K., Senevirathne M., Kim S-K., Synthesis of phenolic acid conjugated

chitooligosaccharides and evaluation of their antioxidant activity,

Environmental Toxicology And Pharmacology 34 (2012), s. 519-527

12. Genaro-Mattos T. C., Maurício A. Q., Rettori D., Alonso A., Hermes-Lima

M., Antioxidant Activity of Caffeic Acid against Iron-Induced Free Radical

Generation – A Chemical Approach, PLoS ONE 10(6) (2015) e0129963

13. Song J-J., Lim H. W., Kim K., Kim K-M., Cho S., Chae S-W., Effect of caffeic

acid phenethyl ester (CAPE) on H2O2 induced oxidative and inflammatory

responses in human middle ear epithelial cells, International Journal

of Pediatric Otorhinolaryngology 76 (2012), s. 675-679

14. Santos J. L. A., Bispo V. S., Filho A. B. C., Pinto I. F. D., Dantas L. S.,

Vasconcelos D. F., Abreu F. F., Melo D. A., Matos I. A., Freitas F. P., Gomes

O. F., Medeiros M. H. G., Matos H. R., Evaluation of Chemical Constituents

and Antioxidant Activity of Coconut Water (Cocus nucifera L.) and Caffeic

Acid in Cell Culture, Annals of the Brazilian Academy of Sciences 85(4)

(2013), s. 1235-1246

15. Asano M., Iwahashi H., Caffeic Acid Inhibits the Formation of 7-

Carboxyheptyl Radicals from Oleic Acid under Flavin Mononucleotide

Photosensitization by Scavenging Singlet Oxygen and Quenching the Excited

State of Flavin Mononucleotide, Molecules 19 (2014), s. 12486-12499

16. Kokoszko-Bilska A., Stepniak J., Lewinski A., Karbownik-Lewinska M.,

Protective antioxidative effects of caffeic acid phenethyl ester (CAPE) in the

thyroid and the liver are similar to those caused by melatonin, Thyroid

Research 7:5 (2014)

17. Rastogi H., Jana S., Evaluation of Inhibitory Effects of Caffeic acid and

Quercetin on Human Liver Cytochrome P450 Activities, Phytotherapy

Research 28 (2014), s. 1873-1878

18. Coelho V. R., Vieira C. G., de Souza L. P., Moysés F., Basso C., Papke D. K.

M., Pires T. R., Siqueira I. R., Picada J. R., Pereira P., Antiepileptogenic,

antioxidant and genotoxic evaluation of rosmarinic acid and its metabolite

caffeic acid in mice, Life Sciences 122 (2015), s. 65-71

19. Ikeda H., Kimura Y., Masaki M., Iwahashi H., Caffeic acid inhibits the

formation of 1 hydroxyethyl radical in the reaction mixture of rat liver

microsomes with ethanol partly through its metal chelating activity, Journal

of Clinical Biochemistry and Nutrition 48 (3) (2011), s.187-193

20. Erboga M., Kanter M., Aktas C., Donmez Y. B., Erboga Z. F., Aktas E., Gurel

A., Anti-Apoptotic and Anti-Oxidant Effects of Caffeic Acid Phenethyl Ester


244

on Cadmium-Induced Testicular Toxicity in Rats, Biological Trace Element

Research (2015) DOI 10.1007/s12011-015-0509-y

21. dos Santos Sales I. M., do Nascimento K. G., Feitosa Ch. M., Saldanha G. B.,

Feng D., de Freitas R. M., Caffeic acid effects on oxidative stress in rat

hippocampus after pilocarpine-induced seizures, Neurological Sciences 32

(2011), s. 375-380

22. Ozkan U., Osun A., Basarslan K., Senol S., Kaplan I., Alp H., Effects

of intralipid and caffeic acid phenethyl ester on neurotoxicity, oxidative stress,

and acetylcholinesterase activity in acute chlorpyriphos intoxication,

International Journal of Clinical and Experimental Medicine 7(4) (2014),

s. 837-846

23. Kilic I., Yesiloglu Y., Spectroscopic studies on the antioxidant activity

of p-coumaric acid, Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular

Spectroscopy 115 (2013), s. 719-724

24. Garzón A., Bravo I., Barbero A. J., Albaladejo J., Mechanistic and Kinetic

Study on the Reactions of Coumaric Acids with Reactive Oxygen Species:

A DFT Approach, Journal od Agricultural and Food Chemistry 62 (2014),

s. 9705-9710

25. Bian Y-Y., Guo J., Majeed H., Zhu K-X., Guo X-N., Peng W., Zhou H-M.,

Ferulic acid renders protection to HEK293 cells against oxidative damage

and apoptosis induced by hydrogen peroxide, In Vitro Cellular &

Developmental Biology – Animal 51 (2015), s. 722-729

26. Cao Y-J., Zhang Y-M., Qi J-P., Liu R., Zhang H., He L-Ch., Ferulic acid

inhibits H2O2-induced oxidative stress and inflammation in rat vascular

smoothmuscle cells via inhibition of the NADPH oxidase and NF-κB pathway,

International Immunopharmacology 28 (2015), s. 1018-1025

27. Machado K. C., Oliveira G. L. S., de Sousa E. B. V., Costa I. H. F., Machado

K. C., de Sousa D. P., Satyal P., de Freitas R. M., Spectroscopic studies on the

in vitro antioxidant capacity of isopentyl ferulate, Chemico-Biological

Interactions 225 (2015), s. 47-53

28. Sompong W., Cheng H., Adisakwattana S., Glucose-Induced Protein

Glycation, Lipid Peroxidation, and Membrane Ion Pump Activity in Human

Erythrocytes, PLoS ONE 10(6): e0129495

29. Picone P., Nuzzo D., Di Carlo M., Ferulic Acid: a Natural Antioxidant

Against Oxidative Stress Induced by Oligomeric A-beta on Sea Urchin

Embryo, The Biological Bulletin 224 (2013), s. 18-28

30. Bacanlı M., Aydın S., Taner G., Göktas H. G., Sahin T., Basaran A. A.,

Basaran N., The protective role of ferulic acid on sepsis-inducedoxidative

damage in Wistar albino rats, Environmental Toxicology and Pharmacology

38 (2014), s. 774-782

31. Silambarasan T., Manivannan J., Priya M. K., Suganya N., Chatterjee S., Raja

B., Sinapic acid protects heart against ischemia/reperfusion injury and H9c2

cardiomyoblast cells against oxidative stress, Biochemical and Biophysical

Research Communications 456 (2015), s. 853-859


245

32. Xu J-G., Hu Q-P., Liu Y., Antioxidant and DNA-Protective Activities

of Chlorogenic Acid Isomers, Journal of Agricultural and Food Chemistry

60 (2012), s. 11625 -11630

33. Cha J. W., Piao M. J., Kim K. Ch., Yao Ch. W., Zheng J., Kim S. M., Hyun

Ch. L., Ahn Y. S., Hyun J. W., The Polyphenol Chlorogenic Acid Attenuates

UVB-mediated Oxidative Stress in Human HaCaT Keratinocytes,

Biomolecules and Therapeutics 22(2) (2014), s. 136-142

34. Pang Ch., Sheng Y-cC, Jiang P., Wei H., Ji L-l., Chlorogenic acid prevents

acetaminophen-induced liver injury: the involvement of CYP450 metabolic

enzymes anD some antioxidant signals, Biomedicine & Biotechnology 16(7)

(2015), s. 602-610

35. Yun N., Kang J-W., Lee S-M., Protective effects of chlorogenic acid against

ischemia/reperfusion injury in rat liver: molecular evidence of its antioxidant

and anti-inflammatory properties, Journal of Nutritional Biochemistry 23

(2012), s. 1249-1255

36. Koriem K. M. M., Soliman R. E., Chlorogenic and Caftaric Acids in Liver

Toxicity and Oxidative Stress Induced by Methamphetamine, Journal

of Toxicology (2015), http://dx.doi.org/10.1155/2014/583494

37. Mehni F., Sharififar F., Ansari M., Antioxidant activity and rosmarinic acid

content of ten medicinal plants, Research in Pharmaceutical Sciences 7(5) (2012)

38. Muñoz-Muñoz J. L., Garcia-Molina F., Ros E., Tudela J., García-Canovas F.,

Rodriguez-Lopez J. N., Prooxidant and antioxidant activities of rosmarinic

acid, Journal of Food Biochemistry (2011) doi:10.1111/j.1745-

4514.2011.00639.x

39. Fadel O., Kirat K. E., Morandat S., The natural antioxidant rosmarinic acid

spontaneously penetrates membranes to inhibit lipid peroxidation in situ,

Biochimica et Biophysica Acta 1808 (2011), s. 2973-2980

40. Hajhosseini L., Khaki A., Merat E., Ainehchi N., Effect Of Rosmarinic Acid

On Sertoli Cells Apoptosis And Serum Antioxidant Levels In Rats After

Exposure To Electromagnetic Fields, African Journal of Traditional,

Complementary and Alternative Medicines 10(6) (2013), s. 477-480

41. Zhu F., Asada T., Sato A., Koi Y., Nishiwaki H., Tamura H., Rosmarinic Acid

Extract for Antioxidant, Antiallergic, and α‑Glucosidase Inhibitory Activities,

Isolated by Supramolecular Technique and Solvent Extraction from Perilla

Leaves, Journal of Agricultular and Food Chemistry 62 (2014), s. 885−892

42. Govindaraj J., Pillai S. S., Rosmarinic acid modulates the antioxidant status

and protects pancreatic tissues from glucolipotoxicity mediated oxidative

stress in high-fat diet: streptozotocin-induced diabetic rats, Molecular and

Cellular Biochemistry 404 (2015), s. 143-159

43. Mushtaq N., Schmatz R., Ahmed M., Pereira L. B., da Costa P., Reichert K.

P., Dalenogare D., Pelinson L. P., Vieira J. M., Stefanello N., de Oliveira L.

S., Mulinacci N., Bellumori M., Morsch V. M., Schetinger M. R., Protective

effect of rosmarinic acid against oxidative stress biomarkers in liver and

kidney of strepotozotocin-induced diabetic rats, Journal of Physiology and

Biochemistry (2015) DOI 10.1007/s13105-015-0438-4


246

44. Zhang Y., Chen X., Yang L., Zu Y., Lu Q., Effects of rosmarinic acid on liver

and kidney antioxidant enzymes, lipid peroxidation and tissue ultrastructure

in aging mice, Food and Function 6 (2015), s. 927-931

45. Sato Y., Itagaki S., Kurokawa T., Ogura J., Kobayashi M., Hirano T.,

Sugawara M., Iseki K., In vitro and in vivo antioxidant properties

of chlorogenic acid and caffeic acid, International Journal of Pharmaceutics

403 (2011), s. 136-138

46. Celik S. E., Özyürek M., Tufan A. N., Güclü K., Apak R., Spectroscopic study

and antioxidant properties of the inclusion complexes of rosmarinic acid with

natural and derivative cyclodextrins, Spectrochimica Acta Part A 78 (2011),

s. 1615-1624

47. Terpinc P., Polak T., Ńegatin N., Hanzlowsky A., Ulrih N. P., Abramovic H.,

Antioxidant properties of 4-vinyl derivatives of hydroxycinnamic acids, Food

Chemistry 128 (2011), s. 62-69

48. Modrzejewska Z., Formy chitozanowe do zastosowań w inżynierii

biomedycznej, Inżynieria i Aparatura Chemiczna 50 (2011), s. 74-75

49. Woranuch S., Yoksana R., Preparation, characterization and antioxidant

property of water-soluble ferulic acid grafted chitosan, Carbohydrate

Polymers 96 (2013), s. 495-502

50. Lee D-S., Woo J-Y., Ahn Ch-B., Je J-Y., Chitosan – hydroxycinnamic acid

conjugates: Preparation, antioxidant and antimicrobial activity, Food

Chemistry 148 (2014), s. 97-104

51. Liu J., Wen X-Y., Lu J-F., Kan J., Jin Ch-H., Free radical mediated grafting

of chitosan with caffeic and ferulicacids: Structures and antioxidant activity,

International Journal of Biological Macromolecules 65 (2014), s. 97-106

52. Garrido J., Gaspar A., Garrido E. M., Miri R., Tavakkoli M., Pourali S., Saso

L., Borges F., Firuzi O., Alkyl esters of hydroxycinnamic acids with improved

antioxidant activity and lipophilicity protect PC12 cells against oxidative

stress, Biochimie 94 (2012), s. 961-967

53. Piazzon A., Vrhovsek U., Masuero D., Mattivi F., Mandoj F., Nardini M.,

Antioxidant Activity of Phenolic Acids and Their Metabolites: Synthesis and

Antioxidant Properties of the Sulfate Derivatives of Ferulic and Caffeic Acids

and of the Acyl Glucuronide of Ferulic Acid, Journal of Agricultural and Food

Chemistry 60 (2012), s. 12312−12323

54. Gaspar A., Martins M. Silva P., Garrido E.M., Garrido J., Firuzi O., Miri R.,

Saso L., Borges F., Dietary Phenolic Acids and Derivatives. Evaluation of the

Antioxidant Activity of Sinapic Acid and Its Alkyl Esters, Journal Agricultural

and Food Chemistry 58 (2010), s. 11273-11280

55. Wang J., Gu S-S., Pang N., Wang F-Q,, Pang F., Cui H-S., Wu X-Y., Wu F-

A., Alkyl Caffeates Improve the Antioxidant Activity, Antitumor Property and

Oxidation Stability of Edible Oil, PLoS ONE 9(4) (2014) e95909

56. Lim K-M., Bae S., Koo J. E., Kim E-S., Bae O-N, Lee J. Y., Suppression

of skin inflammation in keratinocytes and acute/chronic disease models by

caffeic acid phenethyl ester, Archives of Dermatological Research 307 (2015),

s. 219-227


247

57. Juman S., Yasui N., Ikeda K., Ueda A., Sakanaka M., Negishi H., Mikia T.,

Caffeic Acid Phenethyl Ester Suppresses the Production of Proinflammatory

Cytokines in Hypertrophic Adipocytes through Lipopolysaccharide-Stimulated

Macrophages, Biological and Pharmaceutical Bulletin 35(11) (2012),

s. 1941-1946

58. Song J-J., Lim H. W., Kim K., Kim K-M., Cho S., Chae S-W., Effect of caffeic

acid phenethyl ester (CAPE) on H2O2 induced oxidative and inflammatory

responses in human middle ear epithelial cells, International Journal

of Pediatric Otorhinolaryngology 76 (2012), s. 675-679

59. Yang W. S., Jeong D.,1 Yi Y-S., Park J. G., Seo H., Moh S. H., Hong S., Cho

J. Y., IRAK1/4-Targeted Anti-Inflammatory Action of Caffeic Acid (2013)

http://dx.doi.org/10.1155/2013/518183

60. Choi E-Y., Choe S-H., Hyeon J-Y., Choi J-I., Choi I. S., Kim S-J., Effect

of caffeic acid phenethyl ester on Prevotella intermedia lipopolysaccharide-

induced production of proinflammatory mediators in murine macrophages,

Journal of Periodontal Research (2015), doi:10.1111/jre.12260

61. Gamaro G. D., Suyenaga E., Borsoi M., Lermen J., Pereira P., Ardenghi P.,

Effect of Rosmarinic and Caffeic Acids on Inflammatory and Nociception

Process in Rats, (2011), doi:10.5402/2011/451682

62. Ak H., Gülşen I., Karaaslan T., Alaca I., Candan A., Koçak H., Atalay T.,

Çelikbilek A., Demir I., Yılmaz T., The effects of caffeic acid phenethyl ester

on inflammatory cytokines after acute spinal cord injury, Journal of Trauma

and Emergency Surgery 21(2) (2015), s. 96-101

63. Lim K-M., Bae S., Koo J.E., Kim E-S., Bae O-N., Lee J. Y., Suppression

of skin inflammation in keratinocytes and acute/chronic disease models by

caffeic acid phenethyl ester, Archives of Dermatological Research 307 (2015),

s. 219-227

64. Tsai S-J., Chao Ch-Y., Yin M-Ch., Preventive and therapeutic effects

of caffeic acid against inflammatory injury in striatum of MPTP-treated mice,

European Journal of Pharmacology 670 (2011), s. 441-447

65. Pragasam S. J., Venkatesan V., Rasool M., Immunomodulatory and Anti-

inflammatory Effect of p-Coumaric Acid, a Common Dietary Polyphenol on

Experimental Inflammation in Rats, Inflammation 36 (1) (2013)

66. Pragasam S. J., Rasool M .K., Dietary component p-coumaric acid suppresses

monosodium urate crystal-induced inflammation in rats, Inflammation

Research 62 (2013), s. 489-498

67. Zhu H., Liang Q-H., Xiong X-G., Chen J., Wu D., Wang Y., Yang B., Zhang

Y., Zhang Y., Huang X., Anti-Inflammatory Effects of the Bioactive

Compound Ferulic Acid Contained in Oldenlandia diffusa on Collagen-

Induced Arthritis in Rats (2014) http://dx.doi.org/10.1155/2014/573801

68. Shi H., Dong L., Dang X., Liu Y., Jiang J., Wang Y., Lu X., Guo X., Effect

of chlorogenic acid on LPS-induced proinflammatory signaling in hepatic

stellate cells, Inflammation Research 62 (2013), s. 581-587

69. Hwang S.J., Kim Y-W., Park Y., Lee H-J., Kim K-W., Anti-inflammatory

effects of chlorogenic acid in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 cells,

Inflammation Research 63 (2014), s. 81-90


248

70. Chen W-P., Wu L-D., Chlorogenic acid suppresses interleukin-1β-induced

inflammatory mediators in human chondrocytes, International Journal of

Clinical and Experimental Pathology 7(12) (2014), s. 8797-8801

71. Guo Y-J., Luo T., Wu F., Mei Y-W., Peng J., Liu H., Li H-R., Zhang S-L.,

Dong J-H., Fang Y., Zhao L., Involvement of TLR2 and TLR9 in the anti-

inflammatory effects of chlorogenic acid in HSV-1-infected microglia, Life

Sciences 127 (2015), s. 12-18

72. Hebeda C. B., Bolonheis S. M., Nakasato A., Belinati K., Souza P. D. C.,

Gouvea D. R., Lopes N. P., Farskya S. H. P., Effects of chlorogenic acid on

neutrophil locomotion functions in response to inflammatory stimulus, Journal

of Ethnopharmacology 135 (2011), s. 261-269

73. Shin H. S., Satsu H., Bae M-J., Zhao Z., Ogiwara H., Totsuka M., Shimizu M.,

Anti-inflammatory effect of chlorogenic acid on the IL-8 production in Caco-2

cells and the dextran sulphate sodium-induced colitis symptoms in C57BL/6

mice, Food Chemistry 168 (2015), s. 167-175

74. Luan H., Kan Z., Xu Y., Lv Ch., Jiang W., Rosmarinic acid protects against

experimental diabetes with cerebral ischemia: relation to inflammation

response, Journal of Neuroinflammation 10:28 (2013)

75. Yang E-J., Ku S-K., Lee W., Lee S., Lee T., Song K-S., Bae J-S., Barrier

Protective Effects of Rosmarinic Acid on HMGB1- Induced Inflammatory

Responses In Vitro and In Vivo, Journal of Cellular Physiology 228 (2013),

s. 975-982

76. Govindaraj J., Pillai S. S. Rosmarinic acid modulates the antioxidant status

and protects pancreatic tissues from glucolipotoxicity mediated oxidative

stress in high-fat diet: streptozotocin-induced diabetic rats, Molecular and

Cellular Biochemistry 404 (2015), s.143-159

77. Chu X., Ci X., He J., Jiang L., Wei M., Cao Q., Guan M., Xie X., Deng X., He

J., Effects of a Natural Prolyl Oligopeptidase Inhibitor, Rosmarinic Acid, on

Lipopolysaccharide-Induced Acute Lung Injury in Mice, Molecules 17 (2012),

s. 3586-3598

78. Rocha J., Eduardo-Figueira M., Barateiro A., Fernandes A., Brites D., Bronze

R., Duarte C. M. M., Serra A. T., Pinto R., Freitas M., Fernandes E., Silva-

Lima B., Mota-Filipe H., Sepodes B., Anti-inflammatory Effect of Rosmarinic

Acid and an Extract of Rosmarinus officinalis in Rat Models of Local and

Systemic Inflammation, Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology 116

(2015), s. 398-413

79. Fan Y. T., Yin G..J, Xiao W.Q., Qiu L., Yu G., Hu Y. L., Xing M., Wu D. Q.,

Cang X. F., Wan R., Wang X. P., Hu G. Y.. Rosmarinic acid attenuates

sodium taurocholate-induced acute pancreatitis in rats by inhibiting nuclear

factor-κB activation, The American Journal of Chinese Medicine 43 (2015),

s. 1117-35

80. Nunes S., Madureira R., Campos D., Sarmento B., Gomes A.M., Pintado M.,

Reis F.,Therapeutic and Nutraceutical Potential of Rosmarinic Acid

– Cytoprotective Properties and Pharmacokinetic Profile,Critical Reviews

in Food Science and Nutrition (2015), DOI: 10.1080/10408398.2015.1006768


249

81. Kim G. D., Park Y. S., Jin Y. H., Park C. S., Production and applications

of rosmarinic acid and structurally related compounds, Applied Microbiology

and Biotechnology 99(5) (2015), s. 2083-92

82. Huang N., Hauck C., Yum M-Y., Rizshsky L., Widrlechner M. P., McCoy J-

A., Murphy P. A., Dixon P. M., Nikolau B. J., Birt D. F., Rosmarinic Acid

in Prunella vulgaris Ethanol Extract Inhibits Lipopolysaccharide-Induced

Prostaglandin E2 and Nitric Oxide in RAW 264.7 Mouse Macrophages,

Journal Agricultural and Food Chemistry 57 (2009), s. 10579-10589

83. Boonyarikpunchai W., Sukrong S., Towiwat P., Antinociceptive and anti-

inflammatory effects of rosmarinic acid isolated from Thunbergia laurifolia

Lindl., Pharmacology, Biochemistry and Behavior 124 (2014), s. 67-73

84. Chagas-Paula D. A., de Oliveiraa R. B., da Silva V. C., Gobbo-Neto L.,

Gasparotoc T. H., Campanellic A. P., Faccioli L. H., Da Costaa F. B.,

Chlorogenic acids from Tithonia diversifolia demonstrate better anti-

inflammatory effect than indomethacin and its sesquiterpene lactones, Journal

of Ethnopharmacology 136 (2011), s. 355-362

85. Park S-Y., Hwang J-S., Jang M., Lee S. H., Park J-H., Han I-O., A novel

caffeic acid-1-piperonylpiperazine hybridization compound HBU-47 inhibits

LPS-mediated inflammation in RAW264.7 macrophage cells, International

Immunopharmacology 19 (2014), s. 60-65

86. Pittalà V., Salerno L., Romeo G., Siracusa M. A., Modica M. N., Romano G.

L., Salomone S., Drago F., Bucolo C., Effects of novel hybrids of caffeic acid

phenethyl ester and NSAIDs on experimental ocular inflammation, European

Journal of Pharmacology752 (2015), s. 78-83

87. Kim E. O., Min K. J., Kwon T. K., Um B. H., Moreau R. A., Choi S. W., Anti-

inflammatory activity of hydroxycinnamic acid derivatives isolated from corn

bran in lipopolysaccharide-stimulated Raw 264.7 macrophages, Food and

Chemical Toxicology 50 (2012), s. 1309-1316

88. Du W-Y., Chang Ch., Zhang Y., Liu Y-Y., Sun K., Wang Ch-S., Wang M-X.,

Liu Y., Wang F., Fan J-Y., Li P-T., Han J-Y., High-dose chlorogenic acid

induces inflammation reactions and oxidative stress injury in rats

withoutimplication of mast cell degranulation, Journal

ofEthnopharmacology147(2013), s. 74-83

89. Rocha L. D., Monteiro M. C., Teodoro A. J., Anticancer properties of hydroxy-

cinnamic acids – a review, Cancer and Clinical Oncology 1 (2012), s. 109-121

90. Su P., Shi Y., Wang J., Shen X., Zhang J., Anticancer agents derived from

natural cinnamic acids, Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry 15

(2015), s. 980-987

91. Karthikeyan S., Kanimozhi G., Prasad N. R., Mahalakshmi R.,

Radiosensitizing effect of ferulic acid on human cervical carcinoma cells

in vitro, Toxicology in Vitro 25 (2011), s. 1366-1375

92. Dodurga Y., Eroğlu C., Seçme M., Elmas L., Avcı Ç.B., Şatıroğlu-Tufan N.

L., Anti-proliferative and anti-invasive effects of ferulic acid in TT medullary

thyroid cancer cells interacting with URG4/URGCP, Tumour Biology 2015

(artykuł w druku)


250

93. Eroğlu C., Seçme M., Bağcı G., Dodurga Y., Assessment of the anticancer

mechanism of ferulic acid via cell cycle and apoptotic pathways in human

prostate cancer cell lines, Tumor Biology 2015; doi:10.1007/s13277-015-3689-3

94. Yang G.-W., Jiang J.-S., Lu W.-Q., Ferulic acid exerts anti-angiogenic and

anti-tumor activity by targeting fibroblast growth factor receptor 1-mediated

angiogenesis, International Journal of Molecular Sciences 16 (2015),

s. 24011-24031

95. Choi Y. E., Park E., Ferulic acid in combination with PARP inhibitor

sensitizes breast cancer cells as chemotherapeutic strategy, Biochemical and

Biophysical Research Communications 458 (2015), s. 520-524

96. Fahrioğlu U., Dodurga Y., Elmas L., Seçme M., Ferulic acid decreases cell

viability and colony formation while inhibiting migration of MIA PaCa-2

human pancreatic cancer cells in vitro, Gene (2015) artykuł w druku

97. Manoharan S., Rejitharaji T., Prabhakar M. M., Manimaran A., Singh R. B.,

Modulating effect of ferulic acid on NF-κB, COX-2 and VEGF expression

pattern during 7,12-Dimethylbenz(a)anthracene induced oral carcinogenesis,

The Open Nutraceuticals Journal 7 (2014), s. 33-38

98. Wang J.-M., Sheng Y.-C., Ji L.-L., Wang Z.-T., Ferulic acid prevents liver

injury and increases the anti-tumor effect of diosbulbin B in vivo, Journal of

Zhejiang University SCIENCE B 15 (2014), s. 540-547

99. Prasad N. R., KarthikeyanA., Karthikeyan S., Reddy B. V., Inhibitory effect

of caffeic acid on cancer cell proliferation by oxidative mechanism in human

HT-1080 fibrosarcoma cell line, Molecular and Cellular Biochemistry 349

(2011), s. 11-19

100. Zambonin L., Caliceti C., Dalla Sega F. V., Fiorentini D., Hrelia S., Landi L.,

Prata C., Dietary phenolic acids act as effective antioxidants in membrane

models and in cultured cells, exhibiting proapoptotic effects in leukaemia

cells, Oxidative Medicine and Cell Longevity (2012),

doi:10.1155/2012/839298

101. Sen A., Atmaca P., Terzioglu G., Arslan S., Anticarcinogenic effect and

carcinogenic potential of the dietary phenolic acid: o-coumaric acid, Natural

Product Communications 8 (2013), s. 1269-1274

102. Kong C.-S., Jeong C.-H., Choi J.-S., Kim K.-J., Jeong J.-W., Antiangiogenic

effects of p-coumaric acid in human endothelial cells, Phytotherapy Research

27 (2013), s. 317-323

103. Yang J. S., Liu C. W., Ma Y. S., Weng S. W., Tang N. Y., Wu S. H., Ji B. C.,

Ma C. Y., Ko Y. C., Funayama S., Kuo C. L., Chlorogenic acid induces

apoptotic cell death in U937 leukemia cells through caspase- and

mitochondria-dependent pathways, In Vivo 26 (2012), s. 971-978

104. Liu Y.-J., Zhou C.-Y, Qiu C.-H., Lu X.-M., Wang Y.-T. Chlorogenic acid

induced apoptosis and inhibition of proliferation in human acute

promyelocytic leukemia HL-60 cells, Molecular Medicine Reports 8 (2013),

s. 1106-1110

105. Park J. J., Hwang S. J., Park J.-H., Lee H.-J., Chlorogenic acid inhibits

hypoxia-induced angiogenesis via down-regulation of the HIF-1α/AKT

pathway, Cellular Oncology 38 (2015), s. 111-118


251

106. Yan Y., Li J., Han J., Hou N., Song Y., Dong L., Chlorogenic acid enhances

the effects of 5-fluorouracil in human hepatocellular carcinoma cells through

the inhibition of extracellular signal-regulated kinases, Anti-Cancer Drugs 26

(2015), s. 540-546

107. Alcaraz M., Alcaraz-Saura M., Achel D. G., Olivares A., López-Morata J.A.,

Castillo J. Radiosensitizing effect of rosmarinic acid in metastatic melanoma

B16F10 cells, Anticancer Research 34 (2014), s. 1913-1921

108. Sharmila R., Manoharan S., Anti-tumor activity of rosmarinic acid in 7,12-

dimethylbenz(a)anthracene (DMBA) induced skin carcinogenesis in Swiss

albino mice. Indian Journal of Experimental Biology (50) 2012, s. 187-194

109. Nasr Bouzaiene N., Kilani Jaziri S., Kovacic H., Chekir-Ghedira L., Ghedira

K., Luis J., The effects of caffeic, coumaric and ferulic acids on proliferation,

superoxide production, adhesion and migration of human tumor cells in vitro,

European Journal of Pharmacology (2015) doi: 10.1016/j.ejphar.2015.09.044

110. Tsai C. M., Yen G. C., Sun F. M., Yang S. F., Weng C. J., Assessment of the

anti-invasion potential and mechanism of select cinnamic acid derivatives

on human lung adenocarcinoma cells, Molecular Pharmaceutics 10 (2013),

s. 1890-1900

111. Li Y., Jiang F., Chen L., Yang Y., Cao S., Ye Y., Wang X., Mu J., Li Z., Li L.,

Blockage of TGFα-SMAD2 by demethylation-activated miR-148a is involved

in caffeic acid-induced inhibition of cancer stem cell-like properties in vitro

and in vivo, FEBS Open Bio 5 (2015) 466-475

112. Skórka K., Giannopoulos K., Budowa i funkcje jądrowego czynnika

transkrypcyjnego NF kappa B (NF-κB) oraz jego znaczenie w przewlekłej

białaczce limfocytowej, Acta Haematologica Polonica 43 (2012) 54-62

113. Ozturk G., Ginis Z., Akyol S., Erden G., Gurel A., Akyol O., The anticancer

mechanism of caffeic acid phenethyl ester (CAPE): review of melanomas, lung

and prostate cancers, European Review for Medical and Pharmacological

Sciences 16 (2012), s. 2064-2068

114. Akyol S., Ozturk G., Ginis Z., Armutcu F., Yigitoglu M. R., Akyol O., In vivo

and in vitro antıneoplastic actions of caffeic acid phenethyl ester (CAPE):

therapeutic perspectives, Nutrition and Cancer 65 (2013), s. 515-526

115. Omene C., Kalac M., Wu J., Marchi E., Frenkel K., O’Connor O. A., Propolis

and its active component, caffeic acid phenethyl ester (CAPE), modulate

breastcancer therapeutic targets via an epigenetically mediated mechanism

of action, Journal of Cancer Sciences and Therapy 5 (2013), s. 334-342

116. Ketabforoosh H. E., Amini M., Vosooghi M., Shafee A., Azizi E., Kobarfard

F. Synthesis, evaluation of anticancer activity and QSAR study of heterocyclic

esters of caffeic acid, Iranian Journal of Pharmaceutical Research 12 (2013),

s. 705-719

117. Eom T. K., Senevirathne M., Kim S. K., Synthesis of phenolic acid conjugated

chitooligosaccharides and evaluation of their antioxidant activity,

Environmental Toxicology and Pharmacology 2 (2012), s. 519-527

118. Lee S.J., Kang M.-S., Oh J.-S., Na H.S., Lim Y.J., Jeong Y.-I., Lee H.-C.,

Caffeic acid-conjugated chitosan derivatives and their anti-tumor activity,

Archives of Pharmacal Research 36 (2013), s. 1437-1446


252

119. Lee S. J., Choi K. C., Kang M. S., Oh J. S., Jeong Y. I., Lee H. C., Self-

organized nanoparticles of caffeic acid cConjugated polysaccharide and its

anticancer activity, Journal of Nanoscience and Nanotechnology 15 (2015),

s. 1130-1134

120. Peng W., Wu J. G., Jiang Y. B., Liu Y. J., Sun T., Wu N., Wu C. J., Antitumor

activity of 4-O-(2″-O-acetyl-6″-O-p-coumaroyl-β-D-glucopyranosyl)-p-

coumaric acid against lung cancers via mitochondrial-mediated apoptosis,

Chemico-Biological Interactions 233 (2015), s. 8-13

121. Chen H. Z., Chen Y. B., Lv Y. P., Zeng F., Zhang J., Zhou Y. L., Li H. B.,

Chen L. F., Zhou B. J., Gao J. R., Xia C. N., Synthesis and antitumor activity

of feruloyl and caffeoyl derivatives, Bioorganic & Medicinal Chemistry

Letters 24 (2014), s. 4367-4371

122. Dikmen G., Güney G., Genç L., Characterization of solid lipid nanoparticles

containing caffeic acid and determination of its effects on MCF-7 cells, Recent

Patents on Anti-Cancer Drug Discovery 10 (2015), s. 224-232

123. Kim H.-J., Ryu K., Kang J.-H., Choi A.-J., Kim T., Oh J.-M., Anticancer

activity of ferulic acid-inorganic nanohybrids synthesized via two different

hybridization routes, reconstruction and exfoliation-reassembly, The

Scientific World Journal (2013) doi:10.1155/2013/421967

124. Naso L. G., Valcarcel M., Roura-Ferrer M., Kortazar D., Salado C., Lezama

L., Rojo T., González-Baró A. C., Williams P. A., Ferrer E. G., Promising

antioxidant and anticancer (human breast cancer) oxidovanadium(IV)

complex of chlorogenic acid. Synthesis, characterization and spectroscopic

examination on the transport mechanism with bovine serum albumin, Journal

of Inorganic Biochemistry 135 (2014), s. 86-99

125. Lewandowska U., Gorlach S., Owczarek K., Hrabec E., Szewczyk K.,

Synergistic Interactions Between Anticancer Chemotherapeutics and Phenolic

Compounds and Anticancer Synergy Between Polyphenols, Postępy Higieny

i Medycyny Doświadczalnej 68 (2014), s. 528-540

126. Dębska S., Kubicka J., Czyżykowski R., Habib M., Potemski P., Inhibitory

PARP – podstawy teoretyczne i zastosowanie kliniczne, Postepy Higieny

i Medycyny Doświadczalnej 66 (2012), s. 311-321

127. Choi Y. E., Park E., Ferulic acid in combination with PARP inhibitor

sensitizes breast cancer cells as chemotherapeutic strategy, Biochemical

and Biophysical Research Communications 458 (2015), s. 520-524

128. Thakkar A., Chenreddy S., Wang J., Prabhu S., Ferulic acid combined with

aspirin demonstrates chemopreventive potential towards pancreatic cancer

when delivered using chitosan-coated solid-lipid nanoparticles,

Cell & Bioscience (2015) doi:10.1186/s13578-015-0041-y

129. Eitsuka T., Tatewaki N., Nishida H., Kurata T., Nakagawa K., Miyazawa T.,

Synergistic inhibition of cancer cell proliferation with a combination

of α-tocotrienol and ferulic acid, Biochemical and Biophysical Research

Communications 453 (2014), s. 606-611


253

Nowe kierunki w badaniach biomedycznych kwasów

hydroksycynamonowych

W literaturze znaleźć można wiele informacji na temat biologicznej aktywności związków

polifenolowych, głównie flawonoidów. Mniej poznaną grupą związków pozostają natomiast

roślinne kwasy fenolowe, w tym kwasy hydroksycynamonowe. W ostatnich latach wzrasta

jednak znacząco zainteresowanie naukowców tymi związkami. Najnowsze dane dostarczają

informacji na temat przeciwutleniającego, przeciwzapalnego oraz przeciwnowotworowego

działania fenolokwasów. Szeroki zakres działania biologicznego, jak również możliwość

modulowania i zwiększania farmakologicznej aktywności fenolokwasów sprawia, że związki te

stały się przedmiotem wielu badań biomedycznych.

New trends in biomedical research on hydroxycinnamic acids

Current literature provides a lot of information about biological activity of polyphenolic

compounds, mainly flavonoids. Plant phenolic acids, including hydroxycinnamic acids

(hydroxycinnamates), remain a less known group of compounds. However, scientific interest in

these compounds has increased significantly in recent years. The newest data provide information

on antioxidant, anti-inflammatory and anti-tumor activities of phenolic acids.

These compounds have become subjects of numerous biomedical investigations owing to a broad

range of biological action as well as the possibility of modulation and enhancement of their

pharmacological activity.

254

Aleksandra Kruk1, Agnieszka Gadomska-Gajadhur

2, Paweł Ruśkowski

3

Wpływ prekursorów porów

na morfologię membran półprzepuszczalnych

przeznaczonych do hodowli komórkowych

1. Wstęp

Hodowle komórkowe w ostatnich latach zyskały bardzo dużą

popularność w naukach medycznych oraz przyczyniły się do rozwoju

inżynierii tkankowej, dziedziny, której głównym celem jest regeneracja

uszkodzonych, trudno odnawiających się tkanek.

Przez wiele lat tradycyjne badania in vitro, dotyczące komórek

prowadzono wykorzystując modele dwuwymiarowe. Komórki były

hodowane w podłożach mikrobiologicznych umieszczonych na płytkach,

szlakach Petriegolub w podłożu płynnym. Wraz z upływem czasu zaczęto

się zastanawiać nad słusznością tych badań. Stwierdzono, że warunki jakie

panują w hodowlach płaskich znacznie odbiegają od tych, które występują

w tkance. W modelach tych nie dochodzi do interakcji międzykomórkowe,

jakie mają miejsce w rzeczywistości w przestrzeni trójwymiarowej.

Oddziaływania te są odpowiedzialne za wzajemną komunikację komórek

w obrębie jednej tkanki, jak i sąsiadujących oraz za dostarczanie odpo-

wiednich substancji odżywczych, czy cząsteczek sygnałowych niezbędnych

do wzrostu.

Na tej podstawie stwierdzono, że tkankę należy traktować jako skompli-

kowaną, trójwymiarową sieć połączeń, w której kluczowym elementem jest

struktura przestrzenna. Ponadto dowiedziono, że komórki wyhodowane

w modelach 2D mają zmieniony wzrost, metabolizm i ekspresję genów,

w porównaniu do komórek wyhodowanych naturalnie.

To wszystko spowodowało, że zaczęto poszukiwać metod hodowli

komórek oddających możliwie jak najlepiej trójwymiarową strukturę

tkanki. Jedną z technik pozwalających na prowadzenie hodowli 3D, są

[email protected], Laboratorium Procesów Technologicznych, Wydział Chemiczny,

Politechnika Warszawskaprzypisie zachowujemy zasadę od komórki organizacyjnej najniższego

stopnia do wyższych [email protected], Laboratorium Procesów Technologicznych, Wydział Chemiczny,

Politechnika Warszawska [email protected], Laboratorium Procesów Technologicznych, Wydział

Chemiczny, Politechnika Warszawska



255

rusztowania polimerowe, znane również pod angielskojęzyczną nazwą

Scaffolds. Rusztowania te stanowią przestrzenną sieć wzajemnie połączo-

nych ze sobą porów, której głównym zadaniem jest fizyczne utrzymanie

komórekw przestrzeni [1‚4].

Rusztowania do hodowli komórkowych mają często formę membran

półprzepuszczalnych. Oznacza to, że do ich wnętrza mogą jedynie

przedostawać się cząstki o określonym, maksymalnym rozmiarze. Z tej

przyczyny do hodowli określonego typu komórek, membrana musi

posiadać pory o danej wielkości, występujące nie tylko we wnętrzu, ale

także i na powierzchni. W przeciwnym przypadku, komórki nie dostaną się

do środka rusztowania, pozostaną na jego powierzchni, czyli powstanie

hodowla 2D.

Do wytwarzania rusztowań wykorzystuje się przede wszystkim

polimery, zarówno pochodzenia naturalnego, jak i syntetyczne oraz

ulegającelub nieulegające biodegradacji. Wśród polimerów syntetycznych

często wykorzystywanym jest polilaktyd (PLA). Jest to alifatyczny

poliester pozyskiwany ze źródeł odnawialnych (kukurydza, trzcina

cukrowa). Zbudowany jest z połączonych ze sobą liniowo cząsteczek

kwasu mlekowego (LAc).LAcwystępuje w postaci dwóch enancjomerów,

w wyniku czego mogą powstawać polimery różniące się konfiguracją

centrów chiralnych, o odmiennych właściwościach fizycznych (Rysunek

1). Polilaktydhomochiralny, zbudowany jedynie z cząsteczek kwasu L- lub

D-mlekowego (PLLA, PDLA) charakteryzuje się wysoką wytrzymałością

mechaniczną oraz długim czasem biodegradacji, wzrastającym wraz z masą

molową polimeru. Inne właściwości ma polilaktydheterochiralny,

zawierający w strukturze oba enancjomery kwasu mlekowego. Jest on

bardziej elastyczny oraz ulega szybszej degradacji. Przez organizm

przyswajalny jest jedynie izomer kwasu L-mlekowego. Enancjomer

o konfiguracji D może odkładać się w ustroju, powodując w konsekwencji

jego zakwaszenie. Z tych względów największe znaczenie w zastosowaniu

farmaceutycznym ma PLLA o małej masie molowej oraz PLA

z kilkuprocentowym dodatkiem centrów o konfiguracji D.

Polilkatyd jest polimerem biodegradowalnym, który ulega w organizmie

enzymatycznemu, dwuetapowemu rozkładowi. W pierwszym etapie

następuje hydroliza PLA do oligomerów kwasu mlekowego, które

następnie są przekształcane w cyklu kwasu cytrynowego do dwutlenku

węgla i wody [5‚9].


256

OH

OH

O

HCH3

OH

OH

O

CH3H

kwas D-mlekowy kwas L-mlekowy

Rysunek 1.Enancjomery kwasu mlekowego

Innymi popularnymi,biodegradowlnymi polimerami syntetycznymi są poli-

ε-kaprolakton, poliglikolid oraz ich kopolimery (także z PLA). Spośród

polimerów nieulegających biodegradacji, stosuje się m.in.polisulfon oraz

polieterosulfon.

W inżynierii tkankowej stosuje się także polimery naturalne tj. chitozan,

elastyna, kolagen czy kwas hialuronowy. Związki te oprócz tego, że stanowią

materiał budujący rusztowanie, to również mogą być substancjami

odżywczymi dla komórek, co jest ich niewątpliwą zaletą. Mimo to, nie są one

najlepszym materiałem do wytwarzania rusztowań,ze względu na niższą

wytrzymałość mechaniczną w porównaniu do polimerów syntetycznych.

Ponadto są one niestabilne w warunkach zmiany temperatury oraz odczynu

środowiska, co stwarza poważne problemy technologiczne. Zaletą polimerów

syntetycznych w porównaniu do naturalnych, jest możliwość sterowana

czasem degradacji rusztowania, poprzez dobieranie odpowiedniej długości

łańcucha polimerowego [10‚13].

Istnieje wiele technik otrzymywania rusztowań komórkowych. Jedną z nich

jest metoda inwersji faz (Rysunek 2). Charakteryzuje się ona łatwością

i prostotą wykonania. Ponadto nie wymaga skomplikowanej aparatury, co

z kolei nie generuje wysokich kosztów inwestycyjnych. Ograniczenia tej

techniki to przede wszystkim konieczność dokładnej kontroli warunków

otoczenia oraz ryzyko pozostałości rozpuszczalników i prekursorów porów.

Metoda ta polega na wylaniu roztworu polimeru membrantwórczego na

obojętny podkład (np. szklaną płytkę), równomiernym rozprowadzeniu,

a następnie zanurzeniu w kąpieli żelującej, składającej się z nierozpuszczalnika

polimeru [14, 15]. Wariantem tej metody jest dodatek prekursora porów

(Rysunek 3), którego zadaniem jest wniknięcie między łańcuchy polimeru

i odkształcenie tam porów. Na końcu procesu prekursor usuwa się ze struktury

membrany, poprzez wypłukanie (w kąpieli żelującej lub w dodatkowej kąpieli

płuczącej). Jako prekursory porów stosuje się głównie kryształy soli

nieorganicznych (np. NaCl, LiCl, LiF) oraz polimery tj. poliwinylopirolidon

(PVP) czy poli(glikol etylenowy) (PEG). Oprócz wyżej wymienionych

polimerowych substancji porotwórczych, popularny jest także trójblokowy



257

kopolimerpoli (oksyetylen-b-oksypropylen-b-oksyetylen), znany pod handlo-

wą nazwą Pluronic®.Dzięki swej amfifilowej budowie zwiększa on hydro-

filowość membran, co obniża ryzyko foulingu białkowego (zapychania

porów związkami białkowymi, występującymi w organizmach) [14, 16].

Rysunek 2. Metoda inwersji faz [15]

Rysunek 3. Metoda inwersji faz z zastosowaniem prekursora porów [16]

2. Cel pracy

Celem niniejszej pracy było zbadanie wpływu dodatku prekursorów

porów takich jak: PVP, Pluronic® oraz NaCl, na morfologię membran

półprzepuszczalnych przeznaczonych do hodowli komórkowych.


W badaniach użyto poli-L-laktydo Mn 86 000 g/mol (Nature Works NW

2003D), PVP o Mn 10 000 g/mol (Sigma Aldrich, Pluronic® f127) Mn3 600

g/mol(Sigma Aldrich) oraz NaCl (Cenos). Użytymi rozpuszczalnikami

były: chloroform (cz.d.a. POCh SA)i metanol (cz.d.a. POCh SA). Wodę

destylowaną otrzymano we własnym zakresie.

Przygotowanie roztworów

Roztwory PLLA w chloroformieo stężeniu 6%wagotrzymano, poprzez

rozpuszczanie polimeru przez 24h w rozpuszczalniku organicznym (ChCl3).

Podczas rozpuszczania poli-L-laktydu zapewniono ciągłe mieszanie, przy

użyciu mieszadła magnetycznego bez grzania. Roztwory zawierające

prekursory porów otrzymano w analogiczny sposóbz tą różnicą, że po

całkowitym rozpuszczeniu PLLA, dodano substancje porotwórcze


258

w stosunku wagowym 1:1 do poli-L-laktydu. W przypadku mieszanin

prekursorów porów stosunek wagowy substancji w roztworze wynosił

10:5:5 (PLLA:prekursor1:prekursor2). Po dodaniu prekursorów porów,

mieszanie kontynuowano przez kolejne 24 h. W przypadku NaCl, kryształy

soli przed dodaniem do roztworu membranotwórczego, rozdrobniono za

pomocą moździerza i przesiano przy użyciu sit mikrobiologicznych, po

czym zebrano frakcję o rozmiarze <70 µm.

Otrzymanie membran polilaktydowych

Membrany otrzymano metodą inwersji faz. Sporządzone roztwory wylano

na szklany podkład, a następnie rozprowadzono po całej powierzchni. Po

uformowaniu roztworu, membranę żelowano wmetanolu.

Z membran otrzymanych z dodatkiem polimerowych prekursorów

porów (PVP, Pluronic®), substancje te usunięto jeszcze w kąpieli żelującej,

gdyż oba te polimery rozpuszczają się w metanolu. W przypadku membran

otrzymanych z dodatkiem NaCl, sól usunięto poprzez zastosowanie kąpieli

płuczącej, składającej się z wody destylowanej. Podobnie postąpiono

z membranami otrzymanymi z wykorzystaniem NaClwraz z PVP (obie

substancje rozpuszczają się w wodzie).

Po wyżelowaniu polimeru membranotwórczego i usunięciu substancji

porotwórczych, membrany wysuszono na powietrzu.

Metody analityczne

Morfologię otrzymanych membran zbadano za pomocą skaningowego

mikroskopu elektronowego (ang. Scanning Electron Microscopy, SEM)

Hitachi TM1000. Próbki membran przed badaniem zanurzono w etanolu,

a następnie połamano w ciekłym azocie. Po wysuszeniu, próbki membran

pokryto warstwą złota 7-10 nm przy użyciu aparatu K550X Sputter Coater.

Pokryte złotem próbki badano w różnych powiększeniachpod napięciem

przyspieszania 15 kV.

4. Wyniki

W Tabeli 1 przedstawiono morfologię membran z poli-L-laktydu

otrzymanych bez dodatku prekursorów porów.Można zaobserwować, że

powierzchnia I zawiera nieliczne, bardzo małe pory (poniżej 5 µm) oraz lekkie

pofałdowania. W przełomie (wnętrzu) membrany występują liczne, małe pory

których średnica wynosi około 10-15 µm. Na powierzchni II obserwuje się

pory przykryte cienką warstwą naskórkową, uniemożliwiającą dostęp do

wnętrza membrany, a więc powierzchnię tą można traktować jako litą.



259

Tabela 1. Morfologia membran otrzymanych bez dodatku prekursorów porów

powierzchnia I przełom powierzchnia II

W Tabeli 2 przedstawiono morfologię membran, otrzymanych z dodat-

kiem PVP jako prekursora porów. Na powierzchni I obecne pory mają

rozmiar (średnicę) 5-20µm, dodatkowo pomiędzy nimi występują małe

pory, przykryte warstwą naskórkową. Wnętrze membrany jest silnie poro-

wate. Najmniejsze pory, których rozmiar wynosi 10-15 µm występują

w samym środku przełomu. Wraz ze zbliżaniem się do obu powierzchni ich

rozmiar wzrasta i osiąga średnicę 30-50 µm. Na powierzchni II pory są

duże, ich średnica wynosi 20-50 µm. Należy jednak zauważyć, że

porowatość obu powierzchni jest niewielka.

Tabela 2. Morfologia membranotrzymanych z dodatkiem PVP jako prekursora porów


W Tabeli 3 zamieszczono membranę, otrzymaną z dodatkiem Pluronic®.

Powierzchnia I nie zawiera porów. Podobnie jest w przypadku powierzchni

II. Co prawda widoczne są na niej pory, lecz są przykryte cienką warstwa

naskórkową, który czyni ją praktycznie nieprzepuszczalną. Pory w przeło-

mie są rozmieszone bardzo nieregularnie, ich średnica waha się od 10 do

60 µm. Ponadto, można zaobserwować także skupiskabardzo małych

porów, których rozmiar wynosi kilka µm.


260

Tabela 3. Morfologia membranotrzymanych z dodatkiem Plurtonic® jako prekursora porów


W Tabeli 4 przedstawiono membranę, otrzymaną z zastosowaniem

NaCl, będącego prekursorem porów. Powierzchnia I zawiera bardzo nie-

liczne pory, rzędu 15-40 µm oraz pofałdowania. Wnętrze membrany

posiada pory o średnicy 10-15 µm, między którymi występują większe,

o rozmiarze 30-40 µm. Przy jednej z powierzchni można zaobserwować

bardzo duże pory, których wielkość przekracza 100 µm. Powierzchnia II

jest bardzo nieregularna i zwiera pory o średnicy 10-20 µm

Tabela 4. Morfologia membranotrzymanych z dodatkiem NaCl jako prekursora porów


W Tabeli 5 zamieszczono membranę, otrzymaną z dodatkiem PVP

i Pluronic® jako prekursorów porów. Na powierzchni I są obecne pory

ośrednicy 10-15 µm, pomiędzy którymi występują bardzo małe pory (kilka

µm), w większości pokryte warstwą naskórkową. W silnie porowatym

przełomie pory mają przeważnie średnicę 10-15 µm, przy czym pomiędzy

nimi występują większe, o rozmiarze 30-50 µm. Przy powierzchni II jest

najwięcej tych ostatnich porów, poza tym występują też nieregularnie

rozmieszczonepory rzędu 10-40 µm.



261

Tabela 5. Morfologia membranotrzymanych z dodatkiem PVP oraz Plurtonic® jako prekursora

porów


W Tabeli 6 znajdują sięobrazy membrany, otrzymanej z zastosowaniem

NaCl oraz PVP jako prekursorów porów. PowierzchniaI posiada rzadko

występujące pory o średnicy 10-20 µm. W samym środku przełomu obecne

są pory o rozmiarze około 5 µm, między którymi znajdują się większe,

o średnicy sięgającej 15-25 µm. Wraz zezbliżaniem się do obu po-

wierzchni, wewnętrzumembrany pojawiają się pory o średnicy 30-80 µm.

Powierzchnia II posiada dość licznie występujące pory o rozmiarze 15-30 µm.

Tabela 6. Morfologia membranotrzymanych z dodatkiem NacCloraz PVP jako prekursora porów


5. Dyskusja

Membrany otrzymane bez dodatku prekursorów porów, wykazują dużą

porowatość przełomu (Tabela 1). Jedna z powierzchni zawiera nieliczne

pory, natomiast druga jest lita. Taka morfologia uniemożliwia wniknięcie

komórek do wnętrza membrany. W przypadku membran otrzymanych z dodatkiem PVP obserwuje się

występowanie porów na obu powierzchniach (Tabela 2). Dodatkowo, pory


262

występujące w przełomie, zwłaszcza przy powierzchniach, mają większy rozmiar, w porównaniu do membrany otrzymanej bez dodatku PVP.

W przypadkach, w których substancją porotwórczą jest Pluronic®, obie powierzchnie są pozbawione porów (Tabela 3). Przełom jest silnie porowaty, przy czym występujące pory są małych rozmiarów.

Zastosowanie NaCl sprzyja powstawaniu bardzo dużych porów we wnętrzu membrany, które są nieregularnie rozmieszczone pomiędzy porami o małych średnicach (Tabela 4). Pory o największych rozmiarach są rozłożone wzdłuż jednej z powierzchni. Mimo dobrej porowatości przełomu, obie powierzchnie membran mają za mało porów.

Dodatek dwóch prekursorów porów jednocześnie (PVP oraz Pluronic®) sprzyja powstawaniu porów, szczególnie na jednej z powierzchni(Tabela 5). Ponadto w przełomie membrany, oprócz małych porów, pojawiają się także posiadającewiększe średnice.

Użycie NaCl wraz z PVP (Tabela 6) znacznie zwiększyło porowatość, szczególnie jednej z powierzchni. W przełomie, wzdłuż obydwu powierzchni pojawiły się pory o bardzo dużych średnicach. Należy jednak zauważyć, że przełom membrany zawiera także pory o bardzo niewielkich rozmiarach.

Spośród prezentowanych przykładów, najkorzystniejszą morfologię z punktu widzenia prowadzenia hodowli komórkowych, posiada membrana otrzymana z wykorzystaniem PVP oraz Pluronic®, jako prekursorów porów. W membranie tej jedna z powierzchni wykazuje porowatość stwarzającą szanse na wniknięcie komórek do wnętrza. Z kolei druga z nich ma mało porów, co może zapobiegać „wypadaniu” komórek ze struktury membrany. Jednak do prowadzenia wydajnej hodowli komórkowej, wymagane są membrany o regularnie rozmieszczonych,większych porach w przełomie (20-40 µm) oraz o zwiększonej porowatości jednej z powierzchni,czego nie stwierdzono w membranach zamieszczonych wprezentowanych wynikach.Membrana otrzymana z dodatkiem NaCl oraz PVP,charakteryzuje się dużą porowatością jednej z powierzchni. Jednak pory występujące w jej przełomie są zbyt małe by móc zmieścić komórki.

6. Podsumowanie i wnioski

Spośród zbadanych substancji, najkorzystniejszy wpływ na porowatość

oraz wielkość porów, mają mieszaniny prekursorów porów, a szczególnie

PVP wraz z Pluronic®. Substancje te zwiększają wielkość porów

występujących w przełomie membran do około 50 µm oraz sprzyjają

powstawaniu porów na jednej z powierzchni. Zaprezentowane w niniejszej

pracy wyniki dostarczają informacji, które wskazują kierunek prowadzenia

dalszych badań nad otrzymywaniem membran, służących do prowadzenia

wydajnych i efektywnych hodowli komórkowych.



263

Literatura

1. Grolik M., Inżynieria tkankowa-nowe narzędzie w rekonstrukcji tkanek, Zeszyty

Naukowe Towarzystwa Doktorantów UJ Nauki Ścisłe, 3 (2011), s. 33-40

2. Kruk A., Gadomska-Gajadhur A., Ruśkowski P., Zastosowanie

bioresorbowalnych rusztowań w inżynierii tkankowej, Wydawnictwo Tygiel

(2015), s. 91-102

3. Ma P. X., Scaffolds for tissue fabrication, Materials Today, 7 (2004), s. 30-40

4. Gadomska-Gajadhur A., Kruk A., Ruśkowski P., Synoradzki L., Wpływ

dodatku porofora na morfologię skafoldów polilaktydowych. TEMPO s.c.,

(2015), s. 294-297

5. Nowak B., Pająk J., Biodegradacja polilaktydu (PLA), Archiwum Gospodarki

Odpadami i Ochrony Środowiska,12 (2010), s. 1-10

6. Gupta A. P., Kumar V., New emerging trends in synthetic biodegradable

polymers Polylactide: a critique, European Polymer Journal, 43 (2007), s.

4053-4074

7. Gadomska A., Warych I., Ruśkowski P., Synoradzki L., Otrzymywanie

nanosfer polilaktydowych,Przemysł Chemiczny, 93(2014), s.1311-1314

8. Gadomska A., Mierzejewska J., Ruśkowski P, Synoradzki L., Otrzymywanie

sfer polilaktydowych zawierających paracetamol, Przemysł Chemiczny, 10

(2015), s. 1676-1678

9. Kruk A., Gadomska-Gajadhur A., Ruśkowski P., Przybysz A., Bijak V.,

Synoradzki L., Optymalizacja otrzymywania sfer poliaktydowych

zawierających neomycynę z wykorzystaniem matematycznych metod

planowania doświadczeń, Przemysł Chemiczny, w druku

10. Ko H. F., Sfeir C., Kumta P. N., Novel synthesis strategies for natural polymer

and composite biomaterials as potential scaffolds for tissue engineering,

Philosophical Translations of the Royal Society A: Mathematical, Physical

& Engineering Sciences, 368 (2009), s. 1981-1997

11. Kawazoe N., Creation of novel materials for tissue regeneration as next

generation medical technology, National Institute for Materials Science,

on-line (2012)

12. Kim H. J., Kim K. K., Park I. K., Hybrid Scaffolds Composed of Hyaluronic

Acid and Collagen for Cartilage Regeneration, Tissue Engineering

and Regenerative Medicine, 9 (2012), s. 57-62

13. Yang C. R., Di Chen J., Preparation and biological evaluation of chitosan-

collagen-icariin composite scaffolds for neuronal regeneration, Neurological

Sciences, 34 (2013), s. 941-947

14. Chwojnowski A., Półprzepuszczalne membrany polisulfonowe, Warszawa:

Zespół Wydawniczo – Poligraficzny IBIB PAN, 2011

15. Wen Y., Lian F., Ren Y., Guan H., Enhanced electrochemical properties

of a novel polyvinyl formal membrane supporting gel polymer electrolyte

by Al2O3 modification, Journal of polymer science part b polymer physics,

52 (2014), s.572-577

16. Lan Levengood S., Zhang M., Chitosan-based scaffolds for bone tissue

engineering, Journal of Materials Chemistry B, 2 (2014),s. 3161-3184


264

Wpływ prekursorów porów na morfologię membran

półprzepuszczalnych przeznaczonych do hodowli komórkowych

Hodowle komórkowe są ważnym aspektem inżynierii tkankowej, dziedziny której głównym

celem jest wspomaganie regeneracji uszkodzonych, trudnoodnawiających się tkanek. Elementem,

który znacznie zwiększa wydajność hodowli tkankowych są rusztowania komórkowe, będące

fizycznym, trójwymiarowym podłożem. Jedną z form rusztowań są membrany półprzepuszczalne.

W niniejszej pracy przedstawiono doświadczalne wyniki otrzymywania membran, których

przeznaczeniem są hodowle komórkowe. Zbadano wpływ wybranych substancji porotwórczych

(PVP, Pluronic® oraz NaCl) na morfologię otrzymanych membran. Na podstawie przepro-

wadzonych badań wytypowano substancje, stwarzające możliwości otrzymania membran

o pożądanej porowatości i wielkości porów.

Effect of pore precursors on the morphology of the semi-permeable

membranes for cell cultures

Cell cultures are important aspect of tissue engineering (TE). TE is a field whose main aim is to

support regeneration of damaged, difficult to regeneration tissues. The scaffolds are the main and

the latest issue of this science. Scaffolds are medium for cell culture characterized by a highly

developed, three-dimensional spatial structure. One forms of scaffolds are semi-permeable

membranes.

Experimental results of the preparation of semi-permeable membranes for cell cultures were

obtained. The effect of pore precursors (polyvinylpyrrolidone, Pluronic® and NaCl) on the

morphology of the membranes was studied. The studies were selected substances which gave the

largest porosity of membranes.

265

Bartosz Sikora1, Aleksandra Skubis

2, Małgorzata Kimsa

3

Ekspresja markerów molekularnych

ABCG2 oraz P63

w świńskich epitelialnych

komórkach macierzystych rąbka rogówki

1. Wprowadzenie

Ślepota rogówkowa to zaburzenie, z którym na całym świecie żyje

około 10 milionów osób. Jest to dysfunkcja wywołana uszkodzeniami

fizycznymi, chemicznymi, ale również biologicznymi tj. zakażeniami

wirusowymi i bakteryjnymi. Jedną ze stosowanych metod leczenia są

przeszczepy rogówki. Jednak liczba transplantacji nadal jest niewystar-

czająca w odniesieniu do liczby chorych [1, 2, 3].

Nabłonek rogówki jest tkanką posiadającą właściwości samoodnowy

[4]. Dlatego w przypadku uszkodzeń wyłącznie jednej rogówki stosuje się

często metodę polegającą na wykorzystaniu komórek rąbka rogówki

zdrowego oka [2]. Rąbek rogówki to obszar obejmujący cienką

przezroczystą warstwę komórek znajdującą się pomiędzy rogówką,

a twardówką oka. Warstwa ta bogata jest w epitelialne komórki macie-

rzyste rąbka rogówki (LESCs ang. limbalepithelialstemcells), których

zadaniem jest odnawianie sprawności i funkcjonalności rogówki.

W przypadku komórek rąbka rogówki stwierdzono, że posiadają one wolne

tempo cyklu komórkowego oraz niski wskaźnik mitotyczny [3]. Pomimo

wielu zalet przeszczepu autologicznego metoda ta ma pewne ograniczenia.

Jednym z nich jest ryzyko uszkodzenia rogówki prawidłowej w momencie

pobrania fragmentów rąbka rogówki. W efekcie może to doprowadzić do

obuocznej ślepoty [1]. Wśród powikłań obserwuje się zwłóknienie

rogówki, rozrost nieprawidłowego nabłonka i mikrouszkodzenia [3].

[email protected], Katedra i Zakład Biologii Molekularnej, Wydział Farmaceutyczny

z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach,

www.sum.edu.pl [email protected], Katedra i Zakład Biologii Molekularnej, Wydział

Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny

w Katowicach, www.sum.edu.pl [email protected], Katedra i Zakład Biochemii, Wydział Lekarski, Śląski Uniwersytet

Medyczny w Katowicach, www.sum.edu.pl


266

Jednak dzięki rozwojowi medycyny regeneracyjnej istnieje szansa na

terapię do tej pory nieuleczalnych schorzeń rogówki. Jedną z takich metod

może być wykorzystanie komórek LESCs. Potwierdzono między innymi,

żekomórki macierzyste mają zdolność do migracji w kierunku uszko-

dzonych miejsc i różnicowania w określony typ komórek w odpowiedzi na

warunki środowiska w jakim się znajdują [3].

Głównym problemem wykorzystania komórek macierzystych jest

problem ich identyfikacji. Bardzo często pewne typy komórek

macierzystych nie posiadają w pełni sprecyzowanych markerów, w tym

równieżLESCs. Komórki rogówki posiadają dwa charakterystyczne białka.

Są to cytokeratyny: cytokeratyna-3 (CK3) i cytokeratyna-12 (CK12).

Należy zaznaczyć, że cytokeratyna-3 jest białkiem charakterystycznym dla

już zróżnicowanych komórek nabłonkowych rogówki. Stąd też może ona

być wykorzystywana jako marker negatywny LESCs [4]. Obecnie profil

markerów komórek macierzystych rąbka rogówki opiera się na obecności

białek: p63, ABCG2, integryny-9 i braku ekspresji e-kadheryny, konek-

syny-43, inwolukryny, a także cytokeratyny-3 i cytokeratyny-12 [5, 6].

Ważnym czynnikiem mającym wpływ na możliwości wykorzystania

komórek macierzystych rąbka rogówki są warunki w jakich są hodowane

in vitro. Konieczne jest zachowanie przez jak najdłuższy czas ich wzrostu,

proliferacji i potencjału zróżnicowania. W zależności od typu pożywki

komórki te wykazują różne fenotypy i zmienną ekspresję markerów

specyficznych. Oznacza to, że optymalizacja procesu hodowli jest jednym

z ważniejszych celów medycyny regeneracyjnej z wykorzystaniem LESCs.

W zależności od przeznaczenia wykorzystania komórek rąbka rogówki

inne czynniki muszą być dodawane do pożywek w celu szybszego procesu

różnicowania lub też jego zahamowania [7].

W związku z poważnym deficytem rogówek ludzkich do przeszczepów

rozważa się wykorzystanie komórek macierzystych rogówki pochodzących

od zwierząt. Badania wykazały, że kompatybilnym zamiennikiem rogówki

ludzkiej może być rogówka świńska. Bardzo często rogówki pobierane od

dawców ludzkich mają słabą zdolność proliferacji ze względu na zawanso-

wany wiek dawców. Jeżeli rogówki te byłyby pobierane od młodych świń

transgenicznych wtedy zdolności regeneracyjne tego narządu były by też

dużo większe [8]. Jednak do tego celu konieczna jest całkowicie

powtarzalna identyfikacja pobieranych komórek do ksenotransplantacji.

2. Cel pracy

Niniejsza praca miała na celu zidentyfikowanietranskryptów markerów

powierzchniowych p63 oraz ABCG2 metodą QRT-PCR w epitelialnych

komórkach macierzystych rąbka rogówki (LESCs)świni.

Ekspresja markerów molekularnych ABCG2 oraz P63

w świńskich epitelialnych komórkach macierzystych rąbka rogówki

267


Źródłem materiału biologicznego poddanego analizie były świnie

domowe (łac. Sus scrofa)poddane modyfikacji genetycznej. Transgeneza

obejmowała wyciszenie antygenu galaktozylotransferazy lub wprowadzenie

ludzkiego antygenu fukozylotransferazy. Badany materiał obejmował

tkanki pochodzące ze świń zawierających losową ze wskazanych powyżej

modyfikacji genetycznych.

Ze świńex vivo pobierano gałki oczne i na czas dalszej preparatyki,

przechowywano je w rozworze PBS (ang. phosphate-bufferedsaline;

Lonza, Basel, Switzerland) z dodatkiem antybiotyków: amfoterycyny B,

penicyliny i streptomycyny. Z gałek ocznychmetodami mikrochirurgii

okulistycznej wypreparowywano fragmenty rąbka rogówki usytuowanego

po obu biegunach gałki ocznej. W kolejnym etapie otrzymane fragmenty

rozdrabniano z wykorzystaniem skalpela w celu uzyskania kawałków

o rozmiarze około 2 mm2. Tkankę wysiewano na naczynia hodowlane

w liczbie 2-3 kawałki na jeden dołek hodowlany, w płytkach 6-cio

dołkowych (Nunc, Wiesbaden, Germany). W ten sposób rozmieszczone

kawałki rąbka rogówki odstawiono naczas prawidłowego przywarcia do

podłoża, pod komorą z laminarnym przepływem powietrza (od 15 do 20

minut). Przywarte kawałki tkanki następnie zalewano pożywką

standardową DMEM (Dulbecco'sModifiedEagle Medium) z dodatkiem

10% FBS (bydlęca surowica płodowa, ang. fetalbovine serum) oraz 25 mg /

100 ml antybiotyku – gentamycyny (Lonza, Basel, Switzerland) i wsta-

wiono do inkubatora (Direct Heat CO2 Incubator, ThermoScientific,

Waltham, MA).Epitelialne komórki macierzyste rąbka rogówki były

hodowane w atmosferze wzbogaconej dwutlenkiem węgla do całkowitego

stężenia 5%, w temperaturze 37°C. Hodowlę obserwowano z wykorzys-

taniem mikroskopu odwróconego (Olympus IX81, Shinjuku, Tokyo,

Japan). Badania zostały przeprowadzone za zgodą Komisji Bioetycznej.

Liczba komórek i ich żywotność była monitorowanametodą zliczania

komórek w komorze Bürker’astosując wybarwianie roztworem 0,2%

błękitu trypanu (BiologicalIndustries, BeitHaEmek, Israel). Komórki były

hodowane aż do czasu osiągnięcia całkowitej konfluencji i następnie

pasażowane.Podczas pasażu wysiewano do nowych naczyńpo około 10 x

104 żywych komórek na dołek. Hodowlę zakończono po drugim pasażu.

Do dokumentacji fotograficznej wykorzystano kamerę DP70 (Olympus,

Shinjuku, Tokyo, Japan) (Rysunek 1).

Całkowity RNA został wyekstrahowany z osadu komórkowego

wykorzystując odczynnik TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ekstrakty

całkowitego RNA w celu oczyszczenia traktowano DNazą I (MBI

Fermentas, Vilinus, Lithuania), zgodnie z instrukcją zamieszczoną przez


268

producenta. Jakość ekstraktów była weryfikowana elektroforetycznie stosując

0,8% żel agarozowy z dodatkiem bromku etydyny. Wyniki analizowano oraz

dokumentowano wykorzystując system dokumentacji żeli 1D Bas-Sys

(Biotech-Fisher, Perth, Australia). Stężenie kwasów nukleinowych zostało

określone wykorzystując spektrofotometr RNA/DNA GeneQuant II

(Pharmacia Biotech, Cambridge, UK).

Rysunek 1. Epitelialne komórki macierzyste rąbka rogówki w naczyniu hodowlanym (pow. 4x).

Ciemny obiekt w lewym-górnym rogu – fragment rąbka rogówki [opracowanie własne]

W celu identyfikacji transkryptówmarkerów molekularnych p63 oraz

ABCG2 zastosowano ilościową łańcuchową reakcję polimerazy w czasie

rzeczywistym (QRT-PCR) z wykorzystaniem barwnika SYBR Green

(SYBR Green Quantitect RT-PCR Kit, Qiagen) oraz aparatu Opticon™

DNA Engine ContinuousFluorescencedetector (MJ Research) zgodnie

z procedurą opisaną wcześniej (Strzałka i in. 2008). Wszystkie próby

powtarzano trzykrotnie.

ACTB (beta-aktyna) została użyta jako wewnętrzna kontrola endogenna

amplifikacji. Startery oligonukleotydowe specyficzne dla genów: p63

i ABCG2 zostały zaprojektowane w oparciu o sekwencje referencyjne

(GenBankaccession No. XM_003483293.2, NM_214010.1) z wykorzystaniem

oprogramowania PrimerExpressTM Version 2.0 (PE Applied Biosystems,

Foster City, CA) (Tabela 1). Profil termiczny jednego cyklu reakcji

RT-PCR był następujący: odwrotna transkrypcja w temperaturze 50˚C

przez 30 min, denaturacja w temperaturze 95˚C przez 15 min. 40 cykli

reakcji składało się z następujących po sobie temperatur i odstępów

czasowych: 94˚C przez 15 s, 60˚C przez 30 s, i 72˚C przez 30 s. Analiza



269

każdej próbki była zakończona wyznaczeniem krzywej topnienia w celu

potwierdzenia specyficzności produktu i wykluczenia powstania dimerów

starterów. Produkty RT-PCR zostały rozdzielone na 6% żelu poliakrylami-

dowym i wybarwione solami srebra.

Przeprowadzono analizę statystyczną wykorzystując program do analiz

Statistica 10.0 (StatSoft Tulsa, Oklahoma, USA). W analizie statystycznej

zastosowano poziom istotności p<0,05. Miarą aktywności transkrypcyjnej

badanych genów była liczba cząsteczek mRNA przeliczona na 1 g

całkowitego RNA.Wyniki przedstawiono za pomocą mediany (Me) wraz

z kwartylemgórnym i kwartylem dolnym, oraz wartościami minimum

i maksimum. W celu wyznaczenia różnic w ekspresji transkryptówp63

i ABCG2 wykorzystano test U manna-Whitney’a.

Tabela 1. Charakterystyka starterów wykorzystanych do reakcji RT-PCR

Gen Sekwencja starterów Długość

produktu(bp) Tm(oC)

p63 Forward:5’GGAATGAACCGCCGTCCAA3’

153 82 Reverse:5’CGAGACTTGCTGCTTCCTGATGC3’

ABCG2 Forward:5’TGGGTCTGGATAAAGTGGCCG3’

152 80 Reverse:5’GGAGTCTAAGCCAGTCGTGGGC3’

ACTB Forward:5’TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA3’

295 85 Reverse:5’CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG3’

Źródło: Opracowanie własne

4. Analiza wyników

Badaniu molekularnym w kierunku poziomu ekspresji markerów

molekularnych ABCG2 oraz p63 poddano 12 osadów komórkowych. 8

osadów stanowiło materiał zebrany po zakończeniu pasażu 0. Kolejne 6

osadów komórkowych stanowiło materiał zebrany po zakończeniu pasażu 2.

Przy pomocy testu Shapiro-Wilka zbadano zgodność rozkładu

z rozkładem normalnym (Tabela 2)


270

Tabela 2. Test normalności rozkładu Shapiro-Wilka

Marker molekularny Materiał badany W p

ABCG2 pasaż 0 0,983 0,975

p63 pasaż 0 0,962 0,825

ABCG2 pasaż 2 0,740 0,016

p63 pasaż 2 0,779 0,037


Wobec niespełnienia w pełni założeń dotyczących normalności rozkładu

zmiennych dla zmiennej ABCG2 i p63 pasaż 2 do wykazania różnic

w wartościach pomiędzy badanymi zmiennymi zastosowano test U Manna

-Whitney’a (Tabela 3)

Tabela 3. Test U Manna-Whitney'a

Marker molekularny p

ABCG2 0,045

p63 0,001


Wykazano istotną statystycznie zwiększoną liczbę kopii mRNA

ABCG2/μg RNA w komórkach LESCsw pasażu 2 (Rysunek 2).



271

Rysunek 2. Wykres pudełkowy przedstawiający stosunek ekspresji markera ABCG2

w zależności od czasu hodowli [opracowanie własne]

Wynik pomiaru dla poziomu ekspresji genu p63 był odwrotny w sto-

sunku do ABCG2 i wykazał istotne statystycznie zmniejszenie ekspresji

w pasażu 2 (Rysunek 3).

Rysunek 3. Wykres pudełkowy przedstawiający stosunek ekspresji markera p63 w zależności od

czasu hodowli [opracowanie własne]

Wyniki pomiarów przedstawiono w tabeli 4.


272

Tabela 4. Statystyki opisowe badanych prób

Marker Pasaż Mediana Min. Maks. Kwartyl-D Kwartyl-G Odch.std

ABCG2 0 7359,02 3348,51 11550,00 5203,36 8897,02 2629,28

p63 0 267118,90 39340,00 489778,40 128973,46 331062,65 149834,75

ABCG2 2 11840,00 6719,82 13710,00 9584,81 12430,00 2752,95

p63 2 855,46 605,61 1510,51 689,20 1215,00 379,73


5. Dyskusja

Ksenotransplantacja wiąże się z dużym ryzykiem odrzucenia

wszczepianej tkanki. W przeciwieństwie do ksenotransplantacji, problem

odrzutu przeszczepu allogenicznego wydaje się być rozwiązany poprzez

zastosowanie terapii odpowiednimi lekami immunosupresyjnymi. Jednak

w przypadku wykorzystania klinicznego ksenograftów zagrożenie odrzu-

tem przeszczepu jest znacznie większe. Tkanki obcego gatunku posiadają

znacznie więcej czynników zagrażających ludzkiemu organizmowi.

Przeszczepienie niedostosowanych tkanek może wiązać się z natych-

miastową ostrą reakcją odrzutu. Jest to spowodowane występowaniem

odmiennej budowy układu dopełniacza [11].

Aby narządy, tkanki lub komórki pochodzące z obcego organizmu

mogłyby zostać wykorzystane w celach leczniczych, konieczne jest

dostosowanie ich do właściwego przyjęcia przez ludzki organizm. Świnia

domowa (łac. Sus scrofa) gabarytami organów oraz wydolnością

fizjologiczną jest bardzo bliska ludzkiemu ciału. Ze względu na to ten

gatunek zwierząt staje się głównym obiektem zainteresowań jako źródło

tkanek do przeszczepu [11].

Nietolerancję organów, tkanek lub komórek świni domowej przez

ludzki organizm można wyeliminować poprzez wykorzystanie technik

biotechnologicznych, które pozwalają na wprowadzenie zmian w genomie

świni. Wykonywane modyfikacje genetyczne zwierząt skupiają się na

trzech kierunkach. Jednym z nich jest wyłączenie genu warunkującego

powstawanie antygenu αGal (α1,3-galaktozylotransferaza). Drugim,

wprowadzanie do świńskiego genomu genów człowieka regulujących

system dopełniacza, do których zaliczamy czynnik CD46, CD55 oraz

CD59 oraz trzecim modyfikowanie białek powierzchniowych komórek

dawcy: α1,2-fukozyotransferazy, α2,6-sjalilotransferazy, α2,3-sjalilo-

transferazy, α-galaktozydazy [11].



273

Zagrożenie niosą także inne uwarunkowania. Doniesienia z ostatnich lat

wskazują na obecność retrowirusów endogennych wbudowanych na stałe

w genom każdego gatunku ssaków. Świńskie retrowirusy endogenne

(PERVs – ang. porcine endogenous retroviruses) są wirusami zasied-

lającymi genom świni domowej. Podobnie jak HERV (ang. human

endogenous retroviruses) dla człowieka, retrowirusy te nie są patogenne

dla organizmu świni. Należy jednak zapytać czy PERVpo dostaniu się do

organizmu człowieka, nie staną się dla niego przyczyną poważnych

powikłań [11, 12]

Ocena bezpieczeństwa ksenotransplantacji między innymi sprowadza się

do diagnostyki molekularnej w kierunku występowania różnych sub-

typówPERV, co ma na celu ustalenie jak duże ich stężenie występuje w tkance

oraz czy posiada subtyp tworzący groźny dla człowieka rekombinant [13].

Ocena bezpieczeństwa badanych komórek pod względem zawartości PERV

stanowiła oddzielne badania, które są w trakcie publikacji.

Kontynuując analizę przydatności świńskich epitelialnych komórek

macierzystych, w niniejszej pracy wykonano wstępną analizę mającą na

celu identyfikację markerów powierzchniowych LESCs. Otrzymane wyniki

potwierdzają, że uzyskane w hodowli komórki stanowią pule komórek

macierzystych rąbka rogówki. Analiza statystyczna wykazała, że ekspresja

badanych markerów zmienia się w zależności od czasu trwania hodowli.

Uzyskane wyniki jednoznacznie wskazują na to, że po drugim pasażu tych

komórek wzrasta poziom ekspresji ABCG2. Czas otrzymania osadu

komórek pochodzących z drugiego pasażu od momentu założenia hodowli

pierwotnej obejmował około 4 tygodni hodowli.

ABCG2 (CD338) jest genem kodującym białko będące transporterem

błonowym, należącym do rodziny białek G. Jest białkiem wiążącym kasetę

ATP i zalicza się do białek transportujących (ABC) [14]. ABCG2 jest

obecny w tkankach nabłonkowych, dlatego stanowi marker dla LESCs.

Obecność ABCG2 jest konieczna dla utrzymania właściwego fenotypu

komórek i zaburzenie jego ekspresji może wpłynąć na zmniejszenie

populacji komórek lub zaburzyć przynależność do danej linii komórkowej.

ABCG2 uważa się za białko odpowiedzialne za utrzymanie macierzystości

komórek i zachowanie ich w stanie niezróżnicowanym [15]. Wzrost

ekspresji tego markera w drugim pasażu hodowli wskazuje na

uruchomienie mechanizmów pozwalających na utrzymanie stanu

niezróżnicowania.

Drugi badany marker molekularny stanowi białko kodowane przez gen

p63 (TP63). Jest to czynnik transkrypcyjny zaangażowany w procesy

morfogenetyczne. Obecność p63 jest charakterystyczna dla tkanek

epitelialnych i jest zdefiniowanym markerem epitelialnych komórek

macierzystych rąbka rogówki. Poziom ekspresji p63 wskazuje na


274

aktywność procesu proliferacji i świadczy o żywotności komórek.

Zaproponowany nowy model białka p63 określa je jako „strażnik”

kontrolujący przejście komórki na drogę zaprogramowanej śmierci.

Wykazano, że brak ekspresji tego białka powoduje apoptozę komórek

epitelialnych rąbka rogówki [16, 17]. Zaobserwowany silny spadek

ekspresji p63 w uzyskanych wynikach może świadczyć zatem o wejściu

hodowanych komórek na drogęprogramowanejśmierci.

Wstępna analiza poziomu ekspresji markerów molekularnych ABCG2

i p63 w hodowli pierwotnej świńskich epitelialnych komórek

macierzystych rąbka rogówki, toruje drogę dla dalszych analiz. Ustalenie

poziomów ekspresji większej liczby markerów definiujących LESCs

pochodzących od świni domowej oraz weryfikacja na poziomie translacji

pozwoli na dokładniejsze poznanie procesów zachodzących na różnych

etapach hodowli, a to z kolei przyczyni się do optymalizacji jej warunków

i zwiększenia jej wydajności.

Literatura

1. Zhang J., Huang C., Feng Y., Li Y., Wang W., Comparison of beneficial

factors for corneal wound-healing of rat mesenchymal stem cells and corneal

limbal stem cells on the xenogeneic acellular corneal matrix in vitro, Mol Vis.

2012;18:161-73. Epub 2012 Jan 20

2. Yao L., Bai H., Review: mesenchymal stem cells and corneal reconstruction,

Mol Vis. 2013 Nov 7;19:2237-43. eCollection 2013

3. Acar U., Pinarli F. A., Acar D. E., Beyazyildiz E., Sobaci G., Ozgermen B. B.,

Sonmez A. A., Delibasi T., Effect of allogeneic limbal mesenchymal stem cell

therapy in corneal healing: role of administration route. Ophthalmic Res.

2015;53(2):82-9. doi: 10.1159/000368659. Epub 2015 Jan 20

4. Sun T. T., Lavker R. M., Corneal epithelial stem cells: past, present, and

future, J InvestigDermatolSymp Proc. 2004 Sep;9(3):202-7

5. Figueira E. C., Di Girolamo N., Coroneo M. T., Wakefield D., The phenotype

of limbal epithelial stem cells, Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007 Jan;48(1):144-56

6. Li F., Zhao S. Z., Mesenchymal stem cells: Potential role in corneal wound

repair and transplantation, World J Stem Cells. 2014 Jul 26;6(3):296-304

7. Loureiro R. R., Cristovam P. C., Martins C. M., Covre J. L., Sobrinho J. A.,

Ricardo J. R., Hazarbassanov R. M., Höfling-Lima A. L., Belfort R. Jr, Nishi

M., Gomes J. Á., Comparison of culture media for ex vivo cultivation

of limbal epithelial progenitor cells, Mol Vis. 2013;19:69-77

8. Lamm V., Hara H., Mammen A., Dhaliwal D., Cooper D. K.,Corneal

blindness and xenotransplantation, Xenotransplantation, 2014 Mar-

Apr;21(2):99-114

9. Nieto-Miguel T., Calonge M., de la Mata A., López-Paniagua M., Galindo S.,

de la Paz M. F., Corrales R. M., A comparison of stem cell-related gene

expression in the progenitor-rich limbal epithelium and the differentiating

central corneal epithelium, Mol Vis. 2011;17:2102-17



275

10. Nakatsu M. N., González S., Mei H., Deng S. X., Human limbal mesenchymal

cells support the growth of human corneal epithelial stem/progenitor cells,

Invest Ophthalmol Vis Sci. 2014 Oct 2;55(10):6953-9

11. Smorąg Z., Słomski R., Jura J. i in., Transgeniczne świnie jako dawcy tkanek

i narządów do transplantacji u ludzi, Przegląd hodowlany (2011) nr 11: 1-4

12. Gemeniano M., Mpanju O., Salomon D. R. et al., The infectivity and host

range of the ecotropic porcine endogenous retrowirus, PERV-C, is modulated

by residues in the C-terminal region of its surface envelope protein, Virology

346(2006): 108-117

13. Kimsa M. C., Strzałka-Mrozik B., Kimsa M. W., Porcine endogenous retroviruses

in xenotransplantation – molecular aspects, Viruses 201413;6(5): 2062-83

14. Leccia F., Del Vecchio L., Mariotti E., Di Noto R., Morel A. P., Puisieux A.,

Salvatore F., Ansieau S., ABCG2, a novel antigen to sort luminal progenitors

of BRCA1- breast cancer cells, Molecular cancer. 2014 Sep 12;13:213

15. Szabó D. J., Noer A., Nagymihály R., Josifovska N., Andjelic S., Veréb Z.,

Facskó A., Moe M. C., Petrovski G., Long-Term Cultures of Human Cornea

Limbal Explants Form 3D Structures Ex Vivo – Implications for Tissue

Engineering and Clinical Applications, PLoS One. 2015 Nov

18;10(11):e0143053

16. Das P., Pereira J. A., Chaklader M., Law A., Bagchi K., Bhaduri G.,

Chaudhuri S., Law S., Phenotypic alteration of limbal niche-associated limbal

epithelial stem cell deficiency by ultraviolet-B exposure-induced phototoxicity

in mice, Biochemistry and Cell Biology, 2013 Jun;91(3):165-75

17. López-Paniagua M., Nieto-Miguel T., de la Mata A., Galindo S., Herreras J.

M., Corrales R. M., Calonge M., Consecutive expansion of limbal epithelial

stem cells from a single limbal biopsy, CurrentEyeResearch, 2013

May;38(5):537-49


276

Ekspresja markerów świńskich epitelialnych komórek macierzystych

rąbka rogówki

Ślepota spowodowana zaburzeniami funkcji rogówki nadal stanowi poważny problem medyczny.

Pomimo rozwoju medycyny regeneracyjnej, nie ma skutecznej metody leczenia dwustronnego

niedoboru komórek macierzystych rąbka rogówki. Występuje niedobór rogówek dla

przeszczepów. Alternatywnym rozwiązaniem może być wykorzystanie świńskich komórek

rogówki. Opublikowane prace wskazują na to, ze ksenotransplantacja rogówki pochodzącej od

świni może zostać wykorzystana klinicznie. Antygen Gal jest odpowiedzialny za indukcję reakcji

przeszczep przeciw gospodarzowi. Udowodniono, że antygen Gal jest praktycznie nieobecny

w świńskiej rogówce.

LESCs (ang. limbalepithelialstemcells) są komórkami wyizolowanymi z rąbka rogówki. Cienka

warstwa pomiędzy rogówką a twardówką oka jest miejscem, które jest bogate w te komórki.

Komórki te odgrywają potężną rolę w naturalnej rekonstrukcji uszkodzonej rogówki. Są

odpowiedzialne za właściwą wydajność tej części oka. Niestety nie ma w pełni określonych

markerów powierzchniowych LESCs. Część badań sugeruje, że cytokeratyna-3 (CK3),

cytokeratyna-12 (CK12), ABCG-2 charakteryzują epitelialne komórki macierzyste rąbka

rogówki. Innym ważnym markerem jest białko P63, kodowane przez gen TP63, które jest obecne

w tkankach epitelialnych. Pomimo problemów w identyfikacji, innym problemem jest

oczyszczenie i hodowla tych komórek w warunkach in vitro. Przyszłe badania mogą poprawić

obecną wiedzę na temat LESCs, a to z kolei może pozwolić na wykorzystanie tych komórek

macierzystych w terapii.

W tych badaniach przedstawiamy wyniki poziomu ekspresji dwóch markerów molekularnych

sugerowanych przez literaturę. Ekspresję TP63, ABCG-2 zmierzono dzięki metodzie QRT-PCR

w komórkach macierzystych rąbka rogówki zebranych z hodowli in vitro. Komórki były

hodowane w standardowej pożywce DMEM z dodatkiem 10% FBS.

The expression of porcine limbal epithelial stem cells markers.

Blindness caused by disorders of cornea function are still serious problem of medicine. Despite

development of regenerative medicine there is no treatment for bilateral limbal stem cell

deficiency. There is lack of corneal allografts for transplantation. Alternative solution might be

use of porcine corneal cells. Published papers showed that xenotransplantation of cornea obtained

from pigs could be used for clinical applications. Gal antigens are responsible for induction of

graft versus host reaction. It was proven that Gal antigen is almost absent in porcine cornea.

LESCs are cells insulated from corneal limbus. The thin layer between cornea and sclera of eye is

the rich place of stem cells. Those cells play a huge role in cornea reconstruction. They are

responsible for proper efficiency of that part of eye. Unfortunately, there are not fully specified

surface markers of LESCs. Some research suggests that cytokeratin-3 (CK3), cytokeratin-12

(CK12), ABCG-2 characterize limbal epithelial stem cells. Another significant marker is protein

P63 encoded by TP63 gene, which is present in epithelial tissues. Despite problems with

identification, another problem is to purify and culture them at in vitro conditions. Future research

may improve present knowledge about LESCs and thus, this will allow to use them in stem cells

therapy.

In this study we present the results of two molecular markers expression suggested by literature.

The expression of TP63 and ABCG-2 was examined by the use of QRT-PCR method in limbal

epithelial stem cells collected from in vitro culture. Cells were cultivated in standard medium

DMEM with 10% of fetal bovine serum.

277

Magdalena Antonowicz1, Anita Kajzer

2, Magdalena Grygiel-Pradelok

3

Dobór własności mechanicznych

elementów stabilizatora zewnętrznego

do leczenia kurzej klatki piersiowej

1. Wstęp

Deformacje klatki piersiowej od lat stanowią istotny problem leczniczy.

Do zniekształceń wrodzonych klatki piersiowej występujących najczęściej

zalicza się klatkę lejkowatą, zwaną również szewską oraz rzadziej

występującąklatkę kurzą [1]. Pierwotną przyczynątego typu zniekształceń

mogą być zmiany spowodowane wrodzonymi nieprawidłowościami układu

mięśni przyczepiających się i kształtujących klatkę piersiową. Według

Willitala deformacje klatki piersiowej można sklasyfikować graficznie,

wyróżniając 11 typów (rys.1) [2]:

typ I: symetryczna lejkowata klatka piersiowa (rys. 1a);

typ II: asymetryczna lejkowata klatka piersiowa (rys. 1b);

typ III: symetryczna płasko-lejkowata klatka piersiowa (rys. 1c);

typ IV: asymetryczna płasko-lejkowata klatka piersiowa (rys. 1d);

typ V: symetryczna kurza klatka piersiowa (rys. 1e);

typ VI: asymetryczna kurza klatka piersiowa (rys. 1f);

typ VII: symetryczna płasko-kurza klatka piersiowa (rys. 1g);

typ VIII: asymetryczna płasko-kurza klatka piersiowa (rys. 1h);

typ IX: kombinacja kurzej i lejkowatej klatki piersiowej (rys. 1i);

typ X: aplazja żeber (rys. 1j);

typ XI: rozszczep mostka (rys. 1k);

odsetek występowania wszystkich typów (rys. 1l).

[email protected], Katedra Biomateriałów i Inżynierii Wyrobów Medycznych,

Wydział Inżynierii Biomedycznej, Politechnika Śląska [email protected],Katedra Biomateriałów i Inżynierii Wyrobów Medycznych, Wydział

Inżynierii Biomedycznej, Politechnika Śląska [email protected], Katedra Biomateriałów i Inżynierii Wyrobów

Medycznych, Wydział Inżynierii Biomedycznej, Politechnika Śląska


278

Rysunek 1. Deformacje klatki piersiowej wg Willitala [2]

Kurza klatka piersiowa (pectus carinatum) jest deformacją przedniej

ściany klatki piersiowej. Wada ta charakteryzuje się zniekształceniem

mostka oraz chrząstek żebrowych, powodując wypchnięcie ich do przodu

[3] (rys. 2).

Rysunek 2. Deformacja klatki piersiowej: a) budowa anatomiczna kurzej klatki piersiowej [4], b)

kurza klatka piersiowa męska [5]

Najważniejszym oraz praktycznie jedynym wskazaniem do leczenia

kurzej klatki piersiowej jest aspekt psychologiczny oraz estetyczny.

Wyróżniane są trzy główne rodzaje kurzej klatki piersiowej: symetryczna,

asymetryczna oraz mieszana o różnym nasileniu i miejscu występowania

[3, 7]. U mężczyzn wada ta występuje czterokrotnie częściej niż u kobiet.

Leczenie jest dostosowywane indywidualnie w zależności od nasilenia

wady, a także od cech anatomicznych i fizjologicznych pacjenta [3].

Obecnie schorzenie to leczy się operacyjnie bądź zachowawczo.



279

Operacyjne metody małoinwazyjne stosowane są głównie w leczeniu

pacjentów przy silnie rozwiniętych wadach bądź po nieudanym leczeniu za

pomocą stabilizatora zewnętrznego [8‚10]. W celu przywrócenia

anatomicznego ukształtowania klatki piersiowej podczas zabiegu

operacyjnego wykorzystywane są odpowiednio wyprofilowane implanty

(rys. 3a) [6]. Alternatywą technik operacyjnych jest leczenie zachowawcze

polegające na zastosowaniu ortotycznych stabilizatorów zewnętrznych (rys.

3b). Główną zasadą działania zewnętrznego stabilizatora jest zastosowanie

przez dłuższy czas ciągłego nacisku na występujące zdeformowanie w celu

wymodelowania chrząstek żebrowych. Stabilizator zewnętrzny wyko-

rzystujepasy z klamrami otaczającymi klatkę piersiową. Posiada co

najmniej dwa punkty kontaktu ze ścianami klatki piersiowej. Jeden punkt

styku występuje z przodu i ma na celu dostarczania nacisku na deformację,

drugi punkt występuje od strony pleców. Zakłada się, że podatna klatka

piersiowa dostosowuje się do tej techniki więc stosowanie stabilizatora

zewnętrznego wymaga podatności klatki piersiowej [10].

Stabilizatory ortotyczneze względu na rodzaj występującej wady są

dobierane i projektowane indywidualnie dla każdego pacjenta. Ich

zadaniem jest uzyskanie anatomicznego ukształtowania klatki piersiowej

oraz geometrycznego wyrównania poprzez generowanie sił oddziałujących

na punkty najbardziej uwypuklonego miejsca [11].

Ta metoda leczenia dedykowana jest głównie dla młodych pacjentów

ze względu na plastyczność chrząstek żebrowych oraz dla pacjentów,

u których wada występuje o słabym bądź umiarkowanym nasileniu.

Stabilizator, jako alternatywa dla leczenia chirurgicznego przynosi

pozytywne efekty lecznicze, pozwalając uniknąć pooperacyjnych powikłań,

blizn oraz bólu [12, 13].

Wykorzystanie zasad mechaniki i biomechaniki w połączeniu z metodami

komputerowymi pozwala na stworzenie spersonalizowanych konstrukcji

stabilizatorów stosowanych w leczeniu wad kurzej klatki piersiowej.

Rysunek 3. Materiały wspomagające leczenie kurzej klatki piersiowej: a) płyta stabilizująca

stosowana w leczeniu operacyjnym [6], b) stabilizator zewnętrzny firmy Trulifestosowany

w leczeniu zachowawczym [14]


280

Zasadniczym celem pracy było skonstruowanie fizycznego prototypu

stabilizatora zewnętrznego dla mężczyzny w wieku 24 lat.

W ramach pracy przeprowadzono uproszczoną analizę wytrzymałościową

elementów stabilizatora metodą elementów skończonych (MES),

wceluwytypowania obszarów o największych wartościach naprężeń. Na

podstawie uzyskanych wyników dobrano materiały wykorzystywane na

poszczególne jego elementy, dla których w dalszej kolejności przeprowadzono

badania własności wytrzymałościowych. Efektem końcowym prowadzonych

badań było wytworzenie prototypu stabilizatora do leczenia kurzej klatki

piersiowej.

2. Materiały stosowane do konstrukcji stabilizatora zewnętrznego

Stabilizator zewnętrzny do leczenia kurzej klatki piersiowej, zwany również ortezą,zdefiniowanym w normie dotyczącej biologicznej oceny wyrobów medycznych ISO 10993-1 jest wyrobem medycznym kontaktującym się z powierzchnią skóry. Stabilizator zewnętrzny charakteryzuje się konstrukcją techniczną dopasowaną do całej lub części kończyny górnej bądź dolnej, tułowia, głowy lub karku, atakże ich pośrednich przegubów. Ma za zadanie wspomagać lub zastępować funkcje statyczne i ruchowe oraz zabezpieczać przed powstaniem lub pogłębianiem się zniekształceń. Ortezę konstruują, opracowują technicy protetycy i ortotycy zakładów ortopedycznych na podstawie indywidualnych pomiarów[15, 16].

Materiałem, który może być zastosowany do produkcji stabilizatorów zewnętrznych będący wyrobem medycznym może być każdy polimer naturalny bądź syntetyczny, metal, stop metali, ceramika lub inna substancja nieożywiona, włączając w to tkankę pozbawioną funkcji życiowych. Przy doborze materiałów, które zostaną użyte przy produkcji wyrobu, zalecane jest rozważenie przydatności do zamierzonego celu. Należy wziąć pod uwagę cechy i własności materiału, w tym: toksykologiczne, morfologiczne, mechaniczne, elektryczne, chemiczne oraz fizyczne. Zaleca się również, aby zwrócić uwagę na materiały biologiczne, przewidziane środki dodatkowe, zanieczyszczenia z procesu produkcyjnego i ich pozostałości, substancje wymywalne, produkty degradacji, inne składniki i ich interakcje w produkcie gotowym oraz własności i charakterystykę produktu końcowego ze względu na wpływ na ogólną biologiczną ocenę wyrobów [15]. Przy doborze materiałów składowych ortezy należy również wziąć pod uwagę cechy takie jak [17]:

własności mechaniczne;

stopień kontaktu, inwazyjności z ciałem ludzkim;

okres zastosowania;

możliwości wykonawcze;

ekonomiczność rozwiązania.



281

W ostatnich latach nastąpił dynamiczny rozwój metod stabilizacji

zewnętrznej kurzej klatki piersiowej. Na podstawie literatury można

stwierdzić, że składowe stabilizatorów wykonywane są głównie z materiałów

lekkich, szyn aluminiowych oraz elementów polimerowych [18‚20].


3.1. Model trójwymiarowy stabilizatora zewnętrznego

Wykonanie fizycznego modelu spersonalizowanego prototypu stabilizatora

zewnętrznego do leczenia kurzej klatki piersiowej wymaga precyzyjnego

opracowania wieloetapowej procedury. Pierwszym, niezbędnym etapem było

sformułowanie modelu geometrycznego stabilizatora zewnętrznego dla

konkretnego przypadku – mężczyzna lat 24.W tym celu przeniesiono

rzeczywisty kształt trójwymiarowy męskiej klatki piersiowej o prawidłowej

budowie (rys. 4a) do postaci cyfrowej z wykorzystaniem ręcznego skanera

HandyScan 3D Revscan oraz oprogramowaniaGeoMagic 2012, a następnie

w programie InventorFusion 2012 zasymulowano kurzą klatkę piersiową,

która występuje wg literatury najczęściej (typ 5 wg skali Willitala

– zniekształcenie symetryczne) (rys. 4b).

Rysunek 4.Model klatki piersiowej: a) o prawidłowej budowie, b) kurzej [opracowanie własne]

Na podstawie zamodelowanej kurzej klatki piersiowej zaprojektowano

spersonalizowany stabilizator zewnętrzny do jej leczenia. Na etapie

projektowania modelu wzięto pod uwagę założenia konstrukcyjne,

materiałowe (aluminium H24, polimetakrylan metylu, poliuretan oraz

polipropylen), użytkowe, funkcjonalne, estetyczne, a także płeć, wiek oraz

predyspozycje rekonwalescenta. Model stabilizatora zewnętrznego

wykonano w programie Inventor Professional 2015.W skład stabilizatora

wchodzi 13 elementów stałych oraz 2 dodatkowe. Główne elementy, które

odgrywają najważniejszą rolę w konstrukcji stabilizatora to łuk przedni

oraz tylni okalające klatkę piersiową,połączone za pomocą pasków

zapadkowych oraz klamer umożliwiającychregulację siły nacisku


282

stabilizatora względem zniekształcenia. Symetrycznie, na środkowej części

łuku przedniego umieszczono element powodujący ucisk największego

uwypuklenia kurzej klatki piersiowej,tym samym przywracając pozycję

mostka do pozycji anatomicznej.Zaprojektowano ochraniające pianki

mające na celu zabezpieczeniepowierzchni skóry pacjenta przed możliwym

podrażnieniem przez otaczające klatkę piersiową łuki. W celu nadania

estetyki zaprojektowano pokrowce, które są elementami dodatkowymi.

Utrzymanie stabilizatora w pozycji prawidłowej odbywa się poprzez

odpowiedni docisk realizowany przez paski zapadkowe, natomiast w celu

zwiększenia stabilności zamodelowano szelki (rys. 5).

Rysunek 5. Model geometryczny stabilizatora zewnętrznego 1-pokrowiec tylni, pod nim pianka

oraz łuk tylni, 2-pasek zapadkowy, 3-klamra zaciskająca, 4-Pokrowiec prawy, pod nim pianka

oraz łuk przedni, 5-łuk przedni, 6-pokrowiec na element uciskający, pod nim pianka, 7-element

uciskający, 8-szelki [opracowanie własne]

3.2. Analiza wytrzymałościowa

Zweryfikowanie wartości własności wytrzymałościowychelementów

konstrukcji stabilizatora zewnętrznego przeprowadzono za pomocą uprosz-

czonej analizy numerycznej metodąelementów skończonych.

3.2.1. Uproszczony model

Model stabilizatora zewnętrznego uproszczono do elementu łuku

przedniego, elementu uciskającego oraz wkrętów mocujących ze sobą

obydwie częściortezy.Dodatkowo zamodelowano kościec odcinka piersio-

wego klatki piersiowej o szerokości 100mm. Zbudowane modele tworzą ze

sobą układ stabilizator – kość (rys. 6).

8

2

1

3 4 5

6

7



283

Rysunek 6. Uproszczony model geometryczny stabilizatora zewnętrznego oraz łuku odcinka

piersiowego klatki piersiowej [opracowanie własne]

3.2.2. Opracowanie modelu obliczeniowego oraz wyniki analizy

Dyskretyzację opracowanego układu stabilizator – kość wykonano

z wykorzystaniem oprogramowania ANSYS Workbench v15 i elementu

typu SOLID187. Dla układu stabilizator – kość wygenerowano siatkę

o wysokiej jakości wykorzystując zaawansowane metody dyskretyzacyjne,

tj. generowanie siatki od wnętrza objętości oraz wysoką jejrelewancję co

pozwoliło na uzyskanie siatki o skośności poniżej 0,8 co przekłada się na

miarodajność wyników (rys. 7).

Rysunek 7. Modele zdyskretyzowane: a) kość żebra, b) łuk stabilizatora, c) element uciskający,

d) wkręty [opracowanie własne]

Zakres przeprowadzonej analizy obejmował: wyznaczenie stanu

przemieszczeń, odkształceń i naprężeń zredukowanych w poszczególnych

elementach układu stabilizator-kość w zależności od zadanego przemiesz-

czenia. Poszczególnym elementom nadano własności mechaniczne struktur na

podstawie danych literaturowych (tab. 1) [21, 22] oraz nadano warunki

a)

b)

c)

d)


284

brzegowe, które z odpowiednim uproszczeniem odwzorowują zjawiska

zachodzące w układzie rzeczywistym. Zastosowano przemieszczenie

2,5 mm przyłożone na końcachłuku przedniego, które spowodowało

przywrócenieprzedniego łuku klatki piersiowej do pozycji anatomicznej

(rys. 8). Połączenie stabilizatora z kością zrealizowano poprzez nadanie

kontaktów tarciowych o współczynniku tarcia μ = 0,4.

Rysunek 8. Zadane przemieszczenie dla układu stabilizator – kość [opracowanie własne]

Tabela 1. Dane materiałowe dla potrzeby analizy [21, 22]

Element Kość

żebra

Łukprzedni

stabilizatora

(aluminium

H24)

Element

uciskający

(polimetakrylan

metylu)

Wkręty

mocujące

Moduł Younga

[MPa] 7500 69000 2450 200000

Liczba Poissona 0,3 0,33 0,375 0,3

Rysunek 9. Rozkład przemieszczeń zredukowanych dla przemieszczenia o 2,5 mm w układzie

stabilizator-kośćna osi Z [opracowanie własne]

F F



285

Rysunek 10. Rozkład odkształceń zredukowanych dla przemieszczenia o 2,5 mm w elementach

układu stabilizator-kość: a) kość żebra, b) łuk przedni, c) element uciskający, d) wkręt


Rysunek 11. Rozkład naprężeń zredukowanych dla przemieszczenia o 2,5 mm w elementach

układu stabilizator-kość: a) kość żebra, b) łuk przedni, c) element uciskający, d) wkręt


a) b)

c) d)

a) b)

c) d)


286

Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono zróżnicowany rozkład

wartości przemieszczeń, odkształceń i naprężeńzredukowanych zarówno

w poszczególnych elementach stabilizatora,jak i fragmencie

kości.Największa wartość przemieszczenia wystąpiław środkowej części

łuku stabilizatora pod elementem uciskającym w kierunku osi „Z”

i wyniosła l= 0,49 mm (rys. 9).

Ponadto stwierdzono, że maksymalne odkształcenie przy przemiesz-

czeniu o 2,5 mm zaobserwowano na zewnętrznych krawędziach elementu

uciskającego,które wynosiłoεmax = 0,19 %, naprężenie natomiast

ζmax = 4,67 MPa. W kości żebra odkształcenie wyniosło εmax = 0,042 %,

natomiast naprężenie ζmax = 3,15 MPa. Przy tym samym przemieszczeniu

zaobserwowano również maksymalne naprężenie, które wystąpiło w łuku

przednim ζmax = 102,45 MPa, odkształcenie w tym miejscu wyniosło

εmax= 0,14 %. We wkrętach łączących ze sobą łuk przedni oraz element

uciskowy naprężenie wyniosło ζmax = 12,48 MPa, natomiast odkształcenie

εmax= 0,012%(rys. 10, 11).

Rysunek 12. Naprężenia zredukowane w elementach stabilizatora w zależności od

przemieszczenia układu [opracowanie własne]

Uzyskane wartości przemieszczeń świadczą o stabilności i odpo-

wiedniej sztywności analizowanego układu. Wartości naprężeń zreduko-

wanych w stabilizatorze dla łuku przedniego nie przekroczyły granicy

plastyczności aluminium (Rp0,2= 123 MPa) (rys. 12) przy przemieszczeniu

układu w zakresie 0,5 mm‚ 3,0 mm. Gwarantuje to odkształcenie

elementów stabilizatora w zakresie sprężystym. Natomiast przekroczenie

tej wartości następuje przy przemieszczeniu układu powyżej 3,0 mm.

-15

5

25

45

65

85

105

125

0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0

Nap

ręże

nie

, M

Pa

Przemieszczenie, mm

Kość

Łuk

przedni

Element

uciskając

y

Wkręt



287

3.3. Badania własności mechanicznych elementów konstrukcyjnych

W celu zweryfikowania wyników analizy numerycznej wstępnie dobranych materiałów konstrukcyjnych stabilizatora (głównie na łuki okalające klatkę piersiową) przeprowadzono statyczną próbę rozciągania. Do badań wytypowano blachę aluminium H24w stanie umocnionym, o grubościach: 0,5 mm, 1,0 mm, 1,5 mm i własnościach mechanicznych przedstawionych w tabeli 2 będącą materiałem odgrywającym najważ-niejszą rolę w konstrukcji stabilizatora. Dodatkowo statyczną próbę rozciągania przeprowadzono dla pasków poliuretanowych zastosowanych na paski zapadkowe oraz pasy polipropylenowe na ramiączka. W celu przeprowadzenia statycznej próby rozciągania przygotowano próbki aluminium dla każdej z grubości (rys. 13) oraz próbki poliuretanowe (rys. 14) i polipropylenowe (rys. 15).

Tabela 2. Własności mechaniczne blachy aluminiowej o grubości 0,5 mm, 1,0 mm, 1,5 mm [23]

Własności mechaniczne

dla przekroju

poprzecznego

Wytrzymałość

na rozciąganie

Rm [MPa]

Granica

plastyczności

Rp0,2 [MPa]

Wydłużenie

A50 [%]

Blacha

aluminiow

a

o grubości

0,5 mm 138,0 127,0 6,4

1,0 mm 123,0 116,0 4,3

1,5 mm 129,0 123,0 5,2

Rysunek 13. Aluminiowe próbki do badania [opracowanie własne]

Rysunek 14. Próbki pasa poliuretanowego Rysunek 15. Próbki pasa polipropylenowego

[opracowanie własne] [opracowani własne]


288

Statyczną próbę rozciągania przeprowadzono zgodnie z zaleceniami normy PN-EN ISO 6892-1 [24]. W badaniach wykorzystano maszynę wytrzymałościową firmy MTS Criterion model 45. Próba dla wszystkich trzech rodzajów próbek została przeprowadzona w temperaturze pokojowej T=23°C z prędkością rozciągania 5 mm/min.

Na podstawie wyników statycznej próby rozciągania wygenerowano przykładowy wykres dla próbek 3Al_0,5, 3Al_1,0 oraz 3Al_1,5 zależności wartości siły od wartościwydłużenia(rys. 16).

Rysunek 16. Przykładowy wykres zależności siła – wydłużenie dla próbek aluminiowych


Granica plastyczności dla blachy 0,5 mm, 1,0 mm oraz 1,5 mm jest

zbliżona. Próbka aluminium o grubości 1,5 mm charakteryzuje się

największym odkształceniem, a jej granica plastyczności wyniosła 123MPa.

Na podstawie wyników statycznej próby rozciągania pasów

poliuretanowych oraz polipropylenowych stwierdzono, iż są wystarczająco

wytrzymałe na elementy stabilizatora zewnętrznego.

4. Prototyp stabilizatora zewnętrznego

Na podstawie procedur weryfikujących konstrukcje stabilizatora

zewnętrznego, przygotowano jego składowe poprzez następujące czynności:

wyciętoz blachy aluminiowej za pomocą strumienia wody elementów

do wyprofilowania z nich łuków: przedniego oraz tylnego;

wyciętostrumieniem wody części z polimetakrylanu metylu jako

elementu uciskającego największe uwypuklenie;

wycięto ręcznie pianki poliuretanowe: przednie, tylneoraz na element

uciskający, ochraniających ciało przed podrażnieniem przez aluminiowe

łuki;

0

500

1000

1500

2000

2500

0,0 0,2 0,5 0,7 0,9 1,2 1,4 1,6 1,9 2,1 2,3 2,6 2,8

Sił

a, N

Wydłużenie, mm

3Al_0,5

3Al_1,0

3Al_1,5



289

zapadkowe paski polipropylenowe oraz klamry zaciskające jako

elementy gotowe, mające za zadanie przemieszczenie stabilizatora

jednocześnie uciskając klatkę piersiową;

wykonano dwa zestawypokrowców na elementy stabilizatora

z materiału bawełnianego. W skład jednego zestawu wchodzą dwa

przedniepokrowce, jeden tylni oraz pokrowiec na element

uciskający. Od strony wewnętrznej pokrowca, przymocowano piankę

poliuretanową, przy dolnej krawędzi przymocowano zatrzaski

umożliwiające zapięcie pokrowców natomiast na krawędzi górnej

wykonano szlufki w celu przymocowania szelek Wykonane zostały

dwa zestawy, ze względu na możliwość ich wymiany. Pokrowiec ma

za zadanie ochronę przed podrażnieniami, zachowanie higieny oraz

estetyki;

wykonano szelki stabilizująceo długości 60 cm z dodatkową możli-

wością regulacji o 30 cm oraz ich odpięcia za pomocą haczyków.

Tak przygotowane składowe elementów ze sobą połączono tworząc

gotowy prototyp stabilizatora zewnętrznego (rys. 17, 18). W konstrukcji

stabilizatora elementami nieruchomymi są paski zapadkowe oraz klamry

zaciskające. Pozostałe części mogą zostać zdemontowane w celu wymiany

pokrowca bądź jego oczyszczenia.

Rysunek 17. Stabilizator zewnętrzny po montażu wszystkich składowych


290

Rysunek 18. Stabilizator zewnętrzny umieszczony na klatce piersiowej

5. Podsumowanie

W przedstawionej pracy zaprezentowano najistotniejsze aspekty

dotyczące problematyki leczenia kurzej klatki piersiowej za pomocą

stabilizatorów zewnętrznych. Dyskomfort psychiczny wywołany przez

wadę kurzej klatki piersiowej powoduje wzrost zapotrzebowania na

skuteczne i szybkie metody leczenia tej wady. W ostatnich latach nastąpił

dynamiczny rozwój metod stabilizacji zewnętrznej kurzej klatki piersiowej.

Wpracy głównie skoncentrowano się na procedurach pozwalających na

konstrukcję fizycznego modelu stabilizatora zewnętrznego męskiego – ze

względu na większy odsetek zachorowań wśród mężczyzn. Trudnością

w podjęciu działań konstrukcyjnych jest indywidualne uwarunkowanie

anatomiczne pacjenta oraz rodzaj i nasilenie wady.

Pierwszym etapem było zaprojektowanie precyzyjnego stabilizatora

zewnętrznego na podstawie wykonanego modelu kurzej klatki piersiowej

oraz dobrano wstępnie materiały. W celu weryfikacji prawidłowego doboru

materiałów na składowe stabilizatora wykonano analizę numeryczną

z wykorzystaniem metody elementów skończonych dla uproszczonego

układu stabilizator – kość. Wyniki analizy numerycznej elementów układu

stabilizator- kość wskazują na zróżnicowany rozkład wartości przemiesz-

czeń, odkształceń i naprężeń zredukowanych. Przy przemieszczeniu

stabilizatora w zakresie L = 0,5 mm – 3,0 mm nie przekroczono granicy

plastyczności zarówno w poszczególnych jego elementach, jak i w kości

żebra. Następnie na podstawie wyników statycznej próby rozciągania

stwierdzono że, materiałami konstrukcyjnymi na elementy stabilizatora są:

blacha aluminium o grubości 1,5 mm, paski poliuretanowe oraz pasy

polipropylenowe. Wyniki analizy numerycznej metodą elementów



291

skończonych oraz statycznej próby rozciągania materiału dobranego na łuki

okalające klatkę piersiową tj. aluminium H24 wskazują,żedobrany materiał

jest wytrzymały, nie narażając na odkształcenie materiału podczas

stabilizacji. Szacunkowy koszt wykonanego stabilizatora wynosi 170,45 zł

uwzględniając w nim materiał oraz usługi produkcyjne, natomiast koszt

zewnętrznego stabilizatora do leczenia kurzej klatki piersiowej firmy

Trulife wynosi około 600 zł [23]. Koszt wykonanego stabilizatora uległ

czterokrotnemu zmniejszeniu.

Literatura

1. Fibak J.,Chirurgia repetytorium, Warszawa : Wydawnictwo Lekarskie PZWL,

(2004) s. 164-169

2. Stoba Cz., Willitala G. H., Sołtysiak P. K., Atlas chirurgii dziecięcej, Pelpin :

Bernardinum, (2008) s. 31-41

3. Czernik J., Powikłania w chirurgii dziecięcej, Wydawnictwo Lekarskie

PZWL, Warszawa,(2009) s. 58, 59, 330-347

4. http://isurgical3d.com/. [Online]

5. Coelho M., Guimaraes P., Pecus Carinatum, The Journal Brasileiro de

Pneumologia, (2007), strony 463-474

6. Kajzer A., Kajzer W., Dzielicki J., Matejczyk D,. The study of

physicochemical properties stabilizing plates removed from the body after

treatment of pectus excavantum, Acta of Bioengineering and Biomechanics,

(2015), 2, strony 35-44

7. Fokin A. A, Steuerwald N. M., Ahrens W. A., Allen K.E., Anatomical,

Histologic, and Genetic Characteristics of Congenital Chest Wall Deformities,

Thoracic and Cardiovascular Surgery, Elsevier (2009), s. 44-57

8. Park C. H., Kim T., Haam S. J., Jeon I., Lee S., The etiology of pectus

carinatum involves overgrowth of costal cartilage and undergrowth of ribs,

Journal of Pediatric Surgery, (2014) (49), s. 1252-1258

9. Emil S., Laberge J. M., Sigalet D., Baird R., Pectus carinatum treatment in

Canada: current practices, Journal of Pediatric Surgery, (2012) (47), s. 862-866

10. Cohee A. S., Lin J. R., Frantz F. W., Kelly R. E., Staged management of

pectus carinatum, Journal of Pediatric Surgery, (2013) (48), s. 315-320

11. Stephenson J. T., Du Bois J., Compressive orthotic bracing in the treatment

of pectus carinatum: the use of radiographic markers to predict success,

Journal of Pediatric Surgery, (2008) (43), s. 1776-1780

12. Martinez-Ferro M., Fraire C., Bernard S., Dynamic compression system for the

correction of pectus carinatum, Seminars in Pediatric Surgery, (2008) (17),

s. 194-200

13. Desmarais T. J., Keller M. S., Pectus Carinatum, Current Opinion surgery,

(2013) (25), s. 375-379

14. www.trulife.com[Online]

15. Norma PN – EN ISO 10993-1 Biologiczna ocena wyrobów medycznych, s. 5-7

16. Norma PN-EN ISO 9999 Pomoce techniczne dla osób niepełnosprawnych.

Klasyfikacja


292

17. Marciniak J., Biomateriały, Wydawnictwo Politechniki Śląskiej, Gliwice

(2013), s. 18-27, 376-402

18. Kravarusic D., Dicken B. J., Dewar R., Harder J., Poncet P., Schneider M.,

Sigalet D. L,. The Calgary protocol for bracing of pectus carinatum:

a preliminary report, Journal of Pediatric Surgery, (2006) (41), s. 923-926

19. Kang Y., Jung J., Chung S., Cho J., Lee S., Factors affecting patient

compliance with compressive brace therapy for pectus carinatum, Interactive

CardioVascular and Thoracic Surgery (2014) s. 1-4

20. www.oandp.com [Online]

21. Pezowicz C., Głowacki M., The mechanical properties of human ribs in young

adult. Acta of bioengineering and biomechanics.2012, Tom 2, 14, strony 53-60

22. www.matweb.com [Online]

23. Inspection Certificate AssanAluminyum EN 10204-3.1

24. Norma PN-EN ISO 6892-1: Metale, Próba rozciągania, Część 1: Metoda

badania w temperaturze pokojowej



Celem pracy było zaprojektowanie oraz wykonanie prototypu zewnętrznego stabilizatora do

leczenia kurzej klatki piersiowej.

Na podstawie wykonanego skanu 3D powierzchni skóry klatki piersiowej o prawidłowej

budowie dokonano symulacji kurzej klatki piersiowej. Wykonane modele umożliwiły precyzyjne

zaprojektowanie i wytworzenie spersonalizowanego stabilizatora zewnętrznego. W celu zweryfi-

kowania poprawności konstrukcji oraz doboru materiału na składowe stabilizatora wykonano

analizę numeryczną za pomocą metody elementów skończonych. Na podstawie otrzymanych

wartości przemieszczeń, odkształceń i naprężeń zredukowanych oraz wyników statycznej próby

rozciągania stwierdzono, że najkorzystniejszymimateriałami na składowe stabilizatora są:

aluminium o grubości 1,5 mm, pasy poliuretanowe oraz pasy polipropylenowe.

Selection of mechanical properties of materials used in components of

stabilizer for pectus carinatum treatment

The aim of this study has been to design and make an external orthotic stabilizer (pectus bracing)

used the in treatment of the chicken chest (pectus carinatum). On the basis of a 3D scan

performed of the skin surface of the normal structured chest, there has been a simulation

performed of the pectus carinatum. The performed models have made it possible to design and

produce a personalized external stabilizer. In order to verify the correctness of the design and the

selection of material making up the components of the pectus bracing, there has been a numerical

analysis performed using the finite-element method. Based on the obtained values of dislocations,

reduced stress and tensions and the static tensile test along, it has been found that the best

materials for the components of the pectus bracing include: aluminum 1.5 mm thick,

polyurethane belts and polypropylene straps.

293


Wieloaspektowa analiza problematyki

związanej z mechanizmami niszczenia implantów

1. Wstęp

Przyczyn szybkiego zużywania się stawów, zarówno naturalnych, jak

i sztucznych, jest kilka, m.in. aktywny tryb życia, wzrost liczby urazów,

w tym wypadków komunikacyjnych i kontuzji przy uprawianiu sportu,

często również nadwaga. Średnia wieku pacjentów poddawanych operacji

endoprotezoplastyki stawu biodrowego z każdym rokiem spada, natomiast

liczba wykonanych operacji systematycznie rośnie [1]. Lekarze ostrzegają

przed przeprowadzania endoprotezoplastyki u młodych ludzi przez wzgląd

na ograniczoną trwałość protez, niestety – coraz częściej zdarza się, że po

kilkunastu latach od operacji stan endoprotezy wymaga jej reimplantacji

[1]. W efekcie obok kolejki osób oczekujących na protezoplastykę pier-

wotną, tworzy się druga kolejka czekających na realloplastykę. Mimo to,

chorzy bardzo często decydują się na wymianę stawu, bowiem taki zabieg

oznacza dla nich powrót do życia pozbawionego dolegliwości bólowych [2].

Powszechnie stosowane do wytwarzania implantów materiały

metaliczne, pomimo wielu zalet, posiadają szereg niekorzystnych cech.

Metale o bardzo dobrych właściwościach mechanicznych są zbyt sztywne

w stosunku do kości, jak również ulegają korozji w agresywnym

środowisku biologicznym. Działanie na implanty naprężeń mechanicznych

i obecność płynów ustrojowych, może przyspieszać ich degradację,

zmniejszyć stabilność i trwałość [3].

2. Cel pracy

W pierwszej części pracy omówiono i przeanalizowano obciążenia oraz

warunki ich występowania w stawie biodrowym. Przedstawiono tu naj-

częściej opisywane modele przenoszenia obciążeń. W kolejnym rozdziale

krótko scharakteryzowano protezoplastykę, jej przebieg oraz powody, dla

których zabieg ten jest wykonywany. Dalsza część pracy zwraca uwagę na

problemy związane z eksploatacją materiałów stosowanych na implanty,

przeanalizowano procesy niszczenia, a także problemy związane z eksplo-

atacją i pękaniem trzpieni. 1 [email protected], Katedra Inżynierii Materiałowej i Biomedycznej,



294

3. Analiza warunków obciążeń w stawie biodrowym

Układ ruchowy człowieka jest złożony z wzajemnie powiązanych ze sobą za pomocą więzadeł stawów i mięśni, nad którymi kontrolę sprawuje układ nerwowy. Każda zmiana anatomiczna lub fizjologiczna powoduje zaburzenia funkcjonowania i biomechaniki całego układu, ponieważ stanowi on łańcuch kinematyczny [3]. Staw biodrowy, jako składowa narządu ruchu podlega obciążeniom statycznym, które wynikają z oddzia-ływań mięśni, dynamicznym, powstającym na skutek wykonywanych ruchów oraz obciążeniom wynikającym z masy ciała. Wyróżniamy dwa rodzaje obciążeń: przewlekłe – powolne, systematyczne powstawanie zmian zwyrodnieniowych oraz nagłe, prowadzące do pęknięcia lub złamania kości [4]. Przenoszenie wymienionych obciążeń z kręgosłupa przez miednice na kończyny dolne prezentuje rys. 1.

Siły oddziaływujące na staw biodrowy podzielić można na zewnętrzne i wewnętrzne. Siłami zewnętrznymi określa się siły przyciągania ziemskiego, oddziaływanie podporowe oraz siły, z jakimi inne ciała oddziaływają na organizm ludzki. Do sił wewnętrznych zalicza się siły, które są wynikiem pracy mięśni [3]. Dzięki odpowiedniej budowie stawu biodrowego, strukturze kostnej, silnym mięśniom i więzadłom, przysto-sowany jest on do przenoszenia dużych obciążeń oraz pełnienia funkcji podporowej podczas statycznego obciążenia kończyn. Ocena kierunków i wartości oddziaływań, z uwagi na dużą liczbę mięśni i miejsc przyłożenia sił oraz zmieniających się faz chodu, jest bardzo trudna. Wynika to ze zmiany położenia środka ciężkości ciała oraz ruchów w innych płasz-czyznach (przywodzenie, odwodzenie, ruchy rotacyjne). W pracy przedsta-wiono trzy najczęściej opisywane w źródłach literaturowych modele przenoszenia obciążeń.

3.1. Model Pauwelsa

Model ten rozpatruje fazę obciążania obunożnego i jednonożnego (rys.2a,b). Obciążenia pochodzące od głowy, tułowia i kończyn górnych stanowią 62% masy ciała. W modelu Pauwelsa wektor siły (R) ukierunko-wany jest w punkt obrotu (O), stanowiący anatomiczny środek głowy kości udowej. Przyjmuje się, że całkowita wartość sił obciążających staw w fazie podparcia jednonożnego, wynika z oddziaływania masy ciała i sił mięśni okołostawowych. Relacje te przestawia się graficznie za pomocą dwuramiennej dźwigni, której punkt podparcia odwzorowuje środek stawu biodrowego [5].

Siła R jest wielkością wypadkową zredukowanego ciężaru ciała (P; Pz = 0,81 P) oraz siły mięśni odwodzących (M), tj. pośladkowego średniego i małego. Model uwzględnia oddziaływanie pasma biodrowo-piszczelowego, natomiast w płaszczyźnie horyzontalnej – oddziaływanie mięśni rotujących.

Wieloaspektowa analiza problematyki związanej z mechanizmami niszczenia implantów

295

Rysunek 1. Model przenoszenia obciążeń z kręgosłupa na kończyny dolne [5]

Rysunek 2. Model obciążeń wg Pauwelsa: (a) podparcie obunożne, (b) podparcie jednonożne,

(c) aktywny model oddziaływań obciążeń w stawie biodrowym wg Maqueta,

(d) wg Będzińskiego [5]

3.2. Model Maqueta

Na bazie modelu Pauwelsa powstał model Maqueta (rys.2. c), który

w odmienny sposób przedstawia pasmo biodrowo-piszczelowe. W modelu

tym, pasmo zewnętrzne w powięzi szerokiej uda napinane jest przez

odwodziciele. Symulacja modelu przedstawia pasmo jako cięgno, które

biegnie wzdłuż kości udowej od stawu kolanowego do kości miednicy

i opiera się na krętarzu kości udowej, dzięki czemu ma możliwość ślizgania

się po nim. Taki model stabilizuje staw biodrowy lepiej poprzez dodatkową

siłę poziomą [6].

3.3. Aktywny model oddziaływania obciążeń (Będzińskiego)

Uwzględnia oddziaływanie masy tułowia na głowę kości udowej (R),

jak również oddziaływania mięśni odwodzicieli (M), pasma biodrowo

piszczelowego (T) oraz oddziaływanie mięśni rotujących, powodujących

a) b)

c) d)


296

skręcanie kości udowej (rys.2d) [5]. Obciążenia mechaniczne, występujące

w warunkach statycznych i dynamicznych, mają istotny wpływ na

wytrzymałość struktur kostnych oraz ich budowę wewnętrzną

3.4. Rozkład sił w stawie biodrowym

W odcinku bliższym kość udowa tworzy skomplikowany mechaniczny

układ: ciężar ciała przenoszony jest z głowy kości udowej na jej trzon

poprzez dźwignię, którą tworzy szyjka kości udowej i okolice krętarzy.

Wektor tej siły, wg Pauwelsa działa pod kątem 159º do osi pionowej.

Obciążenie podczas podparcia jednonożnego wzrasta trzykrotnie [4]. Punkt

przyłożenia siły oraz jej wektor przebiegają w oddaleniu od osi długiej

kości udowej, co jest wynikiem przesunięcia przyśrodkowego mecha-

nicznej osi w stosunku do osi anatomicznej kończyny dolnej. To z kolei

powoduje powstawanie w korowej warstwie kości udowej sił rozciąga-

jących (po stronie bocznej) i sił ściskających (po stronie przyśrodkowej).

Siły te współistnieją w ścisłej równowadze – pomimo przeważającego

działania sił ściskających, boczne ukształtowanie kości udowej kompensuje

różnice sił [7]. Biomechaniczną konsekwencją działania zbyt dużych sił są

najczęściej złamania w okolicy krętarza mniejszego, które stanowią 34%

wszystkich złamań w okolicy biodra.

W doświadczeniach nad biomechaniką oraz patomechaniką stawu

biodrowego opracowywane są modele fizjologicznego rozkładu sił

i naprężeń w stawie biodrowym. Badanie są również właściwości

mechaniczne, zwłaszcza sztywność i wytrzymałość na obciążenia udarowe

konstruowanych endoprotez przed i po implantacji. W badaniach tych

coraz częściej wykorzystuje się komputerowe techniki numerycznej

symulacji z zastosowaniem Metody Elementów Skończonych (MES).

4. Alloplastyka stawu biodrowego

Endoprotezoplastykę stawu biodrowego stosuje się wtedy, gdy staw

ulega zniszczeniu w wyniku procesów chorobowych (choroba zwyrodnie-

niowa, reumatoidalne zapalenie stawów, dysplazja stawu biodrowego,

jałowa martwica kości udowej) i uniemożliwia funkcjonowanie lub gdy

doszło do złamania szyjki kości udowej [8]. Pogorszenie stanu stawu może

także nastąpić na skutek wielu wrodzonych i nabytych chorób oraz urazów.

Zabieg ten zajmuje z reguły do 2 godzin. Chirurg wykonuje pojedyncze

cięcie (długości 20-30 cm) ponad biodrem i udem. Przecinana jest szyjka

kości udowej, po czym usuwana jest uszkodzona główka stawowa. Aby

przygotować miejsce na wszczepienie endoprotezy stawu biodrowego

wycina się chorą panewkę stawową i na jej miejscu mocuje się protezę

panewki. Następnie opracowuje się jamę szpikową, w sposób


297

umożliwiający dokładne zamocowanie trzpienia protezy, przy pomocy

cementu lub bez niego. Główkę protezy umieszcza się na trzpieniu. Obie

części protezy są następnie łączone ze sobą w celu zbudowania stawu,

tj. rdzeń z zamocowaną do niego główką scalany jest z panewką (rys.3).

Mięśnie zostają zszyte, a rana zamknięta. W stawie umieszcza się dreny

odprowadzające krew, gromadzącą się nad stawem biodrowym [1].

Wymiana stawu naturalnego na sztuczny powoduje likwidację powstałych

zmian patologicznych, skutkiem czego jest wyeliminowanie bólu oraz

odtworzenie naturalnych funkcji biodra.

Rysunek 3. Schemat przebiegu operacji wymiany stawu biodrowego:(1) usunięcie głowy kości

udowej, (2) mocowanie protezy panewki, opracowanie jamy szpikowej, (3) zamocowanie

trzpienia, (4) łączenie komponentów w funkcjonalny przegub [1]

5. Materiały implantacyjne

Materiały implantacyjne stanowią specyficzną grupę materiałów. Ich

cechą charakterystyczną jest kompatybilność i możliwość współpracy

z żywą tkanką. Definicją, która najtrafniej opisuje pojęcie biomateriału, jest

ta, podana na Konferencji Biomateriałów przez National Institute of Health.

Przedstawia ona biomateriał jako „ każdą inną niż lek substancję albo

kombinację substancji syntetycznych lub naturalnych, która może być użyta

w dowolnym okresie, w całości lub części, a której zadaniem jest uzupeł-


298

nienie lub zastąpienie tkanek narządu albo jego części lub spełnianie ich

funkcji” [9].

Biomateriały różnią się składem, budową i właściwościami. Ze względu

na ich zachowanie w kontakcie z tkankami, biomateriały dzieli się na trzy

grupy [10]. Pierwszą grupę stanowią materiały obojętne lub prawie obojętne

– neutralne. Są to substancje, które nie wywołują żadnej znaczącej reakcji

w otaczających je tkankach. Kolejną grupą są materiały aktywne, które

integrują się z tkanką okołowszczepową, stymulują do rozwoju oraz

pobudzają jej regenerację. Trzecią grupę stanowią materiały biodegrado-

walne, które po ściśle określonym czasie działania zostają rozłożone oraz

wchłonięte przez otaczające je tkanki, nie powodując przy tym żadnych

uszkodzeń i zmian patologicznych.

Biomateriał pracuje w zmiennym stanie naprężeń i przemieszczeń oraz w

środowisku reaktywnym. Stosowany jako wszczep, bez względu na

przewidziane dla niego funkcje, musi spełniać szereg wymagań. Biomateriały

o optymalnej biotolerancji nie powodują ostrych lub chronicznych reakcji

organizmu. Oznacza to harmonijną interakcję pomiędzy implantem i tkanką.

Ich zastosowanie poprzedzane jest wieloletnimi testami biozgodności

tkankowej i jeśli wyniki badań są zadowalające, wtedy materiały takie mogą

zostać dopuszczone do zastosowania na implanty [11].

Wymagania stawiane biomateriałom stosowanym w chirurgii kostnej są

wyjątkowo wysokie. Dotyczy to szczególnie materiałów używanych do

produkcji endoprotez stawów, które w trakcie eksploatacji poddawane są

bardzo dużym obciążeniom, zarówno statycznym jak i dynamicznym. Średnie

obciążenia stawu biodrowego u dorosłego człowieka podczas spoczynku

osiągają wartość równą około trzykrotnej jego masie, natomiast w trakcie

biegu wartość ta wzrasta nawet dziesięciokrotnie w stosunku do masy ciała [4].

Twórcą pierwszej endoprotezy stawu biodrowego był Amerykanin, prof. J.

Charnley. Implant zaprojektowano i wykonano w połowie XIX w. i od tamtej

pory jego konstrukcja nie uległa znaczącym zmianom [12]. Na podstawie

doświadczeń i badań klinicznych gromadzonych na przestrzeni wielu lat,

a także na podstawie badań z zakresu biomechaniki oraz biotolerancji,

udoskonalano również skład chemiczny i struktury stopów, które następnie

posłużyły do wytworzenia implantów.

6. Procesy niszczenia materiałów

Poprawnie działający układ immunologiczny bardzo szybko wykryje

w organizmie ciało obce, jakim jest implant. Naturalnym odruchem obronnym

jest reakcja toksykologiczna i immunologiczna. Produkowane są antyciała,

które mają silnie utleniające właściwości. Ich zadaniem jest unieszkodli-

wienie i „pozbycie się” ciała obcego. Antyciała w postaci limfocytów


299

i granulocytów otaczają implant, absorbują do wszczepu i powodują jego

degenerację [1].

Najczęściej występującym problemem, związanym z wykorzystaniem

na implant materiału metalicznego jest korozja. Spowodowane jest to silnie

degradacyjnym i reaktywnym środowiskiem płynów ustrojowych oraz

stałą, wysoką temperaturą i silnie obniżonym pH, które bardzo sprzyjają

rozwojowi korozji. Z klinicznego punktu widzenia pojawienie się korozji

w organizmie może znacznie ograniczyć zdolność do długotrwałej pracy

implantu. Możliwe jest wystąpienie odczynów zapalnych, które ściśle

związane są z uwalnianiem do tkanek okołowszczepowych produktów

zużycia. Stan zapalny równoznaczny jest z pojawieniem się bólu, a jego

długotrwałe utrzymywanie się jest czynnikiem decydującym o usunięciu

wszczepu z ciała [1].

Poprawnie działający układ immunologiczny bardzo szybko wykryje w

organizmie ciało obce, jakim jest implant. Naturalnym odruchem

obronnym jest reakcja toksykologiczna i immunologiczna. Produkowane są

antyciała, które mają silnie utleniające właściwości. Ich zadaniem jest

unieszkodliwienie i „pozbycie się” ciała obcego. Antyciała w postaci

limfocytów i granulocytów otaczają implant, absorbują do wszczepu

i powodują jego degenerację [1].

Najczęściej występującym problemem, związanym z wykorzystaniem

na implant materiału metalicznego jest korozja. Spowodowane jest to silnie

degradacyjnym i reaktywnym środowiskiem płynów ustrojowych oraz

stałą, wysoką temperaturą i silnie obniżonym pH, które bardzo sprzyjają

rozwojowi korozji. Z klinicznego punktu widzenia pojawienie się korozji

w organizmie może znacznie ograniczyć zdolność do długotrwałej pracy

implantu. Możliwe jest wystąpienie odczynów zapalnych, które ściśle

związane są z uwalnianiem do tkanek okołowszczepowych produktów

zużycia. Stan zapalny równoznaczny jest z pojawieniem się bólu, a jego

długotrwałe utrzymywanie się jest czynnikiem decydującym o usunięciu

wszczepu z ciała [1].

6.1. Rodzaje korozji

Ze względu na rodzaje środowiska korozyjnego wyróżnia się dwa jej

typy: chemiczną i elektrochemiczną [13]. W korozji chemicznej istotą

procesu są jednoczesne reakcje utleniania metalu i redukcji utleniacza,

będącego składnikiem środowiska. Z kolei korozja elektrochemiczna

zachodzi w środowisku elektrolitycznym, w którym tworzą się ogniwa

korozyjne. Schemat obrazujący poszczególne typy zniszczeń korozyjnych

przedstawiono na rysunku 4.1., zamieszczonym na końcu podrozdziału.


300

6.1.1. Korozja ogólna (general corrosion)

Jest to korozja stosunkowo najmniej groźna, gdyż polega na równo-

miernym zaatakowaniu całej powierzchni stali nierdzewnej. W wyniku tego

grubość wyrobu stalowego zmniejsza się równomiernie, z jednoczesnym

zmniejszeniem się ogólnej wytrzymałości korodowanego elementu.

Szybkość ubytku grubości nie powinna jednak przekraczać pewnej

praktycznie ustalonej granicy. Dla stali odpornych na korozję jako

dopuszczalny przyjmuje się – dla większości zastosowań – średni roczny

ubytek grubości nie przekraczający 0,1 mm (wyznacza się wg PN-78/H-

04610). Zapobieganie skutkom korozji równomiernej (przez ograniczenie

jej szybkości) polega na: wymianie stali na stal o lepszej odporności na

korozję, zmianie środowiska korozyjnego (zmiana stężenia, temperatury,

prędkości przepływu cieczy, dodanie inhibitora itd.), okresowym

pasywowaniu powierzchni stali [14].

6.1.2. Korozja wżerowa (pitting)

Korozja wżerowa charakteryzuje się punktowym ubytkiem masy stali.

Przebieg procesu tego rodzaju korozji związany jest z działaniem lokalnego

ogniwa. Pitting stali odpornych na korozję występuje najczęściej

w środowiskach wodnych, zawierających jony chloru, bromu, jodu, przy

czym jej intensywność zależy głównie od stężenia tych jonów i temperatury.

Pojawia się przeważnie na wszelkiego rodzaju niejednorodnościach

wewnętrznych metalu (wtrącenia niemetaliczne, wydzielenia, odkształcenia)

i zewnętrznych (krawędzie, zarysowania, wgniecenia, resztki zgorzeliny) [15].

6.1.3. Korozja szczelinowa (cervice corrosion)

Ten typ korozji pojawia się w szczelinach i zagłębieniach konstruk-

cyjnych. Korozja szczelinowa powstaje w wyniku stopniowego zanikania

warstewki pasywnej w szczelinach, w których na skutek utrudnionego

napowietrzenia i zahamowanego dopływu tlenu, warstewka ta nie może się

zregenerować [14]. Wystąpienie korozji szczelinowej prowadzi zazwyczaj

do propagacji pęknięcia i w efekcie uszkodzenia wszczepu. Zapobieganie

temu typowi degradacji materiału polega głównie na właściwym doborze

cech konstrukcyjnych wykonywanych elementów [15].

6.1.4. Korozja galwaniczna – stykowa (galvanic corrosion)

Korozja ta jest wywołana stykiem dwóch metali lub stopów o różnych

potencjałach, zanurzonych w elektrolicie, w którym możliwy jest przepływ

elektronów. Skuteczność działania ogniwa zwiększa się ze wzrostem

różnicy potencjałów stykających się ze sobą dwóch metali w środowisku


301

korozyjnym, np. zawierającym jony chlorkowe. Do korozji galwanicznej

dochodzi również w stopach dwufazowych, w których jedna z faz jest

szlachetniejsza od drugiej. Wytrącenia niemetaliczne w stopach jedno-

fazowych również mogą być czynnikiem powodującym pojawienie się

korozji stykowej. Odporność na korozję stopu jednofazowego o zbliżonym

składzie jest zazwyczaj większa, niż stopu dwufazowego. Do powodów

występowania tego zjawiska zalicza się: różnice w pH, odmienny stopień

chropowatości powierzchni stykowych oraz utwardzenie materiału drogą

wielokrotnego zgniatania [16].

6.1.5. Korozja międzykrystaliczna (intergranular corrosion)

Typ korozji występującej na granicach ziaren. Powstaje w wyniku

istnienia w stopie obszarów o zróżnicowanym składzie chemicznym.

Zróżnicowanie zawartości chromu na granicy ziarna i w jego wnętrzu

prowadzi do wystąpienia korozji międzykrystalicznej. Powstawanie korozji

inicjowane jest wzrostem zawartości węgla oraz spadkiem zawartości

chromu w stali. Stal austenityczna w stanie przesyconym poddawana jest

wygrzewaniu w temperaturze powyżej 500oC, co powoduje powstawanie

węglików (FeCr)23C6 na granicach ziarn, a tym samym zubożenie granic

w chrom. Zjawiska te powodują lokalnie zawartość w materiale

metalicznym pierwiastków stopowych, zwłaszcza chrom oraz tworzenie

mikroogniw korozyjnych, w których katodę stanowi węglik, natomiast

anodę – otaczający metal. Dodatkowo pojawienie się naprężeń w miejscach

tworzenia się nowych faz może niszczyć warstwę pasywną [16].

6.1.6. Korozja cierna (fretting)

Istotą tego procesu jest powstawanie miejscowych ubytków materiału w

elementach, które poddawane są działaniu drgań, niewielkich poślizgów,

ich przemieszczania się pod wpływem cyklicznych obciążeń oraz

intensywnego korozyjnego oddziaływania środowiska [14]. Występowanie

frettingu może znacząco obniżyć wytrzymałość zmęczeniową materiału, co

jest szczególnie niebezpieczne w przypadku zastosowania implantacyjnego.

Z frettingiem wiąże się emisja znacznej ilości produktów korozji do tkanek

otaczających wszczep [13]. Może to być indykatorem do powstania

pęknięć na powierzchni wszczepu, a w konsekwencji prowadzić do jego

uszkodzenia.

6.1.7. Korozja naprężeniowa (stress corrosion)

Korozja naprężeniowa pojawia się tylko wtedy, gdy stal podatna na ten

typ korozji, poddawana naprężeniom wewnętrznym lub zewnętrznym, jest

narażona na działanie środowisk korozyjnie agresywnych, które wywołują


302

ten typ korozji. Im większe są te naprężenia i im bardziej agresywne

środowisko otaczające implant, tym szybciej dojdzie do zużycia produktu.

Pękanie naprężeniowe wywołane jest głównie naprężeniami w makroskali,

występującymi w całej objętości materiału. Naprężenia zginające, rozcią-

gające i ściskające wpływają na obniżenie odporności materiału na korozję

w wyniku obniżania stabilności termodynamicznej metalu i naruszenia

ciągłości warstwy pasywnej, jednak nie powodują one zlokalizowanych

pęknięć materiału. Pęknięcia wynikające z korozji naprężeniowej rozwijają

się po granicach ziaren oraz śródkrystalicznie [17].

6.1.8. Korozja wodorowa (hydrogen damage)

Pod wpływem naprężeń występujących w materiale tworzy się

płaszczyzna poślizgu. Wynikiem poślizgu jest depasywacja powierzchni,

prowadząca do reakcji anodowych, które są przyczyną powstawania

wakansu i w efekcie absorpcji atomów wodoru. Na powierzchni powsta-

łego pęknięcia obserwuje się dwa obszary: zmiękczony i utwardzony.

Współpraca tych dwóch obszarów prowadzi do lokalnego wzrostu naprężeń.

Zaabsorbowany wodór powoduje spadek energii kohezji pomiędzy

płaszczyznami. Zmniejszenie tej energii oraz lokalne spiętrzenie naprężeń

prowadzi do łatwej propagacji pęknięcia [17].

6.2. Pękanie materiału (corrosion fatigue)

Wśród najistotniejszych czynników powodujących przedwczesne

zniszczenie materiałów wymienić należy: nieprawidłowo zrealizowaną

obróbkę cieplną, ukryte wady materiałowe, nieodpowiednią konstrukcję

implantu, niedopasowaną do warunków obciążeń, nieprawidłowe zamoco-

wanie lub eksploatację. Możemy wyróżnić trzy rodzaje pękania mate-

riałów: doraźne, będące wynikiem utraty spójności, zmęczeniowe oraz

będące następstwem działania na materiał wysokiej temperatury i znacz-

nych obciążeń – pełzanie.

Oprócz powyższego podziału rodzaje pęknięć materiału można sklasy-

fikować jako: ciągliwe, kruche oraz będące wynikiem utraty spójności.

Pękanie ciągliwe, inaczej rozdzielcze powstaje wtedy, kiedy na materiał

działają obciążenia wywołujące nagłe przeciążenia plastyczne [18].

Na silnie rozwiniętej powierzchni przełomu widoczne są pustki

wypełnione wydzieleniami lub zanieczyszczeniami w postaci sferycznych

cząstek. Jeżeli większość cząstek, na których tworzą się pustki znajduje się

na granicach ziarn, to pękanie zachodzi po granicach ziarn i jest nazywane

międzykrystalicznym, jeżeli natomiast rozmieszczenie cząstek jest

względnie równomierne, to pękanie zachodzi przez ziarna i jest nazywane

transkrystalicznym. Kruche cząstki innej fazy w ciągliwej osnowie nie są


303

w stanie zaakomodować dużych odkształceń plastycznych osnowy. Dlatego

nawet niewielkie odkształcenia plastyczne osnowy, będące wynikiem

dyslokacji oraz sił zewnętrznych osiąga wartość wystarczającą do

spowodowania pękania cząstek. Podczas pękania ciągliwego wytrzymałość

na rozciąganie jest mniejsza niż naprężenia konieczne do

rozprzestrzeniania się pęknięcia, dlatego próbka odkształca się najpierw

równomiernie, a następnie tworzy się szyjka. Dalsze odkształcenie oraz

łączenie się pustek jest ograniczone do obszaru szyjki. Końcowe

rozdzielenie materiału uzyskuje się przez ścięcie lub niekiedy przez

przewężenie się pierścienia otaczającego pęknięcie [18].

Pękanie zmęczeniowe materiału jest procesem pokrewnym do korozji

naprężeniowej. Występuje, gdy materiał jest pod wpływem cyklicznych lub

zmiennych naprężeń, które nie przekraczają granicy plastyczności materiału.

Oddziaływanie tych naprężeń powoduje naruszenie powierzchniowej warstwy

pasywnej i odsłonięcie metalu [Ratajczak, 2005]. W przeciwieństwie do

korozji naprężeniowej, korozja zmęczeniowa w stali austenitycznej może

pojawić się w dowolnym środowisku, począwszy od pary wodnej, poprzez

wodę, do roztworów chemicznych. Tworzące się wżery i szczeliny mogą

stać się zarodkami pęknięć. Wskutek dalszego działania naprężeń

rozciągających oraz środowiska korozyjnego dochodzi do propagacji

pęknięć śródkrystalicznych oraz po granicach ziaren, mających charakter

pękania kruchego.

Zasadniczy wpływ na odporność na ten typ niszczenia materiału

metalicznego mają: wytrzymałość materiału na rozciąganie, wielkość

ziaren oraz obecność składników stopowych, których zadaniem jest

polepszenie pasywności stali. Podstawową rolę zmian w mikrostrukturze

przypisuje się naprężeniom będącym skutkiem odkształceń sprężystych

sieci krystalicznej na skutek wzrostu gęstości dyslokacji. W początkowej

fazie występują lokalne odkształcenia plastyczne, których oznaką są pasma

poślizgów. W obszarach, w których na skutek poślizgu gęstość dyslokacji

przekroczy wartość krytyczną, pojawiają się mikropęknięcia. Również

zmiany naprężeń, prowadzące do zmiany plastyczności materiału i jego

lokalnego utwardzenia, mogą stać się przyczyną wystąpienia mikropęknięć.

Przy dalszym cyklicznym obciążeniu zwiększa się powierzchni pęknięcia,

co prowadzi do lokalnego zniszczenia [19].

Pękanie zmęczeniowe materiału przebiega w trzech etapach. Pierwszym

etapem jest tworzenie się zarodka, a więc inicjacja powstania ogniska

zmęczeniowego. Następnie dochodzi do propagacji pęknięcia i tworzenia

się prążków zmęczeniowych, a ostatnim etapem jest pękanie doraźne

z typowym złomem ciągliwym.

Wygląd przełomu zależy od rodzaju i wielkości obciążeń zmęcze-

niowych, jakie spowodowały zniszczenie. Dzięki tej zależności można


304

odtworzyć charakter obciążeń oraz ustalić położenie ogniska pęknięcia. Dla

większości metali można wyróżnić dwie odmienne strefy, które odpowia-

dają dwóm następującym po sobie etapom niszczenia materiału: strefę

zniszczenia zmęczeniowego oraz strefę zniszczenia doraźnego (rys. 4)

[20‚21].

Rysunek 4. Charakterystyczny przełom zmęczeniowy [19]

Strefa zniszczenia zmęczeniowego ma wygładzoną powierzchnię, często o

kształtach muszlowych, z widocznymi niekiedy liniami frontu, świadczącymi

o nierównomiernym, skokowym pogłębianiu się szczeliny. Im mniejsza jest ta

strefa, w porównaniu ze strefą pęknięcia doraźnego, tym większa jest wartość

naprężenia zmęczeniowego. Duże pole powierzchni strefy pęknięcia

zmęczeniowego świadczy o działaniu małych naprężeń i małych prędkościach

rozprzestrzeniania się pęknięcia. Natomiast strefa zniszczenia doraźnego (tzw.

strefa resztkowa lub doraźna) ma powierzchnię wizualnie bardziej

gruboziarnistą i powstaje nagle w ostatnim okresie pracy elementu. W okolicy

przełomu brak jest widocznych odkształceń plastycznych, a więc ma on

charakter przełomu kruchego [18‚20].

Ostatni typ zniszczenia materiału dotyczy utraty spójności Charak-

terystyczne jest tutaj nieznaczne lub w ogóle nie występujące odkształcenie

plastyczne. Pęknięcie przebiega jedynie wzdłuż granic ziarn. Powodem

zaistnienia utraty spójności jest osłabienie wytrzymałości granic ziarn spowo-

dowane obecnością zanieczyszczeń, wtrąceń i segregacją pierwiastków [19].

7. Podsumowanie

Implanty stosowane w chirurgii kostnej powinny wykazywać dużą

trwałość w środowisku biologicznym, co w praktyce nie zawsze jest

spełnione. Przyczyną niepowodzenia może być zarówno źle zaplanowana

i zrealizowana procedura wszczepienia implantu, jak też aspekty bio-


305

mechaniczne: wady materiałowe, brak biozgodności pomiędzy implantem

i strukturą kości, niewłaściwe dobranie charakterystyki odkształceniowe

implantu i kości, a także niewłaściwe zaprojektowanie części składowych

w przypadku endoprotez. Ponadto implanty stosowane w leczeniu opera-

cyjnym powinny być uniwersalne, posiadać różne możliwości korekcyjne

i wykazywać jak najmniejszy zakres obróbki mechanicznej podczas

zabiegu. Dlatego do uzyskania nowych w pełni funkcjonalnych bio-

materiałów i technologii dla medycyny, konieczna staje się zastosowanie

nowoczesnego oprogramowania inżynierskiego, opartego na metodzie

elementów skończonych (MES), które wprowadziło ogromny postęp w

zakresie modelowania układów biologicznych [22]. Takie badania są

ukierunkowane głównie na optymalizację konstrukcji implantów, ale też

zastosowanie nowych materiałów.

Decydujący wpływ na długotrwałą bifunkcyjność sztucznego stawu

biodrowego ma relacja sztywności trzpienia endoprotezy do sztywności

kości. Prowadzonych jest wiele prac z zastosowaniem obliczeń

numerycznych, których celem jest dopasowanie sztywności implantu do

sztywności otaczającej go struktury kostnej poprzez optymalizację kształtu

endoprotezy i odpowiednie rozwiązania materiałowe. W tym celu buduje

się specjalne trójwymiarowe modele układu kość – endoproteza i prowadza

się obliczenia przy zastosowaniu różnych parametrów wytrzyma-

łościowych. Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że

głównym czynnikiem wpływającym na procesy adaptacyjne zachodzące

w kości i długotrwałe zamocowanie implantu endoprotezy stawu

biodrowego, główny wpływ wywiera konstrukcja endoprotezy [3].

Praca zrealizowana przy wsparciu finansowym Wydziału Mecha-

nicznego Politechniki Białostockiej w ramach projektu „Rozwój młodych

naukowców i uczestników studiów doktoranckich‖ nr MB/WM/14/2014.

Literatura

1. Ackrermann K., Implantologia, Urban&Partner, (2004), s. 15-29

2. Korzyński M, Cwanek J., Procesy zużycia w stawie biodrowym, Zbiór prac

seminarium naukowego Mechanika w Medycynie 1, (1993), s. 15-18

3. Buśkiewicz J., Podstawy konstrukcji w protetyce, Akademicka Oficyna

Wydawnicza, AGH, (2008), s. 14-21

4. Bernakiewicz M., Będziński R., Analiza stanu naprężeń kości udowej

w ekstremalnych warunkach obciążeń, Zeszyty Nukowe Konferencji

Mechaniki Stosowanej, (1999), s. 33-38

5. Będziński R., Ścigała K., Biomechanika stawu biodrowego i kolanowego.

Tom 5 Biocybernetyka i inżynieria rehabilitacyjna, Akademicka Oficyna

Wydawnicza Exit, (2004), s. 34-54

6. Maquet P. G. J., Biomechanics of the hip, (1985), s. 16-18


306

7. Kapandji A., Physiology of the Joints: Lower Limb v. 2: Annotated Diagrams

of the Mechanics of the Human Joints, Lincoln, LIN, (1997), s. 111-124

8. Przeździak B., Zastosowanie kliniczne protez, ortoz i środków pomocniczych,

Via Medica, vol.40, (2008), s.17-24

9. Gierzyńska- Dolna M., Biotribologia, Wydawnictwo Politechniki

Częstochowskiej, (2002), s.32-32

10. Żurek- Świeczko B., Biomateriały, Wydawnictwo Politechniki Gdańskiej,

(2009), s. 1-14

11. Nowacki L., Gustavo F., Biomateriały w konstrukcji implantów, Open Access

Library vol. 11, (2012), s. 13-42

12. Brooks S., Fracture of fully hydroxyapatite-coated titanium femoral stem

of a total hip replacement – a report of 3 cases, Acta Orthop Scand;

75 no. 6, (2004), s. 768-771

13. Costa I., Terada M., Microstructure and intergranular corrosion of the

austenitic stainless steel, Journal of Nuclear Materials, (2006), s. 40-46

14. Surowska B., Wybrane zagadnienia z korozji i ochrony przed korozją,

Politechnika Lubelska, (2002), s. 20-32

15. Blicharski M., Wstęp do inżynierii materiałowej, Wydawnictwa Naukowo-

Techniczne, (2009), s. 428-446

16. House K., Sernetz F., Dymock D., Sandy J. R., Ireland A. J., Corrosion

of orthodontic appliances, American Journal of Orthodontics & Dentofacial

Orthopedics, (2008), s. 584-595

17. Upadhyay D., Panchal M. A., Dubey R. S., Srivastava V. K., Corrosion

of alloys used in dentistry: A review, Materials Science & Engineering, (2008),

s. 1-15

18. Kowalewski L., Zmęczenie materiałów – podstawy, kierunki badań, ocena

stanu uszkodzenia, Siedemnaste seminarium Nieniszczące Badania

Materiałów, (2011)

19. Ratajczak J., Badanie metali na zmęczenie, Politechnika Szczecińska, (2005),

s.12-15

20. Prowans S., Metaloznawstwo, WNT, (1992), s. 34-45

21. Przybyłowicz K., Metaloznawstwo, WNT, (1997), s. 100-156

22. Madej T., Modelowanie strefy ruchowej endoprotezy stawu biodrowego

w aspekcie biomateriałów, AGH, (2008), s. 29-43


307

Wieloaspektowa analiza problematyki związanej z mechanizmami

niszczenia implantów

Przyczyn szybkiego zużywania się stawów, zarówno naturalnych, jak i sztucznych, jest kilka,

m.in. aktywny tryb życia, wzrost liczby urazów, w tym wypadków komunikacyjnych i kontuzji

przy uprawianiu sportu, często również nadwaga. Średnia wieku pacjentów poddawanych

operacji endoprotezoplastyki stawu biodrowego z każdym rokiem spada, natomiast liczba

wykonanych operacji systematycznie rośnie. Lekarze ostrzegają przed przeprowadzania

endoprotezoplastyki u młodych ludzi przez wzgląd na ograniczoną trwałość protez, niestety

– coraz częściej zdarza się, że po kilkunastu latach od operacji stan endoprotezy wymaga jej

reimplantacji. W efekcie obok kolejki osób oczekujących na protezoplastykę pierwotną, tworzy

się druga kolejka czekających na realloplastykę. Mimo to, chorzy bardzo często decydują się na

wymianę stawu, bowiem taki zabieg oznacza dla nich powrót do życia pozbawionego

dolegliwości bólowych. Powszechnie stosowane do wytwarzania implantów materiały

metaliczne, pomimo wielu zalet, posiadają szereg niekorzystnych cech. Metale o bardzo dobrych

właściwościach mechanicznych są zbyt sztywne w stosunku do kości, jak również ulegają korozji

w agresywnym środowisku biologicznym. Działanie na implanty naprężeń mechanicznych

i obecność płynów ustrojowych, może przyspieszać ich degradację, zmniejszyć stabilność

i trwałość. Jednym z najczęściej stosowanych biomateriałów metalicznych jest stal

X2CrNiMo17-12-2 (316 L). Implanty wykonywane z tej stali zaliczane są do grupy wszczepów

krótkotrwałych. Powinno to wykluczyć stosowanie stali 316 L na endoprotezy stawu

biodrowego, które z założenia są wszczepami długookresowymi, jednak częstość stosowania

implantów wykonanych z tej stali nie maleje, mimo obecności na rynku trwalszych materiałów.

The multifaceted analysis of issues related to the mechanisms

of implants destruction

There are several reasons for the rapid wear of the joints, both natural and man-made, including

active lifestyle, increase in the number of injuries, traffic accidents and injuries during sport, often

overweight. The average age of patients undergoing hip replacement surgery each year is falling,

while the number of operations is steadily growing. Doctors warn against carrying arthroplasty in

young people for the sake of the limited durability of prostheses, unfortunately – more often it

happens that after several years of transactions, the prosthesis requires its reimplantation. As

a result, next to the queue of people waiting for THR primary forms a second queue waiting for

realloplasty. Despite this, patients often decide to exchange the pond, because such treatment is

for them to return to a life without pain. Commonly used implant materials for the production of

metal, in spite of many advantages, have a number of disadvantages. Metals with very good

mechanical properties are too stiff relative to the bone, as well as corrode in an aggressive

biological environment. The effect on implants mechanical stress and the presence of body fluids,

may accelerate their degradation, reduce stability and durability. One of the most common

biomaterials metal is stainless X2CrNiMo17-12-2 (316 L). Implants made of this steel are among

the short-term implants. This should exclude the use of stainless 316 L hip replacement, which by

definition are long-term implants, but the frequency of the use of implants made from this steel is

not decreasing, despite the presence of more durable materials on the market.

308


Przyczyny mechanicznego niszczenia implantów

wytwarzanych tradycyjnymi technologiami

1. Wstęp

Połączenia stawowe przyrównuje się do łożysk ślizgowych. Mecha-

nizmy zużycia, zarówno w naturalnym stawie jak i w łożysku mecha-

nicznym, są podobne. Wyróżniamy [1‚2]:

zużycie adhezyjne, występujące w miejscach najbardziej obciążonych

oraz na wierzchołkach nierówności chrząstki stawowej;

zużycie ścierne, będące skutkiem oddziaływania fragmentów chrząstki

stawowej oderwanych od podłoża, znajdujących się w mazi stawowej;

zużycia zmęczeniowe – pod wpływem zmiennych obciążeń ciecz

synowialna wtłaczana jest do mikroszczelin, skutkiem czego jest

rozklinowanie naturalnych, bądź pourazowych mikroszczelin

występujących w chrząstce stawowej;

zużycie przez zwłóknienie chrząstki stawowej, opisywane jest jako

proces, w którym w mazi stawowej pojawiają się cienkie włókna.

Jeśli w naturalnym stawie biodrowym dochodzi do procesów choro-

bowych, to degradacja chrząstki stawowej przebiega intensywniej. Orga-

nizm nie ma czasu, aby naprawić uszkodzone tkanki. Przyjmuje się, że

w zdrowym stawie biodrowym współczynnik tarcia jest rzędu 0,0025-0,0030,

natomiast grubość warstwy smarującej jest rzędu 50*10-6 m [3]. W przy-

padku stawu, w którym przebiegi procesów zużycia są zaawansowane,

współczynnik tarcia jest dziesięciokrotnie większy, grubość warstwy

smarującej znacząco maleje, a nawet zanika [4].

Jako jedną z przyczyn niepowodzeń alloplastyki stawu biodrowego

wymienia się zużycie ścierne elementów endoprotez, w wyniku którego do

organizmu człowieka dostają się drobiny polietylenu i metali [3]. Produkty

tarcia znajdujące się w strefie kontaktu metalu z polietylenem mogą

wywoływać zwiększone zużycie ślizgowych elementów endoprotezy

i powodować wzrost ilości produktów ścierania. Proces zużycia endo-

protezy przebiega tym intensywniej, im większe jest obciążenie, działające

na sztuczny staw biodrowy (ciężar i aktywność ruchowa pacjenta).

1 [email protected], Katedra Inżynierii Materiałowej i Biomedycznej,

Wydział Mechaniczny, Politechnika Białostocka

Przyczyny mechanicznego niszczenia implantów wytwarzanych tradycyjnymi technologiami

309

Z czasem, w skrajnych przypadkach, nadmierne zużycie może doprowadzić

do ponownej dysfunkcji i konieczności reimplantacji [1‚4].

Drobiny polietylenu i metali uwalniające się w wyniku ścierania

przedostają się z płynem tkankowym do przestrzeni okołostawowej,

zaburzając zachodzące tam procesy biologiczne. Ciągłe drażnienie

okolicznych tkanek przez produkty zużycia wywołuje reakcję obronną ze

strony organizmu, który stara się pozbyć obcego dla niego ciała na drodze

fagocytozy. Wokół produktów zużycia pojawiają się makrofagi i fibro-

blasty, i dochodzi do uaktywnienia osteoklastów, odpowiedzialnych za

osteolizę tkanki kostnej. W efekcie prowadzi to do resorpcji kości

w otoczeniu endoprotezy i jej obluzowania. W rejonie panewki proces ten

rozpoczyna się od jej krawędzi bocznej i postępuje wzdłuż sklepienia [5].

Mechaniczna stabilność implantu określona jest przez stopień

zaawansowania resorpcji i tworzenia pomiędzy cementem i tkanką kostną

odczynowej błony łącznotkankowej, która z czasem może stanowić

warstwę przejściową. Część produktów zużycia może wędrować z płynem

tkankowym, wywoływać resorpcję kości i doprowadzić do obluzowania

endoprotezy daleko poza miejscem jej uszkodzenia. Pozostała część może

zostać przetransportowana poprzez naczynia limfatyczne do organizmu

człowieka [1, 6].

Dominującą rolę w obluzowaniu trzpieni endoprotez odgrywają

czynniki biomechaniczne. Struktura tkanki kostnej dostosowuje się do

istniejącego stanu naprężeń. W fizjologicznym stawie biodrowym

obciążenia są przenoszone przez miednicę na kość udową. Implantacja

endoprotezy zmienia istniejący stan naprężeń, dochodzi do odciążenia

okolicy krętarza i przenoszenia obciążeń przez tkankę kostną wokół

dalszego odcinka trzpienia [7].

2. Mechanizm zmęczeniowego pękania trzpieni

Cykliczne obciążanie i odciążanie elementu powoduje zmęczenie

materiału. Zmiany naprężeń prowadzą do zmiany plastyczności materiału

oraz do lokalnego utwardzenia, co w konsekwencji może stać się przyczyną

wystąpienia mikropęknięć. Zainicjowanie pęknięcia a następnie jego

rozrost powoduje, że zmniejsza się powierzchnia, która efektywnie

przenosi obciążenia [8].

Alloplastyka, tak jak wszystkie zabiegi i ingerencje chirurgiczne,

obarczona jest pewnym prawdopodobieństwem pojawienia się komplikacji

i powikłań. Jednym z nich jest dość rzadko występujące złamanie

izolowane (bez naruszenia ciągłości tkanki kostnej). Prawdopodobieństwo

wystąpienia złamania izolowanego trzpienia endoprotezy stawu biodro-

wego wynosi 0,27% [8‚10]. Z dostępnego piśmiennictwa wynika, że


310

najczęstszym powodem zgłaszania się chorych do ortopedy są dolegliwości

bólowe, zlokalizowane w okolicy biodra i/lub bliższej części uda po stronie

operowanej. Niektórzy chorzy skarżą się na uczucie przeskakiwania

w stawie biodrowym. Większość autorów zgadza się, iż wpływ na

wystąpienie omawianego powikłania ma wiele, często nakładających się na

siebie czynników [10‚11].

Pierwsze doniesienie na temat złamania trzpienia endoprotezy można

spotkać w literaturze specjalistycznej z roku 1977. Carlsson opisał 14

przypadków złamań trzpienia endoprotezy Charnleya. Według niego

czynnikiem prowadzącym do złamania implantu była błędna technika

operacyjna. Murray oraz Yates, na podstawie analizy 14 przypadków

złamania trzpieni endoprotezy stawu biodrowego doszli do podobnych

wniosków, jednak jako nadrzędny czynniki ryzyka wystąpienia powikłania

w postaci złamania trzpienia autorzy wskazali na wysoki wskaźnik masy

ciała pacjenta – BMI (Body Mass Index) oraz błędy techniki operacyjnej.

Harvie i Jarvi, niezależnie od siebie opisali przypadki złamania trzpieni,

w których analiza metalurgiczna wykazała wady odlewnicze i materiałowe

[12]. Większość opisanych przez autorów trzpieni wykonanych było ze

stali austenitycznej. Znamienny jest fakt, że znaczna część z opisanych

trzpieni uległa zniszczeniu w czasie krótszym niż 10 lat od przepro-

wadzenia endoprotezoplastyki.

3. Kliniczne przypadki złamań trzpienia

Alloplastyka, tak jak wszystkie zabiegi i ingerencje chirurgiczne,

obarczona jest pewnym prawdopodobieństwem pojawienia się komplikacji

i powikłań [13‚16]. Jednym z nich jest złamanie izolowane (bez naruszenia

ciągłości tkanki kostnej). Etiologia złamania jest wieloczynnikowa.

Wyróżnia się trzy kategorie: kliniczną, techniczną i materiałową [17].

W kategorii klinicznej złamanie skorelowane jest z wiekiem, wagą,

wzrostem pacjenta, jakością kośćca i poziomem aktywności fizycznej

[17‚19]. W kategorii technicznej możliwość wystąpienia złamania

trzpienia zależna jest od poprawnego doboru techniki operacyjnej, sposobu

mocowania, jakości i ilości cementu kostnego i innych czynników [17‚19].

Z doniesień literaturowych wynika, że częściej dochodzi do złamań trzpieni

endoprotez mocowanych za pomocą cementu kostnego, w porównaniu do

metody bezcementowej. Zbyt rzadka lub zbyt gęsta konsystencja, zbyt mała

ilość, nieprawidłowe wymieszanie lub nieodpowiednie rozłożenie warstwy

kleju kostnego może skutkować przedwczesnym złamaniem trzpienia. Do

kategorii materiałowej zalicza się konstrukcję, rodzaj i jakość materiał.

Nieodpowiednia konstrukcja trzpienia jest przyczyną niekorzystnego

rozkładu naprężeń, które w konsekwencji mogą prowadzić do nadmiernego


311

przeciążenia materiału i jego przedwczesnego zniszczenia. Ponadto, wszelkie

nieciągłości i niejednorodność struktury (pod względem fazowym, składu

chemicznego czy wielości ziarn), powodują zdecydowane obniżenie

właściwości wytrzymałościowych stosowanych implantów.

Z informacji podanych przez Amerykańskie Towarzystwo Chirurgów

Biodra i Kolana wynika, że prawdopodobieństwo wystąpienia złamania

izolowanego trzpienia endoprotezy stawu biodrowego wynosi 0,27%

[14‚15, 20]. Jednak z badań przeprowadzonych przez Martensa [13]

wynika, że procentowy wskaźnik złamań izolowanych w całkowitej liczbie

niepowodzeń obserwowanych w alloplastyce stawu biodrowego, jest nawet

o dwa rzędy wielkości większa i wynosi 11%. Złamania tego typu

odnotowano przy implantach wykonanych z różnych materiałów, o różnej

geometrii i różnym sposobie mocowania [13‚15]

Doniesienie dotyczące złamania trzpienia endoprotezy znaleźć możnaw

literaturze specjalistycznej, pochodzącej z roku 1977 [10, 13]. Carlsson

[21] opisał czternaście przypadków złamań trzpienia endoprotezy

Charnleya. Według tego autora, czynnikiem prowadzącym do złamania

implantu była błędna technika operacyjna. Murray [22], na podstawie

analizy czternastu przypadków złamania trzpieni endoprotezy stawu

biodrowego doszedł do podobnych wniosków, jednak jako nadrzędny

czynniki ryzyka wystąpienia powikłania w postaci złamania trzpienia

wskazał na wysoki wskaźnik masy ciała pacjenta – BMI (Body Mass Index)

oraz błędy techniki operacyjnej. Na uwagę zasługuje fakt, że większość

odnotowanych przypadków złamań izolowanych dotyczy trzpieni

wykonanych ze stali austenitycznej. Ponadto, znamienny jest fakt, że 60%

z opisanych trzpieni uległa zniszczeniu w czasie krótszym niż 10 lat od

przeprowadzenia endoprotezoplastyki.

Jednym z przykładów złamania izolowanego jest przypadek opisany

przez A. Kotela, przedstawiający złamania trzpienia endoprotezy stawu

biodrowego typu Wellera (rys.1), zaimplantowanej 22 lata wcześniej

z powodu wystąpienia zaawansowanych zmian zwyrodnieniowych.

Złamanie nastąpiło w połowie długości trzpienia [16].


312

Rysunek 1. Zdjęcie rentgenowskie obrazujące złamanie, a) zdjęcie rentgenowskie, b) zdjęcie

po ekstrakcji z kości [16]

Kolejne 2 przykłady złamań trzpieni endoprotez opisują Drobniewski i Synder [10]. Jako pierwszy opisano przypadek 45-cio letniej kobiety z wrodzoną dysplazją stawów biodrowych, u której w 24 lata po wszczepieniu endoprotezy Mittlemeiera stwierdzono złamanie trzpienia w połowie długości endoprotezy. Endoprotezę tego samego typu wszcze-piono również 32- letniej kobiecie, która podobnie jak poprzednia pacjentka, cierpiała na dysplazję stawu biodrowego. 10 lat po zaimplan-towaniu endoprotezy u pacjentki stwierdzono złamanie trzpienia w dolnej jego części, poniżej 2/3 jego długości. W obu przypadkach nie podano przyczyn uszkodzenia, jednak przeprowadzony wywiad lekarski wykluczył jako przyczynę złamania uraz zewnętrzny [10].

Ciekawym przypadkiem jest historia 66-letniej kobiety, która zgłosiła się do szpitala z bólem w stawie biodrowym. Badanie rentgenowskie ujawniło złamanie trzpienia endoprotezy (DePuy, wykonanego ze stopu Co-Cr) w połowie jego długości. Jako powód uszkodzenia wskazano niekorzystny rozkład warstwy cementu kostnego. Nieodpowiednie zamoco-wanie trzpienia w kanale szpikowym spowodowało mikroruchy, które przyczyniły się do wykruszania kleju kostnego oraz do powstania pustej przestrzeni między kością a implantem. Ta pusta przestrzeń spowodowała, że spotęgowane zostały wartości pionowych obciążeń, działających na trzpień. Doprowadziło to do tego, że materiał uległ zniszczeniu na skutek zmęczenia materiału [23].


313

Brooks (2004) opisał 3 przypadki złamania trzpieni endoprotez pokry-tych warstwą hydroksyapatytu. We wszystkich przypadkach pęknięcie nastąpiło w połowie długości trzpienia. Uzasadnione zostało to przez autora nieprawidłową geometrią i kształtem endoprotezy (rys.2) Dodatkowo jeden z trzpieni poddano analizie metalograficznej (rys.3) za pomocą mikroskopu elektronowego. Analiza ta ujawniła, że uszkodzenie rdzenia spowodowane było działaniem mechanizmów zmęczeniowych. W miejscu inicjacji autor artykułu zaobserwował wiele rys, pęknięć i drobnych prążków zmęcze-niowych. Powierzchnia przełomu charakteryzowała się niską deformacją plastyczną materiału, co dodatkowo potwierdza tezę o kruchym złamaniu zmęczeniowym [15].

Kolejny przypadek złamania izolowanego trzpienia endoprotezy został opisany przez Prendergasta (2002) z Departamentu Chirurgii Ortope-dycznej Akademickiego Szpitala w Rotterdamie. U pacjentki, lat 52, zdiagnozowano złamanie trzpienia endoprotezy Exter, wprowadzonego do organizmu zaledwie 3 lata wcześniej [24].

Złamanie trzpienia nastąpiło na wysokości 9 cm od jego dolnego końca. Do analizy powierzchni przełomu użyto mikroskopu skaningowego. Jako miejsce inicjacji pęknięcia wyznaczono przednio-boczną krawędź trzonu. Na taką identyfikację pozwoliły, przede wszystkim, bardzo widoczne prążki zmęczeniowe, znajdujące się na powierzchni pęknięcia, wskazujące jednoznacznie na zniszczenie zmęczeniowe powstałe na skutek cyklicznych naprężeń (rys.4). Brak podparcia w części przednio-bocznej mógł być czynnikiem przyczyniającym się do wzrostu naprężeń rozciągających.

Rysunek 2. Zdjęcia obrazujące złamanie, a) zdjęcie rentgenowskie, b) zdjęcie po ekstrakcji

z kości [9]


314

Rysunek 3. Zdjęcia przełomów wykonane przy użyciu wysokiej rozdzielczości SEM,

a) powierzchnia przełomu w centralnej części trzpienia z widocznymi prążkami i szczelinami,

b) powierzchnia na obrzeżach przełomu [9]

Wydłużone ramię momentu siły wywierało nacisk na smukłą część

dystalną protezy. Taki mechanizm pękania trzpieni został opisany w roku

1995 przez Rokkuma – na przykładzie matowych trzpieni typu Exter, przy

czym wykluczono istnienie jakichkolwiek wad materiałowych i produk-

cyjnych. Połączenie dużego momentu działającego na przekrój o niewiel-

kiej powierzchni może być więc powodem gromadzenia się dużych

obciążeń zmęczeniowych stymulujących pękanie trzpienia [24].

Jak podaje źródło, przez 13 lat obserwacji gładko polerowanych trzpieni

wykonanych ze stali 316L, zniszczeniu w postaci pęknięcia lub złamania

izolowanego, uległo tylko 8 z 426 wszczepionych implantów. W roku 1976

zmieniono geometrię trzpienia oraz jego grubość, a powierzchnię z polero-

wanej zmieniono na wykończenie matowe. Wskaźnik złamań matowego

trzpienia Exter w roku 1996 wyznaczono na 0,2 %, jednak okazało się, że

trzpienie te w znacznej większości ulegały obluzowaniu w kanale

szpikowym [24].

Wilson w swoim artykule opisał siedem przypadków złamań trzpieni

endoprotez kołnierzowych, z których dwie mocowane były za pomocą

cementu kostnego, pozostałe – na wcisk (rys.5). W przypadku sześciu

z opisywanych trzpieni złamanie miało miejsce na wysokości 1/3

proksymalnej części trzpienia, natomiast złamanie siódmego trzpienia

złamanie nastąpiło 20 mm od kołnierza. Zdaniem autora powodem

pęknięcia trzpieni, w każdym z tych przypadków, były wady konstruk-

cyjne. Średni czas pomiędzy wszczepieniem implant, a zdiagnozowaniem

złamania wynosił 41 miesięcy [25].


315

Rysunek 4. Zdjęcie SEM obrazujące przełom przy różnym powiększeniu: a) 400 x i b) 100 x [24]

Carlson, Stenport i Gentz [21] opisali 14 przypadków złamań trzpieni

endoprotez mocowanych za pomocą cementu kostnego po operacjach

endoprotezoplastyki przeprowadzonych w General Hospital w Malmo.

Wszystkie te implanty wykonane były ze stali 316L technologią kucia

i pochodziły z tej samej fabryki. Średni czas pomiędzy wszczepieniem

implantu a zdiagnozowaniem złamania wynosił 40 miesięcy, przy czym

jedno nastąpiło już po 14 miesiącach od wszczepienia endoprotezy.

Rysunek 5. Zdjęcia obrazujące dwa różne miejsca złamania, a) przy kołnierzu, b) w miejscy

zwężenia [25]

Badania radiologiczne wykazały, że złamania nastąpiły w odległości 61-

100 mm od koniuszka trzpienia. Jako powód złamania trzpieni autorzy

sugerują złe zamocowanie w kanale szpikowym poprzez niedokładne

naniesienie cementu kostnego, co z kolei spowodowało poluzowanie

endoprotezy i wykruszania się kleju kostnego. Skutkiem tego jest znaczący

wzrost naprężeń panujących w trzpieniu, co może prowadzić do korozji,


316

złamania zmęczeniowego lub do kombinacji tych czynników, co – według

autorów, przy odpowiednio zamocowanej endoprotezie nie powinno się

wydarzyć [21].

Wróblewski w swoim artykule opisuje badanie siedemdziesięciu

trzpieni wykonanych ze stali 316 L. Jako przyczynę pęknięcia trzpieni

wskazuje on na znaczne obciążenia skręcające wynikające z nieodpo-

wiedniej konstrukcji trzpienia. Jako miejsce inicjacji pęknięcia autor

wskazuje na przednio – boczną krawędź trzpienia i popiera swoją teorię

fotografiami przełomów, na których widoczne są prążki zmęczeniowe.

Pęknięcie trzpienia zainicjowane zostało w miejscu największych naprężeń

i rozciągnęło się do góry, do tyłu i przyśrodkowo [18].

W innym artykule ten sam autor dokonuje analizy 120 przypadków

złamań trzpieni Charnley’a wykonanych ze stali 316L [26]. Większość

złamań odnotowano po 11 latach od przeprowadzenia endoprotezoplastyki

na grupie 115 pacjentów. Jedynie w ośmiu przypadkach złamanie nastąpiło

po ok. 2 latach i spowodowane było czynnikami zewnętrznymi, np.

upadkiem pacjenta. Wszystkie endoprotezy mocowane były za pomocą

cementu kostnego i właśnie tutaj autor dopatruje się przyczyn niepowodzeń

implantacji. Dodatkowa analiza wykazała, że wszyscy pacjenci cierpieli na

znaczną nadwagę, co w znacznym stopniu zwiększyło prawdopodo-

bieństwo pęknięcia implantu [26].

Kishida, Sugano i Sakai przeprowadzili na grupie 176 pacjentów 204

operacje endoprotezoplastyki z użyciem porowatych implantów kobaltowo

– chromowo – molibdenowych, mocowanych na wcisk. Jedynie 5 z nich

uległo złamaniu, wszystkie na wysokości 1/3 odległości od wierzchołka

trzpienia. Jedno ze złamań nastąpiło niecały tydzień po operacji, pozostałe

powstały po okresie mniej więcej 5 lat. Autor wymienia kilka powodów,

które mogły spowodować pęknięcie, m.in. wady materiałowe (wskazuje na

obecność porów, ubytków i wtrąceń niemetalicznych), nieodpowiednie

zamocowanie implantu, odbiegającą od normy geometrię kości udowej [27].

Lakstein analizuje 6 przypadków złamań trzpieni endoprotez (Zimmer,

Warsaw, Indiana), które nastąpiły w okresie od 13 do 80 miesięcy po

przeprowadzeniu endoprotezoplastyki. Wszystkie trzpienie były porowate,

mocowane na wcisk. Trzy z nich (rys.6,7) poddane zostały analizie

materiałowej. We wszystkich przypadkach odnotowano boczne i przednie

uszkodzenie ścianki trzpienia, które pod działaniem naprężeń zginających

doprowadziły do pęknięcia trzpienia. Dalsze oględziny powierzchni

złamania ujawniły trzy różne tekstury na powierzchni przełomu. Obszar

A (pękanie zmęczeniowe) zajmuje ok. 40% powierzchni złamania,

charakteryzuje się gładką teksturą o płaskiej orientacji. Obszar C (przełom

resztkowy) ma szorstką fakturę i obejmuje ok. 30% powierzchni złamania.

Obszar B (pękanie doraźne) obejmuje również ok. 30% powierzchni


317

złamania, a jego charakterystyczną cechą jest chropowata struktura

wewnątrz przełomu i gładka na obrzeżach [28].

Hernandez-Rodrigues i Orteza-Saenz (3) przedstawili w artykule

przykład pacjenta, u którego złamanie trzpienia zdiagnozowano niecałe

5 lat od przeprowadzenia operacji endoprotezoplastyki. W celu ustalenia,

dlaczego doszło do pęknięcia trzpień poddano analizie OM, SEM i EDS.

Autorzy na podstawie wyników badań własnych wywnioskowali, że

powodem pęknięcia była wysoka koncentracja naprężeń na przednio-

bocznej powierzchni trzpienia. Nieciągłości materiału i wady powierzchni

skumulowane wokół miejsca inicjacji pęknięcia spowodowały, że przekrój

poprzeczny trzpienia nie był w stanie utrzymać wysokich obciążeń, jakie

generowane były przez aktywnego fizycznie pacjenta. Analiza wykazała

również obecność dużych cząstek zanieczyszczeń, przede wszystkim siarki,

ale według autorów zdecydowanie nie był to główny powód pęknięcia

(rys.8,9) [29].

Rysunek 6. Zdjęcie rentgenowskie obrazujące przełom i a) wyszczególnione obszary złamania:

(A) przełom doraźny, (B) przełom zmęczeniowy, (C) przełom resztkowy, b) ognisko [28]


318

Rysunek 7. Zdjęcia przełomów wykonane przy użyciu wysokiej rozdzielczości SEM obrazujące

przełom zmęczeniowy i ujawniające: a) obszar A, b) miejsce inicjacji i prążki zmęczeniowe,

c) obszar przełomu z wtórnymi pęknięciami, d) dodatkowe pęknięcia poprzeczne, e, f) wgłębienia

wynikające z przeciążenia materiału [28]

Rysunek 8. Zdjęcia przedstawiające: a) złamany trzpień, b) przełom z wyszczególnionym:1

miejscem inicjacji, 2 odkształceniem plastycznym, c) widok z boku obrazujący skręcenie

trzpienia w miejscu pęknięcia [29]


319

Rysunek 9. Zdjęcie z MO obrazujące: a) obecność wytrąceń siarczków, b) strukturę austenityczną

bez widocznych węglików i fazy ferrytycznej [29]

4. Wnioski

W tabeli 4 zsumowano dane dotyczące liczby złamań trzpieni endo-

protez stawu biodrowego otrzymanych z różnych materiałów implan-

tacyjnych oraz czas ich użytkowania. Dane zawarte w tabeli 4 ukazują, że

najwięcej (88,6%) odnotowanych przypadków złamań izolowanych

trzpieni endoprotez dotyczy stali austenitycznej. Stop ten, po przeróbce

plastycznej na zimno, zazwyczaj charakteryzuje się bardzo drobnoziarnistą

mikrostrukturą, która przyczynia się do zwiększenia wytrzymałości na

rozciąganie. Z drugiej strony powoduje zwiększenie twardości i obniżenie

ciągliwości stali, co może wpływać na pogorszenie jej odporności na

pękanie [30].

Według brytyjskiej normy ISO 5832-1:199 stal austenityczna może

zostać wykorzystana do produkcji trzpieni endoprotez stawu biodrowego.

Natomiast zgodnie z polską normą PN-ISO 5832-1 implanty wykonywane

z tej stali austenitycznej zaliczane są do wszczepów krótkotrwałych i nie

powinny być stosowane na elementy endoprotez stawu biodrowego, które

z założenia są wszczepami długookresowymi. Jednak na podstawie

najnowszych danych literaturowych [10, 16, 22, 31‚35] należy stwierdzić,

że częstość stosowania implantów wykonanych z tej stali nie maleje,

pomimo dostępności na rynku innych materiałów. Na pewno, w przypadku

stali istotnym czynnikiem jest jej cena. Chociaż norma ISO dopuszcza stal

austenityczną do produkcji implantów przeznaczonych do długotrwałego

funkcjonowania w organizmie ludzkim, to powstaje pytanie, czy

rzeczywiście i w jakich przypadkach stop ten należy stosować. Być może

istnieje potrzeba ustalenia kryteriów, które powinny być spełnione,

w przypadku stosowania trzpieni wykonanych ze stali austenitycznej.


320

Tabela 4 Tabela zbiorcza dotycząca różnych przypadków złamań trzpieni endoprotezy

Materiał Mocowanie

Liczba

złamanych

trzpieni

Czas

użytkowania

[w miesiącach]

Stal austenityczna Cementowe 1 108


Tytan Bezcementowe 1 8

Tytan Bezcementowe 1

Kobalt Bezcementowe 5 36





Kobalt Bezcementowe 2 Brak danych









Stal austenityczna Cementowe 2 Brak danych



Tytan Bezcementowe 2 Brak danych

Stal austenityczna Cementowe 69 Brak danych




321

Łącznie złamanych

trzpieni 282

% stal austenityczna 86,2 %

% stopy kobaltu 9,2 %

% stopy tytanu 4,6 %

Trzpienie cementowe 86,2 %

Trzpienie

bezcementowe 13,8 %

Chociaż nie wszystkie opisane w literaturze przypadki złamań poddano

wnikliwej analizie metalograficznej, to badania, w których przeprowadzono

obserwacje przy użyciu SEM ujawniły w zdecydowanej większości

przypadków cechy złamania zmęczeniowego. Inicjacja pęknięcia

zlokalizowana została na przednio-bocznym narożu trzpienia.

Z przedstawionego przeglądu literaturowego wynika również, że

główną przyczyną pękania trzpieni jest nadwaga pacjentów, która zgodnie

z badaniami przeprowadzonymi przez Wróblewskiego, wykazuje liniową

zależność pomiędzy masą ciała, a okresem użytkowania endoprotezy.

Ponieważ, pomimo dynamicznego postępy, jaki jest obserwowany w

endoprotezoplastyce stawu biodrowego, do chwili obecnej nie udało się w

pełni wyeliminować problemów związanych z izolowanym pękaniem

trzpieni endoprotez, należy podjąć dalsze badania zmierzające do

wyjaśnienia tego zjawiska.

Literatura

1. Korzyński M, Cwanek J., Procesy zużycia w stawie biodrowym, Zbiór prac

seminarium naukowego Mechanika w Medycynie, 1 (1993)

2. Blicharski M., Wstęp do inżynierii materiałowej, Wydawnictwa Naukowo-

Techniczne, (2009), s. 428-446

3. Nowacki, L., Gustavo F., Biomateriały w konstrukcji implantów, Open Access

Library, vol. 11, (2012)

4. Błaszczyk W., Biomechanika kliniczna. Podręcznik dla studentów medycyny

i fizjoterapii, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, (2004)

5. Ackrermann K., Implantologia, Urban&Partner, (2004)

6. Będziński R., Ścigała K., Biomechanika stawu biodrowego i kolanowego. Tom

5 Biocybernetyka i inżynieria rehabilitacyjna, Akademicka Oficyna

Wydawnicza Exit, (2004)

7. Bernakiewicz M., Będziński R., Analiza stanu naprężeń kości udowej

w ekstremalnych warunkach obciążeń, Zeszyty Nukowe Konferencji

Mechaniki Stosowanej, (1999)


322

8. Kishida Y., Sugano N., Stem fracture of the cementless spongy metal Lubeck

hip prosthesis, The Jurnal of Arthroplasty, (2002)

9. Brooks S., Fracture of fully hydroxyapatite-coated titanium femoral stem

of a total hip replacement – a report of 3 cases, Acta Orthop Scand (2004),

75 (6), s.768-771

10. Drobniewski M., Sibiński M., Złamanie trzpienia endoprotezy jaki rzadkie

powikłanie alloplastyki stawu biodrowego – opis dwóch przypadków,

Chirurgia Narządów Ruchu i Ortopedia Polska, (2010), s. 53-56

11. Hernandez-Rodriguez M., Ortega-Saenz J., Failure analysis of a total hip

prosthesis implanted in active patient, Journal of the Mechanical Behavior of

Biomedical Materials, (2010), s. 619-622

12. Lakstein D., Eliaz N., Fracture of cementless femoral stem at the mid-stem

junction modular revision hip arthroplasty system, The Journal of Bone &

Joint Surgery, (2011)

13. Martens M., Aernoudt E., De Meester P., Ducheyne P., Muller J. C., Delangh

R., Kestelijn P,. Factors in the Mechanical Failure of the Femoral Component

in Total Hip Prosthesis, Acta Orthop Scandinavica (1974), 45(5), s. 693-710

14. Berkenbilt S. I., Hungeford W., Fracture of an Extensively Porous-Coated

Femoral Stem-Case Report, About Joints, (2003) [cited 2013 Jan 21].

Avaliable from: URL:

15. http://aboutjoints.com/physicianinfo/casereports/case4/Case4.htm

16. Brooks S., Sharma D. K., Creasey S., Lewis B., Fracture of fully

hydroxyapatite-coated titanium femoral stem of a total hip replacement—a

report of 3 cases, Acta Orthop Scand, (2004),75(6), s. 768-71

17. Kotela A., Ambroziak P., Deszczyński M. J., Złamanie trzpienia endoprotezy

stawu biodrowego – opis przypadku, Ostry dyżur (2012) tom 5, numer 1-2

18. Bono J., McCarthy J., Thornhill T., Revision Total Hip Arthroplasty, Springer,

(1999)

19. Wróblewski B. M., The mechanism of francture of the femoral prosthesis in

total hip replacement, International Orthopaedics Springer, (1979), vol. 3(2),

s. 137-139

20. Żurek-Świeczko B., Biomateriały, Wydawnictwo Politechniki Gdańskiej,

(2009)

21. Martens M., Aernoudt E., De Meester P., Ducheyne P., Muller J. C., Delangh

R., Kestelijn P., Factors in the Mechanical Failure of the Femoral Component

in Total Hip Prosthesis, Acta Orthop Scandinavica (1974), 45(5), s.693-710

22. Carlsson A. S., Gentz C. F., Stenport J., Fracture of the femoral prosthesis in

total hip replacement according to Charnley, Acta Orthop Scand (1977),

48(6), s. 650-655

23. Murray D. W., Cemented femoral fixation: the North Atlantic divide,

Orthopedics (2011), 34(9), s. 462-463

24. Rae P. J., Hardinge K., Segmental fracture of the femoral stem of a low-

friction arthroplasty. A case report. J. Arthroplasty, (2011) vol.2, s. 241-243

25. Prendergast J., Fracture of an Exeter stem 3 years after impaction

allografting— a case report, Acta Orthop Scand (2002), s.111-113


323

26. Wilson L., Fracture of the femoral stem of the ring TCH hip prosthesis,

British Editorial Society on Bone and Joint Surgery, (1992)

27. Wróblewski B. M., Fractured stem in total hip replacement: A clinical review

of 120 cases, Acta Orthop Scand (1982), s. 279-284

28. Kishida Y., Sugano N., Ohzono K., Sakai T., Nishii T., Yoshikawa H., Stem

Fracture of the Cementless Spongy Metal Lubeck Hip Prosthesis, The Journal

of Arthroplasty, (2002)17:8, s.1021-1027

29. Lakstein D., Eliaz N., Levi O., Backstein D., Kosashvili Y., Safir O., Gross A.

E., Fracture of cementless femoral stem at the mid – stem junction in modular

revision hip arthroplasty system, The Journal of Bone & Joint Surgery (2011)

05;93(1), s. 57-65

30. Hernandez-Rodriguez M., Ortega-Saenz J., Failure analysis of a total hip

prosthesis implanted in active patient, Journal of the Mechanical Behavior of

Biomedical Materials, (2010), s. 619-622

31. Clemens D., Galante J., Rostoker W., The Influence of Grain Size on the

Fatigue Behavior of Annealed 316 LVM Stainless Steel, J Biomed Mater Res

(1979) 13(3), s.437-41

32. Ling S. M. R., Cahrity J., Lee A. J. C., Whitehouse S. L., Timperley A. J., Gie

G. A., The Long-Term Results of the Original Exeter Polished Cemented

Femoral Component – A Follow-up Report, The Journal of Arthroplasty

(2009) 24(4), s.511-527

33. Purbach B., Kay P. R., Siney P. D., Fleming P. A., Wroblewski M.,

The C-Stem in Clinical Practice: Fifteen-Year Follow-Up of a Triple Tapered

Polished Cemented Stem, The Journal of Arthroplasty (2013), vol. 28: 8,

s. 1367-1371

34. Sen R. K., Mootha A. K., Saini R., Kumar V., Segmental Fracture

Of A Cemented Femoral Stem – A Case Report And Review Of Litrature,

The Internet Journal of Orthopedic Surgery (2009); vol.13, no. 1

35. Hailer N. P., Garellick G., Karrholm J., Uncemented and cemented primary

total hip arthroplasty in the Swedish Hip Arthroplasty Register, Acta Orthop

(2010);81(1), s.34-41

36. Scheerlinck T., Druyts P., Casteleyn P. P., The use of primary total hip

arthroplasty in university hospitals of the European Union, Acta Orthop Belg

(2004);70(3), s.231-239


324

Przyczyny mechanicznego niszczenia implantów wytwarzanych

tradycyjnymi technologiami

Prawidłowo zbudowany i funkcjonujący staw biodrowy umożliwia płynny zakres ruchu w wielu

płaszczyznach. Jakakolwiek zmiana chorobowa w tym układzie może prowadzić do uszkodzenia

stawu, poprzez jego deformację, ból lub utratę funkcji. Endoprotezoplastyka stawu biodrowego

jest zabiegiem mającym na celu wymianę uszkodzonych powierzchni stawowych i zastąpienie

ich elementami sztucznymi. Jednak, jak każda ingerencja chirurgiczna, niesie ze sobą ryzyko

powikłań. Jednym z nich jest złamanie izolowanie trzpienia, polegające na złamaniu implantu

wewnątrz kanału szpikowego, bez uszkodzenia otaczających go tkanek. Artykuł zawiera przegląd

literatury dotyczącej klinicznych przypadków złamań izolowanych trzpieni endoprotez stawu

biodrowego wykonanych ze stali austenitycznej. Pomimo, iż izolowane złamanie trzpienia nie

jest zaliczane do częstych powikłań występujących po implantacji, to brak w literaturze fachowej

przejrzystego opisu przyczyn występowania tego zjawiska oraz danych statystycznych, skłania do

podjęcia tej tematyki.

The causes of mechanical destroying of implants manufactured with

traditional technologies

A properly built and functioning hip joint enables a smooth range of motion in multiple planes.

Any lesion in this system may lead to damage of the pond, through its deformation, pain or loss

of function. Hip replacement is an operation designed to replace damaged articular surfaces and

replacing them with artificial components. However, like any surgical intervention, carries the

risk of complications. One of them is to break the isolated stem consisting in breaking the implant

within the intramedullary canal without damaging surrounding tissues. The article contains

a review of the literature on clinical cases of isolated fractures of the hip endoprosthesis stems

mainly made of austenitic stainless steel. Although isolated fracture of the stem is not included in

the frequent complications occurring after implantation, the lack in the literature a clear

description of the causes of this phenomenon and statistical data tends to take up this subject.

325

Adrian Dubicki1, Żaneta Anna Mierzejewska

2

Projekt indywidualnego implantu kości biodrowej

1. Wstęp

Istnieje wiele różnych procedur leczenia dysfunkcji miednicy, zarówno

inwazyjnych jak i nieinwazyjnych. Niektóre ze schorzeń wymagają

zastosowania implantów lub endoprotez, które różnią się konstrukcją,

wykorzystanymi materiałami i wykończeniem powierzchni. Często ich

jedynym wspólnym punktem jest cel zastosowania, którym jest przyw-

rócenie funkcji miednicy. Czasami zaawansowanie i rozległość choroby

czy urazu nie pozwalają na skuteczne zastosowanie standardowych metod

i jedynym wyjściem jest przygotowanie indywidualnego rozwiązania

w postaci implantu [1, 2].

Rola implantów w organizmie oraz fakt, że będą wewnątrz niego

umieszczone, powoduje konieczność postawienia im licznych wyma-

gań [3]. Ze względu na rozległość oraz złożoność zabiegu chirurgicznego,

ważne jest uniknięcie komplikacji oraz maksymalne skrócenie czasu

operacji. Ważnym jej etapem, podczas którego występuje najwięcej

problemów, jest dopasowanie takiego wszczepu. Z tego powodu, w trakcie

przygotowywania spersonalizowanego implantu, należy zwrócić szcze-

gólną uwagę na jego dopasowanie, co pozwoli uniknąć komplikacji

i znacząco skróci czas zabiegu jego wszczepienia [1].

2. Cel pracy

W związku z przedstawionymi powyżej problemami, zaproponowane

w pracy rozwiązanie oparte będzie na wykorzystaniu programów

komputerowych, umożliwiających otrzymanie wirtualnych modeli oraz

wspomagających proces projektowania. Cyfrowy model kości miednicy

otrzymany zostanie dzięki użyciu inżynierii odwrotnej (ang. Reverse

Engineering) – badanie tomografem komputerowym, projektowanie na

jego podstawie implantu przeprowadzone zostanie w programach wspoma-

gających projektowanie (ang. Computer Aided Design), a do wytworzenia

[email protected], Katedra Inżynierii Materiałowej i Biomedycznej, Wydział

Mechaniczny, Politechnika Białostocka, www.pb.edu.pl [email protected], Katedra Inżynierii Materiałowej i Biomedycznej,



326

wszczepu użyta będzie technika szybkiego prototypowania (ang. Rapid

Prototyping) – wydruk 3D z proszków biozgodnych metali.

Obranie takiej ścieżki pozwala na zwiększenie dokładności dopaso-

wania implantu do pozostałych struktur anatomicznych pacjenta, co

przekłada się na zmniejszenie ryzyka powikłań oraz skrócenie czasu

trwania zabiegu operacyjnego.

3. Cyfrowy model kości

Niemal u każdego pacjenta, z poważnymi schorzeniami czy uszko-

dzeniami w obrębie miednicy wykonywane jest badanie tomografem

komputerowym lub rezonansem magnetycznym. Głównym celem jego

przeprowadzenia jest poznanie rozległości choroby lub obrażeń chorego.

Na podstawie badania, lekarz może potwierdzić wstępnie postawioną diag-

nozę, a dzięki dokładności wyników, rozszerzyć ją.

Do otrzymania modelu komputerowego kości wykorzystano oprogramo-

wanie MIMICS. Jest ono profesjonalnym narzędziem do segmentacji obrazów

medycznych pochodzących z tomografii komputerowej lub rezonansu

magnetycznego, ich wizualizacji oraz tworzenia trójwymiarowych modeli [4].

Proces przygotowania trójwymiarowego modelu kości miednicy rozpoczął

się od wczytania danych z tomografii komputerowej. Do celów projektu

wykorzystane zostały skany tomograficzne dostępne w bibliotece programu

MIMICS, zawierające obrazy struktur anatomicznych potrzebnych do

niniejszej pracy. Okno programu MIMICS z wczytanymi obrazami tomogra-

ficznymi przedstawione zostało na rysunku 1.

Rysunek 1. Okno programu MIMICS z wczytanymi obrazami TK


327

W celu zebrania wszystkich pikseli prezentujących na obrazach dany

rodzaj tkanki, np. zgrupowanie tkanek kostnych i ich oddzielenie od tkanek

miękkich, należy przeprowadzić operację progowania – opcja Thresholding

Opcja ta wykorzystuje przypisanie poszczególnym pikselom wartości ze

skali Hounsfielda. Wybranie pewnego przedziału ze skali wartości

powoduje utworzenie maski zawierającej tylko te punkty, które mają

przypisany współczynnik mieszczący się w wybranym przez użytkownika

zakresie. Program umożliwia indywidualne dobranie wartości intere-

sującego nas przedziału lub wybranie określonych w programie prze-

działów, które w przybliżony sposób odpowiadają danej tkance np. kościom.

W projekcie wykorzystano zaproponowany w programie zakres progo-

wania dla kości, wynoszący od 226 do 1634 jednostek HU.

Po wybraniu odpowiedniego przedziału i utworzeniu maski z pikselami

reprezentującymi kości, można przystąpić do jej edycji. W utworzonym

zbiorze znajdują się wszystkie piksele z całego obszaru badania, które

mieszczą się w zadanym zakresie wartości ze skali Hounsfielda.

Utworzenie trójwymiarowego modelu na podstawie tej maski dało by efekt

w postaci modelu połączonych ze sobą kości (brak przejść stawowych),

części naczyń krwionośnych (głównie tętnic) i narządów. Z tego powodu

należy podać maskę edycji.

Interesująca nas prawa kość miedniczna musi zostać odłączona od

pozostałych wybranych tkanek. Umożliwi to w dalszych krokach

oddzielenie pikseli reprezentujących strukturę, której model chcemy

otrzymać i utworzenie z nich nowej maski. W celu oddzielenia punktów

kości miednicznej od innych, reprezentujących kość udową, krzyżową

i spojenie łonowe należy użyć funkcji Edit masks i jej opcji Erase. Pozwala

ona na usunięcie, wymazanie zbędnych pikseli, odseparowanie złączonych

w modelu kości o których wiemy, że w rzeczywistości są połączone tylko

za pomocą tkanki chrzęstnej i nadanie nowych granic obiektom. Funkcja

programu MIMICS – Calculate 3D, umożliwia wygenerowanie na pod-

stawie pikseli wybranej maski, trójwymiarowego modelu struktur

anatomicznych (rysunek 2a).

Wygenerowany trójwymiarowy model kości miednicznej (2b) mógłby

zostać wyeksportowany do oprogramowania CAD, w celu zaprojektowania

implantu kości biodrowej. Posiada on jednak liczne niedoskonałości

i nieciągłości. Wykorzystanie takiego modelu mogłoby spowodować złe

dopasowanie do struktur anatomicznych i nieprawidłowe zaprojektowanie

implantu.

Dzięki opcji Calculate polylines (rysunek 3) program tworzy polilinie,

które prowadzone są na granicy pikseli danej maski. Powoduje to łagodne

wygładzenie powierzchni modelu. Utworzenie polilinii umożliwia

przeprowadzenie kolejnej ważnej operacji. Jest nią Cavity fill from


328

polylines, która umożliwia uzupełnienie luk wewnątrz modelu. W wyniku

użycia tej opcji utworzona jest nowa maska, w której skład wchodzą

również woksele w poprzednich maskach nie uwzględniane.

Rysunek 2. Wygenerowany model a) kośćca miednicy i kręgów lędźwiowych, b) model kości

biodrowej

Rysunek 3. Okno funkcji Calculate polylines oraz utworzone, widoczne na modelu 3D polilinie

a) b)


329

4. Obróbka cyfrowego modelu kości [5]

Dalsza obróbka utworzonego cyfrowego modelu kości miednicznej

wykonana została przy użyciu modułu Mimics Remesh, będącego częścią

oprogramowania MIMICS. Za jego pomocą przygotowany został gotowy,

cyfrowy model prawej kości miednicznej (w rozszerzeniu STL), który

będzie mógł następnie zostać wykorzystany do projektowania implantu

w oprogramowanie CAD.

Po wybraniu opcji Remesh w programie MIMICS trójwymiarowy model

jest automatycznie przenoszony do modułu Mimics Remesh. Okno modułu

podzielone jest na trzy części. Po lewej znajduje się podgląd na model oraz

lista przeprowadzonych procesów, a po prawej stronie okna panel

kontrolny modelu i miejsce do wprowadzenia parametrów wykonywanych

na modelu operacji.

Przeniesiony do Mimics Remesh model przedstawiony jest w postaci

siatki trójkątów. Podobnie jak w przypadku wizualizacji modelu

w programie MIMICS (bez wyświetlenia siatki trójkątów), podobnie

i w jego module, na podstawie obserwacji siatki trójkątów można zauważyć

liczne niedoskonałości i nierówności. Ich wygładzenie możliwe jest dzięki

opcji Smooth. Po jej wybraniu należy ustawić parametry wygładzania.

W tym celu współczynnik wygładzenia (Smooth factor) ustawiony został

na wartość 0,7. Ilość iteracji wygładzania (Number of iterations) ustawiono

na piętnaście powtórzeń.

Działanie funkcji Smooth opiera się na porównywaniu trójkątów

z sąsiednimi i ich dopasowaniu w celu usunięcia nierówności. W wyniku

zastosowania tej opcji, siatka trójkątów została wygładzona. Krawędzie

talerza biodrowego oraz panewki nie są ostre, a powierzchnie mają płynne,

gładkie kształty.

Kolejnym etapem obróbki modelu jest wykorzystanie opcji Reduce. Jej

użycie ma na celu uproszczenie siatki trójkątów. Przed wykonaniem tego

kroku, model utworzony jest z równomiernie ułożonych trójkątów.

Niezależnie czy opisywana przez nie powierzchnia jest płaska czy

wypukła, do ich opisania używana jest taka sama liczba trójkątów.

Powoduje to niepotrzebne skomplikowanie modelu.

Po wybraniu opcji redukcji należy wprowadzić w oknie parametry

procesu. Pierwszym jest Flip thresholds angle, który ustawiamy na wartość

15. Ten parametr decyduje o wartości kątów – im jest wyższy, tym trójkąty

tworzące siatkę będą bardziej równomierne. Ważnym parametrem jest

Geometrical error. Decyduje on o odchyleniu położenia nowego trójkąta

w stosunku do położeń trójkątów go tworzących. Ustawiona na 0,9 wartość

błędu geometrycznego oznacza, że model będzie różnił się od

wejściowego, utworzonego na podstawie zdjęć tomografii komputerowej


330

o wartość maksymalnie 1/8 piksela. Pomimo uproszczenia, pozwoli to na

dosyć dokładne odwzorowanie zdjęć TK przez model. Ilość iteracji

redukcji (Number of iterations) ustawiono na 25 powtórzeń.

W wyniku wykonania opcji Reduce siatka trójkątów tworząca model

składa się 2140. Przed jej wykonaniem liczba trójkątów wynosiła 15954,

więc w wyniku redukcji model został opisany siatką mniejszą o 13814

trójkąty.

Siatka tworząca model, po przeprowadzonych operacjach składa się

z mniejszej liczby trójkątów, ale nie rozłożonych równomiernie. Niektóre

powierzchnie składają się z pojedynczych, a niektóre z nawet

kilkudziesięciu trójkątów. Aby wyrównać siatkę należy użyć opcji Auto

Remesh. W celu uzyskania dokładnego wyrównania położenia trójkątów

wprowadzono parametry procesu. Pierwszym jest dokładność odwzoro-

wania kształtu (Shape quality) wynosząca 0,3 oraz maksymalny błąd

geometrii (Maximum geometrical error) ustawiony na wartość 0,4.

Wymienione parametry zablokują możliwość zbyt dużego odchylenia od

wartości początkowych i pozwolą na dokładne odwzorowanie struktur

anatomicznych. Maksymalna długość krawędzi trójkąta (Maximal edge

length) została ustawiona na wartość 5. Oznacza to że każda powierzchnia

będzie opisana trójkątami o podobnych wymiarach. Ilość iteracji (Number

of iterations) ustawiona została na 15 powtórzeń.


331

Rysunek 4. Parametry opcji Reduce. Modele kości przed redukcją (u góry) oraz po jej wykonaniu

(u dołu)

W wyniku wykonania operacji Auto remesh model ponownie składa się

z większej liczby trójkątów. Ich liczba zwiększyła się do 15728. Świadczy

to o tym że siatka składała się w głównej mierze z dużych trójkątów.

Powierzchnie utworzone z małych trójkątów stanowiły rzadkość w modelu.

Wykorzystanie opcji sprawiło równomierne rozmieszczenie siatki, jej

wygładzenie i rozbudowanie.


332

Ostatnim krokiem, mającym na celu edycję siatki trójkątów jest

wykorzystanie funkcji Quality Preserving Reduce Triangles. Ma ona na

celu ponowną redukcję ilości liczby trójkątów, przy jednoczesnym

zachowaniu jak najlepszej jakości modelu. Wprowadzone parametry

procesu miały takie same wartości, jak w przypadku operacji Auto Remesh.

Różnice pomiędzy siatkami przed i po wykonaniu operacji uproszczenia

siatki są niemal nie zauważalne. Powodem tego jest ilość trójkątów o które

pomniejszono siatkę. W wyniku tej operacji, liczba trójkątów wchodzących

w skład siatki zmniejszyła się już tylko o 372 elementy. Tak otrzymany

model może posłużyć do wykonania implantu kości biodrowej, lecz przed

opuszczeniem programu należy sprawdzić budowę siatki. W tym celu

wykorzystano funkcję Fix Wizard (rys. 5). Pozwala ona wykryć wszystkie

niedoskonałości siatki, np. nieciągłości oraz automatyczną naprawę

prostych defektów.

Rysunek 5. Okno opcji Fix wizard sprawdzającej poprawność siatki

5. Projektowanie indywidualnego implantu kości biodrowej przy

użyciu oprogramowania CAD

Zaawansowane zmiany kości biodrowej mogą uniemożliwiać

wykorzystanie modelu do celów projektowych. W takim przypadku konieczne

było by przygotowanie modelu zdrowej kości miednicznej. Wtedy pierwszym

krokiem, po wgraniu modelu do programu CAD – SolidWorks lub jeszcze na

etapie programu MIMICS, powinno być wykonanie lustrzanego odbicia

modelu zdrowej kości. Budowa anatomiczna kości miednicznych danego


333

człowieka nie różni się aż w takim stopniu, by uniemożliwić ich

naprzemienne wykorzystanie.

Kość biodrowa jest jedną z kości tworzących kość miedniczną. Wraz

z kością łonową i kulszową buduje również panewkę stawu biodrowego.

Z tego powodu, wykonanie implantu tylko i wyłącznie kości biodrowej nie

jest możliwe [6]. Projektowany wszczep musi być zatem wyposażony

w sztuczną panewkę. Aby połączenie implantu z pozostałymi kośćmi

pacjenta nie odbywało się w bezpośrednim sąsiedztwie zewnętrznych

powierzchni panewki, będzie ono miało miejsce na trzonie kości kulszowej

i górnej gałęzi kości łonowej.

Aby przygotować przyszły kształt implantu i odrzucić z wczytanego do

programu modelu kości, które mają być u pacjenta zachowane, użyto opcji

Wyciągnięcie wycięcia (rys. 6). Za jej pomocą, wcześniej przygotowane,

przestrzennie dopasowane do kości szkice, posłużyły do przecięcia kości,

we wcześniej opisanych miejscach.

Rysunek 6. Przecięte w programie SolidWorks kości miednicy (po lewej – trzon kości kulszowej,

po prawej – gałąź kości łonowej)

Kolejnym ważnym krokiem w procesie projektowania implantu kości

biodrowej jest przygotowanie panewki stawu biodrowego. Musi być ona

odpowiednio ustawiona względem kości miednicznej, jak i również kości

udowej. Zakres kąta osi panewki względem trzonu kości udowej powinien

mieścić się w przedziale od 115o do 150

o [6]. Najlepszym rozwiązaniem do

wypozycjonowania łoża pod panewkę jest wykorzystanie naturalnej

panewki pacjenta, której model posiadamy.

W tym celu utworzona została płaszczyzna, przechodzącą symetrycznie

przez środek panewki z wczytanego modelu. Wykonanie przekroju, na

podstawie odpowiednio ustawionej płaszczyzny pozwala naszkicować

kształt przyszłej powierzchni stawowej implantu.

Przed przystąpieniem do projektowania panewki należało usunąć

zbędne elementy modelu. W tym celu utworzony został szkic, który

posłużył do wycięcia w modelu sfery, poprzez wykorzystanie operacji


334

Wycięcie przez obrót. Tak przygotowane miejsce dało pewność, że model

struktur anatomicznych pacjenta nie wpłynie na kształt projektowanego

implantu stawowego, nie będą obecne przenikania na powierzchnię

przyszłej panewki jak i puste przestrzenie pod nią. Następnie został

przygotowany szkic łoża. Etapy jego przygotowania zostały ukazane

poniżej, na rysunku 7.

Do utworzenia panewki (rysunek 8 a) użyto operacji Dodanie przez

obrót. Zaprojektowana została w taki sposób, aby mogła współpracować

z implantami powierzchni stawowych – kapami (po uprzednim przygoto-

waniu powierzchni i pokryciu warstwą odpornego na ścieranie azotku

tytanu (TiN)) lub po wyposażeniu we wkładkę polietylenową – z głową

endoprotezy stawu biodrowego. Wkładka polietylenowa, po umieszczeniu

jej w łożu i wciśnięciu, blokuje się za pomocą wypustek, uniemożliwiając

wysunięcie się [2].

Rysunek 7. Etapy projektowania panewki stawu biodrowego w implancie kości biodrowej

(A – przekrój przez model panewki, B – oczyszczenie miejsca pod panewkę,

C – szkic łoża panewki)

Po wykonaniu operacji dodania do modelu panewki, przeprowadzony

został pomiar, (rys. 8 b) mający na celu sprawdzenie prawidłowego

ustawienia łoża względem trzonu kości udowej. Na odpowiednio

ustawionej względem osi panewki płaszczyźnie, naszkicowane zostały linie

– przechodząca przez jej środek symetrii oraz pionowa. Dokonany pomiar

kąta wykazał wartość bliską 126o. Świadczy to o prawidłowym ustawieniu

implantu panewki w modelu kości miednicznej pacjenta, gdyż wartość kąta

mieści się w poprawnym zakresie od 115o do 150

o [6].

Kolejnym etapem projektowania indywidualnego implantu kości

biodrowej jest dodanie mocowań (rys. 9). Pozwolą one na trwałe

połączenie wszczepu z pozostawionymi kośćmi – kulszową i łonową.

Ważne jest aby wypustki mocujące jak najdokładniej pasowały do

powierzchni kości, a osie otworów pod wkręty kostne nie przecinały się,

aby nie doszło do skrzyżowania umieszczanych w kości wkrętów.

Dodanie mocowań odbywało się przy użyciu operacji Wyciagnięcie

dodania/bazy oraz Wyciągnięcie po profilach. Skomplikowana geometria


335

modelu wymagała pracy na licznych płaszczyznach i przekrojach, na

których następnie rysowane były szkice mocowań. Po wymodelowaniu

wypustek używana była operacja Zaokrąglenie, mająca na celu usunięcie

już na etapie modelu komputerowego ostrych, mogących powodować

skaleczenia pacjenta jak i lekarza krawędzi.

Po przygotowaniu ramienia mocowania, na ich końcach dodawane były

otwory. Będą one umożliwiały przymocowanie za pomocą wkrętów

kostnych, implantu do kości. Średnice wszystkich otworów mają wartość

4,4 milimetra. W fazie obróbki wykańczającej powinny zostać rozwiercone

do średnicy 4,6 milimetra, co umożliwi zastosowanie śrub dokostnych

o średnicy 4,5 milimetra.

Rysunek 8. Dodane do implantu kości biodrowej a) łoże panewki stawu biodrowego, b) pomiar

wartości kąta pomiędzy osią panewki, a trzonem kości udowej

Po zakończeniu przygotowywania otworów pod wkręty kostne, ważne

jest również przygotowanie gniazda pod łeb śruby. W tym celu użyta

została operacja Sfazowanie. Umożliwiła ona otrzymanie wgłębienia,

w które przynajmniej w części schowany będzie łeb wkrętu kostnego.

Kolejnym etapem projektowania jest dodanie na ścianach implantu,

które będą łączyć się z kośćmi, powierzchni umożliwiających przerost

tkanką kostną. Do ich wykonania posłużyła operacja Wyciągnięcie wycięcia

wykonywana na podstawie sporządzonych na kilku płaszczyznach szkiców.

Powierzchnie te umożliwią po pewnym okresie od implantacji wrośnięcie

w przygotowaną strukturę, żywej tkanki kostnej. Rezultatem przerostu

tkanką, będzie dodatkowe, mechaniczne połączenie na granicy implant-

a) b)


336

kość, powodujące jeszcze lepszą stabilizację wszczepu. Mechanizm

osteointegracji można porównać do mechanizmu zrastania się złamanych

kości [7].

Korzystanie z takich powierzchni daje pozytywne efekty, dlatego

w dużej części nowoczesnych implantów, zarówno ortopedycznych jak

i stomatologicznych można zaobserwować ich użycie. Istnieją różnorodne

metody wytwarzania takich struktur oraz ich różne formy [7]. Najczęściej

stosowanymi obecnie są powierzchnie wytworzone z hydroksyapatytu,

napylonego stopu tytanu, a wraz ze wzrostem technik przyrostowych,

bezpośrednio projektowane i drukowane.

Rysunek 9. Mocowania implantu do kości kulszowej (po lewej) i łonowej

Kolejnym etapem jest wykonanie mocowania implantu z kością

krzyżową. Ze względu na położenie implantu względem kości krzyżowej,

utrudnione staje się dodanie mocowań podobnych do wcześniej

omawianych. Wygodniejszym rozwiązaniem jest zastosowanie otworów

przechodzących przez implant, które posłużą do przytwierdzenia implantu

przy użyciu wkrętów kostnych.

Do programu SolidWorks wczytany został wcześniej przygotowany

w programie MIMICS, model kości krzyżowej. Zaimportowany został

w formie grafiki, co powoduje że nie wpływa on na projektowany wszczep

i nie mogą być na nim wykonywane żadne operacje. Implant wraz

z wczytanym modelem ustawione zostały w płaszczyźnie strzałkowej.

Podgląd struktury kości krzyżowej umożliwił prawidłowe rozmieszczenie

otworów (rys. 10), w miejscach gdzie łączy się ona z kością biodrową,

a zarazem gdzie można zauważyć jej grubsze, wypukłe ścianki.

Przy użyciu operacji Wyciągnięcie wycięcia, na podstawie szkiców i ich

rozmieszczenia do modelu dodane zostały otwory służące do wprowa-

dzenia śrub kostnych i trwałego połączenia implant-kość krzyżowa.

Możliwe jest ono dzięki zastosowaniu trzech śrub mocujących, które

pewnie i stabilnie unieruchomią implant w odpowiednim płożeniu.


337

Podobnie jak w przypadku wcześniej omawianych i dodanych mocowań,

wykonane zostały dodatkowe wgłębienia oraz sfazowania, mające na celu

schowanie łba śruby. Tak jak poprzednio, średnice wszystkich otworów

mają wartość 4,4 milimetra, a w fazie obróbki wykańczającej powinny

zostać rozwiercone do średnicy 4,6 milimetra, aby było możliwe zastoso-

wanie wkrętów takich jak w poprzednich mocowaniach.

Na stabilność implantu wpływ ma również rozbudowana, dobrze

dopasowana struktura powierzchni łączących się z kością krzyżową, przez

którą będą przenoszone siły z górnej części ciała.

W kolejnym etapie projektowania należało przygotować szereg

dodatkowych otworów, których funkcją będzie zapewnienie miejsca

przyczepu mięśniom. Bez przywrócenia utraconych, podczas usuwania

zmienionej chorobowo kości, połączeń pomiędzy układem kostnym,

którego częścią staje się projektowany implant, a układem mięśniowym,

nie możliwe jest przywrócenie mobilności i stabilności organiz-

mowi [6, 7].Większość otworów zlokalizowana jest na obwodzie talerza

kości biodrowej. Będą one służyć do przyczepu szerokiego pasma mięśni

biodrowych. Pozostałe, rozmieszczone m.in. na guzowatości kości

kulszowej czy biodrowej, będą służyć jako miejsce mocowania, m.in. dla

mięśnia krawieckiego, lędźwiowego, naprężacza powięzi szerokiej oraz

mięśni pośladkowych. Do przygotowanych otworów przymocowane będą

również więzadła – pachwinowe i krzyżowo-biodrowe [6, 7].

Rysunek 10. Dobranie położenia otworów do mocowania implantu do kości krzyżowej.

Wczytany model kości krzyżowej służy do prawidłowego rozmieszczenia otworów


338

Górna pozostałość krawędzi panewki stawu biodrowego wykorzystana

została do przeprowadzenia przez nią otworów, podobnie jak w poprzed-

nich przypadkach, mających na celu przymocowanie więzadła biodrowo-

udowego [6, 7].

Kolejnym ważnym krokiem projektowania, którego celem jest zmniej-

szenie masy implantu, jest dodanie ażurowych wycięć w rejonach wszczepu

nie przenoszących znacznych sił. Przed przystąpieniem do wykonania tej

operacji, wykorzystano opcję Właściwości masy, pozwalająca określić

objętość i masę modelowanych obiektów. Przed użyciem opcji Właściwości masy, należy modelowi przypisać

materiał, z jakiego ma być wykonany. Do wykonania wszczepu użyty zostanie

stop tytanu Ti6Al4V. Jest on obecnie najczęściej stosowanym materiałem na

różnego rodzaju implanty, spośród wszystkich biomateriałów metalicznych.

Posiada on dobre własności mechaniczne, charakteryzuje się bardzo dobrą

odpornością korozyjną i biokompatybilnością [7]. W porównaniu do innych

stosowanych na endoprotezy materiałów (stali austenitycznej i stopów

kobaltu), stop tytanu posiada niższą masę właściwą oraz moduł Younga.

Wpływa to pozytywnie przy współpracy i przenoszeniu sił na granicy implant-

kość. Najlepsza spośród materiałów biozgodność sprawia że stopy tytanu są

stosowane w licznych wariantach endoprotez, a szczególnie tych

przeznaczonych dla osób młodych [7]. Ze względu na te korzystne połączenie

właściwości mechanicznych (sprężystość, plastyczność, wytrzymałość)

materiał ten zostanie wykorzystany do produkcji zaprojektowanego implantu.

W poniższej tabeli 1, przedstawiono podstawowe właściwości mechaniczne

nadawane przez program SolidWorks projektowanemu wszczepowi.

Tabela 1. Właściwości materiałowe stopu Ti6Al4V z bazy programu SolidWorks

Właściwość Wartość

Moduł Younga 104800,3 N/mm2

Współczynnik Poissona 0,31

Wytrzymałość na rozciąganie 1050 N/mm2

Granica plastyczności 825,4 N/mm2

Masa właściwa 4428,8 kg/m3

W celu porównania masy projektowanego implantu, przygotowany

został również model prezentujący zastępowaną przez wszczep kość.

Program SolidWorks nie zawiera danych dotyczących właściwości

mechanicznych kości, dlatego należało przygotować i wprowadzić dane

dotyczące tkanki kostnej. Wprowadzone dane (tabela 2) dotyczą uśred-

nionych wartości budującej kość tkanki korowej i gąbczastej.


339

Tabela 2. Wprowadzone do programu SolidWorks właściwości materiałowe kości [8]

Właściwość Wartość

Moduł Younga 2130 N/mm2

Współczynnik Poissona 0,3

Granica plastyczności 148 N/mm2

Masa właściwa 2000 kg/m3

Po przypisaniu materiałów, oba modele zostały poddane badaniu

Właściwości masy, które oblicza m.in. objętość modelu i podaje wartość jego

masy. Z otrzymanych danych (rys. 11) wynika, że masa usuniętej pacjentowi

kości wyniosła by ok. 823 gramy, a masa zastępującego ją implantu wynosi

ok. 1816 gram. Jest to wartość ponad dwukrotnie przewyższająca masę

usuniętych tkanek. Wykonanie badania potwierdziło konieczność wykonania

w implancie ażurowych przestrzeni. Główną lokalizacją, ze względu na

przenoszone przez implant siły, będzie powierzchnia talerza kości biodrowej.

Obciążenia, z kręgosłupa na kończynę dolną, przenoszone są pomiędzy kością

krzyżową, a panewką stawu biodrowego. Talerz kości biodrowej w głównej

mierze służy jako miejsce przyczepu licznych mięśni. Zastosowanie implantu

będzie wiązać się z koniecznością znacznego zmniejszenia aktywności

fizycznej. Siły generowane przez mięśnie, które dodatkowo będą poddane

rekonstrukcji nie będą tak duże jak u zdrowego człowieka. Daje to możliwość

zastosowania konstrukcji ażurowej, przy zachowaniu łukowatego brzegu

talerza, który będzie służył za miejsce przyczepu i do przenoszenia sił mięśni.

Rysunek 11. Porównanie masy implantu z masą kości przez niego zastępowaną


340

Pierwszym etapem przygotowania powierzchni i konstrukcji ażurowej

jest wybranie odpowiednich, jak najbardziej równoległych do ścian talerza

biodrowego powierzchni. Na ich podstawie utworzone zostały szkice,

pozwalające na przygotowanie za pomocą operacji Wyciągnięcie wycięcia

wycięć w materiale, w postaci struktury tzw. plastra miodu.

W taki sposób przygotowane zostały cztery takie powierzchnie. Dwie

graniczne, położone nad połączeniem implant-kość krzyżowa oraz przy

guzie przednim, górnym talerza biodrowego powierzchnie nie zostały

wycięte przelotowo przez implant. Ma to na celu zachowanie dopasowanej

powierzchni stawowej (w przypadku pierwszej struktury) oraz wzmoc-

nienia guza przedniego, górnego implantu (druga struktura), który będzie

miejscem przyczepu m.in. mięśnia krawieckiego. Pozostałe dwie

powierzchnie przechodzą na wylot talerza kości biodrowej.

Wykonanie konstrukcji ażurowej pozwoliło na zmniejszenie masy

implantu, przy zachowaniu wystarczającej jego wytrzymałości. Zostało to

potwierdzone dzięki wykonaniu badania Właściwości masy. Widok

implantu z wykonanymi strukturami ażurowymi przedstawiony został na

rysunku 12.

Zastosowanie konstrukcji ażurowej pozwoliło zmniejszyć masę

implantu o 141 gram. W stosunku do pełnego implantu, masa po

wykonaniu operacji wycięcia spadła o ok. 8%. Pozwoliło to na otrzymanie

wartości masy implantu dwukrotnie większej od wartości kości.

W poprzednim przypadku różnica ta wynosiła ok. 2,2.

W celu zmniejszenia masy można byłoby zastosować puste przestrzenie

wewnątrz implantu. Nie wpływały by one znacząco na wytrzymałość

wszczepu. Przy obecnym stanie techniki, nie posiadamy jednak

rozwiązania umożliwiającego pozostawienie takich przestrzeni. Stosowane

techniki przyrostowe, dające możliwość wytwarzania detali z metali, jako

podpory stosują używany do produkcji proszek. Przy zamknięciu

wszystkich ścian, nie można by go było usunąć z wnętrza takiego implantu,

a w przypadku uszkodzeń wszczepu mogło by dojść do wysypania go

wewnątrz organizmu.

Zaproponowana konstrukcja implantu spełnia stawiane mu założenia

i oczekiwania. Wierne odtworzenie modelu kości miednicznej pacjenta

pozwoliło na wykorzystanie modelu do wykonania idealnie pasującego do

pozostałego kośćca pacjenta wszczepu. Dodane wypustki mocujące do

kości kulszowej i łonowej oraz otwory do zamocowania z kością krzyżową

pozwolą na stabilne połączenie implantu z kośćmi, a dodatkowe powierz-

chnie do przerostu tkanką kostną pozwolą na kolejne jej zwiększenie.

Zastosowanie otworów, których funkcją ma być rekonstrukcja przy-

czepów mięśniowych umożliwia w pewnym stopniu odtworzenie funkcji


341

układu mięśniowego w obrębie miednicy. Wykorzystane ażurowe wycięcia

zmniejszają masę implantu, bez znaczących strat w jego wytrzymałości.

Wpasowana na podstawie modelu pacjenta do implantu panewka,

pozwoli na przywrócenie funkcji ruchomości w stawie biodrowym

i z biegiem czasu, w procesie rehabilitacji, umożliwi na lokomocję

pacjenta.

Rysunek 12. Widoki rzutów indywidualnego implantu kości biodrowej prawej


342

6. Wnioski/Podsumowanie

Indywidualne implanty stają się coraz powszechniej stosowanym

sposobem zastąpienia uszkodzonych tkanek i przywrócenia pełnionych

przez nie funkcji. Rosnąca popularność związana jest z coraz częstszymi

przypadkami dysfunkcji w obrębie kośćca miednicy, spowodowanymi

poprzez zmiany zwyrodnieniowe, onkologiczne lub urazy. Zaawansowanie

i rozległość niektórych z nich sprawia, że często jedynym rozwiązaniem są

spersonalizowane implanty.

Do popularyzacji indywidualnych implantów przyczynia się również

rozwój techniki, który umożliwia przygotowanie i wytworzenie idealnie

dopasowanych wszczepów. Nie byłoby to jednak możliwe bez znacznego

postępu, który można zauważyć w technikach obrazowego diagnozowania

medycznego. Oprócz precyzyjnej diagnozy, pozwalają otrzymać niezwykle

przydatne w obecnej medycynie, trójwymiarowe modele tkanek i narządów

pacjenta.

Zaproponowany w pracy projekt, opartego na trójwymiarowym modelu

implantu oraz metoda jego produkcji pozwalają osiągnąć wymienione cele.

Użycie techniki inżynierii odwrotnej, poprzez wykorzystanie obrazów z

tomografii komputerowej pozwoliło na otrzymanie niezbędnych do

utworzenia modelu 3D danych. Wykorzystanie oprogramowania do

rekonstrukcji obrazów medycznych MIMICS umożliwiło otrzymanie

modelu kości miednicznych, a moduł Mimics Remesh, na jego przygoto-

wanie do wykorzystania w celach projektowych, w oprogramowaniu CAD

– SolidWorks. Wykorzystanie programu do komputerowego wspomagania

projektowania dało możliwość przygotowania implantu, który pomimo

licznych, zmniejszających masę ażurowych obszarów, będzie miał

odpowiednią wytrzymałość.

Pomimo licznych zalet, metoda posiada również wady. Wykonanie

gotowego, pustego wewnątrz wyrobu nie jest możliwe. Stosowany jako

podpora proszek pozostaje wewnątrz wszczepu. Możliwość wykonania

implantu w postaci skorupy dałaby pozytywne efekty. Tak przygotowany

implant byłby równie wytrzymały, a dodatkowo lżejszy. Pozwoliłoby to na

naśladowanie w pewnym stopniu naturalnej struktury kości, składającej się

z zbitej, zewnętrznej warstwy korowej i wewnętrznej, ażurowej tkanki

gąbczastej.

Rozwój techniki i medycyny będzie skutkował powstaniem coraz to

nowszych metod zastępowania tkanek i rozwoju już istniejących. W świetle

obecnego stanu techniki, zaproponowany projekt implantu kości biodrowej,

jak i proces jego wykonania spełnia stawiane oczekiwania.


343

Podziękowania

Praca zrealizowana przy wsparciu finansowym Wydziału Mecha-

nicznego Politechniki Białostockiej w ramach projektu „Rozwój młodych

naukowców i uczestników studiów doktoranckich‖ nr MB/WM/14/2014.

Literatura

1. Gonera K., Kurzac J., Rusińska M., Dybała B., Metody CAx w aplikacjach medycznych przy wytwarzaniu technologiami generatywnymi, Wrocław, Miesięcznik Naukowo-Techniczny Mechanik, 2010, tom 83, numer 2, s. 132-142

2. Madej T., Modelowanie strefu ruchowej endoprotezy stawu biodrowego w aspekcie biomateriałów, Kraków, 2008, Praca doktorska, Wydział inżynierii mechanicznej i robotyki, Akademia Górniczo-Hutnicza

3. Markowska O., Budzik G., Innowacyjne metody wytwarzania implantów kostnych za pomocą inżynierii odwrotnej (RE) oraz technik szybkiego prototypowania (RP), Sosnowiec, X Forum Inżynierskie ProCAx, 2011

4. Mimics. Medical Edition. Skrócona instrukcja obsługi oprogramowania [katalog], Leuven, Materialise NV, 2014

5. Mimics Student Edition Course Book [podręcznik], Leuven, Materialise NV, 2012 6. Bochenek A., Reicher M., Anatomia człowieka. Tom I. Warszawa,

Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 2009, s. 232-237, 518-541 i 853-868 7. Anatomia człowieka. Podręcznik dla studentów i lekarzy, Praca zbiorowa pod

redakcją W. Woźniaka. Wrocław: Elsevier Urban i Partner, 2010, s. 379-431 8. Polak Sz., Modelowanie i analiza właściwości mechanicznych kości, Poznań,

2014, Praca dyplomowa inżynierska, Wydział budowy maszyn i zarządzania, Politechnika Poznańska


Zamysłem niniejszej pracy jest połączenie wiedzy medycznej z techniczną, w celu uzyskania

zadowalającego efektu, jakim jest odtworzenie funkcji miednicy. W pracy został przedstawiony

i opisany przebieg projektowania indywidualnego implantu kości biodrowej, przy wykorzystaniu

najnowszych rozwiązań technicznych. Wykonywane badania tomografii komputerowej

pozwalają na postawienie precyzyjnej diagnozy, a otrzymany z ich przetworzenia cyfrowy model

kości miednicznej, posłużył do zaprojektowania w programie CAD wspomnianego implantu,

dokładnie dopasowanego do pozostałych kości miednicy pacjenta. Kolejną korzyścią jest

możliwość szybkiego wykonania takiego wszczepu przy użyciu techniki szybkiego

prototypowania – drukując go z proszku tytanowego, przy użyciu drukarki 3D, czy przy

wykorzystaniu obrabiarek sterowanych numerycznie.

The project of individual ilium bone implant

The intention of this work is to combine technical and medical knowledge in order to achieve a

satisfactory result, which is to restore the function of the pelvis. In this work and described

progress of individual design of the implant of the ilium has been shown, using the most modern

technical solutions. Computed tomography allows to place a precise diagnosis and resulting from

their processing digital model of the pelvic bone and to design the CAD model precisely matched

to the rest of the patient's pelvic bone. Another benefit is the ability to quickly execute such an

implant using rapid prototyping techniques – printing it titanium powder using a 3D printer,

whether using numerically controlled machine tools.

344

Magdalena Grygiel-Pradelok1, Janusz Szewczenko

2, Wojciech Kajzer

3,

Magdalena Antonowicz4

Ocena wpływu biodegradowalnej

warstwy polimerowej (PLGA)

na korozję podłoża ze stopów tytanu

1. Wprowadzenie

Pomimo dynamicznego rozwoju inżynierii tkankowej oraz nowo-

czesnych biomateriałów polimerowych i ceramicznych, w dalszym ciągu

do produkcji implantów najczęściej wykorzystuje się biomateriały

metalowe. Wśród nich wyróżnić można: stal austenityczną, stopy kobaltu,

czysty tytan oraz stopy tytanu [1, 2]. Główną przyczynę szerokiego

stosowania materiałów metalowych stanowi relatywnie niski koszt,

w porównaniu do innych grup materiałowych oraz szeroka dostępność.

Podstawowe ograniczenie ich stosowania stanowi umiarkowana

biotolerancja, na którą wpływa głównie niewystarczająca odporność

korozyjna w środowisku tkanek człowieka, alergiczne i toksyczne

oddziaływanie produktów degradacji na tkanki okołowszczepowe, a także

wysoka wartość modułu sprężystości. Natomiast do zalet biomateriałów

metalowych zalicza się przede wszystkim: wysoką wytrzymałość,

odporność na zmęczenie i zużycie, łatwość produkcji oraz sterylizacji [3].

W wyniku prowadzonych przez wiele lat badań, opracowano szereg

wymagań dotyczących składu chemicznego, struktury i właściwości

mechanicznych biomateriałów metalowych. Szczególnie istotnymi są

normy z serii PN-EN ISO 5832 (części 1‚3) – Implanty dla chirurgii

– Materiały metalowe, a także normy z serii PN-EN ISO 10993:1-18

– Biologiczna ocena wyrobów medycznych. Niestety nadal nie osiągnięto

zadawalającego poziomu biotolerancji implantów. Obecnie powszechnym

dążeniem jest poprawa biotolerancji materiałów metalowych poprzez

1 [email protected], Katedra Biomateriałów i Inżynierii Wyrobów

Medycznych, Wydział Inżynierii Biomedycznej, Politechnika Śląska, www.ib.polsl.pl 2 [email protected], Katedra Biomateriałów i Inżynierii Wyrobów Medycznych,

Wydział Inżynierii Biomedycznej, Politechnika Śląska, www.ib.polsl.pl 3 [email protected], Katedra Biomateriałów i Inżynierii Wyrobów Medycznych,

Wydział Inżynierii Biomedycznej, Politechnika Śląska, www.ib.polsl.pl 4 [email protected], Katedra Biomateriałów i Inżynierii Wyrobów Medycznych,

Wydział Inżynierii Biomedycznej, Politechnika Śląska, www.ib.polsl.pl



345

modyfikowanie ich warstwy wierzchniej [4, 5]. Głównymi celami stoso-

wania różnych metod modyfikacji warstwy wierzchniej implantów

metalowych są: poprawa własności implantów w środowisku płynów

fizjologicznych człowieka, w tym osiągnięcie lepszej biokompatybilności

poprzez poprawę ich odporności korozyjnej i ograniczenie ilości

produktów degradacji. Celem modyfikacji jest obniżenie kinetyki degra-

dacji, a także wytworzenie warstwy wydzielającej substancje lecznicze do

tkanek okołowszczepowych. Jakości warstw powierzchniowych nakładanych

na biomateriały metalowe poświęcono wiele prac, jednakże wciąż prowa-

dzone są badania mające na celu wyłonienie najlepszej. Wyróżnić można

wiele metod obróbki powierzchniowej implantów metalowych, m.in [5]:

polerowanie elektrolityczne;

pasywacja;

nanoszenie powłok metodami CVD oraz PVD;

nanoszenie powłok węglowe typu DLC oraz NCD;

implantacja jonów;

napylanie plazmowe;

utlenianie anodowe;

powłoki nanoszone metodą zol-żel;

nanoszenie powłok polimerowych.

Wybrana metoda obróbki powierzchniowej jest bezpośrednio zależna od

modyfikowanego materiału oraz przeznaczenia docelowej formy implantu.

Niemniej jednak najczęściej, na powierzchni biomateriału, ze szczególnym

uwzględnieniem jego cech geometrycznych, wytwarza się warstwy pasywne.

Warstwy te nie są doskonałe, ponieważ pod wpływem działania płynów

ustrojowych w organizmie człowieka oraz czynników mechanicznym ulegają

uszkodzeniu. Na skutek zniszczenia warstwy pasywnej dochodzi do procesów

korozyjnych w wyniku których przenikające do tkanek okołowszczepowych

produkty degradacji biomateriału metalowego mogą wywoływać reakcje

zapalne, alergiczne, cytotoksyczne bądź po prostu efekt drażnienia tkanek [1].

Aby zapewnić dobre właściwości mechaniczne implantów oraz ograniczyć ich

negatywny wpływ na organizm ludzki niezbędne okazało się stosowanie

różnego rodzaju powłok ograniczających proces metalozy z jednoczesnym

neutralizowaniem reakcji układu immunologicznego pomiędzy tkanką a

implantem. Jedną z nowoczesnych metod jest nanoszenie powłok

biopolimerowych na odpowiednio przygotowane podłoże metaliczne.

Przeprowadzono próby poprawy biozgodności implantów metalowych

poprzez zastosowanie biodegradowalnych warstw polimerowych na bazie

poliestrów alifatycznych [6]. Naniesienie na powierzchnię implantu

metalowego powłoki polimerowej zabezpiecza organizm przed produktami

Magdalena Grygiel-Pradelok, Janusz Szewczenko, Wojciech Kajzer, Magdalena Antonowicz

346

degradacji implantu metalowego, a także może dodatkowo przyśpieszyć

regenerację tkanek poprzez kontrolowane uwalnianie leku [7].

W chirurgii kostnej, poza stalą austenityczną, wykorzystywane są

również stopy tytanu. Jednym z najczęściej używanych stopów tytanu jest

stop Ti6Al4V ELI, który wykazuje się dobrym zespołem własności

mechanicznych, sprzyjających uzyskaniu szybkiej osteointegracji. Niestety

stop ten posiada toksyczne pierwiastki glinu i wanadu, które mogą

uwalniać się do organizmu. Badania nad biomateriałami doprowadziły do

powstania stopu Ti6Al7Nb [1]. Pomimo dobrych właściwości stopów

tytanu – dobra odporność na korozję – nadal trwają prace nad modyfikacją

powierzchni tych stopów, w celu polepszenia ich własności mechanicznych,

chemicznych i biologicznych [8-10]. Jest to spowodowane zwiększającą się

liczbą pacjentów, u których wystąpiły reakcje na produkty ich degradacji,

w tym Ti i Al. Dużą uwagę w ostatnich latach przyciągnęły polimery

biodegradowalne, które dzięki wchłanialności przez organizm mogą być

stosowane w medycynie.

W celu zmiany właściwości oraz zapobieganiu korozji możliwe jest

naniesienie na powierzchnię stopu tytanu powłoki ochronnej, czyli powłoki z

polimeru biodegradowalnego. Naniesiona na powierzchnię stopów warstwa

ma za zadanie podwyższenie odporności na korozję, zwiększenie

biokompatybilności lub też uwalnianie leków do otaczających implant tkanek.

Dla implantów o złożonej budowie lub skomplikowanej geometrii, małych

części lub wyrobów o małej grubości nanoszenie warstwy polimerowej

najczęściej następuje z wykorzystaniem metody zanurzeniowej. Metodę tę

cechuje przede wszystkim prostota i łatwość wykonania [12].

Polimery biodegradowalne w większości zbudowane są z biokom-

patybilnych monomerów L-laktydu, glikolidu, p-dioksanonu i kaprolaktonu

[11]. Poli(L-laktyd-ko-gliokolid) jest jednym z najczęściej stosowanych

polimerów biodegradowalnych na powierzchnię metalowego implantu.

Determinuje to powszechna dostępność tego alifatycznego poliestru

w handlu, który dodatkowo zatwierdzony jest przez FDA. PLGA jest

syntetyzowany z kopolimeryzacji z otwarciem pierścieni dwóch

monomerów: kwasu glikolowego i kwasu mlekowego. Typowymi

katalizatorami tej reakcji są: cyna (II) i etyloheksan cyny (II), alkoholany

lub izopropanol [13]. Jednakże, należy zauważyć, że dostępny w handlu

poliester powszechnie syntetyzuje się stosując związki cynowe jako

inicjatory – zazwyczaj Sn(oct)2, który może być toksyczny [14].



347

2. Cel pracy

Celem przeprowadzonych badań było określenie wpływu naniesionej

warstwy biodegradowalnego polimeru PLGA na proces degradacji

biomateriału metalowego (stopów tytanu). W pracy przedstawiono wyniki

badań wpływu środowiska korozyjnego (roztworu Ringera) na proces

korozji implantów metalowych pokrytych warstwą poli(D,L-laktyd-ko-

glikolidu). Na podstawie przeprowadzonej analizy danych literaturowych

można stwierdzić, że dotychczas nie analizowano tego typu zagadnienia.

Ocenie poddano powierzchnię implantów, odporność korozyjną

metalowego podłoża po długotrwałej ekspozycji na środowisko korozyjne

oraz gęstość jonów metali przenikających do roztworu.

3. Materiał i metodyka badań

Materiał: Do badań wytypowano próbki ze stopu tytanu Ti6Al4V ELI

oraz Ti6Al7Nb o składzie chemicznym, strukturze i własnościach mecha-

nicznych zgodnych odpowiednio z normami ASTM F 136-08e1 oraz ISO

5832-11. Skład chemiczny badanych stopów przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 1. Skład chemiczny stopów tytanu: Ti6Al4V ELI i Ti6Al7Nb

Stop

tytanu

Stężenie pierwiastków, %

N C H Fe O Al V Nb Ta Ti

Ti6Al4V

ELI

max.

0,05

max.

0,08

max.

0,012

max.

0,25

max.

0,13

5,5-

6,5

3,5-

4,5 - - reszta

Ti6Al7Nb max.

0,05

max.

0,08

max.

0,009

max.

0,25

max.

0,20

5,5-

6,5 -

6,5-

7,5

max.

0,5 reszta

Źródło: Normy ASTM F 136-08e1 oraz ISO 5832-11

Próbki pobrano z prętów o średnicy 6 mm. Przed nałożeniem polimeru,

powierzchnię stopów tytanu poddano szlifowaniu na papierach o gradacji:

120, 320 i 600 oraz utlenianiu anodowemu, w kąpieli zawierającej kwas

fosforowy i siarkowy, przy napięciu U = 97 V i czasie t = 2 min. Następnie

przy współpracy z Centrum Materiałów Polimerowych i Węglowych PAN

w Zabrzu naniesiono warstwę PLGA, metodą zanurzeniową. Próbki zostały

zanurzone w roztworze PLGA i dichlorometanu, na czas 30 sekund (w celu

usunięcia nieprzereagowanych monomerów, zanieczyszczenia wytrącono

z wykorzy-staniem alkoholu metylowego [15]), a następnie materiał

osuszono pod ciśnieniem, do czasu odparowania rozpuszczalnika.


348

Część próbek została poddana ekspozycji w roztworze Ringera,

o składzie przedstawionym w tabeli 2, przez okres 90 dni, w temperaturze

T = 37 ± 1 oC.

Tabela 2. Skład chemiczny roztworu Ringera

Związek Zawartość

Chlorek sodu (NaCl) 8,60 g/dm3

Chlorek wapnia (KCl) 0,30 g/dm3

Chlorek wapnia dwuwodny (CaCl2*2H2O) 0,33 g/dm3

Źródło: firma B. Braun Melsungen AG

Dla każdej próbki przeprowadzono: obserwacje mikroskopowe, badania

potencjodynamiczne oraz zbadano przenikalność jonów do roztworu.

Obserwacje makroskopowe: W celu określenia zmian zachodzących na

powierzchni implantów metalowych, dokonano obserwacji makrosko-

powych. Obserwacje makroskopowe przeprowadzono dla próbek przed

procesem degradacji (w stanie wyjściowym), jak i po badaniach koro-

zyjnych. Oględziny powierzchni próbek wykonano na mikroskopie stereo-

skopowym firmy ZEISS – SteREO Discovery V.8 z oprogramowaniem

AxioVisionAxio-CamERc. Badanie przeprowadzono w zakresie powięk-

szenia od 3x do 24x.

Badania potencjodynamiczne: W celu określenia wpływu powłoki

polimerowej na odporność korozyjną metalu, przeprowadzono dla próbek

ze stopów tytanu badania potencjodynamiczne. Badania odporności na

korozję wżerową przeprowadzono zgodnie z normą PN-EN ISO 10993-15,

w roztworze Ringera (T = 37 ± 1 oC, pH = 6,8 ± 0,2), dla próbek po

90-dniowej ekspozycji na środowisko korozyjne. Do badań wykorzystano

potencjostat PGP-201 firmy Radiometer Analytical SAS. Elektrodą

odniesienia była nasycona elektroda kalomelowa NEK typu KP-113,

natomiast elektrodą pomocniczą − drut platynowy PtP-201.

W ramach badań potencjodynamicznych zarejestrowane zostały krzywe

polaryzacji anodowej. Badania rozpoczęto od wyznaczenia potencjału

otwarcia EOCP przez okres 2 godzin. Potencjał początkowy od którego

rejestrowano krzywe polaryzacji anodowej wynosił EINIT = – 100 mV,

a szybkość zmian potencjału wynosiła 3 mV/s. Krzywe rejestrowano do

momentu uzyskania gęstości prądu równej 1 mA/cm2 lub do momentu

osiągnięcia maksymalnej wartości zakresu pomiarowego +4094 mV,

następnie zmieniano kierunek polaryzacji i rejestrowano krzywą powrotną

[9]. Do wyznaczania wartości charakteryzujących odporność korozyjną

badanych próbek zastosowano metodę Sterna. Wyznaczono wielkości

potencjału korozyjnego Ekor oraz oporu polaryzacyjnego Rp.



349

Gęstość jonów metali przenikających do roztworu: W celu dokonania

oceny szczelności nałożonej warstwy powierzchniowej z poli (D,L-laktyd-

ko-glikolidu) na powierzchnie stopów tytanu, przeprowadzono badania

stężenia jonów metalowych, które przeniknęły do roztworu. Każdą

z próbek w okresie 90 dni, zanurzono w 100 ml roztworu fizjologicznego

Ringera. Ilość jonów przenikających do roztworu zmierzono za pomocą

spektrometru JY 2000, firmy Yobin – Yvon, wykorzystujące metodę emi-

syjnej spektrometrii atomowej z plazmą wzbudzoną indukcyjnie (ICP-AES).

Przy sporządzaniu krzywej wzorcowej wykorzystano rozcieńczone

materiały wzorcowe firmy Merck. Oznaczono ilość stężenia jonów: Ti, Al,

V, Nb. Stężenie jonów metalu przeliczono na masę pierwiastka

przenikającego z jednostkowej powierzchni próbki (µg/cm2).

4. Analiza wyników

Obserwacje makroskopowe: Na podstawie obserwacji makroskopowych

próbek (w stanie wyjściowym) zaobserwowano: nierówności, nieciągłości

oraz zróżnicowaną topografię warstwy polimerowej. Zauważalna jest

również niejednorodność powłoki polimerowej oraz zniekształcenia

powierzchni polimeru. Stwierdzono również występowanie nielicznych

pęcherzyków powietrza. Zaobserwowane defekty występują w postaci

miejscowych zacieków, wskutek zastosowania metody zanurzeniowej oraz

spowodowane są także sposobem przechowywania próbek. Zauważono

także uszkodzenia mechaniczne powierzchni metalowej powstałe przed

nałożeniem PLGA, powstałe podczas wstępnej obróbki powierzchniowej.

Wyniki obserwacji makroskopowych przedstawiono na rysunkach 1 i 2.

Zróżnicowane zabarwienie badanego materiału jest wynikiem procesu

utleniania anodowego. Zróżnicowana grubość warstwy polimeru PLGA

naniesionego na próbki jest efektem niedoskonałości metody zanu-

rzeniowej Największą grubość warstwy polimerowej obserwowano na

brzegach próbki.

a)


350

Rysunek 1. Makroskopowy obraz próbki ze stopu Ti6Al7Nb, szlifowanej i utlenianej anodowo

a) obraz próbki, b) widoczne zarysowanie metalowego podłoża, c) niejednorodność w warstwie

polimeru, zacieki d) obraz makroskopowy próbki przy krawędzi, widoczny ślad po uchwycie

podczas procesu utleniania anodowego

Rysunek 2. Wyniki obserwacji makroskopowej próbek po nałożeniu warstwy polimeru,

a) widoczny pęcherz powietrza – materiał: Ti6Al4V ELI, b) zarysowania powierzchni

– stop Ti6Al7Nb



351

Dokonując porównania powierzchni podłoża metalowego zauważono,

że powierzchnia próbek ze stopu Ti6Al7Nb charakteryzowała się większą

ilością uszkodzeń mechanicznych na powierzchni materiału bazowego

w porównaniu do próbek z Ti6Al4V ELI.

Powierzchnia próbek po długotrwałej ekspozycji na środowisko korozyjne

wykazała wzrost, względem stanu wyjściowego, liczby uszkodzeń warstwy

PLGA niezależnie od rodzaju podłoża. Wyniki obserwacji makroskopowych

powierzchni próbek po ekspozycji w płynie fizjologicznym przedstawiono na

rysunku 3.

Rysunek 3. Powierzchni próbek metalowych z powłoką polimerową po 90-dniowej ekspozycji

na środowisko korozyjne i badania potencjodynamiczne, a) roztworzenie warstwy na końcu

próbki – Ti6Al4V ELI, b) przebarwienia – Ti6Al4V ELI, c) roztworzenie warstwy polimerowej

na końcu próbki – Ti6Al7Nb, d) powierzchnia po ekspozycji – Ti6Al7Nb

Długotrwała ekspozycja próbek w środowisku korozyjnym spowodowała

częściowe przebarwienie i zmatowienie powłoki polimerowej, co wskazuje na

zachodzące zmiany w warstwie polimerowej. Zaobserwowano również

zwiększenie nieciągłości powłoki polimerowej, nie zaobserwowano natomiast

na powierzchni zmian korozyjnych, co świadczy o dobrych właściwościach

ochronnych powłoki PLGA.

Badania potencjodynamiczne: Przeprowadzone badania potencjo-

dynamiczne wykazały odporność na korozję wżerową stopów tytanu


352

z powłoką polimerową. Zaobserowano również zróżnicowaną wartość

parametrów dla próbek o powierzchni poddanej procesowi szlifowania

i utleniania anodowego oraz z nałożoną warstwą biodegradowalnego polimeru

PLGA. Zarejestrowane, charakterystyczne krzywe polaryzacji próbek ze

stopów Ti6Al4V ELI oraz Ti6Al7Nb z warstwą polimeru przedstawiono na

rysunku 4. Na podstawie krzywych polaryzacji anodowej dla próbek Ti6Al4V

ELI, Ti6Al7Nb oraz dla próbek pokrytych warstwą polimerową, wyznaczone

wartości potencjału korozyjnego Ekor oraz oporu polaryzacyjnego Rp

przedstawiono w tabeli 3.

Rysunek 4. Typowe krzywe polaryzacji anodowej, 1) Ti6Al4V ELI + PLGA, 2)

Ti6Al7Nb + PLGA

Dla wszystkich badanych próbek ze stopów tytanu stwierdzono perfek-

cyjną pasywację w całym zakresie pomiarowym oraz nie stwierdzono

występowania pętli histerezy i potencjału przebicia, co wskazuje na brak

rozwoju korozji wżerowej na powierzchni badanego materiału. Zauważono

znaczy wzrost oporu polaryzacyjnego, niezależnie od materiału, dla próbek

pokrytych warstwą polimeru PLGA w stosunku do stanu wyjściowego, co

świadczy o lepszej ochronie metalowego podłoża przed korozją. Najwyższą

wartość potencjału korozyjnego uzyskano dla próbek Ti6Al4V – nie-

pokrytych warstwą polimeru (Ekor=205 mV), natomiast najmniejszą

wartość uzyskano dla tego samego rodzaju stopu, z naniesioną warstwą

polimeru PLGA, (Ekor=-418 mV).

Tabela 3. Wyniki badań potencjodynamicznych dla stopów tytanu: Ti6Al4V ELI i Ti6Al7Nb

Ti6Al4V ELI Ti6Al4V ELI+PLGA Ti6Al7Nb Ti6Al7Nb

+PLGA

Ekor, mV +205(43) -418(40) +99(33) -393(31)

Rp, M cm2 +0,582(25) +1,96(72) +3,41(11) +4,10(27)



353

Długotrwała ekspozycja w środowisku korozyjnym nie zainicjowała zmian korozyjnych na próbkach, co świadczy o dobrych właściwościach ochronnych polimerowej warstwy PLGA.

Stężenie jonów metali przenikających do roztworu: Po 90-dniowym okresie przetrzymywania próbek w roztworze Ringera określono stężenie jonów metali przenikających do roztworu. Wyniki przenikalności jonów przedstawiono w tabeli 4 oraz na rysunku 5. Badanie wykazało, że zarówno dla próbek ze stopów tytanu, poddanych wyłącznie procesowi szlifowania i ulteniania anodowego, jak i dla próbek pokrytych warstwą polimeru PLGA, do roztworu przeniknęły jony metali. Jednakże, dla próbek z warstwą polimeru ilość jonów przenikających do roztworu jest prawie 50-krotnie mniejsza, w porównaniu z próbkami bez warswy PLGA.

Tabela 4. Wyniki gęstości masy jonów metali przenikających do roztworu, g/cm2

Ti6Al4V ELI Ti6Al4V ELI

+PLGA Ti6Al7Nb

Ti6Al7Nb

+PLGA

Ti 45,68(18) 0,726(19) 19,57(24) 0,349(99)

Al 30,21(25) 0,400(28) 2,49(36) 0,251(19)

V 23,73(21) 0,345(47) - -

Nb - - 3,41(39) 0,587(28)

Na podstawie otrzymanych wyników oceniono, iż pokrycie implantu

metalowego biodegradowalnym polimerem znacząco wpływa na ilość

jonów metalicznych przenikających do roztworu. Dla próbek z naniesioną

powłoką biodegradowalnego PLGA znakomicie została ograniczona

przenikalność jonów metali względem próbek bez warstwy

Rysunek 5. Wykres przedstawiający gęstość masy jonów metali przenikających do roztworu

Ringera od powierzchni próbek ze stopów Ti6Al4V ELI, Ti6Al7Nb oraz tych stopów pokrytych

warstwą PLGA


354

5. Podsumowanie

Podsumowując, przeprowadzone badania jednoznacznie wykazały, że

naniesiona powłoka biodegradowalnego polimeru PLGA na podłoże

metalowe spowodowała znaczny wzrost odporności na korozję wżerową

stopów tytanu Ti6Al4V ELI i Ti6Al7Nb oraz znacząco obniżyła kinetykę

degradacji metalowego podłoża, wyznacznikiem czego było stężenie jonów

metali przenikających z metalowego podłoża do środowiska zewnętrznego,

symulującego środowisko organizmu ludzkiego.

Zastosowanie warstwy polimerowej powoduje polepszenie biotolerancji

badanych biomateriałów metalowych, tym samym pozwalając na bez-

pieczne i dłuższe wykorzystywanie implantów.

W dalszej kolejności planowane jest przeprowadzenie badania wpływu

warstwy polimerowej PLGA na odporność korozyjną stali Cr-Ni-Mo oraz

ocena własności mechanicznych biodegradowalnych warstw polimerowych

na biomateriałach metalowych. Planuje się również przeprowadzenie

badania degradacji polimeru.

Podziękowania

Autorzy pracy kierują podziękowania dla pracowników naukowych

Centrum Materiałów Polimerowych i Węglowych PAN w Zabrzu, dzięki

którym naniesiono polimerową powłokę biodegradowalnego PLGA.

Szczególne podziękowania kierujemy panią: dr Joannie Jaworskiej oraz

dr Katarzynie Jelonek za wsparcie merytoryczne.

Literatura

1. Marciniak J., Biomateriały, Wydawnictwo Politechniki Śląskiej, 2013 2. Mahapatro A., Metals for Biomedical Applications and Devices, Journal

of Biomaterials and Tissue Engineering, 2012, 2(4), s. 259-268 3. Łaskawiec J., Michalik R., Zagadnienia teoretyczne i aplikacyjne

w implantach, Wydawnictwo Politechniki Śląskiej, 2002, s. 77-78 4. Biel M., Mikrostruktura i właściwości biomateriałów tytanowych po obróbce

powierzchniowej, praca doktorska, Akademia Górniczo-Hutnicza im. S. Staszica w Krakowie, 2006

5. Szewczenko J., Basiaga M., Kiel-Jamrozik M., Kaczmarek M., Grygiel M., Corrosion Resistance of Ti6Al7Nb Alloy after Various Surface Modifications, Solid State Phenomena, 2015 (227), s. 483-486

6. Argarate N., Olalde B., Atorrasagasti G., Valero J., Cifuentes S. C., Benavente R., Lieblich M., Gonzales-Carrasco J. L., Biodegradable Bi-layered coating on polymeric orthopaedic implants for controlled release of drugs, Materials Letters, 2014 (132), s. 193-195

7. Astete C. E., Sabliov C. M., Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles, Journal of Biomaterials Science – Polymer Edition, 2009, 17(3), s. 247-289



355

8. Sena L. A., Rocha N. C. C., Andrade M. C., Soares G. A., Bioactivity assessment of titanium sheets electrochemically coated with thick oxide film, Surface and Coating Technology, Elsevier, 2003 (166), s. 254-258

9. Szewczenko J., Kształtowanie właściwości fizycznych i chemicznych warstwy wierzchniej implantów ze stopu tytanu dla traumatologii i ortopedii, Wydawnictwo Politechniki Śląskiej, 2014

10. Liu X., Chu P. K., Ding C., Surface modification of titanium, titanium alloys, and related materials for biomedical applications, Materials Science and Engineering, Elsevier, 2004, 47(3-4), s.49-121

11. Bartkowiak-Jowsa M., Będziński R., Chłopek J., Filipiak J., Szafraniec B., Comparative analysis of the deformation characteristics of biodegradable polymers considered as a material for vascular stents, Polimery, 2011, 56 (3)

12. Balcerowska B., Ozgowicz W., Rydarowski H., Szota J., Tkaczyk S., Walczak K., Powłoki ochronne, Politechnika Śląska, 1997

13. Zini E., Scandola M., Dobrzynski P., Kasperczyk. J, Bero M., Shape memory behavior of novel (L-lactide-glycolide-trimethylene carbonate) terpolymers, Biomacromolecules, 2008, 8(11), s. 3661-3667

14. Fang H., Li K., Su T., Yang T., Chang J., Lin P., Chang W., Dip coating assisted polylactic acid deposition on steel surface: Film thickness affected by drag force and gravity, Materials Letters, 2008 (62), s. 3739-3741

15. Strona internetowa BioMatPol sp. z o.o. www.biomatpol.pl/pl/produkty/biocop/biocop-poli-laktydo-ko-glikolid, dostęp z dnia 14.12.2015 r.

Ocena wpływu biodegradowalnej warstwy polimerowej (PLGA) na

korozję podłoża ze stopów tytanu

W pracy przedstawiono wyniki badań wpływu środowiska korozyjnego na proces degradacji

implantów metalowych pokrytych warstwą biodegradowalnego polimeru. Na podstawie przepro-

wadzonej analizy danych literaturowych można stwierdzić, że dotychczas nie analizowano tego

typu zagadnień. Oceniano odporność korozyjną metalowego podłoża po długotrwałej ekspozycji

na środowisko korozyjne oraz ilość produktów degradacji. Ponadto przeprowadzono obserwacje

makroskopowe powierzchni próbek.

Do badań wytypowano próbki ze stopu tytanu Ti6Al4V ELI oraz Ti6Al7Nb o składzie

chemicznym, strukturze i własnościach mechanicznych zgodnych odpowiednio z normami

ASTM F136-08e1 oraz ISO 5832-11. Próbki metalowe poddano obróbce wstępnej (szlifowaniu,

utlenianiu anodowemu), następnie naniesiono powłokę biodegradowalnego polimeru.

Zastosowano biodegradowalny poli(D,L-laktyd-ko-glikolid) składający się w 85%

z kwasu mlekowego i 15 % z kwasu glikolowego, o 20% stężeniu.

Badania odporności na korozję wżerową w roztworze Ringera wykonano metodą potencjo-

dynamiczną. Badania przeprowadzono dla próbek po 90 – dniowej ekspozycji na środowisko

korozyjne. Ilość jonów przenikających do roztworu określano z wykorzystaniem metody emisji

atomowej z plazmą wzbudzoną indukcyjnie ICP-AES. Obserwacje makroskopowe próbek po

badaniach korozyjnych przeprowadzono z wykorzystaniem mikroskopu stereoskopowego.

Na podstawie obserwacji makroskopowych stwierdzono niejednorodność warstwy polimerowej

oraz uszkodzenia mechaniczne próbek powstałe przed nałożeniem PLGA. Powierzchnia próbek

po długotrwałej ekspozycji na środowisko korozyjne wykazała wzrost, względem stanu

wyjściowego, liczby uszkodzeń warstwy PLGA niezależnie od rodzaju podłoża. Naniesienie

warstw polimerowych na podłoże metalowe spowodowało wzrost odporności na korozję

wżerową oraz obniżenie kinetyki degradacji metalowego podłoża, wyznacznikiem czego było


356

stężenie jonów metali przenikających z podłoża do środowiska zewnętrznego. Długotrwała

ekspozycja w środowisku korozyjnym nie zainicjowała zmian korozyjnych na próbkach, co

świadczy o dobrych właściwościach ochronnych polimerowej warstwy PLGA.

Podsumowując, stwierdzono, że warstwa polimeru PLGA wpływa na poprawę odporności

korozyjnej stopów tytanu Ti6Al4V ELI i Ti6Al7Nb oraz ogranicza przenikanie jonów metali do

roztworu symulującego środowisko organizmu ludzkiego. Zastosowanie warstwy polimerowej

powoduje poprawę biotolerancji badanych biomateriałów metalowych.

W dalszej kolejności zostaną przeprowadzone badania wpływu warstwy polimerowej na

odporność korozyjną stali CrNiMo oraz ocena własności mechanicznych biodegradowalnych

warstw polimerowych na biomateriałach metalowych. Planuje się również badania degradacji

polimeru.

Influence of biopolymer layer (PLGA) on degradation process of metal

substrate

The paper presents results of influence of a corrosive environment on degradation process of

metal implants coated with a biodegradable polymer layer. Based on analysis of literature data it

can be said that this type of issues has not been analysed. Metal ion concentration in solution and

corrosion resistance of metal substrate were evaluated after prolonged exposure to the corrosive

environment. In addition, a macroscopic observation of the samples surfaces were conducted.

Ti6Al4V ELI and Ti6Al7Nb titanium alloys samples were used in the tests. Their chemical

composition, structure and mechanical properties met the requirements of ASTM F136-08e1 and

ISO 5832-11 standards respectively. Prior to polymer coating the surfaces of titanium alloys were

ground and additionally subjected to anodic oxidation. Metal substrates were coated with

biodegradable layer of poly(D,L-lactide-co-glycolide) composed of 85% lactic acid and 15%

glycolic acid, at 20% concentration by the dip-coating method.

Resistance to pitting corrosion in the Ringer’s solution was tested by the potentiodynamic

method. Tests were conducted for samples after 90-day exposure to the corrosive environment.

Metal ion concentration in the solution was measured with use of inductively coupled plasma –

atomic emission spectrometry (ICP-AES). The surface observation of the samples before and

after corrosion study was analysed using stereoscopic microscope.

Based on the microscopic observations heterogeneity of the polymer layers and mechanical

damage of samples arose prior the PLGA application were observed. Surface samples after long

term exposure to the corrosive environment showed an increase (in relative to initial state)

number of PLGA’s layer damage independently from the type of metal substrate. The increase in

resistance to pitting corrosion and reduction of degradation kinetics were caused by application of

the polymeric layers on the metal substrate. This is confirmed by low concentration of metal ions

penetrating from substrate to the external environment. Long term exposure in the corrosive

environment did not initiate the changes of corrosion on samples, so this indicates good protective

properties of the PLGA polymer layer.

In conclusion, it was found that the polymer layer positively influences corrosion resistance of the

Ti6Al4V ELI and the Ti6Al7Nb alloys. Furthermore, the amount of metal ions released to the

solution simulating the environment of a human body was reduced. Application a polymer layer

improved biocompatibility of the studied biomaterials.

Subsequently, a study of influence of polymer layer on corrosion resistance of stainless steel will

be carried out. Evaluation of mechanical properties of biodegradable polymeric layers on metal

biomaterials will be performed as well. Studies of polymer degradation are also planned.

357

Adrian Dubicki1

Współcześnie stosowane metody przywrócenia

utraconych w wyniku schorzeń i uszkodzeń

funkcji miednicy

1. Wstęp

Ostatnimi laty możemy spotkać się z coraz częstszymi przypadkami

osób z problemami układu mięśniowo-szkieletowego, z anomaliami

struktury kostnej. Mogą być one wywołane poprzez zmiany

zwyrodnieniowe, onkologiczne czy też urazy. Nieustannie rosnące tempo

życia sprawia, że mamy coraz mniej czasu żeby zadbać o to co jest

najważniejsze - o nasze zdrowie. Pomimo wysyłanych przez organizm

sygnałów, wielu ludzi bagatelizuje problem i zgłasza się do lekarza już

z zaawansowanymi zaburzeniami. Medycyna w takich przypadkach

wypracowała szereg standardowych rozwiązań, lecz często rozległość

uszkodzeń nie pozwala na ich zastosowanie. W takich przypadkach coraz

częściej stosowanym rozwiązaniem są implanty indywidualne.

2. Cel pracy

Celem niniejszej pracy jest przedstawienie współcześnie stosowanych

metod leczenia, mających na celu przywrócenie utraconych funkcji

miednicy. Do każdej metody przypisane zostały schorzenia i uszkodzenia,

przy których jest ona najczęściej stosowana.

Szczególną uwagę poświęcono implantom indywidualnym, które są

często jedynym ratunkiem dla pacjentów z zaawansowanymi zmianami lub

uszkodzeniami.

3. Metody przywrócenia funkcji miednicy

We współczesnej medycynie możemy zaobserwować wypracowane na

przestrzeni lat liczne, standardowe procedury leczenia dysfunkcji miednicy.

Niestety w niektórych przypadkach, zaawansowanie zmian nie pozwala na

ich zastosowanie. Tacy pacjenci wymagają intensywnej, spersonalizowanej

terapii.

1 [email protected], Katedra Inżynierii Materiałowej i Biomedycznej, Wydział

Mechaniczny, Politechnika Białostocka, www.pb.edu.pl

mailto:[email protected]

http://www.pb.edu.pl/

Adrian Dubicki

358

Do standardowych, stosowanych w obrębie obręczy kończyny dolnej,

nieinwazyjnych procedur leczenia, można zaliczyć leczenie

farmakologiczne, unieruchomienie opatrunkiem gipsowym lub wyciągiem

oraz rehabilitację. Każda z tych form kuracji stosowana jest w innych

przypadkach [1].

Leczenie farmakologiczne stosowane jest, wraz z odciążeniem chorej

kości, przy jałowej martwicy kości. Wykorzystywane niesteroidowe środki

przeciwzapalne pozwalają na złagodzenie bólu i zahamowanie

rozprzestrzeniania się stanu zapalnego. Niekiedy w przypadku tego

schorzenia podaje się również, zapobiegające obumieraniu tkanki kostnej

leki, stosowane przy leczeniu osteoporozy [2].

Farmakologiczne leczenie ma również miejsce w przypadku terapii

onkologicznych, wymagających często leczenia skojarzonego. W skład

takiej formy leczenia wchodzi radioterapia i chemioterapia oraz chirurgia.

Mają one na celu zniszczenie komórek nowotworowych poprzez ich

usunięcie (chirurgia), naświetlanie (radioterapia) oraz podanie leków

(chemioterapia). Obecnie lekami o najlepszej skuteczności są

bisfosfoniany, powodujące ograniczenie możliwości przerzutów komórek

oraz zahamowaniem ich rozrostu w ognisku choroby. Charakteryzują się

one dwutorowym działaniem - wbudowują się w kość, wzmacniając jej

strukturę oraz ograniczają namnażanie i rozprzestrzenianie komórek

kościogubnych. Skuteczność leczenia w przypadku choroby nowotworowej

jest mocno zależna od rodzaju nowotworu i jego zaawansowania [1, 3].

Jednym ze stosowanych unieruchomień kości są opatrunki gipsowe.

Obecnie wykorzystywane są coraz rzadziej, głównie przy rozejściu się

spojenia łonowego oraz złamaniach kości łonowej i kulszowej, gdy nie

wystąpią znaczne ich przemieszczenia i nie dojdzie do obrażeń narządów

wewnętrznych. W większości przypadków wystarczające jest odciążenie

miednicy poprzez leżenie pacjenta w łóżku lub stosowanie opasek

elastycznych. Ze względu na kształt jaki przybierają opatrunki gipsowe,

obejmując cały uszkodzony odcinek ciała, nazywane są one opatrunkami

okrężnymi. Niemal zawsze posiadają podściółkę z bandaży lub waty, aby

zminimalizować ryzyko wystąpienia podrażnień i otarć skóry [1].

Podczas zakładania opatrunku gipsowego, należy zawsze zwrócić

szczególną uwagę na odciążanie wypukłych fragmentów kostnych

(m.in. okolicy kości krzyżowej), a po jego zastosowaniu na możliwość

powstania obrzęków, zaburzeń krążenia i unerwienia, które wymagają

natychmiastowego jego usunięcia. Założony opatrunek unieruchamiający nie

powinien być też zbyt obcisły lub luźny, gdyż nie spełni wtedy swojej roli [1].

Do nastawienia odłamów kostnych i utrzymania ich w odpowiedniej

pozycji stosowane są również wyciągi. Dzieli się je na bezpośrednie

i pośrednie. Bezpośrednie mocowane są do metalowych elementów


w wyniku schorzeń i uszkodzeń funkcji miednicy

359

wprowadzanych, wkręcanych w kość, a pośrednie zewnętrznie, do skóry

przy pomocy klejów lub z wykorzystaniem pętli czy specjalnego obuwia [1].

W leczeniu, a dokładniej osiągnięciu optymalnego poziomu

funkcjonowania fizycznego i zmniejszenia dolegliwości, często stosowana

jest rehabilitacja. Dzieli się ją na opartą o wykonywanie ćwiczeń

kinezyterapię oraz na wykorzystującą czynniki fizykalne fizykoterapię.

Głównym celem jest przywrócenie w jak największym zakresie sprawności

fizycznej, ale i psychicznej sprzed choroby. Metody fizykalne pomagają

ponadto w uśmierzeniu towarzyszących chorobom kostnym silnych bóli,

w zmniejszeniu odczynów zapalnych oraz zniwelowaniu napięcia mięśni [1].

Przedstawione powyżej metody stosowane są w łagodnych, nie

zaawansowanych dysfunkcjach miednicy. Bardziej złożone, zaawansowane

zmiany chorobowe, czy urazy wieloodłamowe wymagają bardziej

skomplikowanego, często chirurgicznego leczenia. Konieczne może się

okazać zastosowanie implantów kostnych (płytek, wkrętów kostnych,

gwoździ śródszpikowych) lub endoprotez. Najcięższe przypadki mogą

wymagać opracowania spersonalizowanych wszczepów, wykonywanych

pod konkretnego pacjenta. Dostępne rozwiązania dotyczące wszczepianych

podczas zabiegów chirurgicznych implantów zostały przedstawione

w poniższych podrozdziałach.

3.1. Osteosynteza złamań kości

Jedną z operacyjnych metod zespolenia złamań kości jest osteosynteza.

Jest to proces zespolenia kości we właściwym ustawieniu, podczas zabiegu

chirurgicznego, z użyciem metalowych implantów dokostnych (np. płytek,

wkrętów, klamer, gwoździ), wykonanych z niewywołujących po ich

wprowadzeniu do organizmu niekorzystnych reakcji (m.in. stanów

zapalnych) materiałów biozgodnych [4].

Początkowe próby stosowania osteosyntezy polegały na operacyjnym

nastawieniu kości i ich zespoleniu przy użyciu drutów i gwoździ, co nie

było dobrym mechanicznie rozwiązaniem. Współczesne rozwiązania

zostały zaprojektowane przez szwajcarską organizację Arbeitsgemeinschaft

für Osteosynthesefragen (A-O), która nadal nadzoruje ich rozwój.

Osteosynteza często jest nazywana zespoleniem A-O, od nazwy

wspomnianej organizacji. Stabilizujące implanty dokostne pozwalają na

leczenie złamania, bez konieczności stosowania unieruchomień

zewnętrznych (np. gipsowych). Umożliwia to rozpoczęcie wczesnej

rehabilitacji ruchowej [1].

Bezwzględnym wskazaniem do stosowania operacyjnego zespolenia

kości są złamania otwarte i nienastawialne lub niezdolne do utrzymania

nastawienia odłamów oraz powodujące uszkodzenie tkanek i narządów

Adrian Dubicki

360

wewnętrznych. Rozwój chirurgii i anestezjologii spowodował że

operacyjną stabilizację stosuje się także w przypadkach złamań:

- możliwych do nastawienia, z zagrożeniem przemieszczenia odłamów,

- przez stawowych z przemieszczeniami odłamów,

- wielomiejscowych, wieloodłamowych (zdruzgotania kości).

Takie typy uszkodzeń kości wymagają dokładnego nastawienia oraz

wczesnego podjęcia procesu rehabilitacji, co pomimo ryzyka zakażenia

sprawia, że osteosynteza jest w tych przypadkach chętnie stosowana [1, 5].

Podczas operacyjnego zabiegu osteosyntezy należy spełnić następujące

warunki:

- prawidłowe, anatomiczne nastawienie odłamów,

- stabilne zespolenie, bez ruchomości odłamów,

- obciążenia przenoszone przez odłamy, nie przez implanty stabilizujące,

- zachowanie stabilności zespolenia do czasu zrostu kości.

Przedstawione warunki są bardzo ważne, niezbędne dla prawidłowości

przeprowadzanej terapii osteosyntezy, skutkującej otrzymaniem

prawidłowego i wytrzymałego zrostu kostnego [1].

W zależności od tego czy elementy wchodzące w skład stabilizatora

znajdują się w trakcie terapii wewnątrz organizmu czy na zewnątrz,

dokonuje się podziału na osteosyntezę stabilną wewnętrzną oraz

osteosyntezę zewnętrzną [1].

3.1.1. Osteosynteza stabilna wewnętrzna

W zależności od elementu pełniącego funkcję stabilizatora, osteosyntezę

stabilną wewnętrzną dzieli się na zespolenia za pomocą śrub (dociskowe),

płytek (osiowe) lub gwoździ śródszpikowych. Wszystkie odpowiadające

sobie implanty ortopedyczne, niezależnie od firm je produkujących,

charakteryzują się podobną budową, a różnią się tylko drobnymi

szczegółami. Większe różnice można zaobserwować w konstrukcji

dostarczanego instrumentarium, chociaż narzędzia te wykorzystywane są

do tych samych celów [1, 6].



361

Rysunek 1. Stabilizacja przy użyciu płytek i długich wkrętów kaniulowanych [6]

Większość przypadków złamań miednicy wymaga zastosowania

zarówno śrub jak i płytek stabilizujących. Czasami zdarza się, że do

zespolenia mogą być wykorzystane tylko śruby, głównie krótkie. Takie

rozwiązanie stosowane jest przy nieskomplikowanych złamaniach,

w których wystarczające jest przeważnie unieruchomienie, ale przy okazji

operacyjnej stabilizacji poważniejszych dysfunkcji, dokonuje się również

utwierdzenia takiego odłamu. Długie, dodatkowo kaniulowane (wydrążone

na całej długości w celu zastosowania prowadnic z drutu Kirschner’a)

śruby mogą być samodzielnie stosowane do złamań kości krzyżowej.

W pozostałych przypadkach wykorzystuje się je również w połączeniu

z płytkami (rys. 1) [7].

Płytki do osteosyntezy stabilnej miednicy (rys. 2) występują w różnych

rozmiarach, kształtach i konfiguracjach rozmieszczenia otworów.

Projektowane są w taki sposób, aby możliwe było ich zastosowanie

w złamaniach występujących w każdym rejonie miednicy [6, 7, 8].

Rysunek 2. Zestawy płytek do stabilizacji wewnętrznej kości miednicy (A - Stryker, B - DePuy

Synthes) [6 ,7]

Adrian Dubicki

362

We współpracy z lekarzami, firmy ortopedyczne produkują płytki

i wkręty tak, aby zapewnić ich odpowiedni kształt oraz możliwość jego

zmiany w trakcie zabiegu (rys. 3). Wykonane implanty muszą również

charakteryzować się odpowiednią wytrzymałością, odpowiednim przenie-

sieniem sił oraz biozgodnością [7].

Rysunek 3. Dostosowanie kształtu płytki przy użyciu wyginaka wielopłaszczyznowego [8]

Wgłębienia występujące pomiędzy otworami sprawiają że płytki mają

mniejszą masę, ale przede wszystkim pozwalają na ich płynne

wyprofilowanie. Gdyby nie stosowano tego rozwiązania, płytka podczas jej

profilowania zginałaby się w miejscu otworu.

Większość oferowanych płytek posiada wewnątrz otworu

nagwintowaną powierzchnię. Pozwala to, w połączeniu ze specjalnym

wkrętem kostnym, na zablokowanie płytki w wybranym położeniu. Płytki

takie nazywane są blokowanymi (rys. 4) [8]. Pierwszy raz takie

rozwiązanie zastosowano w polskich systemach Zespol i Polfix. Pozwalają

one na zablokowanie położenia płytki np. nad kością, dzięki czemu nie

występuje bezpośredni nacisk na nią i nie dochodzi do uszkodzeń okostnej.

Dodatkowo umożliwiają one wprowadzanie wkrętów do kości pod kątem

nawet 35o [1].



363

Rysunek 4. Płytki blokowane do osteosyntezy Stryker (A - możliwość wprowadzania wkrętów do

kości pod kątem, B - gwintowany otwór, umożliwiający blokowanie położenia płytki) [7]

W przypadku stosowania płytek blokowanych należy unikać

nadmiernego wyginania i deformowania otworów. Znaczne zniekształcenie

może prowadzić do uszkodzenia gwintu w otworze i utraty możliwości

blokowania płytki [8].

Jednym z rodzajów osteosyntezy stabilnej wewnętrznej jest zespolenie

śródszpikowe. Polega ono na rozwierceniu jamy szpikowej i wprowadzeniu

gwoździ o odpowiedniej średnicy lub bezpośrednim (bez rozwiercania)

umieszczeniu w jamie prętów, np. Endera. Zespolenie śródszpikowe

stosowane jest do leczenia złamań kości długich. W stabilizacji kości

miednicy ta metoda nie znalazła jednak zastosowania [1, 5].

3.1.2. Osteosynteza zewnętrzna

Osteosynteza zewnętrzna jest metodą pozwalającą na działanie poza

ogniskiem złamania. Przyczynia się do zmniejszenia ryzyka powstania

powikłań biologicznych w przypadkach, w których interwencja chirurgiczna

w miejscu urazu może pogłębić istniejące zaburzenie. Zakładany ponad

skórą aparat, pozwala uniknąć wprowadzania elementów metalowych

w miejsce złamania, co mogłoby przyczynić się do powstania kolejnych

uszkodzeń, powstania odczynu zapalnego czy alergicznego [1, 5].

Pierwsza koncepcja tego typu stabilizacji miednicy pojawiła się w 1897

roku, a jej autorem był Clayton Parkhill. Przez lata była ona mody-

fikowana, aż w 1950 roku została po raz pierwszy zastosowana przez

Pennalla i Sutherlanda. Na przestrzeni lat stwierdzono, że zastosowanie

stabilizacji zewnętrznej przyczynia się do zmniejszenia liczby przypadków

śmiertelnych u osób po urazach miednicy. Zmniejszyła się również liczba

krwi potrzebna do transfuzji podczas operacyjnego nastawiania i unieru-

chamiania złamania [9].

Adrian Dubicki

364

Osteosynteza zewnętrzna może być wykorzystana w różnych fazach

leczenia chorych ze złamaniami miednicy. Stosowana może być na etapach:

- postepowania resuscytacyjnego (do kontroli krwawienia),

- tymczasowej stabilizacji złamań (umożliwiająca transport chorego),

- pierwotnej lub ostatecznej stabilizacji dla niektórych typów złamań.

Przeciwskazaniem do stosowania metody jest rozwinięta choroba

osteoporotyczna lub ryzyko uszkodzenia czy demontażu stabilizatora przez

pacjenta. Wykorzystaniu stabilizatorów zewnętrznych mogą towarzyszyć

problemy związane z utratą repozycji, odpowiedniego nastawienia kości

i utrzymaniem stabilizatora w odpowiednim położeniu przez kilka,

kilkanaście tygodni oraz powstające miejscowe infekcje wokół wszczepów

i powikłania ogólnoustrojowe [9].

Do stabilizacji miednicy mogą być wykorzystane aparaty

jednopłaszczyznowe lub dwupłaszczyznowe. Zbudowane są najczęściej

z głowic, które są miejscem łączenia stabilizator-kość (za pomocą wkrętów

kostnych, bądź drutów Kirschner’a) oraz elementów nośnych, które

przenoszą obciążenia między odłamami kostnymi (belki, pierścienie). Taka

budowa pozwala na dowolną konfigurację aparatu stabilizującego [1, 5].

Rysunek 5. Przykłady stabilizatorów zewnętrznych wykorzystywanych do osteosyntezy

miednicy (A - ChM, B - Stryker, C - DePuy Synthes) [6, 7, 10]

Większość firmy produkujących implanty, posiada w swojej ofercie

aparaty do stabilizacji zewnętrznej. Wykorzystują one możliwość modułowej

budowy takich stabilizatorów, projektując aparaty z możliwością ich

regulacji i dostosowania do rodzaju i miejsca lokalizacji złamania. Na

powyższym rysunku 5 przedstawiono przykładowe stabilizatory zewnętrzne

firmy ChM, Stryker i DePuy Synthes [6, 7, 10].

Stabilizatory zewnętrzne mogą być stosowane w przypadkach

przerwania ciągłości spojenia łonowego i stawu biodrowo-krzyżowego oraz

złamań kości kulszowej i łonowej. Odpowiednio przestrzennie zbudowana

konstrukcja stabilizatora i wprowadzone do kości wszczepy, pozwalają na



365

ustabilizowanie złamania oraz wczesną jego dynamizację poprzez

umożliwienie pacjentowi poruszania się [10].

3.2. Endoprotezoplastyka

Jednym z najczęściej wykonywanych zabiegów ortopedycznych jest

endoprotezoplastyka stawu biodrowego, nazywana również alloplastyką.

Zabieg ten polega na przywróceniu uszkodzonemu stawowi utraconych

czynności, poprzez wprowadzenie do organizmu elementów obcych,

tworzących zamiennik zdegradowanych powierzchni stawowych.

Wszystkie elementy wchodzące w skład endoprotez, muszą być

wykonywane z materiałów biozgodnych, takich jak metale i ich stopy,

tworzywa sztuczne czy ceramika [11].

Koncepcja endoprotez stawu biodrowego została opracowana ok. 1890

roku przez niemieckiego lekarza, polskiego pochodzenia – Themistoklesa

Glucka. Pierwsze wszczepiane przez niego protezy wykonywane były

z kości słoniowej. Do lat pięćdziesiątych XX wieku, czyli do czasu kiedy to

rozpoczęto próby stosowania materiałów konstrukcyjnych, przepro-

wadzano próby używania w endoprotezoplastyce materiałów takich jak

szkło, żywice fenolowe, a nawet kauczuk. Dopiero rozwój inżynierii

biomedycznej spowodował wypracowanie materiałów stosowanych

(z modyfikacjami) do czasów współczesnych. Do takich materiałów należą:

- stal nierdzewna (316L),

- stop CoCrMo (Vitalium (obróbka plastyczna), Endocast (odlewniczy)),

- stop tytanu (Ti6Al4V),

- ceramiki (ZrO2, Al2O3),

- tworzywa sztuczne (polimetakrylan metylu (PMMA), polietylen

(PE-UHMW, HDPE).

Oprócz posiadania wymaganej biozgodności, pozwalają one na

otrzymanie odpowiednich właściwości tribologicznych (elementy trące

endoprotez wymagają zastosowania materiałów zapewniających zarówno

niski współczynnik tarcia, jak też wysoką odporność na zużycie, co jest

przedmiotem badań i analiz tribologii) [12].

Głównym celem zabiegu alloplastyki jest zniesienie przewlekle

trwającego bólu stawu oraz przywrócenie jego prawidłowych funkcji. Do

schorzeń, które mogą doprowadzić do konieczności wykonania

endoprotezoplastyki należą:

- choroby zwyrodnieniowe stawu biodrowego,

- choroby reumatyczne,

- skomplikowane i powikłane złamania miednicy i kości udowej

(bliższy koniec),

- martwice w obrębie miednicy i głowy kości udowej,

Adrian Dubicki

366

- nowotwory kości.

Pierwszym etapem leczenia może być zastosowanie metod

farmaceutycznych, rehabilitacji i ćwiczeń oraz stosowanie sprzętu

pomocniczego. Jeżeli te zabiegi nie przyniosą rezultatów, przeprowadza się

alloplastykę stawu [13, 14].

Od czasów powstania pierwszych endoprotez, zostały wypracowane

dziesiątki rozmaitych rozwiązań, różniących się budową, materiałem i

sposobem mocowania. Obecnie stosowane endoprotezy można podzielić ze

względu na:

- zasięg implantacji:

- endoprotezy połowiczne (częściowe),

- endoprotezy całkowite:

- endoprotezy trzpieniowe,

- endoprotezy do kapoplastyki;

- konstrukcje panewki:

- endoprotezy z panewką jednolitą,

- endoprotezy z panewką modułową;

- konstrukcje trzpienia:

- endoprotezy jednolite (stałe połączenie głowa-trzpień),

- endoprotezy dzielone (głowa z trzpieniem połączona na wcisk);

- mocowanie w kośćcu:

- endoprotezy cementowe,

- endoprotezy bezcementowe.

Stosowanie danego rodzaju endoprotez jest uzależnione od wielu

czynników. Podstawowym jest rodzaj schorzenia, ale wpływ ma również

wiek chorego czy poziom jego aktywności fizycznej [11, 14].

Endoprotezy całkowite, są najczęściej stosowanymi rodzajami

implantów stawowych. Podczas zabiegu endoprotezoplastyki wymianie

podlegają zarówno panewka, jak i głowa kości udowej. W skład takich

implantów wchodzi trzpień z głową stałą lub nakładaną oraz panewka

jednolita lub modułowa (z wkładką z tworzywa). Stosowane są one

w przypadku zaawansowanych zmian zwyrodnieniowych stawów lub

rzadziej, złamania szyjki kości udowej. Podczas zabiegu usuwana jest

głowa i szyjka kości udowej oraz powierzchnie stawowe panewki stawu

biodrowego. W jamie szpikowej kości udowej formowany jest odpowiedni

otwór, odpowiadający kształtowi trzpienia. Następnie w przygotowane

struktury, mocowane są elementy endoprotezy. Mocowanie może odbywać

się przy udziale cementu kostnego lub poprzez wciśnięcie i późniejszą

integrację, przerośnięcie tkanką kostną porowatej powierzchni implantu.

Postępowanie przy całkowitej endoprotezoplastyce przedstawione zostało

na rysunku 6.



367

Rysunek 6. Schemat postępowania w przypadku alloplastyki całkowitej [11]

Endoprotezy połowiczne (rys. 7) są stosowane głównie u osób

starszych, u których nie ma znacznych uszkodzeń powierzchni stawowych

panewki, a doszło do urazu i złamania szyjki kości udowej. Podczas

zabiegu zachowywana jest panewka, a wymianie poddawana jest głowa

kości udowej. W porównaniu do protez częściowych, głowa charakteryzuje

się większym rozmiarem, zbliżonym do rzeczywistych rozmiarów głowy

kości udowej pacjenta. Postępowanie w trakcie zabiegu jest podobne do

wcześniej omawianej techniki operacyjnej, stosowanej w endoprotezach

całkowitych. Mocowanie protez może odbywać się w sposób cementowy

lub bezcementowy [11].

Rysunek 7. Przykłady protez połowicznych (A – Moore’a,

B – Thompson’a, C – bipolarna Monka) [11]

Stosowanie endoprotez całkowitych i połowicznych wiąże się również

z problemami. Najpoważniejszymi z nich są ryzyko zwichnięcia stawu,

poluzowania elementów endoprotezy, jak również zużycie materiału na

Adrian Dubicki

368

powierzchni sztucznego stawu. Wprowadza to konieczność ograniczenia

aktywności osób po alloplastyce, a w przypadku zużycia endoprotezy – jej

wymiany. Protezy wtórne nazywane są rewizyjnymi. Niestety zużycie

takiej protezy może wiązać się z koniecznością unieruchomienia stawu

biodrowego, a co za tym idzie – również pacjenta [11].

Rozwiązaniem, szczególnie polecanym w przypadku młodych

pacjentów jest kapoplastyka. Zaliczana jest ona do całkowitych endopro-

tezoplastyk. Polega ona na zastąpieniu tylko naturalnych powierzchni

stawowych, przy użyciu metali o niskiej ścieralności. Postępowanie

podczas zabiegu (rys. 8) jest podobne jak w przypadku poprzednich typów

endoprotez. Pierwszym krokiem jest usunięcie chrząstki wraz z przyle-

gającymi warstwami kostnymi z obrębu panewki stawowej oraz usunięcie

chrząstki i uformowanie w postaci stożka głowy kości udowej. Następnie

w tak przygotowanej głowie kości udowej wierci się otwór, mający za

zadanie odpowiednio ustawić kapę i ją utrzymać. Część panewkowa

mocowana jest zazwyczaj na wcisk, do procesu osteointegracji, natomiast

część udowa na cement kostny [11].

Rysunek 8. Schemat postepowania przy kapoplastyce (z lewej – uformowanie kości,

z prawej – zamocowanie na ich powierzchniach kapy) [11]

Kapoplastyka umożliwia oddalenie w czasie konieczności

przeprowadzenia endoprotezoplastyki całkowitej, czy też możliwość

zastosowania endoprotezoplastyki połowicznej (możliwość wykorzystania

panewki z kapoplastyki) [11].



369

W przypadku gdy dojdzie do obluzowania lub zwichnięcia w stawie

biodrowym, powikłaniem może być przemieszczenie się panewki. Może

ono być również spowodowane jej nieprawidłowym umocowaniem lub

zapaleniem czy zakażeniem kości, co w rezultacie może prowadzić do

zaniku kości i przemieszczeń panewki. W tym przypadku rozwiązaniem

jest endoproteza rewizyjna panewki (rys. 9) [15].

Rysunek 9. Przykłady dostępnych panewek rewizyjnych

(A – pressfitowa, B – indywidualna firmy Biomet, C – antyprotuzyjna) [15, 16, 17]

Dużym problemem towarzyszącym przemieszczeniu panewki jest

ubytek tkanki kostnej. Do takich uszkodzeń stosowane są:

- panewka pressfitowa (mocowana śrubami),

- panewka z siatką do mocowania wkrętami i wcementowywana

panewka,

- systemy antyprotruzyjne (z wypustkami i uzupełniającymi bloczkami

metalowymi).

Ubytek tkanki kostnej powoduje konieczność opracowania

indywidualnego umocowania panewki rewizyjnej i uzupełnienia braków

przeszczepami kostnymi. Takie rozwiązania nie zawsze spełniają

w dostateczny sposób swoje funkcje. Lekarz podczas zabiegu musi mieć

przygotowany plan, na ewentualność, gdy nie będzie w stanie dostosować

standardowych implantów do zmian w obrębie miednicy [15].

W takich zaawansowanych przypadkach może być wykorzystana

technika, pozwalająca na zaplanowanie operacji przy użyciu programów

komputerowych lub nawet na wykonanie indywidualnego implantu dla

pacjenta [15].

3.3. Implanty indywidualne

Często jedynym ratunkiem w przypadku zaawansowanych zmian

w obrębie kośćca miednicy mogą okazać się implanty indywidualne. Nie są

one obecnie powszechnie stosowanym rozwiązaniem, ale zyskują coraz

większą przychylność. Mogą być wykorzystywane w przypadku skompli-

Adrian Dubicki

370

kowanych złamań i ich powikłań, zwyrodnień, martwic i powstających z tej

przyczyny deformacji oraz w chorobach onkologicznych kości.

Przy obecnym stanie nauki i techniki, lekarze we współpracy

z inżynierami mogą tworzyć implanty niemal każdej części ciała. Oprócz

wytwarzanych z różnych materiałów wszczepów, mogących zastąpić kości,

coraz częściej można spotkać się z uzupełnieniem innych tkanek. Rozwój

produkcji resorbowalnych rusztowań dla rozwoju i namnażania komórek

macierzystych, powoli prowadzi nas do ery „produkcji” zamiennych

organów. Nad wyprodukowaniem narządów pracuje między innymi

amerykańska firma Organovo, która już ma za sobą pierwsze sukcesy.

Naukowcy z tej korporacji stawiają sobie za cel wszczepienie już za 10 lat

pierwszych organów pochodzących z ich firmy [18].

Zaprojektowanie indywidualnego implantu oraz jego wytworzenie

wymaga zastosowania kilku innowacyjnych technik. Pierwszym etapem jest

otrzymanie modelu z badań diagnostycznych (inżynieria odwrotna

– ang. Reverse Engineering). Następnie otrzymany model jest wykorzystany

do projektowania przy użyciu oprogramowania komputerowego (projek-

towanie wspomagane komputerowo – ang. Com-puter Aided Design)

implantu dla pacjenta. Ostatnim krokiem jest wytworzenie indywidualnego

wszczepu z wirtualnego modelu, przy wykorzystaniu technik przyrostowych

(szybkie prototypowanie – ang. Rapid Prototyping). Połączenie tych

wszystkich kroków daje nam spersonalizowany, idealnie pasujący do

pozostałych struktur organizmu implant [19, 20].

Obecnie najczęściej spotykanymi, wykonywanymi dla konkretnego

pacjenta implantami są wszczepy stomatologiczne oraz płytki służące do

zastąpienia ubytków kostnych czaszki. W literaturze można spotkać

również przykłady trzpieni endoprotez, panewek, implantów żuchwy, głów

kości ramiennej oraz stawów paliczkowych [19, 20, 21, 22]. Wybrane

z nich zostały przedstawione na rysunku 10.



371

Rysunek 10. Przykłady implantów indywidualnych (A – żuchwy,

B – panewka biodrowa, C – implant uzupełniający ubytek czaszki) [19, 22]

Świat medycyny zaczyna powoli stosować również indywidualne

implanty w obrębie miednicy. W porównaniu do przedstawionych powyżej

przykładowych wszczepów, implanty miednicy muszą oprócz zastąpienia

struktury kostnej, przejąć jej funkcje przenoszenia ciężaru ciała na

kończyny dolne. Wiąże się to z koniecznością otrzymania odpowiedniej

wytrzymałości oraz odporności na uszkodzenia zmęczeniowe. Otrzymana

konstrukcja indywidualnego implantu musi więc dodatkowo wytrzymać

codzienną aktywność pacjenta przez długi okres czasu.

Z przykładami implantów w obrębie miednicy można zapoznać się

przede wszystkim na portalach internetowych, prezentujących nowinki

techniczne z zakresu druku 3D. Pierwszym przykładem jest przypadek

pacjenta z chińskiego szpitala Wojskowej Akademii Medycznej w Xi’an.

Został zdiagnozowany u niego złośliwy nowotwór - mięsak Ewinga.

W celu ratowania życia pacjenta, aby nowotwór nie dał przerzutów na inne

tkanki należało usunąć objętą zmianami tkankę - większą część kości

biodrowej. Zachowaniu uległa panewka stawu biodrowego [23].

Na podstawie zdjęć z rezonansu magnetycznego wykonano

trójwymiarowy modeli i zaprojektowano implant (rys. 11). W celu

zmniejszenia masy, wszczep w części swojej struktury ma ażurową

konstrukcję. Do implantu dodane zostały również otwory umożliwiające

połączenie go z pozostałymi kośćmi miednicy za pomocą wkrętów [23].

Adrian Dubicki

372

Rysunek 11. Zaprojektowany w szpitalu w Xi'an implant części kości biodrowej [23]

Implant części kości biodrowej wykonany został przy użyciu techniki

przyrostowej – selektywnego spiekania laserowego (SLS) z biokom-

patybilnych proszków tytanu. Następnie został on wszczepiony pacjentowi,

który po okresie rekonwalescencji i rehabilitacji odzyskał zdrowie

i sprawność [23].

Kolejnym przykładem jest piętnastoletnia szwedka, która otrzymała

indywidualny implant stawu biodrowego. Cierpiała ona na łagodną

odmianę nowotworu - nerwiako-włókniaka. Podczas jego usunięcia doszło

do powikłań, które doprowadziły do ciężkich deformacji i w rezultacie do

unieruchomienia dziewczyny na wózku inwalidzkim. Z pomocą przyszła

belgijska firma Mobelife. Przy wykorzystaniu obrazów z tomografii

komputerowej opracowano dokładny model i na jego podstawie

zaprojektowany został implant (rys. 12). Panewka posiadała porowatą

powierzchnię zewnętrzna, służącą do zmniejszenia masy implantu, ale

przede wszystkim do osteointegracji z kością. Dodatkowymi elementami

mocującymi były wypustki z otworami, do przymocowania implantu przy

użyciu wkrętów [24].



373

Rysunek 12. Zaprojektowany przez belgijską firmę Mobelife

implant panewki stawu biodrowego [24]

Wydrukowany implant, już po osiemnastu miesiącach od operacji,

pozwolił nastolatce na sprawne poruszanie się, nawet bez użycia sprzętu

pomocniczego [24].

Z przykładami stosowania indywidualnych implantów możemy spotkać

się również na terytorium Polski. Zabiegowi wszczepienia implantu na

wymiar została poddana 66-letnia pacjentka krakowskiego szpitala.

W wyniku poważnych zmian zwyrodnieniowych biodra, licznych operacji

i powikłań doszło do przerwania ciągłości pierścienia kostnego miednicy.

Implant został opracowany na podstawie zdjęć z tomografu kompu-

terowego przez belgijską firmę. Wydrukowany wszczep pozwolił uzupełnić

kostny ubytek w obrębie miednicy i zapewnił jej stabilność. Operacja

zakończyła się sukcesem, a pacjentka wraca do zdrowia [25, 26].

Oprócz firm spoza granic naszego kraju, wykonywaniem indywidualnych

implantów, na mniejszą skalę, zajmują się również nasi rodzimi producenci.

Pracownia implantów znajduje się m.in. w łódzkim Bionanoparku oraz

w białostockiej firmie ChM [27, 28].

Wytwarzanie spersonalizowanych implantów zyskuje coraz większą

popularność.

4. Wytwarzanie implantów indywidualnych

Wytwarzanie standardowych implantów oparte jest na procesach

odlewania, kucia, cięcia, wiercenia oraz toczenia i frezowania. Opracowane

przez firmy z branży ortopedycznej procesy technologiczne pozwalają na

Adrian Dubicki

374

seryjną produkcję standardowych wyrobów, które będą spełniać wszystkie

stawiane im wymagania, a koszty ich produkcji pozwolą na

konkurencyjność z innymi korporacjami.

Implanty indywidualne wymagają innego podejścia. Jednostkowa

produkcja takiego wyrobu sprawia, że wykorzystanie metod stosowanych do

produkcji masowej staje się nieopłacalne, a wręcz niemożliwe ze względu na

konieczność dokładnego odwzorowania kształtu implantu indywidualnego.

Proces projektowania indywidualnych implantów z obrazów pochodzących z

urządzeń diagnostycznych zachęca, ale i wymusza zastosowanie technik

wytwarzania ze wspomaganiem komputerowym (ang. Computer Aided

Manufacturing – CAM).

Najczęściej spotykaną formą wytwarzania implantów spersona-

lizowanych są techniki przyrostowe. Pozwalają one na dokładne

odwzorowanie komputerowego modelu implantu i jego niemal

natychmiastowe wszczepienie. Nie są one jednak jednym możliwym

rozwiązaniem. Rozwój współczesnych urządzeń do wytwarzania implantów

metodą ubytkową (która opiera się na sterowaniu przez system

komputerowy) sprawił, że mogą być one z powodzeniem wykorzystane w

produkcji nawet skomplikowanych implantów.

5. Podsumowanie

Coraz szybszy tryb życia, brak troski o prawidłowe odżywianie

i zdrowie sprawia, że coraz częściej możemy zaobserwować w społe-

czeństwie problemy zdrowotne. Dotykają one między innymi obręczy

kończyny dolnej, która odgrywa w organizmie bardzo ważną rolę

– podporową i lokomocyjną.

Każdy rodzaj schorzenia czy uszkodzenia wymaga indywidualnego

podejścia. W każdym z przypadków wdrażane są inne postępowania

mające na celu przywrócenia sprawności i komfortu pacjentowi.

W przypadku skomplikowanych złamań kości miednicy, wielood-

łamowych oraz tych z przemieszczeniami, często stosowaną metodą jest

stabilna osteosynteza wewnętrzna. Innym rozwiązaniem wykorzystywanym

głównie przy przerwaniu ciągłości spojenia łonowego i stawu biodrowo-

krzyżowego jest osteosynteza zewnętrzna. Charakterystyczna dla tej metody

jest możliwość działania poza ogniskiem złamania. Endoprotezoplastyka jest

metodą stosowaną przy chorobie zwyrodnieniowej, martwicach kości, ale

również przy skomplikowanych i powikłanych złamaniach miednicy

i bliższego końca kości udowej oraz nowotworach.

Każde z przedstawionych rozwiązań stosowane jest przy typowych

złamaniach oraz innych chorobach. Szereg rodzajów implantów czy



375

stabilizatorów, o dopasowanych do kości kształtach i wymiarach może być

wykorzystywanych w większości przypadków.

Zaawansowane zmiany wywołane wysokoenergetycznymi wypadkami

komunikacyjnymi czy upadkami oraz zaawansowane zmiany onkologiczne

czy powikłania często nie pozwalają na ich wykorzystanie. W takich

przypadkach, przedstawionych również w niniejszej pracy, konieczne jest

zastosowanie implantów indywidualnych. Nie są one obecnie powszechnie

stosowanym rozwiązaniem, ale zyskują coraz większą przychylność. Do

popularyzacji indywidualnych implantów przyczynia się również rozwój

techniki, który umożliwia przygotowanie i wytworzenie idealnie

dopasowanych wszczepów.

W niedługim czasie, indywidualne wszczepy mogą być powszechnie

stosowanym sposobem na przywrócenie utraconych funkcji pełnionych

przez tkanki kostne.

Literatura

1. Ortopedia i traumatologia. Praca zbiorowa pod redakcją naukową T. S.

Gaździka. Warszawa: Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 2010, strony 45-48,

263-277, 433-456, 473-486 i 532-573, ISBN 978-83-200-4165-1

2. Jałowa martwica kości [online]:

http://zdrowie.gazeta.pl/zdrowie/1,101580,14002449, jalowa_martwica_kosci

[dostęp: 4 VI 2015 r.]

3. Rak kości [online]: www.przychodnia.pl/rbt/index.php [dostęp: 4 VI 2015 r.]

4. Nowacki J., Dobrzański L. A., Gustavo F.: Implanty śródszpikowe

w osteosyntezie kości długich. Gliwice: Open Access Library – Scientiic

International Journal of the World Academy of Materials and Manufacturing

Engineering, 2012, numer 11 (17), ISSN 2083-5191

5. Ebeltt-Paprotny G.: Fizjoterapia. Praca pod redakcją R. Preis. Wrocław:

Elsevier Urban i Partner, 2012, strony 557-591, ISBN 978-83-7609-309-3

6. Pelvic & Acetabular. Fracture Treatment Solutions [katalog]. Freiburg:

Stryker, 2011

7. Pelvic Implants and Instruments. A dedicated system for reconstructive pelvic

and acetabular surgery [katalog]. Oberdorf: Johnson & Johnson – DePuy

Synthes, 2014

8. Płytki rekonstrukcyjne. Zespolenie miednicy [katalog]. Lewickie: ChM, 2015

9. Olszewski G., Misztal M.: Przednia stabilizacja zewnętrzna miednicy. Lublin:

Nowiny lekarskie, 2006, tom 75, numer 2, strony 129-133, ISSN 2353-9801

10. Stabilizator zewnętrzny BigCharstab [katalog]. Lewickie: ChM, 2013

11. Madej T.: Modelowanie strefu ruchowej endoprotezy stawu biodrowego

w aspekcie biomateriałów. Kraków: 2008, Praca doktorska, Wydział inżynierii

mechanicznej i robotyki, Akademia Górniczo-Hutnicza

12. Kowalewski P.: Modelowanie tarcia w endoprotezie stawu kolanowego.

Wrocław: 2007, Praca doktorska, Wydział mechaniczny, Politechnika

Wrocławska

Adrian Dubicki

376

13. Ortopedicum: Sztuczny staw biodrowy. Informacje dla pacjentów [broszura].

Kraków: http://www.ortopedicum.pl [dostęp: 6 VI 2015 r.]

14. Oddział Ortopedyczny Wielospecjalistycznego Szpitala w Miliczu:

Endoproteza stawu biodrowego. Przewodnik dla pacjenta [broszura]. Milicz:

http://www.mcm-milicz.pl [dostęp: 6 VI 2015 r.]

15. Wojciechowski P., Kopeć K., Nowak M., Borowski M., Kamiński J., Kusz D.:

Zaopatrywanie ubytków dna kostnego panewki w endoprotezoplastyce

rewizyjnej stawu biodrowego [prezentacja]. Ustroń Śląski: Międzynarodowe

Sympozjum KOKSARTROZA, 2012

16. GRIPTION TF Acetabular Revision System[online]:

https://www.depuysynthes.com/hcp/hip/ products/qs/GRIPTION- TF-Acetabular-

Revision [dostęp: 6 VI 2015 r.]

17. Biomet PMI Patient-matched Implants [online]:

http://www.biomet.com/wps/portal/internet/ Biomet/Healthcare-

Professionals/products/orthopedics [dostęp: 6 VI 2015 r.]

18. Kubera G.: Druk 3D przyszłością biomedycyny [online]

http://www.pcworld.pl/artykuly/394433_1/Druk.3D.przyszloscia.biomedycyny.html


19. Trusscott M., Beer D., Vicatos G., Hosking K., Barnard L., Booysen G.,

Campbrll R. I.: Using RP to promote collaborative design of customised

medical implants. Bloemfontein-Cape Town: Rapid Prototyping Journal,

2007, tom 13, numer 2, strony 107-114, ISSN 1355-2546

20. Markowska O., Budzik G.: Innowacyjne metody wytwarzania implantów

kostnych za pomocą inżynierii odwrotnej (RE) oraz technik szybkiego

prototypowania (RP). Sosnowiec: X Forum Inżynierskie ProCAx, 2011

21. Jardini A. L., Larosa M. A., Filho R. M., Zavaglia C. A., Bernardes L. F.,

Lambert C. S., Calderoni D. R., Kharmandayan P.: Cranial reconstruction: 3D

biomodel and custom-built implant created using additive manufacturing.

Campinas: Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery, 2014, tom 42, numer 8,

strony 1877-1884, ISSN 1010-5182

22. Raghatate S. C., Kuthe A. M., Deshmukh T. R., Dahake S. W.: Rapid

prototyping-assisted fabrication of the customized metatarsophalangeal joint

implant (SamKu). Nagpur: Rapid Prototyping Journal, 2014, tom 20, numer 4,

strony 270-279, ISSN 1355-2546

23. W Chinach wszczepiono pacjentom drukowane kości [online]:

http://swiatdruku3d.pl/w-chinach-wszczepiono-pacjentom-drukowane-kosci

[dostęp 6 VI 2015 r.]

24. Implant stawu biodrowego z drukarki 3D pozwolił 15-latce znowu chodzić

[online]: http://www.benchmark.pl/aktualnosci/implant-druk-3d-staw-

biodrowy-wozek-chodzi [dostęp: 6 VI 2015 r.]

25. Pionierski zabieg w Krakowie [online]:

http://pulsmedycyny.pl/2848221,19711, pionierski-zabieg-w-krakowie


26. Nota prasowa Szpitala Specjalistycznego im. Ludwika Rydygiera w Krakowie

z dnia 8.11.2012 [online]:

www.rydygierkrakow.pl/str_www_x/nota_prasowa.pdf [dostęp: 6 VI 2015 r.]



377

27. Bionanopark w Technoparku w Łodzi [online]: http://technopark.lodz.pl/

bionanopark/struktura [dostęp: 6 VI 2015 r.]

28. Implanty na wymiar [online]: http://chm.eu/produkty/implant-na-wymiar


Współcześnie stosowane metody przywrócenia utraconych w wyniku

schorzeń i uszkodzeń funkcji miednicy

Streszczenie

Obręcz kończyny dolnej odgrywa w organizmie ważną rolę - jest narządem podpory dla całego

ciała i uczestniczy w lokomocji. Z tego powodu, wystąpienie w jej obrębie nawet najmniejszych

dysfunkcji, może prowadzić do poważnych zaburzeń w prawidłowej realizacji statyki i dynamiki.

Medycyna przy wykorzystaniu techniki wypracowała szereg rozwiązań mających na celu

przywrócenie jej prawidłowej funkcji.

W pracy przedstawiono współcześnie stosowane metody leczenia dysfunkcji miednicy, takich jak

osteosynteza złamań, endoprotezoplastyka oraz implanty indywidualne, które są obecnie

najbardziej rozwijaną z tych metod. Spersonalizowane implanty są często jedynym ratunkiem

w przypadku zaawansowanych zmian.

Contemporary methods of restoration of pelvic function lost due to

diseases and damages

Abstract

The rim of the lower limb plays an important role in the body - it is an organ supporting the entire

body and participates in locomotion. For this reason the occurrence of even the slightest

dysfunction can lead to serious disturbance in the proper implementation of the statics and

dynamics. Medicine by means of technology has developed a series of solutions in order to

restore its proper function.

This article presents the contemporary methods of treatment of pelvic dysfunction, such as

osteosynthesis of fractures, arthroplasty and individual implants, which are currently the most

expandable of these methods. Personalized implants are often the only salvation in case of

advanced changes in human body.

378

Indeks autorów

Antonowicz M. ....................... 277, 344

Bednarczyk M................................... 94

Cwynar A. .........................18, 179, 192

Dereń N. ............................................ 27

Dubicki A. .............. 141, 161, 325, 357

Dyńda M. .......................................... 47

Gadomska-Gajadhur A. ................. 254

Gawroński M. ...................35, 131, 204

Goede A. ................................... 35, 204

Grygiel-Pradelok M................ 277, 344

Janicka A. ..........................18, 179, 192

Kajzer A. ......................................... 277

Kajzer W. ........................................ 344

Kątska K. ......................................... 121

Kimsa M. ......................................... 265

Kołodziejczyk-Czepas J. ................ 223

Kosior-Jarecka E. ........................... 121

Kowalska W. .................................... 77

Kruk A. ............................................ 254

Lach D. ............................................ 112

Łabejszo A. ..................................... 131

Mazurek U. ....................................... 94

Mierzejewska Ż. A.7, 161, 293, 308, 325

Muc-Wierzgoń M. ............................ 94

Nowak P. ......................................... 223

Ostrowski J. .................................... 121

Posmysz A. ....................................... 66

Ruśkowski P. .................................. 254

Siemińska E. ..................................... 18

Sieradzka M. ................................... 223

Sikora B. .......................................... 265

Sikora J. ..................................... 18, 192

Simińska E. ....................................... 27

Skubis A. ......................................... 265

Szewczenko J. ................................. 344

Waldowska M. .................................. 77

Wandtke T......................... 35, 131, 204

Woś J. ................................................ 77

Woźniak J. ........................................ 27

Wybranowski T. ............................. 179

Ziomkowska B. ................ 18, 179, 192

Biomedyczny przegląd naukowy. Tom 2 · 2016-06-01 · Analiza zjawiska biofilmu – mechanizmy...

Documents

Transcript of Biomedyczny przegląd naukowy. Tom 2 · 2016-06-01 · Analiza zjawiska biofilmu – mechanizmy...