BIOLOGÍA MOLECULAR DE LA BARRERA HEMATOENCEFÁLICA

Para mantener un procesamiento neuronal eficiente, es necesario mantener un medio controlado en el SNC, para lograrlo, está protegido por mecanismos de barrera, éstos se encuentran en 5 diferentes interfaces: 1) la barrera hematoencefálica (BHE), a nivel del endotelio cerebral; 2) la barrera aracnoidea, localizada entre el líquido cefalorraquídeo (LCR) del espacio subaracnoideo y la duramadre; 3) los limitantes pia/glia, entre el LCR del espacio subaracnoideo y el fluido extracelular cerebral; 4) la barrera LCR-cerebro, que es sólo significativa en la etapa embrionaria, formada por la separación del sistema ventricular del fluido extracelular cerebral por uniones de correa en el neuroepéndima; y 5) la barrera sangre-LCR (BSLCR) a nivel de las células epiteliales de los plexos coroideos (PC). (1) (2)

Las funciones desempeñadas por estas barreras, se encuentran presentes desde etapas tempranas del desarrollo. El LCR en esta etapa se caracteriza por la presencia de altas concentraciones de proteínas, provenientes en su mayoría del plasma sanguíneo. Dentro de las barreras presentes en el SNC, las más importantes son la BHE y la BSLCR, estas barreras no son sólo anatómicas, son tejidos dinámicos, que expresan múltiples transportadores, receptores y enzimas. Los capilares cerebrales, se asocian a los procesos terminales de los astrocitos y a la microglia, y tienen influencia sobre la permeabilidad de la BHE, dando lugar a la unidad neurovascular. Las 2 funciones principales de estas barreras son: impedir la libre difusión entre los fluidos cerebrales y la sangre, y proveer de mecanismos de transporte para nutrientes esenciales, iones y productos de desecho metabólico. (1) (2)

Morfología de la BHE y BSLCR

Aunque ambas barreras comparten características en común, su base celular y sus funciones primarias difieren. La BHE se localiza en los capilares cerebrales, es una estructura endotelial y su función principal es proteger al cerebro de las fluctuaciones fisiológicas en el plasma de solutos y sustancias liberadas en la sangre que puedan interferir con la neurotransmisión, asimismo, participa en mecanismos de intercambio de nutrientes, productos de desecho metabólico, moléculas de señalización y iones entre el fluido intersticial cerebral y la sangre. (2) La BHE se forma por la microvasculatura cerebral y su permeabilidad está regulada principalmente por las células endoteliales, sin embargo no es la única célula que compone la microvasculatura; existen por lo menos 4 células y cualquier alteración en ellas compromete la permeabilidad de la misma. La célula endotelial y el pericito comparten la membrana basal, hay 1 pericito por cada 2-4 células endoteliales. Los procesos terminales de los astrocitos recubren el 99% de la superficie de los capilares cerebrales. Asimismo, existe inervación en el capilar por terminaciones nerviosas de origen intra o extracerebral. La membrana luminal y abluminal de las células endoteliales se separa por 100-300nm de citoplasma endotelial. Para que una molécula llegue al espacio intersticial cerebral, debe atravesar la membrana plasmática de la célula endotelial, el pericito y los procesos terminales de los astrocitos. El paso de nutrientes y moléculas a través de la BHE

resulta de una compleja interacción entre sistemas de eflujo, en la membrana de las células endoteliales, transportadores activos en los procesos terminales de los astrocitos y ectoenzimas en la membrana plasmática de los pericitos. (3)

Existen 2 razones para estudiar la biología molecular de la BHE: entender la expresión genética específica de cada tejido expresado en la microvasculatura para tener un mejor entendimiento de las enfermedades neurológicas y desarrollar nuevas estrategias para el transporte de fármacos a través de la BHE. (3)

Existen 3 tipos de transporte e la BHE: transportadores mediados pro proteínas de membrana (carrier mediated transport CMT), transportadores activos de eflujo (AET) y transportadores mediados por receptores (RMT). Muchos de los sistemas AET pueden estar presentes en los procesos terminales de los astrocitos o en la membrana plasmática de los pericitos, en vez de en la célula endotelial. (3) Sin embargo, no hay estudios que determinen la localización exacta de cada sistema en la BHE.

Los capilares cerebrales tienen una morfología que les permite la restricción de la difusión de solutos de la sangre por medio de las uniones estrechas que interconectan a las células endoteliales adyacentes y sellan los espacios paracelulares. Adicionalmente, las células endoteliales tienen baja actividad pinocítica, y el endotelio se aísla gracias a los procesos terminales de los astrocitos y los pericitos, que brindan una restricción adicional a la permeabilidad. La BHE tiene gran resistencia al paso de iones, presentando una resistencia transendotelial (TEER) en promedio de 1500Ω cm2 comparada con la TEER en otros tejidos que es de 3-33 Ω cm2. La superficie capilar aproximada del cerebro es de 20m2; por lo que se considera a la BHE provee al cerebro de condiciones ideales para el proceso de intercambio entre la sangre y el fluido intersticial cerebral. (2)

La BSLCR está formada por una capa de epitelio cuboidal modificado, el plexo coroideo, que secreta LCR. Los plexos coroideos son tejido epitelial altamente vascularizado, originado del neuroepéndima en la etapa embrionaria y del epéndima en los adultos; y flota libremente en los ventrículos; se unen al epéndima ventricular por un tallo. El epéndima es continuo con la capa epitelial de los plexos coroideos, constituida por una capa única de células llenas de mitocondrias y unidas por uniones estrechas. La TEER en estas células es de aproximadamente 150 Ω cm2, lo que sugiere que es un epitelio sujeto a filtraciones que secreta grandes cantidades de líquido con relativamente poca energía. Las células epiteliales de los PC tienen vellosidades en su superficie apical y en las paredes laterales se encuentran interdigitaciones complejas que aumentan su área de superficie. Tienen 2 funciones principales: en primer lugar actuar como una barrera de difusión entre la sangre y LCR; en segundo lugar, producir y secretar LCR. Los plexos coroideos están compuestos por un estroma central con numerosos vasos sanguíneos, cubiertos por una sola capa de células endoteliales que descansan sobre una membrana basal gruesa. Estos vasos son fenestrados y las líneas de unión de las células endoteliales son discontínuas, sin embargo cuenta con uniones, como las uniones estrechas, adherentes, de hendidura; formando la barrera sangre-

LCR. La presencia de estas uniones en las células endoteliales de los plexos adyacentes, desde su aparición y durante su desarrollo, se traduce en la reducción del transporte paracelular entre la sangre y el LCR tanto en la etapa embrionaria, como en los adultos. (1) (2)

Durante el desarrollo cerebral, la diferenciación y el crecimiento de los PC ocurre antes de la vascularización; por lo que se sugiere que la vía de entrada de la sangre al cerebro durante esta etapa es a través de los PC y el LCR. (1)

Las características de cada una de las barreras dependen de su componente morfológico y de sus mecanismos de transporte celular. El aspecto morfológico distintivo en la BHE son las células endoteliales y en los plexos coroideos son las células epiteliales. Los mecanismos de transporte celular comprenden mecanismos de influjo para el transporte de nutrientes, y mecanismos de eflujo importantes para prevenir la entrada de toxinas y fármacos al cerebro; además existen mecanismos de transporte de iones y canales para transporte de líquidos que son clave para mantener el ambiente cerebral y asegurar una adecuada función neuronal. (1)

Biología molecular de las uniones estrechas en la BHE y la BSLCR

Las células endoteliales cerebrales y las células epiteliales de los PC están adheridas por uniones estrechas (TJ) y adherentes (AJ), compuestas por proteínas transmembranales y proteínas citoplasmáticas que forman placas que agrupan a las proteínas de las uniones estrechas creando una plataforma de interacción con las proteínas de señalización. Adicionalmente un cinturón circunferencial de actina que rodea a las células endoteliales/epiteliales, es necesario para la formación y fución normal de las TJ. (2)

Estructura protéica de las uniones estrechas:

Las proteínas transmembranales de las TJ incluyen a las ocludinas, claudinas y proteínas de unión adherente (JAM) A, B y C. Las ocludinas poseen 2 bucles extracelulares, 4 dominios transmembranales y 3 dominios citoplasmáticos. Los dominios citoplasmáticos tienen un dominio intracelular corto (N-terminal) y un largo carboxilo (C-terminal), este último asociado a las proteínas de la zonulla occludens (ZO) 1, 2 y 3; e interactúa con otras proteínas reguladoras. Tanto ocludinas como claudinas son fosfo-proteínas que cambian su conformación por medio de fosforilación/desfosforilación de la cadena hidroxilo, alterando su interacción con otras proteínas. La desfosforilación de la ocludina provoca el desensamblaje de su asociación con proteínas de la ZO. La parte N-terminal de la ocludina juega un papel importante en el ensamblaje de las TJ. Las claudinas son las principales proteínas que conforman la barrera, incluyen por lo menos 24 miembros. Todas tienen el mismo patrón estructural: 4 regiones que abarcan la membrana, 2 bucles extracelulares y 2 dominios citoplasmáticos. Dos claudinas de células adyacentes forman los filamentos de las TJ por medio de interacciones homofílicas claudina-claudina. Los bucles extracelulares determinan la selectividad de carga paracelular, por lo que cada tipo de claudina, determina la permeabilidad a moléculas de distintos tamaños. El dominio C-terminal de las

claudinas se une a proteínas citoplasmáticas, sobre todo ZO-1,2 y 3. La interacción adecuada de las claudinas es esencial para limitar el transporte paracelular de iones, produciendo TEER alto en la BHE. Al parecer las diferentes claudinas expresadas en cada barrera juegan un papel importante en la TEER de cada una de ellas. La BHE expresa claudinas 3,5, 12 y probablemente 1, mientras que las claudinas 1, 2, 3 y 11 se expresan en el epitelio de los PC. (2)

El revestimiento de los ventrículos, compuesto por células ependimarias no restrigen la difusión de solutos, ya que no expresan TJ, sin embargo expresan uniones parecidas a TJ brindando a esta capa propiedades de barrera. (2)

Las JAM’s 1,2 y 3, miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas, tienen un dominio asociado a membrana, un dominio extracelular (N-terminal) y uno citoplasmático (C-terminal). Se expresan en las uniones intracelulares de las células endoteliales cerebrales y células epiteliales de los PC y tienen diversos patrones de interacción, tanto homofílicos como heterofílicos, con las JAM de células adyacentes, formando dímeros, importantes para la estructura de las TJ. El dominio C-terminal media la interacción con diversas proteínas. Se cree que estas proteínas tienen que ver con la localización de ZO-1 y ocludina en las TJ. Las proteínas transmembralanes de la TJ están unidas al citoesqueleto por las proteínas e la ZO-1, 2 y 3 en las células endoteliales y epiteliales. Las proteínas de la ZO proveen de anclaje citoesquelético a las proteínas de las TJ y juegan un papel en la distribución espacial de las claudinas. La cingulina, una proteína similar a miocina, se une preferentemente a las proteínas de la ZO en la cabeza globular a otras moléculas de cingulina en la cola y a la actina que tiene sitios de unión en todas las proteínas de la ZO, en claudina, ocludina y cingulinas. (2)La proteín cinasa C (PKC) está involucrada en la expresión de TJ en las células endoteliales cerebrales, provocando un reoirdenamiento de las proteínas de las TJ aumentando la permeabilidad paracelular de la BHE. (2)

Uniones adherentes:

Son uniones célula-célula especializadas formadas por cadherinas y proteínas asociadas en las que se insertan los filamentos de actina. En las células endoteliales se encuentra la cadherina vascular endotelial (VE), sin embargo ésta sólo se encuentra en órganos cicumventriculares y PC, en las células que forman barreras, se expresa principalmente cadherina 10. Las cadherinas regulan las funciones endoteliales de manera directa por la activación de la fosfoinositid-3-cinasa, un sistema de señalización que participa en la reorganización del citoesqueleto, formando complejos con el receptor tipo 2 del factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF). En el epitelio de los PC sólo se han encontrado 2 tipos de cateninas: α y β, la α-catenina se une a la red de actina. (2)

Genes de adhesión celular y uniones estrechas:

En el estudio realizado por Liddelow y colabradores, se buscaron diversos transportadores y expresión de genes durante el desarrollo del SNC en ratones (embriones y adultos) en la barrera

sangre-LCR, donde se demostró que la mayoría de los genes no varía durante el desarrollo y en la edad adulta; lo que indica un alto grado de madurez en los plexos coroideos, incluso en etapas tempranas (día 15 embrionario, 3 días posteriores al inicio del desarrollo del plexo lateral). Los genes que alteran su expresión durante el desarrollo son: de células de adhesión, de transporte iónico, transportadores de solutos, transportadores de eflujo, y en mayor proporción, de proteínas de unión. (1)

Las uniones estrechas forman la base estructural de la BHE y BSLCR; su función de restringir la difusión paracelular entre la sangre y el LCR se encuentra presente en etapas tempranas del desarrollo. Los componentes ultraestructurales como el número y complejidad de las proteínas, no sufre cambios significativos durante el desarrollo. Proteínas clave como las de la zonulla ocludens (ZO-1), ocludinas y claudinas 1, 3, 18 y 13 se encuentran presentes en etapas tempranas del desarrollo (E15) y en la edad adulta. Sin embargo, algunas otras proteínas como la claudina 2, la proteína de unión adherente 3 (JAM3); Marveld3, que aumenta la resistencia eléctrica transepitelial, mediando así la permeabilidad iónica paracelular; estas proteínas aumentan su expresión en la etapa adulta. Durante la etapa embrionaria existen proteínas importantes que contribuyen con la función de barrera en los PC, incluyendo Racgap1 (proteína 1 activadora Rac GTPasa), importante para el establecimiento de las uniones; Rac-1 que regula la función de la barrera ya que su activación es importante para la formación de las uniones estrechas; cadherina 2 (N-cadherina) y 11, importantes para la delimitación de compartimientos en el cerebro embrionario; y protocadherina-18, que participa tanto en la migración celular durante el desarrollo, como en la adhesión celular; la proteína de la familia de las kinecinas Kif, involucrada en el transporte de vesículas y organelos a través de los microtúbulos, lo que indica una mayor importancia en este tipo de transporte durante la etapa embrionaria. (1)

Biología molecular de los procesos de transporte entre la sangre el fluido cerebral extracelular

Un componente clave para mantener en ambiente interno del cerebro es mantener la estabilidad de la composición iónica en el LCR, el cual se asume, refleja la composición del fluido intersticial cerebral. La composición del LCR difiere en la etapa embrionaria y en el adulto. Algunos gradientes LCR/plasma se establecen en etapas tempranas del desarrollo, lo que indica que la integridad de las uniones estrechas incluso en estas etapas, restringe la difusión paracelular de iones, y que hay bombas de iones activas en las células epiteliales de los plexos coroideos. En el adulto, los mecanismos clave para la secreción de LCR son: anhidrasa carbónica, que produce HCO3

-, el cual es transportado a través de las células epiteliales; y el intercambiador de sodio-potasio (Na+-K+

ATPasa) en la membrana apical de las células epiteliales de los PC. Éstos transportadores se encuentran aumentados en la edad adulta. Asimismo, en esta etapa, hay un aumento en los canales iónicos de potasio (Kcnh1, Kcnd3, Kcnd3, Kcnh2 y Kcnk1), en el caso del sodio, cuyo transporte se encuentra mediado por transportadores de solutos no asociadas a ATP, pertenecen a una superfamilia de transportadores de solutos (SLC); esta superfamilia incluye transportadores facilitados, transportadores acoplados a iones e intercambiadores que no requieren ATP. Éstos facilitan el transporte de monosacáridos, aminoácidos, ácidos monocarboxílicos, vitaminas,

nucleósidos, bases purinicas y pirimidinicas, iones y moléculas anfipáticas (aniones y cationes orgánicos), algunos se encuentran aumentados en la etapa embrionaria (Slc6a13, Slc4a4) y otros en la edad adulta (Slc5a5, Slc24a4). (1) (2)

Los transportadores de aniones también son fundamentales para mantener el ambiente interno del cerebro y la secreción de LCR. Los transportadores más importantes en la edad adulta pertenecen a la familia Slc4; durante la etapa embrionaria, 2 de ellos se encontraron aumentados; Slc4a1 (intercambiador Cl—HCO3) y Scl4a4 (co-transportador de Na+-HCO3

-); por lo que se puede inferir que desde la etapa embrionaria, los mecanismos de transporte de iones son funcionales. (1)

La segunda superfamilia de proteínas de casete de unión a ATP (ABC), que se acoplan directamente con los transportadores de eflujo para transportar moléculas a través de la bicapa lipídica contra un gradiente de concentración a hidrólisis de ATP. (2) Estos transportadores son clave para la BHE y la BSLCR desde etapas tempranas del desarrollo y controlan el eflujo de numerosos fármacos lipofílicos. Algunos de estos transportadores se encontraron con mayor expresión en la etapa embrionaria (Abcg2, Abcg5, Abcg8) mientras otros se encontraron más elevados en etapas adultas (Abca2, Abca4). (1) La familia de transportadores ABC se divide en subfamilias: proteínas multidrogorresistentes o P-glicoproteínas (subfamilia Abcb, HUGO ABCB1-11) y las proteínas relacionadas a multidrogorresistencia MRP’s (subfamilia Abcc, HUGO ABCC1-5) y la proteína resistente al cáncer de mama (BCRP, HUGO ABCG 1-8). Sus sustratos pueden ser pequeños iones hasta grandes polipéptidos y el transporte ocurre contra un gradiente de concentración, utilizando la energía producida por la hidrólisis de ATP. (2)

El transporte de moléculas anfifáticas (aniones orgánicos) es independiente de sodio y el transporte es mediado por proteínas de la familia SCL, la familia de transportadores de anión/catión orgánico (OAT’s-SLC22) y la familia de transportadores de aniones orgánicos polipeptídicos (OATP’s-SLC21). Los miembros de la familia SLC21 transportan solutos anfifáticos grandes como sales biliares, hormonas tiroideas, leucotrienos, esteroides conjugados y xenobióticos. OAT’s reciben moléculas hidrofílicas más pequeñas como metabolítos de neurotransmisores, cGMP, cAMP, antibióticos, antiinflamatorios no esteroideos y otros fármacos como antivirales, antidiuréticos, antiepilépticos, y neurotransmisores (dopamina, colina, cimetidina, N-metilnicotinamida). (2)

La P-glicoproteína luminal en la BHE es mediadora del eflujo de sustratos del cerebro a la sangre, impidiendo el influjo de sustratos al cerebro. Una P-glicoproteína (Pgp) abluminal es mediadora del transporte de sustratos de la membrana abluminal al líquido intersticial cerebral, facilitando el influjo de sustratos al cerebro. En los capilares cerebrales estas P-glicoproteínas se presentan principalmente en la membrana luminal. Estas son las principales proteínas que mantienen la impermeabilidad en la BHE. La localización de los MRP’s es controvertida, sin embargo se conoce que MRP4, 5 y probablemente 2, se expresan en la membrana luminal de las células endoteliales cerebrales. Las proteínas resistentes al cáncer de mama se expresan en la membrana luminal, siendo éstos los más abundantes en las células endoteliales después de la Pgp. OATP1A2 y

OATP2B1 se localizan en las células endoteliales; OAT3 y 1 se localizan en la membrana abluminal en células epiteliales de los PC. Pgp en las células epiteliales de los PC se encuentran en la membrana apical (LCR) y subapical, por lo que transportan sustratos de vuelta al LCR, es por ello, que el transporte mediado por Pgp va en sentido contrario en BHE y BSLCR. El transportador de eflujo más importante en PC es MRP1 y 4, y se localiza en la membrana basolateral, al igual que BCRP, mientras que OATP 1-5 se encuentran en la membrana apical, siendo OATP2 la más abundante en PC. (2)

Las 2 diferencias más importantes entre BHE y BSLCR son: Pgp dan la cara al lado sanguíneo de las células endoteliales cerebrales y son el transportador más abundante en la BHE, mientras que en las células epiteliales de los PC se encuentra principalmente en la membrana apical, dando la cara al LCR y su función no es crítica para mantener la homeostasis. Por otro lado, en la BHE MRP1 es escasa, y en BSLCR es el transportador más abundante.

Transportadores de glucosa:

La glucosa es la principal fuente de energía en el cerebro y el suministro de este sustrato es esencial para la función normal del cerebro. Su transporte al cerebro se lleva a cabo por medio de transporte facilitado por proteínas transportadoras. Se han encontrado diversas isoformas de estos transportadores en el cerebro, incluyendo GLUT 1, 3 y 8. GLUT 1 es un transportador ubicuo en todos los mamíferos y es abundante en el cerebro, exclusivo de la BHE en la membrana abluminal y en las células epiteliales del PC. (2)GLUT1 tiene un peso molecular entre 45 y 55kDa, los más grandes se encuentran en la microvasculatura y los más pequeños en las neuronas y glia. GLUT3 sólo se encuentra presente en neuronas in vivo. GLUT1 se encuentra presente en la membrana basolateral de las células epiteliales de los PC y no se encuentra GLUT3 ni 2. Asimismo, la presencia de GLUT1 en la zona apical del epitelio de los PC se encuentra ausente. (2)

Existen diversas alteraciones que disminuyen la expresión de GLUT1 en el cerebro, sin embargo, aunque éste se encuentre disminuido en la BHE, realiza un transporte suficiente de glucosa para mantener la actividad neuronal. La expresión de GLUT1 en la BHE también se ve afectada por los astrocitos y la glia, en caso de que el cerebro necesite mayor aporte de glucosa, aumenta su expresión en las células endoteliales. Los astrocitos sometidos a hipoxia liberan factores humorales que aumentan la expresión de GLUT1. (2)

Se encuentran diferencias funcionales importantes en cuanto al transporte de glucosa en células endoteliales cerebrales y células epiteliales de los PC; las primeras, proveen flujo transcelular de glucosa al líquido intersticial cerebral, proveyendo al cerebro de su principal fuente de combustible, mientras que las segundas, utilizan la glucosa para satisfacer sus necesidades metabólicas. (2)

Transportadores de aminoácidos:

El cerebro requiere aminoácidos esenciales para la síntesis de proteínas. El influjo de aminoácidos de la sangre al cerebro se aproxima a la tasa de incorporación de aminoácidos a las proteínas cerebrales. (2) Numerosos genes de la familia de SLC de transporte de proteínas de membrana se encuentran presentes en los plexos coroideos. En la etapa embrionaria se encontraró aumento en varios transportadores de aminoácidos: Slc16a10, Slc17a11, Slc1a4, Slc38a4, Slc7a1k, la mayoría, involucrados en el metabolismo protéico. Otros, involucrados en el transporte de hormonas tiroideas como Slc16a2 (MCT8) y Slco1c1 (Oatp14) se encontraron de manera similar en embriones y adultos; finalmente uno de los transportadores de hormona tiroidea presentaba mayor expresión en embriones fue Slc16a10 (TAT1, MCT10), sin embargo no se encontró en el cerebro adulto. (1)

El transporte de aminoácidos se encuentra aumentado en la etapa embrionaria, ya que hay un elevado número de transportadores en esta etapa, comparada con la etapa adulta. (1)

La mayor parte de los aminoácidos son neutrales, con cadenas largas y funcionan como sustratos del sistema de L-transportadores de aminoácido (LAT). LAT1 es el principal transportador en BHE y se expresa en la membrana luminal y abluminal de las células endoteliales. Su actividad de induce por la cadena ligera 4F2 (4F2lc), y su tráfico e inserción a la membrana basal depende de la coexpresión de la cadena pesada 4F2 (4F2hc) creando el complejo 4F2lc-4F2hc (antígeno de membrana CD98). Por lo que se considera que 4F2hc es capaz de mediar el transporte e aminoácidos. (2)Otro transportador presente en las células endoteliales es LAT2 aunque en menor proporción. LAT 1 y 2 tienen afinidad por aminoácidos neutros pequeños, alanina, serina y cistina. Los aminoácidos catiónicos son transportados de la sangre al cerebro por transportadores saturables dependientes de sodio; sistema y+ (SLC7A1), presente en la cara luminal de la BHE. En la membrana abluminal se encuentran varios sistemas transportadores dependientes de sodio como SLC38A2 (alanina), SLC1A5 (alanina, serina y cisteína), sistema Bo+ (SLC7A3) para aminoácidos básicos; sistema N (SLC38A5) para aminoácidos ricos en nitrógeno (glutamina, asparagina e histidina) transportadores de aminoácidos exitatorios (EAAT/SLC1A 1-3) que median el transporte de aspartato glutamato. (2)

Aminoácidos pequeños como alanina serina son transportados por 2 sistemas dependientes de sodio que se encuentran exclusivamente en la membrana abluminal; sistema A, que es la ruta principal para el transporte de alanina y el sistema ASC que tiene afinidad para aminoácidos neutrales largos. Ambos sistemas están relacionados con el eflujo de aminoácidos del cerebro. (2)

El sistema EAAT es importante ya que permite remover el glutamato del cerebro, éste puede causar neurotoxicidad si se acumula en el líquido intersticial cerebral ya que puede provocar una sobrecarga de calcio, provocando daño o muerte neuronal. El glutamato se libera durante la neurotransmisión, pero es rápidamente tomado por neuronas y astrocitos. Hay 3 EAAT presentes en la membrana abluminal de las células endoteliales: EAAT 1, 2 y 3, y su función es prevenir la exitotoxicidad, ya que remueven el glutamato del líquido intersticial cerebral al citoplasma de las

células endoteliales cerebrales. En el lado luminal, el glutamato se transporta por transportadores facilitadores XG

-. A diferencia de la BHE, las células epiteliales de los PC no expresan EAAT, lo que sugiere que no juegan un papel importante en la eliminación de neurotransmisores exitatorios fluido extacelular cerebral. (2)

Muchos aminoácidos neutros, aspartato y glutamato cruzan la parte luminal de las células epiteliales de los PC por mecanismos independientes de sodio. Expresan LAT1 lo que puede explicar este mecanismo, asimismo expresan transportador y+, sistema N, pero carecen de sistema A y ASC. Tanto el epitelio de los PC como las células ependimales transportador lisosomal de aminoácidos (LYAAT-1) que regula el cotransporte de H+ y juega un papel activo en el eflujo de aminoácidos de los lisosomas. (2)

Transportadores de monocarboxilato:

El SNC se nutre principalmente de glucosa, sin embargo algunas células gliales y neuronas no usan glucosa como fuente de energía en el mismo grado: los astrocitos toman la glucosa que atraviesa las células endoteliales y realiza glicólisis, produciendo lactato, el cual se libera al líquido intersticial cerebral que subsecuentemente es tomado por las neuronas circundantes. (2)Los protones, el lactato y otros aniones monocarboxilados necesitan mecanismos de transporte específicos para atravesar la membrana celular, esto se logra por medio de los transportadores monocarboxilados unidos a protones (MCT). Se han identificado 14, 4 de ellos se encuentran en el cerebro: MCT 1, 2, 4 y 8. MCT4 se expresa en astrocitos y se encarga de exportar el lactato producido durante la glicólisis al líquido intersticial cerebral, de ahí, el lactato se transporta a las neuronas por MCT2. Las células endoteliales cerebrales expresan MCT1 en la membrana luminal, abluminal y en los organelos. MCT8 se expresa en la microvasculatura y es mediador del transporte de hormonas tiroideas. MCT1 en la BHE juega un papel importante en la eliminación de lactato del líquido intersticial cerebral a la sangre. Las células epiteliales de los PC expresan principalmente MCT8 en la superficie apical y se cree que tiene que participa en el transporte de hormonas tiroideas, también expresa MCT1 en la membrana basolateral y apical en menor medida que en la BHE y MCT2 se encuentra ausente. (2)

Receptores y transportadores de péptidos:

Los péptidos no pueden utilizar los sistemas de transporte de aminiácidos a que presentan enlaces peptídicos por lo que tienen sistemas de transporte específicos. Los transportadores de péptidos (PTR) son proteínas transportadoras de solutos (SLC15A) responsables del transporte de membrana de di y tripéptidos. Otra familia de transportadores de péptidos (PTS 1-9) median el transporte de péptidos más largos (más de 3 aminoácidos en la cadena), en la mayoría de los tejidos funcionan como bombas de eflujo, removiendo los péptidos lipofílicos de las membranas celulares. (2)

La familia de los PTR consiste en 4 miembros: 2 transportadores de péptidos (PEPT 1 y 2) y 2 transportadores de histidina, que también transportan dipéptidos (PHT 1 y 2). El transporte de PTR’s a través de la membrana se acopla con el movimiento de protones (gradiente electroquímico de protones). Aunque no hay evidencia de la presencia de PTRs en las células endoteliales cerebrales estas céluals probablemente expresan algunos PTS en el lado abdluminal que media el eflujo de péptidos pequeños del líquido intersticial cerebral (encefalinas, Tyr-MYF-1, arginina vasopresina y LHRH). (2)

Al parecer los sistemas de transporte de péptidos en la BHE impiden la transferencia de la sangre al líquido intersticial cerebral de pépidos intactos. La entrega de péptidos al cerebro se impide por la existencia de enzimas en las células endoteliales que modifican las cadenas de aminoácidos o hidrolizan los enlaces peptídicos; estas enzimas incuen la γ-glutamil transpeptidasa, descaboxilasa ácida aromática, dipeptidil (amino) peptidasa 4 y aminopeptidasas A y N. (2)

Los péptidos más largos y proteínas tienen receptores específicos en la membrana luminal de las células endoteliales y utilizan la transcitosis mediada por receptores para atravesar la BHE. Este mecanismo se utiliza para el transporte de insulina, transferrina, algnas citocinas, leptina, inmunoglobulina G y factor de crecimiento similar a insulina. (2)

En la endocitosis adsortiva, la interacción de una proteína o un péptido con carga positiva, con glicoproteínas o regiones con carga negativa de las células endoteliales causa adsorción de la molécula a la superficie de las células endoteliales, causando internalización de la molécula, aunque su destino posterior aun se desconoce. Se dice que péptidos de más de 400KDa no pueden atravesar la BHE, sin embargo no hay un punto de corte absoluto. (2)Con el aumento de la liposolubilidad, aumenta el secuestro hepático y la unión con proteínas plasmáticas, por lo que disminuye la vida media del péptido en el plasma y hay menor disponibilidad para la interacción en las células endoteliales. Además, la difusión libre es seguida de escisión proteolítica en las células endoteliales o de eflujo activo por P-gp (Glicoproteína P) o PTS’s. Otra estrategia para el transporte de fármacos al cerebro es por medio de transocitosis mediada por receptores (Caballo de Troya), incluye la conjugación de diferentes péptidos con suministro limitado en el cerebro a anticuerpos monoclonales contra alguno de los receptores de péptidos de la BHE como el de transferrina. Al unirse el anticuerpo al receptor se desencadena el mecanismo de endocitosis, sin embargo, estos receptores no son exclusivos de cerebro, por lo que su uso es limitado. (2)

Las células endoteliales cerebrales no sólo participan en el transporte/transitosis de péptidos/proteínas, también son blanco de péptidos bioactivos y sintetizan péptidos neuroactivos; producen y secretan diversas citocinas posterior a injuria cerebral. (2)

Contrario a lo que sucede en la BHE, muchos transportadores de péptidos acoplados a protones de la familia de los PTR se expresan en la BSLCR. PEPT2 es un transportador de oligopéptidos abundante en las células epiteliales; en cerebro se localiza en la membrana apical, del lado del

LCR. PEPT1 y 2 tienen afinidad a di y tripéptidos. Además de las células epiteliales de los PC, PEPT2 se encuentra en las células ependimales en los ventrículos cerebrales, por lo que la función de este transportador es eliminar los di tripeptidos del LCR. Los PEPT’s también transportan peptidomiméticos, por lo que su presencia en la membrana apical de las células epiteliales de PC restringe la entrada de peptidomiméticos de la sangre al LCR. Las células epiteliales de los PC también participan en la endocitosis mediada por receptores y en la transitosis. (2)

Las células epiteliales de los plexos coroideos no sólo participan en la eliminación de péptidos del LCR y de su transporte de la sangre al LCR, también son blanco para múltiples hormonas como el péptido natriurético auricular, y son fuente extrahipotalámica de arginina vasopresina (AVP) que disminuye el eflujo de cloro y consecuentemente disminuy la producción de LCR. Una característica importante presente en las células epiteliales de los PC y no en las células endoteliales es la síntesis de transtiretina (TTR) que funciona como transportador de tiroxina y proteína de unión a retinol. Al unirse a la albúmina forman un sistema buffer para L-tiroxina plasmática por las afinidades sobrepuestas de la hormona. (2)

Transportadores de iones en la BHE y PC:

Existe evidencia que demuestra que hay flujo desde el fluido cerebral intersticial de los capilares cerebrales hacia los espacios ventriculares donde se mezcla con el LCR, este flujo se lleva a cabo principalmente en los espacios perivscualres. Indicando que hay una producción constante de fluido intersticial cerebral que contribuye al volumen total del LCR. Aunque este fluido se produce por el agua del metabolismo cerebral, la producción de éste por las células endoteliales también es una fuente importante contribuyendo con el 30% de su volumen. Esta producción es esencial para mantener el balance de fluido cerebral. (2)

Hay 2 proteínas de membrana que actúan simultáneamente en las células endoteliales para regular el transporte de sodio y cloro en la BHE: Na+, K+ ATPasas (familia ATP1) y Na+, K+, Cl-

cotransportador (familia SCL12); el primero localizado en la membrana abluminal, proporciona una fuerza motriz para el movimiento de iones y agua a través de la BHE, 3 alfa (ATP1A1-3) y 2 beta (ATP1B1-2). Su actividad está relacionada con la regulación del volumen celular. El segundo, se localiza en la membrana luminal y su actividad se regula por señalización PKC. Adicionalmente, expresan canales de potasio (Kv1 y Kir2), expresados en ambos lados, luminal y abluminal. Además las células endoteliales expresan 2 intercambiadores iónicos de la familia SLC probablemente involucrados en la regulación del pH: el intercambiador decloro-bicarbonato (Cl - - HCO3

-)(SLC4A1) y el intercambiador de sodio-hidrógeno (Na+-H+)(SLC4A6) con 2 isoformas (Nhe1 y Nhe2), ambas presentes en la membrana luminal, ientras el intercambiador de cloro-bicarbonato (Ae1) se encuentra en las membranas luminal y abluminal. (2)

El flujo de K+ en la BHE es crítico para mantener la homeostasis, sin embargo, su flujo a través de la BHE no se conoce con claridad. Al menos uno de los siguientes mecanismos debe ser la fuente de éste en LCR: LCR secretado por los plexos coroideos o el fluido intersticial cerebral secretado por

las células endoteliales. Los PC principalmente reabsorben K+ del LCR, por lo que se dice que por lo menos de manera parcial, el K+ presente en LCR es secretado en la BHE. (2)

El transporte de iones en la BHE juega un papel importante en la regulación del pH de las células endoteliales, especialmente el transporte de bicarbonato. Cuando hay una carga leve de ácido hay influjo de HCO3

- regulado principalmente por el intercambiador de cloro-bocarbonato, sin embargo, si hay cargas grandes de ácido, éste se remueve prácticamente sólo por el intercambiador de Na+ H´+. Si hay una carga alcalina, el pH se regula por el intercambiador de cloro bicarbonato. (2)

El LCR juega un papel importante en la homeostasis y cumple con varias funciones: reducción del peso efectivo del cerebro, remoción de productos de desecho del metabolismo, remover el exceso de neurotransmisores y detritus del epitelio de superficie y transporte de moléculas de señalización. El transporte de bicarbonato afecta directamente el pH del LCR, lo que afecta la actividad neuronal en el centro respiratorio en la medula oblongada. (2)

Existe 2 procesos principales regulados por el transporte de iones en los plexos coroideos: el movimiento transepitelial basolateral a LCR de sodio, bicarbonato y cloro, crea una fuerza osmótica que mueve el agua en la misma dirección. El movimiento de agua a través de las células epiteliales es por medio de acuaporina 1, un canal de agua ampliamente expresado en la membrana apical y en menor medida en la basolateral. En segundo lugar el transporte de potasio del LCR a la membrana basolateral. Además del flujo de otros iones como calcio, aniones y cationes orgánicos. (2)El movimiento de sodio de la sangre a los ventrículos debe ser dependiente de ATP. Los transportadores de sodio que se expresan en la membrana basolateral de las células epiteliales de los PC cargan a las células con sodio, mientras que los que se expresan en la membrana apical, transportan sodio de las células al LCR. El cloro bicarbonato pasan la capa de células epiteliales por vía trascelular. Se cree que la principal ruta de entrada de sodio en la membrana basolateral por un transportador estilbeno-sensible de Na+-HCO3

- y transporta sodio y bicarbonato al interior celular. El cloro se acumula en las células epiteliales de los PC por acción del intercambiador de Cl —

HCO3-. En las células epiteliales en movimiento intracelular de cloro se dirige por un gradiente

externo de bicarbonato, creado por el cotransporte en la membrana basolateral de sodio-bicarbonato. (2)

El transporte de estos iones al LCR en la membrana apical depende de varias proteínas. Na +, K+

ATPasa, localizada en la membrana apical, es probablemente el más importante extrusor de sodio. Hay 3 subunidades en PC: α1 (ATP1A1), β1 (ATP1B1) y β2 (ATP1B2). El intercambiador Na+, H+ tipo 1 tambipen predomina en la membrana apical, sin embargo se involucra en la regulación del pH, más que como extrusor de sodio. El transporte de cloro en la membrana apical es impulsado por un gradiente hacia el LCR, y se lleva a cabo principalmente por el cotransportador 4 de K + - Cl-

(SLC12A7 o KCC4). La membrana apical también expresa el cotransportador 1 de Na +, K+ 2Cl-

(SLC12A2 o NKCC1), sin embargo su papel es controversial ya que estudios recientes sugieren que

no contribuye con el flujo. El transporte de bicarbonato del LCR por la membrana apical es mediado principalmente por el intercambiador electrogénico Na+- HCO3

- (SLC4A5 o NBCe2/NBC4) que transporta 1 sodio y 3 bicarbonatos y tiene un papel importante en la regulación del pH del LCR. El flujo de bicarbonaro en PC es principalmente por el canal iónico de cloro, que tiene ligera permeabilidad a bicarbonato; este canal juega un papel en la extrusión de bicarbonato. (2)

Acuaporinas:

Las acuaporinas 1, 9, 11 y 12, se encuentran igualmente expresadas durante la etapa embrionaria y en la edad adulta en las células epiteliales de los plexos coroideos. Sólo la acuaporina 1 se ha documentado que tiene una función en el transporte de agua y secreción de LCR en plexos coroideos. (1)

Proteínas de unión:

La concentración de proteínas en LCR es mayor durante la etapa embrionaria. Se sugiere que es debido a un mecanismo de transferencia de proteínas específico que permite el movimiento de proteínas de la sangre al LCR, y que éste mecanismo puede ser mediado por receptores. La importancia fisiológica de la alta concentración de proteínas el cerebro en desarrollo se debe a que es necesario mantener gradientes de presión coloidosmótica altos que permitan el desarrollo cerebral normal, y actuar como transportadores de moléculas escenciales como factores de crecimiento, hormonas o nutrientes. (1)

Gypa, Gypc y Sparc, se encontraron aumentadas en la etapa embrionaria comparada con la edad adulta. Éstas están involucradas tanto en el transporte de albúmina, como de otras proteínas plasmáticas a través de las células epiteliales de los plexos coroideos. La distribución de las proteínas cambia dependiendo de la edad; en la etapa embrionaria, GYPA fue inmunorreactiva en las células epiteliales en la zona apical y basolateral, y en células endoteliales, a diferencia de la edad adulta, en la que se encontraban en baja cantidad, en el interior de la célula epitelial. SPARC fue positiva sobre todo en la parte apical, extendiéndose a la membrana basolateral de las células epiteliales de los plexos y su concentración fue disminuyendo hasta llegar a la edad adulta, donde se observa en forma de vacuolas citoplasmáticas; en el espacio perivascular y las células endoteliales fueron negativas. (1)

Proteínas de membrana asociadas a vesículas:

Las proteínas de membrana asociadas a vesículas (VAMP), involucradas en la fusión vesicular, se encuentran distribuidas en estructuras post-Golgi y en la membrana plasmática de las células transportadoras. Vamp 1,5 y 8 se encontraron aumentadas en las células epiteliales de los plexos adultos. Esto sugiere que hay 2 mecanismos de transferencia en la barrera sangre-LCR: uno específico para proteínas individuales; y otro no específico, por formación y liberación vesicular. Estos mecanismos pueden estar implicados en la translocación de albúmina y otras proteínas a

través del epitelio de los plexos. VAMP5 se encuentra en la membrana basolateral y apical, ayudando a empacar moléculas en sangre, LCR y en el interior celular, mientras VAMP1 se encuentra en la membrana celular y VAMP8 se encuentra en los endosomas citoplasmáticos y remueve material no deseado de la célula. (1)

Mecanismo propuesto para el transporte de proteínas plasmáticas a través de las células epiteliales de los plexos coroideos.

Existen 2 mecanismos de transferencia de proteínas que actúan de manera paralela a nivel de las células epiteliales de los plexos coroideos en la BSLCR: uno específico para proteínas plasmáticas individuales (por la presencia de receptores específicos en la superficie basolateral) con dirección de la sangre al LCR, que opera predominantemente durante el desarrollo; y el segundo, no específico de formación y liberación vesicular en ambas direcciones (de la sangre a LCR y del LCR a la sangre), que opera durante el desarrollo y en la edad adulta. (1)

Órganos Circumventroculares:

A pesar de que la BHE y la BSLCR son las principales vías de entrada al SNC, estudios recientes han demostrado que el ingreso de células y moléculas al SNC no se limita a éstas barreras.

En el SNC hay órganos que carecen de BHE, que monitorizan el estímulo hormonal o de otras sustancias o secretan sustancias neuroendócrinas a la sangre y son conocidos como órganos circumventriculares (CVO’s). Se localizan cerca de la línea media del cerebro, dentro de las paredes ependimales que recubren el 3° y 4° ventrículo, formando la BSLCR y pueden ser otra vía de entrada al SNC. (4)

La eminencia media (EM), en la base del 3°ventrículo, corresponde a CVO’s puramente neuroendócrino, contiene los axones terminales de la hipófisis y glia especializada, incluye la glándula pineal y neurohipófisis, se encarga de la liberación de hormona liberadora de gonadotropina, influyendo en las funciones reproductivas. Los CVO’s sensoriales, como el órgano subfornical (OSF), el organum vasculosum de la lámina terminal (OVLT) y el área postrema (AP) se caracterizan por presentar una alta densidad de neuronas pequeñas, astrocitos y microglia. El OSF y OVLT se encuentran en la pared del 3° ventrículo, y el AP se encuentra en el piso del 4° ventrículo. Estos CVO’s monitorean cambios en la composición iónica, osmótica y hormonal de la sangre, y están involucrados en la regulación de la sed y el metabolismo de fluidos. (4)

Schulz y colaboradores realizaron un modelo experimental de encefalomielitis autoinmune en el cual se observó aumento de moléculas de adhesión (ICAM-1 y VCAM-1) en la microvasculatura de los CVO’s, acompañado de aumento de MCHI en CVO’s y MHCII en las células perivasculares; por lo que los CVO’s pueden estar involucrados en procesos inflamatorios en SNC. (4)

Se investigaron 4 CVO’s: OSF, OVLT, EM, AP, todos ellos carecen de BHE y muestran mucrovasculatura fenestrada MECA-32+, el cual es positivo en el endotelio maduro de la BHE. En los ratones sanos se encontró en anticuerpo positivo en los OCV’s, asimismo PCAM-1 fue positivo y en algunos vasos ICAM-2. Moléculas de adhesión como VAM-1, ICAM-1, MAdCAM-1, E y P-selectina fueron negativos en ratones sanos. Se observó positividad para un pequeño número de células perivasculares CD45. Y solo en el 10% de las tinciones se observaron marcadores de macrófagos como F4/80, MAC-1, MHC I o II y LFAI. Las tinciones en parénquima para estos marcadores siempre fueron negativas en ratones sanos. CD3, CD4, CD8 y B220, siembre fueron negativos en los CVO’s en ratones sanos. (4)

En los ratones con EAE, continuaron positivos para MECA-32, PCAM-1 e ICAM-2. Sin embargo se observaron altas concentraciones de células CD45+ en la proximidad de la microvasculatura y se observaron también en el parénquima de los CVO’s. Además del reclutamiento de células CD45+, se observó positividad del marcador en células ramificadas, indicando que CD45 aumenta en en las células de la microglia de los CVO’s. Se buscaron marcadores de células T, B y macrófagos, encontrando macrófagos o microglia F4/80+ exclusivamente alrededor de la vasculatura y Mac-1+

también en el parénquima. MAC-1 se detectó en macrófagos reclutados a los CVO’s y en la microglia. Los linfocitos T DC3+ se encontraron en escasa cantidad, sin embargo, las que fueron positivas, reclutadas en el OSF fueron linfocitos T cooperadores CD4+. (4)

Se buscaron moléculas de adhesión ICAM-1 y VCAM-1 en la microvasculatura de los CVO’s y se observó una inducción importante de ICAM-1 y en menor grado de VCAM-1 y ausencia de MadCAM-1, E-selectina y P-selectina. ICAM-1 se detectó en la superficie luminal y VCAM-1 se detectó en la superficie luminal de los CVO’s excepto en la EM. Con estos resultados se observa que el reclutamiento de células inflamatorias en los CVO’s, depende principalmente de LFA-1/ICAM-1 o Mac-1/ICAM-1. Los mecanismos de reclutamiento de células inflamatorias son diferentes a los de la BHE que son dependientes de α-integrinas y VCAM-1. (4)

Además se observó un aumento en la expresión de MHC clase I en todo el parénquima y MHC clase II en las células perivasculares. El infiltrado inflamatorio, se observó predominantemente en el parénquima o las paredes ventriculares localizados en la vecinidad o adyacente a los CVO’s, demostrando su participación en el reclutamiento de células inflamatorias. (4)

Los CVO’s se pueden considerar como vía de entrada de citocinas proinflamatorias al SNC ya que presentan de manera constitutiva receptores para estas citocinas y fragmentos bacterianos. Asimismo, la liberación de citocinas proinflamatorias como TNF-α o IL-1 fuera del SNC envía señales a éste por los CVO´s provocando respuestas neuroendócrinas como la elevación de ACTH, fiebre y la activación del eje hipotálamo-hipófisis-adrenal. (4)

Bibliografía

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1. Liddelow S, Temple S, Møllga°rd K, Gehwolf R, Wagner A, Bauer H, et al. Molecular Characterisation of Transport Mechanisms at the Developing Mouse Blood–CSF Interface: A Transcriptome Approach. PLoS ONE. 2012; 7(3).

2. Redzic Z. Molecular biology of the blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: similarities and differences. Fluids and barriers of the CNS. 2011; 8(3): p. 1-23.

3. Pardridge W. Molecular Biology of the Blood–Brain Barrier. MOLECULAR BIOTECHNOLOGY. 2005; 30.

4. Schulz M, Engelhardt B. The circumventricular organs participate in the immunopathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis. Cerebrospinal Fluid Research. 2005; 2(8): p. 1-14.

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