Biología de las chaperoninasMuchas proteínas son incapaces por sí solas de alcanzar su conformación nativa. Las chaperoninas son unos complejos proteicos que facilitan el plegamiento adecuado de aquéllas."La conformación nativa de una proteína está determinada por la totalidad de sus interacciones atómicas y, por tanto, por su secuencia aminoacídica." En esta afirmación queda enunciada una de las hipótesis que más interés ha suscitado en el campo de la biología molecular en los últimos treinta años, la relativa al plegamiento de las proteínas.De acuerdo con esa hipótesis, avanzada en 1953 por Christian Anfinsen, la información requerida para que una cadena de aminoácidos se pliegue se encuentra en la propia secuencia. Desde los años veinte, el progreso de la química permitió caracterizar las proteínas como estructuras homogéneas. Además de su tamaño grande, en comparación con los lípidos o los azúcares, las proteínas presentan una notable complejidad. En 1953 Frederick Sanger determinó la secuencia de los aminoácidos componentes de la insulina. Se lograron luego las primeras síntesis de péptidos de interés biológico, las hormonas oxitocina y vasopresina. Se realizaron también las primeras hipótesis sobre los tipos de estructuras que las proteínas pueden adoptar en solución (hélice a, lámina ,B y otras). Se dio un paso más y se vinculó la estructura a la función. Pero, ¿mediante qué mecanismos las moléculas de proteína adoptan la conformación adecuada al objeto de cumplir su función? ¿Cómo se pliegan?.El principio de autoplegamiento de las proteínas descrito por el equipo de Christian Anfinsen, y los experimentos subsiguientes que demostraron su validez, provocaron una revolución en biología molecular y crearon el nuevo campo que ha dado en llamarse del plegamiento de proteínas. Anfinsen sugería en 1963 que "otra molécula (por ejemplo un anticuerpo, otra proteína o incluso la misma proteína) pudiera influir en el proceso de plegamiento mediante reacciones intermoleculares".Se comprobó muy pronto que no basta el proceso de autoplegamiento para garantizar el plegamiento de las proteínas in vivo. El plegamiento no es en muchas ocasiones espontáneo, sino que requiere de la interacción entre proteínas ya existentes y de consumo de energía, de ATP. A esas acompañantes moleculares se las llamó "chaperonas moleculares".El término lo acuñó Ronald Laskey en 1978 para describir las propiedades de la nucleoplasmina, una proteína nuclear que interviene en el ensamblaje de los nucleosomas a partir de ADN y de histonas. La nucleoplasmina, una proteína fuertemente ácida, se une transitoriamente a las histonas, con lo que reduce su carga positiva e inhibe la tendencia de éstas a agregarse inespecíficamente con el ADN. Molécula dotada de carga negativa, la nucleoplasmina no proporciona información espacial a las histonas para que se plieguen adecuadamente, ni es un componente estructural de los nucleosomas, pero su interacción con las histonas permite que las propiedades de autoplegamiento de éstas predominen sobre la tendencia a unirse al ADN en razón de sus cargas opuestas. La acción de la nucleoplasmina, fugaz, ni genera ni rompe enlaces covalentes.

Las chaperonas moleculares son proteínas que unen y estabilizan conformaciones inestables de otras proteínas. Mediante uniones y liberaciones controladas, facilitan la conformación nativa de las proteínas o el ensamblaje entre éstas para crear oligómeros. De la familia de las chaperonas forman parte numerosas proteínas de distinta secuencia y diverso peso molecular. Las chaperoninas, en particular, desempeñan un papel muy activo en el plegamiento de proteínas.

Las chaperoninasSean Hemmingsen acuñó en 1986 el término chaperonina para designar una familia de proteínas que comparten homología en su secuencia aminoacídica y actúan como chaperonas en cloroplastos, mitocondrias y bacterias. Su peso molecular está en torno a los 60 kilodalton.

La primera chaperonina descrita como tal fue la proteína que se une a la ribulosa bifosfato carboxilasa, RBP (Rubisco binding protein). La enzima Rubisco se encarga de asimilar, a partir de CO2, el carbono por los cloroplastos. El grupo de John Ellis, de la Universidad de Warwick, descubrió que la subunidad grande de la Rubisco tiende a formar agregados insolubles cuando se aísla. Ellis y su equipo encontraron una proteína que se une a la Rubisco e impide su agregación. Puesto que RBP, de 60 kilodalton de peso molecular, no guarda ninguna homología con la nucleoplasmina, se pensó que las dos proteínas constituían casos especiales, ideados ad hoc por la naturaleza para tratar con proteínas oligoméricas (histonas y Rubisco), cuyo plegamiento podía presentar dificultades.

Las chaperoninas moleculares ejercen varios efectos en el plegamiento de las proteínas. Chaperonas de diversos tipos se unen a polipéptidos recién sintetizados en los ribosomas, a protínas que atraviesan las membranas de orgánulos o a proteínas que se han desnaturalizado. Esta unión, en un número elevado de casos, desempeña un papel protector y evita que las protínas alcancen un estado de agregación irreversible. Sin negar que las chaperonas intervengan de forma directa en el plegamiento de las proteínas, en la mayoría de los casos parecen transportar los polipéptidos desnaturalizados hasta las chaperoninas, donde se pliegan.

En 1986, Hugh Pelham, del Laboratorio de Biología Molecular de Cambridge, lanzó la hipótesis de que RBP, la nucleoplasmina y otras proteínas asociadas a estados de choque térmico o de aumento de temperatura celular (hsp, heat shock proteins) actuarían como chaperonas moleculares; sugirió también que el mecanismo de plegamiento podría ser un fenómeno común en la naturaleza. Las técnicas de comparación de secuencias respaldaron su hipótesis. La proteína que se une a la ribulosa bifosfato carboxilasa manifestaba una homología del 50% con la secuencia de GroEL, una proteína de E. Coli indispensable en la morfogénesis de ciertos bacteriófagos.

El descubrimiento de la homología entre RBP y GroEL provocó otros muchos ensayos parecidos a los que Anfinsen realizó tres décadas antes: las proteínas se desnaturalizan mediante la urea y se renaturalizan en presencia de GroEL. Este tipo de experimentos mostró que, para un elevado número de proteínas, la presencia de GroEL, en el peor de los casos, acelera el proceso de plegamiento que se produce en ausencia de ella, mientras que en el mejor de los casos resultaba imprescindible para el plegamiento de la proteína.Al mismo tiempo que se descubría la homología entre Rubisco y GroEL, se observó que los anticuerpos generados contra GroEL reaccionan también contra una serie de proteínas de choque térmico y de peso molecular cercano a 60 kilodalton, pertenecientes a mitocondrias de plantas, levaduras y células animales. Esas proteínas intervienen en el plegamiento de proteínas importadas del citosol y presentan, además, una estrecha homología de secuencia con Rubisco y GroEL.Las chaperoninas ayudan al plegamiento de proteínas, lo mismo en situaciones normales que en condiciones de estrés. Ese fenómeno contrasta con la tendencia observada en muchas proteínas celulares a desnaturalizarse. De ese modo adquirió, a ojos de la ciencia, un significado más amplio la función de las acompañantes moleculares. Pero ni todas las proteínas de estrés térmico son chaperoninas ni todas las chaperoninas son proteínas de estrés térmico; así, mientras GroEL ve aumentada su expresión cuando E. coli sufre un choque térmico, las chaperoninas cloroplásticas no se activan con el calor.La familia de las chaperoninas se cierra por ahora con el descubrimiento de un segundo tipo que se encuentra en arqueobacterias y en el citosol de organismo eucariotas. A ella pertenecen las chaperoninas termofílicas del tipo TF55 (factor termofílico 55, en referencia a su peso molecular) y la eucariótica CCT (chaperonina que contiene el polipéptido TCP-1). Esta subfamilia de chaperoninas muestra una estrecha homología entre sus miembros y una débil aunque significativa homología con las del primer tipo.

Plegamiento de una proteína desnaturalizada. Se trata aquí de la rodanasa, enzima mitocondrial involucrada en la formación y mantenimiento de las proteínas de transporte electrónico que poseen hierro y azufre. Que se lleve a cabo el plegamieto depende de la presenciade las chaperoninas GroEL y GroES y de ATP. La rodanasa desnaturalizada no posee actividad enzimática (A, línea negra). Ni la presencia de GroEL (línea azul) no la conjunta de GroEL y GroES (línea roja) son capaces de plegar correctamente la rodanasa de manera que vuelva a ser activa; sólo la adición de GroEL, GroES y ATP (línea verde) consigue su plegamiento eficaz.

Se descubrió que CCT es una chaperonina mientras se buscaban homologías de secuencia de la TFSS. Se observó que la proteína TFSS de origen termófilo guarda bastante homología con TCP-I, proteína de función hasta entonces desconocida. Más tarde se conocería que la chaperonina CCT interviene en el plegamiento de la actina y la tubulina. Las chaperoninas extremófilas parecen ejercer una función más inespecífica en el plegamiento de proteínas.Conviene resaltar una diferencia importante entre chaperoninas del primer y del segundo tipo. Si las del segundo grupo tienden a actuar en solitario, la GroEL y demás chaperoninas del primer grupo actúan en coordinación con una chaperonina de bajo peso molecular (en torno a los 10 kilodalton), a la que se unen en presencia de ATP para formar un complejo estable. Estas proteínas se llaman cochaperoninas, denominándose GroEs a la cochaperonina de GroEL.

Estructura de las chaperoninasPodemos reducir a tres las funciones principales de las chaperoninas: impedir la agregación de los polipéptidos parcialmente plegados y liberados de los ribosomas, unirse a péptidos parcialmente plegados aunque atrapados en una conformación tal que no pueden plegarse de manera espontánea y, por fin, proteger a las proteínas de la desnaturalización debida a estrés térmico o facilitar el plegamiento si se ha producido la desnaturalización. Compete, pues, a las chaperoninas generar las condiciones adecuadas para un plegamiento correcto de las proteínas desnaturalizadas .El porcentaje de proteínas renaturalizadas in vitro guarda una relación inversa con la concentración de proteína en el experimento y la temperatura a la que éste se realiza. De ese modo se reduce la probabilidad de interacciones incorrectas. En la célula, sin embargo, la concentración de proteína total es, al menos, dos órdenes de magnitud mayor que en los experimentos de plegamiento in vitro, concentración que fomenta el "apelotonamiento molecular" y, por tanto, las interacciones incorrectas.Nuestro conocimiento de la estructura de las chaperonina ha avanzado con el desentrañamiento de GroEL de E. coli, un oligómero constituido por catorce subunidades que, juntadas en sendos heptámeros anulares idénticos, conforman un toroide. Observados al microscopio electrónico de transmisión, los anillos del toroide encierran dos cavidades, conectadas a través de un canal de pequeño grosor. Aunque la morfología de "toroide de doble anillo" es compartida por todas las chaperoninas, las de eubacterias y de orgánulos eucariotas difieren de las chaperoninas de arqueobacterias y del citosol eucariota en su simetría y composición. Las chaperoninas de eubacterias y de orgánulos eucariotas dibujan tetradecámeros compuestos por una o dos subunidades distintas, mientras que las chaperoninas de arqueobacterias y del citosol eucariota forman hexadecámeros u octadecámeros que constan de una o varias (hasta ocho) subunidades distintas.La cochaperonina GroES complementa la estructura de las cochaperoninas. Está constituida por un heptámero de la proteína del mismo nombre. En presencia dé GroEL y de algún nucleótido (ATP, ADP o incluso algún análogo no hidrolizable de ATP), el oligómero se une a GroEL y tapa la cavidad de uno de sus anillos.La cristalografía de rayos X vino en ayuda de la biología, permitiéndole descifrar la relación entre estructura y función de las chaperoninas. Los grupos de Arthur Horwich y Paul Sigler, de Yale, han sacado a la luz los dominios funcionales de

GroEL. En el monómero de GroEL se distinguen tres regiones definidas. Hay un dominio ecuatorial, donde encontramos la mayoría de los aminoácidos responsables de la interacción con las subunidades del mismo anillo y todos los responsables de la interacción con las subunidades del otro anillo. Reside en ese mismo dominio la zona de unión a la molécula de ATP, molécula que es decisiva para el mantenimiento del ciclo de funcionamiento de la chaperonina.Un segundo dominio, el apical, forma el techo de la cavidad de cada anillo. En la boca de la cavidad se aloja un grupo de aminoácidos hidrófobos, implicados en la unión de GroEL con el sustrato desnaturalizado y con GroES. El tercero, o dominio intermedio, pone en contacto el dominio ecuatorial con el apical y a modo de bisagra, permite los grandes movimientos que se producen en el dominio apical durante el ciclo de funcionamiento de la GroEL.

Muestra en la que se han incubado chaperoninas GroEL y GroES en presencia de ATP. GroEL es un oligómero formado por 14 subunidades de una sóla proteína, dispuestas en dos anillos heptaméricos, y con una estructura cilíndrica. Al microscopio electrónico GroEL posee dos tipos de vistas. En una de ellas, la llamada frontal (1), GroEL semeja una rosquilla con una cavidad en el centro de la partícula. En la otra vista, denominada lateral (2), se observan en la partícula cuatro bandas o estrías; cada par de las mismas corresponden a uno o dos anillos del oligómero. La vista frontal y lateral de GroEL corresponden al cilindro dispuesto de manera vertical y horizontal, respectivamente, sobre la rejilla del microscopio electrónico, pero detectable cuando está unido a GroEL. En presencia de nucleótidos de adenina, GroES se une al extremo de uno de los anillos de GroEL en forma de caperuza (3). El complejo GroEL-GroES se denomina asimétrico. En condiciones fisiológicas y en presencia de ATP, un oligómero de GroES se une a cada uno de los anillos de GroEL (4) y el simétrico forman parte del ciclo de plegamiento de GroEL.

Se ha determinado también la estructura atómica de GroES. Ese nivel de resolución lo ha conseguido el grupo de Johan Deisenhofer en la Universidad de Texas. El heptámero desarrolla una cúpula que, al unirse a GroEL, tapa la cavidad del anillo. La región que interacciona con GroEL está formada por un grupo de residuos hidrofóbicos carentes de estructura secundaria.Gracias a los trabajos del grupo de Helen Saibil, del Colegio Birbeck de Londres, y el de nuestro laboratorio, conocemos los cambios conformacionales que experimenta la estructura de GroEL cuando interacciona con ATP o con GroES. Dichos cambios estructurales tienen que ver con movimientos del dominio apical con respecto al dominio ecuatorial. La adición de ATP a GroEL genera un movimiento del dominio apical hacia el exterior y hacia arriba, que produce una apertura de la boca del anillo y del volumen de la cavidad. Para que GroES se una a GroEL se necesita, como condición previa, el cambio conformacional inducido por el nucleótido.La utilización de varios tipos de nucleótidos y de diversas concentraciones de éstos ha permitido observar los numerosos cambios conformacionales que sufren los dos anillos de GroEL y, con ello, una caracterización más completa de los cambios estructurales ligados al ciclo funcional de las chaperoninas.Estos estudios han permitido mostrar que los dos anillos del toroide no se comportan de igual manera ante la unión de nucleótidos, sustrato y GroES.Reconstrucción tridimensional de GroEL y de los distintos complejos formados por GroEL y GroES. Cada uno de los dos anillos de GroEL posee una cavidad a la que se accede por su extremo. Este extremo cambia su morfología cuando se une a él GroES (complejo GroES-GroEL), de tal manera que la cavidad se hace más grande. La unión de GroES a los dos anillos de GroEL para formar el complejo simétrico GroEL-GroES (GroEL-GroES2) promueve el mismo cambio en los dos anillos.La unión entre nucleótidos y GroEL muestra una cooperatividad positiva con el primer anillo y, negativa, con el segundo. Cuando se añade ATP a una solución de GroEL, el nucleótido se une rápidamente a uno de los dos anillos. La unión de ATP a los siete monómeros de un anillo modifica la configuración de éstos de tal manera que el nucleótido no se une con la misma facilidad a los siete monómeros del segundo anillo. Además, la unión de ATP al segundo anillo genera otra señal hacia el primero, que sirve para mantener el ciclo en funcionamiento. Existe, pues, una intercomunicación entre los dos anillos.La unión entre el nucleótido ATP y uno de los anillos de GroEL permite el engarce de GroES en GroEL. De esto resulta un complejo asimétrico, porque sólo uno de los dos anillos tiene unido un oligómero de GroES. Durante cierto tiempo se pensó que el complejo GroES-GroEL era la única forma de unión de entrambos. Pero en 1994, y de manera independiente, cuatro grupos, incluido el nuestro, descubrieron que, en presencia de ATP o de AMP-PNP (un análogo no hidrolizable de ATP), GroES se enlaza simultáneamente a los dos anillos de GroEL y forma un complejo simétrico GroEL-GroES. Los complejos simétricos producidos en presencia de ATP son inestables; aparecen y desaparecen continuamente. El nucleótido ATP se hidroliza y se libera de GroEL, lo que posibilita el desarrollo incesante del ciclo.De la estructura de muchas otras chaperoninas carecemos de información a resolución atómica. Mediante microscopía electrónica y técnicas de procesamiento digital de imagen podemos obtener su estructura a baja-media resolución (20 A). La comparación de sus secuencias revela que la homología más estrecha se concentra en el dominio de unión a ATP, mientras que la región de mayor variabilidad corresponde al dominio apical. Situación razonable, si consideramos que las chaperoninas comparten seguramente el mecanismo básico de funcionamiento, del que forma parte el dominio de unión a ATP, y difieren en el reconocimiento del sustrato a plegar, en el que tiene un papel primordial el dominio apical.Función de las chaperoninasEl mecanismo plegador de las chaperoninas opera de un modo pasivo. Sostienen algunos que el sustrato se pliega dentro de la cavidad de GroEL; ello exige que el sustrato se una primero al dominio apical de GroEL. Pero, en cuanto

GroES interacciona con GroEL, el complejo arroja al sustrato dentro de la cavidad del anillo de GroEL. En ese modelo, la cavidad funciona como una caja de Anfinsen en la cual el polipéptido alcanza su conformación natural ("nativa").Opinan otros que el polipéptido, una vez libre en la cavidad de GroEL, no alcanza allí su conformación natural, sino otra precursora, que es la que presentaría cuando aparece en el exterior. Podría entonces adquirir allí su adecuada conformación en un primer intento; si no lo consigue, se uniría otra vez a GroEL donde se sometería a un nuevo ciclo de liberación en la cavidad y posteriormente al exterior de ella.A tenor de los experimentos, las dos hipótesis podrían ser correctas. En razón del sustrato a plegar, operaría un mecanismo u otro. Pero ¿cuál es el mecanismo por el que la chaperonina reconoce el sustrato desnaturalizado?

Características y propiedades de las chaperoninas de tipo I y de tipo II. Las chaperoninas de tipo I son de origen procariota y simbionte, como las mitocondriales y cloroplásticas; de origen eucariota o procedente de arqueobacterias, las de tipo II. En presencia de sustrato, éste se introduce en la cavidad de las chaperoninas. A la derecha se pueden observar imágenes promedio de vistas frontales y laterales de los dos tipos de chaperoninas

Aunque se creyó en un principio que el dominio apical de las chaperoninas reconoce segmentos de estructura secundaria del tipo a-hélice, los ensayos posteriores han demostrado que también se reconoce la estructura de lámina b. Se requiere, en cualquier caso, la presencia, en los polipéptidos desnaturalizados, de zonas con aminoácidos hidrofóbicos expuestos en la superficie. Los residuos aminoacídicos del dominio apical de GroEL involucrados en el reconocimiento del sustrato plegable son también hidrofóbicos. La liberación del sustrato en la cavidad, al forjarse el complejo GroES-GroEL, podría hacer que los residuos hidrofóbicos del polipéptido, libres del riesgo de interaccionar con los de otros polipéptidos, se convirtiesen en factor de nucleación alrededor del cual comenzase su plegamiento.En el plegamiento, el sustrato desnaturalizado se une al dominio apical; GroES se engarza en éste y lo desplaza hacia la cavidad. Allí lo suelta. Pero, ¿en virtud de qué mecanismo se deshace GroES del sustrato? ¿Cuál es el motor del ciclo de plegamiento? La respuesta está en la hidrólisis de ATP y en los consiguientes cambios conformacionales y señales entre los anillos que genera el nucleótido.La energía liberada en la hidrólisis de ATP no se transmite al sustrato renaturalizable, sino que se utiliza para mantener un ciclo de cambios conformacionales concertados entre los dos anillos. En 1994, el grupo de Arthur Horwich, en Yale, indujo numerosas mutaciones en los aminoácidos del dominio ecuatorial involucrados en la interacción entre los anillos. Y produjo un oligómero de GroEL formado por un solo anillo. Este anillo, capacitado para unir nucleótidos, sustrato y GroES, se muestra incapaz de liberar este último y, por tanto, tampoco el sustrato. Aunque los monómeros del anillo hidrolizan el ATP, no se libera la GroES. Ahora bien, en cuanto se desprende la cochaperonina, el sustrato aparece correctamente plegado.Cada anillo de GroEL constituye una unidad funcional de plegamiento. Sin embargo, para que el oligómero de GroES se libere, se requiere una señal procedente del otro anillo. De ello se desprende que ambos anillos deben de operar de común acuerdo.La chaperonina GroEL persiste asimétrica a lo largo de todo el ciclo. No se trata sólo de una asimetría estructural (los dos anillos tienen distinta estructura en todo momento), sino también funcional: en cada momento del ciclo, difiere la afinidad de cada anillo por el ATP o por el sustrato.Para hacernos una idea general del comportamiento de la GroEL, GroES y el sustrato, imaginémonos un oligómero de la chaperonina GroEL en ausencia de nucleótidos (situación que no ocurre in vivo). El polipéptido desnaturalizado reconoce el dominio apical de uno de los dos anillos y se une a él; y aunque puede enlazarse también con GroEL en presencia de nucleótidos, posee más afinidad hacia GroEL en ausencia de éstos.

Comparación de las estructura de GroEL obtenidas por microscopía electrónica y difracción de rayos X en la que se observa cómo las dos técnicas, cada una a su nivel de resolución, reflejan los mismos detalles estructurales. En (a) se presenta la reconstrucción tridimensional de un complejo asimétrico GroEL-GroES obtenida por microscopía electrónica y procesamiento de imágenes, mientras que en (b) se muestra la proyección de toda la masa del mismo complejo. En (c) se observan las estructuras de los monómeros de GroEL y GroES obtenidas mediante difracción de rayos X. En los tres casos, la cochaperonina GroES se visualiza como el disco que tapa la cavidad superior del oligómero de GroEL.El ATP se inserta en el sitio de unión de cada monómero de un anillo. La unión y posterior hidrólisis del ATP genera dos señales. Una se dirige al dominio apical, que sufre un movimiento hacia fuera y hacia arriba al pivotar sobre la bisagra formada por el dominio intermedio. Gracias a esa modificación estérica, puede engarzarse un oligómero de GroES y producirse un mayor movimiento del dominio apical hacia arriba. La unión de GroES desplaza al polipéptido hacia el

interior de la cavidad; allí lo suelta. La segunda señal se transfiere, a través del dominio ecuatorial, al otro anillo. La unión de GroES a este segundo anillo forma un complejo simétrico, que puede mantener encerrado un polipéptido en cada cavidad.El complejo así constituido, muy inestable, no tarda en desaparecer. La unión del ATP en el segundo anillo envía una señal al primero para que el oligómero de GroES se libere, con lo cual el polipéptido puede salir al medio, ya sea plegado en su conformación nativa o bien dispuesto a alcanzarla en el exterior. Este anillo, tras soltar luego el ADP y el fosfato inorgánico producto de la hidrólisis de ATP, se halla listo para unir otra vez sustrato, ATP y GroES y continuar así el ciclo funcional.En ninguna fase del ciclo coinciden los anillos. Mientras uno atrapa al polipéptido desnaturalizado, el otro ya lo ha liberado en su cavidad. GroEL funciona como un motor de dos cilindros en el que el combustible es el ATP y su movimiento se produce por la hidrólisis del nucleótido.También en la chaperonina mitocondrial y cloroplástica rige, así parece, el mecanismo de funcionamiento descrito. Distinto pudiera ser el caso de la chaperonina CCT, dada su especificidad para con la actina y la tubulina. Hemos observado en nuestro laboratorio que, en una suerte de mecanismo de plegamiento parecido a GroEL, la chaperonina CCT atrapa la actina desnaturalizada, que se instala en la cavidad central de la chaperonina. La unión de ATP a las subunidades del anillo a la que la actina se ha unido genera un cambio conformacional en la chaperonina que permite el plegamiento de la actina. En este caso, y a diferencia de GroEL, ciertas subunidades pudieran tener un papel específico en el ciclo de plegamiento.Quedan varios aspectos por resolver. De entrada, el tamaño de la cavidad de los anillos de las chaperoninas. En GroEL y otras chaperoninas la hendidura admite proteínas de hasta 55 kilodalton de peso molecular, más o menos desplegadas. Pero, ¿qué ocurre con proteínas de mayor tamaño? Se ignora también la cantidad de sustrato que en un momento determinado puede plegar la población de GroEL de una célula. Se ha sugerido que GroEL, in vivo, sólo puede plegar el 10% de las proteínas que requieren de ayuda en tal menester. ¿Quién pliega el 90% restante de proteínas?Mecanismos de defensa celularesLas chaperoninas protegen, pues, la función y la estructura de las células a través de la protección de sus componentes. Pero su misión no acaba aquí. En mamíferos, las chaperoninas podrían defender de las infecciones mediante el envío de señales al sistema inmunitario, del que son uno de los más potentes estimuladores. La estimulación procede en dos frentes; en un primer nivel, las chaperoninas activan los mecanismos innatos de defensa, puestos en operación por los fagocitos. En un segundo frente, las chaperoninas actúan sobre los mecanismos de defensa adquiridos, mediante la estimulación de la producción de anticuerpos y linfocitos T.

Cambios conformacionales que sufre GroEL durante el ciclo de plegamiento. Compárense las imágenes que se muestran en B, obtenidas por microscopía electrónica y procesamiento de imágenes, con la estructura de los dos monómeros de GroEL mostrados en A, obtenida por difracción de rayos X. Cada monómero pertenece a un anillo del oligómero de GroEL. Los cambios conformacionales se generan por la unión de ATP al sitio de unión del ATP  de los siete monómeros de un anillo a la vez. La señal se transmite desde allí en dos direcciones: una hacia al dominio apical a través del dominio intermedio, la otra va hacia el monómero del otro anillo con el que está interaccionando, a través de los puntos de contacto 1 y 2. De esta manera, los cambios conformacionales que se producen en un anillo afectan al otro, por lo que ambos anillos actúan de manera concertada. Si partimos de un oligómero de GroEL que no tiene nucleótido (a), la unión de ATP a uno de los anillos genera un cambio conformacional de éste (b). La unión de GroES a los dominios apicales de este anillo genera un movimiento de los dominios apicales del anillo aún mayor (c), con la consiguiente apertura de la cavidad del anillo. Si se añade al oligómero de GroEL una cantidad mayor de ATP, se produce un cambio conformacional de los dominios apicales de ambos (d). La adición de Groes produce primero un complejo asimétirco GroEL-GroES (e) y luego un  complejo simétrico.En ese mismo marco de la defensa, las chaperoninas se relacionan con los factores de crecimiento en los mamíferos. El factor temprano de la gestación ("Early-pregnancy factor"), que aparece en el suero materno a las pocas horas de la fecundación, interviene en la proliferación celular, posee propiedades inmunosupresoras y regula el crecimiento de todo tipo de células, normales o neoplásicas. Además, su acumulación en las plaquetas denuncia su participación en los procesos de cierre de heridas. Se ha sugerido también su implicación en los mecanismos de inflamación.

El factor temprano de la gestación, con tan numerosas propiedades biológicas, ha resultado ser la cochaperonina mitocondrial mt-cpn 10, ayudante de la chaperonina mitocondrial en el plegamiento de proteínas. Del estudio del papel de las chaperoninas en los mecanismos de defensa celular podrían generarse en el futuro aplicaciones médicas de este tipo de proteínas.Aspectos biotecnológicos de las chaperoninasLa producción industrial de proteínas constatuye un fenómeno en expansión creciente. El sector alimentario y el farmacéutico promueven la expresión de proteínas en organismos diferentes de los que se encuentran en la naturaleza, por lo común, bacterias, levaduras o células eucarióticas. Se consigue este resultado mediante la introducción del gen que cifra la proteína deseada en el organismo huésped.Sin embargo, este procedimiento no se halla exento de problemas, siendo el más espinoso la falta de reconocimiento por parte del organismo de la proteína que está expresando, lo que da lugar a los cuerpos de inclusión. Así se llaman los agregados de proteína, insolubles, aunque en algunos casos se solubilizan con urea u otros agentes desnaturalizantes.

El ciclo de plegamiento de GroEL podría ser muy parecido a éste. Una molécula de proteína desnaturalizada se une a los dominios apicales de un anillo de GroEL (anillo de abajo en 1). El oligómero está representado por un complejo asimétrico, en el que en el anillo de arriba hay una molécula desnaturalizada protegida por un oligómero de GroES. Este anillo ha hidrolizado su ATP de tal manera que ahora posee moléculas de ADP (D) en todos sus monómeros. Pero la técnica de la solubilización no es ni barata, ni rápida ni siempre segura. En muchos casos, el problema de la insolubilidad de la proteína sobreexpresada se ataja con el aumento de chaperoninas nativas o la expresión contemporánea de chaperoninas nativas y foráneas.De interés biotecnológico es la generación de chaperoninas híbridas, dotadas con propiedades de las progenitoras; por ejemplo, chaperoninas construidas con la eficacia e inespecificidad plegadora de la GroEL de E. coli y la estabilidad de una chaperonina proveniente de un organismo extremófilo.En el estudio del plegamiento de proteínas acaban de hacer su entrada las minichaperonas. El grupo de Alan Fersht, de la Universidad de Cambridge, ha conseguido, mediante la eliminación del dominio ecuatorial y el intermedio, generar un monómero estable de GroEL en el que sólo se encuentra el dominio apical; en este dominio se mantiene intacta la zona de interacción con el poli- péptido desnaturalizado. La minichaperona posee capacidad para plegar proteínas (no todas) sin necesidad de hidrólisis de ATP. El grupo de Fersht, tras unir la minichaperona a una resina de cromatografía, ha renaturalizado las proteínas mediante el paso de éstas por una columna empaquetada con el complejo resina- minichaperona.El problema del plegamiento de las proteínasEl conocimiento en los primeros años de la década de los cincuenta de que las proteínas están constituidas por una secuencia única (en cada caso) que proviene de la combinación de veinte aminoácidos diferentes hizo que muchos investigadores se hicieran al momento una serie de preguntas: ¿Cómo adquieren su estructura activa las proteínas? ¿Cuáles son los mecanismos que conducen a que una determinada secuencia aminoacídica adopte una estructura con unas propiedades funcionales concretas? La formulación de estos problemas y el intento de responderlos ha dado lugar a una rama de laciencia, hoy en día muy pujante, que se ha denominado "del plegamiento de las proteínas". Mucho se ha investigado desde entonces en este campo y se han producido algunos avances, entre los cuales destacan los descubrimientos realizados por Anfinsen y su euqipo de colaboradores a finales de los años cincuenta, que demostraron que la información necesaria para que una proteína alcance su estructura nativa se encuentra en su propia secuencia. Sin embargo, hoy se sabe que esto no es totalmente cierto, puesto que bajos algunas cisrcunstancias las proteínas no pueden alcanzar su conformación funcional por sí mismas debido a una serie de factores (Figura 1). Uno muy importante y que sólo desde hace poco tiempo ha empezado a tenerse en cuenta, es la alta concentración de macromoléculas existente en la célula (200-400 mg/ml), muy alejada de las condiciones usadas in vitro, y que puede producir interacciones no deseadas entre las proteínas que están siendo sintetizadas. Otro de los problemas con los que se

enfrenta en ocasiones la célula son determinadas situaciones de estrés (térmico, salino, ...) que producen la desnaturalización de ciertas proteínas más sensibles a estos estados. Finalmente, las proteínas sintetizadas deben de conservar una conformación desplegada para poder atravesar las membranas de ciertos orgánulos en los que van a actuar.Las chaperoninasEn muchas de estas ocasiones, las proteínas requieren del auxilio de unas proteínas que empezaron a conocerse a finales de la década de los setenta y que se han denominado chaperonas o acompañantes moleculares (utilizaremos el primer nombre por ser el usado por toda la comunidad internacional). El número de proteínas que se incluye dentro de la familia de las chaperonas es enorme y aumenta de día en día, pero nosotros nos restringiremos a una subfamilia concreta, la de las chaperoninas, que es quizás la más estudiada hasta la fecha.Las chaperoninas son grandes agregados macromoleculares compuestos por proteínas de un peso molecular cercano a 60 kDa. Todas las chaperoninas conocidas hasta la fecha son oligoméricas y comparten una estructura similar: un cilindro compuesto por uno o dos anillos dispuestos espalda contra espalda (Figura 2). Cada anillo encierra una cavidad, que es el lugar donde se produce el plegamiento de las proteínas. Esta arquitectura es común a todas las chaperoninas, que sólo difieren entre sí en el número de subunidades, iguales o diferentes, de las que se compone cada anillo.

Figura 1. Papel de las chaperoninas en la célula. El papel de las chaperoninas en el plegamiento de proteínas es múltiple. Chaperonas de diversos tipos se unen a los polipéptidos recién sintetizados en los ribosomas (arriba a la izquierda), a proteínas que atraviesan las membranas de diversos orgánulos (arriba en el centro) o a proteínas que se han desnaturalizado debido a cualquier tipo de estrés (arriba a la derecha). Esta unión tiene en un número elevado de casos un papel de protección para evitar que las proteínas alcancen un estado de agregación irreversible. Las chaperonas en general pueden tener un papel activo en el plegamiento de las proteínas, aunque en la mayor parte de los casos parecen transportar los polipéptidos desnaturalizados hasta las chaperoninas, donde son plegados (debajo).Las chaperoninas de Grupo ILas chaperoninas más conocidas y estudiadas hasta la fecha son las que se encuentran en eubacterias y orgánulos de organismos eucarióticos (mitocondrias y cloroplastos), que forman parte de las llamadas del Grupo I. Todas las chaperoninas de este grupo tienen una estructura muy parecida, un

Figura 2. Microscopía electrónica de GroEL. Imagen tomada de un campo de microscopía electrónica de una muestra en la que se ha incubado las chaperoninas GroEL y GroES en presencia de ATP. En el microscopio electrónico GroEL muestra dos tipos de vistas. En una de ellas, la llamada frontal, GroEL tiene la forma de una rosquilla con una cavidad en el centro de la partícula. En la otra vista, denominada lateral, se observa en la partícula cuatro bandas o estrías, de las cuales cada dos corresponden a uno de los dos anillos del oligómero. La vista frontal y lateral de GroEL corresponden al cilindro dispuesto de manera vertical y horizontal, respectivamente, sobre la rejilla del microscopio electrónico. GroES es

un pequeño heptámero, apenas visible por si solo en el microscopio electrónico, pero detectable cuando está unido a GroEL. En presencia de nucleótidos de adenina, GroES se une al extremo de uno de los anillos de GroEL en forma de caperuza, tapando de esta manera la cavidad que cada anillo posee. Este complejo GroEL-GroES se denomina asimétrico y tiene la forma de una bala. En condiciones fisiológicas y en presencia de ATP, un oligómero de GroES se une a cada uno de los anillos de GroEL, y da lugar a lo que se ha denominado un complejo GroEL-GroES simétrico, que tiene forma de balón de rugby. Tanto los complejos asimétricos como los simétricos forman parte del ciclo de plegamiento de GroEL.cilindro constituido por uno odos anillos heptaméricos (Figura 3). La proteína más estudiada dentro de esta familia es GroEL de Escherichia coli. GroEL es una proteína esencial para la viabilidad de la bacteria y experimentos bioquímicos han mostrado que al menos el 10 % de las proteínas celulares interaccionan con esta chaperonina. GroEL se identificó genéticamente

Figura 3. Imágenes medias de GroEL, GroEL-ES y GroEL -ES2. Del promediado de cientos de partículas como las mostradas en la Figura 2 se puede obtener imágenes medias de las distintas confórmeros de GroEL que se pueden obtener durante su ciclo funcional. La adición de ATP induce un cambio conformacional en los dominios apicales de GroEL que se pueden observar en la figura D (apertura de la cavidad), especialmente cuando se la compara con la misma molécula en ausencia de nucleótido (Figura B). La unión de ATP a uno o a los dos anillos permite la unión de GroES a éstos, formando los complejos asimétricos (Figura C) o simétricos (Figura E) que se observan en la Figura 2.cuando se observó que es indispensable para la morfogénesis de bacteriófagos como l, concretamente para la formación de una subestructura viral, el conector, que une la cabeza con la cola del fago. Sin embargo, durante varios años se estudió la interacción de GroEL con el mecanismo de morfogénesis viral y no su función propia en la bacteria. Cuando se descubrió su homología con otras proteínas de similar peso molecular e involucradas en mecanismos de defensa relacionados con el choque térmico, (Hsp60, proteínas de choque térmico de 60 kDa), GroEL comenzó a ser utilizada por un gran número de laboratorios para caracterizar los mecanismos de asistencia en el plegamiento de proteínas. Los experimentos que se realizaron para probar su función son ahora clásicos. A la manera de los ensayos de Anfinsen, las proteínas a renaturalizar son desnaturalizadas con agentes caotrópicos e incubadas posteriormente en un tampón que incluye GroEL y que además sirve para diluir el agente desnaturalizante. Una vez realizada la incubación con la chaperonina, se ensaya la actividad funcional de la proteína para comprobar el grado de renaturalización alcanzada. Este grupo de ensayo mostró que un gran número de proteínas, muchas de ellas no pertenecientes a E.coli, son capaces de ser replegadas por GroEL. Para ello, y en la mayor parte de los casos, se necesita el concurso de dos cofactores: el primero es un pequeño oligómero formado por siete subunidades de una proteína llamada GroES, que se une a la boca del anillo de GroEL (ambas estructuras son heptaméricas y por lo tanto se ajustan muy bien) para bloquear la cavidad formada por el anillo de GroEL. El segundo de los cofactores es ATP, y su unión y posterior hidrólisis mantendrá en funcionamiento el ciclo funcional de la chaperonina.Estructuras de GroEL y GroESDe los numerosos estudios realizados por difracción de Rayos X y microscopía electrónica, tenemos una clara de idea de la estructura de GroEL y su cochaperonina GroES, de cómo interaccionan, y de los cambios más drásticos que se producen durante su interacción y durante el ciclo de funcionamiento de GroEL. El monómero de GroEL tiene tres dominios bien definidos (Figura 4): un dominio ecuatorial, que posee la mayor parte de las interacciones que generan el anillo heptamérico y las que mantienen unidos; este dominio también acoge al sitio de unión de ATP, que es el corazón de la maquinaria de GroEL. El segundo dominio es el apical, que se encuentra a la entrada de la cavidad de cada anillo y que posee una agrupación de residuos hidrófobos involucrados en el reconocimiento de los péptidos desnaturalizados

que se encuentren en su entorno. Los mismos residuos están involucrados en la unión con la chaperonina GroES, y este hecho es de capital importancia en el mecanismo de funcionamiento de GroEL. Finalmente, existe un tercer dominio, el intermedio, que ejerce de transmisor de las señales que se producen entre los dominios ecuatorial y apical y funciona como una bisagra para trasladar los grandes cambios conformacionales que, producto de la unión de ATP y GroES, ocurren en el dominio apical.La estructura de GroES es mucho menos compleja (Figura 4). Cada monómero de esta cochaperonina tiene una estructura de barril de láminas b. La mayor parte del monómero está estructurado excepto un gran lazo que se encuentra desordenado, pero que cuando interacciona con el dominio apical de GroEL, se une fuertemente a éste y genera en él un gran cambio conformacional. El heptámero de GroES, dependiendo del momento del ciclo funcional de GroEL en que se encuentre, puede unirse a uno de los anillos de GroEL o a los dos, formando lo que se ha denominado respectivamente, complejos asimétricos o simétricos de GroEL y GroES (Figura 3).

Figura 4. Estructura atómica de los monómeros de GroEL y de GroES. En ambas imágenes se observa la estructura atómica de un monómero de GroEL correspondiente al anillo superior de GroEL, enfrentado a los dos monómeros del anillo inferior con los que interacciona. En la imagen de la izquierda se representa la conformación abierta y susceptible de aceptar polipéptidos desnaturalizados, en la que el dominio apical del monómero superior se encuentra en la posición basal. La unión de ATP en el sitio de unión de este nucleótido (situado en el dominio ecuatorial) y la posterior unión de la cochaperonina GroES (de la que sólo se muestra un monómero en la imagen de la derecha) transmite al dominio apical a través del dominio intermedio una señal para que en aquél se genere un gran cambio conformacional de tal manera que ahora se eleva y apunta hacia arriba, lo que produce un considerable aumento de la cavidad de GroEL.Mecanismo funcional de GroELDurante los últimos años se han realizado multitud de experimentos de carácter bioquímico y biofísico que han permitido tener una idea bastante clara de cual es el mecanismo de funcionamiento de GroEL y por ende, de todas las chaperoninas del grupo I (Figura 5):1)Los residuos hidrofóbicos que forman un anillo alrededor de la boca de la cavidad de cada anillo funcionan como un imán que reconoce y une todos los residuos hidrofóbicos que se encuentran a su alrededor. Si se tiene en cuenta que las proteínas celulares que se encuentran en solución mantienen los residuos hidrofóbicos en el interior de su estructura, la exposición de éstos significa que esas proteínas no se encuentran plegadas correctamente. El mecanismo de reconocimiento utilizado por GroEL es por lo tanto muy simple y muy inespecífico. De ahí el amplio rango de proteínas a las que asiste en su plegamiento.

Figura 5. Mecanismo de funcionamiento de GroEL. En el esquema se observa el ciclo alternado que poseen los dos anillos de GroEL. Así, mientras que el anillo superior ya posee en su cavidad una molécula de polipéptido dispuesta a plegarse por si mismo, el anillo inferior ha reconocido y unido otro polipéptido desplegado (posición 1). La unión de ATP a este anillo (posición 2) permite el cambio conformacional de los dominios apicales que dará lugar a la unión de GroES (posición 3) y a la señal de liberación de GroES del anillo superior, con la consiguiente liberación del polipéptido ocluido en este anillo (posición 4). El anillo superior, en este punto, se encuentra en la misma conformación que el anillo inferior en la posición 1.2) ATP se une a su sitio de unión, en el dominio ecuatorial del monómero de GroEL. La unión de ATP desencadena una cadena de señales en varias direcciones:Existe una cooperatividad positiva entre los monómeros de un mismo anillo, de manera que el resto de los monómeros de ese anillo unen ATP inmediatamente.Se produce una cooperatividad negativa entre las sub unidades de los dos anillos, de manera que una vez que una molécula de ATP se une a un monómero de los anillos y desencadena la unión inmediata de moléculas de ATP a las otras seis sub unidades del mismo anillo, se impide la unión de ATP a las siete sub unidades del otro anillo.Se envía una señal desde el dominio ecuatorial de cada sub unidad que ha unido ATP, a través del dominio intermedio hasta el dominio apical, en el que se produce un cambio conformacional (elevación de la punta del dominio apical) que permite la unión de la cochaperonina GroES.3) La unión del oligómero de GroES induce un levantamiento aún mayor de las puntas de los dominios apicales de GroEL y por lo tanto un aumento de la cavidad dentro del anillo. Esta unión genera la formación del complejo asimétrico descrito en la Figura 3. Por otra parte, la unión de GroES sella la cavidad y es en ésta donde se va producir el fenómeno más importante de todo el ciclo. Los residuos hidrofóbicos que hasta ahora interaccionaban con el polipéptido desnaturalizado lo hacen ahora con el lazo desordenado de GroES. El cambio conformacional promovido por la unión a la cochaperonina hace que todos los residuos hidrofóbicos y cargados que se exponían en la superficie interior de la cavidad, ahora desaparecen y dejan paso a residuos hidrofílicos. El resultado de todo ello es que el polipéptido, que había sido atrapado anteriormente por la boca del anillo, es encerrado en éste y su salida de la cavidad es imposibilitada por la cochaperonina que tapa la boca de ésta. En este estado, y libre de las interacciones no deseadas que le acechan en el exterior, (interacciones con los residuos hidrofóbicos de otras proteínas que dan lugar a agregados irreversibles), y en una cavidad que se ha hecho mucho más grande por efecto de los cambios conformacionales que han sufrido los dominios apicales, puede el polipéptido intentar plegarse por sí mismo utilizando la información codificada en su secuencia primaria. Algunos experimentos sugieren que durante el cambio conformacional inducido por la unión de ATP y GroES, los dominios apicales tiran del sustrato de manera que lo despliegan antes de liberarlo en la cavidad.4)Las moléculas de ATP unidas en todas las sub unidades del anillo se hidrolizan. La hidrólisis del nucleótido, además de relajar la unión de GroES a GroEL en ese anillo, envía una señal al otro anillo para indicarle que ya puede unir ATP. Esta unión se produce, con los consiguientes cambios indicados anteriormente en el punto 2). La unión de ATP permite

también que otra molécula de GroES se una a este segundo anillo, formando un complejo simétrico, con una cochaperonina unida a cada anillo de GroEL, tal y como se describe en la Figura 3.5)La formación del complejo simétrico no es muy estable, porque la unión de GroES al segundo anillo induce la liberación de la cochaperonina del primer anillo y la salida al exterior del polipéptido encerrado en aquel. El primer anillo está dispuesto para recibir otro polipéptido desnaturalizado que se encuentre en su entorno. Los pasos 4) y 5) se reproducen ahora en el segundo anillo.Podemos imaginarnos pues al oligómero de GroEL como un motor de dos cilindros (los dos anillos), en el que cada uno de ellos se encuentra en cada momento en posiciones diferentes del ciclo. Mientras un anillo está liberando la cochaperonina y por ende el polipéptido encerrado, el otro está uniendo otra cochaperonina. Los dos anillos funcionan de manera alternada, ya que cada uno de ellos controla al otro mediante la transmisión de señalesya mencionada, señales que van desde los dominios ecuatoriales de las sub unidades de un anillo al del otro, y viceversa. La unión y posterior hidrólisis del ATP funciona como el combustible de los cilindros, lo que permite que el ciclo se mantenga funcionando indefinidamente.Significado fisiológico del papel de las chaperoninasEl gasto energético que se produce durante el ciclo de GroEL no incide directamente sobre la función de la chaperonina en la asistencia en el plegamiento de proteínas, sino que tan solo sirve para mantener activo el ciclo. En este sentido debe de quedar claro que GroEL y las chaperoninas en general no son enzimas, pues no modifican covalentemente al sustrato con el que interaccionan, sino que permiten que dentro de su cavidad el polipéptido desnaturalizado pueda alcanzar libremente su estructura nativa. Esta puede ser alcanzada por parte del polipéptido dentro de la cavidad, o fuera de ella después de su liberación. Puede también que el polipéptido desnaturalizado se mantenga en esta conformación después de una primera interacción con la chaperonina, en cuyo caso puede ser reconocido otra vez por ésta, con lo que vuelve a intentar su plegamiento. Hay varios estudios bioquímicos que demuestran que distintas proteínas tienen estadísticamente una media de interacciones con GroEL diferente. El mecanismo de GroEL es ineficiente (genera un gasto continuo de ATP independientemente o no de que haya moléculas de sustrato desnaturalizado en la cavidad de la chaperonina; no siempre repliega a la proteína en un solo ciclo de interacción) pero en contrapartida funciona para un rango muy grande de sustratos (en la práctica, y excepto en el caso de ciertas proteínas, puede ayudar a replegar a cualquier proteína con un peso molecular menor de 50 kDa).Siendo GroEL una máquina molecular muy compleja, posee algunos mecanismos aun más sofisticados, como los cambios que se producen en su funcionamiento durante periodos de choque térmico. GroEL y la mayor parte de las chaperoninas del grupo I son proteínas de choque térmico y ven inducidas su producción (hasta diez veces más) durante los momentos en que aquél se produce para tratar de lidiar con el mayor número de proteínas que se desnaturalizan por el aumento de temperatura. Sin embargo, no parece tener sentido que estas proteínas sean renaturalizadas para que vuelvan a ser desnaturalizadas si el choque térmico es prolongado. Pues bien, ahora se conoce que al aumentar la temperatura, la unión de la cochaperonina GroES a GroEL es más fuerte, de tal manera que aquélla tarda más en liberarse y mantiene por lo tanto al polipéptido encerrado en la cavidad más tiempo. Este mecanismo diferente se debe a un cambio conformacional inducido por la temperatura, que altera la señal de liberación de la cochaperonina que envía un anillo al otro. Este fenómeno y quizás algún otro que resta por caracterizar explicaría por qué las chaperoninas están constituidas por dos anillos, cuando cada uno de ellos por separado podría formar una unidad funcional en la asistencia al plegamiento.Chaperoninas del Grupo IIEl otro tipo de chaperoninas, aquéllas que se encuentran en arqueobacterias y en el citoplasma de organismos eucarióticos, es mucho menos conocido, y sólo en los últimos años se han comenzado a realizar caracterizaciones bioquímicas y estructurales de éstas. Por de pronto, y a diferencia de las chaperoninas del grupo I, las de grupo II son muy variables en su grado de oligomerización y en el número de sub unidades distintas que componen el oligómero. Así, la estructura de doble anillo puede constituida por dos anillos octaméricos ó nonaméricos, y los anillos formados por uno, dos, tres o incluso ocho proteínas diferentes. Este caso último es el de la chaperonina citoplasmática de eucariotas ó CCT, que es quizás la chaperonina más interesante por una serie de razones: además de poseer ocho sub unidades diferentes (aunque homólogas entre sí) en cada uno de los dos anillos octaméricos, asiste específicamente al plegamiento de actinas y tubulinas, dos proteínas citoesqueléticas de vital importancia para la célula.Los estudios estructurales realizados con CCT y alguna chaperonina de arqueobacterias muestran que éstas poseen los mismos dominios (ecuatorial, intermedio y apical) que GroEL, así como sus dos mismas conformaciones básicas (Figura 6). Se ha caracterizado una conformación abierta, que se producen en ausencia de ATP, y en la que la cavidad se ofrece accesible para la interacción con el sustrato. La unión de ATP genera la conformación cerrada, pero a diferencia de GroEL, el cierre de la cavidad no se produce por la unión de una cochaperonina, ya que las chaperoninas del grupo II no poseen cochaperoninas, sino que un dominio extra que se encuentra en los dominios apicales cierra la cavidad al producirse el cambio conformacional. El sustrato que se ha unido previamente a la chaperonina queda así cerrado en su cavidad.

Figura 6. Estructuras de CCT, CCT-ATP y CCT-actina. . Las estructuras tridimensionales de los distintos confórmeros de la chaperonina CCT que se muestran aquí se han obtenido mediante microscopía electrónica y procesamiento de imagen, y revelan la típica estructura de dos anillos común a todas las chaperoninas, con la particularidad que en este caso el oligómero está constituido por dos octámeros generados por ocho distintas sub unidades (imagen izquierda). La adición de ATP (imagen derecha) genera un cambio en los dominios apicales de tal manera que éstos apuntan hacia el interior y cierran la cavidad (aunque la baja resolución de la reconstrucción no permite visualizar el cierre completo de aquélla) imitando al confórmero de GroEL en el que se encuentra unida la cochaperonina GroES. La adición a la estructura libre de actina desnaturalizada permite la unión de ésta de dos maneras específicas: en uno de ellos un brazo de actina (coloreada en rojo) se une al dominio apical de la subunidad y otro al de la (imagen central), y en otro caso un brazo de actina se une a la subunidad y otro a la no representado aquí.¿Qué tipo de interacción se produce entre la chaperonina y el sustrato? Muy poco se conoce respecto a los sustratos de las chaperoninas de arqueobacterias, y la información que se ha obtenido hasta la fecha proviene de los estudios realizados con CCT. La interacción entre CCT y el sustrato parece ser de distinta naturaleza a la que se establece entre GroEL y las proteínas a las que asiste en su plegamiento. Mientras GroEL reconoce residuos hidrofóbicos que se encuentran expuestos al azar en el solvente, actina se une a CCT a través de interacciones entre residuos específicos de CCT y actina. Estas interacciones se producen con sub unidades concretas de CCT (Figura 6), mientras que en el caso de GroEL, los polipéptidos que se unen a esta chaperonina lo hacen al azar a cualquiera de las siete sub unidades. Otra de las diferencias importantes es que los sustratos con los que GroEL interacciona están parcial o totalmente desnaturalizados, mientras que parece que actina se une a CCT en una conformación cuasi nativa a la que sólo le falta un pequeño pero importante paso para alcanzar la conformación nativa. Ese paso sólo se lo puede proveer CCT, de tal manera que ciertas mutaciones en esta chaperonina o su ausencia provocan la muerte celular. La especificidad de CCT sobre sus sustratos (actina y tubulina principalmente) y la de éstos por CCT se refuerza por el hecho de que GroEL interacciona promiscuamente con cualquier proteína, incluso actina y tubulina en un estado desnaturalizado, pero no es capaz de plegarlas.Todo parece indicar que CCT apareció en la naturaleza a la vez que los organismos eucariotas (ya que está presente sólo en ellos), como evolución de una chaperonina primigenia y en respuesta a los problemas de plegamiento que plantea la tubulina, proteína que apareció en los organismos eucariotas como una evolución de la más primitiva FtsZ, presente en procariotas. La tubulina es una proteína muy compleja, que forma estructuras enormes llamadas microtúbulos como consecuencia de complejos fenómenos de polimerización. La formación de los microtúbulos tiene que ver con peculiaridades en la estructura de tubulina, y es posible que la aparición de aquéllas haya dado lugar a la evolución de una chaperonina específica para lidiar con un problema muy puntual pero vital a la célula como es el plegamiento de tubulina (y el de actina). El hecho de que FtsZ no interaccione con CCT y su plegamiento se produzca por si sola o con la ayuda de GroEL parece reforzar la hipótesis aquí apuntada.En resumen, los resultados obtenidos hasta la fecha nos muestran a las chaperoninas como unas máquinas moleculares con una arquitectura ideada por la naturaleza para tratar un problema general, el del plegamiento de proteínas, utilizando para ello un mecanismo que aunque ineficiente desde el punto de vista energético se adapta a un gran número de proteínas. Durante la evolución natural de los organismos, esa misma arquitectura ha sido utilizada por otra chaperonina para tratar de forma específica y muy eficiente el problema del plegamiento de dos proteínas citoesqueléticas vitales para la célula como son la actina y la tubulina. 

Plegamiento ProteicoA medida que la cadena polipeptídica va siendo sintetizada se produce el plegamiento de la cadena naciente. Si se calculan la cantidad de formas que podría adquirir una proteína en el espacio, esta estará determinada por la cantidad de aminoácidos que presente. Por ejemplo, una proteína que posea n restos, podría plegarse en 8n conformaciones distintas. Este cálculo se hace en base a que, desde el punto de vista estereoquímico, son ocho los ángulos de enlace permitidos en la columna vertebral de la cadena polipeptídica. Sin embargo, cada proteína adopta una conformación única que denominaremos estado nativo, siendo ésta la forma de plegamiento más estable de la molécula. Para evitar un anormal plegamiento, la célula consta de dos procesos fundamentales. Uno de ellos se realiza a nivel molecular, mediante el cual la proteína se pliega a través de una vía que solo favorece unos pocos pasos intermedios. El otro consiste en un sistema celular que detecta e impide esta condición anómala.

A esta altura, el lector podría formularse la siguiente pregunta: ¿Dónde radica la información para que la proteína pueda adquirir su forma nativa? La clave para contestarla se encuentra en la secuencia de aminoácidos que componen la cadena polipeptídica. Este descubrimiento fue realizado gracias al estudio del plegamiento y desplegamiento in vitro de las proteínas. Debe resultarle sabido que ciertos factores rompen los enlaces no covalentes que estabilizan la conformación nativa de la proteína. El calor, los extremos de pH y ciertos agentes químicos figuran dentro de estos factores. Al proceso por el cual se altera la conformación compacta y la actividad de la proteína, quedando solo su estructura lineal, se lo denomina desnaturalización proteica. La mayoría de las proteínas desnaturalizadas precipitan cuando se encuentran en solución, debido a que sus grupos hidrófobos interactúan con regiones similares de otras moléculas no plegadas, formando así un agregado insoluble. La desnaturalización no es un proceso irreversible sino que generalmente es posible renaturalizar la proteína mediante la eliminación de los elementos desnaturalizantes. Para este propósito se realiza la diálisis, en donde vuelven a formarse todos los enlaces disulfuro, los puentes de Hidrógeno y todos aquellos enlaces no polares que estabilizan la conformación nativa. Dado que esta restauración no requiere cofactores u otras proteínas, al menos in vitro, el plegamiento funciona como un proceso de autoensamblaje. Siendo la secuencia de los aminoácidos la que determine la información necesaria para la adquisición de la forma nativa. En el camino hacia la adquisición de esta forma, la proteína adquiere configuraciones transitorias. Una de estas formas está representada por el estado de glóbulo fundido. El plegamiento proteico es acompañado por verdaderas chaperonasEn vivo la proteína debe alcanzar su forma nativa con rapidez y alta eficiencia. El plegamiento realizado en el laboratorio, que lleva algunos minutos, no es suficientemente rápido a nivel celular. Un plegamiento errático de las proteínas correspondería a un gasto innecesario de energía y, como sabemos, muchos de los procesos celulares tienen su base en el ahorro energético. Estudios realizados en el laboratorio indican que, del total de las proteínas encontradas en una célula, sólo un 5 % distan de su conformación nativa. La explicación a esta notable eficiencia podría radicar en la presencia de ciertas proteínas de la familia de las chaperonas. Las chaperonas se caracterizan por tener representantes en todos los compartimentos celulares, en los cuales se unen a una amplia gama de proteínas, formando parte del mecanismo general que determina su plegamiento. Podemos establecer dos tipos distintos de chaperonas: Las chaperonas moleculares y las chaperoninas. Las primeras se encargan de estabilizar a aquellas proteínas que no están plegadas, impidiendo así su degradación. Las segundas facilitan el plegamiento de las cadenas polipeptídicas. El accionar de las chaperonas demanda un gasto energético, gasto que es cubierto mediante la degradación del ATP. Las chaperonas pertenecen a un grupo más amplio de proteínas conocido como “proteínas de shock térmico”, cuyas siglas en inglés son Hsp (HeatShock-Proteins). Y, dentro de estas, se las conoce como las Hsp 60 y 70. Ambos tipos de chaperonas poseen afinidad por las zonas hidrofóbicas de las proteínas plegadas de forma incompleta. Cuando las chaperonas están unidas al ATP poseen una forma abierta, en la cual un bolsillo hidrofóbico se une a las zonas homónimas de las proteínas cuya estructura dista de la conformación nativa. Ante la unión de estas, la chaperona adopta una forma cerrada que libera la proteína blanco. Se cree que las chaperonas se unirían a todas las cadenas polipeptídicas en formación, generando efectos que se asemejarían a “masajes proteicos”, por los cuales proporcionarían a la proteína otra posibilidad de plegarse. Para que usted pueda darse una idea del proceso, imagínese que estruja un trapo con ambas manos, retorciéndolo hasta que sea compactado. Las chaperoninas eucariotas, o TciP, son grandes complejos formados por ocho unidades de Hsp60. En las células del tipo procariota las chaperoninas poseen catorce sub unidades idénticas que conforman un complejo con forma de barril, conocido bajo las siglas GroEL. El mecanismo por el cual el GroEL interviene en el plegamiento proteico es dependiente del ATP. La proteína ingresa al mismo y otra chaperonina, la GroES, cubre los extremos del barril. Debido a que la chaperonina eucariota TciP carece de una chaperonina análoga a la GroES, el último paso del plegamiento proteico difiere en las células eucariotas.

Muerte programada de las ProteínasLas células son capaces de degradar selectivamente cualquier complejo proteico mal ensamblado mediante un elaborado conjunto de proteínas que permite dirigirlas específicamente hacia la maquinaria que realizará la proteólisis. Una de las funciones que posee dicha proteólisis es, como se mencionó en el párrafo anterior, el reconocer y eliminar aquellas proteínas que se encuentren dañadas o mal plegadas. Sin embargo, esta maquinaria proteolítica actuará también confiriéndole una corta vida media a ciertas proteínas normales, cuya concentración ha de cambiar rápidamente o degradará a otras proteínas, como las ciclinas, que deben permanecer en concentraciones estables hasta que sean degradadas espontáneamente en un determinado momento del ciclo celular. La mayoría de las proteínas que son degradadas a nivel citoplasmático son liberadas a grandes complejos proteicos denominados proteosomas. Cada proteosoma consiste en un cilindro central formado por múltiples proteasas, cuyos centros activos formarían una cámara central. Vale decir que estas estructuras celulares actuarían como verdaderas usinas proteolíticas, en las cuales las proteínas a degradar serían incorporadas y desensambladas. Cada extremo de este cilindro está obturado por un gran complejo proteico constituido por, al menos, 10 polipéptidos distintos. Se cree que los tapones proteicos serían los encargados de seleccionar a las proteínas que deberán ser destruidas, uniéndose a ellas e introduciéndolas en la cámara del cilindro. Las proteínas que sean blanco de esta verdadera máquina, serán degradadas hasta pequeños péptidos que se eliminarán hacia el exterior.

El título de este presente apartado adelantaba que las proteínas a ser degradadas estaban marcadas para “morir”. Es así como los proteosomas actúan sobre aquellas proteínas que han sido marcadas mediante la adición covalente de una pequeña proteína, la ubiquitina. Este pequeño polipéptido está presente en todos los tipos celulares, libre o unida covalentemente a otras proteínas. La unión de la ubiquitina a las proteínas se realiza mediante enzimas específicas, quienes la añaden a un residuo del aminoácido lisina, y posteriormente añaden series de ubiquitinas adicionales, formando una cadena multiubiquitina, la cual es reconocida por un receptor proteico específico del proteosoma. Las proteínas mal plegadas, desnaturalizadas, con residuos oxidados o anormales, son reconocidas y degradadas por el complejo dependiente de la ubiquitina. Las enzimas que añaden este péptido reconocerían ciertas señales proteicas que denotan su anormalidad. Uno de los problemas que plantea este tipo de mecanismo, es la discriminación que debe de realizar la célula entre aquellas proteínas que estén mal plegadas, las cuales deben ser ubiquitinadas para su posterior destrucción, de otras que estén siendo sintetizadas a nivel ribosomal. Una de las posibilidades que se plantean es que estas últimas estén protegidas de la ubiquitinación mediante el acompañamiento de ciertas chaperonas; la otra posibilidad es que el plegamiento proteico, pos traducción, sea realizado tan rápido que el complejo de ubiquitinación no posea el tiempo necesario para actuar. Ciertas enfermedades podrían ser causadas por proteínas mal plegadasLas proteínas podrían adoptar concurrentemente formas distantes a la conformación nativa, por lo cual se produciría la pérdida de la función biológica y su posterior marcado para ser degradada. La acumulación de los fragmentos resultantes de la proteólisis contribuye a ciertas enfermedades degenerativas caracterizadas por la presencia de placas proteicas insolubles en órganos tales como el hígado y el cerebro. La enfermedad de Alzheimer es un ejemplo de lo antedicho, pues se caracteriza por la presencia de placas y ovillos a nivel cerebral. Los filamentos que componen estas placas son producto de la proteólisis de abundantes proteínas naturales, como la proteína precursora de amiloide, una proteína de transmembrana, y Tau, una proteína de fijación de microtúbulos. En otros órganos se ha visto que la formación de placas es el resultado de la proteólisis de proteínas naturales como la gelsolina, una proteína fijadora de la actina, y la albúmina sérica, proteína propia de la sangre. Los fragmentos liberados por proteólisis se unen formando hilos muy estables. La degeneración cerebral, similar a la que se produce por Alzheimer, es causada por priones, una proteína infecciosa derivada de la proteólisis y el replegamiento de una proteína normal del cerebro.