BIOLOGIA MOLECULAR 1... · estuda a composição, estrutura e interações de moléculas celulares...
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Definição
• Biologia Molecular é o campo da biologia que estuda a composição, estrutura e interações de moléculas celulares - tais como ácidos nucléicos e proteínas - que realizam os nucléicos e proteínas - que realizam os processos biológicos essenciais para as funções e manutenção da célula.
Esquema da relação entre a bioquímica (biochemistry), a genética (genetics) e a biologia molecular (molecular biology).
BIOLOGIA MOLECULARBIOLOGIA MOLECULAR
� Possibilita a manipulação de moléculas=> introdução de genes em um genoma receptor
Tecnologia do DNA recombinante
� Enzimas replicar, cortar e ligar o DNA
� Bases nitrogenadas
Tecnologia do DNA recombinante
Depende:
� Clivar DNA com enzimas de restrição
� Inserir DNA eucariótico em bactérias
� Determinar a sequência de um fragmento de DNA
DNA RECOMBINANTEDNA RECOMBINANTE
Ferramenta permite:
� Determinar a sequência de um fragmento de DNA
� Amplificar e sintetizar DNA
� Recombinar fragmentos de DNA, etc.
� Isolar um gene em particular, parte de um gene ou umaregião do genoma;
�Produzir proteína de interesse em larga escala;
Alguns objetivos que a tecnologia do DNA recombinante tornou possível
�Aumentar a eficiência da produção de enzimas e drogaspara comercialização;
�Modificar organismos existentes para que expressem umacaracterística de interesse que não seja codificada pelogenoma = Transgênicos
• Plantas tolerantes à Doenças e a Pragas
• Feijão resistente ao vírus do mosaico dourado e Mamão papayaresistente ao vírus da mancha anelar
• Milho, algodão, soja (Bt) = resistentes ao ataque de insetos
• Plantas tolerantes à Herbicidas
• Soja e Milho (RR) = tolerante ao glifosato
AGRICULTURAAGRICULTURA
• Soja e Milho (RR) = tolerante ao glifosato
• Soja = tolerante ao 2,4-D
• Plantas tolerantes ao estresse ambiental (Seca, frio, calo r,salinidade e acidez)
• Cana-de açúcar tolerante à seca
• Plantas com melhorias nutricionais (vitaminas e aa)
• Arroz dourado (Golden rice), rico em betacaroteno, precursor da vitamina A - evitar a cegueira noturna e desnutrição
GENEGENE
Sequência ordenada de nucleotídeos – DNA
Conceito:
Expressão
Codifica um produto funcional (proteína ou molécula de RNA)
� Perpetuada através da Replicação do DNA
� Expressa através de dois processos:
DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULARDOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR
A informação genética:
(Ácido nucleico)
Transcrição e Tradução
DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULARDOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR
DNA DNA
Transcrição
Replicação
TranscriçãoReversa
RNA
PROTEÍNA
Tradução
PURINASBicíclicas
Bases Púricas e Pirimídicas = Anéis Aromáticos Heterocíclicos
BASES NITROGENADASBASES NITROGENADAS
PIRIMIDINASMonocíclicas
Adenina Guanina
Citosina Uracila Timina
DNA : DNA : POLÍMERO DE NUCLEOTÍDEOSPOLÍMERO DE NUCLEOTÍDEOS
NUCLEOTÍDEOS
HO
fosf
odié
ster
Filamento de nucleotídeos
5’
3’
5’
HO3’
Liga
ção
fosf
odié
ster
3’
3’HO
HO3’
5’
5’
DNA : DNA : ESTRUTURAESTRUTURA
A = T 2 pontes H
2 Fitas de nucleotídeosEstrutura Plana
Complementares e Invertidas
A = T
G C 3 pontes H
DNA: estrutura tridimensional
� Duas fitas enroladas, complementares entre si e
invertidas
� Cada fita: composta por uma sequência linear de
Extremidade 5’ = Fosfato (PO 4)
� Cada fita: composta por uma sequência linear de
nucleotídeos
� Estrutura Helicoidal em dupla hélice
Extremidade 3’ = Hidroxila (HO)
Leitura e Escrita 5’ 3’
(Watson & Crick, 1953)
� Replicação: capacidade do DNA de originar cópiasidênticas (auto duplicação)
COMO O DNA SE REPLICA ?COMO O DNA SE REPLICA ?
O processo é dividido em 3 etapas:
Etapa Enzima Função
Desenrola as duas hélices e rompe as pontes de 1ª DNA Helicase
Desenrola as duas hélices e rompe as pontes de hidrogênio entre os nucleotídeos => separa fitas
2ª DNA Polimerase Encaixa os nucleotídeos na fita molde
3ª DNA LigaseRealiza a ligação dos nucleotídeos (fragmentos de Okasaki)
Primase (RNA polimerase) : confecção de primers para que a DNA polimerase inicie a síntese
DNA : DNA : DUPLICAÇÃODUPLICAÇÃO
DNA polimerase: requer primers para iniciar a síntese (5’-3’)
Fita contínua Helicase
Origem de Replicação: regiões ricas em AT = início da replicação
Fita descontínua
DNA Ligase
Primers
DNA polimerase
Forquilha de replicação
(Primase)
RNA : POLÍMERO DE NUCLEOTÍDEOS
1. DNA se abre: RNA polimerase (bolha de transcrição )
2. Pareamento de novos nucleotídeos (ribose e uracila)
na fita molde de DNA
TRANSCRIÇÃO: DNA => RNATRANSCRIÇÃO: DNA => RNA
na fita molde de DNA
3. RNA pronto se solta e migra para o citoplasma
4. DNA se recompõe
RNA : RNA : ESTRUTURAESTRUTURA
Bolha de Transcrição
RNA polimerase : não necessita primers, abre e renatura o DNA
� DNA se abre� Pareamento de novos nucleotídeos (ribose e
uracila) na fita molde de DNA� RNA pronto se solta e migra para o
citoplasma� DNA se recompõe
TRANSCRIÇÃOTRANSCRIÇÃO
• Enzima responsável: RNA polimerase
• Início da Transcrição : Região Promotora⇒ pequena sequência de nucleotídeos reconhecida pelaRNA polimerase como ponto onde deve se ligar ao DNA
Exemplos promotores :Exemplos promotores :Região TATA box => -10: 5’-TATAAT- 3’
=> -35: 5’-TTGACA- 3’
Término da Transcrição:
TRANSCRIÇÃOTRANSCRIÇÃO
RNA polimerase encontra um Terminador
• Sequência nt que determina o desligamento da RNA polimerase
• Região com pares consecutivos de A/U
• Região rica em G+C (dependente de proteína)
O complexo de transcrição se dissocia
e há liberação da molécula de RNA
RNA : RNA : ESTRUTURAESTRUTURA
• Fita simples (única), helicoidal• Regiões complementares• Formando grampos e alças
• RNA mensageiro (mRNA) => informação genética para asequência de aminoácidos das proteína
• RNA ribossômico (rRNA) => constituinte dos ribossomos
TIPOS TIPOS DEDE RNARNA
• RNA transportador (tRNA) => identifica e transporta osaminoácidos até os ribossomos
TRADUÇÃOTRADUÇÃO
Síntese de proteínas
Converte trincas de nt RNA => Aminoácidos => Proteína
• Local : Ribossomos (citoplasma)• Local : Ribossomos (citoplasma)
• Início da Tradução: Códon de iniciação=> AUG (Metionina)
• Término da Tradução: Códon de terminação=> Não codifica aminoácido
Ex: UGA, UAG, UAA
PROPRIEDADES DO DNAPROPRIEDADES DO DNA
• DESNATURAÇÃO → rompimento das pontes de hidrogênioentre as cadeias complementares do DNA
• RENATURAÇÃO → reanelamento das pontes de hidrogênioentre as cadeias complementares do DNA
=> Fenômenos físicos fundamentais para os processosde replicação e transcrição
Esses processos podem ser realizados in vitro
A Desnaturação pode ser obtida através de:
� Aumento de temperatura
� Agentes desnaturantes (formamida e dimetil-sulfóxido)
� Titulação com ácido ou base
MANIPULAÇÃO DO DNAMANIPULAÇÃO DO DNA
� Titulação com ácido ou base
Tm (°C) = 69,3 + 0,41 (GC%)
Temperatura média de fusão
A Renaturação pode ser obtida através de:
� Diminuição lenta de temperatura
Resfriamento abrupto: colapso do DNA
MANIPULAÇÃO DO DNAMANIPULAÇÃO DO DNA
Resfriamento abrupto: colapso do DNA
T (anelamento) ( oC) = Tm – 25oC
MANIPULAÇÃO DO DNAMANIPULAÇÃO DO DNA
Enzimas => replicar, cortar e ligar
� Replicação: DNA polimerase e helicase
� Transcrição: RNA polimerase
� Corte do DNA: Enzimas de Restrição� Corte do DNA: Enzimas de Restrição
� Ligação de DNA: DNA-ligases
Tornou possível transferir sequências específicas de DNA de uma molécula para outra
Acesso a vários tipos de enzimas:
MANIPULAÇÃO DO DNAMANIPULAÇÃO DO DNA
Enzimas de Restrição
Reconhecem e cortam sequências específicas do DNA
• Encontradas em ampla variedade de procariotos (clivarmoléculas de DNA exógeno)moléculas de DNA exógeno)
• Isolamento de genes e criação de moléculas novas de DNA
• Reconhecem sequências de 4 a 8 nt
• Sítios de Clivagem: hidrolisa ligações fosfodiéster
ENZIMAS DE RESTRIÇÃOENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Enzimas com diferentes especificidades já foram purificadas:
Denominação Origem Sequência de Reconhecimento
� Abreviação de 3 letras do nome da espécie
� Seguida da designação da linhagem
� Número Romano: se mais de uma enzima é produzida
ENZIMAS DE RESTRIÇÃOENZIMAS DE RESTRIÇÃO
5’...
...5’
...3’
3’...
Sequências Palindrômicas (repetições invertidas): sequência das duas cadeias é igual quando for lida de 5’ para 3’
5’...
3’... ...5’
...3’
Extremidade Coesiva Extremidade Cega (Abrupta)
ENZIMAS DE RESTRIÇÃOENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Clonagem: Mais utilizados fragmentos gerados com extremidades coesivas > eficiência de ligação
Isoesquisômeros:
ENZIMAS DE RESTRIÇÃOENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Enzimas provenientes de organismos diferentes quereconhecem e cortam a mesma sequência de bases
ENZIMAS DE LIGAÇÃOENZIMAS DE LIGAÇÃO
� Restabelecem as ligações fosfodiéster entre osnucleotídeos (hidroxila 3’+ fosfato 5´)
� Capacidade de ligar dois cortes produzidos pela mesmaenzima de restrição
O
Ex: T4 DNA ligase
DNA DNA3’ OH - O O 5’P
O
- O
DNA DNA3’ O O 5’
O
P
- O
+
DNA-LigaseATP ou NADDNA ligase