BIOKONVERSI PENISILIN G MENJADI 6-

Aminopenicillanic Acid (6-APA) SECARA ENZIMATIS

SKRIPSI

OLEH

LULU SULISWATI

14.01.021.013

PROGRAM STUDI TEKNOBIOLOGI

FAKULTAS TEKNOBIOLOGI

UNIVERSITAS TEKNOLOGI SUMBAWA

SUMBAWA BESAR

2018

BIOKONVERSI PENISILIN G MENJADI 6-Aminopenicillanic acid (6-APA)

SECARA ENZIMATIS

SKRIPSI

Diajukan kepada

Universitas Teknologi Sumbawa

sebagai salah satu persyaratan menyelesaikan

Program Sarjana Strata Satu (S1)

Oleh

LULU SULISWATI

14.01.021.013

PROGRAM STUDI TEKNOBIOLOGI

FAKULTAS TEKNOBIOLOGI

UNIVERSITAS TEKNOLOGI SUMBAWA

SUMBAWA BESAR

2018

vii

ABSTRAK

Suliswati, Lulu. 2018. Biokonversi Penisilin G Menjadi 6-Aminopenicillanic Acid

(6-APA) Secara Enzimatis. Skripsi. Program Studi Teknobiologi,

Fakultas Teknobiologi, Universitas Teknologi Sumbawa. Pembimbing

(1) Baso Manguntungi, S.Si., M.Si., (II) Dr. Ahmad Wibisana, MT.

Indonesia sampai saat ini masih kekurangan dalam penyediaan bahan baku obat,

khususnya obat yang berfungsi sebagai antimikroba. Antibiotik dibedakan

menjadi 2 yaitu antibiotik alami dan antibiotik semisintetik. Antibiotik

semisintetik tidak hanya lebih baik dari antibiotik alami tetapi juga dapat

mengatasi masalah resistensi mikroba tehadap antibiotik. Salah satu dari sekian

banyak antibiotik yang dibutuhkan dan digunakan sampai saat ini adalah berasal

dari golongan penisilin. Bahan dasar untuk pembuatan penisilin semisintetik

adalah 6-Aminopenicillanic Acid (6-APA) yang dihasilkan secara kimiawi

maupun enzimatik. Hidrolisis secara enzimatik dengan penisilin asilase lebih

efektif dan efisien dari pada hidrolisis secara kimiawi. Reaksi hidrolisis enzimatik

dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain temperatur, pH, dan

konsentrasi substrat. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan biokonversi

penisilin G menjadi 6-APA secara enzimatis dalam reaktor curah (Batch) dan

mengetahui kadar 6-APA yang dihasilkan dari hasil biokonversi berdasarkan

faktor-faktor yang mempengaruhinya. Penelitian dilakukan dengan menghidrolisis

penisilin G menggunakan enzim penisilin asilase amobil. Aktivitas enzim

dilakukan pada kondisi suhu 28 oC, 32

oC, 35

oC, 37

oC, 39

oC, 42

oC, 50

oC, dan

60 oC, pH 6, pH 6,6, pH 7, pH 7,6 dan pH 8, serta konsentrasi substrat 2 % - 10

%. Setelah diperoleh kondisi optimal dari masing-masing faktor, dilakukan proses

biokonversi dalam buffer potasium fosfat yang direaksikan dalam reaktor curah

(Batch). Pengambilan sampel dilakukan pada menit ke-0, 10, 20, 30, 40, 50, 60,

70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, dan 180 menit. Sampel

ditambahkan larutan stop reaksi dan PDMAB (4-Dimethylamino Benzaldehyde),

kemudian dianalisis menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang

415. Berdasarkan hasil penelitian, aktivitas penisilin G asilase untuk

mengkonversi penisilin G dicapai pada suhu 42 oC, konsentrasi substrat 7 %, dan

pH 7,6 dengan aktivitas enzim sebesar 86,020, 37,584, dan 30,331 unit/gram.

Penisilin G yang dapat dikonversi menjadi 6-APA adalah sebanyak 71,615 %.

Kata kunci : Penisilin G, penisilin asilase, 6-Aminopenicillanic Acid (6-APA)

viii

ABSTRACT

Suliswati, Lulu. 2018. Bioconversion of Penicillin G Becomes 6-

Aminopenicillanic Acid (6-APA) Enzymatically. Essay. Biotechnology

Study Program, Faculty of Biotechnology, Sumbawa University of

Technology. Counselor (1) Baso Manguntungi, S.Si., M.Sc., (II) Dr.

Ahmad Wibisana, MT.

Indonesia is still lack of the medicinal raw materials supply, especially antibiotic

drugs. Antibiotic is divided into 2, which are natural-based antibiotics and

semisynthetic antibiotics. Semisynthetic antibiotics is better than natural-based

antibiotic in the way of their effectiveness towards the problem of microbial

resistance to antibiotics. The most common antibiotics are derived from the

penicillin group. Precursor of semisynthetic penicillin manufacture is 6-

Aminopenicillanic Acid (6-APA) which is derived chemically and enzymatically.

Enzymatic hydrolysis using penicillin acylase is more effective and efficient than

chemical hydrolysis. This enzymatic hydrolysis is affected by several factors,

including temperature, pH, and substrate concentration. This study aims to convert

penicillin G to 6-APA enzymatically by batch reactor and to identify the amount

of 6-APA resulting from the bioconversion based on the factors affected. This

research was carried out by penicillin G hydrolysis using immobilized penicillin

acylase enzyme. Several treatments towards enzyme temperature conditions were

28 oC, 32

oC, 35

oC, 37

oC, 39

oC, 42

oC, 50

oC, and 60

oC. While the pH

treatments were pH 6, pH 6.6, pH 7, pH 7.6 and pH 8, and substrate

concentrations from 2 % to 10 %. After obtaining the optimum conditions of each

factors, penicillin G bioconversion was carried out in a potassium phosphate

buffer reacted batch reactor. Sampling was performed at 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60,

70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, and 180 min. The sample was

added with a stop reaction solution and PDMAB (4-Dimethylamino

Benzaldehyde), then analyzed using spectrophotometer with 415 nm wavelength.

Research results showed that the activity of penicillin G acylase to convert

penicillin G was achieved at 42 oC, substrate concentration 7 %, and pH 7, 6 with

enzyme activity of 86.020, 37.584 and 30.331 units/gram. Penicillin G which can

be converted into 6-APA was 71.615 %.

Keywords: Penicillin G, penicillin acylase, 6-Aminopenicillanic Acid (6-APA)

ix

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah Subhanahu Wa Ta’ala atas

limpahan rahmat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan Skripsi dengan judul

‘Biokonversi Penisilin G menjadi 6-Aminopenicillanic Acid (6-APA) Secara

Enzimatis”. Penelitian ini bertujuan untuk menghasilkan substrat yang

merupakan komponen utama dalam produksi penisilin dan sefalosporin. Skripsi

ini disusun sebagai bentuk pertanggungjawaban penulis pada saat melakukan

penelitian Tugas Akhir di Balai Bioteknologi, Badan Pengkajian dan Penerapan

Teknologi (BPPT), Tangerang Selatan, Tahun 2018.

Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada pihak-pihak yang telah

mendukung penulis, baik selama proses penelitian berlangsung maupun dalam

penyusunan laporan Skripsi:

1. Teristimewa kepada orang tua tercinta bu Siti Asiah dan bapak Edi Ahmadi

yang telah memberikan do’a, dukungan materil dan moral serta semangat

selama menempuh pendidikan S1 Teknobiologi di Fakultas Teknobiologi,

Universitas Teknoligi Sumbawa (FTB UTS).

2. Bapak Baso Manguntungi, S.Si., M.Si., selaku dosen pembimbing I atas

segala bimbingan selama penyusunan skripsi ini.

3. Bapak Dr. Ahmad Wibisana, MT, selaku pembimbing II, yang telah

menyediakan waktu, tenaga, dan pikiran untuk mengarahkan penulis selama

penelitian dan penulisan skripsi ini. Tidak hanya bimbingan terkait materi

penelitian, namun juga selalu memberi motivasi untuk melakukan yang

terbaik.

4. Laboratorium Analisis Kimia dan Mikrobiologi, Balai Bioteknologi, Badan

Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT) selaku tempat penulis

melaksanakan penelitian tugas akhir.

5. Seluruh Tim Laboratorium Analisis Kimia dan Mikrobiologi, BPPT (ibu Lira,

bapak Rudi, bapak Musidin, ibu Uli, mbak Tiol, bapak Ujang, ibu Efrida,

bang Jay beserta seluruh staf peneliti dan laboran) yang telah membantu

penulis selama melakukan penelitian di Balai Bioteknologi, BPPT. Selain itu,

beliau semua senantiasa membantu serta memberi dukungan, motivasi, dan

semangat untuk penulis.

6. Seluruh pengajar di Program Studi Bioteknologi Fakultas Teknobiologi

Universitas Teknologi Sumbawa (Dwi Ariyanti, S.Pt., M.Biotech., Ali Budhi

Kusuma, M.Sc., Maya Fitriana, S.Si., Sausan Nafisah, S.Si., Win Ariga

Mansur Malonga, S.Pi., Izzul Islam, S.Pi., M.Eng., Hurul Aini As Silmi,

S.Si., Lili Suharli, S.Si.,M.Pd., Kusdianawati, S.Pt., M.Si., Khotibul Umam,

M.Sc., dan Riri Rimbun Anggih Chaidir, M.Sc.) atas segala didikan yang

telah penulis terima sejak pertama kali penulis menimba ilmu hingga

akhirnya mampu menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi. Beliau

semua tidak pernah lelah memberikan semangat, motivasi, dukungan, dan doa

untuk penulis selama masa perkuliahan.

7. Pertamina Foundation atas Beasiswa Sobat Bumi Inspirasi Indonesia Timur

yang telah diberikan selama penulis menempuh pendidikan di Fakultas

Teknobiologi, Universitas Teknologi Sumbawa.

x

8. Orang tua kedua ibu Hayat Khairiyah dan bapak Darma yang telah

memberikan do’a dan senantiasa memberi dukungan, motivasi, serta

semangat untuk penulis.

9. Keluarga yang selalu menjadi saudara terbaik yang telah memberikan

dukungan, bantuan moral, dan spiritual selama penyusunan skripsi ini.

10. Teman-teman Bioteknologi 2014, khususnya Ani Sulastri, Auliya Safitri,

Eviana, Dariati, Nurul Izzati, Lovi Adekamulyani, Tegar Aprilian, Kurniawan

Eka Putra, Septi Arini, Robby Sahrullah, yang telah banyak membantu

penulis dalam memberikan motivasi, semangat, do’a, dan dukungan, serta

mengoreksi tulisan penulis dalam skripsi ini.

11. Kakak-kakak FTB 2013, teman-teman FTB 2015, 2016, dan 2017, serta

teman-teman SMA yang telah memeberikan motivasi, arahan dan

memberikan semnagat serta dukungan kepada penulis selama pelaksanaan

penelitian dan penulisan skripsi ini.

12. Semua orang yang telah mendukung, memberikan semangat, dan do’a kepada

penulis yang tidak bisa saya sebut satu per satu sehingga penulis mampu

meyelesaikan skripsi ini.

Penyusunan skripsi tentunya tidak terlepas dari kekurangan. Akhir kata,

semoga Allah Subhanahu Wa Ta’ala senantiasa memberikan kasih sayang-Nya

untuk semua pihak yang telah membantu penulis selama ini. Semoga skripsi ini

dapat menjadi salah satu sumber ilmu pengetahuan dan dapat memberikan

manfaat bagi orang-orang yang membutuhkan.

Sumbawa Besar, 18 Juli 2018

Lulu Suliswati

xi

DAFTAR ISI

ABSTRAK ........................................................................................................ vii

ABSTRACT ...................................................................................................... viii

KATA PENGANTAR ...................................................................................... ix

DAFTAR ISI ...................................................................................................... xi

DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ xii

DAFTAR TABEL ........................................................................................... xiv

DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... xv

BAB I PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang ................................................................................ 1

1.2. Rumusan Masalah ........................................................................... 2

1.3. Tujuan .............................................................................................. 2

1.4. Manfaat ............................................................................................ 3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Antibiotik ......................................................................................... 4

2.2. Penisilin G ........................................................................................ 5

2.3. Penisilin G Asilase ........................................................................... 6

2.4. 6-Aminopenicillanic Acid (6-APA) .................................................. 7

2.5. Biokonversi Penisilin G menjadi 6-Aminopenicillanic Acid

(6-APA) ........................................................................................... 8

2.6. Mekanisme Kerja Antibiotik ............................................................ 9

2.7. Bakteri Resisten................................................................................ 10

BAB III METODE PENELITIAN

3.1. Waktu dan Tempat ......................................................................... 12

3.2. Alat dan Bahan Penelitian .............................................................. 12

3.2.1. Alat Penelitian ....................................................................... 12

3.2.2. Bahan Penelitian ................................................................... 12

3.3. Rancangan Penelitian ..................................................................... 12

3.4. Langkah Kerja ................................................................................ 13

3.4.1. Pembuatan Larutan Stok ........................................................ 13

3.4.1.1. Buffer Potasiium Fosfat 0,1 M ......................................... 13

3.4.1.2. Larutan Stop Reaksi ......................................................... .13

3.4.1.3. Larutan PDMAB (4-Dimethylamino Benzaldehyde) ...... .13

3.4.1.4. Larutan Stok 6-APA......................................................... .14

3.4.2. Pembuatan Kurva Standar 6- APA ........................................ .14

3.4.3. Pengujian Aktivitas Enzim Penisilin Asilase ........................ .14

3.4.4. Biokonversi penisilin G menjadi 6-APA .............................. .15

3.4.5. Analisis Spektrofotometer ..................................................... .15

3.5. Analisa Data .................................................................................... .16

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim ..................... 17

4.1.1. Suhu ....................................................................................... 17

4.1.2. Konsentrasi Substrat ............................................................... 19

xii

4.1.3. pH .......................................................................................... 20

4.2. Biokonversi Penisilin G menjadi 6-Aminopenicillanic Acid (6-APA)

.......................................................................................................... 21

BAB V. PENUTUP

5.1. Kesimpulan....................................................................................... 25

5.2. Saran ................................................................................................. 25

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 26

LAMPIRAN ....................................................................................................... 29

xiii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1. Struktur kimia penisilin G, a) cincin β-laktam, b) cincin thiazolidin,

c) R. rantai samping ........................................................................ 5

Gambar 2.2. Struktur kimia konversi penisilin G menjadi 6-APA ...................... 9

Gambar 4.1. Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim ........................................ 17

Gambar 4.2. Pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas enzim ................ 19

Gambar 4.3 Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim .......................................... 20

Gambar 4.4. Jumlah penisilin G terkonversi ....................................................... 22

Gambar 4.5. Perbandingan penisilin G yang terkonversi dan jumlah 6-APA yang

terbentuk ........................................................................................ 23

xiv

DAFTAR TABEL

Tabel 3.1. Rancangan penelitian ........................................................................ 13

xv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Pembuatan Kura Standar 6-APA ................................................... 29

Lampiran 2. Faktor-faktor yang menpengaruhi Aktivitas enzim ....................... 30

Lampiran 3. Tabel hasil biokonversi penisilin G menjadi 6-APA ..................... 31

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Indonesia sampai saat ini masih harus mengimpor kebutuhan bahan baku

obat, khususnya antibiotik yang berfungsi sebagai antimikroba. Kebutuhan akan

antibiotik dewasa ini semakin meningkat seiring dengan berkembangnya berbagai

jenis penyakit akibat infeksi mikroba (Nawfa, 2005). Antibiotik adalah substansi

alamiah hasil metabolisme sekunder mikroorganisme yang mempunyai

kemampuan yang menghambat atau membunuh bakteri (Rachman et al., 2016).

Salah satu jenis antibiotik yang banyak diimpor adalah penisilin. Penisilin

yang digunakan dalam pengobatan terbagai menjadi 2 yaitu penisilin alami dan

penisilin semisintetik. Penisilin alami memiliki kelemahan yaitu spektrumnya

sempit dan peka terhadap penisilinase (β-laktamase). Penisilin semisintetik

diperoleh dengan cara mengubah struktur kimia penisilin alami atau dengan cara

sintesis inti penisilin, bahan dasar yang digunakan untuk pembuatan penisilin

semisintetik adalah 6-Amino Penicillanic Acid (6-APA) (Desriyati et al., 2012).

6-Amino Penicillanic Acid (6-APA) yang dihasilkan dari hasil hidrolisis

penisilin G merupakan salah satu contoh penting dari aplikasi di bidang industri

biokatalis. Senyawa 6-APA sebagai bahan baku antibiotik turunan penisilin dapat

diproduksi melalui proses fermentasi, hidrolisis penisilin G secara kimiawi dan

hidrolisis penisilin G secara enzimatik. Produksi senyawa 6-APA umumnya

dilakukan dengan cara hidrolisis secara enzimatik. Hidrolisis penisilin G secara

enzimatik menggunakan penisilin asilase yang dihasilkan oleh bakteri dan jamur

tertentu. Penggunaan enzim mempunyai beberapa keuntungan antara lain

reaksinya spesifik, efisien, dapat dilakukan pada kondisi lunak, serta lebih ramah

lingkungan (Faber, 2000). Hidrolisis enzimatik lebih banyak digunakan dari pada

hidrolisis kimiawi yang cukup mahal dan menggunakan beberapa bahan kimia

berbahaya. Hidrolisis kimiawi menggunakan banyak reagen kimia dan melewati

berbagai tahapan yang dilakukan pada suhu tinggi, yaitu 40oC (Van Santen et al,

2000). 6-APA adalah prekursor utama untuk produksi antibiotik beta laktam

semisintetik. Penisilin G asilase menyumbang 88% 6-APA dari seluruh dunia,

2

sementara sisanya diproduksi oleh penisilin V asilase (Banerjee & Debnath,

2006).

Hidrolisis penisilin G menjadi 6-APA dipengaruhi oleh beberapa faktor

diantaranya adalah konsentrasi substrat, temperatur, dan pH. Optimasi faktor-

faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim dalam menghidrolisis penisilin G juga

dilakukan untuk meningkatkan produksi 6-APA. Suhu dan pH optimal untuk

aktivitas penisilin asilase dari E. coli telah diteliti oleh Bruggink et al., (1998),

Javadpour et al., (2002) serta Sukandar & Subagjo (2005). Berdasarkan penelitian

tersebut, aktivitas optimal penisilin asilase dari E. coli dicapai pada kisaran pH

7,5-8,0 dan suhu 30-50oC. Suhu dan pH mempengaruhi sebaran muatan pada sisi

aktif enzim sedangkan suhu mempengaruhi stabilitas enzim. Kondisi optimal

hidrolisis oleh penisilin asilase dapat berbeda tergantung mikroorganisme

penghasilnya.

Berdasarkan faktor-faktor yang mempengaruhi produksi 6-APA, penelitian

ini dilakukan untuk mendapatkan kondisi optimal dari faktor-faktor tersebut.

Sehingga produksi 6-APA secara enzimatis yang dilakukan dengan berdasarkan

faktor-faktor yang telah disebutkan mendapatkan hasil yang maksimal. Produksi

6-APA dilakukan menggunakan reaktor curah (sistem batch) yang direaksikan

selama 180 menit.

1.2. Rumusan Masalah

Adapun rumusan masalah dari penelitian ini yaitu sebagai berikut :

1. Bagaimana pengaruh temperatur, pH dan konsentrasi substrat terhadap

hidrolisis penisilin G menjadi 6-APA ?

2. Berapa kadar 6-APA yang dihasilkan dari hidrolisis penisilin G dengan

kondisi temperatur, pH dan konsentrasi substrat yang optimal ?

1.3. Tujuan

Tujuan dari penelitian ini adalah melakukan biokonversi penisilin G

menjadi 6-APA secara enzimatis dalam reaktor curah (Batch) dan mengetahui

kadar 6-APA yang dihasilkan dari hasil biokonversi berdasarkan faktor-faktor

yang mempengaruhinya.

3

1.4. Manfaat

Penelitian ini bermanfaat untuk memberikan informasi mengenai pengaruh

temperatur, pH dan konsentrasi substrat pada hidrolisis penisilin G terkatalisis

penisilin asilase sehingga dapat menghasilkan produk 6-APA yang tinggi.

Informasi tersebut diharapkan dapat menjadi informasi untuk memperoleh proses

biokonversi yang efisien.

4

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Antibiotik

Antibiotik adalah obat yang berasal dari seluruh atau bagian tertentu

mikroorganisme dan digunakan untuk mengobati infeksi bakteri. Antibiotik tidak

efektif untuk melawan virus. Antibiotik selain membunuh mikroorganisme atau

menghentikan reproduksi bakteri juga membantu sistem pertahanan alami tubuh

untuk mengeleminasi bakteri tersebut (Fernandez, 2013).

Pemberian antibiotik merupakan pengobatan utama dalam penanganan

penyakit infeksi. Adapun manfaat penggunaan antibiotik tidak perlu diragukan

lagi, akan tetapi penggunaannya yang berlebihan akan segera diikuti dengan

munculnya kuman kebal antibiotik, sehingga manfaatnya akan berkurang.

Resistensi bakteri terhadap antibiotik, terlebih lagi multi drug resistance

merupakan masalah yang sulit diatasi dalam pengobatan pasien. Hal ini muncul

sebagai akibat pemakaian antibiotik yang kurang tepat, seperti dosis, macam dan

lama pemberian sehingga bakteri berubah menjadi resisten (Negara, 2014).

Antibiotik dibedakan menjadi 2 yaitu antibiotik alami dan antibiotik

semisintetik. Antibiotik semisintetik tidak hanya lebih baik dari antibiotik alami

tetapi juga dapat mengatasi masalah resistensi mikroba tehadap antibiotik. Selain

itu, antibiotik semisintetik umumnya lebih stabil, lebih mudah diabsorbsi dan

lebih sedikit efek sampingnya dibandingkan dengan antibiotik alami (Muharni,

1999). Antibiotik pertama kali ditemukan olah Alexander Flemming pada tahun

1928 yang diproduksi oleh mikroorganisme seperti bakteri dan jamur untuk

membunuh mikroorganisme lainnya. Antibiotik membunuh bakteri dengan

menghambat sintesis dinding sel bakteri. Selanjutnya pada tahun yang sama,

Alexander Flemming juga menemukan antibiotik jenis penisilin secara tidak

sengaja ketika perang dunia I dan perang dunia II (Derderian, 2007).

Salah satu dari sekian banyak antibiotik yang dibutuhkan dan digunakan

sampai saat ini adalah berasal dari golongan penisilin. Antibiotik penisilin

merupakan antibiotik dari golongan beta laktam dibedakan menjadi tiga kelompok

yaitu Penisilin G, Penisilin V dan Ampisilin (Parmar et al., 2000). Penisilin

pertama kali diterapkan untuk aplikasi klinik yaitu pada tahun 1942. Beberapa

5

kelebihan dari penisilin yaitu mempunyai spektrum yang luas, aktif terhadap

bakteri gram positif dan mempunyai toksisitas yang rendah sehingga penggunaan

penisilin G dengan dosis yang tinggi tidak menyebabkan alergi (Rachman et al.,

2016).

2.2. Penisilin G

Penisilin G (Pen-G) dikenal sebagai benzil penisilin yang merupakan

substrat dari enzim Penisilin G Asilase (PGA) untuk pengujian aktivitas enzim.

Pen-G berbentuk garam kalium atau natrium yang berupa bubuk putih sampai

sedikit kuning, tidak berbau, agak higroskopis relatif stabil di udara. Penisilin

dapat menjadi non aktif apabila terkena pengaruh panas, sistein, NaOH,

penicilinase (enzim yang terdapat dalam banyak bakteri yang dapat merusak

penisilin) dan asam hidroklorat. Zat lain yang dapat merusak Penisilin antara lain

adalah logam-logam berat seperti Cu, Ag, Fe, dan Zn (Sarah, 2002).

Pen-G merupakan suatu antibiotik yang tidak dapat diberikan melalui mulut

karena sifatnya yang tidak stabil dengan asam hidroklorat di lambung, bekerja

pada lingkup kerja yang sempit (hanya efektif pada bakteri gram positif). Bakteri

patogen yang resisten terhadap Pen-G adalah Staphylococcus, Streptococcus,

Enterococcus, Pneumococcus, B. antrachis, B. substilis, B. diptheria, Listeria

monocytogen es, Clostridia, Gonococcus dan Meningococcus (Wattimena et al.,

1991) dan juga dapat menimbulkan alergi gatal-gatal serta reaksi efek samping

yang menyebabkan penyakit (diare dan superinfeksi dari k andidiasis). Selain itu

pen-G juga sangat sensitif terhadap enzim β-laktamase yang dapat memutus

ikatan pada cincin β-laktam. Sifat dari antibiotik ini akan hilang jika cincin β-

laktam terputus karena β-laktamase, Selain itu, munculnya resistensi bakteri

terhadap antibiotik dipengaruhi oleh adanya gen resistensi yang terdapat dalam

plasmid, transposon, atau dalam kromosom bakteri (Putri, 2014).

6

Gambar 2.1. struktur kimia penisilin G

a. cincin β-laktam b. cincin thiazolidin R. rantai samping

(Arroliga dan Pien, 2003)

Variasi struktur rantai samping akan membedakan jenis penisilin satu

dengan yang lainnya dan akan mempengaruhi spektrum antibakterinya. Penisilin

alami memiliki kelemahan yaitu sifatnya yang berspektrum sempit dan peka

terhadap penisilinase (β-laktamase) (Pratiwi, 2008). Selain itu, penisilin juga

memiliki beberapa kekurangan dalam pemakaiannya, seperti munculnya gejala

alergi, waktu paruh dalam tubuh sempit, tidak tahan terhadap asam dan β-

laktamase (Sebayang, 2005). Penisilin tidak efektif terhadap bakteri gram negatif

seperti basilus, amuba, plasmodia, ricketsia, virus dan fungi (Patel, 2006).

Kelemahan yang dimiliki oleh penisilin alami sehingga dibutuhkan antibiotik

semisintetik untuk memperbaiki sifat dari penisilin alami. Penisilin semisintetik

diperoleh dengan cara mengubah struktur kimia penisilin alami atau dengan cara

sintesis dari inti penisilin, bahan dasar yang digunakan untuk pembuatan penisilin

semisintetik berupa asam 6-aminopenisilanat (6-APA). Asam 6-aminopenisilanat

(6-APA) merupakan hasil hidrolisis penisilin oleh aktivitas enzim penisilin G

asilase. Penisilin G asilase dihasilkan oleh berbagai macam mikroorganisme,

antara lain jamur dan bakteri (Kafsnochi et al., 2010).

2.3. Penisilin G Asilase

Penisilin G Asilase (PGA) ditemukan pada tahun 1960 dan digunakan

sebagai biokatalis di bidang industri. PGA adalah enzim yang dapat mengkatalisis

reaksi hidrolisis penisilin pada ikatan amida yang menghubungkan rantai samping

asil dengan inti penisilin menjadi 6-Aminopenicillanic Acid (Dolui et al., 2011), 7-

Aminodeacetoxy Cephalosprinic Acid dan dalam mengubah banyak antibiotik

semisintetik seperti ampicillin, amoxicillin, cephalexin, dan cefatoxime (Singh

7

dan Goyal, 2014). Penisilin asilase dikenal sebagai penisilin amidase, penisilin

transferase dan penisilin amidohidrolase dengan nomor golongan enzim (EC

3.5.1.11). Berdasarkan jenis substrat yang dihidrolisis, enzim ini terbagi menjadi:

(1) penisilin G asilase yaitu dengan substrat benzil penisilin; (2) penisilin V

asilase yaitu dengan substrat fenoksimetil penisilin; (3) Ampisilin asilase yaitu

dengan substrat D-α aminobenzil penisilin (ampisilin) (Parmar et al, 2000).

Penisilin asilase adalah enzim yang mengkatalis proses hidrolisis penisilin G atau

penisilin V menjadi 6-APA dan asam organik. Asam organik yang dihasilkan akan

beda – beda tergantung dari jenis penisilin yang dihidrolisis. Bila penisilin G yang

dihidrolisis maka akan dihasilkan asam fenilasetat (PAA), tetapi bila yang dihidrolisis

penisilin V maka akan dihasilkan asam fenoksi metil asetat (Rajendhran et al., 2004).

Penelitian ini dilakukan untuk menghidrolisis penisilin G sehingga menghasilkan 6-

APA dan PAA.

Penisilin asilase adalah enzim yang diproduksi oleh beberapa bakteri dan

jamur. Enzim ini dapat dihasilkan oleh E. coli secara intraselular. Pada gram

positif enzim ini dapat dihasillkan oleh B. megaterium dan Micrococcus roseus,

PGA ini dihasilkan secara ekstraselular. Aplikasi bioteknologi dari penisilin

asilase muncul sebagai alternatif untuk pembuatan antibiotik β-laktam, peptida

kecil dan isomer murni dari campuran rasemat. Namun, penisilin asilase terlibat

terutama dalam industri produksi penisilin semisintesik (Nandi et al., 2014).

Meskipun peran metaboliknya tidak sepenuhnya dipahami, enzim ini secara

luas digunakan untuk produksi 6-APA. Alasan utama adalah bahwa dapat

mengkatalisis hidrolisis Penicillin G dalam hal ini senyawa dan asam fenilasetat.

Enzim ini juga bisa digunakan untuk mengkatalisis reaksi kebalikan dan sintesis

ikatan amida (Nandi et al., 2014). Pada tahun 1950, Sakaguchi dan Murao

menemukan bahwa PGA mampu menghidrolisis rantai samping asam fenil asetat

dari penisilin G. Selanjutnya ditemukan bahwa enzim pensilin asilase ada di mana

– mana pada bakteri, ragi, jamur dan actinomycetes.

PGA berhasil diindustrialisasi pada awal 1990-an untuk rantai samping

hidrolisis penisilin G setelah banyak upaya untuk mengoptimalkan produksi

enzim dan pengembangan proses untuk penghapusan enzim difasilitasi oleh

adopsi strategi imobilisasi enzim dan penggunaan kembali (Door and Fuerst,

2018). Penisilin asilase dapat mengkatalis reaksi bolak – balik dalam

8

menghidrolisis penisilin G, sehingga bila ada campuran asam fenilasetat dan asam

6-APA serta penisilin asilase maka akan terjadi reaksi pembentukan penisilin G

(Chandel et al., 2007).

2.4. 6-Aminopenicilanic Acid (6-APA)

6-Aminopenicilanic Acid (6-APA) dalam industri farmasi digunakan sebagai

produk antara yang sangat penting, terutama sebagai prekursor dalam produksi

antibiotik β-laktam semisintesik seperti ampisilin, amoksisilin dll (Matran et al.,

2013). Senyawa 6-APA ini dapat diperoleh secara hidrolisis kimiawi, enzimatik

maupun fermentasi dari penisilin alam. Lebih dari 60% 6-APA diproduksi secara

enzimatik, karena biaya yang diperlukan dalam proses produksi relatif sedikit dan

lebih murah. Pada proses produksi secara enzimatis, 6-APA diperoleh melalui

reaksi hidrolisis penisilin dengan bantuan enzim penisilin G asilase yang dapat

diperoleh dari berbagai mikroorganisme (Mulyani, 1999).

Enzim dan sel amobil telah digunakan dalam industri farmasi untuk

menghasilkan 6-APA. Produksi 6-APA oleh hidrolisis enzimatik penisilin G

menggunakan penisilin G asilase amobil adalah proses yang ramah lingkungan,

berkelanjutan dan efisien. Dalam reaksi batch, hasil konversi enzimatik penisilin

G ke 6-APA menggunakan sistem immobilisasi sel keseluruhan adalah sekitar

75% (Arshad et al, 2007).

2.5. Biokonversi penisilin G menjadi 6-Aminopenicilanic Acid (6-APA)

6-Aminopenicilanic Acid (6-APA) merupakan prekursor untuk produksi

antibiotik β-laktam semisintetik (amoxycillin, ampicillin, dll). Asam ini dapat

diperoleh dari sintesis kimia. 6-APA juga dapat dihasilkan secara langsung

dengan fermentasi Penicillium sp. tanpa menggunakan prekursor, tetapi tingkat

konversi substrat ke produk yang dihasilkan tidak memuaskan (Matran et al.,

2013).

Sebagian besar penisilin semisintetik dihasilkan dari 6-Aminopenicillanic

Acid (6-APA), yang diproduksi secara deasilasi enzimatik atau kimia dari benzyl

penisilin alami. Metode kimia untuk menghasilkan 6-APA dapat membahayakan

lingkungan dan membutuhkan penggunaan bahan kimia berbahaya seperti

9

piridina, fosfor pentachloride, dan nitrosylchloride. Sebaliknya, konversi secara

enzimatik adalah regio dan stereo-spesifik dan kondisi reaksinya ringan.

Perbandingan ekonomi dari pembuatan 6-APA oleh proses kimia dan enzimatik

menunjukkan bahwa proses enzimatik lebih murah 9% dibandingkan dengan

proses kimia (Parmar et al, 2000).

Gambar 2.1 struktur kimia konversi penisilin G menjadi 6-APA

2.6. Mekanisme kerja antibiotik

Secara umum mekanisme kerja antibiotik terhadap bakteri adalah

menghambat sintesis dinding sel bakteri, menghambat fungsi membran plasma,

menghambat sintesis asam nukleat, menghambat sintesis protein melalui

penghambatan pada tahap translasi dan transkripsi material genetik, dan

menghambat metabolisme folat. Tempat kerja antibiotik pada dinding sel bakteri

adalah lapisan peptidoglikan. Antibiotik bekerja pada dinding sel bakteri,

sehingga kerusakan atau hilangnya lapisan ini akan menyebabkan hilangnya

kekauan dinding sel dan akan mengakibatkan kematian (Neu dan Gootz, 2001).

Penicillin G bekerja dengan mengikat pada protein spesifik yang dapat

mengikat penisilin pada bagian dalam dinding sel bakteri. Tahap awal pada kerja

antibiotik ini dimulai dari pengikatan obat pada reseptor sel bakteri yaitu pada

protein pengikat penisilin (PBPs=Penicillin-Binding Proteins). Kemudian

menghambat kerja enzim D-alanil karboksipetidase yang berperanan pada proses

cross-linking antara rantai peptidoglikan penyusun dinding sel bakteri. Struktur

10

penisilin yang mirip dengan struktur peptida D-alil-D-alanin pada ujung rantai

peptidoglikan, menyebabkan antibiotika ini dapat berikatan dengan enzim D-

alanil karboksipeptidase dan antibiotik menghambat kerja enzim tersebut pada

proses pembentukan dinding sel bakteri (Katzung, 1998). Setelah obat melekat

pada satu atau lebih reseptor maka reaksi transpeptidasi akan dihambat dan

selanjutnya sintesis peptidoglikan akan dihambat. Tahap berikutnya adalah

inaktivasi serta hilangnya inhibitor enzim-enzim autolitik pada dinding sel.

Akibatnya adalah aktivasi enzim-enzim litik yang akan menyebabkan lisis bakteri

(Neu dan Gootz, 2001).

2.7. Bakteri Resisten

Antibiotik β-laktam tidak efektif terhadap semua gram positif atau gram

mikroorganisme negatif dan mungkin secara intrinsik resisten karena (1)

Perbedaan struktural dalam enzim adalah target dari obat-obat ini atau (2) Karena

ketidakstabilan obat untuk menembus ke tempat kerjanya karena lebih kompleks

struktur permukaan. Penyebab utama perkembangan tahan terhadap penisilin

adalah produksi β-laktamase. Proses ini dikendalikan secara genetik; gen untuk

produksi penisilin berada dalam plasmid yang dapat ditransfer oleh fag dari satu

bakteri ke bakteri lain. Produksi β-laktamase sangat penting untuk Staphylococcus

yang diinduksi oleh substrat. Streptococcus tidak menghasilkan β-laktamase.

Bakteri lain yang menghasilkan β-laktamase adalah beberapa strain E.coli,

H.influenza dan B.subtillis. Mekanisme lain dari pengembangan resistensi bisa

karena ketidakmampuan obat untuk menembus situs. Ini terjadi terutama dengan

gram negatif bakteri di mana membran mikroorganisme lain membatasi penetrasi

antibiotik hidrofilik (Patel, 2006).

Pengunaan antibiotik yang tidak rasional dapat menyebabkan resistensi.

Resistensi merupakan kemampuan bakteri dalam menetralisir dan melemahkan

daya kerja antibiotik. Masalah resistensi selain berdampak pada morbiditas dan

mortalitas, juga memberi dampak negatif terhadap ekonomi dan sosial yang

sangat tinggi. Pada awalnya resistensi terjadi di tingkat rumah sakit, tetapi lambat

laun juga berkembang di lingkungan masyarakat, khususnya Streptococcus

11

pneumoniae (SP), Staphylococcus aureus, dan Escherichia coli (Peraturan

Menteri Kesehatan Republik Indonesia Nomor 2406/MENKES/PER/XII/2011).

Permasalahan resistensi bakteri juga telah menjadi masalah yang

berkembang di seluruh dunia sehingga WHO mengeluarkan pernyataan mengenai

pentingnya mengkaji faktor-faktor yang terkait dengan masalah tersebut dan

strategi untuk mengendalikan kejadian resistensi. Salah satu cara untuk

mengendalikan kejadian resistensi bakteri adalah dengan penggunaan antibiotik

secara rasional. Penggunaan obat rasional termasuk antibiotika menurut WHO

adalah pasien mendapatkan pengobatan yang sesuai dengan kebutuhan klinisnya,

dalam dosis yang sesuai dengan kebutuhannya, dalam satu kurun waktu yang

adekuat dan harga terendah baginya dan masyarakat sekitarnya (WHO, 2002).

12

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1. Waktu dan Tempat

Pelaksaan kegiatan penelitian berlangsung dari tanggal 2 Januari sampai

dengan 22 Mei 2018 yang bertempat di Laboratorium Teknologi Gen, Balai

Bioteknologi BPPT, Gedung 630 Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang

Selatan.

3.2. Alat dan Bahan

3.2.1. Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu beaker glass, tabung reaksi,

erlenmeyer, waterbath, pH meter, termometer, mikropipet (100-1000 µL dan 20-

200 µL), pipet ukur, bulp, tip (biru dan kuning), tabung ependorf, rak tabung,

spektrofotometer, kuvet, magnetik stirer, stirer bar, vortex, timbangan analitik,

tissue, alumunium foil.

3.2.2. Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu penisilin G, penisilin G

asilase, 6-Aminopenicillanic Acid (6-APA) standar, K2HPO4, KH2PO4, NaOH,

asam asetat, PDMAB (4-Dimethylamino Benzaldehyde), metanol, dan air RO

(Reserve Osmosis).

3.3. Rancangan Penelitian

Proses biokonversi dilakukan dalam reaktor batch dengan volume 20 mL.

Proses tersebut dilakukan selama 180 menit dengan rentang waktu pengambilan

sampel yaitu 10 menit. Biokonversi dilakukan dengan mempertahankan kondisi

pH 7,5 dan temperatur 37 oC. Proses biokonversi dilakukan sebanyak 3 kali

ulangan. Sebelum dilakukan proses biokonversi, terlebih dahulu melakukan

pengujian aktivitas enzim. Pengujian aktivitas enzim diberikan perlakuan optimasi

suhu, pH dan konsentrasi larutan uji. Masing-masing perlakuan dilakukan

sebanyak 3 kali ulangan.

13

Tabel 3.1. Rancangan Penelitian

Faktor uji Optimasi Ulangan

Suhu 28 oC, 32

oC, 35

oC, 37

oC, 39

oC, 42

oC,

50 oC, dan 60

oC.

3x

pH pH 6, pH 6,6, pH 7, pH 7,6 dan pH 8 3x

Konsentrasi Substrat 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %

dan 10 %

3x

3.4. Metode Kerja

3.4.1. Pembuatan Larutan Stok

3.4.1.1. Buffer Potasiium Fosfat 0,1 M

Larutan buffer potasium fosfat dengan konsentrasi 7 % dan pH 7,5

digunakan sebagai pelarut dari penisilin G yang akan dikonversi menjadi 6-APA.

Langkah kerja yang dilakukan dalam pembuatan buffer adalah membuat larutan

K2HPO4 500 mL dan larutan KH2PO4 100 mL dalam air RO (Reserve Osmosis).

Masing-masing ditimbang sebanyak 8,709 gram dan 1,361 gram. Kedua larutan

tersebut dibuat dengan konsentrasi 0,1 M. Selanjutnya kedua larutan tersebut

dihomogenkan dengan komposisi K2HPO4 sebanyak 80,2 mL dan KH2PO4

sebanyak 19,8 mL dengan pH 7,5.

3.4.1.2. Larutan Stop Reaksi

Stop reaksi terdiri dari campuran 2 larutan yang berbeda yaitu larutan

asam asetat 20 % dan larutan NaOH 0,05 M. Larutan asam asetat dibuat sebanyak

100 mL yaitu dengan mencampurkan air RO dan asam asetat glasial 100 %

masing-masing 80 mL dan 20 mL dengan perbandingan 2:1. Dalam pembuatan

larutan asam asetat ditambahkan air terlebih dahulu kemudian ditambahkan asam

asetat, lalu dihomogenkan. NaOH dibuat dengan konsentrasi 0,05 M dalam 100

mL air, NaOH ditimbang sebanyak 0,2 gram, kemudian homogenkan hingga larut.

3.4.1.3. Larutan PDMAB (4-Dimethylamino Benzaldehyde)

Pembuatan larutan PDMAB dengan konsentrasi 0,5 % sebanyak 10 mL.

Serbuk PDMAB ditimbang sebanyak 0,5 gram, kemudian dilarutkan ke dalam

14

metanol sebanyak 100 mL. Larutan PDMAB merupakan larutan pewarna yang

digunakan dalam proses pembacaan hasil menggunakan spektrofotometer.

3.4.1.4. Larutan Stok 6-APA

Pembuatan larutan stok 6-APA digunakan sebagai standar untuk analisa

hasil yang didapatkan. Larutan dibuat dengan konsentrasi 500 ppm. 6-APA

sebanyak 0,0025 gram dilarutkan dalam 5 mL larutan buffer fosfat 0,1 M pH 7,5.

3.4.2. Pembuatan Kurva Standar 6- APA

Larutan stok 6-APA 500 ppm diencerkan dengan variasi konsentrasi 20

ppm, 40 ppm, 75 ppm, 100 ppm, dan 150 ppm. Dari masing-masing 6-APA

dengan konsentrasi yang bervariasi tersebut diambil sebanyak 140 µL, 280 µL,

525 µL, 700 µL dan 1050 µL 6-APA ditambah larutan stop reaksi hingga volume

akhir menjadi 3500 µL.

3.4.3. Pengujian Aktivitas Enzim Penisilin Asilase

Pengujian aktivitas enzim dimulai dengan pembuatan larutan penisilin G 2

% sebanyak 2 mL (penisilin G ditimbang sebanyak 0,1 gram). Larutan tersebut

dikondisikan di dalam shaker waterbath selama 5 menit, kemudian ditambahkan

enzim penisilin G asilase sebanyak 0,05 gram. Shake dengan kecepatan 100 rpm,

pada suhu 37 oC selama 5 menit. Sambil menunggu 5 menit, ke dalam tabung

ditambahkan larutan stop reaksi sebanyak 500 µL. Setelah 5 menit kemudian

sampling sebanyak 500 µL dan ditambahkan ke dalam larutan stop reaksi (larutan

1). Larutan 1 didilusi sebanyak 50 kali, dengan cara larutan 1 diambil sebanyak

140 µL kemudian ditambahkan ke dalam larutan stop reaksi sebanyak 3360 µL.

Selanjutnya ditambahkan larutan PDMAB sebanyak 500 µL untuk dianalisis

menggunakan spektrofotometer.

Hasil pembacaan selanjutnya dikonversikan ke dalam persamaan linear

standar 6-APA dengan rumus:

Aktivitas enzim PGA =

Dimana, [6-APA] adalah konsentrasi 6-APA yang dihasilkan, BM adalah

berat molekul pen-G (216,255), V adalah volume larutan. Satu unit aktivitas

15

enzim dapat didefinisikan sebagai jumlah enzim yang mengkatalisis hidrolisis

penisilin G untuk menghasilkan 1 μmol asam 6-Aminopenicillanic Acid dalam 1

menit kondisi tertentu (Bahman et al., 2013).

3.4.4. Biokonversi Penisilin G Menjadi 6-APA

Proses biokonversi penisilin G (PenG) menjadi 6-APA dimulai dengan

membuat larutan penisilin G 7 % dalam 10 mL buffer potasium fosfat, kemudian

enzim penisilin asilase ditambahkan ke dalam larutan PenG sebanyak 0,5 %.

Larutan tersebut direaksikan menggunakan stirer di dalam waterbath, suhu dan

pH dijaga agar tetap konstan yaitu pada suhu 37 oC dan pH 7,5.

Pengambilan sampel dilakukan pada rentang waktu 10 menit untuk setiap

pengambilan sampel, sampel diambil hingga menit ke 180 menit. Pada menit ke

180 sampel diambil sebanyak 500 µL dan ditambah 500 µL larutan stop reaksi.

Selanjutnya dilakukan pengenceran sebanyak 50 kali yaitu dengan mengambil

140 µL dari larutan sebelumnya kemudian ditambahkan larutan stop reaksi

sebanyak 3360 µL. Selanjutnya ditambahkan larutan PDMAB sebanyak 500 µL

untuk dianalisis menggunakan spektrofotometer.

3.4.5. Analisis Spektrofotometer

Sampel yang sudah diencerkan kemudian dilakukan pembacaan

menggunakan spektrofotometer. Sebelum melakukan pembacaan sampel terlebih

dahulu melakukan pembacaan kurva standar 6-APA. Sebagai kontrol (blanko)

adalah campuran laruutan stop reaksi dan PDMAB. Semua variasi konsentrasi 6-

APA dimasukkan ke dalam kuvet sebanyak ±3500 µL. Selanjutnya dilakukan

pembacaan untuk pengujian aktivitas enzim, dilakukan dengan cara yang sama

dengan pembuatan kurva standar yaitu menambahkan larutan sebanyak ±3500 µL

ke dalam kuvet. Kemudian dilakukan pembacaan hasil biokonversi penisilin G

menjadi 6-APA.

16

3.5. Analisa Data

Data yang didapatkan dari penelitian disajikan dengan grafik dan Tabel,

selanjutnya data yang didapatkan dianalisa secara deskriptif. Hasil yang diperoleh

merupakan data yang diolah menggunakan microsoft excel.

17

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim

Berikut adalah hasil analisis yang digunakan dalam penelitian ini untuk

melihat pengaruh dari beberapa faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim

penisilin G asilase. Beberapa faktor yang dapat mempengaruhi aktivitas enzim

diantaranya adalah sebagai berikut:

4.1.1 Temperatur

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan didapatkan bahwa Aktivitas

enzim pada awal terjadinya reaksi dengan temperatur 28 oC yaitu sebesar 38,593

unit/gram. Sebelum mencapai kondisi optimum, aktivitas enzim terus mengalami

kenaikan hingga mencapai kondisi optimum. Kondisi suhu optimum enzim

penisilin asilase adalah pada suhu 42 oC dengan aktivitas enzim sebesar 86,020

unit/gram. Artinya bahwa 1 gram enzim PGA dapat menghasilkan 6-APA sebesar

86,020 µmol per menit pada kondisi yang ditentukan. Setelah mencapai kondisi

optimum aktivitas enzim kemudian mengalami penurunan jumlah aktivitasnya

pada suhu 50 oC yaitu sebesar 59,170 unit/gram.

Grafik 4.1 Aktivitas enzim pada berbagai suhu

Meskipun kondisi suhu optimum enzim ini sebesar 42 oC tetapi suhu yang

digunakan pada tahapan selanjutnya suhu yang digunakan yaitu 37 oC. Karena

18

pada suhu yang tinggi laju denaturasi enzim semakin cepat sehingga enzim

menjadi tidak aktif. Dengan pertimbangan tersebut maka pada proses biokonversi

selanjutnya digunakan suhu 37 oC.

Penelitian yang dilakukan oleh Abedi et al, (2004) menyatakan bahwa suhu

optimal aktivitas enzim ditunjukkan pada suhu 25 – 30 oC. Enzim yang digunakan

dalam penelitian ini yaitu enzim penisilin G asilase amobil. Oleh karena itu faktor

lingkungan merupakan faktor penting yang mempengaruhi aktivitas enzim.

Penelitian yang dilakukan oleh Mulyani (1999), suhu optimum penisilin asilase

yaitu 55oC. Enzim yang digunakan yaitu enzim amobil yang telah diimobilisasi

dari isolat bakteri Eschericia coli B-130. Menurut Wang et al., (2010), suhu

optimal konformasi enzim berada dalam keadaan paling sesuai berikatan dengan

substrat sehingga enzim lebih aktif dalam mengkatalisis reaksi.

Hal ini disebabkan kenaikan temperatur akan berpengaruh terhadap ikatan

hidrogen, sehingga akan terjadi pembukaan ikatan non kovalen pada struktur

kwarterner menjadi struktur tersier. Hal tersebut akan menyebabkan perubahan

konformasi enzim terutama pada residu asam amino yang berfungsi untuk

mengikat substrat sehingga akan menurunkan aktivitas enzim penisilin asilase

tersebut (Mulyani, 1999).

Suhu berpengaruh terhadap energi kinetik enzim, dimana pada suatu titik

yang disebut titik optimal, suhu akan menaikkan kecepatan reaksi. Pada suhu

yang rendah, reaksi akan berjalan lambat karena energi kinetik yang diperoleh

oleh molekul enzim dengan substrat untuk melakukan benturan kecil, sedangkan

pada suhu yang terlalu tinggi, akan menyebabkan proses denaturasi yang dapat

merusak bagian aktif enzim, sehingga konsentrasi efektif enzim menjadi

berkurang dan kecepatan reaksinya menurun (Poedjiadi, 1994).

Secara umum, setiap peningkatan sebesar 10 °C di atas suhu minimum,

aktivitas enzim akan meningkat sebanyak dua kali lipat. Aktivitas enzim

meningkat pada kecepatan ini hingga mencapai kondisi optimum. Peningkatan

suhu yang melebihi suhu optimumnya menyebabkan lemahnya ikatan di dalam

enzim secara struktural (Pratiwi, 2008). Pada suhu maksimum enzim akan

terdenaturasi karena struktur protein terbuka dan gugus non polar yang berada di

dalam molekul menjadi terbuka keluar, kelarutan protein di dalam air yang polar

19

menjadi turun, sehingga aktivitas enzim juga akan turun (Lehninger, 2005).

Aktivitas enzim sangat dipengaruhi oleh suhu. Suhu optimal enzim antara 35 ºC –

50 ºC, pada suhu di atas dan di bawah optimalnya, aktivitas enzim berkurang

karena enzim secara bertahap menjadi inaktif akibat protein terdenaturasi.

4.1.2 Konsentrasi Substrat

Aktivitas enzim dilakukan dengan berbagai konsentrasi penisilin G dan

didapatkan bahwa pada konsentrasi 7 %, penisilin G asilase memiliki aktivitas

tertinggi yaitu sekitar 37,584 unit/gram. Hal ini berarti bahwa 1 gram enzim PGA

dapat mendenaturasi senyawa penisilin G menjadi 6-APA sebesar 37,584 µmol

per menit. Hasil tersebut terjadi pada kondisi konsentrasi 6-APA sebesar 829 ppm.

Pada konsentrasi 2 % - 7 % aktivitas enzim semakin meningkat hingga mencapai

konsentrasi optimum, kemudian pada konsentrasi 8 % mengalami penurunan.

Grafik 4.2. Aktivitas enzim dengan perlakuan konsentrasi Penisilin G

Menurut Liao et al., (1999), menyatakan bahwa semakin tinggi konsentrasi

penisilin G, aktivitas enzim relatif menurun. Karena penisilin G memiliki sifat

menghambat enzim penisilin asilase, sehingga aktivitas enzim penisilin aslase

tidak terlalu tinggi. Pertambahan konsentrasi substrat akan menaikkan kecepatan

reaksi, hingga pada batas konsentrasi tertentu, dimana penambahan substrat tidak

menaikkan kecepatan reaksi. Substrat yang berlebih dapat mengakibatkan inhibisi

20

substrat, sehingga aktivitas enzim menurun atau sebagian substrat tidak

membentuk kompleks dengan enzim (Poedjiadi, 1994).

4.1.3 pH

Aktivitas enzim dengan berbagai perlakuan pH buffer yang digunakan

menghasilkan tingkat keasaman optimum pada pH 7,6. Aktivitas enzim pada pH

tersebut adalah 30,331 unit/gram dengan konsentrasi 6-APA sebesar 682 ppm.

Hal ini berarti bahwa 1 gram enzim PGA dapat mendegradasi senyawa penisilin G

menjadi 6-APA sebesar 30,331 µmol per menit. Satu unit aktivitas enzim dapat

didefinisikan sebagai jumlah enzim yang mengkatalisis hidrolisis penisilin G

untuk menghasilkan 1 μmol asam 6-Aminopenicillanic Acid dalam 1 menit di

bawah kondisi pengujian yaitu pengaruh pH buffer yang digunakan (Bahman et

al, 2013). Pengujian aktivitas enzim menggunakan berbagai pH pada larutan

buffer fosfat digunakan untuk melihat kondisi pH yang optimum untuk produksi

6-APA. Pengaruh pH adalah pada bentuk struktur ion enzim yang dapat berbentuk

ion positif, ion negatif atau ion bermuatan ganda (zwitter ion) (Poedjiadi, 1994).

Grafik 4.3. Aktivitas enzim dengan perlakuan pH buffer

Penelitian yang dilakukan oleh Abedi (2004), menunjukkan hasil optimasi

pH yang digunakan memperoleh kondisi optimum pada pH sekitar 5,5-6,5.

Perubahan pH sangat mempengaruhi aktivitas enzim karena pH dalam larutan

menunjukkan jumlah ion H+ yang ada dalam larutan. Sehingga perubahan pH

21

sangat mempengaruhi muatan pada enzim maupun substrat. Perubahan pH pada

enzim sangat mempengaruhi pusat aktif enzim yang terdiri dari asam-asam amino.

pH mempengaruhi sebaran muatan pada sisi aktif enzim. Kondisi optimal

hidrolisis oleh penisilin asilase dapat berbeda tergantung mikroorganisme

penghasilnya. Perubahan muatan listrik dapat mengakibatkan perubahan

konformasi maupun perubahan muatan pada residu asam amino yang berfungsi

sebagai pengikat substrat (Mulyani, 1999).

Penurunan aktivitas enzim ini karena konformasi enzim tidak berikatan

dengan konformasi substrat yang disebabkan oleh pH yang terlalu tinggi sehingga

enzim terdenaturasi. Hubungan aktivitas enzim dengan pH (konsentrasi ion

hidrogen) mencerminkan keseimbangan antara denaturasi enzim pada pH yang

terlalu tinggi atau rendah dan efek pada keadaan muatan dari enzim, substrat atau

keduanya (Murray, 2009). Uji aktivitas penisilin G asilase dari E. coli B130 hasil

PCR mutagenik pernah dilakukan oleh Megahati (2001), hasil penelitiannya

menunjukan bahwa pada klon mutagenik menghasilkan enzim dengan aktivitas

tertinggi pada pH 7,5. pH lingkungan enzim yang bersifat basa akan

menyebabkan peningkatan konsentrasi OH- dilingkungan enzim. OH

- akan

membentuk ikatan dengan ion H+ yang terdapat pada gugus karboksil dari asam

amino, aktif pada kisaran pH yang relatif menyebabkan asam amino bermuatan

negatif ini akan menyebabkan perubahan struktur tersier enzim yang selanjutnya

menyebabkan perubahan pada struktur enzim dalam mengkatalisis substratnya.

Setiap enzim mempunyai karakteristik pH optimum dan enzim tersebut aktif pada

kisaran pH yang relatif (Soeka, 2009).

4.2 Biokonversi Penisilin G menjadi 6-Aminopenicillanic Acid (6-APA)

Proses biokonversi yang dilakukan sebanyak 3 kali ulangan dengan

konsentrasi penisilin G sebanyak 7 %, temperatur reaksi yang digunakan yaitu 37

oC dan pH larutan 7,5. Kondisi yang digunakan pada proses biokonversi ini

berdasarkan pada hasil pengujian aktivitas enzim dengan ketiga faktor tersebut.

Hasil uji aktivitas terhadap pengaruh konsentrasi substrat didapatkan konsentrasi

substrat sebesar 7 %. Temperatur yang didapatkan dari hasil uji aktivitas yaitu 42

oC, namun pada proses biokonversi dilakukan pada kondisi suhu 37

oC. Suhu ini

22

digunakan karena pada suhu 42 oC kondisinya terlalu panas sehingga enzim yang

digunakan akan mengalami denaturasi. Kondisi pH yang digunakan pada proses

biokonversi yaitu 7,5, sedangkan pada tahap pengujian aktivitas pH optimum

yang didapatkan yaitu 7,6. Ini dianggap sama karena pada proses pengujian

aktivitas tidak menggunakan pH 7,5 melainkan pH 7,6, dari hal ini tidak akan

berbeda nyata antara pH 7,6 dan pH 7,5.

Grafik 4.4 Jumlah penisilin G terkonversi

Konversi tersebut dilakukan dengan sistem batch yang direaksikan selama

180 menit dengan rentang waktu pengambilan sampel 10 menit (grafik 4.4).

Penisilin G yang terkonversi pada waktu pengambilan sampel pertama yaitu pada

waktu 10 menit yaitu sebesar 8,885% dengan konsetrasi 6-APA yang terbentuk

yaitu 0,3720 mol. Pada menit berikutnya yaitu 20 hingga 80 menit besar penisilin

G yang terkonversi semakin meningkat hingga mencapai 78,177% dengan

konsentrasi 6-APA yang terbentuk yaitu 3,2730 mol. Selanjutnya pada menit

berikutnya yaitu 90 menit mengalami penurunan hasil biokonversi yaitu 44,684%

dengan konsentrasi 6-APA yang terbentuk yaitu 1,8707 mol. Selanjutnya

mengalami peningkatan hingga menit ke 180 menit yaitu dengan jumlah penisilin

G yang terkonversi yaitu 71,615% dan konsentrasi 6-APA yang terbentuk yaitu

2,9982 mol.

23

Grafik 4.5 penisilin G yang terkonversi

Proses biokonversi penisilin G berbanding lurus dengan jumlah konsentrasi

6-APA yang terbentuk. Hal ini sesuai dengan penelitian yang telah dilakukan

bahwa semakin tinggi jumlah penisilin G yang terkonversi maka jumlah 6-APA

yang terbentuk semakin meningkat. Dapat dilihat pada (grafik 4.4 dan 4.5).

Semakin tinggi jumlah 6-APA yang terbentuk maka semakin sedikit jumlah

penisilin G yang tersisa, sehingga penisilin G yang terbuang akan lebih sedikit

dan penggunaan bahan yang lebih efisien.

Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Cao et al (2004), bahwa hasil

konversi penisilin G menjadi 6-APA adalah 0,963 yang direaksikan selama 40

menit. Rasio konversi yang tinggi dalam waktu yang singkat mungkin disebabkan

oleh aktivitas enzim yang tinggi. Penelitian yang dilakukan oleh Miao et al,

(2010), didapatkan hasil pada konsentrasi yang lebih rendah dari substrat,

menghasilkan 95,4% 6-APA dan 94,8% PAA. Konversi dari penicillin G adalah

95% atau lebih. Penisilin asilase dapat mempengaruhi waktu kesetimbangan

reaksi, dan juga mempengaruhi hasil konversi penicillin G dalam skala kecil.

24

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Hidrolisis penisilin G dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu temperatur,

pH dan konsentrasi substrat. Produksi 6-APA optimum pada temperatur 42 oC,

konsentrasi penisilin G 7 % dan pH 7,6. Penisilin G mampu dikonversi

menggunakan enzim penisilin G asilase dengan jumlah penislin G yang

terkonversi sebesar 71,615 % dan konsentrasi 6-APA yang terbentuk yaitu 2,9982

mol.

5.2 Saran

Adapun saran yang harus dilakukan pada penelitian berikutnya yaitu perlu

dilakukan proses biokonversi lebih lanjut dengan optimasi waktu reaksi untuk

memastikan peroses biokonversi akan terus meningkat atau tidak dan diharapkan

dapat dilakukan dalam skala industri untuk memenuhi kebutuhan bahan baku obat

di Indonesia.

25

DAFTAR PUSTAKA

Abedi, D., Fazeli, M.R., dan Jafarian, A. 2004. Optimization of Enzimatic

Synthesis of Ampicillin Using Cross-Linked Aggregates of Penicillin G

Acylase. Iranian Journal of Pharmaceutical Research. 3: 159-164. Iran.

Arshad, R., Farooq, S., dan Ali, S.S. 2007. 6-Aminopenicillanic Acid Production

by Intact Cells of E. coli Containing Penicillin G Acylase (PGA).

Pakistan Journal of Biological Sciences. 10(18). 3190-3194. ISSN 1028-

8880. Pakistan.

Banerjee, S., dan Debnath, M. 2006. Kinetic Parameter Studies of 6-Amino

Penicillanic Acid (6-APA) Production by Agarose Immobillized

Penicillin Acylase In a Packed Column Reactor. Proceedings of the 1st

International Conference on Natural Resources Engineering &

Technology; Putrajaya, Malaysia, 237-242. India.

Bruggink, A., Roos, E.C. dan de Vroom, E., 1998, Organic Process Research &

Development, 2, 128-133, Chemferm, DSM Research, Gist-brocades,

Netherland.

Cao, X.J., Wu, X.Y., Luis, P.F., Joaquim, M.S.C., dan Marcos, J.C. 2004.

Production of 6-Aminopenicillanic Acid in Aqueous Two-Phase System

by Recombinant Escherichia coli with Intracellular Penicillin Acylase.

China.

Chandel A.K, L. Venkateswar Rao, M. Lakshmi Narasu, Om V. Singh. 2008. The

realm of penicillin G acylase in lactam antibiotics. Enzyme and

Microbial Technology. 42 : 199–207.

Derderian, Stacie L. 2007. Alexander Fleming's Miraculous Discovery Of

Penicillin. Academic Journal. 3(2). ISSN 1559-9388.

Desriyati., Fifendy, Mades., Siregar, RRP Megahati. 2012. Pegaruh pH Terhadap

Aktivitas Penisilin G Aslase yang dihasilkan Isolat Bakteri dari Air

Batang Kurao Kota Padang.

Dolui, A.K., Sahana, S., Kumar, A. 2011. Studi on Production of 6-

Aminopenicillanic Acid by Free and κ- Carrageenan Immobilized Soil

26

Bacteria. Indian Journal of Pharmaceutical Education and Research.

46(1). 70-74. India.

Door, B.M., and Fuerst D.E. 2018. Enzymatic Amidation for Industrial

Applications. Current Opinion in Chemical Biology. 43: 127-133.

Fernandez,Beatrix Anna Maria. 2013. Studi Penggunaan Antibiotik Tanpa Resep

di Kabupaten Manggarai dan Manggarai Barat – NTT. Jurnal Ilmiah

Mahasiswa Universitas Surabaya. Vol. 2 No. 2.

Kafshnochi, M., Farajnia, S., Aboshof, R., Babaei, H. and Aminolroayaee, M.

2010. “Cloning and over-expression of Penicillin G acylase in E. coli

BL21”. African Journal of Biotechnology, 9 (18): 2697-2701.

Lehninger, A.L. 2005. Dasar-Dasar Biokimia. Erlangga. Jakarta.

Liao, L.C., Ho, C.S., Wu, W.T. 1999. Bioconversion With Whole Cell Penicillin

Acylase in Aqueous Two-Phase Systems. Process Biochemistry.

Elsevier. 34. 417-420. Taiwan.

Matran, R.M., Galaction, A.I., Blaga, A.C., Turnea, M., dan Cascaval. 2013.

Green Technology for 6-Aminopenicillanic Acid Production – Study of

Penicillin G Hydrolysis in A Bioreactor with Mobile Bed of Immobilized

Penicillin Amidase Under Substrate Inhibition. Environmental

Engeneering and Management Journal. 12(11). 2261-2266. Romania.

Megahati, RRP. 2001. Deteksi Mutasi Gen PGA Dari E. coli B130 Hasil PCR

Mutagenik Dengan Mengunakan Metode Single Strand Conformation

Polymorphism (SSCP). Prodi Biologi Pasca Sarjana ITB : Bandung.

Miao, S., Chen, J., Cao, Xuejun. 2010. Preparation of A Novel Thermo-Sensitive

Copolymer Forming Recyclable Aqueous Two-Phase Systems and Its

Application In Bioconversion of Penicillin G. Elsevier. 75. 156-164.

China.

Muharni. 1999. Seleksi Klon Gen Penisilin G Asilase dengan menggunakan

Bakteri Serratia marcescens. Jurnal Penelitian Sains. 26-31. ISSN 1410-

7058.

Mulyani, Nies Suci. 1999. Karakterisasi Enzim Penisilin Asilase dari Eschericia

coli B-130. Jurnal Kimia Sains dan Aplikasi. 2(2): 48-53.

Murray, R. K. 2009. Biokimia Harper. Buku Kedokteran EGC: Jakarta

27

Nandi, A., Pan, S., Potumarthi, R., Danquah, M.K., Sarethy, I.P. 2014. A Proposal

for Six Sigma Integration for Large-Scale Production of Penicillin G and

Subsequent Conversion to 6-APA. Journal of Analytical Methods in

Chemistry. India.

Nawfa, Refdinal. 2005. Formation of Benzyl Penicillyn Using Intermediate

Compounds Outside More Permeable Cells of Penicillium Chrysogenum

ATCC 26818. Majalah IPTEK 16(3). Surabaya.

Negara, Ketut Surya. 2014. Analisis Implementasi Kebijakan Penggunaan

Antibiotika Rasional untuk Mencegah Resistensi Antibiotika di RSUP

Sanglah Denpasar: Studi Kasus Infeksi Methicillin Resistant

Staphylococcus Aureus.

Neu HC, Gootz TD. 2001. Antimicrobial chemotherapy. Medmicro.

Parmar, A., Kumar, H., Marwaha, S.S., Kennedy, J.F. 2000. Advances in

Enzymatic Transformation of Penicillins to 6-Aminopenicillanic Acid (6-

APA). Jurnal Biotechnology Advances. 8 : 289-301. India.

Patel, Rashmin N. 2006. Semisynthetic Penicillins. Department of Pharmacology

S.K. Patel College of Pharmaceutical Education And Rsearch. Kherva,

North Gujarat.

Pratiwi, S. T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Universitas Gadjah Mada: Jakarta.

Putri, Fentri Paramitha. 2014. Optimasi Produksi Penisilin Asilase (PAc)

Menggunakan B megatirium MS941 Rekobinan yang Mengandung Gen

pac dari B thuringiensis BGSC BD1 dengan Metode Respon Permukaan.

Institut Pertanian Bogor. Bogor.

Rachman, S.D., Safari, A., Fazli., Kamara, D.S., Sidik, A., Udin, L.Z., Ishmayana,

S. 2016. Produksi Penisilin Oleh Penicillium chrysogenum L112 dengan

Variasi Kecepatan Agitasi pada Fermentor 1 L. Kartika Jurnal Ilmiah

Farmasi. 4(2). 1-6. p-ISSN 2354-6565/e-ISSN 2502-3438. Bandung.

Sarah M. 2002. Parameter Katabolik Untuk Pembuatan Penisilin G. Universitas

Sumatera Utara. Medan.

Soeka, S. Y. 2009. Kondisi Optimum Produksi Kitinase dari Aktinomisetes

dengan Karakterisasi pH dan Suhu Enzim. Bidang Mikrobiologi.

Cibinong.

28

Sukandar, U., dan Subagjo, Konversi Penisilin G menjadi Asam6-

Aminopenisilanat (6-APA) dengan Enzim Penisilin Asilase dalam

Bioreaktor Curah. Departemen Teknik Kimia, Fakultas Teknologi

Industri, Institut Teknologi Bandung, Bandung.

Wattimena JR, Sugiarso NC, Widianto NB, Sukandar EY, Soemardji. 1991.

Farmakodinamik dan Terapi Antibiotik. UGM Pr. Yogyakarta.

World Health Organization. (2002). Promoting Rational Use of Medicine.

Geneva: Core Components.

29

Lampiran Lampiran 1. Pembuatan Kura Standar 6-APA

Tabel 1. Hasil standar 6-APA

No standar ppm abs

1

6-APA

0 0

2 20 0,067

3 40 0,141

4 75 0,255

5 100 0,341

6 150 0,502

Gambar 1. Grafik kurva standar 6-APA

30

Lampiran 2. Faktor-faktor yang menpengaruhi Aktivitas enzim

Tabel 2. Pengaruh Temperatur

no. sampel pengenceran abs ppm rata-rata ppm

berat enzim

(g)

volume (mL)

aktivitas enzim

(unit/g)

rata-rata

1 T28 10

0,409 856 851

0,102 5 38,825 38,593

2 0,405 846 0,102 5 38,360

3 T32 10

0,424 895 940

0,104 5 39,789 41,784

4 0,459 985 0,104 5 43,779

5 T35 10

0,49 1064 1058

0,103 5 47,773 47,485

6 0,485 1051 0,103 5 47,197

7 T37 10

0,593 1328 1396

0,104 5 59,056 62,077

8 0,646 1464 0,104 5 65,099

9 T39 10

0,638 1444 1476

0,103 5 64,810 66,249

10 0,663 1508 0,103 5 67,688

11 T42 10

0,716 1644 1897

0,102 5 74,512 86,020

12 0,914 2151 0,102 5 97,528

11 T50 10

0,599 1344 1331

0,104 5 59,740 59,170

12 0,589 1318 0,104 5 58,600

11 T60 10

0,599 1344 1451

0,104 5 59,740 64,529

12 0,683 1559 0,104 5 69,317

Tabel 3. Pengaruh pH

no. sampel pengenceran abs ppm rata-rata ppm

berat enzim

(g)

volume (mL)

aktivitas enzim

(unit/g)

rata-rata

1 buffer pH 6

10 0,257 470

454 0,102 5 21,307

20,572 2 0,245 438 0,102 5 19,837

3 buffer pH 6,6

10 0,328 662

551 0,104 5 29,430

24,503 4 0,246 440 0,104 5 19,576

5 buffer pH 7

10 0,274 516

585 0,104 5 22,941

26,005 6 0,325 654 0,104 5 29,069

7 buffer pH 7,6

10 0,32 640

682 0,104 5 28,468

30,331 8 0,351 724 0,104 5 32,194

9 buffer pH 8

10 0,297 436

489 0,103 5 19,586

21,945 10 0,359 541 0,103 5 24,304

31

Tabel 4. Pengaruh konsentrasi substrat

no. sampel pengenceran abs ppm rata-rata ppm

berat enzim

(g)

volume (mL)

aktivitas enzim

(unit/g)

rata-rata

1 2% 10

0,133 192 194

0,203 10 8,744 8,854

2 0,136 197 0,203 10 8,965

3 3% 10

0,204 306 312

0,204 10 13,893 14,149

4 0,211 318 0,204 10 14,405

5 4% 10

0,239 363 361

0,205 10 16,372 16,299

6 0,237 360 0,205 10 16,226

7 5% 10

0,331 511 521

0,203 10 23,294 23,734

8 0,343 531 0,203 10 24,175

9 6% 10

0,370 574 569

0,204 10 26,031 25,775

10 0,363 563 0,204 10 25,519

11 7% 10

0,486 761 829

0,204 10 34,513 37,584

12 0,570 897 0,204 10 40,655

11 8% 10

0,357 553 573

0,203 10 25,204 26,086

12 0,381 592 0,203 10 26,968

11 9% 10

0,418 652 685

0,203 10 29,686 31,230

12 0,460 719 0,203 10 32,773

11 10% 10

0,457 715 749

0,203 10 32,552 34,132

12 0,500 784 0,203 10 35,712

Lampiran 3. Tabel hasil biokonversi penisilin G menjadi 6-APA

No sampel Pengenceran abs ppm rata-

rata

berat

enzim

(g)

volume

(mL)

aktivitas

enzim rata-rata

t0

1

t 10

50 0,27

6 4022

4066

0,102

3 20 3636,107

3675,991

2 50 0,28

2 4110

0,102

3 20 3715,875

3

t 20

50 0,47

0 6875

6949

0,102

3 20 6215,283

6281,757

4 50 0,48

0 7022

0,102

3 20 6348,230

5

t 30

50 0,64

2 9404

9581

0,102

3 20 8501,975

8661,512

6 50 0,66

6 9757

0,102

3 20 8821,049

7

t 40

50 0,76

4 11199

1120

6

0,102

3 20

10123,93

2 10130,57

9 8 50

0,76

5 11213

0,102

3 20

10137,22

6

32

9

t 50

50 0,89

6 13140

1306

6

0,102

3 20

11878,83

5 11812,36

1 10 50

0,88

6 12993

0,102

3 20

11745,88

8

11

t 60

50 1,02

8 15081

1460

3

0,102

3 20

13633,73

8 13201,66

0 12 50

0,96

3 14125

0,102

3 20

12769,58

1

13

t 70

50 1,12

1 16449

1680

9

0,102

3 20

14870,14

8 15195,86

8 14 50

1,17

0 17169

0,102

3 20

15521,58

9

17

t 90

50 1,37

8 20228

1997

1

0,102

3 20

18286,89

1 18054,23

4 18 50

1,34

3 19713

0,102

3 20

17821,57

6

19

t 100

50 1,51

6 22257

2207

4

0,102

3 20

20121,56

3 19955,37

9 20 50

1,49

1 21890

0,102

3 20

19789,19

5

21

t 110

50 1,48

8 21846

2225

0

0,102

3 20

19749,31

1 20114,91

6 22 50

1,54

3 22654

0,102

3 20

20480,52

1

23

t 120

50 1,56

1 22919

2314

0

0,102

3 20

20719,82

6 20919,24

7 24 50

1,59

1 23360

0,102

3 20

21118,66

7

25

t 130

50 1,66

9 24507

2458

1

0,102

3 20

22155,65

6 22222,12

9 26 50

1,67

9 24654

0,102

3 20

22288,60

3

27

t 140

50 1,78

6 26228

2567

6

0,102

3 20

23711,13

8 23212,58

6 28 50

1,71

1 25125

0,102

3 20

22714,03

4

29

t 150

50 1,79

5 26360

2596

3

0,102

3 20

23830,79

1 23471,83

3 30 50

1,74

1 25566

0,102

3 20

23112,87

6

31

t 160

50 2,00

1 29390

2937

5

0,102

3 20

26569,50

4 26556,20

9 32 50

1,99

9 29360

0,102

3 20

26542,91

4

33

t 170

50 2,15

8 31699

3044

1

0,102

3 20

28656,77

5 27520,07

7 34 50

1,98

7 29184

0,102

3 20

26383,37

8

35

t 180

50 2,20

7 32419

3273

5

0,102

3 20

29308,21

7 29594,05

3 36 50

2,25

0 33051

0,102

3 20

29879,89

0

33

no. konsentrasi

6_APA (mol)

konsentrasi penG 7%

(mol)

penG terkonversi

(%)

pen G sisa

(mol)

pen G sisa (%)

4,187 100,000

1 0,3720

4,1866 8,885 3,815 91,115

2 4,1866

3 0,6358

4,1866 15,187 3,551 84,813

4 4,1866

5 0,8698

4,1866 20,775 3,317 79,225

6 4,1866

7 1,0357

4,1866 24,738 3,151 75,262

8 4,1866

9 1,2152

4,1866 29,026 2,971 70,974

10 4,1866

11 1,3947

4,1866 33,314 2,792 66,686

12 4,1866

13 1,5212

4,1866 36,335 2,665 63,665

14 4,1866

17 1,8707

4,1866 44,684 2,316 55,316

18 4,1866

19 2,0584

4,1866 49,167 2,128 50,833

20 4,1866

21 2,0204

4,1866 48,258 2,166 51,742

22 4,1866

23 2,1196

4,1866 50,629 2,067 49,371

24 4,1866

25 2,2665

4,1866 54,138 1,920 45,862

26 4,1866

27 2,4256

4,1866 57,938 1,761 42,062

28 4,1866

29 2,4379

4,1866 58,231 1,749 41,769

30 4,1866

31 2,7181

4,1866 64,923 1,469 35,077

32 4,1866

33 2,9316

4,1866 70,023 1,255 29,977

34 4,1866

35 2,9982

4,1866 71,615 1,188 28,385

36 4,1866