Biokonjugátumok

Hudecz Ferenc

Előzmények

1) Fehérjék szerkezet – hatás összefüggéseinek kutatása (1925 –� Sumner, J.B., Graham V.A.: The nature of insoluble

crease Proc Soc Exp Biol Med 22 504 (1925)� Melyik aminosav (oldallánc) „kell” és melyik „nem kell” a

hatás megmaradásáhozOlcott, H.S., Fraenkel-Conrat, H.: Specific group reagentsfor proteins Chem Rev 41 151 (1947)Herriot, R.M.: Reactions of nativ proteins with chemicalreagents Adv Prot Chem 3 161 (1947)

2) Szerkezet vizsgálat� Fehérjék

� N-terminális meghatározások

� Szekvencia meghatározás (1956)Edman, P., Begg, G.: A protein sequenator Eur J Biochem 1 80 (1967)

� Aminosav meghatározás (1960)Moore, S., Stein, W.H.: Chromatographicdetermination of amino acids …Methods in Enzymol 6 819 (1963)

F

O2N NO2

N

SO2Cl

CH3CH3

λ = 254 nm λs = 360 nm

λe = 480 nm

NC

Sop.: -21 oC

O

O

OH

OH

CHO

CHO

λs = 340 nm

λe = 455 nm

�Szénhidrátok� E. Fischer 1884 Redukáló monoszacharidok

O

OH

H

OH

OH

OH

OH

NHNH2

fenil-hidrazin

N

OH

H

OH

OH

OH

OH

NH

D-Glükóz Glükóz-1-fenilhidrazon

NHNH2

fenil-hidrazinN

OH

H

OH

OH

OH

N

NH

NH

Glükóz fenil-oszazon

�Szénhidrátok� Reakció oxo-csoporttal

oxo-csoport „előállítása” hidroxil-csoportból

O

OH

O

OH OH

OO

OH

O O

O O

10 mM Nátrium-perjodát

β-D-Mannóz részlet C - C kötés hasadása

poliszacharid láncban aldehid részlet oxidálásával

�Nukleinsavak� Maxam, A.M., Gilbert, W …: A new method for

sequencing DNA PNAS 74 560-564 (1977)

� Sanger, F. et al. PNAS 74 5463 (1977)� Smith, L.M. et al. Nature 321 674 (1986)

N

N

N

N

NH2

R

1

2

34

56 7

8

9

1

2

34

56 7

8

9N

NH

N

N

NH2

O

R

N+

N

N

N

NH2

RCH3

N

NH

N

N+

NH2

O

R

CH3

(CH3)2SO4

a) 0.1 M HCl

b) pH 7, 100 oC

N

N

O

H

O H

NH (CH2)5

O

NH

O

O

HH

OH

H

HH

O O

O-

O

P O

O-

O

P OH

O-

O

P

O OOH

O

OH

3 Na+

� ChromaTide fluoreszcein-12-dUTP szerkezete (C-7604)

2) Biopolimerek kimutatása sejtben, szövetben� Fehérjék jelölése radioaktív izotóppal

� Li, C.H.: Iodination of tyrosine groups in serumalbumin and pepsin JACS 67 1065 (1945)

I131 I3- I2 + I-

I2 + H2O H2OI+ + I-

Tyr His

I

O-

COO-

NH3+

I

O-

I

NH+

NHI

COO-

NH3+

� Hnatowich, D.J. et al.: The preparation and labeling ofDTPA-coupled albumin Int J Appl Radiat Isot 33 327-332 (1982)

N

O

NH+ N

O

O

O

O

O

O-

O

NNH

+ N

O-

O

NH OR

O

O-

O-

O

O-

O

R NH2

amin tartalmú molekula

DTPA

� Fehérjék jelölése biotinnal� Bayer, E.A., Wilehek, M.: The use of avidin-biotin

complex Methods Biochem Anal 26 1 (1980)Chaiet, L., Wolf, F.J.: The properties of streptavidin, a biotin-binding protein produced by streptomyces Arch

Biochem Biophys 106 1 (1964)Green, N.M.: Avidin Adv Protein Chem 29 85 (1975)

NH NH

S

O

COOH

2

4*

D-Biotin

[Hexahidro-2-oxo-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-pentánsav]

Ka = 1015 M-1

op.: 232-233 oC

� Biopolimerek jelölése fluorofórokkal� McKinney, R. et al. Factors affecting the rate of

reaction of fluorescein isothiocyanat with serumproteins J Immunol 93 232 (1964)

OO-

O

NC

S

O-

O

R NH2

amin tartalmú molekula+

OO-

O

NHC

S

O-

O

NHR

Fluoreszcein izotiocianát Tiourea kötés létrehozása

2) Affinitás kromatográfia� Bethell, G.S. et al. A novel method of activation of

cross-linked agarose with 1,1’-carbonyldiimidazol which gives a matrix for affinity chromatography J Biol

Chem 254 2572 (1979)

O

OH

OH

OO

CH2OH

O

O

O

O

CH2

CHOH

CH2

O

CH2

O

OH

OH

OO O

O

O

OH

CNBr

C NH

O

O

C NO

L NH2C NHO

NH

L

Gyógyszerkutatás

Analitika(kémiai, orvosi)

Protein:hatás-szerkezet

Elválasztástechnika

Szerkezetvizsgálat

Definíció

1. Mindkét komponens aktív2. Kovalens kötés

3. Lehet több komponens is

� Megközelítési lehetőségek1. A partnerek mérete

� Kicsi – kicsi� Kicsi – nagy � Nagy – nagy

2. A kötés jellege� Közvetlen

NH2 HOOC

� Közvetett

NH2 HOOC

spacer

3. A kötés típusa� Savamid

� Savészter

� Savanhidrid

C NH

O

S NH

O

O

O P NH

O-

O

O P O

O-

CH3O

C O

O

karbonsav szulfonsav foszforamidát

karbonsav foszforsav

CO

O

C

O

PO

O

P

OOH

OH

CO

O

P

O

OH

karbonsav foszforsav „vegyes”

� Hidrazon

� Schiff bázis

� Éter

C NH

O NAldehid + hidrazon

Aldehid + amin

Alkohol

NC

H

CH2

OCH2

� Karbamát

� Szekunder amin(N-glikozid)

� Izourea

� Izotiourea

CH2

OC

NH

O

CH2Alkohol

Amin+ aldehid

+ aril-halogenid

Amin

Amin

CH2

NH CH2

NHCH2

CH2

NHC

NH

O

CH2

CH2

NHC

NH

S

CH2

� Tioéter

� Tioészter

� Diszulfid

� Diazo

� C – X

Tiol

Tiol

Tiol

Azid

CH2

S CH2

SCH2

C

S CH2

O

CH2S

SCH2

SS

CH2

NN

C I

1. Példa: kicsi – kicsi, közvetlen, anhidrid kötés„Firefly” lumineszcencia

LH2 + ATP-Mg + ATP LH2AMP

LH2

luciferáz enzim

LHAMP-

-

AMP + CO2 + P + hν LHAMP

21

3 proton elvonás

konformáció változás

+ O2

1. Példa

O

OH

O

O

P O

OH

O

P OH

OH

O

P

N

S

N

S

COOH

H

HOH 11'

3'4

ATP

D (-) luciferin (LH2) Luciferil-adenilát

Adenilsav andidrid

"Karbonsav"

Luciferáz

Mg2+

11'

3'4

O

OH

O

O

P

N

S

N

SH

HOH

O + ADP

N

S

O

R

oxiluciferin

2. Példa: kicsi – nagy, közvetlen, amid kötésLiposzoma – haptén konjugátum

NH2

NH2

O

O

OO

CH3

O

CH3

O

O-

O

P

NH3+

PE liposzóma Foszfatidil etanolamin

2. Példa

O

O

OO

CH3

O

CH3

O

O-

O

P

NH3+

+ HOOC GAFA

NH

CH3

O

NC

N

CH3

NH+

CH3

CH3

EDC

1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil)karbodiimid

O

O

OO

CH3

O

CH3

O

O-

O

P

NH NH CH3

O

GAFACO

+ EDC HOH

NH CO GAFA NHAc

NH CO GAFA NHAc

NH2

3. Példa: nagy – nagy, közvetett,diszulfid kötésImmunotoxin konjugátum

1. lépés: védett -SH csoport kiépítése az ellenanyag molekulán (Ab + SPDP → amidkötés)

2. lépés: szabad -SH csoport létrehozása a toxin alegységben (-S-S- kötés hasítása, DTT)

3. lépés: az –SH partner reakciója a „védett” SH tartalmú komponenssel (AB-SSP + Toxin-SH →diszulfid kötés)

3. Példa� Carlsson, J. et al. Biochem J 173 723 (1978)

� Cleland W. Biochemistry 3 480 (1964)

NH2

+ N O

O S

S

N

O

O

N OH

O

O

NH

O S

S

Namino csoportot tartalmazó SPDP

antitest NHS

SPDP aktivált antitest

NH

O S

S

B lánc

A lánc

DTT

B lánc A lánc

Toxin molekula A és B alegységgel

Redukció, szabadtiol csoportok keletkezése

Immunotoxin képződésdiszulfid híddal

N

S

Piridin-2-tionλ = 343 nm

R

O

O

R1 (C, P)

R

S

O

R1

R

NH

O

R1

R

O

O

R1

O R

NH

O

NH2

R

N3

O

R

NH

O

N

R2

R

OH

O

R2

H

O

R2

H

N

N N

CH2

CH2RR3 OH

R2 O

R4

NH

R4

OR3

O

észter tioészter amid

anhidrid hidrazid azid

hidrazon

diazo

Schiff bázis

éter karbamát

redu

kció

oxid

áció

Térkép

R5 NH2

R5 NH

R (Ar)R

NHR5

O

CH

NR5

NH

R

NHR5

O

NH

R

NHR5

S

Térkép

Schiff-bázis izourea izotiourea

szekunder amin amid (SO, POH)

R6 SH

R6 S

R6

S R

SR6

tioéter diszulfid híd

1) Hogyan lehet funkciós csoportot kiépíteni? (-COOH, -CHO, -OH, -SH, -NH2)

2) Hogyan lehet funkciós csoportot eltüntetni?