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Bioinformatik I: Grundlagen der Gentechnik

Prof. Jörg Kudla (Freisemester) Dr. Oliver BatisticInstitut für Biologie &Biotechnologie der PflanzenSchlossplatz 7

Schwerpunkte:

Vorlesung 1: Einführung & Enzyme der GentechnikVorlesung 2: Methoden der GentechnikVorlesung 3: Vektoren & KlonierungVorlesung 4: Reportergene und Hefe-Zwei-Hybrid SystemVorlesung 5: Transgene OrganismenVorlesung 6: Genomik und moderne MethodenVorlesung 7: Proteine

Reportergene und Markergene

Reporter- und Markergene

Genprodukte der Reportergene erlauben den Nachweis (und eventuell die Quantifizierung) und/oder die Selektion von zu untersuchenden Ereignissen oder Eigenschaften von biologischen Substanzen bzw. Organismen.

Markergene: Erlauben die Selektion von gesuchten Ereignissen (z. B. Transformation). Sind in der Regel dominant.Zur Selektion sind unterschiedliche Systeme verfügbar:- die Komplementation defizienter Rezipienten mit dem intakten Wildtypgen-die Verwendung dominant selektierbarer Marker (z.B. Antibiotika- oder Toxin-Resistenzen.

Reportergene: Als Reportergene werden solche Makergene bezeichnet, die zwar nicht dominant selektiv sind, deren Genprodukte aber leicht durch einfache biochemische, histochemische oder photometrische Methoden nachweisbar sind.

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Reporter- und Markergene

Anforderungen/Merkmale

- Selektierbarkeit von Organismen oder Ereignissen(Wachstumsselektion, optischer Nachweis, radioaktiver Nachweis)?

- Quantifizierbarkeit von Aktivitäten?

- möglichst einfacher (und preiswerter) Nachweis?

- Nachweis in lebenden Organismen?

- hohe Sensitivität bzw. optische Auflösung?

Reporter- und Markergene - Anwendungen

- Selektionsmarker

a) transformierte Zellen, Gewebe bzw. Organismen(Antibiotikaresistenz, auxotrophe Marker, Herbizidresistenz, Farbreaktion)

b) Klonierungsereignisse (ß-Galactosidase)

- Bestimmung von Enzymaktivitäten (Luciferase, Alkalische Phosphatase)

- Expressionsmuster und –stärke von Genen (Promoterfusionen mit GUS, GFPoder Luciferase)

- Lokalisation von Proteinen in Zellen und Geweben (Fusionsproteine)

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Reportergene

- ß-Galactosidase *

-ß-Glucuronidase *

- Neomycin-phosphotransferase (NPT)

- Chloramphenicol acetyl transferase (CAT)

- Alkalische Phosphatase

- Luciferase *

- green fluorescent protein (GFP) *

ß-Galactosidase

tiefblau

farblosX-Gal(5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-Galctosid)

5-Brom-4-chlor-indigo

ß-Galactosidase

Lactose Galactose + Glucoseß-Galactosidase

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ß-Galactosidase: Blau-Weiß Selektion von Bakterien

Vektor mit Insert Vektor ohne Insert

(Eine endogene ß-Galactosidase darf nicht im genetischen Hintergrund aktiv sein!

ß-Galactosidase: Blau-Weiß Selektion von Bakterienmit Hilfe von geeigneten Vektoren

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ß-Glucuronidase

tiefblau

farblos

ß-Glucuronidase

X-Gluc(5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-Glucuronid)


ß-D-Glucuronid + H2O Glucuronsäure + Alkohol ß-Glucuronidase

Promotor-GUS-Fusionen in trasgenen Pflanzen

Beispiele:Prinzip:

Gen X:ATG TAA

XPromotor

GUSPromotor

Transformationsvektor

ß-Glucuronidase

X-Gluc5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-Glucuronid


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quantitative ß-Glucuronidase Assays

Fluoreszenz 455 nm (Anregung 365 nm)

erlaubt eine Quantifizierung derReportergenaktivität

-

ß-Glucuronidase

MUG(4-Methyl-b-D-umbelliferylglucuronid)

MUB (Methylumbelliferon)

quantitative ß-Glucuronidase Assays II

ß-Glucuronidase

Glucuron

CPD-Star(Dioxetan)

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Luciferase

Luciferase aus Glühwürmchen (Photynis pyralis):

• 62kDa Protein

• emitiert Licht 562nm (grün-gelb)

instabiles DioxetanOxyluciferin

Luciferase als Reportergen in Pflanzen

LUCPromotor


Prinzip:

Gen X:ATG TAA

XPromotor

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Signal Transduktions-Mutanten - Screens

LB T- DNA RB

vir-Gene

ori

tra

noc

Mutagenese F0

F1

F2

selbsten

selbsten der Pflanzen

Promotor RD29 Luciferase

Screening: - Stress- Luciferin sprühen- Imaging mittels

CCD-Kamera

Selektion von Mutanten durch Reportergenanalyse (fiery2- Mutante)

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Selection of mutants by analysis of reporter genes (hos2- mutant)

(Xiong et al. 2004, Plant J.)

green fluorescent protein (GFP)

- aus Aequorea victoria

- 28 kDAa Protein

- zwei Anregungspeaks (395 nm und 470 nm)

- emitiert Licht von 509 nm

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Lichtemmision des GFP

ApoAequorin

Coelenterazine

Ca3-Aequorin-coelenterazine

3 Ca++

Ca3-Aequorin-coelenteramide + CO2

In vitro BLUE LIGHT

max 469 nm

In vivo GREEN LIGHT

max 509 nm

GFP

Aequorea victoria

GFP= Grün Fluoreszierendes Protein

GFP als Reporterprotein in Pflanzen

Zellkultur

CBL1::GFP

Prinzip:

ATG TAA

GFPGen


Pflanze

CRY2::GFP

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Subcellular localization of CBL Proteins

plasma membrane tonoplast(vacuolar membrane)

cytoplasm and nucleus

CBL1 CBL2 CBL7

GFP als Reportergen

in Pflanzen

in Säugern

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GFP als Reportergen

Modifizierte GFP-Proteine• Anpassung der Proteins an den zu untersuchenden Organismus

Temperaturoptimum, codon usage, kryptic splice sites)

• smGFP (soluble modified GFP)

• GFPs mit subcellulären targeting Sequenzen (ER-GFP)

• enGFP (enhanced fluorescence)

• YFP, CFP, RFP (veränderdete Absorbtions- und Emissionspeaks):

erlauben Co-Lokalisationsuntersuchungen von zwei Proteinen

• Photoconversion

• FRET (fluorescence resonance energie transfer):

in vivo Protein-Protein- Interaktionsstudien

• Cameleon (Calcium imaging)

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Varianten des GFP

Entwicklung fluoreszierender Proteine

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Entwicklung neuer fluoreszierender Proteine

mHoneydew, mBanana, mOrange, mTomato, mTangerine, mStrawberry and mCherry








• Photoconversion




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Co-Lokalisation von GFP und RFP-Fusionen

CBL1/CIPK1

CBL10/CIPK24

CBL6::OFP

CBL6::OFP

overlay

overlay








• Photoconversion




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Photoconversion Grün zu Rot mit EosFP

Lobophyllia hemprichii








• Photoconversion




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FRET: „fluorescent resonance energy transfer“:

FRET:Energietransfer zwischen zwei Fluorochromen durch:

1. Räumliche Nähe der Reportergen-Proteine

2. Überlagerung des Emmisions- des CFP mit dem Anregungsspektrum des YFP

CFP YFP

433nm 476nm

CFP YFP

512nm

Fluoreszenz: FRET:

433nm

476nm

Interaktionsstudien mit FRET

YFP

433nm

CFP YFP

433nm

CFP

512nm

Interaktion

476nm

476nm

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BiFC – Bimolecular fluorescence complementation

FRET BiFC

433nm 476nm

A B A B

512nm

BA

512nm

A B

433nm4769nm

interactionno interaction interactionno interaction

emission shift no emission light emission

Establishment of the BiFC technology to investigate protein-protein interactions in plant cells:

vector control cytoplasmic proteins nuclear proteins

(Walter et al., 2004, Plant J.)

BiFC – Bimolecular fluorescence complementation

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Lokalisation von Proteinkomplexen durch BiFC

Plasmamembran:CBL1 + CIPK1

Tonoplast:CBL2 + CIPK1

Modifizierte GFP-Proteine

• Anpassung der Proteins an den zu untersuchenden Organismus










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Cameleon: A FRET based calcium indicator

Allen et al. (1999) Plant J 19, 735

Miyawaki et al.(1997) Nature 388,882

+Ca2+ -Ca2+

CFP

YFP

YFP

CFP

440nm 480nm

509nm

440nm

FRET

CaM M13

Z MBP

480nm

Measuring Calcium with the Cameleon Protein

YFP

CFP

Ratio

P2P1

Kamera

Filterrad

Excitation

PC

Pumpe

Mikroskop -

Kammer

EmissionP2P1

Kamera

Filterrad

Excitation

PC

Pumpe

Mikroskop -

Kammer

Emission

YFP CFP Ratio

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Z MBP

1.50

1.75

2.00

2.25

0.8

0.85

0.9

0.95

1

Cold shock + 0.5µM Baf

Hyp Hyp

[Ca2+]cyt oscillations in protoplasts

Hyperpolarization

Calcium-Oszillationen in Blattepidermiszellen

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Yeast two-hybrid system

1. 1,2,3-Hybrid-Systeme

- Two-Hybrid-System

- Grundprinzip, Vektoren, technische Durchführung

- Anwendungen

- Vorteile und Nachteile

- One-Hybrid-System

- Three-Hybrid-System

Two-Hybrid-System

1. System zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Hefezellen. Nachweis geschieht durch die Aktivierung der Transkription von Reportergenen.

2. Ein bekanntes protein X ("bait" – Köder) wird mit der DNA-Bindungsdomäne (BD) eines Trans-kriptionsfaktors (GAL4) fusioniert (Fusionsprotein)

3. Ein (oder mehrere) zu untersuchende Proteine(e) Y ("prey" – Beute) werden mit der Aktivierungs-domäne (AD) dieses Transkriptionsfaktors fusioniert.

4. Interagieren die Proteine X und Y, so bringen sie AD und BD in räumliche Nähe zueinander und der Transkriptionskomplex (RNA Polymerase II) der Hefe wird gebildet.

5. Die BD vermittelt hierbei die spezifische Bindung an die entsprechenden Zielpromotoren. Die AD bindet an die in trans wirkenden Komponenten des Transkriptionskomplexes.

6. Die Transkription der Reportergene (auxotropher Marker HIS3 und ß-Galactosidase) wird hierdurch aktiviert und erlaubt die Selektion positiver Kolonien.

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Funktionsprinzip I

A) GAL4-Transkriptionsfaktor (BD & AD in einem Protein)

B) Nur Bindungsdomäne

Transkription

BD AD

HIS 3Gal 4 binding site

RNA-Pol.II

BD

HIS 3

Keine TranskriptionGal 4 binding site

C) Nur Aktivierungsdomäne

HIS 3

Keine TranskriptionGal 4 binding site

ADRNA-Pol.II

Funktionsprinzip II

BD

HIS 3

Transkription

AD RNA-Pol.II

Gal 4 binding site

YX

Transkription

BD AD


RNA-Pol.II

BD

HIS 3

AD

Gal 4 binding site

Y

XHybridprotein 1

Hybridprotein 2RNA-Pol.II

Keine Transkription

Interaktion

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Funktionsprinzip III

Gal4

TRP1LEU2HIS 3

HIS 3LacZ

Hefegenom

ADH-Prom

AD Protein YBD Protein X

LEU2TRP1

GAL4-BD cDNA „Y“cDNA „X“

„prey“„bait“

GAL4-AD

ADH-Prom

2µ 2µ

Auxotrophie

BD TranskriptionAD RNA-Pol.II

Gal 4 binding site

YX

Plasmide

Ablauf eines Two-Hybrid-Screenings

Klonierung der „bait“cDNA in das BD-Plasmid

Transformation in die Hefe

(Selektion auf -Trp-Platten)

Kultivierung der „bait“-Hefe in Flüssigmedium

Selektion auf -Leu, -Trp, -His-Platten

Klonierung der „prey“cDNA in das AD-Plasmid

bzw. Herstellung einer cDNA-Bank

Transformation in die Hefe (nur sinnvoll bei einzelnen

„prey“-cDNA-Klonen (Selektion auf -Leu-Platten)Kontrolle auf ß-GAL-Aktivität

und -His-Medium (negativ!)

Transformation der „prey“-cDNA-Klone bzw. Bank

Erneute Selektion der Kolonien:

auf LTH-Platten, Duplikate

auf ß-GAL-Aktivität untersuchen (Filter-Lift-Assay)

Transformation in E. coli und Plasmidisolation

Erneute Transformation in Hefe:

Kontrollen:

+ „leere Hefe“: His+ß-GAL: -

+ „bait Hefe“: His+ß-GAL: +

Sequenzanalyse der „prey-cDNA“

Isolation der Plasmide aus der Hefe

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Anwendungen

ADH-Prom


TRP1LEU2



GAL4-AD

ADH-Prom

2µ 2µ

ADH-Prom

AD ProteineBD Protein X

TRP1LEU2

GAL4-BD cDNA-BankcDNA „X“


GAL4-AD

ADH-Prom

2µ

1. Untersuchung zweier bekannter Proteine auf Interaktion

2. Identifizierung unbekannter interagierender Proteine2µ

Identifikation von interagierenden Proteinen

BD CBL1 AD cDNA-Bank

AD cDNA-Bank

AD cDNA-Bank

AD cDNA-Bank

Transkription

Histidinauxotrophie ß-Gal-Aktivität

BD CBL1ADcDNA-Bank

...Hefe

RNA-Pol.II

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Testing of protein-interactions

CIPK1

CIPK2

CIPK4

CIPK5

CIPK6

CIPK7

CIPK8

CIPK9

CIPK11

CIPK12

CIPK13

CIPK14

control CBL1

CIPK15

CIPK16

CIPK17

CIPK18

CIPK19

CIPK20

CIPK21

CIPK22

CIPK23

CIPK24

CIPK25

control CBL1

(Kolukisaoglu et al., 2004, Plant Physiol.)

Anwendungen

ADH-Prom


TRP1LEU2



GAL4-AD

ADH-Prom

2µ 2µ

Fragment Y1AD

Y2AD

Y3AD

3. Kartierung von Bindungsdomänen

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Anwendungen

3. Kartierung von Bindungsdomänen

Analysis of protein-interactions - growth and filter lift assays

Kim, Jungmook et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. (94), 11786-11791

A and B : SD -Trp -Leu

C and D : SD -Trp -Leu -His, 25 mM 3AT

E and F : filter lift assay

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Vorteile des Two-Hybrid-Systems

1. technisch einfache und schnelle Methode

2. prinzipiell für jeden Organismus anwendbar, in vivo System

3. direkter Zugang zum Gen (cDNA)

4. unabhängig von in der Zelle vorliegenden Proteinmenge

5. erlaubt den Nachweis schwacher und temporärer

Wechselwirkungen

Nachteile des Two-Hybrid-Systems

- nicht jede Interaktion ist nachweisbar (fehlende Modifikation der Proteine,

Membranproteine, toxische Proteine)

+ "false negatives":Proteine, die in ihrem Originalorganismus interagieren,

aber nicht in der Hefe

+ "false positives":Proteine, die in der Hefe interagieren, aber nicht in ihrem

Originalorganismus

- Gewebe- oder entwicklungsspezifische Expression der Proteine wird nicht

wahrgenommen (in der Hefe werden Proteine miteinander in Kontakt gebracht, die

im Originalorganismus nicht gleichzeitig exprimiert sein müssen)

- zufällig interagierende Proteine und transaktivierende Proteine

Die Ergebnisse einer Hefe-Zwei-Hybrid-Analyse müssen durch andere Techniken

untermauert werden.

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Two-Hybrid-SystemSystem zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Hefezellen.

One-Hybrid-SystemSystem zur Identifizierung von unbekannten Proteinen bzw. Untersuchung von Proteinen, die an eine

bekannte DNA-Sequenz binden.

Three-Hybrid-SystemSystem zur Identifizierung von unbekannten Proteinen bzw. Untersuchung von bekannten Proteinen, die

an eine bekannte RNA-Sequenz binden.

Two-Hybrid-System

Transkription

HIS 3Promotorentspricht „bait“

RNA-Pol.II

ADYHybridprotein 1

BD

HIS 3

TranskriptionAD RNA-Pol.II

Gal 4 binding site

YXHybridprotein 2Hybridprotein 1

One-Hybrid-System

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Three-Hybrid-System

RNP

Transkription

BD


RNA-Pol.II

Y AD

Y AD

Hybridproteine 3

RNP BD

Hybridprotein 2RNA-Hybrid

RNA-Domäne 1:bindet an RNP

RNA-Domäne 2:bindet ???

+

entspricht „bait“

Three-Hybrid-Systeme

RNP

Transkription

BD


RNA-Pol.II

Y AD

BD

HIS 3


Gal 4 binding site

YXProtein 2Protein 3

Protein 1

„Echtes“ Three-Hybrid

„Falsches“ Three-Hybrid

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Split Ubiquitin System zur Detektion von Interaktionen zwischen Membranproteinen

Two-Hybrid-System

BD

HIS 3


Gal 4 binding site

YXHybridprotein 2Hybridprotein 1

Yeast-BIFC-System

A B

512nm

BA

interactionno interaction

no emission light emission

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