BIOFILMS: SURVIVAL MECHANISMS OF CLINICALLY

RELEVANT MICROORGANISMSRodney M. Donlan and J. William

CostertonClin. Microbiol. Rev. 2002, 15(2):167. DOI:10.1128/CMR.15.2.167-

193.2002.

Yenny Maylin Aybar Flores.

INTRODUCCIÓN

Teoría de predominancia de los biofilms (1978)

Adheridos a superficies nutritivas.

Ecosistemas

acuáticos naturales.

PROBLEMÁTICA. Muestreadores de biofilms

Bacterias => Estrategias de supervivencia.

Tuberías.

Sistemas industriales.

Recipientes

Uso de biocidas.

Bacterias sésiles.

¿Creer? O ¿NO creer?

BiofilmsProtegidos de antibacterianos

Bacteriófagos ambientales.

Resistencia a antibióticos.

Resistencia a mecanismos de defensa de hospedero.

Pseudomonas y Legionella => Estrategias => Nuevos problemas.

Células plantónicas de patóg. Especializ.

GRUPOS ETARIOS EN PELIGRO.

BIOFILMS:

Fibrillas muy delgadas de polímeros extracelulares que anclaban bacterias a la superficie (Marshall, 1976)

Matriz de glicocálix => permitía la adhesión.

Células y microcolonias, que se encontraban embebidas en una matriz de exopolímeros predominantemente aniónicos, altamente hidratada.

Estudio de características de heterogeneidad y composición.

Adhesión=>Desencadena la expresión génicaDe componentes

Bacterianos especiales.

Transcripción de genes en la adhesión =>Formación de biofilms

Pseudomonas aeruginosa:Gen algC => Fosfomanomutasa => sínt. de alginato.También: algD, algU, rpoS => Polifosfokinasa: MetabolismoPolifosfato.

Uniónirreversible

DEFINICIÓN ACTUAL:

Comunidad sésil derivada de microorganismos, caracterizada por células

que se encuentran irreversiblemente adheridas a un sustrato o interfase o unas

con otras, embebidas en una matriz extracelular de sustancia poliméricas que

ellos mismos han producido, y que exhiben un fenotipo alterado respecto a la tasa de

crecimiento y expresión de genes. Verdaderos biofilms: Características

inherentes de resistencia. Deben asumir el fenotipo del biofilm.

RELEVANCIA NUEVA: Una vez que el biofilm se ha formado y la matriz de exopolisacáridos ha sido secretada

por las células sésiles, la estructura resultante es altamente viscoelástica y se comporta de

manera elástica.

Ambientes que les confieren menor % de ruptura.

 High shear: Propiedad de un terreno que le permite resistir el desplazamiento entre las partículas del mismo al ser sometido a una

fuerza externa => Alta resistencia a la tracción

MECANISMOS DE RESISTENCIA: (i) Penetración retardada del agente

antimicrobiano en la matriz del biofilm. (ii) tasa de crecimiento alterada de los

microorganismos (iii) Otros cambios fisiológicos debido al

tipo de crecimiento en el biofilm.

PENETRACIÓN RETARDADA DEL AGENTE ANTIMICROBIANO EN LA MATRIZ DEL BIOFILM.

Barrera difusional presente en la matriz. Ejemplo: Pseudomonas aeruginosa Normal: 40 seg (desinfección)Biofilms: 21 minutos.

Bacterias dispersas: 15 veces más suceptibles a antimicrobianos.

*Clave: organización celular.

COMPUESTOS ESENCIALES: Hatch and Schiller 2% suspensión de

alginato aislado de P. aeruginosa inhibieron la difusión de gentamicina and tobramycina, y este efecto a su vez fue revertido usando alginato liasa.

Teicoplamina y Vancomicina => K.O Rifampicina y clindamycina min.

Afect.

No para todos los antibióticos es igual.

Mixed-species heterotrophic biofilm

grown on stainless steel in a potable-water biofilm

reactor containing Pseudomonas aeruginosa,

Klebsiella pneumoniae, and Flavobacterium spp. This image of a biofilm

was obtained, after staining with 4,6-

diamidino-2-phenylindole, with a

Zeiss Axioskop 2 epifluorescence

microscope and the Zeiss deconvolution system.

TASA DE CRECIMIENTO ALTERADA DE LOS MICROORGANISMOS

Crecimiento más lento. La toma de antimicrobiano es más lenta. Mét. De cultivo celular: E. coli Tasa de

crecimiento < Resistencia (Cetrimida) S. epidiermidis:

tasa de crecimiento cel. = Ciprofloxacina P. aureginosa:Biofilms de más tiempo = Mayor resistencia.

OTROS CAMBIOS FISIOLÓGICOS DEBIDO AL TIPO DE CRECIMIENTO EN EL BIOFILM. Productos que mitigan el estrés

(factores sigma):Sintetizados por rpoS.Represión o inducción de genes => Varias rptas.

Colonias: De mayor densidad y un alto # de organismos viables. (rpoS+)Limitación de nutrientes. Favorecen laFormación de toxinas formación de Biofilms.

INFECCIONES HUMANAS – BIOFILMS: Postulados de Koch:1) Microorganismos debe encontrarse

regularmente en lesiones de la enfermedad.

2) El agente debe ser aislado del cuerpo en un cultivo puro a partir de las lesiones de la enfermedad.

3) El agente debe provocar la enfermedad en un animal susceptible al ser inoculado.

4) El agente debe ser aislado de nuevo de las lesiones producidas en los animales de experimentación.

BIOFILMS? ESCAPAN DE LOS POSTULADOS

ANTERIORES.

Prostatis crónica => (CNS) presentes en biopsias PERO… no se podía concluir que eran el agente etiológico.

Mera asociación.

ENFERMEDADES INFECCIOSAS Endocarditis de válvula Nativa:

Endotelio vascular dañado

Barreras mecánicas

Acceso:Orofaringe.Tracto gastrointestinal.Tracto urogenitario.

NBTE: Plaquetas + Fibrina + Algunos eritrocitos

ENDOCARDITIS DE VÁLVULA NATIVA:

Streptococci (viridans streptococci, enterococci, pneumococci, and

Streptococcus bovis), 25% by Staphylococci (19% coagulase positive and 6% CoNS), and the balance by gram-negativebacteria and

Fungi (Candida and Aspergillus spp.).

Fibronectina => responsable del daño vascular.Se une a: Cél humanas, fibrinas de colágeno y bacterias.

PAPEL DE LOS RECEPTORES. + binding = + virulencia.

Fibrina impidió la motilidad de los leucocitos. – Mayor activ. en la superficie

Las bacterias penetran el tejido.

Embolos => Embolia (Predominantemente fungi)

Fluconazole es el más efectivo (Candida)

Trato. Prolongado de Rifampicina y Vancomicina.

OTITIS MEDIA Consecuencia: Disfunción de la

trompa de Eustaquio

Común de la niñez. Aguda – Crónica. Inflamación del

revestimiento mucoperióstico.

Fluído viscoso.

OTITIS MEDIA – MICROORGANISMOS: Streptococcus pneumoniae,

Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, group A beta-hemolytic streptococci, enteric bacteria, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa.

Solución: Implantación de tubos de timpanostomía para aliviar la fuerte presión y pérdida de audición.

Superficies perfectasPara contaminación.

Experimentos:

Silicona Armstrong.

Recubierto de óxido de plata

Tubos de fluoroplástico.

Silicona ionizada.

Tubos tratados son mejores.

* Estudios clínicos prospectivos.

Adherencia y colonización

~ Óxido de plata.

Poca penetración de antibióticos en el oído medio… concentraciones

PROSTATITIS BACTERIANA CRÓNICA

Infectada por las bacterias que han ascendido desde la uretra o por el reflujo de orina infectada en los conductos prostáticos desembocan en la uretra posterior.

Rpta. Inmune

Ducto y acinos. => Biofilms.

Etapa aguda => Fácil remoción.

MICROORGANISMOS AISLADOS: E. coli (most common isolate),

Klebsiella, enterobacteria, Proteus, Serratia,

Pseudomonas aeruginosa, CoNS, coryneforms, and Enterococcus faecalis.

In another study, Nickel and Costerton isolated E. coli, P. aeruginosa, Bacteroides spp., Gardnerella spp., Corynebacterium spp., and CoNS.

ESTUDIOS Las muestras también se sometieron a

se sembraron en agar MacConkey. Demostraron que las bacterias estaban presentes en microcolonias glicocalix-revestidas y parecían estar firmemente adheridas a las capas mucosas ductal y acinos.P. Aureginosa <adherencia

BIOFILMS DE LOS TEJIDOS:

Una vez que las bacterias infectan la próstata, producen una glicocalix y se vuelven inactivas. Con este cambio en

el metabolismo, las células pueden llegar a ser más resistentes a agentes

antimicrobianos.

Tratamiento: Suministrar mayores concentraciones de antibióticos

directamente a la biopelícula dentro de los conductos prostáticos.

FIBROSIS QUÍSTICA:Deficiencia neta de H2O

Dificulta el flujo ascendente de la capa de moco.

Secreción

& Abs. electrolitos

Deshidratación y espesamiento

de las secreciones que cubren el

epitelio respiratorio

Crecimiento bacteriano.

DATOS: 70% de los pacientes con FQ son defectuosos en

el gen regulador de la proteína reguladora de conductancia transmembrana (CFTR).

Deriva en secreciones alteradas de los epitelios. Staphylococcus aureus: 1era colonia en aislarse. S. aureus e infecciones por H. influenzae

predisponen a la colonización por P. aeruginosa. Burkholderia cepacia también se ha demostrado

para infectar los pulmones de pacientes con FQ con consecuencias letales. (Rara)

Mecanismo de colonización: Desconocido.

POSIBLES CAUSAS: Receptores potenciados de pseudomonas en el

epitelio respiratorio. Incapacidad de despeje a nivel mucociliar.

No mucosos (1er etapa) Persistencia en pulmones => Fenotipos Mucosos.

(Meses – años)

Selección de cepas y mutaciones.

Exopolisacáridos mucosos producidos transitoriamente => Adherencia de P. aureginosa

¿Qué era? => Alginato

MECANISMO Respuesta inflamatoria mediada por

PMNs.

PMNs activados y producción de H2O2

Rol en la generación de microorg. MucososTratamiento:

Ciprofloxacina and colistina inhalada, posponían infección crónica.

Vacuna => Efectiva para prevenir la colonización.

MÁS MECANISMOS: Se propuso otro mecanismo de persistencia y supervivencia

porCochrane et al. Utilizando ratas que habían sido artificialmenteinfectadas con perlas de agar que contenían P. aeruginosa, seencontró que las bacterias dentro de estas perlas producían elevados niveles de proteínas de membrana reguladas por hierro de alto peso molecular que pueden funcionar como receptores para los complejos de hierro-sideróforos.

Estas moléculas ayudan en el barrido de los bajos niveles dehierro de la corriente sanguínea. Un mecanismo de defensa del huésped contra organismos patógenos es restringir hierro disponible para limitar este nutriente indispensable . Mediante la producción de barrido de compuestos de hierro, los organismos son más capaces de sobrevivir en el hospedero.

Mayor edad => Menos suceptibilidad.

PERIODONTITIS

Inflamaciones leves &

Reversibles – Destrucción crónica

Enzimas proteolíticas

causan lesiones.

*Colagenasa*Hialuronidasa

Gram - :

Endotoxinas => Inflamación

El canal entre la raíz del diente y la gingiva (encías), llamado la grieta subgingival, es el sitio primario de la infección periodontal y se profundizará en una bolsa periodontal con el la progresión de la enfermedad

Microorganismos encontrados:Fusobacterium nucleatum, Peptostreptococcus

micros, Eubacterium timidum, Eubacterium brachy, Lactobacillus spp., Actinomyces naeslundii, Pseudomonas anaerobius,

Eubacterium sp. strain D8, Bacteroides intermedius, Fusobacterium sp., Selenomonas

sputigena, Eubacterium sp. strain D6, Bacteroides pneumosintes, and Haemophilus

aphrophilus. (Todos relacionados con gingivitis)

DATOS: Espiroquetas y cocos son abundantes.

Microflora predominante en áreas subginigivales lesionadas:

Fusobacterium nucleatum, Wolinella recta, Bacteroides intermedius,

Bacteroides forsythus, and Bacteroides gingivalis (Porphyromonas gingivalis).

Infección polimicrobiana.

COMPOSICIÓN DE LA PELÍCULA: Contiene: albúmina, lisozima, glicoproteínas,

fosfoproteínas, lípidos, y fluído gingival.

Horas después los colonizadores entran en acción con la producción de glucanos extracelulares de unión:

Streptococci, Actinomycetes, and smaller numbers of Haemophilus.

Días después: Predominancia de Actinomycetes. Desarrollo de la matriz de polisacáridos

característica.

COAGREGACIÓN: Reconocimiento celular mediante

adhesinas. Reconocmiento de receptores de

glicoproteínas, proteínas o polisacáridos.

Placa bacteriana => Comunidad de biopelícula climax. (Tarda de 2-3 semanas)

Cálculos: Placa mineralizada con iones de fosfato y calcio.

Prolifera en cualquier lugar. Es cada vez más difícil que la saliva

actue.

TRATAMIENTO - PREVENCIÓN: Limpieza dental profesional + agentes

antimicrobianos. Limpieza dental propia denodada.

Nutrientes bacterianos: Fluído gingival (principal nutriente): Contiene proteínas, glicrop y otros

nutrientes Dieta del hospedero SalivaA pesar del flujo de aire en la cavidad oral, todo es

mayormente anaeróbico.

¿Y EL OXÍGENO QUÉ?

Cultivos mixtos pueden proteger a los anaerobios obligados de los efectos tóxicos del oxígeno.

BIOFILMS EN APARATOS MÉDICOS:

ESTUDIOS: Han sido estudiados durante los últimos

20 años. Herramientas simples => Técnicas de

cultivos viables y microscopía electrónica. (Caracterización y visualización)

Materiales susceptibles a contaminación.

VÁLVULAS CARDÍACAS: Válvulas mecánicas y bioprótesis, ambas

con tasas similares de contaminación. Implantación => Daño tisular:

acumulación de plaquetas y fibrinas => Gran susceptibilidad.

Colonización inicia en la sutura. Eventualmente avanzarán y separarán

la válvula del tejido => Drenarán fluídos.CNS => Primeros colonizadores (Contaminación durante la cirugía)

DIAGNÓSTICOS DE AGENTES ET: Cultivo sanguíneo. (Común)

También se usa para biofilms: Ecocardiografía Transesofágica.

Nuevas ténicas ¿?

MICROORG. AISLADOS: Streptococci, CoNS, enterococci, S.

aureus, gram-negative coccobacilli, or fungi.

Viridans group streptococci (fase tardía – 12 meses)

NUEVOS HORIZONTES: Tasa de colonización in vivo, Tasa de desprendimiento Fisiología de los organismos en biofilms

organisms dentro del ambiente nutritivo del corazón.

CATÉTERES VENOSOS CENTRALES: Son los más susceptibles a

contaminación (3-5%) Administración: fluídos, nutrientes,

sangre, etc. Biofilms en el lumen o en el exterior

(asociados universalmente). Colonizadores: Cél piel del paciente o de

los profesionales. Superficie cubierta de: plaquetas, fibrinógeno, fibronectina y laminina.

MICROORGANISMOS: S. aureus=> fibrinógeno, fibronectina y

laminina. S. epidermidis => fibronectina Producción de adhesinas ~ Producción de biofilms => 3 días. CoNS, S. aureus, P. aeruginosa, Klebsiella

pneumoniae, Enterococcus faecalis, and Candida albicans.

CATÉTERES URINARIOS:

*Recolectar orina durante la cirugía * Prevenir la retención urinaria* Control de la incontinencia urinaria.

Catéter Foley:Globo

Sistemas abiertos o cerrados.

DATOS: 10 – 50% pacientes: Infección Más tiempo (>28 días) = Desarrollo

inminente. +10% de susceptibilidad/ día

ORIGEN DE MICROORGANISMOS: (i) organisms are introduced into the

urethra or bladder as the catheter is inserted,

(ii) organisms gain entry through the sheath of exudate that surrounds the catheter, or

(iii) organisms travel intraluminally from the inside of the tubing or collection bag.

LENTES DE CONTACTO

Almacenamiento y limpieza. Compuestos de amonio cuaternario,

clorhexidina gluconato-, y peróxido dehidrógeno y encontraron que el peróxido de hidrógeno al 3% fue más eficaz en la inactivación de microorganismos que forman biopelículas bacterianas que contaban con “24 h de edad”.

Silicato de sodio contra la adherencia.

MICROORGANISMOS:

Tratables: Serratia marcescens, P. aeruginosa, S.

epidermidis, Streptococcus pyogenes.

Resitentes (incluído el mejor):Candida albicans

SIN EMBARGO…

Pacientes con queratitis microbiana – indicaciones.

Serratia marcescens puede crecer en soluciones desinfectantes de clorhexidina

Se necesita más investigación.

LÍNEAS DE AGUA DE LA UNIDAD DENTAL

Tratmto: Lavado.Filtración.Suministro de agua esteril. Estudios hablan de su

poca efectividad. Iodopovidona*

ESTUDIOS Demostraron que las muestras de tubos con

tratamiento con Iodopovidona, pero los niveles volvieron a ser lo mismos del tratamiento previo 22 días después.

Fiehn y Henriksen mostraron que el tratamiento con 0,5 - 1 ppm de cloro libre por 10 min cada día redujo los recuentos bacterianos normales en alrededor de 2 registros por debajo de los niveles de pre tratamiento. Cuando se suspendió la cloración, los recuentos continuaron aumentando.

Sin embargo, Murdoch- Kinch et al. (143) encontraron que la cloración (1:10 lejía) no servía para la remoción de biofilms.

POSIBLE CAUSA: El problema puede estar en el hecho de

que las líneas de agua de la unidad dental son muy pequeñas en diámetro, presentar una superficie muy alta y velocidades de flujo relativamente bajas, por lo que son ideales para la colonización con bacterias acuáticas.

ESTRATEGIAS NUEVAS Y NO PROBADAS: Efectos en el paciente & compatibilidad

con el dispositivo. Zips et al. demostraron que el

tratamiento con ultrasonidos elimina hasta a 95% de Pseudomonas diminuta unida a ultrafiltración membranas.

Huang et al. demostraron la eficacia de la ecografía frente a biofilms de P. aeruginosa en acero y también demostró que este tratamiento mejora la eficacia de gentamicina.

ESTRATEGIAS NUEVAS Y NO PROBADAS: Blenkinsopp et al. (17) encontraron que

los campos de baja resistencia eléctrica

(más o menos 12 V cm -1) combinados con una baja densidad de corriente (más o menos 2.1 mA cm-2)mejoraron la eficacia de varios biocidas comerciales a niveles por debajo del umbral para la eficacia contra las células planctónicas

Erradicar o penetrar.

CONCLUSIONES:

Los biofilms son una estrategia exitosa para colonizar y diseminarse desde épocas ancestrales.

La importancia médica de los estudios científicos y de ingeniería tomará mayor auge en esta problemática.

Todas las infecciones crónicas descritas en comparten las características fundamentales de todos los biofilms bacterianos.

El fenotipo diferente las hace resistentes a agentes antibacterianos, y su matriz las hace resistentes a las moléculas y células antibacterianos comandados por el hospedero.

CONCLUSIONES: Aunque muchas infecciones biofilm en su

desarrollo inicial pueden producir pocos síntomas, pero a la larga pueden ser muy perjudicial porque promueven secuelas en el complejo inmune y actuan como reservorios.

Debemos de empezar a usar el fenotipo del biofilm cada patógeno crónico en el desarrollo de nuevas vacunas y antibióticos dirigidos a objetivos específicos de biofilm y en los estudios de las causas y los medios de control de este grupo creciente de enfermedades.