Biodegradación de hidrocarburos alifáticos saturados por ...
Biodegradación de Petróleo Diesel_PRESENTACION
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Biodegradación de Petróleo Diesel
Docente:Alumno :
Universidad Nacional “Pedro Ruiz Gallo”
Microbiología Industrial
MSc. Carmen Carreño FarfánRómulo Aycachi Inga.
Lambayeque – Marzo 2007
Biodegradación de Petróleo Diesel
Rómulo Aycachi Inga
El crudo de Petróleo El crudo de petróleo se caracteriza por ser un líquido
negro, viscoso y con una composición química sumamente compleja, pudiendo contener miles de compuestos, básicamente de la familia de los hidrocarburos.
Los hidrocarburos componen la familia predominante de compuestos (un 50-98% de la composición), por lo que constituyen uno de los grupos de contaminantes ambientales más importantes, tanto por su abundancia, como por su persistencia en distintos compartimentos ambientales.
Mayoritariamente son alcanos de cadena lineal (n-alcanos o nparafinas), alcanos ramificados (en menor cantidad), cicloalcanos (o naftenos) y cantidades variables de hidrocarburos aromáticos.
Los principales componentes se subdividen y purifican en distintas fracciones: Fracción saturada (n-alcanos, alcanos
ramificados con cadenas alquílicas y las cicloparafinas),
Fracción aromática (monoaromáticos, diaromáticos y hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs),
Fracción de resinas y Fracción de asfaltenos que son menos
abundantes y consisten en compuestos más polares, pudiéndose encontrar hidrocarburos heterocíclicos, hidrocarburos oxigenados y agregados de alto peso molecular .
Refinado del crudo de Petróleo El refinado pasa por un proceso de destilación,
con la finalidad de eliminar el color y olor, así como también, los compuestos del azufre.
Se destila a temperaturas crecientes obteniendo 4 fracciones principales: gasolina, queroseno, destilados medios (querosenos, gasoil, aceites lubricantes) y un residuo.
Este residuo se destila al vacío obteniéndose otros aceites lubricantes (más pesados), ceras y parafinas y betunes asfálticos (alquitranes).
Durante el proceso de refinado, se eliminan componentes de la fracción asfalténica (altamente recalcitrante) lo que implica que los refinados intermedios (gasoil, fueles, querosenos y también las gasolinas) sean productos relativamente más biodegradables que los coques o alquitranes residuales.
Así pues, la composición química de la gasolina es diferente a la del gasoil debido a que se han obtenido como productos de destilación del petróleo a partir de diferentes intérvalos de temperatura.
En la gasolina encontramos como componentes más abundantes: nbutano, isopentano, pentano, mono y dimetilpentanos, hexano, BTEX, mono y dimetil hexanos, trimetilbencenos, metiletilbencenos, y en menor cantidad los naftalenos, sus mono y dimetilados y heptano (de menor índice de octanaje).
Biorremediación del Petróleo Diesel usando diversos microorganismos
La biorremediación es la adición de materiales a ambientes contaminados para producir una aceleración del proceso natural de biodegradación.
La elevada complejidad de la composición del crudo de petróleo y derivados, implica la existencia de una amplia capacidad enzimática si se quiere conseguir una degradación significativa del crudo.
La mayor parte de los estudios realizados se han llevado a cabo con cepas bacterianas individuales o con la combinación de diferentes cepas aisladas.
En la mayoría de los casos, son degradadoras de alcanos, debido a que los alcanos son los componentes más abundantes del crudo de petróleo. No obstante en algunos casos, estas cepas tienen la capacidad de oxidar selectivamente las cadenas alquílicas de ciertos HAPs alquilados, compuestos abundantes en el crudo.
La alternativa a la utilización de cepas individuales es la obtención y utilización de cultivos mixtos, los cuales pueden ser consorcios definidos y consorcios no definidos.
Los consorcios definidos se caracterizan por ser una combinación de cepas aisladas con capacidades degradativas conocidas que son complementarias entre sí.
Los consorcios no definidos se caracterizan por ser el resultado de procesos directos de enriquecimiento a partir de muestras ambientales con historia previa de contaminación y por lo tanto no son el resultado de una combinación de cepas previamente aisladas.
Biosurfactantes Se dice que un soluto es un agente tensoactivo o
surfactante cuando da lugar a un descenso significativo de la tensión superficial.
El descenso de la tensión facilita la eliminación de las partículas de la suciedad de las superficies sólidas.
Son moléculas que contienen un segmento liposoluble (soluble en aceite) y otro hidrosoluble (soluble en agua o disolventes polares). La solubilidad parcial tanto en agua como en aceite permite al surfactante ocupar la interfase.
Reducen la tensión superficial y las tensiones interfaciales entre moléculas individuales en la superficie y la interfase, respectivamente. Tienen propiedades emulsionantes.
Atendiendo a estos criterios un biosurfactante sería una molécula biológica (orgánica) con propiedades surfactantes o tensoactivas producidas sobre superficies vivas, mayormente superficies de células microbianas, o excretados al medio extracelular.
Todas las propiedades y usos de los surfactantes provienen de dos propiedades fundamentales de estas sustancias: su capacidad de adsorberse a las interfases y de otra parte su tendencia a asociarse para formar estructuras organizadas.
Naturaleza químicaa) Lípidosb) Hidratos de carbonoc) Aminoácidosd) Glucolípidose) Lipopéptidos
Clasificación de los Biosurfactantes
Peso molecular a) Bajo peso molecular: glicolípidos. El más estudiado
es el rhamnolípido, producido por diversas especies como Pseudomonas. La función principal de estos biosurfactantes es reducir la tensión superficial entre fases (agua-roca).
b) Alto peso molecular: Suelen ser polisacáridos, proteínas, lipoproteínas, LPS o mezclas de estos polímeros. Estos biosurfactantes no son tan eficaces en cuanto a la reducción de la tensión superficial entre fases, pero si son buenos emulsionantes. Además se ha demostrado que son muy eficaces a bajas concentraciones y poseen una considerable afinidad por el sustrato. P.Ej. Alasan producido por Acinetobacter radioresistens.
Carga iónica Agentes aniónicos: Contiene generalmente
uno de cuatro grupos polares solubles-carboxilato, sulfonato, sulfato o fosfato- combinado con una cadena hidrocarbonada hidrófoba. Si esa cadena es corta son muy hidrosolubles y en el caso contrario tendrán baja hidrosolubilidad y actuaran en sistemas no acuosos como aceites lubricantes. Se usan principalmente en la industria de jabones y detergentes.
Agentes catiónicos: Están compuestos por una molécula lipofílica y otra hidrofílica, consistente de uno o varios grupos amonio terciarios o cuaternarios. Son utilizados comúnmente en detergentes, agentes limpiadores, líquido de lavaplatos, tratamiento de textiles, como sustancias activas antimicrobianas y en cosmética.
Agentes no iónicos: No se disocian en iones hidratados en medio acuoso. Las propiedades hidrofílicas son provistas por hidratación de grupos amido, amino, éter o hidroxilo.
Otros tipos de surfactantes: La combinación en la misma molécula de un
grupo con tendencia aniónica y de un grupo con tendencia catiónica produce un surfactante anfotérico, como por ejemplo los aminoácidos, las betainas o los fosfolípidos. Según el pH del medio una de las dos disociaciones prevalece.
Este tipo de surfactante se usa sólo en casos particulares debido a su alto costo.
Utilización de los Biosurfactantes Los contaminantes hidrofóbicos presentes en los
hidrocarburos del petróleo, suelos y aguas del medio ambiente requieren su solubilización antes de ser degradados por la célula microbiana.
Los surfactantes pueden aumentar el área de los materiales hidrofóbicos, como pesticidas en suelos y agua del medio, aumentándose así su solubilidad en agua.
La presencia de biosurfactantes puede aumentar la degradación microbiana de los contaminantes.
La habilidad de los biosurfactantes para emulsionar hidrocarburos mezclados con agua ha sido ampliamente divulgada.
Estas propiedades emulsionantes también se ha demostrado que favorecen la degradación de los hidrocarburos en el medio ambiente, por tanto los hacen muy útiles para el control de la contaminación por vertidos de aceites.
En la biorremediación en vertidos de petróleo, estudios recientes han mostrado que se puede utilizar el poder solubilizante de las micelas para extraer ciertas sustancias contaminantes aún cuando su concentración sea extremadamente baja.
Función de los biosurfactantes a la hora de aumentar la biodisponibilidad
Dispersar el petróleo aumentando la superficie de contacto.
Aumenta la biodisponibilidad de compuestos hidrofóbicos. Serían en este caso sobre todo los de bajo peso molecular.
Pueden ayudar a los microorganismos productores a desprenderse de las gotas de petróleo una vez se ha agotado la fuente de hidrocarburo que utilizaba.
Bacterias degradadoras de PD Achrornobacter Acinetobacter Actinomyces Alcaligenes Arthrobacter Bacillus Beneckea Brevebacterium Coryneformes Erwinia Flavobacterium Klebsiella
Lactobacillus Leumthrix Moraxella Nocardia Peptococcus Pseudomonas Sarcina Spherotilus Spirillum Streptomyces Vibrio Xanthomyces
Hongos degradadores de PD Allescheria Aspergillus Aureobasidium Botrytis Candida Cephalosporium Cladosporium Cunninghamella Debaromyces Fusarium Gonytrichum Hansenula Helmintrosporium
Mucor Oidiodendrum Paecylomyses Phialophora Penicillium Rhodosporidium Rhodotorula Saccharomyces Saccharomycopisis Scopulariopsis Sporobolomyces Torulopsis Trichoderma Trichosporon
También se ha reportado la utilización de dos especies de camarones en la biodegradación del petróleo, siendo estos Peanus duorarum y Peanus aztecuz cuya capacidad de degradar los hidrocarburos casi en su totalidad van desde los compuestos de 12 carbonos hasta los compuestos de 22 carbonos.
La cantidad y diversidad de los microorganismos degradadores de petróleo depende de la exposición de las aguas a estos hidrocarburos.
La velocidad de degradación de los compuestos presentes en el petróleo es como sigue:
HC saturados > aromáticos ligeros > aromáticos de alto PM > asfaltenos, resinas
PARTE PRÁCTICA
Muestra: 100 g de suelo contaminado
con PD
Tamizar
50g de tamizado
A
100 mL de caldo BH + 1% PD
10 mL de la muestra
enriquecida A100 mL de caldo BH
+ 2% PD
30 ºC x 72 hB
30 ºC x 72 h10 mL de la
muestra enriquecida
A
100 mL de caldo BH + 4% PD
30 ºC x 72 h
C
Tomar una alícuota de la
muestra enriquecida C
Agar BH + 4% PD
Sembrar
30 ºC x 48 h
Seleccionar y repicar 3 colonias
Incubar
> biomasa, > rapidez de crecimiento
Repicar
Agar BH + 4% de PD + TSA 30 ºC x 48 h
Conservar las cepas en refrigeración
Tiempo requerido para su utilización
Reactivar
5 mL caldo nutritivo
Incubar
30 ºC x 24 hCentrifugar
3500 rpm x 15 min.
Eliminar sobrenadante
Lavar sedimento con SSFE x 2 veces
consecutivas
Preparar suspensión al Tubo Nº 3 del NMF (9x108 cel/mL)
1 mL
Inocular de cada cepa en botellas
Realizar esto por cada cepa
10 mL caldo BH con 0.2 mL de resarzurina y 0.1 mL de
PD
Dejamos un tubo con medio no inoculado como testigo
Incubar a 30 ºC x 5 d. a agitación cte. (150 rpm)
Observar diariamente si cambia de azul a rosado
brillante
Como se usó púrpura de bromocresol veremos el cambio de color de lila a amarillo
Del inóculo preparado al Tubo Nº 3 del NMF
(9x108 cel/mL)1 mL
Inocular en tubos de dilución con 10 mL de
caldo Extracto de Levadura + 0.2 mL de etanol
30 ºC x 3 d. en agitación constante (150 rpm)
Incubar
Observar y diariamente formación de burbujas y turbidez del medio
Centrifugar cada uno de los tubos (2000 rpm)
Tomar el sobrenadante
(1mL)
9 mL caldo levadura etanol +
0.2 mL de PDTapamos
herméticamente
Agitamos 1 min. hasta lograr una emulsión
Calibramos a cero el espectrofotómetro con el tubo
blanco
Leer absorvancia a 540 nm
Realizar la conversión de la absorvancia de cada una de
las muestras a UAE
Considerar 0.816 de absorvancia como 1 UAE/mL
RESULTADOS
Tiempo requerido para la utilización del PD como fuente de carbono y energía
CEPADÍAS DE VIRAJE
COLOR DE VIRAJE
pH
Cepa 01 ---- ---- ----
Cepa 02 5 días Violeta ≥ 6.8
Cepa 03 12 días Amarillo ≤ 5.2
Cuantificación de las Unidades de Actividad Emulsificante
CEPA UAE
Cepa 01 1.281
Cepa 02 1.353
Cepa 03 1.561
Identificación de las cepas aisladas
CARACTERISTICAS CEPA 01 CEPA 02 CEPA 03
Morfología
Bacilos cortos, espora
central no deformante
Bacilos largos, delgados,
espora terminal no deformante
Bacilos medianos no esporulados
DisposiciónDe a dos o en
cadenas cortas
De a dos Aislados y de a dos
Tinción Gram Positivo Positivo Negativo
Catalasa Positivo Positivo Positivo
Crecimiento en caldoPelícula, turbidez y sedimento
Película, turbidez y sedimento
Película, turbidez y sedimento
Reducción de NO3-
O – F glucosa
Rojo de Metilo -
Voges Proskawer + + -Hidrólisis de almidón + + +
Indol - -
Caldo glucosa + +
Caldo maltosa + +
Hidrólisis de gelatina + +
Género Bacillus sp. Bacillus sp.Pseudomonas
sp.
GRACIAS POR SU ATENCIÓN