biochemj00482-0090 (1)
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Biochem. J . (1978) 173, 441-447 4 4 1 Printed i n Great Britain Evidence f o r a n Essential Arginine Recognition Site on Adenosine 3' : 5'-Cyclic Monophosphate-Dependent Protein Kinase of Rabbit Skeletal Muscle B y MASAFUMI MATSUO, CHING-HSIEN HUANG a n d LAURA C . HUANG Departments o f Biochemistry a n d Pharmacology, University o f Virginia School o f Medicine, Charlottesville, V A 22901, U.S.A. (Received 2 2 November 1977) O n t h e basis o f t h e chemical a n d structural features o f t h e amino acid sequences i n t h e vicinities o f phosphorylatable hydroxyamino acid residues i n several o f t h e well-known protein substrates- f o skeletal-muscle cyclic AMP-dependent protein kinase, it i s hypo- thesized that t h e phosphorylatable residue at position i a n d arginine residue a t position i - 3 o f these protein substrates a r e located o n a peptide turn o n t h e hydrophilic protein surface. It i s further hypothesized that there i s a n arginine-recognition site near the active centre o n t h e protein kinase. This site i s essential f o r t h e function o f cyclic AMP-dependent protein kinase, for, n o t only does it recognize specifically t he exposed arginine residue o f t h e protein substrate, but, more importantly, v ia t h e interaction with arginine-(i- 3 ) , i t may help t o steer t h e topologically adjacent serine-i into proper orientation o n t h e nearby active centre for phosphorylation. Model-building a n d kinetic data that provide support f o r t h e proposed hypotheses a r e presented. Cohen a n d co-workers have elegantly identified t h e primary amino acid sequences near t h e phos- phorylated sites in several o f t h e best protein sub- strates f o r skeletal-muscle cyclic AMP-dependent protein kinase (Yeaman et al., 1977; Cohen et al., 1977). O n inspection o f these sequences, some remarkable features o f t h e protein substrates sur- rounding t h e phosphorylated site a re revealed. ( 1 ) These authors note that t w o basic amino acids a re present on t h e N-terminal side of t h e phosphoryl- ated hydroxy amino acid (either serine o r threonine). More specifically, i f t h e residue i s designated a s t h e ith residue i n these sequences, arginine i s invariably found a t residue i - 3 in a l l substrates. (2) We further note that residues with marked hydrophobic character, such a s valine, leucine, isoleucine, phenylalanine a d tyrosine, a r e con- spicuously absent from t h e tetrapeptide sequence from arginine-(i-3) t o t h e phosphorylated i t h resi- d u e f o r t e great majority, although n o t all, o f t h e protein substrates. (3) Moreover, sequences that are well known t o form turns on t h e surface o f protein molecules (Lewis et al., 1971; Kuntz, 1972) ar e persistently found i n the tetrapeptide residues (i-3)-i f o r t h e great majority of t h e protein substrates. These a r e t h e u n - interrupted sequences o f three o r more of any com- bination o f glycine, proline, aspartate, glutamate, arginine, lysine, serine, threonine, histidine, aspara- gine, glutamine a n d tyrosine. Alanine i s included i f i t alone i s adjacent t o on e o f t h e above (Kuntz, 1972). * To whom reprint requests should b e addressed. Vol. 1 7 3 From t h e structural features given above, w e suggest t h e tentative hypothesis that t he hydroxy amino acid residue, i , i s characteristically located a t a peptide turn o n t he hydrophilic surface o f t h e pro- tein substrate, thus enabling i t s hydroxy group t o b e a s fully exposed a s possible t o t h e cyclic AMP- dependent protein kinase. W e further hypothesize that t he occurrence o f arginine-(i- 3 ) in t h e turn n o t only makes arginine available f o r possible binding of anionic groups b u t also contributes t o stabilization o f t h e turn. Implicit i n this hypothesis i s that, in close proximity t o t h e active centre of protein kinase, there i s a recognition site f t h e enzyme that binds t o t h e spatially e x - posed i n t h e protein substrates. Unfortunately, secondary o r tertiary structures i n t he best protein substrates f o r cyclic AMP-dependent protein kinase a s listed b y Cohen a n d co-workers (Cohen e t al., 1977) n o t y e t available, hence t h e proposed topological locations o f t h e functional groups o f arginine-(i- 3 ) a n d serine-i ( o r threonine-i) exposed simultaneously a t a peptide turn remain t o be verified. A seemingly favourable sequence does n o t always ensure that t h e peptide turn o r bend will occur. F o r instance, sequence Arg(21)-Gly-Tyr- Ser(24)-Leu-Gly o f t h e native lysozyme, b y inspec- tion, seems t o exhibit a l l t h e necessary features o f a protein substrate. However, serine-24 i s not a residue characteristically located a t a peptide turn i n t h e known secondary structure of native lysozyme (Kuntz, 1972), a n d i t i s partially buried i n t h e three- dimensional structure o f t h e protein; hence this seg- ment does n o t meet t h e sufficient condition t o serve
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7/27/2019 biochemj00482-0090 (1)
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B i o c h e m . J . ( 1 9 7 8 ) 1 7 3 , 4 4 1 - 4 4 7 4 4 1P r i n t e d i n G r e a t B r i t a i n
E v i d e n c e f o r a n E s s e n t i a l A r g i n i n e R e c o g n i t i o n S i t e o n A d e n o s i n e 3 ' : 5 ' - C y c l i cM o n o p h o s p h a t e - D e p e n d e n t P r o t e i n K i n a s e o f R a b b i t S k e l e t a l M u s c l e
By MASAFUMI MATSUO, CHING-HSIEN HUANG* a n d LAURA C . HUANGD e p a r t m e n t s o f B i o c h e m i s t r y a n d P h a r m a c o l o g y , U n i v e r s i t y o f V i r g i n i a S c h o o l o f M e d i c i n e , C h a r l o t t e s v i l l e ,VA 2 2 9 0 1 , U . S . A .
( R e c e i v e d 2 2 N o v e m b e r 1 9 7 7 )
On t h e b a s i s o f t h e c h e m i c a l a n d s t r u c t u r a l f e a t u r e s o f t h e a m i n o a c i d s e q u e n c e s i n t h e
v i c i n i t i e s o f p h o s p h o r y l a t a b l e h y d r o x y a m i n o a c i d r e s i d u e s i n s e v e r a l o f t h e w e l l - k n o w n
p r o t e i n s u b s t r a t e s - f o r s k e l e t a l - m u s c l e c y c l i c A M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e , i t i s h y p o -
t h e s i z e d t h a t t h e p h o s p h o r y l a t a b l e r e s i d u e a t p o s i t i o n i a n d a r g i n i n e r e s i d u e a t p o s i t i o ni - 3 o f t h e s e p r o t e i n s u b s t r a t e s a r e l o c a t e d o n a p e p t i d e t u r n o n t h e h y d r o p h i l i c p r o t e i ns u r f a c e . I t i s f u r t h e r h y p o t h e s i z e d t h a t t h e r e i s a n a r g i n i n e - r e c o g n i t i o n s i t e n e a r t h e a c t i v ec e n t r e o n t h e p r o t e i n k i n a s e . T h i s s i t e i s e s s e n t i a l f o r t h e f u n c t i o n o f c y c l i c A M P - d e p e n d e n tp r o t e i n k i n a s e , f o r , n o t o n l y d o e s i t r e c o g n i z e s p e c i f i c a l l y t h e e x p o s e d a r g i n i n e r e s i d u e o f
t h e p r o t e i n s u b s t r a t e , b u t , more i m p o r t a n t l y , v i a t h e i n t e r a c t i o n w i t h a r g i n i n e - ( i - 3 ) , i t
m ay h e l p t o s t e e r t h e t o p o l o g i c a l l y a d j a c e n t s e r i n e - i i n t o p r o p e r o r i e n t a t i o n on t h e n e a r b ya c t i v e c e n t r e f o r p h o s p h o r y l a t i o n . M o d e l - b u i l d i n g a n d k i n e t i c d a t a t h a t p r o v i d e s u p p o r t
f o r t h e p r o p o s e d h y p o t h e s e s a r e p r e s e n t e d .
C o h e n a n d c o - w o r k e r s h a v e e l e g a n t l y i d e n t i f i e dt h e p r i m a r y a m i n o a c i d se que nce s ne a r t h e p h o s -
p h o r y l a t e d s i t e s i n s e v e r a l o f t h e b e s t p r o t e i n s u b -
s t r a t e s f o r s k e l e t a l - m u s c l e c y c l i c A M P - d e p e n d e n tp r o t e i n k i n a s e (Yeaman e t a l . , 1 9 7 7 ; C o h e n e t a l . ,
1 9 7 7 ) . On i n s p e c t i o n o f t h e s e sequences, somer e m a r k a b l e f e a t u r e s o f t h e p r o t e i n s u b s t r a t e s sur-
r o u n d i n g t h e p h o s p h o r y l a t e d s i t e ar e r e v e a l e d .( 1 ) T h e s e a u t h o r s n o t e t h a t two b a s i c a m i n o a c i d s
ar e p r e s e n t on t h e N - t e r m i n a l s i d e o f t h e p h o s p h o r y l -
a t e d h y d r o x y a m i n o a c i d ( e i t h e r s e r i n e o r t h r e o n i n e ) .More s p e c i f i c a l l y , i f t h e p h o s p h o r y l a t e d r e s i d u e i sd e s i g n a t e d as t h e i t h r e s i d u e i n t h e s e sequences,
a r g i n i n e i s i n v a r i a b l y f o u n d a t r e s i d u e i - 3 i n a l ls u b s t r a t e s .
( 2 ) We f u r t h e r n o t e t h a t r e s i d u e s w i t h m a r k e dh y d r o p h o b i c c h a r a c t e r , s u c h as v a l i n e , l e u c i n e ,i s o l e u c i n e , p h e n y l a l a n i n e a n d t y r o s i n e , ar e con-
s p i c u o u s l y a b s e n t f r o m t h e t e t r a p e p t i d e sequence
f r o m a r g i n i n e - ( i - 3 ) t o t h e p h o s p h o r y l a t e d i t h r e s i -
d u e f o r t h e g r e a t m a j o r i t y , a l t h o u g h n o t a l l , o f t h e
p r o t e i n s u b s t r a t e s .( 3 ) M o r e o v e r , sequences t h a t ar e w e l l known t o
f o r m t u r n s on t h e s u r f a c e o f p r o t e i n m o l e c u l e s ( L e w i s
e t a l . , 1 9 7 1 ; K u n t z , 1 9 7 2 ) ar e p e r s i s t e n t l y f o u n d i nt h e t e t r a p e p t i d e r e s i d u e s ( i - 3 ) - i f o r t h e g r e a t
m a j o r i t y o f t h e p r o t e i n s u b s t r a t e s . T h e s e are t h e un-
i n t e r r u p t e d sequences o f t h r e e o r more o f any com-
b i n a t i o n o f g l y c i n e , p r o l i n e , a s p a r t a t e , g l u t a m a t e ,
a r g i n i n e , l y s i n e , s e r i n e , t h r e o n i n e , h i s t i d i n e , aspara-
g i n e , g l u t a m i n e a n d t y r o s i n e . A l a n i n e i s i n c l u d e d i fi t a l o n e i s a d j a c e n t t o o ne o f t h e a b o v e ( K u n t z , 1 9 7 2 ) .* To whom r e p r i n t r e q u e s t s s h o u l d b e a d d r e s s e d .
V o l . 1 7 3
From t h e s t r u c t u r a l f e a t u r e s g i v e n a b o v e , we
s u g g e s t t h e t e n t a t i v e h y p o t h e s i s t h a t t h e h y d r o x y
a m i n o a c i d r e s i d u e , i , i s c h a r a c t e r i s t i c a l l y l o c a t e d a ta p e p t i d e t u r n o n t h e h y d r o p h i l i c s u r f a c e o f t h e p r o -
t e i n s u b s t r a t e , t h u s e n a b l i n g i t s h y d r o x y g r o u p t o b e
a s f u l l y e x p o s e d a s p o s s i b l e t o t h e c y c l i c AMP-d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e .We f u r t h e r h y p o t h e s i z e t h a t t h e o c c u r r e n c e o f
a r g i n i n e - ( i - 3 ) i n t h e t u r n n o t o n l y m a k e s a r g i n i n ea v a i l a b l e f o r p o s s i b l e b i n d i n g o f a n i o n i c g r o u p s b u t
a l s o c o n t r i b u t e s t o s t a b i l i z a t i o n o f t h e t u r n . I m p l i c i ti n t h i s h y p o t h e s i s i s t h a t , i n c l o s e p r o x i m i t y t o t h ea c t i v e c e n t r e o f p r o t e i n k i n a s e , t h e r e i s a r e c o g n i t i o ns i t e o f t h e e n z y m e t h a t b i n d s t o t h e s p a t i a l l y e x -
p o s e d a r g i n i n e - ( i - 3 ) i n t h e p r o t e i n s u b s t r a t e s .U n f o r t u n a t e l y , s e c o n d a r y o r t e r t i a r y s t r u c t u r e s i n
t h e b e s t p r o t e i n s u b s t r a t e s f o r c y c l i c A M P - d e p e n d e n tp r o t e i n k i n a s e a s l i s t e d b y C o h e n a n d c o - w o r k e r s
( C o h e n e t a l . , 1 9 7 7 ) a r e n o t y e t a v a i l a b l e , h e n c e t h e
p r o p o s e d t o p o l o g i c a l l o c a t i o n s o f t h e f u n c t i o n a lg r o u p s o f a r g i n i n e - ( i - 3 ) a n d s e r i n e - i ( o r t h r e o n i n e - i )e x p o s e d s i m u l t a n e o u s l y a t a p e p t i d e t u r n r e m a i n t o
b e v e r i f i e d . A s e e m i n g l y f a v o u r a b l e s e q u e n c e d o e sn o t a l w a y s e n s u r e t h a t t h e p e p t i d e t u r n o r b e n d w i l lo c c u r . F o r i n s t a n c e , s e q u e n c e A r g ( 2 1 ) - G l y - T y r -S e r ( 2 4 ) - L e u - G l y o f t h e n a t i v e l y s o z y m e , b y i n s p e c -t i o n , s e e m s t o e x h i b i t a l l t h e n e c e s s a r y f e a t u r e s o f a
p r o t e i n s u b s t r a t e . H o w e v e r , s e r i n e - 2 4 i s n o t a r e s i d u ec h a r a c t e r i s t i c a l l y l o c a t e d a t a p e p t i d e t u r n i n t h ek n o w n s e c o n d a r y s t r u c t u r e o f n a t i v e l y s o z y m e
( K u n t z , 1 9 7 2 ) , a n d i t i s p a r t i a l l y b u r i e d i n t h e t h r e e -d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e o f t h e p r o t e i n ; h e n c e t h i s s e g -m e n t d o e s n o t m e e t t h e s u f f i c i e n t c o n d i t i o n t o s e r v e
7/27/2019 biochemj00482-0090 (1)
http://slidepdf.com/reader/full/biochemj00482-0090-1 2/7
M. MATSUO, C . HUANG AND L . C . HUANG
as a s u b s t r a t e . I n d e e d , i t h a s b e e n r e p o r t e d t h a t n a t i v el y s o z y m e c a n n o t b e p h o s p h o r y l a t e d b y p r o t e i n
k i n a s e ( B y l u n d & K r e b s , 1 9 7 5 ) . H o w e v e r , t h e syn-
t h e t i c f r a g m e n t A r g - ( l ) - G l y - T y r - S e r - ( 4 ) - L e u - G l yca n serve as a s u b s t r a t e f o r p r o t e i n k i n a s e , a l b e i t a
p o o r o ne (Kemp e t a l . , 1 9 7 6 ) , a n d t h e r e i s a muchg r e a t e r c h a n c e t h a t t h i s f r a g m e n t assum e s a f l - b e n dc o n f o r m a t i o n . I t i s w e l l known t h a t i n a q u e o u s s o l u -t i o n s m a l l o l i g o p e p t i d e s d o n o t r e a d i l y f o r m a - h e l i c e s ,a n d t h e r e i s a f i n i t e p r o b a b i l i t y o f occurrence o f f l -
b e n d s i n s m a l l o l i g o p e p t i d e s ( A n f i n s e n & S c h e r a g a ,
1 9 7 5 ) . I t i s t h e r e f o r e l i k e l y t h a t some o f t h e s y n t h e t i cf r a g m e n t s may h a v e t h e i r a r g i n i n e - l a n d s e r i n e - 4f u n c t i o n a l gr o ups s i m u l t a n e o u s l y e x p o s e d i n c l o s ep r o x i m i t y on f l - b e n d s , r e n d e r i n g t h e m more suscep-
t i b l e t o r e c o g n i t i o n a n d p h o s p h o r y l a t i o n b y p r o t e i nk i n a s e t h a n i n t h e n a t i v e l y s o z y m e .
The a s s u m p t i o n t h a t t h e g u a n i d i n i u m i o n o f
a r g i n i n e - ( i - 3 ) i n p r o t e i n s u b s t r a t e s may b e s p e c i f i c -a l l y i n v o l v e d i n s t a b i l i z i n g i n t e r a c t i o n s w i t h t h e
r e c o g n i t i o n s i t e o f c y c l i c A M P - d e p e n d e n t p r o t e i n
k i n a s e can b e t e s t e d e x p e r i m e n t a l l y . I n t h e p r e s e n t
paper, e x p e r i m e n t s w e r e d e s i g n e d t o assess t h e e f f e c to f p o l y a r g i n i n e on t h e e n z y m i c a c t i v i t i e s o f c y c l i cA M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e a n d i t s c a t a l y t i c s u b -
u n i t i s o l a t e d f r o m r a b b i t s k e l e t a l m u s c l e . We f o u n d
t h a t p o l y a r g i n i n e , b u t n o t p o l y l y s i n e , h a s a p r o f o u n d
i n h i b i t o r y e f f e c t on t h e p r o t e i n k i n a s e a c t i v i t y , sug-
g e s t i n g t h a t t h e e n z y m e may i n d e e d h a v e a r e c o g n i -t i o n s i t e f o r t h e p r o t e i n s u b s t r a t e a n d t h a t t h e
r e c o g n i t i o n s i t e can b e b l o c k e d c o m p e t i t i v e l y b y
p o l y a r g i n i n e .
E x p e r i m e n t a l
M a t e r i a l s
D E A E - c e l l u l o s e ( D E - 5 2 ) a n d C M - c e l l u l o s e (CM-
5 2 ) w e r e p u r c h a s e d f r o m Whatman, C l i f t o n , N J ,
U . S . A . S e p h a d e x G - 1 0 0 was p u r c h a s e d f r o m P h a r -
m a c i a F i n e C h e m i c a l s , P i s c a t a w a y , N J , U . S . A . Two
b a t c h e s o f p o l y - L - a r g i n i n e h y d r o c h l o r i d e w e r e u s e d :
o ne ( m o l . w t . 1 0 0 0 0 - 2 0 0 0 0 ; c o n t r o lno . 1 2 5 4 6 ) was
o b t a i n e d f r o m U n i t e d S t a t e s B i o c h e m i c a l C o r p . ,
C l e v e l a n d , OH, U . S . A . , a n d t h e o t h e r ( t y p e V B ;
m o l . w t . 1 5 0 0 0 - 5 0 0 0 0 ) f r o m S i g m a , S t . L o u i s , MO,
U . S . A . P o l y - L - l y s i n e h y d r o b r o m i d e ( t y p e V ; m o l . w t .
2 5 0 0 0 ; l o t no . 2 6 C - 5 0 0 5 1 ) a n d h i s t o n e t y p e I I A were
p u r c h a s e d f r o m S i g m a . P o l y - L - g l u t a m i c a c i d ( m o l . w t .
4 1 0 0 ; l o t no . 6 0 2 ) a n d p o l y - L - a s p a r t i c a c i d ( m o l . w t .
4 2 6 0 ; l o t no . A S 4 3 ) w e r e p u r c h a s e d f r o m M i l e s -
Y e d a , R e h o v o t , I s r a e l . A l l t h e p o l y - ( L - a m i n o a c i d )s o l u t i o n s w e r e a d j u s t e d t o pH 7 . 0 b e f o r e use.
" P i was p u r c h a s e d f r o m Ne w E n g l a n d N u c l e a r
C o r p . , B o s t o n , MA, U . S . A . , a n d u s e d t o p r ep a r e
[ y - 3 2 P ] A T P b y t h e m e t h o d o f G l y n n & C h a p p e l l( 1 9 6 4 ) .
P u r i f i c a t i o n o f c y c l i c A M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e
a n d i t s c a t a l y t i c s u b u n i t
T h e c y c l i c A M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e ( t y p e I )w a s p u r i f i e d f r o m r a b b i t s k e l e t a l m u s c l e a s d e s c r i b e dp r e v i o u s l y ( H u a n g & H u a n g , 1 9 7 5 ) . T h e c a t a l y t i cs u b u n i t o f t h e c y c l i c A M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e( t y p e I ) w a s p r e p a r e d b y t h e m e t h o d o f B e c h t e l e t a l .
( 1 9 7 7 ) w i t h t h e f o l l o w i n g m i n o r m o d i f i c a t i o n . T h e
f r e s h r a b b i t s k e l e t a l m u s c l e w a s h o m o g e n i z e d w i t h
2 . 5 v o l . o f 1 O m M - p o t a s s i u m p h o s p h a t e b u f f e r , pH 7 . 2 ,c o n t a i n i n g 4mM-EDTA a n d 6 m m - m e r c a p t o e t h a n o l .A f t e r t h e h o m o g e n a t e w a s c e n t r i f u g e d a t 7 0 0 0 g
f o r 3 0 m i n , t h e s u p e r n a t a n t w a s f r a c t i o n a t e d b y
( N H 4 ) 2 S O 4 ( 5 0 % - s a t u r a t e d ) . T h e r e s u l t a n t p r e c i p i t a t ew a s d i s s o l v e d i n 1 O m M - P i p e s ( 1 , 4 - p i p e r a z i n e d i e t h a n e -s u l p h o n i c a c i d ) b u f f e r , pH 7 . 0 , c o n t a i n i n g 2mM-EDTAa n d 1 5 m M - m e r c a p t o e t h a n o l , a n d d i a l y s e d a g a i n s t2 x
1 O v o l .o f
t h es a m e b u f f e r . T h e d i a l y s e d e n z y m e
w a s c e n t r i f u g e d a t 7 8 0 0 0 g f o r 2 h , t h e n t h e s u p e r -
n a t a n t w a s a p p l i e d t o a D E A E - c e l l u l o s e i o n - e x c h a n g e
c o l u m n ( 8 c m x 3 0 c m ) . T h e c y c l i c A M P - d e p e n d e n tp r o t e i n k i n a s e ( p e a k I ) w a s t h e n e l u t e d w i t h 1 0 0 m M -
N a C l i n t h e s a m e b u f f e r . T h e s u b s e q u e n t s t e p s w e r e
i d e n t i c a l w i t h t h o s e d e s c r i b e d b y B e c h t e l e t a l . ( 1 9 7 7 ) .
A s s a y o f p r o t e i n k i n a s e a c t i v i t y
P r o t e i n k i n a s e a c t i v i t y w a s a s s a y e d r a d i o i s o t o p i c -a l l y a s d e s c r i b e d e l s e w h e r e ( H u a n g & H u a n g , 1 9 7 5 ) .T h e a s s a y s o l u t i o n ( t o t a l v o l u m e 9 0 , u l ) c o n t a i n e d :
g l y c y l g l y c i n e b u f f e r , 5 , u m o l , pH 7 . 0 ; M g C I 2 , 0 . 5 , u m o l ;h i s t o n e t y p e I I A , 0 . 0 5 m g ; [ y - 3 2 P ] A T P , 3 n m o l
( s p e c i f i c r a d i o a c t i v i t y 5 0 - 1 0 0 c . p . m . / p m o l ) ; c y c l i cAMP, 0 . 1 n m o l w h e n a d d e d ; p o l y ( a m i n o a c i d ) a tv a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s a s s t a t e d i n t h e r e l e v a n tF i g u r e l e g e n d . T h e e n z y m i c r e a c t i o n w a s i n i t i a t e d b y
a d d i n g a p o r t i o n ( l O , u l ) o f p u r i f i e d p r o t e i n k i n a s e .A f t e r i n c u b a t i o n a t 3 0 ° C f o r 1 0 m i n , 7 5 u l 1 o f t h e
r e a c t i o n m i x t u r e w a s s p o t t e d o n a p i e c e o f f i l t e r p a p e r .
T h e p a p e r w a s t h e n w a s h e d i n 10% ( w / v ) t r i c h l o r o -a c e t i c a c i d a n d c o u n t e d f o r r a d i o a c t i v i t y ( 3 2 P ) a s
p r e v i o u s l y d e s c r i b e d . T h e r e a c t i o n o f p r o t e i n k i n a s e
w i t h p o l y - ( L - a m i n o a c i d s ) w a s f i r s t c a r r i e d o u t a tr o o m t e m p e r a t u r e ( a b o u t 2 3 ° C ) f o r 1 0 m i n .
O t h e r m e t h o d s
P u r i t y o f t h e e n z y m e p r e p a r a t i o n w a s c h e c k e d b y
p o l y a c r y l a m i d e - g e l e l e c t r o p h o r e s i s a s d e s c r i b e dp r e v i o u s l y ( H u a n g & H u a n g , 1 9 7 5 ) . P r o t e i n c o n c e n -
t r a t i o n w a s d e t e r m i n e d b y t h e m e t h o d o f L o w r y e ta l . ( 1 9 5 1 ) , w i t h a l b u m i n a s s t a n d a r d .
R e s u l t s
T h e c y c l i c A M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e a n d i t sc a t a l y t i c - s u b u n i t p r e p a r a t i o n s w e r e h i g h l y p u r i f i e d a s
1 9 7 8
4 4 2
7/27/2019 biochemj00482-0090 (1)
http://slidepdf.com/reader/full/biochemj00482-0090-1 3/7
ARGININE-RECOGNITION S I T E ON PROTEIN KINASE
j u d g e d b y p o l y a c r y l a m i d e - g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( H u a n g& H u a n g , 1 9 7 5 ) . T h e p o s i t i o n o f t h e e n z y m e a c t i v i t yo n t h e p o l y a c r y l a m i d e g e l w a s i d e n t i c a l w i t h t h ep r o t e i n p o s i t i o n d e t e c t e d b y s t a i n i n g w i t h C o o m a s s i eB l u e i n a d u p l i c a t e g e l ( H u a n g & H u a n g , 1 9 7 5 ) . T h ep o l y p e p t i d e c h a i n s o f
t h eh o l o e n z y m e d e t e r m i n e d b y
s o d i u m d o d e c y l s u l p h a t e / p o l y a c r y l a m i d e - g e l e l e c t r o -p h o r e s i s w e r e f o u n d t o h a v e m o l . w t s . 4 9 0 0 0 a n d4 1 0 0 0 , c o r r e s p o n d i n g t o t h e i n h i b i t o r y a n d t h e
c a t a l y t i c s u b u n i t r e s p e c t i v e l y ( H o p p e & W a g n e r ,1 9 7 7 ) . T h e c a t a l y t i c - s u b u n i t p r e p a r a t i o n s h o w e do n l y o n e b a n d a f t e r s o d i u m d o d e c y l s u l p h a t e /p o l y a c r y l a m i d e - g e l e l e c t r o p h o r e s i s , o f m o l . w t .
4 1 0 0 0 .
T h e i n c o r p o r a t i o n o f r a d i o a c t i v i t y f r o m [ y _ 3 2 p ] _ATP i n t o t h e p r o t e i n s u b s t r a t e ( h i s t o n e I I A ) w a sl i n e a r w i t h t i m e a n d w i t h t h e e n z y m e c o n c e n t r a t i o n
u p t o t h e p r o d u c t i o n o f a t l e a s t I l O p m o l o f 3 2 p _
l a b e l l e d h i s t o n e .
R e a c t i o n o f p o l y a r g i n i n e a n d p o l y l y s i n e w i t h p r o t e i nk i n a s e
A d d i t i o n s o f p o l y a r g i n i n e t o a c y c l i c AMP-d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e r e s u l t e d i n b o t h i n a c t i v a -t i o n o f t h e e n z y m e a n d a c o n v e r s i o n o f t h e e n z y m ef r o m a c y c l i c A M P - d e p e n d e n t f o r m i n t o a n i n d e p e n -d e n t f o r m . I n c o n t r a s t , p o l y l y s i n e c a u s e s p r i m a r i l yt h e c o n v e r s i o n ( T a b l e 1 ) . S i m i l a r l y t o t h e e f f e c t o fp r o t a m i n e ( M i y a m o t o e t a l . , 1 9 7 3 ) , t h e o b s e r v a t i o n
t h a t t h e c y c l i c A M P - d e p e n d e n c e o f t h e h o l o e n z y m ei s a b o l i s h e d o n a d d i t i o n o f p o l y a r g i n i n e o r p o l y -l y s i n e p r e s u m a b l y r e f l e c t s t h e d i s s o c i a t i o n o f c y c l i cA M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e b y t h e p o l y ( b a s i ca m i n o a c i d ) . To s i m p l i f y o u r s t u d i e s o f t h e e f f e c t o ft h e p o l y ( a m i n o a c i d ) o n e n z y m i c a c t i v i t y a n d t oa v o i d p o s s i b l e c o m p l i c a t i o n s c a u s e d b y t h e i n h i b i t o r ys u b u n i t , s u b s e q u e n t s t u d i e s w e r e c a r r i e d o u t w i t ht h e p u r i f i e d c a t a l y t i c s u b u n i t o f t h e c y c l i c AMP-d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e .
T h e a c t i v i t y o f t h e c a t a l y t i c s u b u n i t w a s o b s e r v e dt o d e c r e a s e w i t h i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n o f p o l y -a r g i n i n e a d d e d , a n d t h e i n h i b i t i o n w a s u n c h a n g e d
w h e n a d i f f e r e n t b a t c h o f p o l y a r g i n i n e w a s u s e d . I nc o n t r a s t w i t h t h e d r a m a t i c i n h i b i t o r y e f f e c t o f p o l y -a r g i n i n e , t h e c a t a l y t i c - s u b u n i t a c t i v i t y w a s n o ti n h i b i t e d b y p o l y l y s i n e ( F i g . 1 ) . T h e s e r e s u l t s s u g g e s tt h a t p o l y a r g i n i n e may r e a c t s p e c i f i c a l l y w i t h t h ec a t a l y t i c s u b u n i t .
T a b l e 1 . E f f e c t s o f p o l y a r g i n i n e a n d p o l y l y s i n e o n t h ee n z y m i c a c t i v i t y o f p r o t e i n k i n a s e a s s a y e d i n t h e p r e s e n c e
a n d a b s e n c e o f c y c l i c AMPP u r i f i e d c y c l i c A M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e ( 4 0 , u g /m l i n 0 . 1 M - g l y c y l g l y c i n e , p H 7 . 0 ) w a s p r e i n c u b a t e dw i t h v a r i o u s a m o u n t s o f p o l y a r g i n i n e ( l o t 1 2 5 4 6 ) o r
p o l y l y s i n e , g i v e n i n t h e f i r s t c o l u m n , a t r o o m t e m -p e r a t u r e f o r 1 0 m i n . A p o r t i o n ( l O p l ) o f t h e p r e i n c u -b a t e d e n z y m e w a s t h e n a d d e d t o t h e a s s a y m i x t u r ef o r m e a s u r i n g t h e e n z y m i c a c t i v i t y i n t h e p r e s e n c e a n da b s e n c e o f c y c l i c AMP u n d e r t h e a s s a y c o n d i t i o nd e s c r i b e d i n t h e E x p e r i m e n t a l s e c t i o n . T h e e n z y m i ca c t i v i t y , g i v e n i n c o l u m n s 2 - 5 , i s e x p r e s s e d a s p m o lo f 3 2 p i n c o r p o r a t e d i n t o h i s t o n e / l O m i n . T h e f i n a lp o l y a r g i n i n e o r p o l y l y s i n e c o n c e n t r a t i o n i n t h e a s s a ym i x t u r e i s o n e - n i n t h o f t h a t i n t h e p r e i n c u b a t i o nm i x t u r e .
A c t i v i t y
P o l y ( a m i n o a c i d )c o n c e n t r a t i o n
( p g / m l )06
3 01 0 0
3 0 04 0 0
P o l y a r g i n i n e P o l y l y s i n e
- C y c l i c + C y c l i c - C y c l i c + C y c l i cAMP AMP AMP AMP
1 . 9 5 3 1 . 9 5 39 4 7 2 8 4 9
4 3 3 6 3 4 4 24 4 4 3 3 9 4 72 3 2 0 5 0 4 41 4 1 0 5 0 4 5
0 1 0 20 30 4 0
C o n c e n t r a t i o n o f p o l y ( a m i n o a c i d ) ( p g / m l )
F i g . 1 . E f f e c t o f p o l y a r g i n i n e ( 0 ) a n d p o l y l y s i n e ( 0 ) o np r o t e i n k i n a s e a c t i v i t y
A c t i v i t y w a s m e a s u r e d b y t h e m e t h o d d e s c r i b e d i nt h e t e x t .
P o l y a r g i n i n e i n h i b i t i o n
I f p o l y a r g i n i n e h a s m u l t i p l e b i n d i n g s i t e s t h a ti n t e r a c t w i t h M g A T P 2 - , a s u b s t r a t e f o r p r o t e i nk i n a s e , o n e w o u l d e x p e c t t h a t a l e s s e r a m o u n t o f t h e
s u b s t r a t ew o u l d b e
a v a i l a b l e t o t h e e n z y m e f o rc a t a l y s i s w h e n p o l y a r g i n i n e i s a d d e d , a n d h e n c e l e s s
V o l . 1 7 3
r a d i o a c t i v e p r o d u c t w o u l d r e s u l t . K i n e t i c a l l y t h i st y p e o f i n t e r a c t i o n
Kp
P o l y a r g i n i n e MgATP2 p o l y a r g i n i n e + MgATP2
K A+ E n z y m e = MgATP2 * E n z y m e - * E + p r o d u c t
4 4 3
7/27/2019 biochemj00482-0090 (1)
http://slidepdf.com/reader/full/biochemj00482-0090-1 4/7
M. MATSUO, C . HUANG AND L . C . HUANG
w o u l d l e a d t o t h e f o l l o w i n g c o m p e t i t i v e L i n e w e a v e r -B u r k t y p e e q u a t i o n :
-=-Vt ( 1 + [ p o l y a r g i n i n e ] [ M g A T P 2 j -
w h e r e V i s t h e maximum v e l o c i t y , a n d K t h e d i s -s o c i a t i o n c o n s t a n t . I n t h e p r e s e n c e o f v a r i o u s f i x e dc o n c e n t r a t i o n s o f p o l y a r g i n i n e , d o u b l e - r e c i p r o c a lp l o t s o f i n i t i a l - v e l o c i t y d a t a f o r M g A T P 2 - , s h o w n i nF i g . 2 ( a ) , c l e a r l y d e m o n s t r a t e d t h a t t h e p o l y a r g i n i n ei s n o n - c o m p e t i t i v e w i t h r e s p e c t t o M g A T P 2 - . T h i s
k i n e t i c b e h a v i o u r i s o b v i o u s l y n o t c o m p a t i b l e w i t ht h e s i m p l e a s s u m p t i o n t h a t p o l y a r g i n i n e i n t e r a c t ss p e c i f i c a l l y w i t h M g A T P 2 - . H o w e v e r , t h e n o n -
c o m p e t i t i v e p a t t e r n d o e s i m p l y t h a t p o l y a r g i n i n e a n dMgATP2- b i n d t o s e p a r a t e s i t e s o n t h e c a t a l y t i c
1 5
1 0
1-1
1
dt - it ;
z
b 5
( a )
A
I
-100 0 10 0 20 0 300 400 500 600 700
1 / [ M g A T P 2 - 1 (mM-)
K 5
i ' 4
-. 3
2
( b )
0 0 . 0 2 0 . 0 4 0 . 0 6
1 / 1 H i s t o n e l [ ( , u g / m l ) - ' IF i g . 2 . L i n e w e a v e r - B u r k p l o t s o f i n i t i a l v e l o c i t y v e r s u s( a ) [ M g A T P 2 - ] a t a f i x e d h i s t o n e c o n c e n t r a t i o n ( 0 . 5 5 m g /m l ) a n d ( b ) [ h i s t o n e ] a t a f i x e d c o n c e n t r a t i o n o f MgATP2-
( 3 3 n m o l f m l )P o l y a r g i n i n e w a s a d d e d a s f o l l o w s : ( a ) 0 , O j u g / m l ;A , 2 . 5 p g / m l ; E l , 0 j u g / m l ; ( b ) 0 , O j u g / m l ; A , 2 . 5 , g / m l ;
U , 5 , u g / m l .
s u b u n i t a n d t h a t MgATP2- c a n n o t d o n a t e i t s y -p h o s p h a t e g r o u p a t t h e a c t i v e c e n t r e w h e n p o l y -
a r g i n i n e i s b o u n d t o t h e o t h e r s i t e .I f p o l y a r g i n i n e , o n t h e o t h e r h a n d , i n t e r a c t s
s p e c i f i c a l l y w i t h t h e r e c o g n i t i o n s i t e o f t h e e n z y m e ,
w h i c h p r e s u m a b l y l i e s n e a r t h e a c t i v e c e n t r e o f t h e
e n z y m e , a s p o s t u l a t e d i n t h e i n t r o d u c t i o n , p o l y -
a r g i n i n e a n d t h e p r o t e i n s u b s t r a t e w i t h known A r g -X - Y - S e r s e q u e n c e w o u l d t h e n c o m p e t e f o r t h e s a m er e c o g n i t i o n s i t e o f t h e e n z y m e , a n d c o n s e q u e n t l y
c o m p e t i t i v e - t y p e k i n e t i c s w o u l d b e e x p e c t e d . D o u b l e -r e c i p r o c a l p l o t s o f i n i t i a l - v e l o c i t y d a t a f o r h i s t o n e ,s h o w n i n F i g . 2 ( b ) , a t v a r i o u s f i x e d c o n c e n t r a t i o n s o f
p o l y a r g i n i n e i n d i c a t e d t h a t p o l y a r g i n i n e i s i n d e e d
c o m p e t i t i v e w i t h r e s p e c t t o h i s t o n e . T h i s k i n e t i cb e h a v i o u r i s i n c o m p l e t e a c c o r d w i t h o u r h y p o t h e s i s
t h a t t h e r e c o g n i t i o n s i t e l i e s n e a r t h e p h o s p h o r y l a t i o ns i t e o f t h e e n z y m e a n d i s s p e c i f i c f o r i n t e r a c t i o n w i t h
a n a r g i n i n e r e s i d u e o f t h e s u b s t r a t e . V a r i o u s k i n e t i cp a r a m e t e r s c a l c u l a t e d f r o m s e c o n d a r y p l o t s o f F i g . 2
a r e g i v e n i n T a b l e 2 .
S u b s t r a t e i n t e r a c t i o n w i t h p o l y g l u t a m a t e o r p o l y -a s p a r t a t e
I f o u r h y p o t h e s i s t h a t t h e a r g i n i n e r e s i d u e n e a r t h e
p o t e n t i a l p h o s p h o r y l a t a b l e s i t e o f t h e p r o t e i n s u b -
s t r a t e i s s p a t i a l l y e x p o s e d a t a p e p t i d e t u r n on t h e
p r o t e i n s u r f a c e i s a r e a s o n a b l e o n e , t h e n t h e p r o t e i ns u b s t r a t e c a n b e e x p e c t e d t o i n t e r a c t w i t h p o l y -g l u t a m a t e s o r p o l y a s p a r t a t e s v i a i t s e x p o s e d a r g i n i n e
r e s i d u e . S u c h c o m p l e x - f o r m a t i o n i n t h e r e a c t i o ns e q u e n c e s
P o l y g l u t a m a t e *h i s t o n e - p o l y g l u t a m a t e +
h i s t o n e + enzyme = e n z y m e*h i s t o n e -E+ p r o d u c t
w o u l d l e a d t o a c o m p e t i t i v e L i n e w e a v e r - B u r k - t y p ee q u a t i o n t h a t i s v e r y s i m i l a r t o t h a t d e s c r i b e da b o v e f o r t h e p o s s i b l e p o l y a r g i n i n e MgATP2-
T a b l e 2 . A p p a r e n t k i n e t i c c o n s t a n t s a s s o c i a t e d w i t h
p o l y ( a m i n o a c i d ) i n h i b i t i o n o f t h e r e a c t i o n c a t a l y s e d b y t h ec a t a l y t i c s u b u n i t o f p r o t e i n k i n a s eT h e d a t a w e r e c a l c u l a t e d f r o m t h e s l o p e s o f L i n e -w e a v e r - B u r k p l o t s w h i c h s h o w c o m p e t i t i v e a n d n o n -c o m p e t i t i v e i n h i b i t o r s a s s h o w n i n F i g s . 2 a n d 3v e r s u s i n h i b i t o r c o n c e n t r a t i o n . E r r o r s a r e a b o u t 1 0 % .
V a r i a b l eI n h i b i t o r s u b s t r a t e
P o l y a r g i n i n e ATPH i s t o n e
P o l y g l u t a m a t e ATPH i s t o n e
P o l y a s p a r t a t e ATP
H i s t o n e
F i x e ds u b s t r a t e
H i s t o n eATP
H i s t o n eATP
H i s t o n e
ATP
K , ( p g / m l )2 . 43 . 7
3 0 . 0
2 0 . 5
3 3 . 3
1 3 . 9
1 9 7 8
4 4 4
7/27/2019 biochemj00482-0090 (1)
http://slidepdf.com/reader/full/biochemj00482-0090-1 5/7
ARGININE-RECOGNITION S I T E ON PROTEIN KINASE
7
4
C)
- 3z
' b2
7
6
5
7
4C )
zJ
° 2
( a )
0 . 0 2 0 . 0 4
l / [ H i s t o n e l l ( , u g / m l ) - ' I
0 . 0 6
( b )
a
0
10 0 20 01 / [ M g A T P 2 - 1 (mM-')
F i g . 3 . L i n e w e a v e r - B u r k p l o t s o f i n i t i a l v e l o c i t y versus ( a )h i s t o n e a t a f i x e d c o n c e n t r a t i o n o f [ M g A T P 2 - ] ( 3 3 n m o l /
m l ) a n d ( b ) [ M g A T P 2 - ] a t a f i x e d h i s t o n e c o n c e n t r a t i o n
( 0 . 5 5 m g / m l )P o l y g l u t a m a t e was a d d e d as f o l l o w s : ( a ) 0, O u g / m l ;
A-, 1 2 . 5 p g / m i ; a l , 2 5 , p g / m l ; ( b ) 0, O p g / m l ; A, 2 0 , p g /m l ; l , 4 0 , p g / m l .
c o m p l e x - f o r m a t i o n . The i n h i b i t i o n p a t t e r n f o r p o l y -
g l u t a m a t e a g a i n s t h i s t o n e i s s h o w n i n F i g . 3 ( a ) . As i m i l a r p a t t e r n i s a l s o o b s e r v e d f o r p o l y a s p a r t a t e .
T h e s e r e c i p r o c a l p l o t s i n d i c a t e t h a t t h e s e p o l y p e p -t i d e s f u n c t i o n as l i n e a r c o m p e t i t i v e i n h i b i t o r s w i t h
r e s p e c t t o h i s t o n e . S e c o n d a r y s l o p e p l o t s ar e l i n e a ra n d t h e v a l u e s f o r K i , , p e ar e g i v e n i n T a b l e 2 . T h e s e
c o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n s w i t h r e s p e c t t o h i s t o n e ar e
c o n s i s t e n t w i t h o ur a s s u m p t i o n t h a t an a r g i n i n e
r e s i d u e i s l o c a t e d on t h e s u r f a c e o f t h e p r o t e i n s u b -
s t r a t e ; m o r e o v e r , i t i s e s s e n t i a l f o r t h e e n z y m i c
a c t i v i t y .I n v e s t i g a t i o n s w e r e a l s o made o f t h e i n h i b i t i o n b y
p o l y g l u t a m a t e a n d p o l y a s p a r t a t e when t h e concen-
t r a t i o n o f MgATP2- was v a r i e d . R e s u l t s i n d i c a t et h a t t h e s e p o l y p e p t i d e s are n o n - c o m p e t i t i v e i n h i b i -t o r s w i t h r e s p e c t t o MgATP2- ( F i g . 3 b ) .
V o l . 1 7 3
D i s c u s s i o n
T h e c y c l i c A M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e i nm a m m a l i a n t i s s u e a p p e a r s a t p r e s e n t t o b e a s p e c i f i ce n z y m e t h r o u g h w h i c h c y c l i c AMP c a r r i e s o u t i t sf u n c t i o n a s a u b i q u i t o u s ' s e c o n d m e s s e n g e r ' i n r e s -
p o n s e t o h o r m o n a l s t i m u l i . I n t h e h o r m o n a l r e g u l a -t i o n o f g l y c o g e n m e t a b o l i s m i n s k e l e t a l m u s c l e , f o ri n s t a n c e , c y c l i c A M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e
c a t a l y s e s t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f p h o s p h o r y l a s e
k i n a s e , g l y c o g e n s y n t h a s e a n d p h o s p h o p r o t e i n p h o s -p h a t a s e I I I i n h i b i t o r I b y t r a n s f e r r i n g t h e t e r m i n a l
p h o s p h a t e g r o u p o f MgATP2- t o s e r i n e o r t h r e o n i n e
r e s i d u e s o f t h e s e e n z y m e s o r p r o t e i n s . T h e a m i n o a c i d
s e q u e n c e a t t h e p h o s p h o r y l a t e d s i t e o f some o f t h e s ee n z y m e s a n d p r o t e i n s i n v o l v e d i n g l y c o g e n m e t a -
b o l i s m a n d o t h e r p r o t e i n s h a s b e e n d o c u m e n t e d
( C o h e n e t a l . , 1 9 7 7 ) . Of p a r t i c u l a r i n t e r e s t i n t h e s es e q u e n c e s t u d i e s i s t h e o b s e r v a t i o n t h a t a n a r g i n i n er e s i d u e i s a l w a y s f o u n d a t t h e t h i r d r e s i d u e f r o m t h eN - t e r m i n a l s i d e o f t h e p h o s p h o r y l a t e d s i t e . T h i s
s p e c i f i c l o c a t i o n r a i s e s t h e q u e s t i o n o f t h e m o l e c u l a r
b a s i s f o r t h e i m p o r t a n c e o f t h i s a r g i n i n e r e s i d u e .On t h e b a s i s o f t h e c o m m on c h e m i c a l a n d s t r u c -
t u r a l f e a t u r e s o f t h e a m i n o a c i d s e q u e n c e a t t h e s i t eo f p h o s p h o r y l a t i o n , we p r o p o s e t h a t t h e s p e c i f i ca r g i n i n e r e s i d u e a n d t h e s e r i n e ( o r t h r e o n i n e ) r e s i d u ea r e l o c a t e d a t p e p t i d e t u r n s o n t h e s u r f a c e o f t h e
p r o t e i n s u b s t r a t e . One s u c h t u r n , a t y p e - I f - b e n d
( V e n k a t a c h a l a m , 1 9 6 8 ) , i s s h o w n d i a g r a m m a t i c a l l y i nF i g . 4 . S e r i n e - i a n d a r g i n i n e - ( i - 3 ) r e s i d u e s a r e i n
s p a t i a l p r o x i m i t y t o e a c h o t h e r . I n f a c t , t h e m a i n -c h a i n g e o m e t r y o f t h e f l - b e n d i s f i x e d i n s u c h a wayt h a t t h e b a c k b o n e a m i d e -NH g r o u p o f s e r i n e - i f o r m sa h y d r o g e n b o n d w i t h t h e b a c k b o n e a m i d e C=Og r o u p o f a r g i n i n e - ( i - 3 ) ; m o r e o v e r , t h e a l i p h a t i ch y d r o x y o x y g e n o f s e r i n e - i m ay a l s o f o r m a h y d r o g e nb o n d w i t h t h e -NH g r o u p o f t h e g u a n i d i n i u m i o n o f
a r g i n i n e - ( i - 3 ) .E x a m i n a t i o n s o f P a u l i n g - C o r e y - K o l t u n m o d e l s
o f t h e t y p e - I f l - b e n d s t r u c t u r e o f A r g - ( i - 3 ) - X - Y -
S e r - i s u g g e s t t h a t a h y d r o g e n b o n d b e t w e e n t h e s i d ec h a i n s o f a r g i n i n e - ( i - 3 ) a n d s e r i n e - i c a n b e a c h i e v e d
m o s t r e a d i l y i f a n o t h e r a r g i n i n e r e s i d u e i s l o c a t e d a t
t h e X p o s i t i o n o r t h e ( i - 4 ) p o s i t i o n . T h i s i s d u e t o t h ef a c t t h a t t h e p o s i t i v e c h a r g e o f g u a n i d i n i u m i o n i smuch m o r e d e l o c a l i z e d t h a n t h e c h a r g e o n t h e
p r i m a r y a m i n e g r o u p o f l y s i n e . H e n c e e l e c t r o s t a t i cr e p u l s i o n s b e t w e e n t h e t w o a d j a c e n t g u a n i d i n i u mi o n s w i l l s h i f t t h e s i d e c h a i n o f a r g i n i n e - ( i - 3 ) c l o s e rt o t h e s i d e c h a i n o f s e r i n e - i a n d t h u s h a v e t h e e f f e c to f b r i n g i n g t h e -NH g r o u p o f g u a n i d i n i u m i o n a n dt h e o x y g e n atom o f t h e h y d r o x y g r o u p i n t o c l o s ep r o x i m i t y , a l l o w i n g f o r s t a b l e h y d r o g e n - b o n d i n g .From s i m i l a r e l e c t r o s t a t i c r e a s o n i n g , t h e s e q u e n c e
A r g - L y s - Y - S e r w i l l h a v e a h i g h e r p r o b a b i l i t y o f
o c c u r r e n c e o f a f l - b e n d t h a n A r g - N - Y - S e r , w h e r e N
i s a n e u t r a l r e s i d u e . C o n s e q u e n t l y , t h e m o s t i n t e r e s t -
4 4 5
7/27/2019 biochemj00482-0090 (1)
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M. MATSUO, C . HUANG AND L . C . HUANG
F i g . 4 . S c h e m a t i c d i a g r a m i l l u s t r a t i n g t h e t y p e - I f 8 - b e n ds t r u c t u r e o f A r g - X - Y - S e r
i n g o b s e r v a t i o n s t h a t two a d j a c e n t b a s i c a m i n o a c i d s
ar e p r e s e n t on t h e N - t e r m i n a l s i d e o f t h e p h o s p h o r y l -
a t e d s i t e s o f p r o t e i n k i n a s e s u b s t r a t e ar e e x p e c t e d ,
p r o v i d e d t h a t t h e p h o s p h o r y l a t a b l e r e s i d u e a t
p o s i t i o n i and t h e a r g i n i n e r e s i d u e a t i-3 ar e a d o p t i n g
a s i d e - c h a i n ( i - 3 ) -* i h y d r o g e n - b o n d e d c o n f o r m a -
t i o n i n a f l - b e n d s t r u c t u r e as h y p o t h e s i z e d i n F i g . 4 .By u s i n g p r o b a b i l i t y f a c t o r s l i s t e d b y Chou &
Fasman ( 1 9 7 4 ) , i t h a s b e e n c a l c u l a t e d b y D a i l e e t a l .( 1 9 7 5 ) t h a t s e v e r a l p h o s p h o r y l a t a b l e s e g m e n t s , A r g -
X - Y - S e r , f r o m p r o t e i n s u b s t r a t e s o f c y c l i c AMP-
d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e h a v e a h i g h p r o b a b i l i t y o f
occurrence as f l - b e n d s . S i n c e s i m i l a r h i g h e r p r o b a -
b i l i t i e s h a v e a l s o b e e n o b t a i n e d f o r sequences a r o u n d
s e r i n e r e s i d u e s t h a t ar e n o t p h o s p h o r y l a t a b l e , D a i l e
e t a l . ( 1 9 7 5 ) d i d n o t e m p h a s i z e t h e i r c a l c u l a t i o n .I t s h o u l d b e n o t e d , h o w e v e r , t h a t t h e s e e m p i r i c a l
c o m p u t a t i o n s are b a s e d on t h e a s s u m p t i o n t h a t t h e
f o u r r e s i d u e s i n t h e f l - b e n d s t r u c t u r e b e h a v e i n d e p e n -
d e n t l y . I f t h e e x t r a s t a b i l i z a t i o n energy f o r t h e f - b e n d
s t r u c t u r e as p r o v i d e d b y t h e h y d r o g e n bond b e t w e e n
t h e s i d e c h a i n s o f a r g i n i n e a n d s e r i n e ( F i g . 4 ) i s t a k e n
i n t o a c c o u n t , t h e t e t r a p e p t i d e a r o u n d t h e p o t e n t i a lp h o s p h o r y l a t a b l e s i t e o f p r o t e i n k i n a s e s u b s t r a t e ,e s p e c i a l l y i f i t i s A r g - A r g - Y - S e r a n d A r g - L y s - Y - S e r ,
may h a v e an e v e n h i g h e r p r o b a b i l i t y o f occurrence
as a f l - b e n d t h a n h a s b e e n r e a l i z e d p r e v i o u s l y .K e m p e t a l . ( 1 9 7 7 ) r e p o r t e d t h a t t h e s y n t h e t i c
h e p t a p e p t i d e L e u - A r g - A r g - A l a - S e r - L e u - G l y ,corres-
p o n d i n g t o a s e g m e n t o f t h e p h o s p h o r y l a t e d sequence
i n p i g l i v e r p y r u v a t e k i n a s e , s e r v e s a s a b e t t e r s u b -
s t r a t e t h a n t h e s y n t h e t i c p e p t i d e L e u - A r g - L y s - A l a -
S e r - L e u - G l y f o r t h e p r o t e i n k i n a s e . T h i s r e s u l t i sc o n s i s t e n t w i t h o u r p r o p o s e d m o d e l o f t h e s e c o n d a r y
s t r u c t u r e o f p r o t e i n s u b s t r a t e s n e a r t h e p h o s p h o r y l a t -
a b l e s i t e . As d i s c u s s e d a b o v e , r e p l a c e m e n t o f l y s i n eb y a r g i n i n e i n p o s i t i o n X o f A r g - X - Y - S e r w o u l dp r o m o t e h y d r o g e n - b o n d f o r m a t i o n b e t w e e n t h e s i d ec h a i n s o f a r g i n i n e - ( i - 3 ) a n d s e r i n e - i ; h e n c e t h i ss u b s t i t u t i o n w o u l d i n c r e a s e t h e p r o b a b i l i t y o f o c c u r -
r e n c e o f f l - b e n d s f o r t h e s y n t h e t i c h e p t a p e p t i d e i ns o l u t i o n . S i n c e a r g i n i n e r e s i d i n g i n t h e f l - b e n d s t r u c -t u r e i s , a c c o r d i n g t o o u r h y p o t h e s i s , r e c o g n i z e d b y
p r o t e i n k i n a s e , o n e w o u l d e x p e c t t h e p e p t i d e L e u - A r g -
A r g - A l a - S e r - L e u - G l y t o b e a b e t t e r s u b s t r a t e t h a n
L e u - A r g - L y s - A l a - S e r - L e u - G l y . F u r t h e r m o r e , o n e
c a n p r e d i c t t h a t t h e s y n t h e t i c p e p t i d e L e u - A r g - L y s -
A l a - S e r ( i ) - L e u - G l y c a n s e r v e a s a much b e t t e r s u b -
s t r a t e f o r p r o t e i n k i n a s e t h a n L e u - A r g - A l a - A l a -S e r ( i ) - L e u - G l y f o r t h e f o l l o w i n g t w o r e a s o n s . ( 1 )S i n c e t h e s i d e c h a i n o f a l a n i n e - ( i - 2 ) i n t h e s e c o n d
p e p t i d e i s n e u t r a l , i t c a n n o t r e p e l e l e c t r o s t a t i c a l l y t h e
s i d e c h a i n o f a r g i n i n e - ( i - 3 ) , W h e r e a s t h e s i d e c h a i n
o f l y s i n e - ( i - 2 ) i n t h e f i r s t p e p t i d e c a n r e p e l e l e c t r o -s t a t i c a l l y , a l b e i t n o t a s e f f e c t i v e l y a s i f i t w e r e a r g i n i n e -( i - 2 ) , t h e s i d e c h a i n o f a r g i n i n e - ( i - 3 ) ; t h e f o r m e r i st h u s e x p e c t e d t o h a v e a h i g h e r p r o b a b i l i t y i n f o r m i n g
a f l - b e n d s t r u c t u r e i n s o l u t i o n . ( 2 ) T h e s y n t h e t i ch e p t a p e p t i d e L e u - A r g - A l a - A l a - S e r ( i ) - L e u - G l y d o e s
n o t p o s s e s s t h e c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f p e p t i d es e q u e n c e s t h a t a r e w e l l k n o w n t o f o r m t u r n s o n t h e
p r o t e i n s u r f a c e , a s d i s c u s s e d i n t h e i n t r o d u c t i o n . I no t h e r w o r d s , o w i n g t o t h e p r e s e n c e o f l e u c i n e - ( i - 4 ) ,A l a - A l a a n d l e u c i n e - ( i + 1 ) i n t h e s e q u e n c e , t h e p r o b a -
b i l i t y o f h a v i n g a f l - b e n d s t r u c t u r e f o r t h i s s y n t h e t i ch e p t a p e p t i d e i s l i k e l y t o b e e x t r e m e l y l o w . C o n s e -
q u e n t l y , t h e s y n t h e t i c p e p t i d e L e u - A r g - L y s - A l a -
S e r ( i ) - L e u - G l y s h o u l d s e r v e a s a s u b s t a n t i a l l y b e t t e rs u b s t r a t e t h a n t h e h e p t a p e p t i d e L e u - A r g - A l a - A l a -
S e r ( i ) - L e u - G l y f o r p r o t e i n k i n a s e . E x p e r i m e n t a l d a t a
o b t a i n e d b y K e m p e t a l . ( 1 9 7 7 ) i n d e e d b e a r t h i s o u t .T h e r e i s o n e i m p l i c i t a s s u m p t i o n i n t h e f o r e g o i n g
d i s c u s s i o n t h a t s h o u l d b e e m p h a s i z e d , n a m e l y t h a t ,i n a d d i t i o n t o t h e f l - b e n d s t r u c t u r e o f a s e g m e n t o f
f o u r a m i n o a c i d s i n t h e p r o t e i n s u b s t r a t e f r o ma r g i n i n e - ( i - 3 ) t o t h e p h o s p h o r y l a t a b l e r e s i d u e i , t h ep r o t e i n k i n a s e h a s a n a r g i n i n e - r e c o g n i t i o n s i t e n e a r
i t s a c t i v e c e n t r e . T h i s s i t e i s e s s e n t i a l f o r t h e f u n c t i o n
o f t h e e n z y m e , b e c a u s e n o t o n l y d o e s i t a c t a s a s i t ef o r r e c o g n i t i o n o f t h e e x p o s e d a r g i n i n e o n t h e s u r f a c eo f t h e p r o t e i n s u b s t r a t e , b u t a l s o , v i a t h e i n t e r a c t i o nw i t h a r g i n i n e - ( i - 3 ) , i t m ay h e l p t o s t e e r t h e s p a t i a l l ya d j a c e n t s e r i n e - i i n t o a p r o p e r o r i e n t a t i o n o n t h e
n e a r b y a c t i v e c e n t r e f o r p h o s p h o r y l a t i o n . One
e x p e r i m e n t a l a p p r o a c h t h a t we h a v e t a k e n t o t e s t t h e
h y p o t h e s i s o f a s p e c i f i c a r g i n i n e - r e c o g n i t i o n s i t e o n
p r o t e i nk i n a s e i s
k i n e t i c s t u d i e so f
t h ee n z y m e u n d e r
v a r i o u s c o n d i t i o n s , a s e l a b o r a t e d b e l o w .
1 9 7 8
4 4 6
7/27/2019 biochemj00482-0090 (1)
http://slidepdf.com/reader/full/biochemj00482-0090-1 7/7
ARGININE-RECOGNITION S I T E ON PROTEIN KINASE 4 4 7
C o m p a r a t i v e s t u d i e s o f c a t a l y t i c - s u b u n i t a c t i v i t yi n t h e p r e s e n c e o f p o l y a r g i n i n e a n d p o l y l y s i n e i n d i -c a t e t h a t i t i s s p e c i f i c a l l y i n h i b i t e d b y p o l y a r g i n i n e( F i g . 1 ) . T h e s e d a t a a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e a s s u m p -t i o n t h a t a r g i n i n e , b u t n o t l y s i n e , i s r e c o g n i z e d b y t h e
c a t a l y t i c s u b u n i t ; h e n c e p o l y a r g i n i n e c a n i n a c t i v a t et h e c a t a l y t i c s u b u n i t b y b i n d i n g t o t h e a r g i n i n e -r e c o g n i t i o n s i t e o f t h e e n z y m e . T h i s i n t e r p r e t a t i o n i sf u r t h e r s u p p o r t e d b y t h e k i n e t i c d a t a ( F i g . 2 b ) , w h i c hs h o w t h a t p o l y a r g i n i n e f u n c t i o n s a s a l i n e a r c o m -p e t i t i v e i n h i b i t o r w i t h r e s p e c t t o h i s t o n e a s p r o t e i ns u b s t r a t e . F u r t h e r m o r e , t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e i n h i b i -t i o n r e a c t i o n i s d u e t o r a p i d i n t e r a c t i o n b e t w e e n p o l y -a r g i n i n e a n d MgATP2- i s r u l e d o u t b y o u r k i n e t i cd a t a , a s i l l u s t r a t e d i n F i g . 2 ( a ) .
A d d i t i o n a l e x p e r i m e n t a l d a t a a r e s h o w n i n F i g . 3 .T h e s e r e s u l t s c a n b e t a k e n a s e v i d e n c e t h a t t h e
g u a n i d i n i u m i o n o f t h e a r g i n i n e r e s i d u e n e a r t h e
p o t e n t i a l l y p h o s p h o r y l a t a b l e h y d r o x y a m i n o a c i d o ft h e e n z y m e s u b s t r a t e m u s t b e e x p o s e d o n t h e p r o t e i ns u r f a c e , a n d h e n c e r e a c h e s o u t t o i n t e r a c t w i t h ac a r b o x y g r o u p o f t h e a d d e d p o l y g l u t a n i a t e s o r p o l y -a s p a r t a t e s . I n a d d i t i o n , t h e c o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n b yp o l y g l u t a m a t e s o r p o l y a s p a r t a t e s s u g g e s t s t h a t t h e
i n t e r a c t i o n o f a r g i n i n e - ( i - 3 ) o f t h e p r o t e i n s u b s t r a t ew i t h p o l y g l u t a m a t e s o r p o l y a s p a r t a t e s w i l l p r e v e n tt h e p r o t e i n s u b s t r a t e f r o m s p e c i f i c r e c o g n i t i o n a n dp h o s p h o r y l a t i o n b y p r o t e i n k i n a s e .
F i n a l l y , i t s h o u l d b e p o i n t e d o u t t h a t o u r k i n e t i cd a t a a r e c o n s i s t e n t w i t h o u r h y p o t h e s i s a b o u t t h es e c o n d a r y s t r u c t u r e o f A r g - X - Y - S e r i n t h e p r o t e i n
k i n a s e s u b s t r a t e ; t h e y a r e a l s o i n t e r n a l l y c o n s i s t e n tw i t h t h e a s s u m p t i o n t h a t t h e r e i s a r e c o g n i t i o n s i t ef o r a r g i n i n e , b u t n o t l y s i n e , n e a r t h e a c t i v e c e n t r e o ft h e p r o t e i n k i n a s e . H o w e v e r , t h e s e k i n e t i c d a t a d on o t p r o v e t h e s e a s s u m p t i o n s . D e t a i l e d s t r u c t u r a ls t u d i e s a r e n e e d e d f o r t h e v e r i f i c a t i o n o f o u r h y p o -t h e s e s . We a r e a l s o a w a r e t h a t t h e s t r u c t u r a l m o d e lp r e s e n t e d i n F i g . 4 i s n o t a c o m p l e t e o n e . F o r i n s t a n c e ,we d i d n o t d i s c u s s t h e e f f e c t o f v a r i o u s Y r e s i d u e s i nt h e s e q u e n c e A r g - ( i - 3 ) - X - Y - S e r ( i ) o n t h e s t a b i l i t yo f t h e f l - b e n d s t r u c t u r e , a l t h o u g h i t i s r e a s o n a b l e t o
b e l i e v e t h a t g l y c i n e a n d a l a n i n e , w h i c h d o n o t h a v eh y d r o g e n - b o n d a c c e p t o r s o r d o n o r s i n t h e i r s i d ec h a i n s a n d h e n c e c a n n o t c o m p e t e w i t h t h e g u a n i -d i n i u m g r o u p o f a r g i n i n e - ( i - 3 ) f o r t h e h y d r o x y g r o u po f s e r i n e - i , a r e p r e f e r a b l e a t t h e Y - p o s i t i o n f o r s t a b l e, f - b e n d s t r u c t u r e s . I n a d d i t i o n , we a r e a w a r e t h a t t h em o d e l m ay b e a g r o s s o v e r - s i m p l i f i c a t i o n o f a t r u e
s e c o n d a r y s t r u c t u r e o f t h e p r o t e i n s u b s t r a t e , w h e nt h e t h r e e - d i m e n s i o n a l t e r t i a r y s t r u c t u r e o f t h e
p r o t e i n s u b s t r a t e i s t a k e n i n t o a c c o u n t . D e s p i t e a l lo f t h e s h o r t c o m i n g s , t h e o v e r a l l h y p o t h e s i s d o e sa p p e a r t o b e a r e a s o n a b l e o n e t o e x p l a i n , a t l e a s t t o af i r s t a p p r o x i m a t i o n , t h e s u b s t r a t e s p e c i f i c i t y o f c y c l i cA M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e . M o r e o v e r , o n ep o t e n t i a l u s e f u l n e s s o f t h e m o d e l l i e s i n i t s
p r e d i c -t i o n s . F o r e x a m p l e , t h e t h i r d r e s i d u e f r o m t h e N -t e r m i n a l s i t e o f t h e p h o s p h o r y l a t e d s i t e 2 o f g l y c o g e ns y n t h a s e h a s n o t y e t b e e n i d e n t i f i e d a s a r g i n i n e o rl y s i n e ( P r o u d e t a l . , 1 9 7 7 ) . O u r s t r u c t u r a l m o d e ls u g g e s t s t h a t i t i s m o s t l i k e l y t o b e a n a r g i n i n e r e s i d u e .O n l y f u t u r e e x p e r i m e n t s c a n t e l l t h e v a l i d i t y o f o u rp r e d i c t i o n .
T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y g r a n t G M - 2 2 4 3 0 f r o m t h eN a t i o n a l I n s t i t u t e o f G e n e r a l M e d i c a l S c i e n c e s , U . S .P u b l i c H e a l t h S e r v i c e . L . C . H . i s t h e r e c i p i e n t o f C a r e e rD e v e l o p m e n t A w a r d I K 0 4 - A M - 0 0 2 1 2 f r o m t h e U . S .P u b l i c H e a l t h S e r v i c e .
R e f e r e n c e s
A n f i n s e n , C . B . & S c h e r a g a , H . A . ( 1 9 7 5 ) A d v . P r o t e i nC h e m . 2 9 , 2 0 5 - 3 0 0
B e c h t e l , P . J . , B e a v o , J . A . & K r e b s , E . G . ( 1 9 7 7 ) J . B i o l .C h e m , 2 5 2 , 2 6 9 1 - 2 6 9 7
B y l u n d , D . B . & K r e b s , E . G . ( 1 9 7 5 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 0 ,6 3 5 5 - 6 3 6 1
C h o u , P . Y . & F a s m a n , G . C . ( 1 9 7 4 ) B i o c h e m i s t r y 1 3 ,2 2 2 - 2 4 5
C o h e n , P . , R y l a t t , D . B . & N i m m o , G . A . ( 1 9 7 7 ) FEBSL e t t . 7 6 , 1 8 2 - 1 8 6
D a i l e , P . , C a r e z i e , P . R . & Y o u n g , J . D . ( 1 9 7 5 ) N a t u r e( L o n d o n ) 2 5 7 , 4 1 6 - 4 1 8
G l y n n , I . M. & C h a p p e l l , J . B . ( 1 9 6 4 ) B i o c h e m . J . 9 0 ,1 4 7 - 1 4 9
H o p p e , J . & W a g n e r , K . G . ( 1 9 7 7 ) FEBS L e t t . 7 4 , 9 5 - 9 8H u a n g , L . C . & H u a n g , C . ( 1 9 7 5 ) B i o c h e m i s t r y 1 4 , 1 8 - 2 4Kemp, B . E . , B e n j a m i n i , E . & K r e b s , E . G . ( 1 9 7 6 ) P r o c .
N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 7 3 , 1 0 3 8 - 1 0 4 2Kemp, B . E . , G r a v e s , D . J . , B e n j a m i n i , E . & K r e b s , E . G .
( 1 9 7 7 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 2 , 4 8 8 8 - 4 8 9 4K u n t z , I . D . ( 1 9 7 2 ) J . Am. C h e m . S o c . 9 4 , 4 0 0 9 - 4 0 1 2L e w i s , P . N . , Momany, F . A . & S c h e r a g a , H . A . ( 1 9 7 1 )
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 6 8 , 2 2 9 3 - 2 2 9 7L o w r y , 0 . H . , R o s e b r o u g h , N . J . , F a r r , A . L . & R a n d a l l ,
R . J . ( 1 9 5 1 ) J . B i o l . C h e m . 1 9 3 , 2 6 5 - 2 7 5M i y a m o t o , E . , P e t g o l d , G . L . , K u o , J . F . & G r e e n g a r d , P .
( 1 9 7 3 ) J . B i o l . C h e m . 2 4 8 , 1 7 9 - 1 8 9P r o u d , C . G . , R y l a t t , D . B . , Y e a m a n , S . J . & C o h e n , P .
( 1 9 7 7 ) FEBS L e t t . 8 0 , 4 3 5 - 4 4 2V e n k a t a c h a l a m , C . M. ( 1 9 6 8 ) B i o p o l y m e r s 6 , 1 4 2 5 - 1 4 3 6Y e a m a n , S . , C o h e n , P . , W a t s o n , D . C . & D i x o n , G . H .
( 1 9 7 7 ) B i o c h e m . J . 1 6 2 , 4 1 1 - 4 2 1
V o l . 1 7 3
