BioNanoParkPRAKTYKI 2014

PREZENTACJĘ WYKONAŁA AGNIESZKA DĄBROWSKAPRAKTYKI SWOJĄ DROGĄ TEŻ ODBYŁA

Czo za praktyki?

Gdzie te praktyki?

GDZIEŚ TAM DALEKO

TUTAJ!

TUTAJ

GDZIEŚ!

Kiedy?

BioNanoParkUl. Debois 114/116 Łódź

Laboratorium Biofizyki Molekularnej i Nanostrukturalnej

Pracownia Biofizyki Molekularnej i Nanostrukturalnej

Mikroskop skaningowy elektronowy Phenom ProX z EDS

http://www.ntmdt.com/afm-raman/ntegra-spectra/page/spectra-working-principle

Spektrometr Ramana sprzężony z AFM

Pracownia Biologii Komórki

Celem naszej pracy w pracowni hodowli komórkowej było porównanie dwóch grup komórek fibroblastów.• I grupa – kontrolna – komórki hodowane bez dodatkowego podłoża• II grupa – komórki hodowane na stali chirurgicznej

W ramach dodatkowego eksperymentu potraktowaliśmy komórki fibroblastów substancjami o różnych stężeniach, po czym zabarwiliśmy je kalceiną oraz bromkiem etydyny w celu określenia ich przeżywalności:

ETP 1uLPRÓBA KONTROLNAETP 10uLETP 20uL

MetOH 5 uL Trioton X-100 5 uL

Pracownia Proteomiki i Transkryptomiki

Badanie RNA (mikromacierze)Ze względu na małą ilość

komórek zebranych ze wcześniejszej hodowli nie mogłyśmy przeprowadzić

badania. Jednak przewidziano ten problem i przygotowano inną

hodowlę tych samych komórek z odpowiednią ilością materiału

genetycznego.

Szlak metaboliczny Zmienione geny

Synteza insuliny PDX1, gen karboksypeptydazy E

Metabotropowy glutaminian klasa C, feromony GRM8, GPR5 1

Szlak sygnałowy osteoklastów RANK ligand, OGR1

Epigenetyczna regulacja stresu NGFI-A

Metabolizm aminokwasów i pochodnychgen dehydrogenazy proliny, gen liazy histydyno-amoniowej, gen prekursoru

kortykotropiny

Uwalnianie kortykotropiny FOS, FOSB, GNAS, CAMK2A, POMC

W tabeli przedstawiono szereg zmian w szlakach metabolicznych komórek fibroblastów hodowanych na stali chirurgicznej i zmiany genów, które przyczyniły się do tych różnic.

Elektroforeza DIGE

Wyizolowane i oczyszczone białka komórek fibroblastów (P1) i Saos-2 (P2) poddano ogniskowaniu izoelektrycznemu na stripie o długości 18 cm, którego

zakres pH wynosił 3-10, gradient liniowy. Rozdział wykonano na żelu 12,5%. Elektroforezie 2D-DIGE

poddano 100 ug białka. Próbki wyznakowano znacznikami fluorescencyjnymi Cy3 (P1) i Cy5 (P2).

Spoty zaznaczone kolorem zielonym odpowiadały białkom znajdującym się w nadekspresji

(ratio>2) lub supresji (ratio<0.5). W nadekspresji znajdowało się 215 białek,

supresji 208 białek.

a) Obraz ekspresji białek komórek fibroblastów (P1) wyznakowanych Cy3b) Obraz ekspresji białek komórek Saos-2 (P2) wyznakowanych Cy5

Spektrometria Mas MALDI – TOF-

TOFKalibracja: PeptideCalibStandard (Bruker)Spektrometr mas: UltrafleXtreme (Bruker); częstotliwość lasera: 2000 Hz; napięcie na źródle 1: 24,80 kV; napięcie na źródle 2: 22,95 kVPreparatyka próbki:Target: Unchore Steel, układ matryc HCCA w nasyconym acetonie, rozp. Próbki w 85%AcN/0.1%TFA, nakładanie próbki cienką warstwą (thin layer) metodą wysychającej kropli (dried droppled). Rozpuszczalnik próbki: woda jakości LC-MS z dodatkiem NH4CO3, pH7 Zakres pomiaru: 500-5000Da, pomiar MS: tryb odbiciowy, polaryzacja pozytywna; pomiar MS/MS: metoda Lift, polaryzacja pozytywna.

Wyniki -widmo MS na matrycy HCCA

Widma jonów fragmentacyjnych MS/MS

Laboratorium Indywidualnych

Implantów Medycznych

Dziękuję

za uwagę!