BIO-034 Clase 3.Pdfconsu

BIOLOGIA CELULAR BIO-034

METODOS EN BIOLOGIA CELULAR

Lorena Varela-Nallar, PhD [email protected]

Facultad de Ciencias Biologicas Universidad Andres Bello

In vivo (en el organismo viviente): Experimentos que se llevan a cabo en organismos completos.

Tipos de experimentos

Figure 8-4 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

In vitro (en vidrio): Experimentos que se realizan en cultivos celulares,

1. Clulas de cultivo primario 2. Lneas clulares

3. Hibridomas

4. Clulas madres (stem cells)

Fibroblastos Mioblastos Celulas nerviosas Celulas tabaco

Diseccin

1. Mecnico

Manual Lser

Microdiseccin por captura laser desde corte histolgico

1. Cul@vo primario (extraccin de clulas)

Diseccin

1. Mecnico

2. Enzimtico

- Tripsina - Colagenasa

Enzimas proteolcas

Degradan de matriz extracelular

Figure 8-3 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

1. Cul@vo primario (extraccin de clulas)

1. Cul@vo primario (neuronas hipocampales)

Se pueden u7lizar varios mtodos para separar los diferentes @pos celulares de la suspensin celular, segn sus propiedades: 1. La diferencia de tamao de las clulas permite separarlas por centrifugacin. 2. La capacidad que 7enen algunos 7pos celulares de adherirse al vidrio o al pls@co, permite separarlos de otras clulas que se adhieren dbilmente. 3. Algunos an@cuerpos se unen especficamente a sustancias presentes en determinadas clulas. Luego, se emplea diferentes matrices (como colgeno, bolitas de polisacridos, pls7co) a la cuales slo las clulas reconocidas por los an7cuerpos podrn adherirse. 4. Se emplean an@cuerpos acoplados a colorantes fluorescentes para marcar clulas especficas adheridas a ellos. Las clulas marcadas por interaccin con el an7cuerpo pueden ser separadas de las no marcadas en un separador de clulas ac7vado por fluorescencia o cell sorter

1. Cul@vo primario Separacin de los dis5ntos 5pos celulares

Las clulas individuales viajan a travs de un conducto muy delgado y son iluminadas por un lser.

Una boquilla vibratoria forma diminutas gotas (que con7enen 1 o ninguna clula)

La go7ta recibe carga posi7va o nega7va dependiendo de si la clula es fluorescente (el equipo detecta qu clulas emiten fluorescencia por el an7cuerpo adherido).

Luego, las gotas son separadas por un campo elctrico hacia los recipientes colectores segn su carga.

1. Cul@vo primario Separador de clulas ac5vado por fluorescencia

Tabla 8-1 Biologa molecular de la clula, quinta edicin ( Garland Science 2008 y Ediciones Omega 2010)

2. Lneas celulares

Lnea de clulas epiteliales humanas procedentes de un carcinoma cervical, y las primeras clulas humanas de las cuales se estableci una lnea celular permanente.

En 1951 se prac7c una operacin quirrgica a la paciente HenrieQa Lacks (de ah el nombre), una mujer afroamericana de 31 aos, en la cual se extrajeron clulas de un carcinoma en el tero con la intencin de evaluar su malignidad. La paciente falleci 8 meses despus a causa de su tumor.

Las clulas extradas estaban invadidas por el virus del papiloma humano 18 (HPV18), transformndose en clulas tumorales.

Hoescht

- Replicacin indefinidamente: immortal - Hasta hoy >80.000 publicaciones con HeLa -10-20% otras lneas clulares estan contaminados con HeLA

2. Lneas celulares (lnea celular HeLa)

Secretan an@cuerpos monoclonales contra un anOgeno en par@cular.

3. Hibridomas

Los an7cuerpos son fabricados por linfocitos B

Cada linfocito B en reposo lleva un an@cuerpo especfico (que reconoce un anZgeno especfico) ligado a su membrana

Cuando el anZgeno se une se es7mula la divisin de los linfocitos B y la produccin y secrecin de an@cuerpos solubles

An@cuerpos

Produccin de An@cuerpos

Produccin de hibridomas

Subgrupo de clulas que 7enen la habilidad de reponerse a s mismas a travs de auto-renovacin y 7enen el potencial de diferenciar a diferentes 7pos de clulas.

Los dos 7pos principales son: - Clulas madre embrionarias (ESCs), 7enen la capacidad de generar las tres capas germinales embrionarias ectodermo, endodermo y mesodermo, de los que derivarn todos los tejidos y rganos

- Clulas madre adultas

Las clulas madre pueden producir uno o ms tejidos maduros, funcionales y plenamente diferenciados en funcin de su grado de mul@potencialidad.

4. Clulas Madre (Stem Cells)

Totipotente, puede crecer y formar un o r g a n i s m o c o m p l e t o , t a n t o l o s componentes embrionarios como los extra-embrionarios (placenta).

Pluripotente, puede formar cualquiera otro tipo de clula proveniente de los tres l inajes embr ionar ios (endodermo, ectodermo y mesodermo), as como el germinal y el saco vitelino.

Multipotentes, solo pueden generar clulas de su propia capa o linaje embrionario de origen

Unipotentes pueden formar nicamente un tipo de clula particular.

4. Clulas Madre (Stem Cells)

Fuente inagotable de material que a futuro podra se usada para terapia celular Aun no son del todo seguras (tumores) Rechazo si son de otra persona (terapias personalizadas)

4. Clulas Madre Clulas madre embrionarias

Figura 8-6 Biologa molecular de la clula, quinta edicin ( Garland Science 2008 y Ediciones Omega 2010)

4. Clulas Madre Transplante de ncleo de clula som5ca

ES personalizada

4. Clulas Madre Mtodos para inducir reprogramacin

4. Clulas Madre Proyecciones cul5vo de clulas madre

Composicin de medios de cul7vo para clulas eucariotas animales: Los medios de crecimiento pueden variar en pH, concentracin de glucosa,

factores de crecimiento y la presencia de otros componentes nutri7vos. Los factores de crecimiento usados para suplementar a los medios derivan a menudo de sangre

animal, como el suero bovino.

5% CO2 -95% O2 95% Humedad 37C

Incubadora con condiciones controladas:

Clula eucariote

Cmo se cul@van las clulas?

- Permiten un control preciso y fino del medio ambiente. En un cul7vo se pueden controlar todos los factores dle medio: Fsico-qumicos (pH, temperatura, presin osm7ca, niveles de O2, CO2, tensin superficial...), y fisiolgicos (hormonas, factores de crecimiento, densidad celular,...) - Caracterizacin y homogeneidad de la muestra. Las clulas en cul7vo de una lnea celular, o de una lnea con7nua son homogneas, con morfologa y composicin uniformes. Se pueden obtener con facilidad un nmero elevado de rplicas idn7cas, con lo que se supera el grave problema de heterogeneidad de las muestras inherente asociado al uso de animales de experimentacin.

- Economa. Suponen una economa en el uso de reac7vos o drogas a estudiar pues al realizarse en volmenes reducidos, y con un acceso directo de las clulas a la droga las concentraciones requeridas son mucho ms bajas que en el animal completo. - Mo@vaciones @cas. La inves7gacin biomdica supone el sacrificio cada ao de muchos miles de animales de experimentacin. El cul7vo celular no puede reemplazar siempre el ensayo "in vivo" pero es una alterna7va vlida en muchas situaciones.

Ventajas de los cul@vos celulares

- No reproduce la situacin en vivo (3-D) con mltiples interacciones entre distintos tipos de clulas - Tcnica sensible. El crecimiento de las clulas animales es mucho ms lento que el de los contaminantes ms habituales (hongos, levaduras, bacterias, micoplasmas...) y adems dado que proceden de organismos pluricelulares son incapaces de crecer en ausencia de una compleja mezcla de nutrientes que simula el plasma o el fluido intersticial. Esto supone la necesidad de mantener las condiciones de asepsia en todo momento, lo cual es limitante a nivel tanto del instrumental requerido como del personal cualificado para su manipulacin. - Cantidad y costo. El costo de produccin de 1 gramo de tejido desde cultivo es ms de 10 veces superior al obtenido en el animal. Asimismo existe una limitacin de produccin, que es del orden de 10 g de clulas en un laboratorio normal, y que para ser superior a 100 g requiere instalaciones de tipo industrial. - Inestabilidad. Muchas de las lneas celulares continuas son inestables, como consecuencia de la dotacin cromosmica aneuploide. La poblacin celular puede variar su composicin si alguna de las subpoblaciones celulares es capaz de crecer con una tasa ligeramente superior, es decir podemos encontrar diferencias significativas en la lnea celular de una generacin a la siguiente. La nica manera de evitarlo es emplear lneas estables que se resiembran a partir de un stock congelado cada determinado tiempo, o despus de un determinado nmero de generaciones.

Desventajas de los cultivos celulares

Fraccionamiento subcelular

Rotura de clulas y tejidos

Centrfuga

Centrifugacin diferencial

Centrifugaciones repetidas a velocidades cada vez ms elevadas fraccionan los homogenizados celulares en sus componentes

Separan los componentes en base a su tamao y su densidad:

mayor tamao mayor fuerza centrfuga, forman precipitado mientras componentes mas pequeos y menos densos se mantienen en suspensin (sobrenadante).

Sedimentacin por velocidad

Los componentes subcelulares sedimentan en base a su forma y tamao

Gradiente de sacarosa

Equilibrio de sedimentacin

Como comprobar pureza de las fracciones?

Separacin de Protenas

Cromatogra^a

Mtodo mediante el cual se separan molculas basado en las diferencias existentes entre su estructura y/o composicin. Generalmente, los compuestos a separar (protenas) se 7enen en solucin y se hacen pasar por un soporte estacionario (columna que con7ene matriz slida porosa). Los dis7ntos niveles de interaccin entre el soporte estacionario y las molculas permi7rn a estas ul7mas migrar lenta o rpidamente a travs del soporte. Separaciones cromatogrficas se pueden realizar u7lizando una variedad de soportes: silica inmovilizada en placas de vidrio (cromatograca de capa fina), gases vol7les (cromatograca de gases), papel (cromatograca de papel), lquidos (cromatograca liquida).

Las protenas se pueden separar en base a su carga (c. de intercambio inico), hidrofobicidad (c. hidrofbica), de su tamao (c. de filtracin), capacidad de unin a determinados grupos qumicos (c. de afinidad)

Biologa molecular de la clula, quinta edicin ( Garland Science 2008 y Ediciones Omega 2010)

Dependiendo de la matriz que se u7 l i ce se pueden separar protenas segn su carga, tamao, carcter hidrofbico, etc

Cromatogra^a en columna

Tipos de matrices

Figure 8-13 and 8-14 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

Cromatogra^a de intercambio inico


Tipos de matrices

Cromatogra^a de filtracin en gel


Tipos de matrices

Cromatogra^a de afinidad

Electroforesis Las protenas suelen tener carga neta posi7va o nega7va debido a los aminocidos cargados Si se aplica un campo elctrico la protena migrar a una velocidad que depende de su carga neta, su tamao

y su forma Se u7liza un detergente cargado nega7vamente (dodecil sufato sdico, SDS) que permite la disociacin de

las protenas de otros componentes proteicos o lipdicos y enmascara la carga intrnseca de la protena hacindola migrar hacia el electrodo posi7vo

Se utliza un agente reductor para romper puentes disulfuro para separar los polipp7dos cons7tu7vos de molculas de varias subunidades

Electroforesis


Sucesivos estados de purificacin de una enzima (se carg igual cantidad (g) de protena)

Anlisis de muestra proteica mediante electroforesis

Usos de los anticuerpos


Usos de los anticuerpos Western Blotting

Anlisis del DNA

Nucleasas de restriccin:


Secuencias especficas de 6 pb palindrmicas (identicas en ambas hebras si se gran en 180)

Puede generar extremos romos o cohesivos.

Se generan fragmentos de DNA que se pueden unir (ingeniera gentica, que permite manipular DNA in vitro)

Anlisis del DNA

Nucleasas de restriccin generan fragmentos que se pueden unir


Insercin de un fragmento de DNA en un plsmido bacteriano utilizando DNA ligasa.

Plsmido y DNA a ligar estn digeridos con la misma enzima de restriccin

Se aparean extremos cohesivos y se sellan los cortes en la cadena de DNA (DNA ligasa + ATP)

Electroforesis en gel de agarosa

DNA est cargado nega7vamente por el grupo fosfato Gel de agarosa Se usa bromuro de e7dio que se une al DNA y emite fluorescencia al ser observado con luz UV

Electroforesis en gel de agarosa


Southern o Northern bloang

Northern blofng: RNA con sonda de DNA Southern blofng: DNA con sonda de DNA

Amplificacin de DNA mediante PCR


Uso de PCR en medicina forense

VNTR: variable number of tandem repeat Secuencias cortas repe7das (nmero variable de veces, entre 4 y 40 veces en

dis7ntos individuos) Se encuentran en varias posiciones (loci) del genoma)

Uso de PCR en medicina forense

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