Białka złożoneBiałka złożone

Sylwia GołąbPaulina Rydz

Magdalena Światłoń

Ogólna charakterystykaOgólna charakterystykaBiałka są to polipeptydy zbudowane z około 100 aminokwasów. Charakteryzują je dość duże masy cząsteczkowe powyżej 10 000 Da. Pierwiastkami budującymi białka w większej mierze są: C, O, H, N, S i P. Informacje o budowie białek jest zawarta w DNA. Ogromne bogactwo form żywych i złożoność budowy należy zawdzięczać białkom. W organizmie żywym większość związków organicznych stanowią białka, które stanowią 50% suchej masy komórki. Cechuje je daleko posunięta swoistość gatunkowa, a nieraz osobnicza. Zasadniczy szkielet części białkowej stanowią powtarzające się w łańcuchu polipeptydowym elementy strukturalne -CH-CO-NH-, składające się z węgla a oraz wiązania peptydowego -CO-NH-. Atom wodoru grupy NH znajduje się prawie zawsze w pozycji trans do atomu tlenu grupy ketonowej. Łącząc te elementy węglem a rodników aminokwasowych (R) otrzymuje się łańcuch polipeptydowy o budowie zygzaka.

Budowa szkieletu białka Budowa szkieletu białka

O takim kształcie łańcucha peptydowego decyduje sposób ułożenia atomów w wiązaniu peptydowym. Przegrupowanie elektronów (delokalizacja) w obrębie wiązania peptydowego powoduje, że staje się ono polarne i może występować w dwóch odmianach.Wiązanie C-N ma około w 40% charakter wiązania podwójnego, a wiązanie C-O w około 60%. Wytworzenie wiązania podwójnego pomiędzy C i N nadaje wiązaniu peptydowemu znaczna sztywność oraz sprawia, że wszystkie jego cztery atomy (CO i NH) są rozmieszczone w tej samej płaszczyźnie. Łańcuch ten nie jest do końca sztywny, gdyż pojedyncze wiązanie przy atomach a węgla umożliwia ruch obrotowy. W tych miejscach łańcuch może się zginać lub zwijać.

Przegrupowanie atomów Przegrupowanie atomów (delokalizacja)(delokalizacja)

Budowę białek bada się metodami chemicznymi, fizykochemicznymi i fizycznymi. Początkowo białko jest wyizolowywane i oczyszczane. Sekwencje aminokwasów wyznacza się chemicznie przez znakowanie końcowej grupy amidowej dinitrofluorobenzenem i następnie przez hydrolizę wg. Sangera, można też oznaczać sekwencje aminokwasów metodą Edmana, w trakcie, której aminokwas o wolnej grupie aminowej uwalnia się z peptydu w postaci pochodnej hydantoinowej. Biochemicznie sekwencje aminokwasów wyznacza się przez hydrolizę enzymatyczną, głównie przy udziale karboksy- i aminopeptydaz.Dane na temat struktury przestrzennej białek dostarczają badania kryształów białek metodami dyfrakcji promieni rentgenowskich.

Znaczenie białekZnaczenie białekBiałka pełnią różne ważne funkcje biologiczne. Stanowią element budulcowy i wzmacniający (podporowy, osłaniający, spajający), np. keratyna naskórka, kolagen tkanki łącznej, białka błon komórkowych. Występują też białka kurczliwe np. aktyny i miozyny z miofibryli tkanki mięśniowej, które łącząc się powodują skurcz mięśnia realizując jego ruch. We wszystkich komórkach występują białka katalityczne tzw. enzymy, które przyspieszają reakcje chemiczne. W płynach ustrojowych występuje wiele białek transportujących, które wiążą i przenoszą różne cząsteczki np. hemoglobina transportuje tlen, a inne transportują jony metali hormony, składniki pokarmowe. Do białek regulujących należą hormony. Do białek obronnych należą immunoglobuliny, tworzące różne przeciwciała. Białka sensoryczne (nerwowe) z narządów zmysłowych np. rodopsyna mają zdolność odbierania i przesyłania sygnałów z środowiska. Włosy i pióra okrywające ciała zwierząt są zbudowane z keratyny. W tym przypadku białko pełni funkcje izolacyjną od wpływów środowiska zewnętrznego. U roślin białka pełnią też funkcję magazynującą substancje zapasowe i energetyczne odkładane w nasionach. Jady i toksyny zwierzęce w dużej mierze oparte są na substancjach białkowych. W tym wypadku białka pełnia funkcje toksyczne.

Aspekty historyczneAspekty historyczneW 1784 r. De Fourcroy jako pierwszy doszedł do wniosku, że białka stanowią szczególną klasę substancji. Angielska nazwa białek protein, pochodzi od greckiego słowa proteuo (zajmuje pierwsze miejsce) i została wprowadzona przez Berzeliusa. Pod koniec XIX w. Kossel wyodrębnił pewna ilość białek. W tym samym czasie Hofmeister i Fischer stwierdzili, że białka są łańcuchami złożonymi z jednostek aminokwasowych, co udowodniono później, dokonując syntezy tych związków. Hofmeister pracując z albuminą jajka kurzego, jako pierwszy wyodrębnił białko w postaci krystalicznej. Abel w 1925 r. wykrystalizował insulinę, a dziesięć lat później Summer przeprowadził krystalizację ureazy. Stanley w 1935 r. otrzymał w krystalicznej postaci wirusa mozaiki tytoniowej. Svebderg określił masę cząsteczkową wielu białek metodą ultra wirowania. Rozwój nowych technik analitycznych np. elektroforazy (Tiselius w 1937 r.) oraz ulepszenie technik chromatograficznych doprowadziło do wielu odkryć w tej dziedzinie.W 1956 r. Sanger określił sekwencje aminokwasów w insulinie. Metody wykorzystane w tej pracy, były podstawa do ustanowienia zasad systematycznego badania pierwszorzędowej struktury wielu innych białek. Po 1945 r. rozpoczęto systematyczne badania nad drugorzędowa strukturą białek oraz ich struktura przestrzenna. Pierwsze badania nad tym zagadnieniem podjęli Pauling i Corey. Następnie Kendrew i Purutz określili strukturę mioglobiny i hemoglobiny, korzystając z zjawiska dyfrakcji promieni rentgena. Na podstawie danych strukturalnych, można uzyskać wskazówki na temat funkcji biologicznych białek.

Podział białekPodział białekBiałka są substancjami o skomplikowanej budowie, dlatego ciężko było by przeprowadzić ich klasyfikacje na podstawie ich struktury. Z tego powodu białka są klasyfikowane na różne sposoby, na przykład: na ich pochodzenie (białka roślinne, zwierzęce, wirusowe, bakteryjne) lub na występowanie w różnych organach (białko plazmy, mięśni wątroby itp.), albo organellach komórkowych (białko cytoplazmy białko rybosonalne, jądrowe, błon itp.). Jako inne kryterium można przyjąć ich funkcje biochemiczne np.(białka enzymatyczne, ochronne, strukturalne, strukturalne, zapasowe, transportowe). Najwcześniej stosowany podział uwzględnia różnice w rozpuszczalności i kształcie cząsteczek.

Białka globularne: rozpuszczalne w wodzie i rozcieńczonych roztworach soli, przybierają kształt kulisty.Białka fibrylarne: nie rozpuszczalne w roztworach wodnych i roztworach soli, struktury włókniste występują na poziomie makroskopowym. Są odporne na działanie zasad i kwasów.

Obecnie stosuje się podział białek pod względem składu chemicznego i dzieli białka na dwie grupy:Białka proste - w wyniku całkowitej hydrolizy tych białek powstają tylko same aminokwasy.Białka złożone - w wyniku całkowitej hydrolizy tych białek powstają aminokwasy i składniki nie białkowe.

Podział ten jest stosowany do dnia dzisiejszego, chociaż badania najnowocześniejszą aparaturą wykazały, że niektóre białka proste błędnie zostały zaliczone do tej grupy.

FosforoproteidyFosforoproteidyFosforoproteidy zawierają grupy kwasu fosforowego, które są połączone są wiązaniami estrowymi z grupami hydroksylowymi łańcuchów bocznych seryny lub rzadziej treoniny.Do ważnych fosforoproteidów nalezą kazeiny. Znajdują się one w dużej ilości w mleku krowim. Stanowią one 79% białek zawartych w mleku. Najważniejszymi z nich są: a-, b-, c-kazeiny.c-kazeina jest jednołańcuchową cząsteczką składająca się z 169 aminokwasów. Jej masa cząsteczkowa wynosi 19 100 u.

Do grupy fosforoproteidów należą też fosfowityna i witellina, a otrzymywane z żółtka jaja. 50% reszt aminokwasowych fosfowityny stanowią reszty fosfoseryny. Chociaż witelina jest głównym białkiem żółtka jaja, to zawiera ona jedynie 5% grup fosforanowych w cząsteczce. Do fosfoproteidów można zaliczyć też owoalbuminę.

LipoproteidyLipoproteidyLipoproteidy są ważnymi z fizjologicznego punktu widzenia kompleksami białka z lipidami. Głownie występują w plazmie krwi, żółtku jaja kurzego, błonach i organellach komórkowych. Lipoproteidy plazmy odpowiedzialne są za transport tłuszczów obojętnych i substancji tłuszczopodobnych. Największe lipoproteidy, chylomikrony, mają średnicę 500 nm. Pojawienie się ich we krwi powoduje lipodemię. Lipoproteidy można wydzielić przez wirowanie w gradiencie ciężkości. Ze względu na dużą zawartość lipidów (40-90%). Lipoproteidy mają względnie nie wielkie gęstości, z wyjątkiem lipoproteidów o dużej gęstości. Badania pierwszorzędowej struktury lipoproteidów pozbawionych tłuszczy (apoliproteidów) wykazały, że składniki białkowe z budowane są z dwóch krótkich łańcuchów białkowych o małej masie cząsteczkowej.

GlikoproteidyGlikoproteidyGlikoproteidy są to kompleksy węglowodanowo-białkowe, w których krótkie, oligosacharydy są przyłączone wiązaniami glikozydowymi do łańcuchów bocznych niektórych aminokwasów. Istnieje kilka sposobów łączenia się, oligosacharydów: np. wiązanie O-glikozydowe (Ser, Thr), N-glikozydowe (N-końcowych grup amiowych, Lys, Asn), oraz połączenie estrowe z udziałem tlenu glikozydowego (Glu, Asp). Składowe węglowodanowe zawierają heksozy, N-acetylohekzoaminy lub kwas sialowy (kwas N-acetyloneuraminowy). Sacharydowe łańcuchy glikozydów nie przekraczają 10 reszt. Glikoproteidy mogą zawierać tylko jeden łańcuch węglowodanowy (owoalbumina) lub 800 łańcuchów. Glikoproteidy są szeroko rozpowszechnione w świecie roślin i zwierząt. Są składnikami błon enzymów, przeciwciał, substancji grupowych krwi, śluzów, czynników komplementarnych, hormonów i białek plazmy. Występuje we wszystkich frakcjach plazmy z wyjątkiem frakcji albumin. Ich masa cząsteczkowa waha się pomiędzy 4000 a 106 u.Kwaśny orosomukoid jest jednym z najlepiej poznanych glikoproteidów. Jego masa cząsteczkowa wynosi 41 000 u. Składa się on z jednego łańcucha zawierającego 181 aminokwasów. Charakteryzuje się on największą ilością węglowodanów z białek występujących w plazmie. Zawiera on pięć łańcuchów sacharydowych, przyłączonych do reszt asparaginowych. Glikoproteidy spełniają szereg ważnych funkcji. Na powierzchni komórek biorą aktywny udział w transporcie przez błony oraz działają jako białka przenoszące jony pewnych metali (Fe3+, Cu2+). Duża lepkość roztworów glikoproteidowych nadaje im właściwości smaru. Stanowią substancje śluzowe w wydzielinach gruczołów w płynach stawowych oraz w tkance łącznej.

NukleoproteidyNukleoproteidyNukleoproteidy są kompleksami kwasów nukleinowych i białek. Mają charakter heteropolarny. Składnikiem białkowym może być protoamina, histony lub białka nie histonowe chromosomów. W kompleksach tych kwasem nukleinowym najczęściej jest DNA. Nukleoproteidy odgrywają rolę w replikacji DNA jak i kontroli genetycznej.Najlepiej poznanym nukleoproteidem jest wirus mozaiki tytoniowej. Był to pierwszy wirus wyodrębniony w postaci krystalicznej. Ma on postać cylindrycznej pałeczki o długości 300 nm. i średnicy 17 nm. Pomiędzy skręty helisy tworzącej otoczkę białkową wydrążonego cylindra wpleciony jest długi łańcuch RNA. W bakteriofagu T4 osłonka białkowa (kapsyd) ma kształt wydłużonego dziesięciościanu. Główka bakteriofagu jest przyłączona przez szyjkę do ogonka o skomplikowanej budowie. W główce znajduje się DNA. Kiedy bakteria jest zakażana bakteriofagiem, jego ogonek przyłącza się do błony komórkowej i wprowadza DNA do komórki.

MetaloproteidyMetaloproteidyJony niektórych metali maja zdolność wiązania się z białkami i tworzenia z nimi kompleksów, do najliczniejszych należą jony Cu2+, Mn2+, Fe3+, Zn2+, Mo3+. Stwierdzono, że w przypadku dużej ilości enzymów usunięcie jonów metali oznaczało utratę aktywności enzymatycznej. Wiele oksydaz zawiera w swej budowie jony miedzi. Natomiast jony Mn2+ działa jako aktywator syntezy glutaminowej. Tkankowe enzymy glikolityczne i proteolityczne też zawierają mangan. Anhydraza węglanowa zawiera cynk. Ferrityna i hemosydyryna, są białkami przechowującymi jony żelaza. Ferrityna jest przykładem białka składającego się z 24 podjednostek. Przechowuje ona nadmiar żelaza w postaci wodorotlenków lub tlenków tworząc micele. Każdy micel może zawierać do 4300 jonów Fe3+. Białko to jest gromadzone w wątrobie i szpiku kostnym.

ChromoproteidyChromoproteidyBiałka te zawierają chromoforową grupę prostetyczną, będącą barwnikiem. Bardzo ważne znaczenie w tej grupie mają hemoproteidy, z grupą hemową, a wśród nich najważniejsze znaczenie ma hemoglobina.Hemoglobina składa się z czterech grup hemowych i czterech łańcuchów polipeptydowych: dwóch łańcuchów a po 141 reszt aminokwasowych i dwóch łańcuchów b po 146 reszty aminokwasowe. Transportuje ona tlen cząsteczkowy, przyłączony do żelaza w grupie hemowej, z płuc do mioglobiny w mięśniach. Mioglobina zawiera jedną grupę hemową i jeden łańcuch polipeptydowy złożony z 153 aminokwasów. Tlen magazynowany jest przez tworzenie kompleksów, aż do zużycia w procesie metabolicznym. Hemoglobina jest też odpowiedzialna za przenoszenie dwutlenku węgla do płuc. Do hemoproteidów należą również takie enzymy jak katalaza i peroksydaza.

Właściwości fizyczne Właściwości fizyczne białekbiałek

Rozpuszczalność Rozpuszczalność Rozpuszczalność białek zależy o szeregu takich czynników jak: pH, rodzaj rozpuszczalnika, stężenie elektrolitu oraz typu jonów w środowisku. Ważną rolę odgrywa też charakter białka i jego cechy strukturalne. Dodatek słabo polarnych lub nie polarnych rozpuszczalników takich jak etanol lub aceton, do wodnego roztworu białka obniża względną przenikalność elektryczną układu. W efekcie obniża się rozpuszczalność i stopień hydratacji białek. Jeśli doda się odpowiednią ilość takiego rozpuszczalnika białko zaczyna się wytrącać. Bardzo ważne dla rozpuszczalności białek jest stężenie elektrolitu. Często konieczne jest utrzymanie odpowiedniego stężenia soli, aby w roztworze utrzymać białko o znacznej asymetrii w rozłożeniu ładunków. Jony soli gromadzą się na powierzchni białek i silnie podwyższają ich rozpuszczalność. Efekt wytrącenia białka po dodaniu do roztworu soli związany jest z odwodnieniem cząsteczki białka, co jest konieczne do hydratacji dużego nadmiaru elektrolitu. Do wysalania stosuje się najczęściej siarczan VI amonu, ponieważ jest dobrze rozpuszczalny w wodzie, a jego jony są silniej hydratowane niż jony chlorku sodu. Ponieważ różne białka wytrącają się przy różnym stężeniu elektrolitów, metodę tą uważa się za bardzo ważną do wstępnego rozdzielenia mieszaniny białek w łagodnych warunkach.

Masa cząsteczkowaMasa cząsteczkowa

Masa cząsteczkowa białek waha się od 105 do 106 u, w przypadku cząsteczek jednołańcuchowych, a od 5 * 104 do kilku milionów w przypadku większości białek. Do określenia masy cząsteczkowej i kształtu cząsteczek białkowych stosuje się wiele różnych metod fizyko-chemicznych, obejmujące pomiary lepkości, szybkości dyfuzji i sedymentacji w elektowirówce, określenie ruchliwości elektoferycznej i chromatograficznej oraz pomiary rozproszenia światła i ciśnienia osmotycznego.

Pomiary rozproszenia światłaPomiary rozproszenia światła

Metoda związana z rozproszeniem światła opierają się na prostej zależności: wzrost wielkości cząsteczki powoduje wzrost efektu Tyndalla. Rozproszenie mierzy się porównując natężenie światła padającego i rozproszonego pod kątem prostym. W idealnych warunkach różnica pomiędzy rozproszeniem światła w czystym rozpuszczalniku i w roztworze białka jest wprost proporcjonalna do liczby i rozmiaru cząsteczek tego białka.

Ciśnienie osmotyczneCiśnienie osmotyczneCiśnienie osmotyczne można wyznaczyć osmometrem mierząc ciśnienie par (masa cząsteczki < 20 000 u) lub osmometrem membranowym (masa cząsteczki > 20 000 u).W osmometrze membranowym ciśnienie osmotyczne określa się, mierząc różnice ciśnień hydrostatycznych w kapilarze wzorcowej i badanej. Czas potrzebny do osiągnięcia równowagi można skrócić przez zastosowanie osmometrii dynamicznej, w której mierzy się szybkość przepływu wody do lub z osmometru, przy różnych wartościach ciśnienia zewnętrznego. Szybkość ta może być automatycznie kompensowana. Metody osmometryczne obecnie są rzadko używane.

UltrawirówkaUltrawirówkaW ultrawirówce masę cząsteczek białek można wyznaczyć na dwa sposoby. Metodą pomiaru szybkości sedymentacji oraz metodą równowagi sedymentacyjnej. W rotorze wirówki umieszcza się probówki z roztworem białka. W czasie wirowania w rotorze panuje bardzo niskie ciśnienie. Za pomocą specjalnego układu optycznego podczas wirowania można mierzyć stężenie białka w każdym punkcie wirówki.W metodzie opartej na pomiarze szybkości sedymentacji konieczne jest wytworzenie takiego pola grawitacyjnego, które zapewniłoby całkowitą sedymentacje badanej substancji. Szybkość sedymentacji białka jest wprost proporcjonalna do jego masy cząsteczkowej. W celu wykonania pomiaru współczynnika sedymentacji i masy cząsteczkowej, roztwór białka umieszcza się w polu grawitacyjnym 500 000 razy silniejszym od przyciągania ziemskiego. Co można uzyskać w wirówce mającej 70 000 obrotów na minutę. Zmiany stężenia obserwuje się za pomocą specjalnego układu optycznego. Metodą tą można mierzyć gradient współczynnika refrakcji w każdym punkcie probówki. Metoda ta została opracowana przez Schlierena. Vbiałka można obliczyć, znając gęstość roztworu. Aby obliczyć masę cząsteczkową, należy też znać współczynnik dyfuzji. Dla cząsteczek globularnych można go obliczyć teoretycznie jednak w większości mamy do czynienia z białkiem nie globularnym współczynnik dyfuzji wyznacza się przez wirowanie z mniejszą prędkością i pomiar, spowodowanej dyfuzją, zmiany szerokości pliku sedymentacyjnego. Aby masę cząsteczkową za pomocą metody równowagi sedymentacyjnej nie trzeba znać współczynnika dyfuzji. W porównaniu z metoda pomiaru szybkości sedymentacji, gdy roztwór białka jest wirowany w polu 500 000 g, pole grawitacyjne używane w tej metodzie wynosi tylko 10 000-15 000 g. W tych warunkach szybkość sedymentacji cząsteczki białka jest tego samego rzędu, co szybkość ich dyfuzji w rejonach o dużym stężeniu do rejonu o mniejszym stężeniu białka. W ciągu kilku godzin lub dni ustala się równowaga pomiędzy, w której wypadkowy przepływ cząsteczki staje się równy zeru. Masę cząsteczki wyznacza się za pomocą powstałego gradientu stężeń. Wadą tej metody jest długi czas wirowania potrzebny do ustalenia się równowagi.

Białka hydrofilowe i hydrofoboweBiałka hydrofilowe i hydrofobowe

Białka hydrofilowe mają duże powinowactwo do wody. Dipole wody skupiają się wokół powierzchni białka tworząc tzw. płaszcz wodny. Białka te są dobrze rozpuszczalne w rozpuszczalnikach polarnych przy różnych wartościach pH, a także w pI. Przykładem jest albumina osocza krwi lub białko jaja kurzego. Białka hydrofobowe nie posiadają powinowactwa do rozpuszczalników polarnych ze względu, że ich powierzchnia jest utworzona jest z aminokwasów apolarnych. Białka te rozpuszczają się tylko jako kationy albo aniony, czyli są zdysocjowane i posiadają na swej powierzchni ładunki. Rozpuszczają się, więc w roztworach kwaśnych lub zasadowych w pH innym niż pI np. kazeina mleka.

Właściwości chemiczne Właściwości chemiczne białekbiałek

AmfoterycznośćAmfoterycznośćAmfoteryczny charakter białek jest wynikiem obecności i rozmieszczenia kwasowych i zasadowych grup łańcuchów bocznych, ponieważ w długim łańcuchu polipeptydowym końcowe grupy aminowa i karboksylowa, odwrotnie niż w przypadku aminokwasów, mają mały udział w tworzeniu dipolarnego charakteru cząsteczki.W roztworze kwaśnym białka mają ładunek dodatni w roztworze zasadowym ujemny, a ich stopień hydratacji i rozpuszczalność są największe w roztworach o skrajnych wartościach pH. Ruchliwość elektroforetyczną określa ładunek wypadkowy cząsteczki. W punkcie izoelektrycznym ładunki dodatnie i ujemne równoważą się. W punkcie izoelektrycznym białko wykazuje minimalną rozpuszczalność i minimalny stopień hydratacji. Punkt izoelektryczny białka można określić przez: określenie minimalnej rozpuszczalności w roztworach buforowych, elektroforetycznie przy różnym pH lub metodą ogniskowania izoelektrycznego. Białka zawierające stosunkowo dużo aminokwasów zasadowych maja wartość pI w zakresie dużych wartości pH (protoamina pI 11,8 pH), natomiast białka a z dużą ilością aminokwasów kwasowych mają pI w zakresie niskich wartości pH (pepsyna pI 1 pH).

Ważny fizjologicznie efekt buforowania białek zależy od równowagi:

W stabilizacji pH krwi dużą rolę odgrywa hemoglobina. Normalna wartość pH krwi wynosi 7,35 - 7,40. Obniżenie go o 0,5 pH zagraża życiu.

WysalanieWysalanieNiewielkie stężenie soli w nieorganicznych zwiększa rozpuszczalność białek. Jeżeli jednak stężenie soli będzie wzrastać, korzystny wpływ jonów soli na rozpuszczalność białka ustaje, a przy dużym stężeniu soli białka rozpuszczalne w wodzie będą się wytrącać z roztworów wodnych. Proces ten nazywa się wysalaniem.

Działanie wysalające dużych stężeń jonów mało cząsteczkowych polega na ich znacznie większym oddziaływaniu na cząsteczki wody w porównaniu z siłami wywołującymi uwodnienie cząsteczki białka. Sole mające możność wiązania wody rywalizują z cząsteczkami białka i odbierają im "płaszcz wodny", co zmniejsza ich rozpuszczalność i prowadzi do wytracenia z roztworu. Stężenie soli potrzebne do wysolenia zależy od właściwości białka i od pH środowiska. Białka najłatwiej wysolić w ich punkcie izoelektrycznym, gdyż wtedy ich rozpuszczalność jest najmniejsza. Solą najczęściej stosowaną do wysalania jest siarczan VI amonu. Wysalanie białek jest procesem odwracalnym, ponieważ przez obniżenie stężenia soli, np. dodanie rozpuszczalnika wytrącone białko można ponownie rozpuścić. Białko takie zachowuje wszystkie swoje właściwości, ponieważ wysalanie nie powoduje denaturacji białek.

Hydroliza Hydroliza Hydroliza białek polega na depolimeryzacji białek na poszczególne aminokwasy. Hydrolizę białek można przeprowadzać na trzy sposoby: pod wpływem kwasu, zasady lub enzymu.Hydroliza kwasowa polega na ogrzewaniu białka w roztworze HCl o stężeniu 2 mol lub roztworze H2SO4 o stężeniu 4 mol przez 18-24 h. Jednak w warunkach tych całkowitemu rozkładowi ulega tryptofan.Podczas hydrolizy zasadowej najczęściej ogrzewa się białko z NaOH o stężeniu 2 mol. Metoda ta jest praktycznie nie stosowana, ponieważ zupełnie niszczy argininę, cysteinę i treoninę.Najlepszą metodą hydrolizy białek jest hydroliza enzymatyczna, gdyż zniszczeniu nie ulegają żadne aminokwasy. Wadą tej metody jest powolność procesu, a co za tym idzie długi czas depolimeryzacji białka.Metoda hydrolizy enzymatycznej znalazła zastosowanie w określaniu sekwencji białek.

DenaturacjaDenaturacjaDenaturacją białka nazywamy takie przeprowadzenie metodami fizycznymi lub chemicznymi, zmian w strukturze białka, które prowadza do mniejszej lub większej utraty aktywności biologicznej białka, przy czym jego struktura pierwszorzędowa nie zostaje zmieniona. Podczas denaturacji w dużej mierze zniszczeniu ulegają wiązania wodorowe, a w obecności odczynników redukcyjnych rozszczepieniu ulegają wiązania disiarkowego. Często denaturacja jest odwracalna i po usunięciu czynnika denaturującego białko wraca do pierwotnej postaci. Proces ten nazywa się renaturacją. Renaturacja jest też możliwa w przypadku denaturacji redukcyjnej, ale wiele przypadków denaturacji jest nieodwracalnych.Podczas denaturacji zachodzą takie zmiany jak: zmniejszenie rozpuszczalności, może się w wyniku wyeksponowania nowych zjonizowanych grup przesunąć pH punktu izoelektrycznego. Rozwinięcie łańcucha może prowadzić do zwiększenia się lepkości, a także absorpcji w nadfiolecie. Obserwuje się też procesy agregacji i wytrącania, co jest związane z ze zmianą stopnia hydratacji i rozpuszczalności białek, a także zmianami w mostkach disiarkowych.

Fizycznymi metodami denaturacji białek są:Silne mieszanie, ogrzewanie, naświetlanie promieniami UV, rentgenowskimi i c lub działanie ultradźwiękami. Denaturacja chemiczna zachodzi pod wpływem takich związków jak:Roztwór mocznika (6-8 mol/dm3) lub guanidyny (4 mol/dm3), na skutek działania kwasów lub zasad (pH poniżej 3 lub powyżej 9), na skutek działania detergentów, roztworów soli ciężkich lub niektórych substancji organicznych takich jak: aceton, benzen, formaldehyd, benzyna. Poszczególne białka różnią się zdolnością do denaturacji.

Świecące białkaŚwiecące białkaBiałko GFP-TCTP w dzielacych sie komórkach (etapy podziału – od lewej: metafaza, anafaza i telofaza). Zielono fosforyzujace białko widac w całej komórce, ale szczególnie duzo w aparacie mitotycznym. DNA zabarwiono na niebiesko innym barwnikiem.

Amerykanie Osamu Shimomura, Martin Chalfie i Roger Y. Tsien kolejno: odkryli fluoryzujące białko o nazwie GFP, wskazali, jak wykorzystać je do badań, i ulepszyli.Komitet Noblowski stara się zatrzeć XIX-wieczną klasyfikację dziedzin nauki. Granica między badaniami chemicznymi i biologicznymi jest dziś bowiem szczególnie płynna: np. biochemia i biologia molekularna w pełni należą do obu dziedzin. Tegoroczny Nobel chemiczny zgrabnie łączy klasyczną chemię z nowoczesną biologią. Wyjaśnienie, dlaczego GFP (Green Fluorescent Protein) świeci fluoryzującym światłem, było nie lada osiągnięciem chemicznym. A z wiedzy tej korzysta biologia, medycyna, neurologia czy embriologia.W połowie lat 50. profesor Yashimasa Hirata z Uniwersytetu w Nagoi wyznaczył młodemu asystentowi Osamu Shimomurze trudny temat badawczy. Chodziło o odkrycie, co wywołuje świecenie morskiego skorupiaka o nazwie Cyprinda. Shimomura poradził sobie z zadaniem nadzwyczaj dobrze i już po roku doniósł, że fluoryzującą substancją żyjątka jest białko. Prof. Hirata wysłał ucznia na kolejne badania do prof. Franka Johnsona z prestiżowego University of Princeton w USA. Shimomura i Johnson skupili się na świecącej meduzie Aequorea victoria. Już w 1962 r. opisali białko podobne do barwnika japońskiej Cyprindy, które nazwali ekworyną. Następnie zauważyli, że ekworyna współpracuje z innym białkiem dającym w świetle ultrafioletowym zielonkawą poświatę. W ten właśnie sposób odkryto GFP.

Jak wykorzystać GFP, pokazał drugi tegoroczny Noblista – Martin Chalfie. Dowiedział się o jego istnieniu dopiero w 1988 r., i to przypadkiem, słuchając seminarium na temat bioluminescencji. Sam interesował się rozwojem układu nerwowego, świecące białka meduzy były dlań równie odległe, co nieznane. Zafascynowany, postanowił sprawdzić, czy uda się użyć GFP jako znacznika komórek. Pomysł był tyleż prosty, co szalony. Chalfie rozumował tak: skoro GFP świeci samoistnie w komórkach meduzy (co wykazał Shimomura), to może zaświeci również w komórkach innych organizmów?Ale jak wprowadzić GFP do tych komórek? Chalfie dowiedział się, że Douglas Prasher z Oceanographic Institution w Woods Hole koło Bostonu zidentyfikował i wyizolował (w języku naukowym – sklonował) gen meduzy odpowiedzialny za produkcję GFP. Poprosił go o przysłanie próbek. Z początku Prasher nieszczególnie chciał się dzielić osiągnięciem, w końcu jednak się zgodził. Chalfie wprowadził ów gen do DNA bakterii i po pewnym czasie zaczęły one świecić zieloną poświatą. Następnie umieścił ten sam gen meduzy w DNA małego, przeźroczystego nicienia, i to w wybranych jego komórkach nerwowych. To był strzał w dziesiątkę. Neurony, do których wprowadzono gen, świeciły pod mikroskopem, podczas gdy inne komórki nicienia – nie. Stało się oczywiste, że można używać GFP jako świecącego znacznika komórek dowolnych organizmów.Dzięki zabiegom łączenia ze sobą DNA różnych organizmów (zwanego transgenezą) zaczęto włączać GFP do wybranych genów muszki owocowej, myszy, małpy i człowieka, tworząc tzw. geny hybrydowe.

Taki gen składa się z dwóch części: jedna koduje badane białko, druga GFP. Produkuje on hybrydowe białko – jedno, ale zbudowane z obu części. Przykładowo w moim laboratorium skonstruowaliśmy hybrydowy gen, który produkuje pojedyncze białko złożone z nowotworowego białka o nazwie TCTP i świecącego GFP. Obserwując pod mikroskopem komórki produkujące takie białko, możemy określić, gdzie się ono znajduje, bo umiejscawia się ono tam, gdzie jego niewidoczny odpowiednik. W ten sposób wykazaliśmy, że białko GFP-TCTP łączy się zarówno z włóknistym aparatem podziałowym wokół DNA (zob. zdjęcia), jak i z wieloma innymi włókienkami komórki rakowej. Współdziałanie TCTP z wewnątrzkomórkowymi mikroskopijnymi włóknami bierze udział w procesie nowotworzenia, a szczególnie w groźnym dla życia powstawaniu przerzutów.Tak można śledzić losy dowolnego białka. Używamy tej technologii także do doświadczeń, które mają pomóc zrozumieć przyczyny zespołu Downa. Wspólnie z dr. Zbigniewem Polańskim z Zakładu Genetyki i Ewolucjonizmu UJ wprowadzamy hybrydowy gen GFP-cyklina B (białko, za którego odkrycie przyznano medycznego Nobla w 2001 r. Brytyjczykowi Timowi Huntowi) do komórek jajowych myszy. Fluoryzujące w komórkach jajowych białko zachowuje się tak samo jak naturalna cyklina B: jest cyklicznie niszczone i odtwarzane, gdy komórki jajowe uzyskują zdolność do zapłodnienia. Prawidłowy przebieg tego procesu (za opis mechanizmu niszczenia nie tylko cykliny B, ale i wielu innych białek, przyznano Nobla z chemii w 2004 r.) jest krytyczny dla kontroli rozdzielania DNA komórek. Wiadomo, że zła jakość tej kontroli bywa przyczyną zespołu Downa. Badanie GFP-cykliny B u myszy, a nie u ludzi, oprócz przyczyn etycznych, ma dodatkowy plus: możemy użyć komórek jajowych genetycznie modyfikowanych myszy pozbawionych wybranych genów, które kontrolują podział komórki (za opracowanie metody uzyskiwania takich myszy przyznano medycznego Nobla w zeszłym roku). Ustaliliśmy niedawno, jak jeden z takich genów (o nazwie MOS) kontroluje niszczenie i odtwarzanie GFP-cykliny B. Do dokładnego opisu mechanizmu wywołującego zespół Downa droga daleka, ale nasze badania przybliżają rozwiązanie zagadki.

Bywa jednak, że zielona fluorescencja szkodzi badanym komórkom. Dlatego naukowcy marzyli od dawna, by uzyskać GFP świecące na czerwono – najlepiej tolerowany przez komórki kolor światła. To marzenie spełnił trzeci noblista, Roger Y. Tsien. Nie tylko wyjaśnił wiele chemicznych zagadek związanych z emisją światła przez GFP, ale modyfikując jego gen, stworzył odmiany dające całą paletę barw. Możliwe stało się badanie w tej samej komórce wielu różnych białek naraz (np. białka TCTP zabarwionego klasycznym zielonym GFP i cykliny B – czerwonym).Zastosowań GFP i jego pochodnych jest o wiele więcej. Konstruuje się genetycznie zmodyfikowane organizmy (bakterie, drożdże, żaby) z hybrydowym genem zawierającym GFP. Ów gen zaczyna produkować fluoryzujące białko pod wpływem np. trucizn: arszeniku czy innych substancji zanieczyszczających wodę. Mierząc intensywność fluorescencji GFP (co można łatwo zautomatyzować), bada się zanieczyszczenie wody.Jak to często w nauce bywa, drobne odkrycie dotyczące egzotycznego jamochłona okazało się jednym z najważniejszych narzędzi w dzisiejszej biologii i medycynie.