Besnoitiosis bovina: descripción y análisis de un brote … · Al laboratorio Saluvet de la...

Besnoitiosis bovina: descripción y análisis de

un brote en una explotación extensiva de una

zona endémica del Pirineo aragonés

Memoria presentada por la licenciada

Dª. Adriana Esteban Gil

Para optar al grado de Doctor en Veterinaria

Dirigida por los Doctores

D. Juan Antonio Castillo Hernández y

D. Carlos Calvete Margolles

Zaragoza, Noviembre 2015

D. Juan Antonio Castillo Hérnandez, Catedrático de Universidad del

Departamento de Patología Animal de la Facultad de Veterinaria de la

Universidad de Zaragoza,

D. Carlos Calvete Margolles, Investigador de la Unidad de Sanidad Animal

del Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria del Gobierno de

Aragón,

INFORMAN:

Que la memoria titulada “Besnoitiosis bovina: descripción y análisis de

un brote en una explotación extensiva de una zona endémica del

Pirineo aragonés”, presentada por la Licenciada en Veterinaria Dª. Adriana

Esteban Gil, ha sido realizada bajo su dirección, cumpliendo los requisitos

exigidos en la legislación vigente y ajustándose al proyecto de Tesis Doctoral

inicialmente presentado para optar al grado de Doctor en Veterinaria.

Zaragoza, a 10 de noviembre de 2015.

Juan Antonio Castillo Hernández Carlos Calvete Margolles

Doctor en Veterinaria Doctor en Veterinaria

Este trabajo ha sido realizado gracias a

la colaboración de la Dirección General de

Alimentación y Fomento Agroalimentario

del Departamento de Agricultura,

Ganadería y Medio Ambiente del

Gobierno de Aragón mediante el contrato

OTRI 2011/1023.

“Si no conozco una cosa, la investigaré”

Louis Pasteur

A mis padres, Arsenio y Maribel

A mi hermano, Eduardo

A Aitor

AGRADECIMIENTOS

Agradecimientos

Cuántas son las veces que a lo largo del doctorado he pensado en estas

líneas y de lo mucho que me quedaba por caminar para llegar hasta aquí.

Sin embargo, poco a poco, todo ha ido tomando forma y de repente me

encuentro frente a ellas, escribiéndolas. Tengo la sensación de que los

últimos meses han sido una carrera a largo plazo sin descanso y que por fin,

casi sin darme cuenta de ello, estamos aquí. Llegados a este punto, me

viene a la mente una gran cantidad de personas sin las que su aportación,

por pequeña que haya sido, este trabajo no hubiera sido posible.

En primer lugar, deseo expresar mis agradecimientos a todas aquellas

personas e instituciones que han contribuido de una forma u otra en la

elaboración de esta tesis.

A mis directores, Juan Antonio Castillo, muchas gracias por haberme dado la

oportunidad de formar parte de su equipo, por transmitirme su experiencia y

su afición por la Parasitología, por su paciencia y por apoyarme en todo

momento durante esta etapa. A Carlos Calvete Margolles, agradecerle todo

su apoyo, dedicación y guía durante estos meses. No sabría decir la cantidad

de dudas que me habrá resuelto, y a cual más rápida, sin su ayuda todavía

me vería atascada entre cientos de números. Gracias por enseñarme a jugar

con los datos, a ordenarlos y a escucharlos para conocer todo lo que ellos nos

tienen que contar. En definitiva, muchas gracias a los dos por todo lo que he

aprendido de vosotros.

A la Dirección General de Alimentación y Fomento Agroalimentario del

Departamento de Agricultura, Ganadería y Medio Ambiente del Gobierno de

Aragón por la financiación económica de una gran parte de este trabajo y por

las facilidades para la obtención de datos imprescindibles para su finalización.

Dentro de la Dirección General de Alimento y Fomento Agroalimentario,

nuestro especial reconocimiento a D. Javier Gracia Gasca y D. Enrique

Novales Allué.

De igual manera me gustaría agradecer al personal del Centro de

Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA). En especial a

Isabel Casasús y todo su equipo, pilar fundamental que ha hecho posible este

trabajo que presento. También, al resto de compañeros del edificio de

investigación agroalimentaria del CITA por hacerme sentir como una más

Agradecimientos

desde el primer día. Y por supuesto, a las “Pardas” y las “Piris” de Bescós,

grandes protagonistas de este trabajo.

Al Centro de Investigaciones Biológicas del CSIC, más concretamente a

Vicente Larraga y su grupo, y al equipo de CZ Veterinaria, con Esteban

Rodríguez al frente, por su apoyo personal, sin ellos, no hubiera sido tan fácil

llegar hasta aquí.

Al laboratorio Saluvet de la Universidad Complutense de Madrid por su

asesoramiento y apoyo técnico en la realización de este trabajo.

A los profesores y becarios del área de Parasitología y enfermedades

parasitarias de la Facultad de Veterinaria de Zaragoza, todo mi cariño y

agradecimiento. A Javier, Chusa, Peribáñez y Alberto Cortés, gracias por el

interés y apoyo que he recibido de vuestra parte, hacéis que formemos una

gran familia. A los compañeros que me han acompañado durante este

tiempo, Rocío, Víctor, Pedro, Rosa, Mikel, Julieta, Ana Peris y Ana Muñoz,

gracias por compartir estos años conmigo y haberme hecho sentir como en

casa. A Sarah y Paz, muchas gracias por todo, por escucharme siempre, por

darme consejos, por apoyarme incondicionalmente e incluso por aguantarme

en los momentos difíciles. Sé que aparte de dos compañeras, me llevo dos

grandes amigas. Paz, con esa frase que a mi tanto me gusta ”yo, si fuera tú”

te animo a hacer todo aquello que te propongas, estoy segura de que lo

conseguirás. Y Sari, “Supermami Mosquita”, con esa dedicación y pasión que

tienes hacia tu trabajo ojalá sigas siendo siempre nuestra “vigilante de los

pequeños invasores”, en tus manos, estamos seguros. Te deseo todo lo

mejor en el mundo de la entomología, te lo mereces. A las dos, espero veros

pronto en la misma situación en la que yo me encuentro ahora, aunque parte

de esta tesis también es vuestra. Agradecer igualmente a nuestro último

fichaje Charly, su apoyo, como bien me dijo él un día parece que “alguien” lo

hubiera puesto junto a mi mesa para ayudarme en la recta final. Gracias

también a Josemi, parte de lo que he aprendido en esta etapa se lo debo a él.

Por último a Nachete, muchas gracias por tu ayuda y por ser cómplice de la

mención internacional de este trabajo.

Agradecimientos

A los profesores y compañeros de los departamentos vecinos de Infecciosas,

Genética y Reproducción (Nabil, Nacho de Blas, Héctor, Ana Rosa, Olga y

Rodrigo), muchas gracias por atender mis dudas cuando os he necesitado y

por vuestra siempre dispuesta ayuda ya sea de material, de conocimiento o

de consejos.

También me gustaría agradecer a los profesores Philippe Jacquiet y Nicole

Hagen de la Facultad de Veterinaria de Toulouse por su agradable acogida y

por haberme dado la oportunidad de realizar una estancia de doctorado tan

fructífera y con un comienzo en un entorno inolvidable como fue los Alpes.

Volviendo a la Facultad, me gustaría dar las gracias al personal de cafetería,

Manolo, Julián y Nati, por darme con sus cafés la energía necesaria para

comenzar cada jornada, sobre todo en las últimas semanas cuando más lo he

necesitado.

A mis amigos de la carrera, sobre todo a Laura y Nuria, por estar siempre

ahí, por todos los momentos que hemos pasado juntas y por hacer que

Veterinaria se convirtiera en nuestra segunda casa.

A los compañeros de Máster, muchos de ellos también de doctorado, en

especial a Carlos Hedman, compañero de este viaje desde Honduras, hasta

Zaragoza pasando por Toulouse.

A mis amigos, porque su apoyo y sus risas en las horas de desconexión se

convierten en momentos indispensables para seguir adelante.

A toda mi familia, en especial a mis padres, Arsenio y Maribel, por depositar

su confianza en mí, por enseñarme a no reblar nunca y por animarme a

seguir siempre adelante. Muchas gracias por ponerme las cosas tan fáciles

para llegar hasta aquí. Todo vuestro apoyo incondicional ya sea moral,

material e incluso económico tiene para mí un valor incalculable, gracias de

todo corazón. A mi hermano, agradecerle por sus sabios consejos y por el

apoyo técnico, tanto digital como revisor. Edu, algunas pequeñas pero no

poco importantes aportaciones de esta tesis son tuyas, muitas gracias.

Agradecimientos

Por último, me gustaría agradecer a Aitor, parte del esfuerzo que hay en esta

tesis es suyo. Eskerrik asko beti nire ondoan egoteagatik, niretan sinestu eta

elkarren artean eratutako etorkizunaren aldeko apostua egiteagatik. Zure

laguntza eta babesik gabe, ezingo genuke jarraitu behin Irlandan hasitako

bide hau.

Gracias a todos ellos por acompañarme hasta aquí.

ÍNDICE

Índice

i

ÍNDICE

1-INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS............................................................ 1

2-REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ................................................................ 5

2.1-INTRODUCCIÓN ............................................................................ 5

2.2-ANTECEDENTES HISTÓRICOS ....................................................... 7

2.3-GENERALIDADES SOBRE LA BESNOITIOSIS BOVINA ................. 9

2.3.1-ETIOLOGÍA ................................................................................. 9

2.3.1.1-CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA............................................... 9

2.3.1.2-MORFOLOGÍA...................................................................... 12

2.3.1.3-CICLO BIOLÓGICO .............................................................. 18

2.3.2-EPIDEMIOLOGÍA DESCRIPTIVA .................................................. 19

2.3.2.1-DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA .............................................. 19

2.3.2.2-ESTUDIOS EPIDEMIOLÓGICOS PREVIOS .............................. 24

2.3.2.3-FACTORES DE RIESGO ASOCIADOS ..................................... 26

2.3.3-EPIDEMIOLOGÍA ANALÍTICA ...................................................... 28

2.3.3.1-CICLO HETEROXENO ........................................................... 29

2.3.3.2-CICLO MONOXENO .............................................................. 33

2.3.3.3-TRANSMISIÓN VERTICAL..................................................... 37

2.3.3.4-POSIBLES RESERVORIOS .................................................... 37

2.3.4-PATOGENIA, CUADRO CLÍNICO Y LESIONES............................... 38

2.3.4.1-INMUNIDAD ........................................................................ 38

2.3.4.2-SIGNOS CLÍNICOS, PATOGENIA Y LESIONES ....................... 39

2.3.4.3-ANIMALES ASINTOMÁTICOS ................................................ 45

2.3.5-DIAGNÓSTICO .......................................................................... 45

2.3.5.1-DIAGNÓSTICO CLÍNICO-EPIDEMIOLÓGICO .......................... 45

2.3.5.2-DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL ............................................... 46

Índice

ii

2.3.5.3-DIAGNÓSTICO LABORATORIAL O DE CONFIRMACIÓN........... 49

2.3.6-MÉTODOS DE LUCHA ................................................................ 54

2.3.6.1-TRATAMIENTO .................................................................... 54

2.3.6.2-PROFILAXIS........................................................................ 55

3-MATERIAL Y MÉTODOS ..................................................................... 59

3.1-CONTEXTO DEL ESTUDIO............................................................ 59

3.2-DESCRIPCIÓN DEL ÁREA Y PERIODO DEL ESTUDIO ................. 59

3.3-DISEÑO DEL ESTUDIO ................................................................ 64

3.3.1-ESTUDIO SEROEPIDEMIOLÓGICO .............................................. 65

3.3.1.1-ENCUESTAS EPIDEMIOLÓGICAS Y TOMA DE MUESTRAS ....... 65

3.3.1.2-TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS .................................................. 68

3.3.1.3-ANÁLISIS ESTADÍSTICO Y EPIDEMIOLÓGICO DE LOS

RESULTADOS.................................................................................. 74

3.3.2-ESTUDIO REPRODUCTIVO ......................................................... 79



RESULTADOS.................................................................................. 81

3.3.3-ESTUDIO MOLECULAR ............................................................... 81


3.3.3.2-TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS .................................................. 83


RESULTADOS.................................................................................. 87

4-RESULTADOS ..................................................................................... 91

4. 1-ESTUDIO SEROEPIDEMIOLÓGICO ............................................. 91

4.1.1-CARACTERÍSTICAS DE LA MUESTRA .......................................... 91

4.1.2-ELECCIÓN DE LA TÉCNICA SEROLÓGICA ÓPTIMA ....................... 96

4.1.2.1-EVALUACIÓN DE LA FIABILIDAD .......................................... 96

4.1.2.2-EVALUACIÓN DE LA CONCORDANCIA Y CORRELACIÓN ENTRE

LA TÉCNICAS DE IFI Y ELISA ........................................................... 97

Índice

iii

4.1.3-ESTUDIO DE LA POBLACIÓN ADULTA ......................................... 98

4.1.3.1-DISTRIBUCIÓN Y EVOLUCIÓN DE LA INFECCIÓN Y LA

ENFERMEDAD: MEDIDAS TRANSVERSALES Y LONGITUDINALES........ 98

4.1.3.2-ANÁLISIS DE LOS FACTORES DE RIESGO AL INICIO DEL

ESTUDIO ...................................................................................... 101

4.1.3.3. ANÁLISIS DE LA DINÁMICA DE LA INFECCIÓN Y LA APARICIÓN

DE CASOS DE ENFERMEDAD.......................................................... 102

4.1.4-ESTUDIO DE LA DESCENDENCIA ............................................. 111

4.1.4.1-DISTRIBUCIÓN DE LA INFECCIÓN Y LA ENFERMEDAD:

MEDIDAS TRANSVERSALES ........................................................... 111

4.1.4.2-ANÁLISIS DE LA DINÁMICA DE LA INFECCIÓN Y LA APARICIÓN

DE CASOS DE ENFERMEDAD.......................................................... 115

4.2-ESTUDIO REPRODUCTIVO ....................................................... 118

4.2.1-DESCRIPCIÓN DE LOS ÍNDICES REPRODUCTIVOS HISTÓRICOS

DEL REBAÑO.................................................................................... 118

4.2.2-INFLUENCIA DE LA INFECCIÓN POR B.BESNOITI SOBRE LA

EFICIENCIA REPRODUCTIVA DEL REBAÑO......................................... 120

4.2.2.1-EVALUACIÓN DE LA EFICIENCIA REPRODUCTIVA DE LAS

HEMBRAS ..................................................................................... 120

4.2.2.2-EVALUACIÓN DE LA EFICIENCIA REPRODUCTIVA DE LOS

MACHOS ....................................................................................... 124

4.3-ESTUDIO MOLECULAR .............................................................. 124

4.3.1-DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LA FASE AGUDA ....................... 125

4.3.2-DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LA FASE CRÓNICA.................... 126

5-DISCUSIÓN ..................................................................................... 129

5.1-ESTUDIO SEROEPIDEMIOLÓGICO ........................................... 130

5.1.1-ELECCIÓN DE LA TÉCNICA SEROLÓGICA ÓPTIMA ..................... 130

5.1.2-ESTUDIO DE LA POBLACIÓN ADULTA ....................................... 132


ENFERMEDAD: MEDIDAS TRANSVERSALES Y LONGITUDINALES...... 132


ESTUDIO ...................................................................................... 135

Índice

iv


DE CASOS DE ENFERMEDAD ......................................................... 136

5.1.3-ESTUDIO DE LA DESCENDENCIA ............................................. 141


MEDIDAS TRANSVERSALES ........................................................... 141


DE CASOS DE ENFERMEDAD ......................................................... 143

5.2-ESTUDIO REPRODUCTIVO ........................................................145


DEL REBAÑO ................................................................................... 146


EFICIENCIA REPRODUCTIVA DEL REBAÑO ........................................ 148


HEMBRAS ..................................................................................... 148


MACHOS....................................................................................... 150

5.3-ESTUDIO MOLECULAR...............................................................151

5.3.1-DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LA FASE AGUDA....................... 151

5.3.2-DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LA FASE CRÓNICA ................... 152

5.4-RECOMENDACIONES .................................................................154

6-CONCLUSIONES...............................................................................157

7-CONCLUSIONS.................................................................................159

8-RESUMEN .........................................................................................161

9-SUMMARY ........................................................................................165

10-BIBLIOGRAFÍA ..............................................................................169

11-ÍNDICE DE FIGURAS .....................................................................187

12-ÍNDICE DE TABLAS .......................................................................191

13-ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS .......................................................193

INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS

Introducción y objetivos

1

1-INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS

La besnoitiosis bovina es una enfermedad parasitaria causada por Besnoitia

besnoiti (Besnoit & Robin, 1912), un protozoo del phylum Apicomplexa que

se halla estrechamente relacionado con los géneros Toxoplasma, Neospora y

Hammondia. Hasta el momento, el género Besnoitia engloba 10 especies

diferentes que afectan a roedores, lagomorfos, marsupiales y ungulados,

tanto domésticos como silvestres. Besnoitia besnoiti ha sido principalmente

descrita en el ganado bovino aunque también se ha encontrado en otros

rumiantes como antílopes, ciervos y corzos que podrían estar actuando como

reservorios silvestres de la enfermedad.

Se trata de una patología tradicionalmente endémica en zonas del África

subsahariana y Asia. Descrita desde principios del siglo XX en el continente

europeo, en los últimos años la besnoitiosis bovina ha vuelto a cobrar

importancia al experimentar un aumento en su prevalencia y una expansión

geográfica, lo que ha llevado a considerarla actualmente como una

enfermedad emergente en Europa (EFSA, 2010). Existen varias hipótesis

para explicar esta reciente expansión de la enfermedad. Por un lado, el papel

que pueden jugar algunos animales silvestres (también hospedadores

intermediarios) como posibles reservorios del parásito. Por otro, al tratarse

de una parasitosis mayoritariamente subclínica en la que los animales con

signos clínicos representan un pequeño porcentaje, la introducción de

animales infectados de manera subclínica en áreas libres supone una práctica

de riesgo que puede favorecer la transmisión de la enfermedad. Finalmente,

el aumento del periodo y el área de actividad del ciclo natural de los vectores

a causa del cambio climático también podría estar contribuyendo a su

diseminación.

Desde el punto de vista económico, se trata de una patología con especial

relevancia para el sector bovino debido a las importantes pérdidas que puede

causar a los productores como consecuencia del tratamiento de los animales

afectados, de la instauración de medidas de lucha frente a la infección (como

los controles serológicos o los tratamientos con insecticidas), del descenso en

la productividad del rebaño, de la aparición de problemas reproductivos en


2

los sementales y del progresivo deterioro y depreciación que sufren los

animales enfermos. Un aproximación al coste total que soportan aquellas

explotaciones que conviven con la besnoitiosis bovina realizada en Francia

sitúa las pérdidas económicas en torno a 55 €/animal.año¹ (Duboisset,

2013).

Muchos de los aspectos relacionados con la epidemiología de la enfermedad y

el ciclo biológico del parásito como son la prevalencia e incidencia de

infección en áreas endémicas o los factores de riesgo asociados presentan

numerosas incertidumbres en la actualidad. Además, la única vía de

transmisión del parásito confirmada por el momento es la transmisión

horizontal, ya sea bien por el contacto directo a través de escoriaciones en la

piel y mucosas o bien por una transmisión mecánica mediante insectos

vectores (tabánidos, Stomoxys y moscas hematófagas).

En cuanto a las posibilidades de control de la besnoitiosis bovina, las

actuaciones en base a medidas profilácticas son muy limitadas ya que no

existe un tratamiento eficaz que impida el desarrollo de la infección y

tampoco se dispone de vacunas comercializadas.

En este contexto, el principal objetivo del presente trabajo ha sido

profundizar en el conocimiento de la epidemiología de la besnoitiosis bovina

mediante el estudio y seguimiento de un brote en una explotación extensiva

de una zona endémica del Pirineo aragonés. Para ello, se procedió al

desarrollo y consecución de los siguientes objetivos secundarios:

1. Identificar los principales factores de riesgo involucrados en la

dinámica de la infección y en la aparición de casos de enfermedad en

el brote.

2. Determinar la influencia de la infección por B. besnoiti sobre la

eficiencia reproductiva del rebaño.

3. Evaluar la técnica de diagnóstico molecular de PCR cuantitativa como

método de diagnóstico durante la fase aguda y la fase crónica de la

besnoitiosis bovina.


3

Los resultados obtenidos han permitido identificar alguno de los principales

factores de riesgo asociados a la infección y al desarrollo de la enfermedad en

el brote estudiado así como confirmar la utilidad del diagnóstico molecular de

la besnoitiosis bovina mediante la técnica de PCR. En base a esta

información ha sido posible recomendar una serie de estrategias de control

encaminadas principalmente hacia el diagnóstico precoz de los casos y la

instauración de medidas preventivas de manejo que limiten la transmisión del

parásito en los rebaños.

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

Revisión bibliográfica

5

2-REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1-INTRODUCCIÓN

La besnotiosis bovina, también conocida como globidiosis, elefantiasis bovina,

anasarca de los bóvidos o sarcosporidiosis cutánea, es una enfermedad

parasitaria del ganado bovino causada por el protozoo Besnoitia besnoiti

(Besnoit & Robin, 1912; Marotel, 1912) Henry, 1913. Este patógeno se trata

de un parásito esporozoario intracelular obligado perteneciente a la familia

Sarcocystidae.

Afecta principalmente al ganado bovino, tanto de carne como de leche, sin

aparente predisposición de raza y sexo. En cuanto a la edad, la probabilidad

de que un animal se infecte parece aumentar con ella (Fernández-García et

al., 2010; Jacquiet et al., 2010; Álvarez-García et al., 2014b), siendo los

bóvidos menores de 6 meses raramente sensibles al desarrollo clínico de la

enfermedad.

La mayor parte de los animales afectados resultan asintomáticos y no

desarrollan signos clínicos. Sin embargo, cuando éstos aparecen, el cuadro

clínico de la enfermedad presenta tres etapas consecutivas de intensidad

creciente: una primera fase aguda febril con descargas nasales y oculares,

una segunda fase subaguda de edemas seguida por una fase crónica de

esclerodermia.

Los principales focos de besnoitiosis bovina se localizan fundamentalmente en

zonas de montaña, donde los sistemas de ganadería extensiva y la monta

natural son prácticas habituales. La presencia de animales afectados en una

explotación puede suponer un inconveniente para los productores ya que

éstos causan importantes pérdidas económicas consecuencia del descenso en

su producción y de la posible aparición de alteraciones en la reproducción

provocadas por la enfermedad tales como abortos (Pols, 1960) e infertilidad

(Kumi-Diaka et al., 1981; Cortes et al., 2009).

Se trata de una enfermedad tradicionalmente endémica en Europa, África

subsahariana y Asia, que recientemente ha sido declarada como emergente


6

en el continente europeo (EFSA, 2010). Tal y como se ha expuesto

anteriormente, esta situación de expansión de la enfermedad podría ser

atribuida por una parte a su carácter vectorial, ya que la actividad de muchos

insectos vectores está viéndose aumentada a causa del cambio climático. Por

otra parte, la extensión del comercio de ganado entre diferentes países con

fines de mejora genética podría contribuir también a la transmisión de la

enfermedad, principalmente a través de aquellos animales infectados que

padecen la enfermedad de forma subclínica. Por último, el hecho de que

algunos de los aspectos epidemiológicos más importantes de la besnoitiosis

bovina, como por ejemplo su hospedador definitivo, permanezcan indefinidos

a día de hoy, impide llevar a cabo eficaces medidas de control sobre la

transmisión del parásito.


7

2.2-ANTECEDENTES HISTÓRICOS

Las primeras referencias bibliográficas de la enfermedad datan de finales del

siglo IV, época en la cual Végèce, recogiendo textos previos de Caton,

Columela y Pélagonios, describe los signos clínicos de la fase crónica de una

enfermedad a la que denomina elefantiasis (Franc et al., 1987).

En 1884, Cadéac hace una descripción de la enfermedad en ganado bovino

procedente del sur de Francia y la denomina como elefantiasis y anasarca de

los bóvidos (Cadéac, 1884).

Sin embargo fue varias décadas más tarde, en el año 1912, cuando los

profesores de la Escuela Veterinaria de Toulouse Besnoit y Robin describen

por primera vez la etiología de la enfermedad al aislar formas quísticas del

parásito en las lesiones cutáneas de una vaca, denominándola como

sarcosporidiosis cutánea (Besnoit & Robin, 1912). En ese mismo año,

Marotel describe también por primera vez el parásito en Sudáfrica, donde fue

denominado Gastrocystis besnoiti (Marotel, 1912). En 1913, Henry definió

el género y la especie del parásito como Globidum besnoiti (Henry, 1913).

Por otro lado, tres años más tarde, Franco y Borges describieron otros casos

de la enfermedad en animales procedentes de la zona del Alentejo, al sur de

Portugal (Franco & Borges, 1916).

Según la cita de Franc y cols. (Franc et al., 1987), los investigadores Cuillé,

Chelle y Berlureau lograron en el año 1936 la transmisión y la reproducción

experimental de la enfermedad mediante la inoculación de sangre procedente

de un animal en la fase febril inicial de la infección. Estos mismos autores

remarcan también el carácter contagioso de la enfermedad y el interés

terapéutico del uso de inyecciones intravenosas de formol descrito por

Berthelon y Labeyrie en torno a esa época para el tratamiento de animales en

fases iniciales (Franc et al., 1987). Del mismo modo hacen referencia a

Dusart, quién recomendaba en sus textos el uso de sulfamidas para el

tratamiento de la enfermedad.


8

La nomenclatura actual del parásito, Besnoitia besnoiti, fue definida por

Jellison en el año 1956 en honor a la primera descripción del parásito

realizada por Besnoit y Robin en 1912 (Jellison, 1956).

De igual interés histórico resultan los diversos trabajos publicados por Pols en

los años 50. En 1954, Pols confirmó el trabajo realizado previamente por

Cuillé, Chelle y Berlureau al reproducir experimentalmente la enfermedad

mediante la inoculación de las formas proliferantes del parásito (trofozoítos)

en el ganado bovino y en conejo (Pols, 1954a). A su vez, este autor

demostró microscópicamente los citados trofozoítos, localizados tanto de

manera libre como en el interior de monocitos, en improntas de sangre y

nódulos linfáticos durante la fase febril inicial de la besnoitiosis. Además,

Pols planteó la fisión binaria como principal mecanismo de multiplicación del

parásito y realizó una primera descripción de la morfología de las formas

quísticas de B. besnoiti (Pols, 1954b). Por último, en el año 1960 Pols

apuntó que la sintomatología desarrollada a partir de una infección artificial

inducida mediante la inoculación de formas proliferantes era leve, y que la

mayoría de animales que sobrevivían a la fase aguda de la enfermedad

quedaban como portadores de quistes parasitarios, lo que le llevó a señalar la

posibilidad de que estos individuos actuaran como reservorios de la

enfermedad (Pols, 1960).

En 1967 Bigalke logró reproducir artificialmente la enfermedad a partir de

inóculos que contenían una suspensión de tejido rico en quistes parasitarios

procedentes de un animal infectado de manera crónica. Este autor observó

también que la mayor parte de los animales infectados no presentaba una

sintomatología aparente, lo que respaldaba la teoría de la existencia de

reservorios de la enfermedad. Este investigador llegó incluso a plantear la

idea de una posible transmisión mecánica de la enfermedad por medio de

vectores artrópodos hematófagos (Glossina spp., tábanos o Stomoxys spp.)

(Bigalke, 1967), hipótesis que demostró un año más tarde (Bigalke, 1968).

En base al estudio llevado a cabo por Peteshev en 1974 (Peteshev et al.,

1974), donde se mostró el papel del gato doméstico y silvestre como posible

hospedador definitivo de la besnoitiosis bovina, y debido a la existencia de

distintos estudios con similares resultados para otras especies del género


9

Besnoitia (Rommel, 1975), este carnívoro fue aceptado como potencial

hospedador definitivo de la enfermedad. No obstante, según la descripción

realizada en ese trabajo, previsiblemente se tratase de Toxoplasma gondii.

Asimismo, varios estudios realizados posteriormente por diferentes autores,

en los cuales se llegó a valorar más de 20 especies de animales, no lograron

confirmar dichos resultados (Diesing et al., 1988).

Además de todas las razas del ganado vacuno, varios estudios realizados

durante los años 60 incluyen también a los óvidos, cápridos y algunos

rumiantes silvestres (antílope, ñu y gran kudú) en el rango de hospedadores

intermediarios de la besnoitiosis bovina (Basson et al., 1965; Bigalke, 1967;

Bwangamoi, 1967).

2.3-GENERALIDADES SOBRE LA BESNOITIOSIS BOVINA

2.3.1-ETIOLOGÍA

2.3.1.1-CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA

Clasificación basada en criterios fenotípicos:

El agente causal de la besnoitiosis bovina fue aislado por primera vez en

1912 por Besnoit y Robin (Besnoit & Robin, 1912), si bien no fue hasta el año

1956 cuando fue nombrado como Besnoitia besnoiti y se incluyó dentro del

género Besnoitia (Jellison, 1956).

Se trata de un protozoo esporozoario intracelular obligado. La posición del

género Besnoitia en la clasificación de Levine es la siguiente (Levine, 1982):

-Phylum Sporozoa (Apicomplexa) (Levine, 1970)

-Clase Sporozoasida (Leuckart, 1879)

-Subclase Coccidiasina (Leuckart, 1879)

-Orden Eucoccidiorida (Léger & Duboscq, 1910)


10

-Suborden Eimeriorina (Léger, 1910)

-Familia Sarcocystidae (Poche, 1913)

-Subfamilia Toxoplasmatinae (Biocca, 1956)

-Género Besnoitia (Henry, 1913)

A pesar de que actualmente el ciclo de B. besnoiti continua en parte

desconocido, debido a la analogía con otras especies del género Besnoitia

descritas en su totalidad, se sospecha que el parásito presenta un ciclo

coccidiano de tipo heteroxeno. Se caracterizaría por presentar un ciclo

intracelular intestinal en el hospedador definitivo (HD) con una reproducción

asexual o merogonia (formación de merozoítos) y una gametogonia

(formación de ooquistes), seguida de una esporogonia (formación de

esporozoítos) que tendría lugar en el exterior. Una vez los ooquistes

esporulados son ingeridos por el hospedador intermediario (HI), se sucedería

un ciclo extraintestinal donde se distinguiría una primera fase de proliferación

(multiplicación de taquizoítos con formación de pseudo-quistes

principalmente en los monocitos y en las células de los endotelios

vasculares), seguida de una fase quística de multiplicación asexual o

merogonia (en los fibroblastos) (Frenkel, 1977; Levine, 1982).

Hasta la actualidad han sido descritas 10 especies dentro del género

Besnoitia, que afectan a pequeños y grandes mamíferos, tanto domésticos

como silvestres: Besnoitia akodoni, Besnoitia bennetti, Besnoitia besnoiti,

Besnoitia caprae, Besnoitia darlingi, Besnoitia jellisoni, Besnoitia oryctofelisi,

Besnoitia tarandi, Besnoitia wallacei y Besnoitia neotomofelis (Mehlhorn et

al., 2009; Dubey & Yabsley, 2010). Sin embargo, a pesar de los numerosos

estudios llevados a cabo, sólo se ha logrado reproducir por completo el ciclo

del parásito en cuatro de ellas: B. wallacei (Wallace & Frenkel, 1975),

B. darlingi (Smith & Frenkel, 1977), B. oryctofelisi (Dubey & Lindsay, 2003a)

y B. neotomofelis (Dubey & Yabsley, 2010), quedando todavía sin identificar

en la mayoría de las especies aspectos tales como la taxonomía, el ciclo

biológico o la descripción morfológica del parásito.


11

Clasificación basada en criterios genotípicos y proteómicos:

Análisis filogenéticos basados en el estudio molecular de la secuencia 18S del

ARN ribosómico del parásito han puesto de manifiesto la estrecha relación

existente entre el género Besnoitia y los géneros Toxoplasma, Neospora y

Hammondia, agrupándose todos ellos dentro de la subfamilia

Toxoplasmatinae (Figura 1) (Ellis et al., 2000).

Figura 1: Árbol filogenético realizado mediante análisis de parsimonia representando las

relaciones entre varios géneros y especies de coccidios formadores de quistes (Ellis et al.,

2000). En el cuadro, géneros incluidos dentro de la subfamilia Toxoplasmatinae.

En 2000, Ellis y colaboradores encontraron además una elevada identidad

entre las secuencias de la región del ITS-1 del ARN ribosómico de las

diferentes especies del género Besnoitia (Ellis et al., 2000). Estudios

posteriores han demostrado sin embargo que existen algunas divergencias

genéticas entre las especies que afectan a grandes mamíferos ungulados

(B. bennetti, B. besnoiti, B. caprae y B. tarandi) y pequeños mamíferos

(B. darlingi, B. jellisoni, B. wallacei, B. oryctofelisi, B. akodoni y

B. neotomofelis) (Olias et al., 2011). Cortes y colaboradores han señalado

recientemente que aquellas especies del género Besnoitia cuyo HD continúa

sin ser identificado parecen presentar una región del ITS-1 más conservada,

planteando la hipótesis de que el ciclo biológico del parásito podría ser

silvestre y que el HI actuaría como mero hospedador accidental en el cual el


12

parásito se multiplicaría exclusivamente de manera asexual (Cortes et al.,

2014).

Por otro lado, en la bibliografía existe también cierta controversia en torno a

la taxonomía de las especies que afectan a los ungulados rumiantes

(B. besnoiti, B. tarandi y B. caprae) ya que, a falta de evidentes diferencias

genéticas, en repetidas ocasiones se ha cuestionado su clasificación como

una única especie o como especies separadas (Dubey et al., 2003b; Olias et

al., 2011). En un reciente estudio llevado a cabo por García-Lunar y cols. se

describe la existencia de cierta variabilidad en la expresión de proteínas entre

B. besnoiti y B. tarandi, lo que respalda la hipótesis de su clasificación como

dos especies diferenciadas (García-Lunar et al., 2014).

2.3.1.2-MORFOLOGÍA

En cuanto a la morfología, se sospecha que el parásito presenta cuatro

estadios o formas diferentes:

Ooquistes:

Hasta la fecha, se desconoce la morfología de los ooquistes de B. besnoiti

puesto que su HD continúa sin ser identificado. Sin embargo, en base a la

homología que presenta este parásito con los géneros estrechamente

emparentados Toxoplasma y Neospora, y principalmente con otras especies

del género Besnoitia de ciclo conocido (B. wallacei, B. darlingi, B. oryctofelisi,

B. neotomofelis), podemos inferir una descripción aproximada.

Los ooquistes localizados en el intestino del HD (el gato en el caso de

B. wallacei, B. darlingi, B. oryctofelisi y B. neotomofelis) presentan una forma

subesférica con unas dimensiones de 10 a 13 X 10 a 13 µm, y están

rodeados de una pared formada por dos capas de 0,5 µm de grosor. Estos

ooquistes son eliminados sin esporular al exterior en torno a los 10-15 días

post-infeccción (PI), manteniéndose la eliminación de 3 a 13 días. Los

ooquistes de las diferentes especies de Besnoitia no presentan prácticamente

diferencias antes de la esporulación, lo que dificulta su identificación. Una

vez sucedida la esporulación, las dos capas de la pared se muestran


13

parcialmente separadas y el ooquiste adopta una morfología algo más

elíptica. Cada ooquiste esporulado contiene dos esporoquistes que a su vez

cada uno alberga cuatro esporozoítos en su interior (Figuras 2 y 3) (Frenkel,

1977; Smith & Frenkel, 1977; Dubey & Lindsay, 2003a; Dubey & Yabsley,

2010).

Figura 2: Imagen de microscopía

electrónica de ooquistes de Toxoplasma

gondii aislados de heces de gato. (a, b)

ooquistes esporulados con esporoquistes y

esporozoítos. (c) ooquiste no esporulado.

(d) ooquiste esporulado con dos esporoquistes

en su interior (Ferguson, 2009).

Figura 3: Imagen obtenida mediante

microscopía electrónica (TEM) de un

ooquiste sin esporular de B. darlingi

observado en las heces de un gato

infectado de forma natural (Dubey et al.,

2002).

Taquizoítos:

El taquizoíto es la forma equivalente a los trofozoítos de otros parásitos

protozoarios. Se localizan tanto de manera libre en la sangre como en el

interior de células endoteliales, monocitos y neutrófilos del HI. Cuando los

taquizoítos procedentes de cultivo en células Vero son observados al

microscopio óptico y electrónico presentan un tamaño de 6 a 7,5 µm de largo

X 2,5 a 3,9 µm de ancho, tienen forma curvada (forma de plátano) y la

disposición de los orgánulos es similar a la de los bradizoítos (conoide,

micronemas, roptrias, gránulos densos, microtúbulos y mitocondria)

(Figura 4a) (Shkap et al., 1988; Cortes et al., 2006b).

Durante el estadio de taquizoíto, el parásito se multiplica de forma asexual

por endodiogenia formando vacuolas parasitóforas y prolifera de forma rápida

por todo el organismo (Figura 4b) (Göbel et al., 1985).


14

Figura 4: (a) Taquizoítos de B. besnoiti en cultivo de células Vero observados al microscopio

electrónico (nuc: núcleo, mito: mitocondria, mic: micronemas, api: complejo apical, rho:

roptrias) (Cortes et al., 2006b). (b) Cultivo de células Vero infectado con vacuolas

parasitóforas y taquizoítos de B. besnoiti.

En el momento que los taquizoítos invaden las células hospedadoras, éstos

sufren una serie de modificaciones en el conjunto de microtúbulos

subpediculares que poseen en más de dos tercios de su superficie facilitando

así la interacción con dichas células (Reis et al., 2006).

Quistes tisulares:

Las células diana de los quistes tisulares de B. besnoiti son los fibroblastos

del HI, por lo que su localización puede ser muy diversa. Según la

bibliografía, estos quistes se desarrollan principalmente en la dermis (cuello y

porción distal de las extremidades), en la conjuntiva esclerótica, en la

mucosa del tracto respiratorio superior (rinario, laringe, faringe), en la

mucosa del tracto genital inferior femenino (vulva, vagina) (Frey et al., 2013)

y en los testículos, glándulas y conductos del aparato reproductor masculino

(Kumi-Diaka et al., 1981), aunque también pueden encontrarse en otros

tejidos conectivos más internos como fascias, músculos, tendones, corazón y

paredes de vasos sanguíneos. Recientemente ha sido localizado por primera

vez un número importante de quistes en el corión laminar de las pezuñas de

vacas infectadas de forma crónica (Langenmayer et al., 2014a).

En cuanto a la morfología de los quistes, macroscópicamente son de aspecto

esférico, de color blanco brillante a simple vista (Mehlhorn et al., 2009) y con

un diámetro que puede alcanzar desde 29,3 µm hasta 409,9 µm según el

tejido y el estado de crecimiento del quiste (Langenmayer et al., 2014a).

b a

nuc

mic

mito

rho api


15

Éstos pueden encontrarse de forma aislada o a menudo formando grupos de

3 ó 4 quistes (Figura 5a).

Cada quiste se desarrolla en el interior de una célula hospedadora, la cual

sufre, conforme el quiste va creciendo, un alargamiento y una degeneración

parcial de sus estructuras e hipertrofia del núcleo. Al microscopio electrónico,

los quistes tisulares presentan tres envueltas diferenciadas: una capa externa

o pared quística, una capa intermedia compuesta por el citoplasma, núcleo y

orgánulos de la célula hospedadora y una tercera capa formada por las

vacuolas parasitóforas conteniendo los bradizoítos en su interior (Figura 5b)

(Dubey et al., 2003b; Cortes et al., 2006b; Dubey et al., 2013).

-Pared quística: se trata de una envoltura densa y homogénea formada por

láminas concéntricas de tejido conectivo, probablemente de tipo hialino en su

mayor parte. La superficie externa de la pared está formada por restos de

membranas sin otros componentes celulares, lo que le confiere un aspecto

rígido y denso. La parte interna de la pared aparece completamente

condensada (Mehlhorn et al., 2009). Langenmayer y cols. apuntan en sus

recientes trabajos que en aquellos quistes en estado avanzado de desarrollo

pueden llegar a observarse mediante tinciones específicas dos componentes

en la pared quística bien diferenciados, uno interno y otro externo, por lo que

proponen una nueva nomenclatura para los quistes tisulares de B. besnoiti

compuesta por cuatro capas (Langenmayer et al., 2014a). Según estos

autores, la pared quística externa está compuesta por múltiples fibrillas de

colágeno y la interna por componentes estructurales de la matriz extracelular

tales como partículas de proteoglicanos y filamentos finos (Langenmayer et

al., 2014b).

-Capa intermedia: bajo la pared quística, se encuentra la membrana de la

célula hospedadora, el citoplasma con los restos de orgánulos celulares y los

núcleos aparentemente hipertrofiados, todo ello consecuencia del proceso de

degeneración (Mehlhorn et al., 2009).

-Vacuola parasitófora: cada vacuola está delimitada por una membrana

sencilla y contiene múltiples bradizoítos en su interior (Mehlhorn et al.,

2009). Sin embargo, como ocurre también en otros coccidios formadores de

quistes tisulares como Toxoplasma, varios autores describen esta membrana


16

de la vacuola como una pared quística primaria adosada a la parte interna

(Cortes et al., 2006b).

Figura 5: (a) Imagen microscópica de quistes tisulares de B. besnoiti en la dermis de una

vaca infectada. (b) Corte histológico de piel con quistes de B. besnoiti: pared quística (PQ),

célula hospedadora (CH) y vacuola parasitófora (VP).

Los quistes se encuentran generalmente rodeados por un infiltrado

inflamatorio granulomatoso no purulento consistente en su mayor parte de

linfocitos T y monocitos/macrófagos activados (Frey et al., 2013; Dubey et

al., 2013). Algunos autores señalan además la posible aparición de un

contenido necrótico mineralizado alrededor de los quistes (McCully et al.,

1966) e incluso describen la degeneración y ruptura de la pared quística

(Frey et al., 2013; Langenmayer et al., 2014a), si bien no se han llegado a

detectar bradizoítos fuera de los quistes tisulares.

Bradizoítos, cistozoítos o merozoítos quísticos:

Cada bradizoíto, con un tamaño de 6 a 7,5 µm de largo X 1,9 a 2,3 µm de

ancho (Dubey et al., 2003a), se encuentra rodeado de una película

característica formada por tres capas. La parte externa recubre toda la

superficie del parásito mientras que las otras dos membranas internas dejan

interrumpidos el extremo apical y posterior, formando de este modo los

anillos polares. El polo apical es alargado mientras que el polo posterior tiene

una forma redondeada. En la zona del tercio anterior de la película se

encuentra el microporo típico de los coccidios. Desde el anillo polar se

extienden 22 microtúbulos subpeliculares que ocupan longitudinalmente los

a b

PQ

VP

CH


17

dos tercios anteriores del bradizoíto y cuya principal función es favorecer la

motilidad y mantener la forma del parásito.

En el extremo apical o anterior del bradizoíto se localiza el complejo apical,

un conjunto de estructuras formado por el conoide, las roptrias y los

micronemas destinado a facilitar la invasión de las células hospedadoras y la

motilidad del parásito (Figura 6). El conoide es una proyección tubular

retráctil situada por delante del anillo apical y sustentado por siete elementos

anulares en disposición helicoidal. En la luz de este tubo se observan los

conductos de las roptrias que, junto con los micronemas, forman los llamados

cuerpos vesiculares. En esta zona anterior también se encuentra el

apicoplasto y los cuerpos densos, además de una mitocondria y el aparato de

Golgi, situados justo por delante del núcleo.

El polo posterior del bradizoíto, carente de microtúbulos, es la zona donde

queda relegado el núcleo, gránulos de amilopectina, ribosomas y porciones

del retículo endoplasmático rugoso (Figura 6) (Dubey et al., 2003; Cortes

et al., 2006b; Mehlhorn et al., 2009).

Figura 6: Imagen de microscopía electrónica de un corte longitudinal (a) y transversal (b) de

bradizoítos en el interior de un quiste tisular: película (PE), microporo (MP), núcleo (N),

microtúbulos subpeliculares (ST), conoide (C), roptrias (RH), micronemas (MN), amilopectina

(A) (Mehlhorn et al., 2009).

Según un estudio sobre la ultraestructura comparada de B. besnoiti realizado

por Langenmayer y cols., los bradizoítos y taquizoítos presentan diferencias

en cuanto a la forma y al número de gránulos de amilopectina del citoplasma.

La forma de los taquizoítos es más redondeada u ovoide, mientras que los

a b


18

bradizoítos muestran un contorno más alargado, en forma de banana. Los

gránulos de amilopectina escasamente se detectan en los taquizoítos

mientras que los bradizoítos contienen múltiples de ellos (Langenmayer et

al., 2014b).

2.3.1.3-CICLO BIOLÓGICO

Como se ha comentado anteriormente, se sospecha que B. besnoiti presenta

un ciclo coccidiano de tipo heteroxeno. El HD sería un carnívoro,

previsiblemente depredador del HI, que se infectaría por ingestión de quistes

tisulares del parásito presentes en los bóvidos. La hipótesis sobre el papel

del gato y/u otros felinos silvestres como HD de la besnoitiosis ha sido

demostrada en varias especies del género Besnoitia (B. wallacei, B. darlingi,

B. oryctofelisi y B. neotomofelis), e incluso existe una cita en B. besnoiti

(Peteshev et al., 1974). Sin embargo, esta última observación no ha podido

ser confirmada posteriormente por otros autores (Diesing et al., 1988; Basso

et al., 2011; Marcén-Seral, 2011), por lo que se considera que el HD de la

besnoitiosis bovina continúa sin ser conocido.

Una vez los quistes tisulares del parásito llegan al intestino del HD, tendría

lugar una fase de reproducción asexual o merogonia (formación de

merozoítos), seguida de una sexual o gametogonia (formación de ooquistes)

y los ooquistes resultantes serían eliminados con las heces al exterior donde

sufrirían una esporogonia (formación de esporozoítos). Estos ooquistes

esporulados presentes en el medio serían ingeridos en este caso por el HI,

donde se sucedería un ciclo extraintestinal con una primera fase de

proliferación (multiplicación de taquizoítos con formación de pseudo-quistes

principalmente en los monocitos y en las células de los endotelios

vasculares), seguida de una fase quística de multiplicación asexual o

merogonia (en los fibroblastos).


19

2.3.2-EPIDEMIOLOGÍA DESCRIPTIVA

2.3.2.1-DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA

La distribución geográfica mundial de la besnoitiosis comprende Europa,

África, Asia, América y Australia, y varía según las especies (Tabla 1). En el

caso de las seis especies que afectan a pequeños mamíferos (B. darlingi,

B. jellisoni, B. wallacei, B. oryctofelisi, B. akodoni y B. neotomofelis), su

distribución se centra principalmente en el continente americano, si bien

pueden localizarse también en África (B. wallacei y B. oryctofelisi), Australia y

Asia (B. wallacei). En el caso de las besnoitiosis que afectan a los ungulados

(B. besnoiti, B. tarandi, B. caprae y B. bennetti), la localización del parásito

se concentra en África y Europa, aunque también se ha encontrado en los

continentes asiático y americano (Figura 7a).


20

Tabla 1: Primera descripción, hospedadores, distribución geográfica y localización de los

quistes tisulares de las distintas especies conocidas del género Besnoitia (Marcén-Seral, 2011).

Especie Primera

descripción Hospedador intermediario

Hospedador definitivo

Distribución geográfica

Localización de los quistes tisulares

B. besnoiti Besnoit &

Robin 1912

Bóvidos, óvidos,

cápridos, ñu, gran kudú,

antílope, corzo

Desconocido

África, Asia, Europa,

América del Sur

Epidermis, conjuntiva esclerótica, fascias,

mucosa respiratoria y vulvar, músculos y

tendones, testículo y epidídimo, corazón y

grandes venas

B. tarandi Hadwen

1922

Reno y caribú, ciervo mulo,

buey almizclero

Desconocido

E.E.U.U., Canadá, antigua

U.R.S.S., Suecia,

Finlandia

Epidermis, yugular, músculos y periostio,

esclerótica y conjuntiva, mucosa

nasal

B. bennetti Bennett

1927

Équidos: caballo, asno, mulo, cebra

Desconocido

Francia, Sudán

Sudáfrica, E.E.U.U., México

Epidermis, conjuntiva esclerótica, tejido

conectivo, faringe y laringe, escroto y

mesentéreo

B. caprae Heydorn et

al. 1984 Cabra Desconocido

Irán, Kenia, Nigeria (Nueva

Zelanda sin confirmar)

Epidermis, fascias, esclerótica y

párpados, pulmón, linfonodos, escroto y

testículo

B. darlingi Darling 1910 Zarigüeya y ¿reptiles?

Gato

E.E.U.U., América central,

(Brasil sin confirmar)

Epidermis, lengua, riñón, adrenales, pulmón, corazón

B. jellisoni Frenkel 1953 Roedores Desconocido E.E.U.U.,

Perú

Epidermis, mesentéreo y serosas

digestivas, ciego, colon, páncreas

B.wallacei Wallace &

Frenkel 1975 Roedores Gato

Hawai (E.E.U.U.), Australia,

Japón, Kenia

Epidermis, lengua, corazón y pulmón

B. oryctofelisi Dubey &

Lindsay 2003 Lagomorfos

(conejo) Gato

Kenia, Argentina

Epidermis, serosas

B.akodoni Dubey et al.

2003 Akodon

montensis Desconocido Brasil Epidermis

B.neotomofelis Dubey &

Yabsley 2010 Neotoma micropus

Gato E.E.U.U. Corazón, pulmón y

bazo


21

Figura 7: (a) Distribución mundial de las especies de Besnoitia que afectan a ungulados.

Rojo: B. besnoiti, azul: B. tarandi, gris: B. caprae y amarillo: B. bennetti. (b) Evolución

cronológica de la besnoitiosis bovina en Europa. Cruces: antes de 1990, triángulos: 1991-

2000, círculos: 2001-2014 (adaptado de Álvarez-García et al., 2013).

En cuanto a la besnotiosis bovina, se trata de una enfermedad ampliamente

distribuida por Europa, África subsahariana, Asia y América del Sur. Fue

descrita por primera vez en el sur de Francia por Cadéac en 1884, quien la

denominó como “élèphantiasis et anasarque du boeuf” (Cadéac, 1884). Unos

años más tarde, se encontraron de nuevo casos en ganado bovino localizado

en los Pirineos franceses, donde se logró aislar el parásito y se le denominó

como sarcosporidiosis (Besnoit & Robin, 1912). En esa misma época, se

sucedían también los primeros casos en Portugal en ganado procedente de la

zona del Alentejo (Franco y Borges, 1915). Unas décadas más tarde, Leitao

describía nuevos casos de besnoitiosis bovina en Portugal y apuntaba que el

ganado importado de Angola parecía portar con frecuencia la enfermedad

(Leitao, 1949) (Figura 7b).

. B. besnoiti

. B. tarandi

. B. caprae

. B. bennetti

b

a


22

La primera descripción de la besnoitiosis bovina en el continente africano se

dio en Sudáfrica (Hofmeyr, 1945), y posteriormente la enfermedad ha sido

detectada en diferentes países subsaharianos (Botsuana, Namibia, Zimbabue,

Angola, Congo, Kenia, Tanzania, Uganda, Sudán, Camerún, Mozambique y

Nigeria) (Bwangamoi, 1968; Biglake, 1981; Kumi-Diaka et al., 1981).

Asimismo, un trabajo llevado a cabo recientemente en Egipto ha revelado la

presencia de anticuerpos frente a B. besnoiti tanto en ganado bovino como

en búfalos de agua procedentes de diferentes provincias (Ashmawy & Abu-

Akkada, 2014). Además de África, la enfermedad ha sido descrita también

en otros países como Rusia (Peteshev et al., 1974), Corea del Sur (Lee et al.,

1970), Israel (Neuman & Nobel, 1960; Neuman, 1962), Jordania (Talafha et

al., 2015) y Venezuela (Vogelslang & Gallo, 1941). Un actual estudio

serológico realizado en ganado bovino de Brasil sugiere la hipótesis de la

posible existencia del parásito B. Besnoiti en dicho país, no obstante sus

autores apuntan que el parásito podría presentar ciertas diferencias en la

composición antigénica con respecto a las cepas aisladas en Europa y África

(Uzêda et al., 2014).

En cuanto a Europa, desde que se sucedieron las primeras citas durante la

primera mitad del siglo XX, la enfermedad no volvió a tener especial

relevancia hasta los años 90, momento a partir del cual la besnoitiosis bovina

acaparó de nuevo el interés debido a la reaparición de nuevos casos.

En España, la enfermedad fue observada por primera vez en el norte del país

(País Vasco y Navarra) y en otras áreas montañosas de los Pirineos (Juste et

al., 1990; Irigoien et al., 2000; Castillo, 2009). Sin embargo, la enfermedad

parece haberse extendido posteriormente también fuera del área pirenaica ya

que se han detectado casos en zonas del centro de España y del sur próximas

a la frontera con Portugal (Fernández-García et al., 2010; EFSA, 2010)

(Figura 7b). En el caso de Portugal, la mayoría de brotes descritos hasta

ahora se han localizado en la región del Alentejo al sur del país, y

generalmente han sido asociados al comercio de toros con fines reproductivos

(Cortes et al., 2005; Cortes et al., 2006b). No obstante, un reciente estudio

realizado por Waap y cols. en todo el territorio de Portugal ha demostrado

por primera vez evidencias serológicas y clínicas de la infección por

B. besnoiti en zonas del noreste y centro del país (Waap et al., 2014).


23

Con respecto a Francia, en torno al año 2007 reaparecían de nuevo casos al

sur del país en la zona de los Pirineos (Alzieu et al., 2007), y posteriormente

la enfermedad se ha ido propagando hacia zonas del este y centro del país

(Jacquiet et al., 2010; Alzieu et al., 2011). En Italia, Agosti y cols.

describieron en 1994 un brote de besnoitiosis bovina en un rebaño con

animales importados de Francia, pero no fue hasta el año 2009 cuando la

enfermedad fue detectada en ganado autóctono de la zona norte de los

montes Apeninos (Gollnick et al., 2010; Gentile et al., 2012). En Alemania,

los primeros casos se dieron en una explotación en la región de Bavaria,

probablemente a causa de la importación de animales de raza Charolaise y

Limusine de origen francés (Schares et al., 2009).

Esta expansión geográfica de la enfermedad junto con el aumento en el

número de casos observados en los últimos años hizo que la besnoitiosis

bovina fuera reconocida en el año 2010 por la EFSA como una enfermedad de

carácter emergente en Europa (EFSA, 2010).

Finalmente, habría que añadir las citas descritas en los últimos años en

ganado autóctono de Suiza y Hungría, presumiblemente también ligadas a la

importación de animales infectados de zonas endémicas con fines de mejora

genética (Basso et al., 2013; Hornok et al., 2014), la primera descripción en

Croacia (Beck et al., 2013), además del reciente caso de Grecia, donde se

han detectado animales positivos en ganado bovino de leche del norte del

país tanto importado como local (Papadopoulos et al., 2014). Estos hechos

hacen sospechar una actual extensión de la besnoitiosis bovina hacia

regiones del centro y este de Europa.

En cuanto al área geográfica donde se ha llevado a cabo el presente estudio,

se trata de una zona montañosa de los Pirineos perteneciente a la provincia

de Huesca (Aragón, España) donde la besnoitiosis bovina es considerada

como endémica ya que la detección de los primeros casos datan del año 1990

(Juste et al., 1990).


24

2.3.2.2-ESTUDIOS EPIDEMIOLÓGICOS PREVIOS

Los primeros estudios sobre prevalencia de besnoitiosis bovina se llevaron a

cabo en Israel y Sudáfrica mediante el uso de técnicas serológicas como la

inmunofluorencencia indirecta (IFI) y el enzimoinmunoensayo (ELISA).

En el estudio realizado por Neuman en 1972 en vacas lecheras y animales de

matadero se observó una seroprevalencia total superior al 50%, siendo

mayor la prevalencia obtenida en el caso del bovino de carne que en el de

leche (Neuman, 1972). Unos años más tarde, Goldman y Pipano

demostraron que el 36% de un grupo de toros jóvenes y sanos se

enfermaban al año de ser introducidos en un rebaño positivo, además de

observar que tanto machos como hembras presentaban tasas similares de

prevalencia (Goldman & Pipano, 1983). Un reciente trabajo epidemiológico

llevado a cabo por Talafha y cols. describe por primera vez la infección por

B. besnoiti en Jordania, con una prevalencia real individual y de rebaño del

6 y 28,7% respectivamente (Talafha et al., 2015).

Por su parte, Janitscke encontró una prevalencia del 50% según la técnica de

IFI y del 46% según la prueba de ELISA en un estudio realizado en Sudáfrica

en un rebaño bovino de carne que no presentaba ningún tipo de signo clínico

de besnoitiosis (Janitscke, 1984). Recientemente, en un estudio de

prevalencia realizado por Sambo y cols. en el norte de Nigeria se ha

detectado una prevalencia aparente individual mediante la técnica de IFI del

77,8%. En ese mismo trabajo se analizaron muestras de leche procedentes

de hembras en lactación y se observó la presencia de anticuerpos frente a

B. besnoiti en un 96,8% de las muestras analizadas (Sambo et al., 2014).

Con respecto a Europa, los primeros datos disponibles sobre la prevalencia de

besnoitiosis bovina se corresponden a países en los cuales la enfermedad se

presenta de forma endémica. En Portugal, Cortes y cols. comprobaron que la

tasa de prevalencia observada en un rebaño bovino de carne aumentó del 36

al 70% en un período de 18 meses (Cortes et al., 2006c). Otro estudio

llevado a cabo en varias explotaciones ubicadas en un área endémica de

montaña del norte de España (Navarra) describe una tasa de prevalencia en

torno al 50% de animales infectados (48,6% mediante la técnica de IFI y


25

44,5% mediante ELISA) (Zacarias, 2009). Sin embargo, en el primer brote

de besnoitiosis bovina descrito en una zona aparentemente no endémica del

centro de España la prevalencia del rebaño llegó a alcanzar una tasa del

71,4% en el caso de los machos y un 90% en hembras tres años después de

la aparición del primer caso (Fernandez-García et al., 2010).

Según Alzieu, diversas encuestas serológicas realizadas en Francia revelan

una tasa de prevalencia creciente a menudo en torno al 20-30% a los 2 ó 3

años de la introducción de la besnoitiosis bovina en un rebaño, pudiendo

llegar en algunos casos a cerca del 50-60% de animales seropositivos (Alzieu

et al., 2011). En un estudio seroepidemiológio longitudinal realizado en un

rebaño lechero del sur de Francia observaron también un marcado

incremento de la tasa de prevalencia del 30 al 89,5% en un intervalo de

15 meses (Liénard et al., 2011).

En Italia, la primera encuesta epidemiológica se llevó a cabo en el sur del

país revelando una prevalencia de rebaño del 83,0% y una prevalencia

individual del 44,1% (Rinaldi et al., 2012). Sin embargo, un estudio

realizado recientemente en la zona noroeste de Italia ha arrojado unos

resultados de prevalencia mucho menores a los observados previamente en

el sur del país, incluso se ha confirmado la ausencia de rastro serológico de

B. besnoiti en Cerdeña, lo que ha conducido a replantearse la presencia de

posibles focos aislados de besnoitiosis bovina más que una situación

endémica generalizada de la enfermedad en Italia (Gazzonis et al., 2014).

A lo largo del año 2014 han sido publicados dos estudios seroepidemiológicos

de tipo transversal realizados en áreas endémicas del norte de España. En el

primero, tras analizar más de 600 animales tanto de aptitud cárnica como

lechera pertenecientes a varias explotaciones de Navarra, se han observado

unas tasas de prevalencia del 16% para el vacuno de carne y del 0% en el de

leche (Álvarez-García et al., 2014a). Respecto al segundo trabajo, centrado

en varias explotaciones bovinas de aptitud cárnica de la provincia de Huesca

(Aragón), se describe un 87% de rebaños positivos, con un 52,3% y un

49,2% de prevalencia individual en hembras y machos respectivamente

(Gutiérrez-Expósito et al., 2014). Más recientemente, otro estudio realizado

en Cataluña, donde por el momento sólo se conocían casos esporádicos de la


26

enfermedad, ha revelado una seroprevalencia del 63,9% (Garrido et al.,

2015). También en los últimos meses se ha llevado a cabo en Portugal un

estudio sobre la prevalencia y la distribución geográfica de la infección por

B. besnoiti en el que se ha observado una prevalencia intra-rebaño que varió

entre 0,7 y 72,4%, encontrándose la mitad de los rebaños con una tasa de

prevalencia relativamente baja (≤10,3% de animales positivos). La

prevalencia real de rebaño estimada mediante una aproximación bayesiana

resultó un 5,1%, con una media de prevalencia entre rebaños positivos del

33% (Waap et al., 2014).

En este contexto habría que remarcar que, a pesar de los diferentes trabajos

epidemiológicos disponibles en la bibliografía, hasta la fecha no existe un

estudio epidemiológico de tipo longitudinal con una descripción detallada de

las tasas de prevalencia y principalmente de incidencia de besnoitiosis bovina

en una zona donde la enfermedad se presente de forma endémica, lo que

verdaderamente ayudaría a determinar la extensión, la importancia y sobre

todo, el impacto de la enfermedad.

2.3.2.3-FACTORES DE RIESGO ASOCIADOS

Edad:

En áreas donde la besnoitiosis bovina se encuentra de manera endémica, la

enfermedad ha sido principalmente observada en animales mayores de

6 meses, puesto que los terneros de menor edad parecen poseer cierta

inmunidad calostral y raramente resultan infectados. No obstante, Álvarez-

García y cols. señalan en su trabajo que la enfermedad ha sido recientemente

confirmada en un ternero de 4 meses de edad (Álvarez-García et al., 2014b),

demostrando que los animales menores de 6 meses también pueden resultar

afectados. A pesar de que todos los animales son susceptibles de ser

infectados, varios autores han encontrado una asociación entre la prevalencia

de la enfermedad y la edad, describiendo que el porcentaje de animales

seropositivos y la morbilidad de las poblaciones estudiadas aumenta

significativamente con la edad (Bigalke, 1981; Fernandez-García et al., 2010;

Álvarez-García et al., 2014; Waap et al., 2014; Talafha et al., 2015). Por


27

otro lado, diversos estudios realizados en Francia muestran que la mayor

incidencia de casos clínicos se observa generalmente en animales adultos,

entre 1 y 4 años de edad (Jacquiet et al., 2010; Alzieu et al., 2011).

Sexo:

Tanto un antiguo estudio realizado en Israel en 1983 por Goldman y Pipano

(Goldman & Pipano, 1983) como diversos estudios más recientes (Gutiérrez-

Expósito et al., 2014; Álvarez-García et al., 2014; Waap et al., 2014) parecen

coincidir en que no existe asociación entre el sexo de los animales y la

probabilidad de que éstos se infecten. No obstante, Jacquiet y cols. sugieren

en un trabajo realizado en Francia que los machos podrían ser más

susceptibles de desarrollar la forma clínica de la besnoitiosis bovina ya que a

menudo suelen presentar signos clínicos más severos, además de mostrar

una mayor tasa de mortalidad (Jacquiet et al., 2010). Sin embargo, esta

observación podría estar sesgada puesto que, en general, los toros con fines

reproductivos suelen verse como los animales más valiosos del rebaño y por

tanto, pueden atraer con mayor facilidad la atención de ganaderos y

veterinarios.

Raza y aptitud:

Según se refleja en diferentes estudios, la infección por B. besnoiti puede

afectar tanto al ganado de aptitud cárnica como lechera (Bigalke, 1981;

EFSA, 2010; Jacquiet et al., 2010). Además, también se ha podido observar

que cualquier raza parece ser sensible a padecer la besnoitiosis (Álvarez-

García et al., 2014). Sin embargo, es destacable que la mayor parte de los

brotes detectados han sido descritos en ganado bovino de aptitud cárnica,

hecho que posiblemente sea debido a las condiciones de manejo a las que

están sometidos estos animales más que a su raza o aptitud.

Sistema de manejo:

A lo largo de los años de estudio de la enfermedad se ha comprobado que

ésta se da principalmente en el ganado bovino de aptitud cárnica localizado

en pastos de áreas montañosas. Estas condiciones son las empleadas en los

sistemas de producción en extensivo, lo que conduce a pensar que los

animales criados bajo estas condiciones están expuestos a un mayor riesgo

de infección (Alzieu et al., 2011; Álvarez-García et al., 2014).


28

El trabajo desarrollado recientemente en Jordania por Talafha y cols. apunta

que algunas medidas de manejo tales como la limitación de las visitas del

personal trabajador entre explotaciones diferentes o el mantenimiento del

entorno de los animales lo más limpio posible parecen actuar como factores

de protección frente a la enfermedad, minimizando así el riesgo de

transmisión del parásito dentro de un mismo rebaño y entre explotaciones

(Talafha et al., 2015).

Estacionalidad:

Hasta la fecha, varios autores han observado una marcada estacionalidad en

la epidemiología de la besnoitiosis ya que la mayoría de los casos descritos

en sus estudios se dieron en el periodo que va de la primavera al otoño

(Fernandez-García et al., 2010; Jacquiet et al., 2010; Alzieu et al., 2011).

Del mismo modo, otros autores han señalado también la existencia de un

pico de casos clínicos (hasta un 80% de los casos) en los meses de verano

(de julio a septiembre) (Bigalke, 1981; Ferrié, 1984; Legrand, 2003). Esta

citada estacionalidad ha sido principalmente atribuida a dos hechos que

podrían favorecer la transmisión de la enfermedad en esa época. En primer

lugar, al manejo empleado habitualmente en las explotaciones durante los

meses de más calor, momento en el cual los animales son trasladados a

pastos comunes de montaña donde suelen cohabitar animales procedentes

de diferentes rebaños. En segundo lugar, este aumento de prevalencia ligado

a los meses de verano podría deberse también al aumento de las poblaciones

de artrópodos vectores durante esos meses.

No obstante, es importante remarcar que en la bibliografía existen también

citas de casos invernales de la enfermedad, si bien de una forma más

esporádica.

2.3.3-EPIDEMIOLOGÍA ANALÍTICA

B. besnoiti es un coccidio intracelular obligado, formador de quistes tisulares

y perteneciente al phylum Apicomplexa. Su ciclo biológico no se conoce por

completo en la actualidad, sin embargo, debido a su estrecha relación con los


29

parásitos de su misma subfamilia Toxoplasma gondii y Neospora caninum, se

sospecha que posee un ciclo heteroxeno de tipo obligado. Teóricamente, el

parásito realizaría un ciclo coccidiano intestinal con una reproducción asexual

o merogonia seguida de otra sexual o gametogonia (formación de ooquistes)

y finalmente de una esporogonia (formación de esporozoítos) en el HD, y otro

extraintestinal con una reproducción asexual en el HI.

Por el momento, la identidad del HD continúa sin ser descubierta, si bien, por

analogía con otras especies del género Besnoitia de ciclo conocido , un

carnívoro, un félido silvestre más concretamente, es el principal sospechoso.

A pesar de los diferentes estudios llevados a cabo en los que se ha evaluado

el papel de más de 20 especies de animales diferentes como posibles HD,

nadie ha logrado involucrar a ninguno de ellos de forma concluyente.

En consecuencia, esto podría hacernos pensar que la transmisión de la

enfermedad a través de la ingestión por parte del HI de ooquistes

esporulados eliminados en las heces del HD es poco probable, siendo la

transmisión horizontal directa o indirecta entre bóvidos la principal vía de

diseminación de la besnoitiosis en la actualidad.

2.3.3.1-CICLO HETEROXENO

El ciclo heteroxeno de B. besnoiti implicaría la presencia de dos

hospedadores, el definitivo, el gato doméstico y/o silvestre, y el

intermediario, los bóvidos. Para que se produzca la transmisión del parásito

de un hospedador a otro, es necesario que el ganado bovino se infecte de

forma natural a través de la ingestión de ooquistes esporulados presentes en

las heces del HD previamente infectado. El HD debe tener a su vez fácil

acceso a restos de bóvidos infectados con quistes tisulares. Actualmente,

esta situación es poco frecuente en las explotaciones puesto que la mayoría

de ellas siguen numerosas medidas preventivas de higiene. Este hecho

refuerza también la teoría citada en el apartado anterior con respecto a una

posible predominancia de la transmisión horizontal de la enfermedad entre HI

bóvidos.


30

Hospedador definitivo (HD):

El estudio realizado por Peteshev y cols. en 1974 señaló al gato doméstico y

silvestre (Felis silvestris catus y Felis silvestris lybica) como posibles HD de la

besnoitiosis bovina, ya que en su trabajo describió la detección de ooquistes

en heces de gatos alimentados con quistes tisulares de B. besnoiti (Peteshev

et al., 1974). Sin embargo, esta implicación del gato en el ciclo ha sido

siempre muy cuestionada por otros autores ya que por el momento nadie ha

logrado reproducir dichos resultados a pesar de haber analizado un amplio

rango de animales. Este es el caso por ejemplo del estudio llevado a cabo

por Diesing y cols., donde se intentó infectar mediante ingestión de quistes

tisulares al gato doméstico además de otras 11 especies de carnívoros

diferentes, seis especies de serpientes y buitres (Diesing et al., 1988). Otros

estudios más recientes han tratado de reproducir también sin éxito el ciclo

tanto en perro y gato doméstico como en conejo o en varias especies de

roedores (jerbo, cobaya, topillo y ratón) (Basso et al., 2011; Marcén-Seral,

2011).

En la bibliografía existe además un estudio seroepidemiológico llevado a cabo

en España donde se analizó más de 15 especies de carnívoros silvestres

diferentes (lobo, zorro, gato silvestre, marta, garduña, tejón europeo y jineta

común entre otros) con el objetivo de determinar mediante serología el

posible contacto de estos animales con el parásito sin encontrar tampoco

evidencias que permitieran implicar a estos animales como posibles

candidatos a HD de la besnoitiosis bovina (Millán et al., 2012). Más

recientemente, Hornok y cols. han publicado un trabajo donde describen el

hallazgo de una secuencia de ADN altamente homóloga a la de B. besnoiti

(99%) en una muestra de heces de murciélago procedente de Holanda. En

consecuencia, estos autores sugieren la hipótesis de que los murciélagos

podrían actuar como HD de la besnoitiosis bovina y se infectarían al ingerir el

parásito a través de su alimentación basada en diferentes especies de

insectos hematófagos (Hornok et al., 2015a).

La identidad del HD y el ciclo que el parásito desarrolla en él ha sido

únicamente descrita por completo en cuatro de las nueve especies del género

Besnoitia: B. wallacei, B. darlingi, B. oryctofelisi y B. neotomofelis. Para

todas ellas se demostró la eliminación de ooquistes en las heces del gato


31

doméstico tras la ingestión de quistes tisulares procedentes de sus

correspondientes HI. Por analogía con estas especies, en la besnoitiosis

bovina se considera que el gato se infectaría por ingestión de quistes de

B. besnoiti presentes en los tejidos del HI. Una vez en el intestino, estos

quistes son digeridos y se liberan los bradizoítos que invaden las células

endoteliales de los vasos sanguíneos intestinales y realizan una fase

merogónica de reproducción asexual en la que los merozoítos resultantes se

diferencian en macro y microgametos. Tras producirse la fecundación de

estos gametos, los ooquistes resultantes crecen hasta romper las células

hospedadoras y son liberados al exterior sin esporular con las heces en torno

a los 10-15 días PI (Figura 8).

Figura 8: Ciclo biológico de Besnoitia besnoiti (Álvarez-García et al., 2014).

Esta eliminación puede mantenerse de 3 a 13 días, dependiendo de la

especie. Una vez en el exterior, estos ooquistes deben sufrir una

esporulación para que sean infectantes para el HI que generalmente ocurre

tras un mínimo de dos días en un ambiente húmedo y cálido (Dubey &

Yabsley, 2010).


32

Hospedador intermediario (HI):

En cuanto a las especies de HI afectadas, B. besnoiti es capaz de infectar a

cualquier bóvido doméstico sin distinción de raza (Bigalke, 1968).

Igualmente, parece ser capaz de infectar a otras especies de rumiantes

silvestres como el impala (Aepyceros melampus), ñu azul (Connochaetes

taurinus) y gran kudú (Tragelaphus strepsiceros) (Basson et al., 1965). En

estos trabajos se demostró la presencia de quistes tisulares muy similares a

B. besnoiti pero, a diferencia de la besnoitiosis bovina, estos quistes se

localizaban principalmente en las vísceras y parecían ser menos patógenos, lo

que lleva a pensar que estos animales puedan comportarse más bien como

posibles portadores o reservorios de la enfermedad. Además, también se ha

logrado la infección experimental de otros rumiantes domésticos como los

óvidos (Bigalke, 1967) y los cápridos (Bwangamoi, 1967).

Por último, en base a lo que ocurre en los ciclos de otras especies del género

Besnoitia y partiendo de la hipótesis de que el ganado bovino podría tratarse

de un hospedador accidental de la besnoitiosis bovina, Basso y cols. han

evaluado en un reciente trabajo el papel del conejo y de cuatro especies de

roedores (jerbo, cobaya, topillo y ratón) como posibles HI no rumiantes de la

enfermedad. El estudio indicó que los aislados europeos de B. besnoiti

pueden infectar a estos animales, sin embargo, sólo se logró demostrar la

persistencia del parásito en los tejidos del topillo (Basso et al., 2011).

Se asume que el HI bóvido se infecta por ingestión de los ooquistes

esporulados eliminados en las heces del HD. En el aparato digestivo, estos

ooquistes son digeridos y los esporozoítos liberados al tracto intestinal

penetran en las células endoteliales de los vasos sanguíneos donde realizan

una reproducción asexual por endodiogenia y forman vacuolas parasitóforas.

Esta primera etapa del ciclo en el HI es lo que se corresponde con la fase

aguda de la besnoitiosis bovina. Tras esta primera fase de replicación, los

taquizoítos resultantes invaden nuevas células endoteliales adyacentes,

monocitos, neutrófilos e incluso pueden llegar a circular extracelularmente en

la sangre de los animales infectados, distribuyéndose así de forma rápida por

todo el organismo. Esta etapa de proliferación coincide con la fase de

edemas de la enfermedad. La multiplicación de los taquizoítos continúa hasta

que la respuesta inmunitaria del HI es capaz de frenar esta proliferación y


33

hacer que el parásito se enquiste. Los quistes tisulares se forman por lo

general en los fibroblastos del tejido conectivo subcutáneo del HI y su

localización puede ser muy diversa. Según la bibliografía, se desarrollan

principalmente en la dermis (cuello, porción distal de las extremidades), en la

conjuntiva esclerótica, en la mucosa del tracto respiratorio superior (rinario,

laringe, faringe), en la mucosa del tracto genital inferior femenino (vulva,

vagina) (Frey et al., 2013) y en los testículos, glándulas y conductos del

aparato reproductor masculino (Kumi-Diaka et al., 1981), aunque también

pueden encontrarse en otros tejidos conectivos más internos como fascias,

músculos, tendones, corion laminar, corazón y paredes de vasos sanguíneos.

La aparición de estos quistes se corresponde con la fase de esclerodermia de

la enfermedad.

Basándonos en las cuatro especies de Besnoitia de ciclo conocido, el tiempo

que va desde la ingestión de ooquistes esporulados hasta que el HI desarrolla

los quistes tisulares puede oscilar entre 1 y 3 semanas dependiendo de la

especie (Leighton & Gajadhar, 2001). Estos quistes tisulares poseen una

envoltura característica formada por tres capas y pueden contener en su

interior unos 200.000 bradizoítos cada uno (EFSA, 2010).

2.3.3.2-CICLO MONOXENO

En la actualidad, el único modo de transmisión conocido de la besnoitiosis

bovina es la transmisión horizontal de un HI a otro, bien sea por contacto

directo o a través de insectos hematófagos.

Transmisión horizontal por contacto directo:

En 1968, Bigalke demostró experimentalmente la transmisión de la

enfermedad por contacto directo entre bóvidos infectados con heridas y

lesiones dérmicas, previsiblemente a través de una ruptura mecánica de los

quistes tisulares localizados superficialmente causada por el rozamiento. Sin

embargo, los animales sanos que resultaron infectados tras el contacto

desarrollaron una infección muy suave o incluso subclínica (Bigalke, 1968).


34

Por extensión, varios autores han sugerido la posibilidad de una transmisión

de la besnoitiosis bovina a través de la monta (Castillo et al., 2009; Álvarez-

García et al., 2014), ya que, en condiciones naturales, los animales

permanecen en continuo rozamiento y estrecho contacto durante la época de

monta, lo que puede favorecer la aparición de lesiones y la ruptura de los

quistes presentes tanto en la mucosa de la vulva y vagina de las vacas

infectadas (Frey et al., 2013) como en el pene, prepucio, testículos, glándulas

y conductos del aparato reproductor masculino (Kumi-Diaka et al., 1981;

López et al., 2011; Dubey et al.,2013; Gollnick et al., 2015), posibilitando así

la transmisión del parásito.

Otra posible vía de transmisión por contacto, aunque especulativa, es la

transmisión directa del parásito de un animal a otro a través del contacto

directo entre mucosas que ocurre durante el lamido (Cortes et al., 2014).

Transmisión sexual:

La posibilidad de una transmisión de la besnoitiosis bovina a través del

semen de toros infectados, como ocurre en el caso de N. caninum (Ortega-

Mora et al., 2003), también ha sido cuestionada en varias ocasiones. A pesar

de la importante presencia de quistes de B. besnoiti en al aparato genital de

los toros infectados, principalmente a nivel del epidídimo, de la pared de los

vasos sanguíneos del plexo pampiniforme y del lumen de los tubos

seminíferos de los testículos (Kumi-Diaka et al., 1981; López et al., 2011;

Dubey et al.,2013), la ausencia de detección de ADN parasitario en el semen

de toros infectados de forma crónica en un estudio llevado a cabo en una

zona emergente de besnoitiosis bovina en Francia hace pensar que, en

condiciones naturales, un transmisión sexual de la enfermedad es poco

probable (Esteban-Gil et al., 2014).

Transmisión horizontal por vectores:

La marcada estacionalidad que presenta la besnoitiosis bovina hizo sospechar

de su transmisión a través de insectos hematófagos. Esta hipótesis fue

demostrada experimentalmente por Bigalke en la mosca tsetse (Glossina

brevipalpis), en la mosca de los establos (Stomoxys calcitrans) (Figura 9) y

en algunas especies de tábanos (Atylotus nigromaculatus, Tabanocella

denticornis y Haematopota albihirta) (Bigalke, 1968). Posteriormente,


35

Liénard y cols. volvieron a demostrar in vitro la capacidad de S. calcitrans

para transmitir de manera mecánica la besnoitiosis bovina (Liénard et al.,

2013). Por otra parte, en un estudio llevado a cabo recientemente en

Hungría no se ha logrado detectar ADN de B. besnoiti en garrapatas extraídas

de animales seropositivos (Hornok et al., 2015b).

Figura 9: Potencial vector de la besnoitiosis bovina (Stomoxys calcitrans)

(fuente: http://www.naturespot.org.uk/species/stable-fly, fecha de consulta: 07/09/2015).

Esta transmisión vectorial de la enfermedad se basa en el hecho de que los

quistes de B. besnoiti se localizan principalmente en la dermis y tejido

conectivo subcutáneo del rostro, cavidad nasal superior y porción distal de las

extremidades de los animales infectados, lugar de predilección para la

alimentación de este tipo de insectos. Además, la mayoría de estos vectores

suelen ser interrumpidos en su alimentación y necesitan de varios

hospedadores para completarla, transmitiendo así de una forma mecánica el

parásito de un HI infectado a otro sano mediante sus piezas bucales

(Figura 9). También se ha podido comprobar que estos vectores actúan

como meros transmisores mecánicos de B. besnoiti ya que el parásito no

logra persistir en el interior de su aparato digestivo por mucho tiempo (<3h

en la Glossina, <24h en los tábanos y <1h en los Stomoxys) (Bigalke, 1968),

lo que a su vez parece indicar que esta transmisión vectorial no es capaz de

diseminar la besnoitiosis bovina largas distancias.

http://www.naturespot.org.uk/species/stable-fly


36

En su trabajo, Alzieu y cols. detallan diferentes factores que intervienen en la

capacidad de transmisión de la besnoitiosis bovina que presenta cada vector.

Si tenemos en cuenta las especies, los tábanos parecen ser más eficaces en

la transmisión, probablemente debido a su mayor tamaño. Sin embargo, si

valoramos el comportamiento de estos insectos, los Stomoxys parecen tener

un comportamiento más gregario, lo que puede favorecer también la

transmisión. Por último, si tenemos en cuenta el periodo de actividad, los

tábanos suelen estar presentes desde junio hasta agosto mientras que los

Stomoxys muestran un periodo más amplio, de mayo a octubre-noviembre

(Alzieu et al., 2011). Esto podría explicar tanto el carácter estacional de la

enfermedad como el pico de casos que se detecta en verano en algunas

zonas de Francia citado por varios autores.

Por otro lado, puesto que los taquizoítos han sido detectados en las

secreciones lagrimales (Bigalke, 1968), igualmente existe la posibilidad de

que otros insectos o moscas no hematófagos, como la Musca autumnalis o la

Musca domestica, tal vez sean capaces de transmitir mecánicamente el

parásito al entrar en contacto con los taquizoítos de B. besnoiti presentes en

el fluido lacrimal (Cortes et al., 2014). Hornok y cols. sugieren también en

un estudio muy reciente la posibilidad de una transmisión del parásito por el

sudor a través de moscas secretófagas al encontrar una dilatación de los

conductos de las glándulas sudoríparas durante la fase aguda de la

enfermedad con presencia incluso de formas compatibles con quistes de

B. besnoiti en el sudor de animales afectados en fase crónica (Hornok et al.,

2015b).

Transmisión iatrogénica:

Varios autores han planteado la posible transmisión mecánica de la

besnoitiosis bovina vía iatrogénica a partir de una inadecuada utilización de

las agujas hipodérmicas durante los programas de profilaxis o de tratamiento

en los rebaños (Pols, 1960; Bigalke, 1968).


37

2.3.3.3-TRANSMISIÓN VERTICAL

La posibilidad de una transmisión vertical, uterina o transplacentaria de la

enfermedad fue planteada por primera vez por Nobel y cols. al encontrar

quistes tisulares de B. besnoiti en la vagina y el útero de vacas infectadas de

forma crónica y con una marcada sintomatología de la enfermedad (Nobel et

al., 1981). En ese mismo trabajo se apuntó también que, en base al número

de quistes y las lesiones encontradas, los quistes de B. besnoiti no parecían

causar importantes alteraciones en el funcionamiento normal del aparato

reproductor, y en consecuencia, en la fertilidad de las hembras.

Contrariamente a lo descrito por Nobel, en un estudio más reciente llevado a

cabo en vacas infectadas de forma subclínica, el parásito ha sido únicamente

encontrado en el tracto genital inferior (vulva y vagina), lo que parece indicar

como poco probable una transmisión vertical de la enfermedad (Frey et al.,

2013).

Por otro lado, una hipotética transmisión vertical de la enfermedad por

contacto de la madre con el ternero resulta también poco probable durante

los primeros meses de vida puesto que, según se ha observado en múltiples

ocasiones, los terneros nacidos de hembras infectadas, con o sin signos

clínicos, a menudo muestran anticuerpos frente a B. besnoiti desde los 3-5

primeros días de vida hasta los 5-6 meses, muy posiblemente debido a una

inmunidad calostral (Shkap et al., 1994; Sambo et al., 2014).

2.3.3.4-POSIBLES RESERVORIOS

Como ocurre en otras especies del género Besnoitia, el papel que podrían

jugar algunos animales silvestres como potenciales reservorios de la

besnoitiosis bovina ha sido sugerido en repetidas ocasiones en la bibliografía

(Bigalke, 1981; Castillo et al., 2009).

En 2010, Fernández de Luco y cols. describieron un caso de besnoitiosis en

un corzo encontrado muerto en Aragón. En la necropsia del animal se

encontraron quistes en la conjuntiva esclerótica además de observarse


38

también quistes tisulares en el análisis histológico de muestras de piel

(Fernández et al., 2010).

En un estudio serológico llevado a cabo por Millán y cols. se analizó el suero

de más de 15 especies de carnívoros silvestres diferentes presentes en

España con el objetivo de detectar anticuerpos específicos frente a

B. besnoiti. Los resultados obtenidos no lograron evidenciar la implicación de

estos animales en la transmisión de la enfermedad (Millán et al., 2012).

Recientemente, Gutiérrez y cols. han señalado por primera vez rastros

serológicos de la infección por B. besnoiti en rumiantes silvestres de España.

En el estudio se analizaron sueros de ciervos, corzos, muflones y sarrios

procedentes de diferentes localizaciones españolas con presencia de ganado

bovino y en las que previamente se habían detectado casos de besnoitiosis

bovina. En dicho estudio, se encontraron anticuerpos específicos frente a

B. besnoiti en ciervo y corzo (Gutiérrez et al., 2013).

En base a todos estos resultados, parece muy recomendable continuar los

estudios en rumiantes silvestres de áreas endémicas de besnoitiosis para así

poder esclarecer el papel que podrían estar desempeñando estos animales

como HI, e incluso, confirmar si se tratan de reservorios de la enfermedad.

2.3.4-PATOGENIA, CUADRO CLÍNICO Y LESIONES

2.3.4.1-INMUNIDAD

En la actualidad, la naturaleza y el tipo de respuesta inmunitaria que

desarrollan los animales frente a la infección por B. besnoiti continúa sin

conocerse por completo.

Se sospecha de una respuesta inmunitaria mixta, celular y humoral. La

respuesta inmunitaria de tipo humoral se halla principalmente ligada a la

presencia y al desarrollo de los quistes parasitarios. Varios autores han

observado incluso un aumento de los títulos de anticuerpos frente a

B. besnoiti en aquellos animales infectados que desarrollan quistes tisulares


39

frente a aquellos que no presentan quistes (Liénard et al., 2011; Esteban-Gil

et al., 2014). Como en la mayor parte de las enfermedades parasitarias, la

aparición de anticuerpos o inmunidad humoral suele darse a los 15-18 días

tras la infección, presentando un pico máximo entre el día 30-40 PI (Franc et

al., 1987). Esta respuesta humoral se considera poco protectora ya que, una

vez los parásitos se enquistan, éstos quedan al abrigo de la respuesta

inmunitaria como ocurre en el caso de la infección por T. gondii. Similar a lo

que sucede en otros parásitos intracelulares obligados, la inmunidad celular

parece jugar un papel muy importante en la defensa frente a la infección por

B. besnoiti, si bien su mecanismo está muy poco estudiado.

En 1994, Shkap y cols. demostraron la transferencia calostral de anticuerpos

frente a la infección por B. besnoiti de hembras infectadas en fase crónica a

su descendencia, inmunidad que parecía durar entre 2 y 4 meses

post-nacimiento (Shkap et al., 1994).

2.3.4.2-SIGNOS CLÍNICOS, PATOGENIA Y LESIONES

En la besnoitiosis bovina, la mayoría de animales resultan infectados de

forma subclínica (Pols, 1960; Bigalke, 1968), pudiendo actuar como

portadores asintomáticos de la enfermedad. Según Jacquiet y cols., la

incidencia de casos clínicos de besnoitiosis bovina puede variar dependiendo

de si la enfermedad se encuentra de forma endémica (1-10% de casos por

año) o emergente (15-40% de casos por año) (Jacquiet et al., 2010). Las

muertes se producen principalmente durante la fase crónica, con una tasa de

mortalidad que ronda el 10% (Pols, 1960; Bigalke, 1968). Sin embargo, la

mayor parte de los animales afectados consiguen sobrevivir, generalmente

tras un lento periodo de convalecencia. Algunos autores han descrito en la

bibliografía una recuperación clínica parcial tras la infección con una

apreciable disminución de los quistes tisulares en aquellos animales

infectados crónicamente (Frey et al., 2013).

Una vez los animales se infectan, la besnoitiosis bovina puede presentar un

periodo de incubación que oscila entre las 2 semanas y los 2 meses (Álvarez-


40

García et al., 2014). El desarrollo de la enfermedad presenta un cuadro

clínico con tres fases consecutivas de intensidad creciente: una fase inicial

aguda febril, seguida por una fase subaguda de edemas y finalmente una

fase crónica de esclerodermia.

Fase aguda febril:

Al inicio, la infección se caracteriza por la aparición repentina de hipertermia

(de 40 a 42ºC), reflejo del estado de parasitemia y de la rápida multiplicación

de los parásitos en el organismo. Durante esta fase, los taquizoítos invaden

macrófagos, fibroblastos y células endoteliales de los vasos sanguíneos

causando vasculitis, trombosis, hiperplasia y necrosis de vénulas y arteriolas.

Esta fase suele durar de 3 a 10 días, y los animales pueden presentar

además de fiebre otros signos inespecíficos tales como depresión,

taquicardia, taquipnea, congestión de mucosas, petequias, epífora

(Figura 10a), descarga nasal serosa (Figura 10b), anorexia, pérdida de peso,

disminución de la producción láctea y empeoramiento de la condición

corporal. Algunos autores describen también la posible aparición de abortos

en hembras gestantes durante esta fase aguda de la enfermedad (Pols,

1960; Juste et al., 1990).

Figura 10: Animales en fase aguda de besnoitiosis bovina con epífora (a) y descarga nasal

serosa (b) (Alzieu et al., 2011).

Esta fase de la besnoitiosis bovina puede pasar a menudo desapercibida o

incluso ser confundida con otras afecciones. Sin embargo, es muy

importante reconocer la infección en este punto ya que los únicos

a b


41

tratamientos disponibles en la actualidad son principalmente eficaces durante

esta fase.

Fase subaguda de edemas:

El aumento de la permeabilidad causado por el daño vascular pronto resulta

en la fase subaguda de la enfermedad con la aparición de edemas,

inicialmente localizados en áreas de la cabeza y cuello. En los casos más

severos, se puede detectar incluso edema alveolar e intersticial en los

pulmones, causando alteraciones respiratorias. Conforme la enfermedad

progresa, la temperatura desciende y la aparición de edemas se extiende a

las extremidades y zonas más declives del cuerpo (sobre todo en codos,

mamas y escroto) (Figura 11a y b). Los ganglios linfáticos más superficiales

pueden aparecer inflamados y las extremidades rígidas. Los edemas

presentes en las articulaciones causan dolor al movimiento pudiendo llevar a

los animales a desarrollar cojeras permanentes del miembro posterior. Esta

fase de la infección puede durar de 1 a 4 semanas.

Figura 11: Animales infectados por B. besnoiti en fase subaguda con edemas en extremidades

(a) y mamas (b) (Alzieu et al., 2011).

Según Cortes y cols., los toros infectados por B. besnoiti suelen presentar

orquitis aguda dolorosa durante esta fase (Cortes et al., 2005).

Durante la fase aguda y subaguda de la besnoitiosis bovina, los animales

pueden presentar alteraciones de algunos parámetros de laboratorio como

una reducción de la concentración de leucocitos y eritrocitos, un incremento

a

b


42

de las globulinas séricas totales y un aumento de la concentración de

bilirrubina y de la actividad de las enzimas aspartato aminotransaminasa

(AST) y creatin quinasa (CK). Estas alteraciones podrían ser reflejo de un

estado de inflamación aguda, del empeoramiento de la condición corporal

incluso de lesiones en la musculatura de los animales (Langenmayer et al.,

2015).

Fase crónica de esclerodermia:

Al tiempo que los edemas se atenúan y la fiebre desaparece por completo,

comienzan a presentarse otros signos clínicos como fotofobia, lagrimeo,

descarga nasal mucopurulenta, engrosamiento, endurecimiento y

plegamiento progresivo de la piel, además de alopecia, seborrea e

hiperqueratosis (Figura 12a). En algunos casos podemos encontrar

desprendimientos de piel esclerosada y aparición de grietas profundas en

carne viva en las zonas de pliegues que a menudo pueden infectarse por

gérmenes oportunistas o larvas de moscas (Castillo et al., 2009). De forma

menos frecuente aparecen nódulos cutáneos característicos en las

extremidades, orejas y dorso, incluso pueden llegar a observarse profundas

cicatrices, principalmente en la zona de los pezones. Esta fase de la

enfermedad, conocida como fase de esclerodermia, es la responsable de su

denominación como elefantiasis bovina y está asociada al asentamiento del

parásito en el tejido conectivo y a la formación de quistes tisulares con

bradizoítos en su interior.

Los animales en peores condiciones presentan numerosos quistes parasitarios

en el tejido conectivo, y la severidad de sus lesiones cutáneas está

directamente relacionada con la carga parasitaria. Estos quistes se

encuentran a menudo rodeados por un infiltrado granulomatoso inflamatorio

(Dubey et al., 2013), incluso pueden llegar a desarrollar una

neovascularización periférica. La formación de estos quistes suele ocurrir en

la dermis (cuello, porción distal de las extremidades, escroto) (Figura 12b),

en la conjuntiva esclerótica y en la mucosa del tracto respiratorio superior

(rinario, laringe, faringe), aunque también pueden encontrarse en otros

tejidos conectivos más internos como fascias, músculos, tendones, corazón y

paredes de vasos sanguíneos. Recientemente se han detectado quistes del

parásito en el corion laminar de animales infectados de forma severa,


43

asociados en la mayoría de los casos a una importante laminitis

(Langenmayer et al., 2014a).

Los machos afectados clínicamente suelen presentar quistes de B. besnoiti en

testículos, glándulas y conductos del aparato reproductor (Kumi-Diaka et al.,

1981). Estos quistes aparecen con frecuencia acompañados de esterilidad

temporal o permanente causada por una orquitis necrotizante que por lo

general termina en atrofia e induración de los testículos (Cortes et al., 2005).

Sin embargo, la fertilidad de los machos afectados de forma asintomática no

resulta aparentemente alterada (Cortes et al., 2006a). En el caso de las

hembras en fase crónica, los quistes parasitarios suelen presentarse en la

mucosa del tracto genital inferior (vulva, vagina) (Frey et al., 2013) y

endometrio (Nobel et al., 1981), generalmente acompañados de una reacción

inflamatoria granulomatosa. Sin embargo, ni los quistes tisulares ni los

granulomas parecen alterar el funcionamiento normal de los órganos

afectados, sin comprometer por tanto la fertilidad de las vacas infectadas

(Nobel et al., 1981). No obstante, el desarrollo de la enfermedad conlleva

por lo general un impacto negativo sobre la producción de leche y un

deterioro progresivo de la piel en la zona de la ubre de las vacas, lo que

podría afectar negativamente al crecimiento de los terneros.

Los quistes tisulares aparecen a las 6-7 semanas PI y son fácilmente

reconocibles en la conjuntiva esclerótica (Figura 12c), región vulvar y mucosa

nasal mediante inspección clínica, lo que posee un importante valor

diagnóstico.

Además de las lesiones cutáneas y la aparición de quistes parasitarios, la

forma crónica de la besnoitiosis bovina se caracteriza también por producir

pérdida de peso y un deterioro progresivo de la condición corporal, lo que

habitualmente conlleva un desvieje precoz de los animales. Si la enfermedad

sigue su curso, los animales pueden acabar postrados de forma irreversible,

incluso llegándose a producir su muerte. Sin embargo, en algunas ocasiones

los animales se recuperan lentamente quedando como único signo de

enfermedad algunos quistes presentes en la conjuntiva esclerótica.


44

Figura 12: (a) Engrosamiento, endurecimiento, plegamiento e hiperqueratosis de la piel en un

animal infectado por besnoitiosis bovina en fase crónica. (b) Engrosamiento de la piel de la

zona escrotal causado por la formación de quistes de B. besnoiti en un toro infectado en fase

crónica. (c) Quistes de B. besnoiti presentes en la conjuntiva esclerótica de un animal con

enfermedad crónica.

Los parámetros hematológicos y bioquímicos de los animales afectados de

manera crónica también pueden aparecer alterados mostrando una

disminución de la concentración de los eritrocitos y una

hipergammaglobulinemia, principalmente ligada a la inflamación crónica

causada por el parásito (Langenmayer et al., 2015).

En un reciente trabajo realizado por Gollnick y cols. se ha comprobado que la

severidad en el curso de la besnoitiosis bovina durante la fase crónica

a

b c


45

aparentemente se corresponde con la detección de títulos elevados de

anticuerpos en el suero y con altas cargas de ADN del parásito en la piel de

los animales afectados (Gollnick et al., 2015).

2.3.4.3-ANIMALES ASINTOMÁTICOS

En aquellas zonas donde la besnoitiosis bovina se presenta de forma

endémica, la frecuencia de aparición de casos clínicos resulta a menudo

limitada, siendo la mayor parte de los animales infectados serológicamente

positivos pero sin signos clínicos de enfermedad. Esta situación dificulta la

identificación precoz de los casos conllevando por tanto un riesgo

epidemiológico de diseminación de la enfermedad de unos rebaños a otros

mediante la introducción de estos animales infectados subclínicos.

2.3.5-DIAGNÓSTICO

2.3.5.1-DIAGNÓSTICO CLÍNICO-EPIDEMIOLÓGICO

Principalmente se basa en el reconocimiento de los signos clínicos propios de

la besnoitiosis bovina, aunque también puede apoyarse en algunos distintivos

epidemiológicos de la enfermedad como son su carácter estacional o su

distribución geográfica. Además, pueden identificarse posibles factores de

riesgo asociados a la infección como el tipo de manejo productivo empleado

en la explotación bajo sospecha, la presencia de vectores en la zona o el

grupo de edad, el sexo y la raza de los animales afectados.

Durante la fase aguda febril, el diagnóstico clínico suele ser complicado

debido a que los signos que presentan los animales afectados, tales como

fiebre, congestión, hipersensibilidad, epífora o fotofobia, suelen ser poco

específicos. Con la aparición de los edemas durante la fase subaguda el

diagnóstico resulta más acertado, sin embargo, la intensidad del cuadro

clínico es con frecuencia muy variable, lo que puede dar lugar a confusiones

en el diagnóstico en este punto. Por último, el diagnóstico durante la fase


46

crónica de esclerodermia de la besnoitiosis bovina resulta prácticamente

inequívoco. En este caso, se caracteriza por la identificación de pequeños

quistes de B. besnoiti de color blanquecino sobre la esclera conjuntival y/o

mucosas además de la observación de las lesiones cutáneas típicas

(hiperqueratosis, alopecia y esclerodermia).

En 1962 Bigalke y cols. describieron un método simple, específico y fiable

que permitía detectar los animales afectados crónicamente de besnoitiosis

bovina. Consiste en la observación, mediante examen visual, de los quistes

parasitarios que aparecen en la esclera conjuntival entre los 35 y 49 días PI

(Bigalke & Naude, 1962). En la mayoría de los casos, estos quistes oculares

suelen presentarse como único signo visible de enfermedad. En ese trabajo

se detalla también que los quistes suelen aparecer de forma bilateral y su

número puede variar desde algunas unidades a varias decenas. Según unas

encuestas realizadas por estos mismos autores, en torno al 6,8% de los

animales examinados presentaban quistes oculares, y sólo un 14% de éstos

(1% del total) presentaban lesiones cutáneas típicas. Sin embargo, la

sensibilidad diagnóstica de este método se ve drásticamente disminuida

debido a las limitaciones que presenta para la detección de los casos de

infección crónica subclínica, que por lo general representan la gran mayoría

de los animales afectados en un rebaño.

2.3.5.2-DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL

Fase aguda:

-Rickettsiosis y babesiosis: ambas afecciones provocan alteraciones en las

células sanguíneas y pueden causar por tanto signos clínicos comunes a la

besnoitiosis como un síndrome febril de aparición súbita.

-Bronconeumonía infecciosa enzoótica: el cuadro clínico típico de esta

enfermedad presenta una fuerte hipertermia, abatimiento, taquipnea,

anorexia, detención de la rumia, descarga nasal mucopurulenta y ruidos

respiratorios, lo que puede llevar a confusiones con la besnoitiosis bovina.


47

-Rinotraqueítis infecciosa bovina (IBR): generalmente cursa con fiebre,

anorexia, descarga nasal de serosa a mucopurulenta, tos, disnea y

conjuntivitis con epífora, también compatible con la sintomatología de la

besnoitiosis.

Fase subaguda:

-Ehrlichiosis: causada por Anaplasma phagocytophilum, cursa con fiebre y

apatía en las primeras fases y después puede provocar edemas en la parte

distal de los miembros.

-Fiebre catarral maligna: provoca fiebre, inapetencia y epífora, sin embargo

no suelen aparecer alteraciones cutáneas.

Fase crónica:

-Dermatitis nodular cutánea: se caracteriza por la erupción de nódulos

cutáneos, un poco más voluminosos que en el caso de la besnoitiosis y

principalmente localizados en los flancos, además de edemas y

linfadenomegalia.

-Fotosensibilización: todas las formas de fotosensibilización cursan

generalmente con dermatitis agudas en zonas con ausencia de pigmentación,

claras o con pelo blanco, lo que suele provocar malestar e inquietud en los

animales.

-Sarna: sobretodo en el caso de la sarna sarcóptica, se producen alteraciones

de la piel tales como seborrea, hiperqueratosis e infecciones secundarias,

además de un intenso prurito. Al contrario de lo que ocurre en la

besnoitiosis, estas afecciones no suelen provocar ni fiebre ni edemas.

-Demodicosis: provoca lesiones generalizadas discretas en forma de

pequeños nódulos en los folículos pilosos especialmente en la zona de la

testuz, flancos, cola y corvejones.

-Pediculosis: se trata de una afección pruriginosa e invernal sin grave

repercusión en el estado general de los animales. Se caracteriza por producir

una dermatitis exudativa y pruriginosa de la piel en la zona de los ojos y bajo

la cola, y por lo general pueden visualizarse los piojos sobre la piel.


48

-Dermatofilosis: es una enfermedad típica de épocas cálidas y húmedas

originada por Dermatophilus congolensis. Las lesiones cutáneas se sitúan

principalmente en la espalda, zonas desprovistas de pelo, extremidades y

cabeza. Los mechones de pelo se apelmazan, la piel se agrieta, se engruesa

y se produce un exudado seroso. La paraqueratosis de las zonas afectadas

puede confluir y formar costras con descamaciones incluso áreas alopécicas.

-Paraqueratosis: puede ser hereditaria o debida a la carencia de zinc y se

caracteriza por un mal estado general acompañado por la presencia de placas

de paraqueratosis dolorosas a la palpación a nivel de la base de los cuernos,

de las articulaciones y de las mucosas vulvar y de alrededor del ano.

-Intoxicación por leguminosas (veza, trébol y altramuz): se observa en

primavera, aunque cada vez de forma menos frecuente. Se debe a la

germinación rápida y abundante de estas leguminosas. En el 50% de los

casos supone la muerte y cursa con edema parpebral, conjuntivitis, pápulas

confluyentes en el cuello, mamas, escroto y perineo que generalmente

conducen a alopecias. También se observa hipersalivación y diarrea.

-Enfermedad del músculo blanco: se trata de una deficiencia de selenio y

vitamina E. Causa alteraciones cardiacas y locomotoras que provocan

debilitamiento del animal, reluctancia al movimiento, postración, llegando

incluso a originar la muerte de los animales en pocas horas.

-Síndrome de la dermatitis pruriginosa de la vaca lechera: se debe a la

ingestión de ensilados que han sido conservados a base de ácido sulfúrico y

formol. Provoca una hiperqueratosis acompañada de hipertermia e

importantes hemorragias internas difusas.

-Ictiosis congénita: responsable de la aparición de placas de hiperqueratosis

cutánea en la espalda, cola, extremidades y hocico en terneros neonatos.

Estas lesiones alopécicas pronto se fisuran y terminan por ulcerarse.


49

2.3.5.3-DIAGNÓSTICO LABORATORIAL O DE CONFIRMACIÓN

Directo o etiológico:

Se basa en la observación de diferentes formas parasitarias en los tejidos de

los animales afectados. Para ello se han descrito diversas técnicas:

-Observación directa: consiste en la visualización de quistes de B. besnoiti

sobre el propio ganado. Estos quistes parasitarios pueden ser observados

macroscópicamente en forma de pequeños puntos blanquecinos y en número

muy variable en la conjuntiva esclerótica especialmente, pero también en la

mucosa del tracto respiratorio superior y de la región vulvar/vaginal en las

hembras. Este método es muy específico, sin embargo hay que tener en

cuenta que los quistes se desarrollan a las 6-7 semanas PI, por lo que se

trata de un diagnóstico de la besnoitiosis bovina en fase crónica.

-Examen microscópico: el análisis puede realizarse en un frotis de sangre, en

un rapado o en una biopsia.

En el primer caso, se basa en la observación de los taquizoítos libres en

sangre mediante la tinción de Giemsa. Su presencia en el torrente

circulatorio es muy corta, de 1 a 10 días tras la infección, por lo que este

diagnóstico se centra en la fase aguda de la enfermedad.

En el caso del raspado, el método consiste en realizar un raspado de aquellas

zonas de la dermis o de la mucosa afectadas con sospecha de presencia de

quistes tisulares. La muestra obtenida se coloca en un portaobjetos con un

cubre y se pueden observar al microscopio los bradizoítos resultantes de la

ruptura mecánica de los quistes.

Por último, mediante la biopsia de piel podemos observar, directamente en

fresco (mediante placas de compresión) o por medio de técnicas histológicas,

los quistes tisulares de B. besnoiti presentes en la dermis y subcutis de

aquellos animales con esclerodermia. Esta técnica ha sido descrita en la

bibliografía como un método rápido, económico y de elección para la

confirmación de la besnoitiosis bovina (Sannusi, 1991). Además de mostrar

los quistes de B. besnoiti, si se realiza un estudio histológico del tejido

adyacente, este técnica permite valorar también la existencia de posibles


50

lesiones que suelen acompañar a los quistes como los infiltrados

inflamatorios o granulomas.

Tanto el examen macroscópico como microscópico, al estar basados en la

observación directa del parásito, presentan la ventaja de ser métodos de

diagnóstico de la enfermedad muy específicos. Sin embargo, ambas técnicas

muestran el inconveniente de no poder detectar los casos subclínicos de la

enfermedad.

-Diagnóstico molecular: el método de PCR cuantitativa descrito por Cortes

(Cortes et al., 2007a) y adaptado posteriormente por Schares (Schares et al.,

2011) permite la detección de ADN de B. besnoiti en muestras de piel y

mucosa vaginal en aquellos animales afectados de forma crónica. Esta

prueba se basa en la amplificación del fragmento de ARN ribosómico incluido

en la región del ITS-1 (Internal Transcribed Spacer-1), previamente

caracterizado por Ellis y colaboradores (Ellis et al., 2000). Se trata de un

método altamente sensible y específico para la detección de la infección por

B. besnoiti que no presenta reacciones cruzadas con otras especies de

protozoos estrechamente emparentadas (Schares et al., 2011).

Según Schares y cols., la PCR cuantitativa descrita en su artículo es capaz de

detectar ADN de B. besnoiti en muestras de piel y mucosa entre los días

1-3 tras el comienzo de la fase aguda febril, lo que implica un diagnóstico

muy temprano de la infección (Schares et al., 2013).

Del mismo modo, varios autores apuntan que esta técnica podría resultar

muy interesante para la detección de los taquizoítos circulantes presentes en

la sangre durante los primeros días de la infección, lo que sería de gran

utilidad para lograr un diagnóstico fiable y precoz de los casos agudos de

besnoitiosis bovina (Alzieu et al., 2011; Álvarez-García et al., 2013).

Indirecto:

El diagnóstico indirecto está basado en la detección de anticuerpos séricos

frente a la infección por B. besnoiti. Según Schares y cols., este tipo de

diagnóstico es válido a partir de los 7-8 días tras la fase de infección aguda

febril, por lo que se trata de una herramienta diagnóstica menos precoz que

la PCR cuantitativa descrita anteriormente (Schares et al., 2013).


51

En la actualidad existen varias técnicas serológicas disponibles para la

detección de la infección:

-Inmunofluorescencia indirecta (IFI): la técnica consiste en una reacción

específica entre los anticuerpos séricos del animal y los antígenos de

B. besnoiti previamente fijados en un soporte sólido. Esta reacción se

evidencia por medio de un segundo anticuerpo marcado con un fluorocromo o

una enzima cromógena capaz de unirse a los anticuerpos primarios.

Los primeros test de inmunofluorescencia descritos para el diagnóstico de la

besnoitiosis bovina fueron desarrollados en Israel (Neuman, 1972), siguiendo

los procedimientos utilizados por Goldman para el diagnóstico de Toxoplasma

(Goldman & Carver, 1962).

Como aparece detallado anteriormente en el apartado de estudios

epidemiológicos previos, la técnica de IFI ha sido empleada en múltiples

ocasiones con el objetivo de realizar diferentes estudios de prevalencia

(Goldman & Pipano, 1983; Janitschke et al., 1984; Shkap et al., 1984).

En lo que respecta a nuestro laboratorio, la técnica de inmunofluorescencia

empleada se puso a punto siguiendo el protocolo descrito por Álvarez-García

y cols. para la detección de la infección por N.caninum (Álvarez-García et al.,

2002). En un estudio seroepidemiológico previo realizado por nuestro equipo

se vio que el punto de corte que permitía obtener los mejores resultados era

el 1/100, mostrando una sensibilidad del 100% y una especificidad del

99,38% (IC95%: 86,58-99,97). Al aumentar el punto de corte se observaba

un aumento de la especificidad, y por tanto un menor riesgo de falsos

positivos, pero se detectaba en consecuencia una disminución en la

sensibilidad (Zacarias, 2009). Este mismo hecho fue observado en un

trabajo publicado poco después por Schares y colaboradores (Schares et al.,

2010).

-Enzimoinmunoensayo (ELISA): el fundamento de esta técnica consiste en

evidenciar la reacción antígeno-anticuerpo en el suero de los animales

infectados por medio de una enzima que transforma un substrato en un

producto cuantificable mediante espectrofotometría.


52

Al igual que en el caso anterior, las primeras descripciones del diagnóstico de

la besnoitiosis bovina mediante el test de ELISA se sucedieron en Sudáfrica e

Israel (Janitschke et al., 1984; Shkap et al., 1984). En ambos países, la

técnica de ELISA presentaba similares especificidades en comparación con la

IFI. Respecto a la sensibilidad, Janitschke observó en sus encuestas una

mayor sensibilidad diagnóstica mediante la prueba de IFI y Shkap,

contrariamente, mediante el test de ELISA. Más recientemente, Zacarias

detalló en su trabajo que la IFI demuestra mayor sensibilidad para la

detección de la besnoitiosis bovina que el ELISA, aunque la diferencia era

escasa. Además, en ese artículo también se especifica que la concordancia

obtenida entre ambas pruebas para el punto de corte de IFI 1/200 fue

excelente, con un coeficiente kappa (k) de 0,89±0,02 (Zacarias, 2009).

Cortes y cols. evaluaron en 2006 un test de ELISA para Besnoitia basado en

la utilización de un antígeno somático soluble, previamente descrito para

N. caninum (Gottstein et al., 1999). La sensibilidad obtenida fue del 87,0% y

la especificidad varió del 96,4 al 98% (Cortes et al., 2006d). El propio autor

propone también en su trabajo el empleo combinado de la técnica de ELISA

para la realización de estudios de tipo cribado y la técnica de Western Blot

para una confirmación diagnóstica más acertada de los casos individuales de


Respecto al test de ELISA desarrollado por Fernández y cols. para el estudio

de un brote en el centro de la península ibérica, dicha técnica se basó en el

uso de antígeno soluble de B. besnoiti, y la sensibilidad y especificidad

obtenidas alcanzaron el 100% (Fernández-García et al., 2009).

-Western Blot (WB): consiste en la detección mediante electroforesis de un

patrón de bandas de proteínas específico frente a la infección por B. besnoiti.

En el WB puesto a punto por Cortes y cols. se describe un patrón de bandas

típico de besnoitiosis bovina compuesto por tres áreas antigénicas

principales: área I (de los 12 a los 20 kDa), área II (entre 23 y 38 kDa) y

área III (entre 60 y 90 kDa). A partir de ese patrón, se estableció el

estándar necesario para determinar el diagnóstico de la infección. El criterio

establecido fue un mínimo de cuatro bandas para el área I, cuatro para el

área II y otras cuatro para el área III. El análisis de WB demostró una


53

sensibilidad del 91,3% y una especificidad entre el 94,6 y 100% (Cortes et

al., 2006d).

Haciendo uso de la técnica de WB, Fernández-García y cols. llevaron a cabo

en 2009 un estudio con el objetivo de identificar los antígenos

inmunodominantes específicos de los taquizoítos y los bradizoítos de

B. besnoiti, lo que podría resultar de utilidad para el desarrollo de futuras

vacunas y nuevas herramientas diagnósticas que permitan diferenciar entre

la infección aguda y crónica. En el citado trabajo se caracterizaron más de

28 antígenos en taquizoíto y 30 en el caso del bradizoíto. Para los

taquizoítos, el reconocimiento de bandas fue idéntico en los sueros de

animales asintomáticos o con signos clínicos de besnoitiosis bovina. Sin

embargo, el número de antígenos de bradizoíto reconocido por los sueros de

animales con signos fue mayor que el de los asintomáticos, tal vez debido a

una exposición más prolongada al parásito (Fernández-García et al., 2009).

En la misma línea, Schares y colaboradores caracterizaron 10 antígenos de

taquizoíto y otros 10 de bradizoíto en sueros de animales infectados. En su

estudio proponen un patrón mínimo de cuatro bandas de entre los 10

antígenos de taquizoíto y bradizoíto seleccionados para considerar un animal

como positivo. Esta técnica mostró una especificidad del 100% y una

sensibilidad del 90%, además de presentar una concordancia casi perfecta

con la prueba de IFI detallada en el mismo trabajo (Schares et al., 2010).

-Test de aglutinación directa (DAT): esta técnica se basa en la formación de

un coágulo de aglutinación entre los anticuerpos presentes en los sueros de

los animales infectados y una suspensión de antígeno junto con otras

partículas preparada previamente que favorecen la fijación de este enlace.

En 2011, Waap y cols. desarrollaron el único test de aglutinación directa

descrito para el diagnóstico de la infección por B. besnoti. Considerando el

punto de corte 1/160, el DAT mostró un grado de concordancia casi perfecto

con la técnica de IFI (k=0,97), registrando una sensibilidad del 97,2% y una

especificidad del 99,3% (Waap et al., 2011).

Una de las principales limitaciones del diagnóstico serológico es la dificultad

para detectar la fase aguda y subaguda de la enfermedad, ya que, en ese


54

momento de la infección, los animales no han tenido tiempo suficiente para

desarrollar anticuerpos frente a B. besnoiti. No obstante, este tipo de

técnicas presentan la gran ventaja de poder identificar animales seropositivos

con infección subclínica, que en el caso de la besnoitiosis bovina son la

mayoría, además de resultar muy interesantes para la realización de estudios

de evolución temporal de la seroprevalencia o de controles serológicos

rutinarios de los rebaños.

En resumen, teniendo en cuenta un estudio inter-laboratorial llevado a cabo

recientemente en el que se han comparado las diferentes opciones de

pruebas serológicas para el diagnóstico de la besnoitiosis bovina disponibles

en Europa, se recomienda el uso de la técnica de ELISA para la realización de

estudios epidemiológicos, y el WB, que demostró unos valores de sensibilidad

y especificidad más elevados, como método de confirmación o para el caso

de animales de gran valor (García-Lunar et al., 2013).

2.3.6-MÉTODOS DE LUCHA

2.3.6.1-TRATAMIENTO

En la actualidad, no existe un tratamiento totalmente eficaz que evite el

desarrollo de la infección por B. besnoiti. En la bibliografía pueden

encontrase varios compuestos y terapias como la oxitetraciclina (Shkap et

al., 1985), la halofuginona (Shkap et al., 1987), los anticuerpos

monoclonales (Shkap et al., 1995; Njagi et al., 2004) o más recientemente

los tiazólidos (Cortes et al., 2007b), que han sido ensayados in vitro e incluso

in vivo en diferentes especies. No obstante, a pesar de esta amplia gama de

productos estudiados, ninguno de ellos parece haber resultado lo

suficientemente eficaz y convincente como para ser testado y extrapolado al

ganado bovino.

A fecha de hoy, el tratamiento de elección recomendado durante la fase

febril, o al inicio de la fase de edemas en último caso, se centra en el empleo

de sulfamidas por vía oral o intravenosa que ayudan a limitar los efectos de


55

la enfermedad. Sin embargo, hay que tener en cuenta que aquellos animales

que logran sobrepasar la enfermedad pueden quedar a menudo como

portadores del parásito. Además de las sulfamidas, Alzieu y cols.

recomiendan instaurar en esta misma fase un tratamiento sintomático de

apoyo que ayude a los animales a sobrellevar la enfermedad. Este

tratamiento debería incluir antibioticoterapia, para controlar posibles

infecciones secundarias (sobre todo a nivel de las lesiones dérmicas) y

antiinflamatorios no esteroideos, por sus propiedades antiinflamatorias y

antipiréticas. Más tarde, en la fase de edemas, se recomienda el uso de

corticoides junto con diuréticos. Por último, la administración de

suplementos vitamínicos, minerales e incluso pienso de alta calidad resulta

también muy recomendable para minimizar el deterioro producido por la

enfermedad (Alzieu et al., 2011).

Durante la fase crónica de la besnoitiosis bovina, el tratamiento suele ser

muy difícil y de escasa eficacia, probablemente debido a la limitada

accesibilidad de los principios activos al interior de los quistes tisulares

parasitarios.

2.3.6.2-PROFILAXIS

Vacunal:

Las primeras y únicas vacunas utilizadas frente a la besnoitiosis bovina

surgieron en Sudáfrica e Israel a partir de cepas vivas atenuadas del

parásito. Es reseñable sin embargo que ninguna de las citadas vacunas se

encuentra disponible en Europa.

Bigalke y cols. elaboraron en 1974 una vacuna viva atenuada a partir de

taquizoítos de una cepa de B. besnoiti aislada de ñu azul que inoculada en el

ganado bovino lograba prevenir del desarrollo clínico de la enfermedad

(Bigalke et al., 1974).

Por otro lado, desde 1986 se lleva a cabo en Israel la vacunación sistemática

de todos los toros importados que entran en el país, en este caso con una

vacuna atenuada elaborada a partir de una cepa bovina. Con esta medida se


56

consigue que los machos superen la enfermedad de forma leve sin desarrollar

casos graves de besnoitiosis bovina, limitando de este modo la transmisión

de la enfermedad (Pipano et al., 1997).

En el caso de Europa, este tipo de vacunas elaboradas a partir del patógeno

vivo atenuado no se encuentran disponibles, posiblemente debido a que su

uso podría suponer un elevado riesgo de introducción del parásito en rebaños

y zonas indemnes hasta ahora, más aun considerando el desconocimiento

existente en torno a la biología, transmisión y ciclo de vida del parásito.

Sanitaria:

Para poder instaurar medidas preventivas de lucha eficaces frente a la

besnoitiosis bovina es muy recomendable conocer en primer lugar el estado

sanitario de partida del rebaño, ya que, en función de la seroprevalencia

resultante, podrán plantearse diferentes opciones de control (Alzieu et al.,

2011).

En las zonas donde la besnoitiosis bovina se presenta de forma endémica, las

estrategias de control deberán ir encaminadas a controlar y minimizar la

prevalencia de besnoitiosis bovina para evitar así su diseminación. Para ello,

como primera medida se recomienda el aislamiento, incluso si es posible, la

eliminación de todos aquellos animales enfermos con signos clínicos,

especialmente los infectados crónicos portadores de quistes en la conjuntiva

esclerótica. Gollnick y cols. proponen en base a los resultados obtenidos en

un reciente estudio que una distancia mínima de 20 m puede ser suficiente

para reducir notablemente el riesgo de transmisión de la enfermedad por

contacto (Gollnick et al., 2015). En el resto de animales del rebaño, es

aconsejable realizar un análisis serológico para poder establecer medidas

más concretas. Si la prevalencia obtenida es muy baja (<10%), la estrategia

podría ser la eliminación de todos los animales seropositivos junto con el

control riguroso de las nuevas entradas. Por el contrario, si la prevalencia

observada es mayor (>30%), las medidas se dirigirán a minimizar el impacto

de la enfermedad en el rebaño hasta que éste alcance la estabilidad

endémica, principalmente mediante la eliminación de los animales afectados

clínicamente.


57

De forma complementaria, en la explotación ha de llevarse a cabo una

vigilancia y control de los posibles factores de riesgo presentes: limitar la

presencia de vectores mediante el uso de insecticidas o trampas, restringir el

acceso de reservorios silvestres a la instalación y realizar un estricto control

de las condiciones de manejo tales como la monta natural o los periodos de

pastoreo en extensivo.

En los rebaños indemnes, el objetivo se centrará en evitar la entrada de la

infección. Con este fin, resulta imprescindible la realización de controles

clínicos y serológicos obligatorios a todos los animales de nueva entrada,

sobre todo si se trata de bovinos mayores de 6 meses. Si es posible, se

recomienda la repetición de este control a las seis semanas ya que nos

permitirá detectar casos de infecciones muy recientes que hubieran podido

resultar negativos en el primer control. En cualquier caso, la vigilancia y el

control de los posibles factores de riesgo asociados a la enfermedad puede

ser igualmente interesante en este tipo de rebaños.

MATERIAL Y MÉTODOS

Material y métodos

59

3-MATERIAL Y MÉTODOS

3.1-CONTEXTO DEL ESTUDIO

Tras la bajada de los animales de los pastos de puerto en septiembre del año

2009, los veterinarios responsables del rebaño bovino de la finca

experimental de montaña “La Garcipollera” identificaron a un animal

sospechoso de sufrir besnoitiosis en fase crónica muy avanzada. Ello llevó a

la observación del resto del rebaño, en el que se encontraron otros cinco

animales con signos compatibles con la enfermedad como hiperqueratosis,

zonas de piel desprendida, grietas y abatimiento. En diciembre, al realizar la

campaña anual de saneamiento, los veterinarios encargados de la finca

observaron de nuevo más animales con un cuadro clínico similar. Dada la

extensión de la patología se contactó con el Departamento de Parasitología

de la Facultad de Veterinaria de Zaragoza para el análisis y seguimiento del

brote.

3.2-DESCRIPCIÓN DEL ÁREA Y PERIODO DEL ESTUDIO

Entre enero del año 2010 y febrero del año 2011 se procedió al seguimiento

y análisis de la población bovina de la finca experimental “La Garcipollera”,

una finca de carácter extensivo dedicada al estudio de sistemas ganaderos de

montaña y sus posibilidades técnicas de mejora, propiedad del CITA (Centro

de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón) y ubicada en una

zona montañosa del Pirineo aragonés. Estas zonas de montaña constituyen

importantes territorios en la Unión Europea y especialmente en Aragón,

donde la ganadería ha sido desde hace siglos la principal actividad

económica, de fijación de la población rural y de conservación del medio

ambiente.

La explotación a estudio está situada en Bescós de la Garcipollera, una

pequeña localidad enclavada en el valle de la Garcipollera, un discreto y

recogido valle formado por el río Ijuez (afluente del río Aragón), ubicado en

Material y métodos

60

un lateral del conocido valle de Canfranc, en la comarca oscense de la

Jacetania (España, 42°37′N, 0°30′W) (Figura 13). La altitud del área de

estudio oscila entre los 950 y 2200 m sobre el nivel del mar. La climatología

de esta zona es la típica del clima oceánico de montaña, con inviernos fríos y

prolongados (tª media en torno a los 4ºC) y veranos secos y templados

(tª media próxima a los 20ºC), con una tª media anual de 10,9ºC. La

precipitación anual total se sitúa en torno a los 1000 l/m³, concentrada en

forma de lluvias en primavera y otoño-principio de invierno, nieve en invierno

y tormentas en verano (datos climatológicos del Instituto Aragonés de

Estadística).

Geológicamente, el terreno en el valle de La Garcipollera está compuesto

principalmente por Flysch (un conjunto de sedimentos que comprenden

areniscas, conglomerados, margas, pizarras y arcillas), en contacto con

tierras calizas en la parte norte. En cuanto a la vegetación, pueden

diferenciarse dos tipos principales: la vegetación de zona baja (de 900 a

1500 m de altitud), consistente en pastos forestales (bosques de pinos,

arbustos tales como endrinos, bojes, aliagas y un manto herbáceo) y los

pastos altos supraforestales (entre 1500 y 2200 m de altitud),

fundamentalmente compuestos por gramíneas.

Con respecto a las características de la finca estudiada, la explotación lleva a

cabo un manejo de producción de carne en régimen extensivo basado en el

aprovechamiento de los pastos próximos mediante un sistema de pastoreo

valle-puerto, donde los animales comparten en verano los pastos de montaña

con rebaños vecinos, en primavera y otoño pastorean en zonas boscosas

próximas o pastos intermedios y en invierno permanecen en praderas de

fondo de valle o estabulados en la finca alimentados con forrajes

conservados.

Material y métodos

61

Figura 13: Mapa comarcal de Aragón con la situación de la localidad donde se encuentra la

explotación a estudio, Bescós de la Garcipollera (adaptado del repositorio de mapas del Portal

de las comarcas de Aragón).

Bescós de la

Garcipollera

Material y métodos

62

En cuanto al manejo reproductivo de la explotación, las cubriciones de las

hembras se realizan mediante monta natural justo después del parto y se

dividen en dos épocas de partos-cubriciones al año, primavera y otoño

(Casasús et al., 2002). De manera rutinaria, las vacas son estabuladas en

función de su raza en grupos de cubrición de unos 20 individuos al azar

compartiendo un único macho por grupo durante 2-3 meses. Si dentro de un

mismo periodo de cubrición se detecta algún problema en cualquiera de los

sementales, éstos pueden ser sustituidos por otro para así garantizar la

cubrición de las hembras. La reposición de los toros y las novillas en la

explotación se realiza fundamentalmente a partir de terneros procedentes de

la propia finca.

En el siguiente gráfico (Figura 14) puede verse representado el esquema de

actuación para los dos periodos de partos-cubriciones llevados a cabo en la

explotación:

Figura 14: Diagrama con las épocas de partos-cubriciones de otoño y primavera realizadas en

la explotación (adaptado de Casasús-Pueyo, 1998).

-Vacas con parto en OTOÑO: el periodo de parto de estas vacas comprende

desde el 1 de octubre al 31 de diciembre y las cubriciones del 15 diciembre al

15 marzo. Durante la lactancia, es decir, desde el inicio de la época de

partos hasta aproximadamente el 15 de abril (fecha que puede variar según

las condiciones meteorológicas), estas vacas son alojadas en la nave principal

de la explotación en grupos de cubrición de unas 20 vacas con sus terneros

cerca. Estos terneros son destetados a mediados de marzo con un promedio

de 4,5 meses de edad y generalmente no suben a los pastos de montaña ya

Material y métodos

63

que suelen venderse directamente. Tras la época de cubrición, se realiza un

diagnóstico de gestación de las vacas. Por un lado, aquellas que han

quedado vacías se reintroducen en la cubrición de primavera. Por otro, las

vacas gestantes y secas pastorean primero dos meses (del 15 de abril al 15

de junio) en pastos boscosos próximos a la finca para después subir con el

resto del rebaño a los pastos de puerto hasta septiembre. Una vez bajan del

puerto, estas vacas se distribuyen de nuevo en los alojamientos para el

siguiente periodo de partos-cubriciones de otoño. En total, la temporada de

pastoreo de estos animales es de 158 días.

-Vacas con parto en PRIMAVERA: en este caso los partos de las vacas se

suceden del 1 de febrero al 1 de abril y las cubriciones del 15 de abril al

15 de junio. Desde mediados de diciembre hasta el 15 de junio, es decir,

durante la última etapa de la gestación y los primeros meses de lactancia,

estas vacas se alojan generalmente en la nave principal de la explotación en

grupos de cubrición de unas 20 vacas con sus terneros cerca. Para las vacas

secas y que no han quedado cubiertas en el periodo anterior, las cubriciones

suelen realizarse en las praderas cercanas en lotes algo más grandes y con

acceso a pastos, aunque se juntan diariamente a comer el suplemento

alimenticio suministrado en carros al aire libre. Durante el verano, las vacas

y sus terneros pastorean en los pastos de alta montaña hasta el destete, en

torno al mes de septiembre, cuando los terneros tienen una media de

6 meses de edad. Desde entonces hasta el 15 de diciembre, los terneros no

lactantes y las vacas permanecen en los pastos forestales. La duración

media del tiempo de pastoreo en este periodo es de 183 días. En el mes de

noviembre se realiza un diagnóstico de gestación de las vacas para

comprobar su estado. Aquellas que han quedado vacías entrarán en las

cubriciones de otoño y las gestantes, parirán y entrarán de nuevo en

cubrición en primavera.

El ganado bovino presente en la explotación convive además con un rebaño

ovino de la raza Churra Tensina y con varios perros pastores. Ni en la finca

ni en sus proximidades consta la presencia de gatos domésticos. Por otro

lado, en el valle existe una Reserva Nacional de Caza con una de las mayores

poblaciones de venado del país, uno de los principales reservorios silvestres

sospechoso de transmitir la besnoitiosis bovina.

Material y métodos

64

Por último, es interesante recalcar que, según los resultados de un trabajo

realizado en colaboración con otros autores en toda la región del Pirineo

aragonés, la explotación a estudio se ubica en un área tradicionalmente

endémica de besnoitiosis bovina con una tasa de seroprevalencia de rebaño

del 87,3% y una prevalencia individual que varía entre un 15,1% y un 95,7%

de animales seropositivos (Gutiérrez-Expósito et al., 2014).

3.3-DISEÑO DEL ESTUDIO

Con el fin de lograr los objetivos planteados, el trabajo se dividió en tres

partes diferentes:

-Estudio seroepidemiológico: se diseñó un estudio observacional longitudinal

del rebaño completo, tanto de la población adulta como de su descendencia.

Basándonos en el sistema de partos-cubriciones llevado a cabo en la

explotación, para la población adulta se planificaron tres puntos de muestreo

a lo largo del estudio: enero 2010 (aprovechando el momento entre la época

de partos de otoño y la de primavera), septiembre 2010 (a la bajada de

puerto) y febrero 2011 (de nuevo en el periodo entre los partos de ambas

épocas). Para el estudio de los terneros, únicamente se estableció un punto

de muestreo en torno al momento del destete, cuando los animales

alcanzaron los 4-6 meses de edad.

-Estudio reproductivo: en primer lugar se llevó a cabo un análisis descriptivo

de los índices reproductivos históricos de la explotación para luego

determinar la posible influencia de la infección por B. besnoiti sobre la

eficiencia reproductiva del rebaño mediante un análisis detallado de aquellos

animales involucrados en las cubriciones llevadas a cabo en la explotación

durante el periodo que duró el estudio.

-Estudio molecular: dadas las limitaciones de las técnicas serológicas para la

detección de animales infectados en la fase aguda o de los animales

infectados pero seronegativos junto con el hecho de que el torrente

sanguíneo funciona como medio de transporte de los taquizoítos a los tejidos

diana durante la fase de parasitemia, en este trabajo se planteó evaluar el

Material y métodos

65

potencial de la PCR cuantitativa como técnica de diagnóstico temprano de la

fase aguda de la besnoitiosis bovina. Además, se valoró también su potencial

como técnica de confirmación diagnóstica de la fase crónica de la

enfermedad. Para ello, se procedió a la puesta a punto y optimización en

nuestro laboratorio de la técnica de PCR cuantitativa basada en la

desarrollada por Schares y cols. aunque con algunas modificaciones (Schares

et al., 2011).

3.3.1-ESTUDIO SEROEPIDEMIOLÓGICO

3.3.1.1-ENCUESTAS EPIDEMIOLÓGICAS Y TOMA DE MUESTRAS

En cuanto al método de selección de los participantes y al tamaño de la

muestra de la población adulta, previendo la pérdida de animales que suele

afectar a este tipo de trabajos, se decidió seleccionar la población completa

presente en la explotación desde enero del 2010 a febrero del 2011. La

población total muestreada constó de 276 cabezas de vacuno de carne,

aunque el tamaño muestral presentó pequeñas variaciones a lo largo del

estudio al producirse salidas y entradas de nuevos animales a la explotación.

Los criterios de inclusión fueron todos aquellos animales a partir de 1 año de

edad que estuvieran presentes en la explotación a lo largo del estudio,

incluyendo las salidas y entradas de animales.

Los tres puntos de muestreo fijados en el estudio para la población adulta,

enero de 2010, septiembre de 2010 y febrero de 2011, permitieron

establecer dos periodos diferenciados en el trabajo, puerto y valle. El primer

periodo llamado puerto transcurrió de enero a septiembre de 2010, con una

duración de 7,3 meses y comprendió un periodo inicial de estabulación, que

varió en función de la época de partos-cubriciones a la que perteneció cada

vaca (3,7-20,7 semanas), seguido de la subida de todos los animales a los

pastos de puerto. El segundo periodo se denominó valle y englobó los

5 meses que fueron desde septiembre de 2010 hasta febrero de 2011, por lo

que su duración fue algo menor. Este segundo periodo incluyó el alojamiento

de las vacas en las praderas y naves de la explotación (Figura 15).

Material y métodos

66

Inicio:

22 enero

2010

19

abril

15

junio

1 septiembre

2010

15

diciembre

Fin:

1 febrero

2011

Puerto Valle

Cubriciones

otoño 09 Subida a puerto

Partos

otoño 10 Cubriciones otoño 10

Partos-cubriciones

primavera 10

Subida a

puerto

Alojamiento en praderas y naves de la

explotación

Figura 15: Esquema del diseño y cronología del estudio seroepidemiológico en base a las dos

épocas de partos-cubriciones establecidas en la explotación.

Respecto a la información recopilada en las encuestas epidemiológicas, por

un lado, se recogieron los datos correspondientes al número de identificación

de los animales (crotal), fecha de nacimiento, sexo, raza, además de

examinar la presencia de signos de besnoitiosis bovina crónica

(principalmente quistes en la conjuntiva esclerótica, mucosa vaginal y

alteraciones cutáneas). Por otro, se tomó una muestra de sangre mediante

punción de la arteria coccígea o vena yugular, usando para su recogida un

tubo sin anticoagulante para la obtención de suero que se envió refrigerado al

laboratorio para su posterior procesado (Figura 16). Una vez en allí, las

muestras de sangre sin anticoagulante fueron centrifugadas (2500 rpm,

10 minutos, 21ºC) y el suero resultante se congeló a -80ºC hasta su

utilización.

Además, con el objetivo de conocer con qué animales había mantenido

contacto cada individuo y durante cuánto tiempo, a posteriori, se realizó un

seguimiento de la distribución de los alojamientos y las agrupaciones llevadas

a cabo en la explotación para cada periodo del estudio. Para ello, se exploró

qué lotes se habían organizado en la finca para cada época de partos y de

cubriciones y en qué instalaciones habían sido alojados esos animales (nave

roja o parques de la vaquería), además de registrarse el tiempo que duró su

estabulación.

Material y métodos

67

Figura 16: Gráfico resumen del estudio seroepidemiológico en la población adulta.

En el caso de la muestra de terneros, se decidió incluir en el análisis todos

aquellos animales nacidos y destetados en la explotación durante el tiempo

que duró el estudio. En este caso, la población total muestreada fue de

145 terneros, 83 nacidos en el periodo de otoño de 2009 y 62 nacidos en

primavera de 2010. Para su estudio, únicamente se estableció un punto de

muestreo coincidiendo con el momento de su destete, que para aquellos

animales nacidos en el primer periodo fue en marzo de 2010 y para los

nacidos en el segundo fue a la bajada de puerto en septiembre de 2010.

Como datos se recogieron el número de identificación de los animales

(crotal), fecha de nacimiento, sexo, raza, posible presencia de signos clínicos

de enfermedad y los datos relativos a la madre. Asimismo, se realizó la toma

de una muestra de sangre para el análisis serológico posterior siguiendo el

mismo procedimiento que para la población adulta (Figura 17). Por último,

en este caso se procedió también a la exploración de la distribución de los

alojamientos y las agrupaciones llevadas a cabo con estos animales en la

explotación.

Material y métodos

68

Figura 17: Gráfico resumen del estudio seroepidemiológico en la población de terneros.

3.3.1.2-TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS

En relación a las pruebas diagnósticas empleadas en el estudio

seroepidemiológico para detectar la presencia de anticuerpos frente a

B. besnoiti en el suero de los animales se decidió utilizar las técnicas de IFI y

ELISA, desarrolladas previamente en colaboración con el grupo SALUVET de

la Universidad Complutense de Madrid. Según un trabajo llevado a cabo por

ese grupo, en el que se realizó un estudio comparativo de las diferentes

herramientas de diagnóstico serológico de la besnoitiosis bovina disponibles

en diversos laboratorios europeos frente a un panel de sueros de referencia,

el coeficiente kappa observado entre estas dos pruebas fue 0,68±0,09

(García-Lunar et al., 2013), lo que refleja un adecuado grado de

concordancia (Thrusfield, 2007). Por tanto, cualquiera de las dos técnicas

parece apropiada para la realización de estudios epidemiológicos o de

cribado.

A continuación se describe la metodología desarrollada en nuestro estudio

para la realización de las técnicas de diagnóstico serológico:

Material y métodos

69

Cultivo del antígeno de B. besnoiti:

Con el objetivo de disponer de antígeno para la realización de las técnicas

serológicas, en primer lugar se procedió al mantenimiento en cultivo celular

de una cepa de B. besnoiti (BbSpain-1) aislada a partir de los quistes

tisulares de la piel de una vaca infectada clínicamente procedente de una

explotación del centro de España (Fernández-García et al., 2009b) y cedida a

este grupo por el equipo de investigación SALUVET.

La muestra de piel fue cortada en diversos fragmentos que fueron lavados

varias veces en tampón fosfato salino (PBS) con penicilina (500U/ml),

estreptomicina (500U/ml) y fungizone (0,125 µg/ml). Una vez lavado, el

tejido fue raspado con un bisturí para disgregar los quistes tisulares y liberar

los bradizoítos en una placa de Petri con PBS, penicilina (200U/ml),

estreptomicina (200U/ml) y fungizone (0,05 µg/ml). Los bradizoítos se

separaron de los restos celulares mediante un pase a través de un cedazo de

Nylon de 40 µm de poro y se recuperaron mediante una centrifugación a

1350 xg durante 15 minutos a 4ºC. El sobrenadante fue descartado y el

sedimento resuspendido en un medio esencial mínimo de Dulbecco, DMEM

(Dulbecco´s modified Eagle medium), suplementado al 5% con suero fetal

bovino (SFB), penicilina (100U/ml), estreptomicina (100U/ml) y fungizone

(0,025 µg/ml). Los bradizoítos resultantes fueron inoculados en un cultivo de

células MARC-145 previamente sembradas en frascos Easy Flask de 70 ml

(Nunc™, Ref. 169900) y obtenidas a partir de un clon de la línea celular

MA-104 proveniente de células epiteliales de riñón de feto de mono Rhesus

(Kim et al., 1993). Posteriormente, los cultivos se incubaron a 37ºC con un

5% de CO2. Tras la infección, los cultivos fueron observados mediante un

microscopio invertido (Nikon Eclipse TS100) (Figura 18) y se comprobó la

existencia de vacuolas parasitóforas en el interior de las células infectadas a

las 36 horas PI y de bradizoítos extracelulares a las 60 horas PI. Una vez

establecidos los cultivos, éstos fueron renovados de forma rutinaria cada 3-4

días, realizando pases en una proporción 5:1 parásito:célula en el caso de

cultivos destinados al mantenimiento de taquizoítos, o en una proporción de

10:1 en el caso de aquellos destinados a la producción de antígeno de

B. besnoiti.

Material y métodos

70

Figura 18: Cultivo de taquizoítos de B. besnoiti sobre células MARC-145 observado al

microscopio óptico.

Todas las operaciones de mantenimiento de los cultivos celulares de

MARC-145 y de taquizoítos se llevaron a cabo en una cabina de flujo laminar

vertical (TELSTAR, BIO-11-A) y en condiciones asépticas.

Preparación del antígeno:

Para la obtención y purificación de los taquizoítos, tras proceder al raspado

de los botes con un raspador celular estéril (Sarstedt, Ref. 83.1830), la

suspensión de células parasitadas fue recogida en un tubo estéril y se pasó

dos veces consecutivas a través una jeringuilla de insulina con una aguja de

25G para así romper las células hospedadoras. Una vez liberados los

taquizoítos, éstos fueron centrifugados a 1350 xg, a 4ºC, durante 15 minutos

y el sedimento resultante fue resuspendido en PBS. Esta suspensión fue

vertida y filtrada a través de una columna de cromatografía Econo-pac 10 DG

(BIORAD, Ref. 732-2010), previamente equilibrada con PBS estéril. La

suspensión de taquizoítos purificada fue recogida y se procedió a su recuento

mediante un hemocitómetro (cámara de Neubauer). Tras una última

centrifugación a 1350 xg, a 4ºC, durante 15 minutos, el sedimento fue

resuspendido en PBS y distribuido en alícuotas de 1 ml en tubos Eppendorf.

En el caso de producción de antígeno para IFI, la concentración de las

alícuotas se ajustó a 107 parásitos/ml con formol al 0,2% para preservar los

taquizoítos procesados y se conservó a 4ºC hasta su utilización. Para el

Material y métodos

71

antígeno destinado a la obtención de extracto proteico de la prueba de ELISA

o para el aislamiento de ADN, la concentración se ajustó a 108 taquizoítos/ml,

dichas alícuotas se centrifugaron de nuevo a 1350 xg, a 4ºC, durante

15 minutos y después de retirar el sobrenadante, el extracto resultante se

almacenó a -80º C para su conservación. Finalmente, para la preparación del

antígeno soluble de ELISA, tras la descongelación del sedimento, los

taquizoítos se resuspendieron en una solución TRIS base 10mM con el

inhibidor de proteasas PMSF 2mM y se procedió a la ruptura de su membrana

mediante 5-6 ciclos de sonicación de 15 segundos en hielo picado. Tras

comprobar por microscopía la lisis del parásito, la suspensión resultante fue

centrifugada de nuevo tres veces a 500 xg durante 20 minutos a 4ºC. El

sobrenadante se dividió en alícuotas previa determinación de la concentración

de proteínas y se almacenó a -80ºC hasta su utilización.

Realización de las técnicas:

-IFI: para la preparación de las placas se procedió a depositar 10 μl de la

suspensión formolada con 107 taquizoítos/ml de la cepa BbSpain-1 en cada

pocillo, utilizando para ello placas de 10 pocillos. Esta suspensión se dejó

secar sobre el vidrio a tª ambiente, protegida del polvo y de la luz. Una vez

secos los pocillos, el contenido se fijó mediante la inmersión de las placas en

acetona a -20ºC durante 10 minutos. Después, se procedió al lavado de las

placas con agua destilada durante 10 minutos en agitación continua, se

dejaron secar a tª ambiente y se almacenaron a -20ºC hasta su utilización.

Siguiendo las indicaciones de Fernández-García y cols. (Fernández-García et

al., 2009a), se realizaron sucesivas diluciones al duplo de los sueros

problema, empezando por una dilución inicial 1:50. Se depositaron 10 μl de

cada dilución de los sueros en cada pocillo junto con un pocillo control

positivo y otro negativo por cada placa para así aumentar la fiabilidad de la

técnica. Las placas fueron incubadas a 37ºC durante 30 minutos en cámara

húmeda y posteriormente se lavaron dos veces con PBS, durante 10 minutos

cada una y en agitación. Sobre los pocillos todavía húmedos se depositó una

dilución 1/150 del anticuerpo conjugado anti-IgG bovino marcado con FITC

obtenido en oveja (AbS Serotec, Ref. AAI23F) diluido en azul de Evans al

0,2% en PBS. Las placas fueron incubadas de nuevo en cámara húmeda a

37ºC durante 30 minutos. Una vez incubadas, se lavaron de nuevo tres

Material y métodos

72

veces con PBS, y una última con agua destilada, todas ellas durante

10 minutos, en agitación y en oscuridad. Tras los lavados, las placas se

dejaron secar a tª ambiente y en oscuridad. Por último, las placas se

montaron con Fluokeep (Argene, Ref. 33-040) y se depositó encima un

cubreobjetos de 22x60 mm.

Las placas fueron observadas al microscopio de fluorescencia (Nikon Eclipse

80i) con un objetivo de 40 aumentos. Un pocillo se consideró positivo en

caso de observar un halo de fluorescencia verde completo y definido

alrededor de la membrana de, como mínimo, el 80% de los taquizoítos en

cada campo de observación (Figura 19a). En caso de observar los taquizoítos

rojos o con una fluorescencia periférica incompleta o exclusivamente apical,

el pocillo fue considerado negativo (Figura 19b). En cuanto al punto de corte,

se acordó que una titulación igual o superior a 1/100 sería considerada como

suero positivo ya que, según el estudio de Fernández-García y cols., este

título resultó ser el que mayor sensibilidad y concordancia presentaba con la

técnica de WB (Fernández-García et al., 2009a).

Figura 19: Reacción de inmunofluorescencia indirecta frente a B. besnoiti positiva (a) y

negativa (b).

-ELISA: el protocolo utilizado en nuestro estudio se basó en la técnica de

ELISA indirecto puesta a punto y desarrollada por Fernández-García y cols.

(Fernández-García et al., 2010).

Para su realización, en primer lugar fue necesaria la preparación de las

microplacas de poliestireno de 96 pocillos mediante la adición de 100 μl del

a

)

b

)

Material y métodos

73

antígeno soluble preparado anteriormente disuelto en tampón carbonato-

bicarbonato 0,1M en cada pocillo. A continuación, las placas se incubaron

durante toda la noche (18-24 horas) a 4ºC para permitir la adherencia del

antígeno a las paredes del pocillo. El exceso de antígeno no fijado fue

arrastrado al realizar tres lavados con una solución de PBS con Tween-20 al

0,05%. Para evitar posibles reacciones inespecíficas con aquellas zonas de

los pocillos que no quedaron cubiertas de antígeno, se procedió a la

incubación de la placas con una solución de PBS-Tween-20 al 0,05%

suplementada con 10% de suero fetal equino durante 2 horas a tª ambiente.

Tras varios lavados, las placas se conservaron a -80ºC hasta su utilización.

En el momento de realizar la técnica, se depositaron 100 μl de una dilución

1/100 del suero problema en cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a

37ºC. Tras realizar varios lavados, se añadieron 100 μl del conjugado, un

anticuerpo monoclonal anti-IgG₁/IgG₂ bovino marcado con peroxidasa (LSI

laboratorios), diluido 1/6000 en PBS-Tween 20 al 0,05% y se incubó a 37ºC

durante 1 hora. Finalmente, los pocillos fueron lavados de nuevo varias

veces con PBS-Tween 20 al 0,05%, se añadieron 100 μl de enzima sustrato

(Sigma, Ref. A3219) y se incubaron durante 20 minutos a tª ambiente y en

oscuridad. Pasado ese tiempo, se procedió al bloqueo de la reacción

añadiendo 100 μl de ácido oxálico 0,3M por pocillo. El sustrato, por lo

general incoloro o ligeramente coloreado, toma coloración en presencia de la

peroxidasa con una intensidad proporcional a la cantidad de anticuerpos

fijados al antígeno (Figura 20). Para su lectura, se realizó una medida de la

absorbancia como densidad óptica (DO) mediante un lector de ELISA

(Multiscan RC 6.0, Labsystems) a 405 nm. Las muestras de suero se

analizaron por duplicado y el valor medio de DO se convirtió en un porcentaje

relativo siguiendo la siguiente fórmula: % RIPC= (DO muestra-DO control

negativo)/(DO control positivo-DO control negativo) x100. El punto de corte

utilizado fue el 9%, por lo que los valores de RIPC igual o superiores al 9%

fueron considerados como positivos y los valores de RIPC inferiores a 9%

fueron considerados negativos (García-Lunar et al., 2013).

Material y métodos

74

Figura 20: Distribución de los sueros y visualización de la placa tras la realización de la

técnica de ELISA frente a B. besnoiti.

Tanto en el caso de la IFI como en el del ELISA, cada vez que se llevó a cabo

una de las técnicas se incluyó en el análisis un control positivo y un control

negativo del proceso. El control positivo empleado fue el suero procedente

de una vaca con infección crónica clínica confirmada mediante histología.

Como control negativo se utilizó el suero de un ternero sano descendiente de

una vaca seronegativa y sana.


RESULTADOS

En primer lugar, la descripción de las características de la población del

estudio se realizó mediante tablas de frecuencias relativas (expresadas en

porcentajes) en el caso de las variables cualitativas o categóricas (sexo,

raza), y mediante la media y su desviación estándar o la mediana y su rango

(en aquellos casos en los que la muestra presentaba valores extremos)

cuando las variables fueron cuantitativas (edad). Para realizar el análisis

estadístico de dos variables cualitativas, se aplicó la prueba no paramétrica

de Chi² de Pearson para tablas de contingencia de 2x2 o la prueba de razón

de verosimilitud en tablas de dimensiones mayores a 2x2. En relación a la

Material y métodos

75

comparación de medias entre distintas categorías, cuando la variable

cuantitativa fue homocedástica (prueba de homocedasticidad de Kolmogorov-

Smirnov), se aplicó la prueba paramétrica de t de Student para comparar dos

medias o el análisis de varianzas o ANOVA para comparar más de dos

medias. En el caso contrario, se utilizaron las pruebas no paramétricas

alternativas, prueba U de Mann-Whitney y prueba de Kruskal-Wallis

respectivamente. Para rechazar las hipótesis nulas planteadas se estableció

el error α en 0,050.

En segundo lugar, con el objetivo de seleccionar la técnica de diagnóstico

serológico de la besnoitiosis bovina más óptima para el posterior análisis

epidemiológico y estadístico de los datos, se realizó una breve evaluación de

las dos pruebas empleadas en este estudio. Para el cálculo de su fiabilidad

diagnóstica, se procedió a la comparación de los resultados obtenidos frente

al diagnóstico clínico como prueba de referencia mediante el cálculo de la

sensibilidad, especificidad e índice J de Youden con los datos

correspondientes al inicio del estudio (enero de 2010). Además, se

determinó el grado de concordancia entre ambas pruebas serológicas

mediante el cálculo del coeficiente kappa de Cohen, cuya interpretación se

basó en la escala propuesta por Thrusfield (Thrusfield, 2007).

Posteriormente, se analizó la correlación existente entre las titulaciones de

anticuerpos estimadas con la prueba de IFI (previa transformación a sus

correspondientes logaritmos) y los resultados de DO de la técnica de ELISA

mediante el coeficiente de correlación de Spearman.

Dentro de la epidemiología descriptiva, el análisis de la distribución y la

evolución de la infección en el rebaño se basó por un lado, en el cálculo de

medidas transversales como la seroprevalencia aparente y real en cada punto

del estudio (tres puntos en el caso de la población adulta y dos en la muestra

de terneros) y por otro, en la estimación de la Incidencia Acumulada (IA) y

Tasa de Incidencia (TI) como medidas longitudinales de la infección para los

dos periodos puerto y valle diferenciados en el trabajo (en este caso

solamente en la población adulta). Las fórmulas empleadas en los cálculos se

basaron en las descritas por Thrusfield (Thrusfield, 2007). En el caso de la

TI, puesto que en la mayor parte de los casos no se pudo conocer con

exactitud el momento en el que se produjo la infección de los animales, se

Material y métodos

76

recurrió a realizar una aproximación del análisis considerando que la infección

había tenido lugar hacia la mitad de cada periodo (es decir, a los 3,7 y 2,5

meses del inicio del periodo de puerto y valle respectivamente). Este

parámetro tiene un importante valor en nuestro estudio ya que nos permitió

estimar una tasa de incidencia de infección mensual que subsanó el

inconveniente de la diferencia de duración entre periodos (7,3 meses de

puerto frente a los 5 meses de valle). La comparación de los valores de

seroprevalencia e incidencia obtenidos para cada uno de los diferentes puntos

de muestro o periodos del estudio se realizó mediante la prueba de Chi² de

Pearson.

Todas las estimaciones se acompañaron entre paréntesis de los

correspondientes límites de su intervalo de confianza al 95%, calculados en

base a la fórmula planteada por de Blas y colaboradores (de Blas et al.,

2008).

Asimismo, se analizó la evolución de las titulaciones de anticuerpos

detectadas a lo largo del estudio en la población adulta y para las dos épocas

de nacimientos en el caso de los terneros, lo que se representó gráficamente

mediante histogramas.

Con respecto al estado clínico del rebaño adulto, la descripción de la

distribución y evolución de la enfermedad a lo largo del estudio se realizó

mediante tablas de frecuencias absolutas, donde los animales con o sin

signos clínicos de enfermedad se clasificaron en función de su estado

serológico en enero 2010, septiembre 2010 y febrero 2011.

En el caso de los terneros, se procedió también a la representación en tablas

de frecuencias absolutas de aquellos animales que resultaron seropositivos

para cada uno de los dos periodos de nacimientos, clasificados por un lado,

en función del sexo, raza y edad, y por otro, según el estado serológico de la

madre. Del mismo modo, se representaron aquellos terneros seropositivos

para las dos épocas de nacimientos en función de su estado clínico y según el

estado serológico o clínico de las madres.

Para tratar de identificar aquellas variables que pudieran estar actuando

como factores de riesgo asociados a la dinámica de la infección y a la

Material y métodos

77

aparición de casos de enfermedad, se procedió a la realización de análisis

multivariantes mediante el ajuste de modelos lineales generalizados. Estos

análisis han sido empleados en diversas ocasiones para la realización de

estudios epidemiológicos de enfermedades que se encuentran estrechamente

relacionadas con la besnoitiosis bovina como son la toxoplasmosis o la

neosporosis (Sanderson et al., 2000; Otranto et al., 2003; Schoonman et al.,

2010; Ahmad et al., 2014). El uso de este tipo de modelos permite

encontrar aquellas variables que pueden comportarse como indicadores

predictivos de la infección o de la enfermedad.

En el caso de la población adulta, en primer lugar se trató de caracterizar la

situación de partida identificando aquellos factores asociados a la prevalencia

de anticuerpos frente a B. besnoiti detectada al inicio del estudio (enero

2010). Para ello, se procedió al ajuste de un modelo de regresión logística en

el que la variable dependiente fuera la presencia, o no, de anticuerpos,

mientras que como variables predictoras de este modelo inicial se incluyeron

el sexo, la edad y la raza de los animales.

Debido a que el manejo llevado a cabo con los toros en esta explotación es

muy diferente al de las vacas, a partir de este punto se decidió excluir al

grupo de machos de los posteriores análisis del estudio seroepidemiológico.

De manera similar, y con el fin de identificar los factores de riesgo asociados

a la probabilidad de seroconvertir que presentaron los animales a lo largo del

estudio, se procedió al ajuste de un nuevo modelo de regresión logística

realizado únicamente sobre los datos de las vacas seronegativas en el que la

variable dependiente fuera la ocurrencia, o no, de seroconversión a lo largo

del estudio. Como variables predictoras en este caso, además de la raza,

edad y periodo (puerto o valle), se incluyeron dos nuevas variables

explicativas relacionadas con el riesgo de infección por contacto, a) el tiempo

en estabulación y b) el número de vacas positivas por serología con las que

cada animal había compartido alojamiento. Respecto a estas dos nuevas

variables, el tiempo en estabulación de las vacas se calculó en base al tiempo

que cada animal había permanecido estabulado en las instalaciones de la

finca, desde el inicio del estudio hasta la subida a puerto en el primer periodo

o desde la bajada de puerto hasta el final del estudio en el segundo. El

Material y métodos

78

número de vacas positivas presentes por alojamiento para cada animal se

estimó en función de los alojamientos por los que había pasado ese animal en

cada periodo, calculando la media en aquellas situaciones en las que los

animales habían cambiado de alojamiento en más de una ocasión.

Principalmente, ambas variables presentaron diferencias en función del

estado del animal (si estuvo gestante y en lactación o gestante y seco), de la

época de partos-cubriciones en la que se había incluido y de si un individuo

había entrado o salido de la explotación en una fecha diferente a la de inicio o

final del estudio.

En esta parte del estudio serológico también se realizó un análisis de

regresión logística para identificar aquellos factores asociados al desarrollo de

la enfermedad (presencia o no de signos clínicos), estudiando las variables

raza, periodo, edad y titulación de la repuesta inmunitaria (cuantificación de

la respuesta de anticuerpos) como posibles factores de riesgo. Por último, se

ajustó un modelo de regresión lineal para tratar de determinar el grado de

asociación de las variables raza, periodo, edad y presencia de signos clínicos

de besnoitiosis con la intensidad de la respuesta inmunitaria desarrollada

(cuantificada mediante la titulación de anticuerpos).

En el estudio de la población de terneros también se analizó los posibles

factores de riesgo asociados a la probabilidad de seroconvertir que había

tenido un ternero en nuestro estudio. Para ello, se realizó un análisis de

regresión logística teniendo en cuenta las variables sexo, raza, periodo de

nacimiento, tiempo de estabulación y número de vacas positivas por

alojamiento como datos relativos al ternero junto con el estado serológico y

clínico de la madre en torno al momento del parto o lactación. En esta

ocasión, el tiempo en estabulación se calculó a partir de la fecha de

nacimiento y la fecha de destete o subida a puerto del ternero, y el número

de vacas seropositivas con las que había compartido alojamiento se estimó

en base a los datos de la madre. Mediante un análisis de regresión lineal se

exploró también la posible correlación entre las respuestas inmunitarias

desarrolladas por los terneros, su edad y la intensidad de la respuesta

inmunitaria de las madres.

Material y métodos

79

En el caso de que los ajustes de modelos incluyeran alguna variable numérica

como variable predictora, se procedió a transformarla en su raíz cuadrada

para así homogeneizar las varianzas.

En todos los análisis multivariantes, los modelos finales ajustados se

obtuvieron a partir del modelo inicial tras un proceso de selección hacia atrás

por pasos. Una vez realizados los ajustes de los modelos finales, los

exponentes de los coeficientes de las ecuaciones resultantes en los modelos

fueron considerados como estimadores de riesgo ya que su interpretación es

similar a la de los Odds Ratios.

Para detectar la posible existencia de colinealidad entre las variables

predictoras retenidas en un modelo final y poder observar el efecto relativo

que tuvo una variable explicativa a nivel individual o grupos de variables

relacionadas con un efecto conjunto, se realizó un análisis de partición de las

varianzas (Borcard et al., 1992). Esto ha permitido especificar qué

porcentaje de la variación de un modelo final fue explicado por el efecto puro

de cada factor y qué proporción fue atribuible a su efecto compartido.

La representación gráfica de los resultados obtenidos en el estudio sobre la

dinámica de la infección y la aparición de casos de enfermedad se realizó

mediante gráficos de superficie, diagramas de barras o histogramas y

diagramas de Venn.

3.3.2-ESTUDIO REPRODUCTIVO


El estudio de los índices históricos del rebaño consistió por un lado, en el

registro de la fertilidad global anual de los machos desde el año 2009 hasta el

2013, calculada como el porcentaje correspondiente al número de vacas

preñadas por un animal con respecto al número total de vacas presentes en

dicho grupo de monta, y por otro, en la exploración del intervalo entre partos

(IEP) medio anual de las hembras desde el año 2000 hasta el 2013 como

parámetro indicador de su fertilidad.

Material y métodos

80

En un siguiente paso, para evaluar la posible influencia de la infección por

B. besnoiti en la eficiencia reproductiva del rebaño se procedió al estudio

comparado y en detalle de las dos épocas de cubriciones llevadas a cabo en

la explotación durante el periodo que duró el estudio: la cubrición de

primavera de 2010, en la que se realizó monta natural, y la de otoño de

2010, en la que se recurrió a la inseminación artificial (IAr) en un intento de

controlar la transmisión (Figura 21). En el caso de la IAr, se trató de que los

partos-cubriciones fueran en los mismos periodos. Para ello, se realizaron

dos tandas de IAr (días 14-dic-10 y 10-feb-11) y se procedió con el mismo

manejo de vacas lactantes y secas que si fuera monta natural.

Figura 21: Esquema con los animales involucrados en las cubriciones llevadas a cabo en la

explotación durante el estudio.

Para cada época de cubriciones se anotaron los siguientes datos o índices:

machos y hembras involucrados en cada grupo de cubrición, fertilidad de los

machos, tasa de gestación (porcentaje de vacas gestantes al final de la

cubrición estimado mediante la realización de diagnóstico de gestación) e IEP

(intervalo desde el parto de ese año al siguiente parto que tuvieron las

vacas). Del mismo modo, se realizó un registro de todos los abortos

ocurridos en la explotación durante el periodo del estudio. Tanto la fertilidad

de los machos como la tasa de gestación e IEP de las hembras son índices

reproductivos comúnmente utilizados para evaluar la eficiencia reproductiva

en el ganado bovino de carne.

Además de los parámetros reproductivos, también se pudo contar con los

datos relativos al estado serológico y clínico de estos animales con respecto a

Cubriciones año 2010

Primavera 2010

71 hembras 6 machos

Otoño 2010 (IAr)

110 hembras 8 machos

Material y métodos

81

la besnoitiosis registrados para el apartado previo de estudio

seroepidemiológico.


RESULTADOS

El análisis descriptivo de los índices reproductivos históricos del rebaño se

realizó mediante su representación gráfica en un diagrama de barras en el

caso de la fertilidad global anual de los toros y en un gráfico de puntos para

el IEP promedio anual de las vacas. Posteriormente, se describió la tasa de

gestación y la media de los IEP junto con su desviación estándar de las

hembras en función de su estado serológico y clínico para cada una de las

épocas de cubriciones a estudio. Finalmente, se procedió a la realización del

ajuste de modelos de regresión para determinar la posible influencia del

estado serológico o clínico frente a la besnoitiosis bovina sobre la fertilidad de

los machos y la tasa de gestación e IEP de las hembras. Además de estas

variables relacionadas con el estado sanitario de los animales, en el análisis

se incluyeron también los factores periodo de cubrición (monta natural/IAr) y

macho involucrado en la cubrición para así controlar su posible efecto sobre

los índices reproductivos evaluados.

3.3.3-ESTUDIO MOLECULAR


Para la valoración de la técnica de diagnóstico molecular PCR cuantitativa se

establecieron dos partes en el estudio. En primer lugar, para la detección

temprana de la fase aguda de la infección, se planearon dos puntos de

muestreo, enero 2010 y febrero 2011, en los cuales se procedió a la toma de

una muestra de sangre con anticoagulante de un 60% y un 90% de la

población adulta presente en la explotación respectivamente.

Material y métodos

82

Al coincidir los puntos de muestreo con los del estudio seroepidemiológico,

además de los datos referentes al sexo, raza y edad de los animales, también

se pudo disponer de su estado serológico y clínico frente a la besnoitiosis

tanto en enero de 2010 como en febrero de 2011.

En segundo lugar, para la confirmación de la fase crónica de la enfermedad,

se realizó un único punto de muestreo en septiembre de 2010. Previo

examen clínico de los animales, se recogió una biopsia de piel de la zona del

cuello mediante un punzón de 8 mm (Kruuse, Ref. 273693) y bajo anestesia

en 28 animales que presentaban quistes de B. besnoiti en la conjuntiva

esclerótica, indicadores de la fase crónica de la besnoitiosis bovina. Dichas

biopsias fueron enviadas al laboratorio en un Eppendorf y congeladas a

-80ºC para su posterior examen microscópico y molecular. En este caso,

también se pudo contar con los datos referentes al sexo, raza, edad, estado

serológico y estado clínico de los animales (Figura 22).

Figura 22: Esquema donde se muestra la cronología y el diseño de las dos partes en las que

se dividió el estudio molecular, fase aguda y fase crónica.

Material y métodos

83

3.3.3.2-TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR):

El uso de técnicas de diagnóstico molecular basadas en la amplificación del

ADN de B. besnoiti fue descrito por primera vez por Cortes y cols. (Cortes et

al., 2007a), y posteriormente por Schares y cols. (Schares et al., 2011). La

técnica desarrollada y puesta a punto en nuestro laboratorio se trata de una

PCR cuantitativa basada en la detección de un fragmento de la secuencia del

ITS-1 del ARN ribosómico, y se fundamenta en la descrita por Schares en

2011 aunque con algunas modificaciones que se detallan a continuación.

Para la optimización de la técnica se emplearon muestras de ADN de

taquizoítos procedentes de los cultivos de B. besnoiti descritos en el apartado

de técnicas serológicas. Una vez puesta a punto la prueba, se procedió al

análisis de las muestras de sangre y piel de los animales a estudio.

-Extracción del ADN:

En primer lugar se procedió a la extracción del ADN de las muestras. En el

caso de las muestras de taquizoítos de cultivo y de sangre, la extracción se

realizó mediante el kit comercial de MO BIO UltraClean® BloodSpin® DNA

Isolation Kit (MO BIO Laboratories, Ref. 12200-250). Siguiendo el manual de

instrucciones, 200 μl de cada muestra se incubaron junto con 10 μl de

proteinasa K y 200 μl de tampón de lisis a 65ºC durante 10 minutos. Tras

realizar tres lavados con diferentes tampones, el sedimento de ADN

resultante fue resuspendido en 200 μl de tampón de elución. En cada serie

de muestras, se incluyó un control negativo de extracción que contenía todos

los reactivos excepto la muestra de ADN para así poder detectar posibles

contaminaciones durante el proceso. En el caso de las muestras de tejido

procedentes de la piel de aquellos animales afectados clínicamente, la

extracción del ADN se realizó mediante el kit High Pure PCR Template

Preparation Kit (Roche, Ref. 11796828001), siguiendo el protocolo específico

señalado para los tejidos de mamíferos. Para ello, unos 50 mg de tejido se

incubaron junto con 200 μl de tampón de lisis y 40 μl de proteinasa K

durante 1 hora a 55ºC. Después de una segunda incubación de 10 minutos a

70ºC con un tampón de captura, se realizó una serie de lavados como en el

Material y métodos

84

caso de las muestras de sangre para finalmente obtener una solución de

200 μl con el ADN en suspensión.

-Optimización de la PCR cuantitativa:

Para el diseño de los cebadores y la sonda empleados en el desarrollo de la

técnica se recurrió al uso del programa ProbeFinder y de la biblioteca de

sondas Universal ProbeLibrary de Roche Applied Science. Las secuencias de

cebadores elegidas fueron Bb F (5’-ATTAACCAATCCGTGATAGC-3’) y Bb R

(5´-CCAACGATCTGTTGTTTAGC-3´), de 20 pares de bases cada una y

sintetizadas por IDT laboratorios. La sonda utilizada en el estudio fue la

número 10 de Roche (10 μM) (Roche, Ref. 04685091001). En base a las

condiciones óptimas de amplificación descritas por otros autores y a las

observadas en ensayos propios previos, se decidió llevar a cabo cada

reacción en un volumen final de 25 μl, usando 12,5 μl de GoTaq® Probe qPCR

Master Mix 2X (Promega, Ref. A6101/2), 100 nM de sonda, 10 μM de cada

cebador, 5 μl de muestra de ADN y agua ultrapura hasta completar el

volumen final. Como soporte de la reacción se utilizaron placas de PCR de

48 pocillos (low 48-well Clear, Bio-Rad, Ref. 012250). La amplificación de

todas las muestras se realizó por duplicado, distribuyendo en un primer

pocillo la muestra a su concentración de origen y realizando en el segundo

una dilución 1/10 de la primera.

En cada placa de reacción se incluyó por un lado, tres réplicas de un control

positivo del proceso elaborado a partir de taquizoítos de B. besnoiti

procedentes de cultivo con una cantidad de ADN equivalente a

7.5x10³ taquizoítos para confirmar la repetibilidad de la técnica y comprobar

que las condiciones de amplificación han sido las adecuadas. Por otro, se

añadió un control negativo de agua ultrapura en cada placa para corroborar

la ausencia de contaminación durante la manipulación de las muestras.

Con el objetivo de confirmar o descartar la presencia de inhibiciones en el

desarrollo de la técnica que pudieran dar lugar a resultados falsos negativos

se recurrió simultáneamente al uso de un control interno de amplificación

para cada muestra basado en una secuencia del gen que codifica para la

proteína β-actina, descrito por Robinson y cols. en 2007 como uno de los

genes bovinos de referencia más indicados para su uso como control

Material y métodos

85

endógeno de amplificación en la técnica de PCR cuantitativa (Robinson et al.,

2007).

Las reacciones se llevaron a cabo en el termociclador M iniOpticon™ System

de Bio-Rad siguiendo las siguientes condiciones: una desnaturalización inicial

a 95ºC durante 5 minutos seguida de 45 ciclos de amplificación en los cuales

las muestras fueron incubadas 15 segundos a 95ºC, 30 segundos a 55ºC,

otros 15 segundos a 72ºC y por último 5 segundos a 77ºC. Los resultados

obtenidos fueron analizados usando el programa Bio-Rad CFX Manager,

versión 1.5. Para el cálculo de la carga parasitaria de las muestras se

procedió a la cuantificación absoluta del ADN parasitario amplificado

mediante la ecuación lineal resultante de la curva estándar.

Con el fin de confirmar aquellas muestras que resultaron positivas, al mismo

tiempo se optimizó una PCR cuantitativa usando en este caso como marcador

el fluorocromo SYBER® Green. Esta vez, para llevar a cabo la reacción se

empleó: 12,5 μl GoTaq® qPCR Master Mix 2X (Promega, Ref. A6001/2),

10 μM de cada cebador (descritos previamente), 5 μl de muestra de ADN y

agua ultrapura hasta completar el volumen final de 25 μl. El protocolo de

amplificación utilizado se basó en el descrito en el párrafo anterior pero con

pequeñas modificaciones. Tras una primera desnaturalización a 95ºC

durante 5 minutos se sucedieron 50 ciclos con las siguientes etapas: 95ºC

durante 1 minuto, 60ºC otro minuto, 65ºC durante 1 minuto y por último,

75ºC durante 5 segundos. La temperatura de fusión tanto de las muestras

control positivas con taquizoítos de cultivo como de las muestras problema

fue de 78,5-79ºC. El análisis de los resultados se realizó con el mismo

programa detallado anteriormente.

-Estimación de la sensibilidad y especificidad:

La sensibilidad que presentó la técnica de PCR cuantitativa desarrollada en

este estudio para la detección de ADN de B. besnoiti se determinó mediante

la elaboración de una curva estándar a partir de diluciones logarítmicas de

una muestra de ADN de taquizoítos de concentración conocida procedente de

cultivo y previamente cuantificada mediante cámara de Neubauer. Para ello,

se realizaron seis diluciones seriadas de ADN equivalente a 75000, 7500,

750, 75, 7,5 y 0,75 taquizoítos en tampón PBS, con tres réplicas de cada

Material y métodos

86

punto. Como puede observarse en la figura 23, el límite de detección de la

técnica, equivalente a la cantidad mínima de ADN de B. besnoiti capaz de ser

detectado, fue de 0,75 parásitos.

Figura 23: Curva estándar de amplificación del ADN correspondiente a

7.5x10-¹-7.5x10⁴ taquizoítos de B. besnoiti.

La ecuación lineal resultante de la curva estándar permitió definir la eficiencia

de amplificación E=99,5%, indicando una elevada repetibilidad de la prueba,

y el coeficiente de determinación R2=0,997.

Por otro lado, para descartar la existencia de posibles inhibiciones de la

técnica de PCR en las muestras de ADN procedentes de sangre, se elaboró

una segunda curva estándar en la que las diluciones seriadas de los

taquizoítos de cultivo se hicieron directamente en sangre y se procedió a su

amplificación bajo las mismas condiciones. Los resultados obtenidos en

sangre fueron muy similares a aquellos observados previamente para el caso

de la curva estándar de taquizoítos realizada en PBS, confirmando la

capacidad de la técnica para la detección del parásito en muestras de sangre.

La especificidad analítica de la técnica se comprobó mediante el análisis de

muestras de ADN de dos parásitos del phylym Apicomplexa estrechamente

Material y métodos

87

relacionados, T. gondii y N. caninum. La ausencia de amplificación observada

confirmó la elevada especificidad de los cebadores y la sonda elegida.

Examen microscópico:

Para el examen visual directo en fresco de los quistes tisulares de B. besnoiti

presentes en la dermis y subcutis de aquellos animales en fase crónica se

recurrió al uso placas de compresión de vidrio de 28 compartimentos. Una

vez obtenidas las biopsias de piel, en primer lugar se realizaron varias

secciones de aproximadamente 1 mm de las muestras con la ayuda de una

hoja de micrótomo para posteriormente proceder a su observación al

microscopio (Nikon Eclipse 80 i) (Figura 24a y b).

Figura 24: Observación de la biopsia de piel de un animal en fase crónica de esclerodermia

mediante placa de compresión (a) al microscopio óptico (b).


RESULTADOS

Los resultados de PCR de la fase aguda se analizaron por comparación con

una aproximación teórica al número de animales infectados que cabría

encontrar en un punto de muestreo cualquiera del estudio calculado a partir

de los datos epidemiológicos disponibles y asumiendo que la tasa de

transmisión de la enfermedad (B) es constante. Esta tasa de transmisión es

un parámetro cuyo valor depende de la unidad de tiempo y que en nuestro

caso fue asumida como dos semanas, lo que aproximadamente se

corresponde con el tiempo que dura la parasitemia (Cortes et al., 2014).

a b

Material y métodos

88

La expresión más simple que refleja esta situación es:

Número de nuevas vacas infectadas por unidad de tiempo= BIS/N

donde:

B es la tasa de transmisión a estimar

I es el número total de vacas seropositivas o infectadas

S es el número total de vacas susceptibles

N es el total de la población (S+I)

Para resolver numéricamente esta fórmula se recurrió al uso del

complemento Solver de la hoja de cálculo de Microsoft Excel 2010.

En el caso de la evaluación de la PCR cuantitativa como técnica de

confirmación diagnóstica de la fase crónica, en primer lugar se procedió a la

comparación de sus resultados frente al diagnóstico clínico (prueba de

referencia), al examen microscópico de los quistes tisulares y al análisis

serológico, mediante el cálculo de la sensibilidad diagnóstica de cada una de

las técnicas. Adicionalmente, se contrastaron las diferencias existentes entre

los resultados de PCR (Ciclo umbral o Ct) de aquellos animales que

presentaron quistes tisulares observables al microscopio óptico y los que no

mediante la prueba de t de Student. Por último, se procedió al cálculo del

coeficiente de correlación de Spearman para explorar la asociación entre los

resultados de PCR (Ct) y las respuestas inmunitarias desarrolladas por los

animales. Ambos análisis se representaron gráficamente en un diagrama de

cajas y un gráfico de dispersión con línea de tendencia respectivamente.

Los resultados de PCR se acompañaron entre paréntesis de la

correspondiente carga parasitaria, expresada como el número de taquizoítos

detectados por reacción, que se calculó a partir de la ecuación de la curva

estándar. En el caso de expresar un valor medio de Ct, se utilizó la media

junto con la desviación estándar.

Material y métodos

89

Todas las tareas de recolección de muestras del estudio fueron llevadas a

cabo por el personal encargado de la finca junto con los veterinarios

responsables de la explotación siguiendo procedimientos no invasivos. Tanto

la extracción de muestras de sangre como la toma de biopsias de piel son

pruebas utilizadas comúnmente en el diagnóstico de enfermedades

infecciosas y parasitarias.

Todos los datos y los resultados de las muestras analizadas en los tres

estudios se recogieron en una hoja de cálculo Microsoft Office Excel para su

posterior análisis estadístico y epidemiológico.

RESULTADOS

Resultados

91

4-RESULTADOS

4. 1-ESTUDIO SEROEPIDEMIOLÓGICO

4.1.1-CARACTERÍSTICAS DE LA MUESTRA

La población total estudiada estuvo constituida por 276 animales de las razas

Parda de Montaña y Pirenaica. Al observar la evolución de la población entre

el primer y segundo punto de muestreo del estudio se vio que, de los

25 animales que salieron durante ese periodo (Tabla 2): 19 fueron

sacrificados por su estado clínico de enfermedad entre mayo y junio del 2010

al ser considerados como un importante foco de infección (12 hembras con

6,2 años de promedio de edad y 7 machos de 3,3 años de media, de ambas

razas), 1 hembra de 17 años y 1 macho de 1 año de la raza Parda de

Montaña se enviaron a matadero, 1 hembra Pirenaica de 10 años se encontró

muerta en el puerto a causa de la enfermedad, otra hembra Pirenaica de

16 años murió en la explotación, y por último, 1 macho Pirenaico y otro de la

raza Parda de 1 y 2 años respectivamente fueron devueltos o trasladados a

otras explotaciones. De los 29 animales que entraron como reposición

durante este periodo (con fecha de alta en la explotación abril del 2010)

(Tabla 2) encontramos 21 hembras de la raza Parda de Montaña,

20 alrededor de los 2 años de edad y 1 entorno a los 3 años, y 1 hembra

Pirenaica de 7 años. Además entraron 7 machos, 6 de los cuales fueron

terneros de 1 año de la raza Parda de Montaña (3) y Pirenaica (3), y otro fue

1 macho de 2 años de la raza Parda.

Tabla 2: Frecuencia relativa de las entradas y salidas de animales con respecto al total de la

explotación para cada punto de muestreo del estudio.

Punto del estudio Salidas Entradas n

Enero 2010 0% 0% 219

Septiembre 2010 11,4% (25) 13,2% (29) 223

Febrero 2011 24,2% (54) 12,5% (28) 197

Resultados

92

De los 54 animales que se dieron de baja entre el segundo y tercer punto de

muestreo (Tabla 2): 46 fueron sacrificados y 2 encontrados muertos a causa

de la besnoitiosis bovina (42 hembras y 4 machos de ambas razas y con una

edad promedio de 8,4 años), 2 hembras más de la raza Parda de 2 y 11 años

se sacrificaron por presentar un desgarro anal y una parada ruminal

respectivamente, otras 3 hembras fueron enviadas a matadero (1 Pirenaica

de 11 años y 2 Pardas de 3 y 8 años) y por último, 1 macho Pirenaico de

3 años fue trasladado a otra explotación. De las 28 entradas que se

produjeron durante este segundo periodo (Tabla 2), todos los animales

fueron hembras de alrededor de 1 año de edad, 10 de raza Pirenaica y 18 de

Parda de Montaña.

En relación a las características de los animales estudiados, el rebaño estuvo

compuesto por las razas Parda de Montaña (60,7%) y Pirenaica (39,3%)

(Tabla 3), con una proporción media de 91,4% de hembras y 8,6% de

machos a lo largo del estudio (Tabla 4).

Tabla 3: Composición (%) del rebaño adulto a lo largo del estudio con respecto a la raza.

Punto

del estudio

Raza (%)

Parda de Montaña Pirenaica n

Enero 2010 57,1 42,9 219

Septiembre 2010 62,3 37,7 223

Febrero 2011 62,9 37,1 197

Total 60,7% 39,3%

Tabla 4: Composición (%) del rebaño adulto a lo largo del estudio con respecto al sexo.

Punto

del estudio

Sexo (%)

Hembra Macho n

Enero 2010 90,0 10,0 219

Septiembre 2010 91,9 8,1 223

Febrero 2011 92,4 7,6 197

Total 91,4% 8,6%

Resultados

93

Tanto la distribución de la raza como el sexo se mantuvieron proporcionales a

lo largo del estudio, si bien se puede apreciar una leve disminución no

significativa de la proporción de animales de la raza Pirenaica (χ²=1,87;

gl=2; p=0,393) (Tabla 3) y de los machos (χ²=0,90; gl=2; p=0,636)

(Tabla 4) a lo largo del estudio. Además, los porcentajes de ambos sexos se

distribuyeron por igual para las dos razas incluidas en el estudio (χ²=0,16;

gl=1; p=0,687).

La edad de los animales estuvo comprendida entre 1 y 19 años, con al menos

la mitad de la población por debajo de los 5 años de edad (Figura 25).

Además, como se puede observar en la gráfica, a lo largo del estudio hubo

una disminución, si bien no significativa, de la mediana de edad de la

población en 1 año, de 5 a 4, debido a la eliminación de animales enfermos y

la reposición con individuos más jóvenes (H de Kruskal-Wallis=2,78;

p=0,249).

Figura 25: Evolución de la mediana, rango intercuartil, mínimo y máximo de la edad de los

animales a lo largo del estudio.

Resultados

94

Al estratificar la edad de la población total de animales muestreados en todo

el estudio en función del sexo se observó que los machos, con una mediana

de edad de 2 años, fueron significativamente más jóvenes que las hembras,

con una mediana de 4 años (U de Mann-Whitney=8338,50; Z=-5,89;

p<0,001) (Figura 26). No obstante, estas diferencias no fueron apreciables

al distribuir la edad en función de las razas (U de Mann-Whitney=47884,00;

Z=-0,35; p=0,722).

Figura 26: Edad (años) de los animales en estudio distribuida en función del sexo.

Respecto a las características de la muestra de terneros analizada, se

observó que la proporción de ambas razas presentaba un cambio significativo

según el periodo de nacimiento estudiado: en otoño de 2009 la mayor parte

de los animales fueron de la raza Parda de Montaña (66,3%) mientras que en

primavera de 2010 nacieron una mayoría de la raza Pirenaica (64,5%)

(χ²=13,50; gl=1; p<0,001) (Tabla 5).

0

10

20

30

40

50

60

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Nº d

e a

nim

ale

s

Machos

Hembras

Resultados

95

Tabla 5: Proporción (%) de terneros de las razas Parda de Montaña y Pirenaica nacidos en los

dos periodos incluidos en el estudio.

Periodo

de nacimiento

Raza (%)

Parda de Montaña Pirenaica n

Otoño 2009 66,3 33,7 83

Primavera 2010 35,5 64,5 62

Total 53,1% 46,9%

Mientras tanto, la proporción de cada sexo en los terneros, en torno a un

60% y 40% de hembras y machos respectivamente, se mantuvo similar en

ambos periodos de nacimientos (χ²=0,01; gl=1; p=0,906) (Tabla 6) y para

las dos razas presentes en el estudio (χ²=0,40; gl=1; p=0,529).

Tabla 6: Proporción (%) de terneros macho y hembra nacidos en los dos periodos incluidos en

el estudio.

Periodo

de nacimiento

Sexo (%)

Hembra Macho n

Otoño 2009 59,0 41,0 83

Primavera 2010 58,1 41,9 62

Total 58,6% 41,4%

Finalmente, la edad de los terneros muestreados en el momento del destete

osciló entre los 3,1 y 7,1 meses. La media de edad de los animales presentó

una marcada diferencia entre periodos (U de Mann-Whitney=154,50;

Z=-9,75; p<0,001), siendo los terneros nacidos en el periodo de otoño de

2009 significativamente más jóvenes (4,9±0,7) que los del periodo de

primavera de 2010 (6,5±0,5) en el momento del muestreo. Esta diferencia

de edad es debida al manejo llevado en la explotación donde de manera

habitual el destete de los terneros nacidos en la época de otoño es más

temprano que el de aquellos nacidos en primavera. Además, también se

encontró una leve diferencia de edad en los terneros según su raza, siendo

los de raza Parda (5,3±0,1) en torno a 15 días más jóvenes de media que los

de raza Pirenaica (5,9±0,1) (U de Mann-Whitney=1908,00; Z=-3,05;

p=0,002). En este caso, este hallazgo podría ser debido a que en el periodo

Resultados

96

de nacimientos de otoño, en el que los terneros fueron más jóvenes, hubo

una mayor proporción de animales de la raza Parda de Montaña. Estas

variaciones no se encontraron al analizar la edad de los animales según el

sexo (U de Mann-Whitney=2305,00; Z=-1,20; p=0,229).

4.1.2-ELECCIÓN DE LA TÉCNICA SEROLÓGICA ÓPTIMA

Con el objetivo de elegir la técnica de diagnóstico serológico más adecuada

entre las dos empleadas en este trabajo para la realización de los análisis

seroepidemiológicos posteriores, se procedió a la evaluación de su fiabilidad

mediante el cálculo de la Sensibilidad, Especificidad y J de Youden,

enfrentándolas al diagnóstico clínico como prueba de referencia. Esta

valoración previa se complementó con el cálculo de la concordancia y la

correlación entre ambas pruebas. Para la realización de estas estimaciones

se recurrió al análisis de los datos relativos al inicio del estudio, es decir,

enero de 2010.

A modo de recordatorio, para realizar la evaluación de ambas técnicas el

punto de corte utilizado para considerar como positivo el suero de un animal

fue una titulación de anticuerpos ≥ 1/100 en el caso de la técnica de IFI y un

valor de RIPC ≥ 9% para la prueba de ELISA.

4.1.2.1-EVALUACIÓN DE LA FIABILIDAD

Ambas técnicas presentaron similares resultados en cuanto a especificidad,

siendo un 85,1% para la IFI y un 87,2% para el ELISA (Tabla 7). En el caso

de la sensibilidad, la técnica de IFI en nuestro estudio fue muy superior

(100% de sensibilidad) en comparación con la técnica de ELISA, cuya

sensibilidad se situó en torno al 81,6%. En base a los resultados obtenidos

con respecto al índice J de Youden, la técnica de IFI fue la que presentó

mejor balance sensibilidad-especificidad.

Resultados

97

Tabla 7: Valores (%) de sensibilidad, especificidad e índice J de Youden de las técnicas de IFI

y ELISA empleadas en el estudio estimados frente al diagnóstico clínico.

IFI ELISA

Sensibilidad (%) IC95% 100 81,6 (69,3-93,9)

Especificidad (%) IC95% 85,1 (79,9-90,3) 87,2 (82,2-92,1)

J de Youden (%) IC95% 85,1 (79,9-90,3) 68,7 (55,5-82,0)

4.1.2.2-EVALUACIÓN DE LA CONCORDANCIA Y CORRELACIÓN ENTRE

LA TÉCNICAS DE IFI Y ELISA

Para estimar el grado de concordancia entre las dos técnicas se procedió al

cálculo del coeficiente de Cohen (kappa) mediante la elaboración de una tabla

de contingencia con los resultados de los 217 animales analizados por ambas

pruebas (Tabla 8).

Tabla 8: Tabla de contingencia con la frecuencia de resultados positivos y negativos obtenida

mediante las pruebas de IFI y ELISA al inicio del estudio.

Prueba ELISA

Positivo Negativo

Prueba Positivo 148 (68,2%) 5 (2,3%)

IFI Negativo 15 (6,9%) 49 (22,6%)

El análisis de los resultados reveló un coeficiente kappa de 0,77±0,09,

confirmando un grado de concordancia adecuado entre ambas técnicas

(Everitt, 1989), por lo que cualquiera de las dos parece ser apropiada para la

detección de anticuerpos frente a la infección por B. besnoiti.

Teniendo en cuenta que los resultados de ambas técnicas guardan una

concordancia adecuada entre sí, en el siguiente análisis se propuso evaluar si

las titulaciones de anticuerpos obtenidas mediante la técnica de IFI y el % de

RIPC resultante del análisis de ELISA también guardaban correlación. Para

ello, puesto que las variables a correlacionar no fueron normales (IFI: H de

Kolmogorov-Smirnov=0,44; gl=218; p<0,001; ELISA: H de Kolmogorov-

Smirnov=0,32; gl=218; p<0,001), se procedió al cálculo del coeficiente de

Resultados

98

correlación Rho de Spearman, cuyo resultado sugirió la existencia de una

correlación moderada entre los resultados de ambas pruebas (Rho=0,66;

p<0,001) (Tabla 9).

Tabla 9: Coeficiente de correlación Rho de Spearman entre el logaritmo del título de

anticuerpos de IFI y el % de RIPC de ELISA al inicio del estudio.

% RIPC ELISA

Enero 2010

Log Título IFI

Enero 2010

% RIPC ELISA

Enero 2010

Coeficiente 1 0,66

Sig. (bilateral) 0,000

n 217 217

Log Título IFI

Enero 2010

Coeficiente 0,66 1

Sig. (bilateral) 0,000

n 217 217

Basándonos en los resultados de fiabilidad, concordancia y correlación

observados en este primer apartado para las dos técnicas diagnósticas

utilizadas, se decidió seleccionar la técnica de IFI como herramienta para el

posterior análisis seroepidemiológico del rebaño.

4.1.3-ESTUDIO DE LA POBLACIÓN ADULTA


ENFERMEDAD: MEDIDAS TRANSVERSALES Y LONGITUDINALES

La proporción global de animales del rebaño que presentó anticuerpos frente

a la besnoitiosis bovina a lo largo del estudio fue del 38,34% (34,53-42,07).

Los resultados muestran que los mayores valores de seroprevalencia se

presentaron justo a la bajada de puerto en septiembre de 2010,

detectándose anticuerpos frente a B. besnoiti en un 51,57% de los animales

(Tabla 10). Esta seroprevalencia mostró diferencias significativas con

respecto las estimaciones calculadas al inicio y al final del estudio, es decir,

Resultados

99

en enero de 2010 (χ²=97,20; gl=4; p<0,001) y febrero de 2011

respectivamente (χ²=37,40; gl=4; p<0,001), situándose la seroprevalencia

en ambos momentos en torno al 30% de animales seropositivos. Con

respecto a la seroprevalencia real, calculada en base a los resultados de

sensibilidad y especificidad de la técnica de IFI, los valores resultantes fueron

menores que los descritos para la seroprevalencia aparente, mientras que las

proporciones observadas para cada punto de muestreo mantuvieron similares

las diferencias entre sí.

Tabla 10: Medida transversal de la infección: distribución de la seroprevalencia (%) aparente

y real en los tres puntos de muestreo establecidos en el estudio.

Punto del

estudio n Positivo

Seroprevalencia

aparente (PA) (%)

IC95%

Seroprevalencia

real (PR) (%)

IC95%

Enero

2010 219 65 29,68 (23,65-35,75) 17,39 (12,38-22,42)

Septiembre

2010 223 115 51,57(44,94-58,06)* 43,14 (36,60-49,60)

Febrero

2011 197 65 32,99 (26,43-39,57) 21,29 (15,58-27,02)

Total 639 245 38,34 (34,53-42,07) 27,54 (24,04-30,96)

p <0,001*

*Significación según la prueba de Chi² de Pearson

Para conocer la proporción de animales sanos al inicio del estudio que se

infectó a lo largo del tiempo se procedió al cálculo de medidas longitudinales

de la infección tales como la incidencia acumulada (IA) y la tasa de incidencia

(TI) para los periodos puerto y valle. Si se observa la IA estimada para cada

uno de los periodos se aprecia que ésta fue significativamente mayor para el

primer periodo (puerto) que para el segundo (valle), detectándose un

34,77% y 24,59% de nuevos infectados respectivamente (Tabla 11)

(χ²=128,90; gl=2; p<0,001). Sin embargo, si se compara la TI de ambos

periodos, en la que se incluye un componente temporal correspondiente al

periodo de tiempo en el que cada individuo fue susceptible de infectarse, se

observa que el número de nuevos infectados por animal-mes fue 0,058 para

el periodo de puerto y 0,061 para el periodo de valle (Tabla 11), lo que indica

unas TI muy similares en ambos periodos.

Resultados

100

Tabla 11: Incidencia acumulada (IA) (% de nuevos casos entre la población susceptible) y

tasa de incidencia (TI) (nuevos infectados por animal-mes) para los periodos de puerto y valle.

Periodo del estudio IA TI

Puerto 34,57 0,058

Valle 24,59 0,061

p <0,001*


Al analizar los títulos de anticuerpos de aquellos animales que resultaron

seropositivos se ha podido apreciar que éstos mostraron una disminución

significativa a lo largo del estudio (LR χ²=52,17; df=14; p<0,001). Tanto

para enero 2010 como para septiembre 2010, el resultado 1/400 fue la

titulación más frecuente, y el rango de las titulaciones observadas varió

desde la dilución 1/100 hasta la 1/6400 (Figura 27). Sin embargo, en

febrero 2011, es decir, al final del estudio, los títulos de anticuerpos

detectados oscilaron de 1/100 a 1/1600, siendo la dilución 1/200 la más

frecuente.

Figura 27: Distribución de los títulos de anticuerpos estimados mediante la técnica de IFI a lo

largo del estudio.

0

5

10

15

20

25

30

35

100 200 400 800 1600 3200 6400

Nº d

e a

nim

ale

s

Enero 2010

Septiembre 2010

Febrero 2011

Resultados

101

En relación a la variación de la prevalencia de animales con signos clínicos y

la distribución de la enfermedad en la población a lo largo del tiempo, el

porcentaje de animales con desarrollo clínico de la enfermedad tanto en

enero como en septiembre de 2010 se situó en torno al 17-19% del rebaño

(Tabla 11). No obstante, debido a la eliminación progresiva de aquellos

animales que se mostraron afectados clínicamente llevada a cabo en la

explotación principalmente durante el segundo periodo en un intento de

control del brote, este porcentaje de animales con signos clínicos se redujo

drásticamente al final del estudio (LR χ²=50,95; df=4; p<0,001) (Tabla 12).

Tabla 12: Frecuencia de aparición y prevalencia (%) de animales con signos clínicos de

besnoitiosis en el rebaño a lo largo del estudio.

En este estudio también se ha podido apreciar que al inicio, todos los

animales con signos clínicos resultaron positivos por serología, mientras que

en septiembre 2010 y febrero 2011 se encontró un porcentaje de animales,

11,36% (5/44) y 66,66% (2/3) respectivamente, con signos clínicos de

enfermedad pero seronegativos.


ESTUDIO

La identificación de los posibles factores de riesgo asociados a la prevalencia

de anticuerpos frente a B. besnoiti al inicio del estudio se realizó mediante el

ajuste de modelos de regresión incluyendo en el modelo inicial las variables

raza, sexo y edad de los animales. En el modelo final obtenido, con el que

tan sólo se consiguió explicar un 2,18% de variación, únicamente quedó

Estado

serológico

Enero 2010 Septiembre 2010 Febrero 2011

Con

signos

Sin

signos

Con

signos

Sin

signos

Con

signos

Sin

signos

Seropositivo 38

(17,35%)

27

(12,33%)

39

(17,49%)

76

(34,08%)

1

(0,51%)

64

(32,49%)

Seronegativo 0 154

(70,32%)

5

(2,24%)

101

(45,29%)

2

(1,01%)

130

(65,99%)

Total 38

(17,35%)

181

(82,65%)

44

(19,73%)

177

(79,37%)

3

(1,52%)

194

(98,48%)

Resultados

102

retenida como variable predictora la raza, indicando que en el momento de

iniciar el estudio, en enero de 2010, el riesgo de presentar un resultado

seropositivo fue 1,43 veces superior en los individuos de raza Pirenaica que

en los de raza Parda de Montaña (Tabla 13).

Tabla 13: Modelo final ajustado para las variables asociadas a la prevalencia de anticuerpos

detectada al inicio del estudio (enero 2010).

Variable Coeficiente EE Estadístico Wald Significación

Constante -0,837 0,150 31,16 <0,001

Raza (Pirenaica) 0,360 0,150 5,77 0,016

Devianza explicada por el modelo: 2,18%

4.1.3.3. ANÁLISIS DE LA DINÁMICA DE LA INFECCIÓN Y LA

APARICIÓN DE CASOS DE ENFERMEDAD

-Análisis de la seroconversión del rebaño:

En primer lugar se realizó un análisis de los posibles factores de riesgo

involucrados en la probabilidad de seroconvertir que presentaron las vacas a

lo largo del estudio. Las variables predictoras incluidas en el modelo inicial

fueron: raza y edad de los animales, periodo del estudio (puerto o valle),

número de vacas seropositivas con las que habían compartido alojamiento,

tiempo de permanencia en estabulación y finalmente, la interacción entre

estas dos últimas variables. En base a estos factores se observó que en el

ajuste global del modelo final obtenido, con un 6,9% de variación explicada,

las variables retenidas fueron el periodo, el número de animales

serológicamente positivos con los que había compartido alojamiento una vaca

durante el periodo de estabulación y su interacción con el tiempo de

estabulación (Tabla 14).

Resultados

103

Tabla 14: Modelo final ajustado para los factores de riesgo asociados a la probabilidad de

seroconversión que tuvo un animal a lo largo del estudio.

Variable Coeficiente EE Estadístico

Wald Significación

Constante -1,411 0,588 5,75 0,016

Periodo (puerto) 0,530 0,260 4,16 0,041

Raíz nº vacas positivas -1,125 0,492 5,23 0,022

Raíz tiempo estabulación*

raíz nº vacas positivas 0,229 0,104 8,22 0,004


El coeficiente de regresión obtenido para la variable periodo muestra que el

riesgo asociado a la probabilidad de seroconvertir fue 1,7 veces mayor en el

periodo de puerto que durante el de valle (Tabla 14).

Con respecto a las variables relacionadas con una posible transmisión de la

enfermedad por contacto, si se considera de forma independiente la variable

número de vacas seropositivas con las que se había compartido alojamiento

puede apreciarse que el riego de seroconvertir de un animal estuvo

inversamente relacionado con dicha variable. No obstante, en el modelo final

obtenido puede observarse que esta variable estuvo condicionada por el

tiempo de estabulación, cuya interacción sí que presentó un efecto conjunto

directamente relacionado con la probabilidad de seroconvertir que tuvo un

animal.

Si se observan los gráficos donde se representa la probabilidad de

seroconvertir que tuvieron los animales en función del tiempo que habían

pasado estabulados y del número de vacas seropositivas con las que habían

convivido para cada uno de los periodos del estudio se puede ver que en

ambos casos, aunque más claramente en el periodo de valle, esta

probabilidad aumentó proporcionalmente con el tiempo de estabulación y con

el número de vacas seropositivas con las que un animal había compartido

alojamiento (Figura 28 y 29).

Resultados

104

Fig

ura 2

8:

Grá

fico de superf

icie

con la

pro

babilid

ad de sero

convers

ión de un anim

al

(Y)

en fu

nció

n del

núm

ero

de vacas

sero

positiv

as p

resente

s e

n los a

loja

mie

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s c

om

part

idos (

X)

y e

l tiem

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e e

sta

bula

ció

n (

Z)

para

el periodo de p

uerto

.

Resultados

105

F Fig

ura 2

9:

Grá

fico de superf

icie

con la

pro

babilid

ad de sero

convers

ión de un anim

al (Y

) en f

unció

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X)

y e

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e e

sta

bula

ció

n (

Z)

para

el periodo de v

alle.

Resultados

106

Al realizar un análisis de partición de la varianza del modelo final para

considerar por separado el efecto puro con el que había contribuido por un

lado, el periodo y por el otro, el conjunto de variables relacionadas con el

riesgo de infección por contacto (número de vacas seropositivas presentes en

el alojamiento y tiempo de estabulación), se observa que los factores que

contribuyeron con más fuerza a explicar la probabilidad de seroconvertir que

presentó un animal fueron aquellos relacionados con una posible transmisión

por contacto, mostrando un efecto puro del 4,96%, seguidos por el periodo

(1,49%) (Figura 30).

Además, al estimar estas particiones se observa que la intersección entre las

variables que conforman el modelo presentó signo negativo, lo cual es

indicativo de la existencia de un efecto supresivo entre sí (Figura 29), es

decir, el efecto de dichas variables de forma conjunta se potencia en

presencia de ambas (Friedman et al., 2005).

Figura 30: Diagrama de Venn representativo de la partición de la varianza del modelo

ajustado para la probabilidad de seroconversión.

-Análisis de la presencia de signos clínicos en el rebaño:

Sobre la población de hembras que resultaron seropositivas al inicio o que

seroconvirtieron a lo largo del estudio se realizó un ajuste de modelos de

regresión para determinar los posibles factores de riesgo asociados a la

probabilidad de desarrollar signos clínicos de enfermedad que habían

presentado dichas vacas. El modelo inicial incluyó las variables periodo, raza,

5,41%

1,94%

-0,45%

Devianza total del modelo: 6,9%

Variables

relacionadas

con el contacto

Periodo

Resultados

107

edad, log del título de anticuerpos de IFI, código de seroconversión asignado

a cada animal (0=no seroconvirtió, 1=seroconvirtió y 2=seropositiva desde el

inicio) y por último, la interacción del periodo con el código de

seroconversión. El ajuste global del modelo mostró que la probabilidad de

que un animal desarrollara signos clínicos en nuestro estudio estuvo

relacionada con el periodo, con su edad, con su título de anticuerpos y con la

interacción del periodo con el código de seroconverisón (Tabla 15). En este

caso, la combinación de estos cuatro factores permitió explicar un 32,5% de

variación.

Tabla 15: Modelo final ajustado para los factores de riesgo asociados a la probabilidad de

desarrollar signos clínicos que tuvo un animal seropositivo a lo largo del estudio.


Wald Significación

Constante -8,799 1,835 22,99 <0,001

Periodo (puerto) 1,159 0,533 4,72 0,030

Edad 1,259 0,351 12,89 <0,001

Log Título IFI 1,478 0,504 8,61 0,003

Periodo*código

seroconversión (1) 0,672 0,243 7,64 0,006


Según se puede observar en el modelo final, aquellos animales que

seroconvirtieron (código de seroconversión 1) durante el periodo de puerto

fueron los que presentaron un riesgo mayor de desarrollar signos clínicos de

enfermedad. Además, este riesgo también aumentó con la edad de los

animales. Finalmente, el modelo muestra que las respuestas inmunitarias

más intensas estuvieron directamente relacionadas con la presencia de

signos clínicos.

En este caso, al aplicar el análisis de partición de la varianza se aprecia que

las variables que contribuyeron con más fuerza en el modelo fueron el efecto

conjunto del periodo y su interacción con el código de seroconversión de los

animales en primer lugar (11,6%), seguido muy próximo por el efecto puro

de la edad en segundo lugar (9,4%) y por último, las titulaciones de

anticuerpos (6%). El resto de variación explicada por el modelo se debió a

un efecto solapado de los tres grupos de variables (Figura 31).

Resultados

108


ajustado para el riesgo de desarrollar signos clínicos.

Al separar el análisis por periodos y centrarse en aquellos animales que

seroconvirtieron durante el periodo de puerto, ya que en el segundo periodo

de valle la mayoría de los animales afectados clínicamente habían sido

eliminados, se puede observar que la media de edad de los animales que

presentaron signos de besnoitiosis bovina fue de 7,7±4,1 años y resultó

significativamente mayor respecto a los 4,3±2,7 años de los animales que no

presentaron signos (t de Student=-3,36; df=44; p=0,020) (Figura 32).

7,2%

10,6% 11,6%

-1,2% 6,7%

5,5%

Periodo e interacción

Log título

IFI

Edad


3,3%

Resultados

109

Figura 32: Edad (años) de los animales que seroconvirtieron en el periodo de puerto

distribuida en función del desarrollo o no de signos clínicos de besnoitiosis bovina.

-Análisis de la intensidad de la respuesta inmunitaria desarrollada:

De nuevo sobre la población de hembras seropositivas se realizó un ajuste de

modelos, en este caso de regresión lineal, para identificar si alguno de los

factores presentes en el estudio pudo estar asociado con la intensidad de la

respuesta inmunitaria desarrollada por los animales (cuantificada mediante la

titulación de anticuerpos con la técnica de IFI). En el modelo inicial se

incluyeron las variables periodo, raza, edad, presencia de signos, código de

seroconversión y su interacción con el periodo. Los resultados de modelo

final, que permitió explicar un 11,71% de variación, indicaron que la

intensidad de las respuestas inmunitarias estuvo directamente relacionada

con la presencia de signos clínicos de enfermedad, así como con la raza de

las vacas (Tabla 16).

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1 2 3 5 6 7 8 9 10 11 12 13 18

Nº d

e a

nim

ale

s

Sin signos

Con signos

Resultados

110

Tabla 16: Modelo final ajustado para los factores de riesgo asociados a la intensidad de la

respuesta inmunitaria desarrollada por los animales seropositivos a los largo del estudio.

Variable Coeficiente EE t Significación

Constante 2,684 0,044 60,69 <0,001

Presencia de signos (positivo) 0,171 0,043 3,97 <0,001

Raza (Parda) -0.068 0,038 -1,77 0,078

Varianza explicada (R²) por el modelo: 11,71%

Según el modelo, aquellas vacas con signos clínicos de besnoitiosis

presentaron las respuestas inmunitarias más intensas. Además, la raza

también tuvo un efecto, si bien no significativo, en el modelo, siendo las

vacas de raza Parda de Montaña las que mostraron títulos de anticuerpos

más bajos con respecto a los de las vacas de raza Pirenaica.

Una vez aplicado el análisis de partición de la varianza se puede observar que

la variable que contribuyó principalmente al modelo fue la presencia de

signos (9,89%), seguida de lejos por el efecto puro de la variable raza

(2,6%) (Figura 33).


ajustado para la intensidad de la respuesta inmunitaria desarrollada.

Nuevamente, el conjunto de variables que forman el modelo de riesgo de la

respuesta inmunitaria desarrollada por las vacas se relacionó de manera

10,76%

3,47%

-0,87%

Variación total (R²) del modelo: 11,71%

Presencia

de signos

clínicos

Raza

Resultados

111

supresora, explicando un mayor porcentaje del modelo de forma conjunta

que por separado (Figura 33).

En la siguiente gráfica se puede comprobar cómo las titulaciones de

anticuerpos desarrolladas por las vacas seropositivas que presentaron algún

signo de enfermedad, con una dilución 1/800 como título más abundante,

fueron significativamente mayores que las de aquellas asintomáticas, cuya

dilución más frecuente fue 1/100 (LR χ² =17,58; df=6; p=0,007).

Figura 34: Títulos de anticuerpos desarrollados por los animales seropositivos a lo largo del

estudio distribuidos en función de la presencia o no de signos clínicos de besnoitiosis bovina.

4.1.4-ESTUDIO DE LA DESCENDENCIA


MEDIDAS TRANSVERSALES

Además del estudio de la población adulta, se procedió al análisis de los

terneros nacidos en la explotación durante las dos épocas de nacimientos

incluidas en el estudio, otoño de 2009 y primavera de 2010.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

100 200 400 800 1600 3200 6400

Nº d

e a

nim

ale

s

Sin signos

Con signos

Resultados

112

La seroprevalencia global detectada en los terneros fue del 15,17%

(9,36-21,04). Al observar la seroprevalencia detectada según la época de

nacimientos se puede apreciar que la proporción correspondiente a la primera

época (otoño de 2010) fue del 7,23% de los animales, y mostró diferencias

significativas con respecto a la seroprevalencia observada en la época

siguiente (primavera 2010), que se situó en torno al 25,81% (χ²=9,43;

gl=1; p=0,002) (Tabla 17). En relación a la seroprevalencia real observada,

los valores estimados resultaron inferiores a los descritos para la

seroprevalencia aparente, no obstante las variaciones encontradas entre las

dos épocas de nacimiento se mantuvieron semejantes.

Tabla 17: Seroprevalencia (%) aparente y real en terneros para las dos épocas de

nacimientos incluidas en el estudio.

Periodo de

nacimiento n Positivo

Seroprevalencia

aparente (PA) (%)

IC95%

Seroprevalencia

real (PR) (%)

IC95%

Otoño 2009 83 6 7,23 (1,64-12,76) 0

Primavera 2010 62 16 25,81 (14,91-36,69)* 12,83 (4,48-21,12)

Total 145 22 15,17 (9,36-21,04) 0,320 (0-1,19)

p 0,002*


En relación a las características de los animales seropositivos, para el periodo

de nacimientos de otoño 2009, la mayoría de los terneros fueron machos y

de raza Parda de Montaña. Sin embargo, para el segundo periodo de

nacimientos, la mayor parte fueron hembras y de raza Pirenaica. Si se tiene

en cuenta su edad en el momento del análisis, aquellos animales nacidos en

otoño tenían 5,2±0,6 meses y los de primavera eran algo mayores, con

6,5±0,5 meses de edad (Tabla 18). Cabe destacar por tanto que todos los

terneros nacidos en otoño de 2009 que resultaron seropositivos eran

menores de 6 meses, incluso se observó que el ternero seropositivo más

joven no pasaba de los 4 meses de edad.

Resultados

113

Tabla 18: Características (sexo, raza y edad) de los terneros seropositivos en otoño de 2009 y

primavera de 2010.

Periodo

nacimiento

Sexo (%)

Macho Hembra

Raza (%)

Pirenaica Parda

Edad

(Media±DE)

Total

Otoño

2009

4

(66,66%)

2

(33,33%)

2

(33,33%)

4

(66,66%)

5,2±0,6 6

Primavera

2010

4

(25%)

12

(75%)

12

(75%)

4

(25%)

6,5±0,5 16

Por otro lado, si se observa el estado serológico de las madres de los terneros

incluidos en el estudio se aprecia que un 50% (11/22) de los terneros

seropositivos descendieron de madres seropositivas (χ²=9,47; gl=1;

p=0,002) (Tabla 19). Este porcentaje fue similar aun separando los

resultados por periodos, siendo un 66,6% (4/6) para los terneros nacidos en

el periodo de otoño 2009 y un 43,8% (7/16) en los nacidos en primavera de

2010. No obstante, es importante matizar que aparte de esta concordancia

encontrada entre la serología de las madres y sus terneros, en el estudio

también se detectaron tanto terneros seropositivos descendientes de madres

negativas como vacas seropositivas que dieron lugar a una descendencia

totalmente sana.

Tabla 19: Frecuencia de aparición y prevalencia (%) de anticuerpos frente a B. besnoiti en los

terneros para los dos periodos de nacimientos del estudio en función de la serología de sus

madres.

Estado

serológico

madre

Terneros periodo

otoño 2009

Terneros periodo

primavera 2010

Seropositivo Seronegativo Seropositivo Seronegativo Total

Seropositiva 4

(66,6%)

14

(18,2%)

7

(43,8%)

10

(21,7%)

35

Seronegativa 2

(33,3)

63

(81,8%)

9

(56,2%)

36*

(78,3%)

110

Total 6 77 16 46 145

*En este grupo hay 2 terneros procedentes de un parto gemelar.

En relación a la prevalencia de enfermedad, tras el examen clínico de los

terneros se encontraron quistes en la esclera conjuntival compatibles con

B. besnoiti en 3 de los 16 animales seropositivos nacidos en el periodo de

primavera de 2010. Se trataba de 2 hembras, 1 Parda de Montaña y otra

Resultados

114

Pirenaica, y 1 macho Pirenaico. Sus edades entorno a la fecha del análisis

fueron de 6,5, 6,2 y 5,2 meses respectivamente. En la tabla 20 se puede

observar que todos los terneros que presentaron quistes en la conjuntiva

esclerótica fueron descendientes de madres seropositivas en el momento del

parto y con presencia de signos clínicos de besnoitiosis bovina durante la

lactación.

Tabla 20: Frecuencia de aparición y prevalencia (%) de signos clínicos de besnoitiosis en

terneros para los dos periodos de nacimientos del estudio en función del estado serológico y

clínico de las madres.

Estado

serológico/

clínico

madre

Terneros periodo

otoño 2009

Terneros periodo

primavera 2010

Con

signos clínicos

Sin

signos clínicos

Con

signos clínicos

Sin

signos clínicos

Total

Seropositiva/con

signos clínicos

0

(0%)

18/15

(21,7/18,1%)

3/3

(100%)

14/5

(23,7/8,5%)

35/23

Seronegativa/sin

signos clínicos

0

(0%)

65/68

(78,3/81,9%)

0

(0%)

45/54*

(76,3/91,5%)

110/122

Total 0 83 3 59 145

*En este grupo hay 2 terneros procedentes de un parto gemelar.

Por último, al profundizar en la respuesta inmunitaria desarrollada por los

terneros que resultaron seropositivos, se aprecia que las titulaciones para el

periodo de nacimientos de otoño 2009 oscilaron de 1/100 a 1/400, siendo la

dilución 1/100 la más frecuente, si bien para aquellos nacidos en primavera

2010 el rango de titulaciones fue superior y varió de 1/200 a 1/1600, con el

título 1/200 como el más frecuente (LR χ²=10,35; df=4; p=0,035)

(Figura 35).

Resultados

115

Figura 35: Titulación de anticuerpos de los terneros seropositivos distribuida según su periodo

de nacimiento.

4.1.4.2-ANÁLISIS DE LA DINÁMICA DE LA INFECCIÓN Y LA


Una vez conocida la prevalencia de infección y de enfermedad de los terneros

del rebaño a lo largo del estudio se planteó un análisis sobre los factores de

riesgo que podrían estar asociados a la probabilidad de seroconvertir, a la

intensidad de la respuesta inmunitaria y al riesgo de desarrollar signos

clínicos que presentaron estos animales.

-Análisis de la seroconversión de los terneros:

En esta ocasión, como variables a estudiar en el modelo inicial se incluyeron

la raza del ternero, el tiempo de estabulación, el número de vacas

seropositivas con las que había compartido alojamiento, la interacción del

tiempo con el número de vacas seropositivas y el resultado serológico de la

madre frente a la infección por B. besnoiti en torno al momento del parto

(para los terneros nacidos en primavera 2010) o de la lactación (para los

terneros nacidos en otoño 2009). Puesto que en el rebaño de los terneros el

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

100 200 400 800 1600 3200

Nº d

e a

nim

ale

s

Otoño 2009

Primavera 2010

Resultados

116

manejo de los machos y las hembras en la explotación es el mismo, en este

caso se incluyó también la variable sexo. Además, en lugar de la variable

edad se decidió incluir en su lugar el periodo de nacimiento del ternero por

estar muy relacionadas, si bien la variable periodo aporta una mayor

información, y por último, la interacción de éste con el resultado serológico

de la madre.

Tabla 21: Modelo final de regresión ajustado para la probabilidad de seroconversión que

tuvieron los terneros en el estudio.


Wald Significación

Constante -1,572 0,266 34,77 <0,001

Serología madre (positiva) 0,708 0,253 7,83 0,005

Periodo nacimiento

(primavera 2010) 0,747 0,265 7,97 0,005


Según se observa en el modelo final, que permitió explicar un 14,0% de

variación, el riesgo de seroconvertir que tuvo un ternero en nuestro estudio

estuvo principalmente asociado a la serología de la madre y a su periodo de

nacimiento (Tabla 21). La probabilidad de seroconvertir que tuvieron los

terneros nacidos en primavera de 2010, los cuales durante los meses de

verano subieron a los pastos de puerto, fue 2,11 mayor que la de aquellos

nacidos en el periodo anterior (otoño de 2009). Además, los terneros hijos

de madres seropositivas presentaron el doble de riesgo de seroconvertir que

los descendientes de madres negativas.

Resultados

117


ajustado para la probabilidad de seroconversión de los terneros.

Al aplicar el análisis de partición de la varianza se puede apreciar que la

variación de la probabilidad de seroconvertir de un ternero estuvo

principalmente asociada con el efecto puro de su periodo de nacimiento

(8,17%) y la serología de la madre contribuyó en segundo lugar aunque con

un efecto muy similar (7,79%). De nuevo en este caso, el conjunto de las

dos variables que componen el modelo interaccionaron como variables

supresoras, explicando un mayor porcentaje del modelo de forma conjunta

que por separado (Figura 36).

Por otro lado, se comparó el posible papel predominante de las madres

seropositivas afectadas clínicamente de besnoitiosis bovina frente a las

seropositivas subclínicas en relación a la transmisión de la infección a sus

terneros. Para ello, se llevó a cabo un proceso similar al anterior pero

centrado en los terneros descendientes de madres seropositivas. En el

modelo inicial se incluyeron las variables raza y sexo del ternero, tiempo de

estabulación, número de vacas seropositivas con las que había compartido

alojamiento, interacción del tiempo con el número de vacas seropositivas, el

periodo y como nueva variable, el estado clínico de la madre y su interacción

con el periodo. Tras realizar el análisis no se obtuvo ningún modelo ajustado,

lo que parece indicar que el desarrollo de signos clínicos por parte de las

9,19%

8,81%

-1,02%


Periodo de nacimiento

Serología de la madre

Resultados

118

madres no contribuyó a la probabilidad de seroconvertir que tuvieron los

terneros.

-Análisis de la presencia de signos clínicos:

En este caso, no se pudo llevar a cabo una exploración detallada de los

posibles factores de riesgo asociados a la enfermedad desarrollada por los

terneros puesto que el número de animales con signos clínicos compatibles

con besnoitiosis bovina encontrado en el estudio fue muy reducido, además

de que algunas de las variables incluidas en este análisis eran recurrentes.


Con el objetivo de conocer un poco más acerca de los factores asociados a la

dinámica de la infección en los terneros se realizó un último análisis de la

respuesta inmunitaria desarrollada por aquellos animales que resultaron

seropositivos. En este caso, se planteó un modelo inicial de regresión lineal

en el que se incluyó la edad de los terneros y la respuesta inmunitaria de sus

madres como variables predictoras de la respuesta inmunitaria desarrollada,

sin embargo, no fue posible ajustar ningún modelo.

4.2-ESTUDIO REPRODUCTIVO


DEL REBAÑO

En primer lugar, se procedió al estudio de los datos relativos a los IEP medios

anuales de las vacas en época reproductiva presentes en el rebaño durante el

periodo 2000-2013. Debido a que en el año 2005 se produjeron en la

explotación una serie de cambios técnicos que afectaron a los partos y las

cubriciones de las vacas, se decidió excluir del análisis los datos

correspondientes a ese año. Según la información registrada, la media del

IEP medio anual de los años 2000-2013 es de 447 días, mientras que en el

año 2010, época en la que el brote de besnoitiosis bovina estaba en plena

transmisión, se aprecia un alargamiento del IEP, es decir, el tiempo medio

entre el parto de ese año y el siguiente parto de las vacas parece mayor,

Resultados

119

pasando incluso de los 500 días (Figura 37). No obstante, si se considera la

curva de IEP medios en conjunto, observando su evolución año tras año,

parece que ésta presenta variaciones de manera frecuente a lo largo del

tiempo.

Año 2000 2001 2002 2003 2004 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 Media

IEP 458 432 401 438 478 464 456 442 421 527 460 428 406 447

n 102 130 152 128 153 117 105 105 144 122 123 138 107 125

Figura 37: IEP medio anual de las vacas durante el periodo 2000-2013.

En cuanto a la fertilidad de los machos, en la figura 38 se pueden observar

las fertilidades globales por cubrición desde el año 2009 hasta el 2013, a

excepción de las fertilidades correspondientes a las IAr de otoño de 2010 y

primavera de 2011. En este caso, se aprecia que en la cubrición por monta

natural incluida en el periodo de estudio (primavera de 2010), la fertilidad de

los machos no pasó del 60%, si bien también se observa cierta variación de

los porcentajes de fertilidad de los toros a lo largo del tiempo.

0

100

200

300

400

500

600

2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013

IEP

m

ed

io

Resultados

120

Figura 38: Fertilidad (%) global de los machos de la explotación durante el periodo

2009-2013.

Además de los IEP y la fertilidad, en el estudio reproductivo se recogió

también información relacionada con los abortos ocurridos en la explotación

durante el periodo que duró el estudio. En base a esta información se

comprobó que enero del año 2010 se detectaron 4 abortos, cuando la

gestación de las vacas estaba a término. El correspondiente análisis de las

muestras (pulmón de los fetos y placenta de las vacas) identificó al patógeno

Leptospira interrogans como agente causal de los abortos.


EFICIENCIA REPRODUCTIVA DEL REBAÑO


HEMBRAS

El estudio se centró en evaluar y comparar los índices tasa de gestación e IEP

según el estado serológico y clínico de las vacas para las dos épocas de

Primavera

2009

Otoño

2009Primavera

2010

Otoño

2011Primavera

2012

Otoño

2012

Primavera

2013

Otoño

2013

Fertilidad (%) 82,0 79,0 60,0 70,0 67,0 69,0 58,0 91,0

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

100,0

Resultados

121

cubriciones llevadas a cabo en la explotación durante el periodo del estudio:

primavera 2010, realizada con monta natural, y otoño 2010, mediante IAr.

-Análisis de la tasa de gestación:

Al explorar el número de vacas que quedaron gestantes o vacías tras cada

uno de los periodos de cubrición estudiados se observa que en la cubrición de

primavera de 2010, época en la que se realizó monta natural y el brote

estaba más activo, un 53,5% (38/71) de las vacas quedaron vacías, frente a

un 19,1% (21/110) en el caso de la cubrición realizada en otoño de 2010

mediante IAr (χ²=42,17; gl=2; p<0,001*) (Figura 39).

Figura 39: Tasa de gestación (%) para las dos cubriciones a estudio.

Si se considera en detalle el estado serológico y clínico de estas hembras

previo a las cubriciones, del total de vacas que quedaron vacías (59), un

52,5% estaban infectadas de manera subclínica y un 3,4% presentaban

signos clínicos, siendo para el caso de las vacas gestantes (122) un 54,9% de

hembras seropositivas y un 1,6% con signos clínicos. No obstante, estas

diferencias no fueron significativas (Tabla 22) (Estado serológico: χ²=0,07;

gl=2; p=0,967; estado clínico: χ²=2,07; gl=4; p=0,724).

46,5%

80,9%

*53,3% *19,1% 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Primavera 2010 Otoño 2010

Nº d

e a

nim

ale

s

Gestante

Vacía

Resultados

122

Tabla 22: Frecuencia y prevalencia (%) de vacas gestantes y vacías en función de su estado

serológico y clínico frente a la besnoitiosis bovina para las dos épocas de cubriciones

estudiadas.

Estado

serológico/

clínico

Cubrición primavera 2010 Cubrición otoño 2010 (IAr)

Gestante Vacía Gestante Vacía

Seropositiva /

Con signos

14/2

(42,4/6,1)% 17/2

(44,7/5,2)% 53/0

(59,5/0)% 14/0

(66,6/0)% Seronegativa/

Sin signos

19/31

(57,6/93,9)% 21/36

(55,3/94,8)% 36/89

(40,5/100)% 7/21

(33,3/100)%

Total 33 (46,5%) 38 (53,5%) 89 (80,9%) 21 (19,1%)

Para intentar identificar aquellos posibles factores de riesgo que estuvieron

relacionados con la probabilidad de que una hembra quedara gestante o no

tras el periodo de cubrición se procedió a realizar un ajuste de modelos de

regresión. Como variables predictoras en el modelo inicial se incluyeron el

macho involucrado en la cubrición, el periodo de cubrición (monta natural en

primavera 2010 frente a IAr en otoño 2010), el estado serológico y el estado

clínico de la hembra previo a la cubrición. Sin embargo, no fue posible

ajustar ningún modelo final en base a estas variables que explicara las

variaciones observadas en la tasa de gestación durante el estudio.

-Análisis de los IEP:

El IEP medio de las vacas fue muy similar para las dos épocas de cubriciones

a estudio, 530,8 días en la cubrición de primavera 2010 y 523,4 días en la de

otoño 2010 (t de Student=0,28; df=173; p=0,781). Si se analizan los

valores medios de IEP teniendo en cuenta el estado serológico de las

hembras se observa que las vacas que resultaron seropositivas mostraron un

IEP ligeramente superior que el observado para aquellas hembras

seronegativas, 539,2 y 513,1 días respectivamente, si bien estas diferencias

no fueron significativas (t de Student=-0,96; df=168; p=0,336) (Tabla 23).

Resultados

123

Tabla 23: Media del IEP en las dos cubriciones a estudio clasificado en función del estado

serológico de las hembras frente a la besnoitiosis bovina.

Estado

serológico

IEP medio±DE

Primavera 2010 Otoño 2010 (IAr) Media 2010±DE

Seropositiva 525±209,2 543,8±163,8 539,2±183,3

Seronegativa 536,6±179,9 490,9±148,1 513,1±164,9

Total 530,8±194,1 523,4±159,3 526,5±174,4

Al comparar los IEP medios de las vacas que presentaron signos clínicos

frente a las que no (Tabla 24) se aprecia que las hembras con desarrollo

clínico de la enfermedad presentaron un IEP medio inferior al de las hembras

sanas, 505 frente a 525,6 días, aunque esta disminución tampoco fue

significativa, (t de Student=0,26; df=171; p=0,796).

Tabla 24: Media del IEP en las dos cubriciones a estudio clasificado en función del estado

clínico de las hembras frente a la besnoitiosis bovina.

Estado

clínico

IEP medio±DE

Primavera 2010 Otoño 2010 (IAr) Media 2010±DE

Con signos clínicos 466,7±153,4 0 505±133,7

Sin signos clínicos 534,5±196,9 523,36±159,3 525,6±176,2

Total 530,8±194,1 523,36±159,3 526,5±174,4

Por último, al plantear un análisis multivariante mediante ajustes de modelos

de regresión para valorar la posible influencia conjunta de los factores

periodo de cubrición, macho involucrado en la cubrición, estado serológico y

estado clínico de la hembra previo a la cubrición no se consiguió encontrar

ningún modelo que explicara la variación observada en los valores de IEP de

las vacas a estudio.

Resultados

124


MACHOS

Para la evaluación del impacto que el brote de besnoitiosis bovina tuvo sobre

la fertilidad de los machos el estudio se centró en la cubrición llevada a cabo

mediante monta natural, es decir, la correspondiente a primavera de 2010.

Sin embargo, este análisis no pudo llevarse a cabo ya que todo el grupo de

machos involucrados en esta cubrición seroconvirtió durante el primer

periodo del estudio y en consecuencia, no se pudo comparar su fertilidad

frente a la de toros sanos para esa misma cubrición (Tabla 25).

Tabla 25: Fertilidad (%), estado serológico y clínico de los toros antes y después de la

cubrición de primavera de 2010 realizada mediante monta natural.

Nº macho

Fertilidad (%)

Serología pre-cubrición

Cínica pre-cubrición

Serología post-cubrición

Clínica post-cubrición

0080 44 Negativo Negativo Positivo Positivo

5723 92 Negativo Negativo Positivo Negativo

6244 50 Negativo Negativo Positivo Positivo



A pesar de esa limitación, en la tabla se puede apreciar que dos de los tres

toros que mostraron una fertilidad ≤50%, presentaron a su vez signos

clínicos de besnoitiosis bovina (Tabla 25).

4.3-ESTUDIO MOLECULAR

Una vez realizada la puesta a punto y optimización de la PCR cuantitativa, se

procedió a la valoración de su utilidad como técnica de diagnóstico de la


Resultados

125

4.3.1-DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LA FASE AGUDA

La proporción de casos esperados en la fase aguda de besnoitiosis bovina

estimada en función de los cálculos teóricos descritos en el apartado de

material y métodos se situó en torno al 1,32% del rebaño en enero de 2010

y 1,4% para el segundo punto de muestreo correspondiente a febrero de

2011 (Tabla 26).

Tabla 26: Estimación del porcentaje esperado de animales en fase aguda de parasitemia para

los dos puntos de muestreo establecidos.

Punto del

estudio

Nº vacas infectadas

esperado n

Proporción de animales

infectados esperada (%)

Enero 2010 3 226 1,32

Febrero 2011 2,8 199 1,4

Media 2,9 212,5 1,36

En relación a los resultados obtenidos mediante la PCR cuantitativa en

muestras de sangre para enero de 2010 se observa que, de los 131 animales

analizados, se obtuvieron dos resultados positivos, 36,91 y 33,16 Ct, lo que

supone un 1,5% de prevalencia de detección de ADN del parásito en sangre.

Este valor parece estar en concordancia con las estimaciones de la proporción

esperada de animales infectados en fase aguda calculada anteriormente. En

cuanto a las características de los animales positivos, éstos fueron 1 hembra

seropositiva afectada clínicamente y 1 macho seronegativo sin signos, ambos

de raza Pirenaica y con una edad de 5 y 3 años respectivamente (Tabla 27).

Tabla 27: Características de los animales que resultaron positivos mediante la técnica de PCR

cuantitativa en el muestreo de enero de 2010.

Sexo Raza Edad

(años)

Resultado

IFI Signos clínicos

Resultado Ct

qPCR

Hembra Pirenaica 5 Positivo Alteraciones

cutáneas 36,91 (1,44)

Macho Pirenaica 3 Negativo Negativo 33,16 (13,79)

Resultados

126

Respecto al muestro del año siguiente, en febrero de 2011, se detectó ADN

del parásito en 5 de los 180 animales muestreados, lo que supone una

prevalencia de B. besnoiti en sangre del 2,7%. Éstos animales positivos

mostraron un resultado de Ct medio de 33,77±2,61, equivalente al ADN de

9,55 parásitos por reacción. Con respecto a sus características, todos ellos

fueron hembras, 1 de raza Pirenaica y 4 de Parda de Montaña, entre 2 y 10

años de edad, 3 de ellas seropositivas subclínicas y 2 seronegativas sin

signos clínicos (Tabla 28).

Tabla 28: Características de los animales que resultaron positivos mediante la técnica de PCR

cuantitativa en el muestreo de febrero de 2011.

Sexo Raza Edad

(años)

Resultado

IFI

Signos

clínicos

Resultado Ct

qPCR

Hembra Parda de Montaña 4 Positivo Negativo 35,25 (3,91)



Hembra Parda de Montaña 2 Negativo Negativo 30,7 (88,97)

Hembra Pirenaica 2 Negativo Negativo 36,68 (1,65)

4.3.2-DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LA FASE CRÓNICA

En este último apartado se procedió a la evaluación de la técnica de PCR

cuantitativa para el diagnóstico de confirmación de la fase crónica en biopsias

de piel procedentes de animales con signos clínicos de besnoitiosis bovina.

En la siguiente tabla se presenta una comparativa de los resultados obtenidos

mediante la PCR cuantitativa, el examen microscópico de las muestras de piel

y el análisis serológico, todo ello frente al diagnóstico clínico. Los resultados

muestran que de los 28 animales estudiados, todos ellos presentaron ADN de

B. besnoiti en las muestras de piel, con una Ct media de 25,51±4,58

(18,46-34,71), lo que equivale al ADN de cerca de 1400 parásitos por

reacción. Sin embargo, cuando esas mismas muestras fueron analizadas al

microscopio óptico, sólo un 25 % (7/28) presentaron quistes tisulares visibles

mediante placas de compresión. Por último, al comparar con el diagnóstico

Resultados

127

serológico, un 92,8% (26/28) de las muestras resultaron seropositivas

mediante la técnica de IFI.

Tabla 29: Comparación del diagnóstico molecular (PCR cuantitativa), microscópico y

serológico de la besnoitiosis bovina frente al diagnóstico clínico.

Diagnóstico

clínico

PCR

cuantitativa

Examen

microscópico

Resultado

IFI

Nº animales

positivos/total 28/28 28/28 7/28 26/28

Sensibilidad

(%) IC95% 100 100

25

(9,0-41,0)

92,8

(83,3-102,4)

Según los resultados se puede apreciar que la técnica más sensible para la

confirmación diagnóstica de la fase crónica de la enfermedad fue la PCR

cuantitativa de biopsia de piel, presentando una sensibilidad incluso mayor

que las técnicas serológicas.

En cuanto al análisis estadístico de los resultados, en primer lugar se

comprobó que el resultado de PCR (Ct) de las muestras de piel de aquellos

animales que presentaron quistes tisulares observables al microscopio óptico

fue significativamente inferior con respecto a los que no mostraron quistes

visibles por microscopía, 19,79 y 27,39 Ct respectivamente (t de

Student=4,47; df=26; p<0,001) (Figura 40). Es decir, aquellos animales con

quistes tisulares observables al microscopio óptico fueron los que presentaron

las mayores cargas parasitarias en piel. Estas diferencias en las cargas

parasitarias no se observaron con respecto al estado serológico de los

animales (t de Student=-0,08; df=25; p=0,940).

Por último, al contrastar los resultados de PCR con los títulos de anticuerpos

obtenidos mediante la prueba de IFI se demostró una correlación negativa

moderada entre el resultado de Ct en piel y el logaritmo de las titulaciones de

anticuerpos de estos animales (Rho=0,54; p=0,004) (Figura 41). Aquellos

animales con mayores cargas parasitarias en la piel presentaron a su vez las

respuestas inmunitarias más intensas.

Resultados

128

Figura 40: Valor medio del resultado de PCR (Ct) en biopsia de piel en función de la presencia

o no de quistes tisulares observables al microscopio óptico.

Figura 41: Correlación entre el resultado de Ct en piel y las titulaciones de anticuerpos

estimadas por IFI.

12

17

22

27

32

37

1,500 2,000 2,500 3,000 3,500 4,000

Re

su

lta

do

C

t p

iel

Log título anticuerpos IFI

Rho=0,54

27,38 ±3,72

19,79 ±4,36

Explicación del modelo (Rho²): 28,7%

DISCUSIÓN

Discusión

129

5-DISCUSIÓN

En la actualidad, no se dispone de un tratamiento contra la besnoitiosis capaz

de eliminar el parásito en los bóvidos afectados ni de una profilaxis vacunal

que permita proteger a los rebaños y así frenar su expansión. En este

sentido, las medidas de control de la enfermedad deberán ir encaminadas a

minimizar, incluso si es posible interrumpir, su transmisión. En el presente

trabajo se ha planteado un estudio en profundidad sobre la infección por

B. besnoiti mediante la descripción y el análisis de un brote presente en una

explotación extensiva de montaña que permitiera deducir una serie de

medidas de control de la transmisión más precisas. Para ello ha sido

necesario contar con un conocimiento sobre la epidemiología de la

enfermedad lo más detallado posible además de evaluar nuevas herramientas

de diagnóstico que permitan una detección temprana de la infección. Por

otro lado, al tratarse de una enfermedad con una importante repercusión

económica en los rebaños, en este mismo trabajo se ha tratado de

determinar la posible influencia de la infección por B. besnoiti en la eficiencia

reproductiva del rebaño a estudio.

En este punto convendría comentar que el trabajo reflejado en esta memoria

se trata de un estudio epidemiológico de campo con las ventajas e

inconvenientes que eso conlleva. Este tipo de trabajos permiten observar y

conocer la distribución, frecuencia y tendencia natural de las enfermedades

además de identificar las posibles causas o factores de riesgo asociados, si

bien, al no tratarse de un estudio experimental, la existencia de posibles

sesgos o factores de confusión puede estar presente.

Discusión

130

5.1-ESTUDIO SEROEPIDEMIOLÓGICO

5.1.1-ELECCIÓN DE LA TÉCNICA SEROLÓGICA ÓPTIMA

Al calcular la sensibilidad y especificidad de las técnicas serológicas

empleadas en nuestro estudio frente al diagnóstico clínico se ha comprobado

que tanto la prueba de IFI como el ELISA presentaron una especificidad

similar (85,1% y 87,2% respectivamente), sin embargo, la sensibilidad de la

IFI fue muy superior (100% frente al 81,6%). Estos valores de especificidad

observados para las dos pruebas difieren ligeramente con respecto a los

resultados alcanzados por García-Lunar y cols. en un estudio inter-laboratorial

en el que se comparan diversas técnicas serológicas frente a un panel de

sueros de referencia definido en función del resultado obtenido por la

mayoría de las pruebas junto con la presencia de signos clínicos compatibles

con la besnoitosis bovina. En este trabajo, la mayor parte de las pruebas

serológicas evaluadas mostraron una especificidad por encima del 90%

(García-Lunar et al., 2013). Respecto a la técnica de IFI, varios autores

señalan en la bibliografía la posibilidad de aumentar su especificidad, y en

consecuencia disminuir el riesgo de falsos positivos, en detrimento de la

sensibilidad incrementando el punto de corte de la dilución 1/100 a la 1/200

(Zacarias, 2009; Schares et al., 2010). No obstante, esta menor

especificidad encontrada en nuestro estudio para ambas técnicas serológicas

podría ser debida a que, al establecer el diagnóstico clínico como prueba de

referencia, aquellos animales sin signos clínicos de enfermedad pero

serológicamente positivos no se correspondan realmente con falsos positivos

sino más bien con animales infectados de manera subclínica, que en el caso

de la besnoitiosis bovina son bastante frecuentes. Por otro lado, la menor

sensibilidad registrada en este trabajo para la técnica de ELISA se debe a que

ésta no logró detectar 7 de los 38 animales que presentaban signos clínicos

de besnoitiosis al inicio del estudio. A pesar de estas divergencias en

términos de sensibilidad, ambas técnicas presentaron un grado de

concordancia adecuado en nuestro estudio (coeficiente kappa de 0,77±0,09)

(Everitt, 1989).

Discusión

131

El propósito intrínseco de este trabajo ha sido la detección de la infección

para el posterior estudio de su dinámica poblacional. El Manual de la OIE

sobre animales terrestres de 2014 sugiere que las características de la

técnica idónea para este tipo de trabajos de cribado serológico deben ser una

alta sensibilidad diagnóstica (DSe) asociada a una baja especificidad

diagnóstica (DSp). A pesar de que la técnica de ELISA parece ser más

sencilla de realizar y más apropiada para procesar una gran cantidad de

muestras, según los resultados obtenidos en este estudio, la técnica de IFI

fue la que mejor se ajustó a los requisitos necesarios para una prueba de

cribado donde el interés va dirigido sobre todo a identificar el mayor número

posible de animales infectados. Además, la técnica de IFI ha sido

considerada históricamente como la prueba serológica de referencia para la

detección de la infección por B. besnoiti (Shkap et al., 2002).

En contraposición, Shkap y cols. señalaban en su trabajo que a una dilución

de los sueros 1/64 o inferior, la técnica de IFI puede presentar reacciones

cruzadas entre los anticuerpos de N. caninum y el antígeno de B. besnoti

(Shkap et al., 2002). Sin embargo, Cortes y cols. apuntan que si se realiza

con experiencia y habilidad es una de las técnicas más fiables para el

diagnóstico de la besnoitiosis bovina ya que no presenta reacciones cruzadas

con N. caninum o T. gondii y viceversa (Cortes et al., 2014). Esta misma

observación ha sido realizada en el laboratorio de la Escuela Veterinaria de

Toulouse donde, con un punto de corte 1/200, la IFI presentó una

concordancia casi perfecta con la técnica de WB además de no mostrar

durante su puesta a punto reacciones cruzadas con los patógenos

mencionados (Lenfant et al., 2013).

Con respecto a nuestro trabajo, en paralelo al diagnóstico serológico de la

besnoitiosis, al inicio del estudio se procedió a la detección de anticuerpos

frente a N. caninum mediante la técnica de ELISA. De todo el rebaño adulto

analizado, tan sólo se encontraron cinco animales seropositivos. Estos cinco

individuos mostraron a su vez coinfección con B. besnoiti, presentando

incluso dos de ellos signos clínicos de enfermedad. Además, todos sus títulos

se situaron por encima de la dilución 1/400. Todo ello parece indicar que en

este caso tampoco se ha observado la existencia de reacciones cruzadas.

Discusión

132

Finalmente, puesto que ambas técnicas serológicas mostraron un grado de

concordancia adecuado, siendo la IFI la prueba que mejor balance

sensibilidad-especificidad presentó, se decidió seleccionar la técnica de IFI

para el posterior análisis epidemiológico de los resultados.

5.1.2-ESTUDIO DE LA POBLACIÓN ADULTA


ENFERMEDAD: MEDIDAS TRANSVERSALES Y LONGITUDINALES

Al analizar cómo se distribuyó temporalmente la infección en los tres puntos

del estudio mediante el cálculo de la prevalencia aparente y real como

medidas transversales se ha podido observar que, en todos los casos, los

resultados de prevalencia aparente se situaron un 10% de media (8,43-

12,30) por encima de los valores de seroprevalencia real. Esta disminución

de la seroprevalencia real probablemente sea debida a los valores de

especificidad presentados por la técnica diagnóstica empleada.

Al centrarnos en la seroprevalencia individual del rebaño se puede apreciar

que los valores totales se situaron en torno al 38,34% en el caso de la

seroprevalencia aparente y al 27,54% en la seroprevalencia real. Estos datos

se encuentran dentro de los márgenes descritos por la mayoría de los

trabajos realizados en otras áreas endémicas, no obstante, el rango de

variabilidad de los resultados publicados es bastante amplio. Si se tienen en

cuenta los resultados obtenidos mediante la técnica de IFI en áreas

tradicionalmente endémicas de besnoitiosis bovina como Israel y Sudáfrica,

la seroprevalencia observada alcanzaba entre un 50-60% de animales

seropositivos en ambos países (Neuman, 1972; Janitschke, 1984). Sin

embargo, estos resultados no son totalmente comparables con estudios

posteriores ya que los autores usaban como punto de corte diluciones

notablemente inferiores (1/16 y 1/20 respectivamente). Con respecto a

Europa, los resultados de seroprevalencia encontrados en países endémicos

como Portugal y Francia oscilan en función del rebaño estudiado del 0,7 al

72,5% y del 18 al 70% de animales positivos respectivamente (Waap et al.,

Discusión

133

2014; Fouquet, 2009;). En otras zonas endémicas localizadas al sur de

Italia, los resultados se sitúan en torno al 44,1% de seroprevalencia

individual (Rinaldi et al., 2012). En relación a España, un estudio realizado

en 2009 por Zacarías reveló una seroprevalencia del 48,6% mediante la

técnica de IFI en un área endémica de la comunidad foral de Navarra

(Zacarías, 2009). Más recientemente, la prevalencia registrada en la zona de

Huesca, provincia donde se localiza la explotación a estudio, varía entre el

15,1 y el 95,7% según el rebaño (Gutiérrez-Expósito et al., 2014).

Con independencia de la seroprevalencia considerada, ya sea aparente o real,

se han encontrado diferencias significativas entre las seroprevalencias

observadas en los diferentes puntos de muestreo del estudio. Los mayores

valores se presentaron en septiembre de 2010 (51,57%), coincidiendo con la

bajada de puerto de los animales. Al considerar las IA como medidas

longitudinales de la infección, en este caso también se ha podido observar

que estas diferencias fueron similares para los dos periodos en los que se

dividió el estudio, ya que la IA estimada para el periodo de puerto (34,57%)

fue significativamente superior a la IA del segundo periodo de valle

(24,59%). Tanto el aumento de seroprevalencia registrado en septiembre de

2010 como el mayor valor de IA detectado para el periodo de puerto parecen

indicar una posible estacionalidad de la infección con un aumento de los

casos en los meses de verano, hecho que ha sido reflejado en la bibliografía

en diversas ocasiones (Fernandez-García et al., 2010; Jacquiet et al., 2010;

Alzieu et al., 2011). Varios autores apuntan además que este aumento de la

seroprevalencia ligado a los meses de verano podría deberse por un lado, al

aumento de la actividad de las poblaciones de insectos vectores durante esos

meses y por otro, a la mezcla de ganado procedente de distintas

explotaciones en la época estival para el aprovechamiento de los pastos de

puerto. Esta hipótesis no puede ser confirmada con nuestro trabajo debido a

que al calcular las TI mensuales para cada periodo, en las que ya se tuvo en

cuenta tanto el periodo de tiempo en el que cada individuo fue susceptible de

infectarse como la diferencia de duración entre los periodos (7,3 meses de

puerto frente a los 5 meses de valle), se observó que los valores de las TI

fueron muy similares para ambos, lo que más bien parece indicar una

aparición de nuevos casos uniforme a lo largo del estudio. Sin embargo, para

Discusión

134

reforzar este resultado sería conveniente poder establecer con exactitud el

periodo de tiempo con el que cada nuevo infectado contribuye en el estudio,

ya que en este caso, al no conocerse ese dato, tuvo que asumirse que las

infecciones se habían producido hacia la mitad de los periodos.

Los títulos de anticuerpos detectados en los animales seropositivos también

variaron según el punto de muestreo. Estas variaciones observadas en la

intensidad de las respuestas inmunitarias podrían estar indicando la

existencia de animales en distintas fases de la infección. Por otro lado, a lo

largo del estudio se ha encontrado una disminución de los títulos de

anticuerpos de la dilución 1/200 a la 1/100. Esta disminución ocurrió entre el

segundo y tercer punto del estudio y podría estar relacionada con la

eliminación de los animales con signos clínicos de enfermedad y por

extensión, con la presencia de una mayoría animales seropositivos

subclínicos.

En relación a la presencia de animales afectados clínicamente en la

explotación, el porcentaje de individuos con desarrollo clínico de la

enfermedad se situó en torno al 17-19% del rebaño en enero y septiembre

de 2010 respectivamente. Estos resultados son notablemente inferiores a los

publicados recientemente por Gutiérrez-Expósito y cols. en un área endémica

próxima de Navarra donde la media de animales con signos clínicos fue del

62% (Gutiérrez-Expósito et al., en prensa). Por otro lado, también se ha

podido apreciar que al final del estudio (febrero de 2011), el número de

animales afectados clínicamente se redujo al 1,52% a causa de la eliminación

progresiva de estos individuos llevada a cabo en la explotación

principalmente durante el segundo periodo en un intento de control de la

enfermedad. Sin embargo, a pesar de esta marcada disminución de los

animales sintomáticos, si se tiene en cuenta la seroprevalencia detectada al

final del estudio, se puede inferir que la infección continuó transmitiéndose

eficazmente dentro del rebaño gracias a una mayoría de animales

seropositivos con infección subclínica. En este mismo sentido, varios autores

han expresado en sus trabajos la idea de que algunos animales seropositivos

sin signos clínicos visibles (denominados habitualmente como casos

subclínicos) pueden presentar esporádicamente en la piel cargas parasitarias

muy bajas contribuyendo así a la propagación del parásito (Frey et al., 2013;

Discusión

135

Gollnick et al., 2015). Hay que considerar por tanto que los animales

subclínicos, además de ser en muchas ocasiones la vía de entrada del

parásito a zonas indemnes, también parecen jugar un papel importante en la

transmisión del parásito dentro de un mismo rebaño. En consecuencia,

parece recomendable establecer medidas a este respecto con el fin de

minimizar la transmisión de la infección en los rebaños.

Jacquiet y cols. han demostrado que es posible reducir completamente la

prevalencia en las explotaciones de áreas emergentes mediante la

eliminación de todos los animales seropositivos (Jacquiet et al., 2012). No

obstante, en un trabajo realizado por Gollnick y cols. se expone que una

distancia de 20 m entre animales infectados y sanos parece ser suficiente

como medida de control para evitar la transmisión de la enfermedad (Gollnick

et al., 2015).

En este estudio se ha podido observar también que la mayor parte de

animales con signos clínicos de besnoitiosis presentó a su vez anticuerpos

frente a la infección. Aun así cabe señalar que tanto en septiembre de 2010

como en febrero de 2011 se detectó un porcentaje de animales afectados

clínicamente pero seronegativos. Profundizando en el historial de estos

animales se ha encontrado que, de los cinco animales seronegativos con

signos clínicos observados en septiembre, todos ellos resultaron

seronegativos asintomáticos al inicio del estudio (enero de 2010), y de los

dos individuos detectados en febrero, ambos fueron seropositivos e incluso

uno de ellos ya era sintomático en el muestreo anterior. Una posible

explicación a este hallazgo podría ser la inmunotolerancia al parásito o la

recuperación serológica de estos animales, si bien la información al respecto

es muy escasa.


ESTUDIO

Como punto de partida se planteó un ajuste de modelos de regresión para

identificar si aquellas características inherentes al hospedador como son la

raza, el sexo y la edad podían estar actuando como factores de riesgo

Discusión

136

asociados a la prevalencia de anticuerpos frente a B. besnoiti detectada al

inicio del estudio. A partir del modelo resultante se comprobó que ni la edad

ni el sexo parecían haber influido en la prevalencia de partida del estudio, sin

embargo, la probabilidad de presentar un resultado seropositivo fue mayor

para las vacas de raza Pirenaica que para las de raza Parda de Montaña.

Este resultado podría estar relacionado con la hipótesis sobre el origen del

brote. Según información facilitada por los responsables de la finca, la

principal sospecha sobre el posible inicio del brote fue la introducción en el

rebaño durante el invierno del año 2008-2009 de seis vacas de la raza

Pirenaica con fines de mejora genética, entre 4 y 6 años de edad,

procedentes de una explotación próxima y presumiblemente infectadas.

Todas ellas resultaron seropositivas al inicio del estudio además de presentar

quistes en la conjuntiva ocular, incluso cuatro de ellas mostraron a su vez

alteraciones cutáneas. Debido al manejo reproductivo llevado en la

explotación, donde los lotes de animales se organizan en función de la raza,

el contacto del grupo de vacas pirenaicas con estas seis vacas infectadas fue

mayor, lo que explicaría esta situación de partida encontrada al inicio del

estudio.



-Análisis de la seroconversión del rebaño:

Según el modelo resultante en relación al riesgo de seroconvertir que

tuvieron las vacas en el estudio se ha comprobado que la probabilidad de

seroconversión frente a la infección por B. besnoiti de un animal estuvo

principalmente relacionada con el número de animales serológicamente

positivos con los que había compartido alojamiento durante el periodo de

estabulación, así como con la duración de éste, confirmando la importancia

de la transmisión horizontal como una de las principales rutas de difusión de

la enfermedad. Los resultados obtenidos en estos análisis indican que cuanto

mayor fue la densidad de vacas seropositivas con las que convivió un animal

y mayor fue la duración de su estabulación con ellas, mayor fue la

probabilidad que tuvo de infectarse. Esto sugiere que la transmisión de la

Discusión

137

enfermedad en un rebaño es más eficaz cuando los animales cohabitan en

estrecho contacto durante periodos de tiempo prolongados, es decir, cuando

los animales se alojan en la explotación y las medidas de manejo se vuelven

más intensivas. Cabe suponer por tanto que la transmisión de la enfermedad

en el rebaño estudiado tuvo lugar principalmente durante los meses de las

cubriciones en los que los animales convivieron en estrecho contacto en lotes

durante varias semanas en las instalaciones de la explotación. Este hallazgo

parece complementarse con los resultados observados por Garrido y cols. en

su estudio sobre la seroprevalencia de besnoitiosis bovina en Cataluña en el

que se detectó un mayor riesgo de infección en aquellos animales que no

habían salido a pastar fuera de las explotaciones (Garrido et al., 2015).

En un experimento de cohabitabilidad llevado a cabo en Alemania donde se

alojaron seis animales sanos junto con tres afectados clínicamente de

besnoitiosis bovina se demostró que, tras 12 semanas de tiempo, tres de los

animales sanos resultaron infectados y dos de ellos presentaron incluso la

forma clínica de la enfermedad, confirmando que el contacto estrecho entre

animales juega un papel importante en la transmisión de la enfermedad

(Gollnick et al., 2015).

Bigalke ya demostró en el año 1968 la transmisión mecánica de la

enfermedad por contacto directo al inocular fases quísticas del parásito

(bradizoítos) en los ollares de una vaca logrando una infección clínica, lo que

hizo sospechar de la capacidad de los quistes del parásito para atravesar las

mucosas (Bigalke, 1968). Una hipótesis más reciente sugerida en la

bibliografía, aunque especulativa, es la transmisión del parásito por contacto

directo entre mucosas a través del lamido: un animal infectado crónicamente

con numerosos quistes en la conjuntiva ocular puede presentar asimismo

quistes en otras superficies mucosas y podría transmitir bradizoítos liberados

mecánicamente a otro animal a través de la mucosa oral (Cortes et al.,

2014).

Por otra parte, en este análisis de los factores de riesgo asociados a la

probabilidad de seroconvertir que tuvieron los animales también se ha

observado que los animales en el periodo de puerto presentaron casi 2 veces

más de riesgo de seroconvertir que en el periodo de valle. Esto lleva a

Discusión

138

pensar que dentro de este periodo de puerto tal vez hubo otros factores que

no se lograron controlar que pudieron favorecer la transmisión de la

enfermedad. Podrían considerarse como factores de este tipo la realización

de las cubriciones (ya que la mayor parte de las épocas de cubriciones se

concentraron en este periodo), el empleo de la monta natural frente a la IAr

utilizada en el periodo de valle, la mayor presencia de animales con signos

clínicos, la subida de los animales a pastos de puerto de 2 a 4 meses, el

aumento de la actividad de los vectores durante esa época o simplemente la

mayor duración del periodo de puerto con respecto al de valle. La similitud

de las magnitudes de TI obtenidas para ambos periodos parecen sugerir que

quizás haya sido este último factor el que más ha determinado esta

diferencia encontrada entre la probabilidad de seroconvertir de ambos

periodos.

Otro hallazgo importante a tener en cuenta, consecuencia de este análisis, es

la aparentemente ausencia de relación entre la raza y la edad de los animales

y el riesgo de seroconvertir que éstos presentaron a lo largo del estudio.

Dicho de otro modo, la probabilidad de que un animal seroconvirtiera frente a

la infección fue independiente de su raza y edad. Estos resultados confirman

observaciones previas hechas por otros autores quienes apuntan que todas

las razas bovinas parecen ser susceptibles de infectarse por igual ya que la

infección ha sido descrita en una amplia variedad de razas (Álvarez-García et

al., 2014; Álvarez-García et al., 2014b). En relación a la edad, los resultados

sugieren que la edad de los animales no fue un factor de riesgo. Este hecho

se encuentra en desacuerdo con gran parte de los trabajos realizados al

respecto en los que se describe un aumento de la prevalencia con la edad

(Álvarez-García et al., 2014; Álvarez-García et al., 2014b; Gutiérrez-Expósito

et al., 2014; Waap et al., 2014). No obstante, es importante señalar que en

este estudio se ha analizado la probabilidad que presentó un animal sano de

seroconvertir en un periodo de tiempo determinado en función de su edad,

mientras que en el resto de trabajos se describe la prevalencia observada

según la edad, pudiendo existir en esos resultados un efecto acumulativo del

tiempo. De hecho, la mayoría de sus autores coinciden en que ese aumento

de la seroprevalencia encontrado en los animales de mayor edad podría ser

Discusión

139

debido más bien a sucesivas exposiciones acumuladas al parásito a causa de

la edad.

-Análisis de la presencia de signos clínicos en el rebaño:

Resultado del análisis multivariante sobre los posibles factores de riesgo

asociados al hecho de que un animal seropositivo hubiera desarrollado signos

clínicos de enfermedad se ha encontrado que este riesgo fue mayor para

aquellas vacas que seroconvirtieron durante el periodo de puerto, además de

que este aumentó con la edad de los animales. Según este análisis, la raza

tampoco parece haber estado involucrada en el desarrollo clínico de la

besnoitiosis. Aquellos animales que seroconvirtieron y mostraron signos

clínicos de enfermedad en el periodo de puerto fueron de media 3 años

mayores que los que no desarrollaron clínica. Relacionado con lo expuesto

en el apartado anterior, varios autores sugieren que, además de un aumento

de la prevalencia con la edad, los animales de mayor edad suelen resultar

más a menudo afectados de forma clínica (Fernández-García et al., 2010;

Álvarez-García et al., 2014b). Liénard y cols. describen en un estudio

longitudinal realizado en una explotación bovina de leche en Francia que sólo

aquellos animales mayores de 4 años mostraron signos clínicos de

besnoitiosis (quistes en la conjuntiva esclerótica) (Liénard et al., 2011).

Las causas de que un animal infectado desarrolle o no la fase clínica crónica

de la enfermedad continúan siendo poco conocidas en la actualidad. En el

presente trabajo se ha podido comprobar que la edad parece tener un

importante papel a este respecto. Esto podría explicarse por un lado, por la

existencia de diferencias fisiológicas en los animales debidas a la edad, como

por ejemplo aspectos relacionados con el sistema inmunitario, y por otro, por

las características asociadas al comportamiento de los animales según la

edad que pudieran predisponer hacia unas vías u otras de transmisión, y en

consecuencia, recibir diferentes dosis infectantes o exposiciones al parásito.


El principal factor de riesgo relacionado con la intensidad de la respuesta

inmunitaria desarrollada frente a la infección por B. besnoiti en el rebaño fue

la presencia de signos clínicos. Los animales con infección clínica mostraron

niveles de anticuerpos más elevados que aquellos con infección subclínica,

Discusión

140

siendo las diluciones 1/800 y 1/100 respectivamente los títulos de

anticuerpos más frecuentes. Teniendo en cuenta los análisis descriptivos

realizados en el apartado 4.1.3.1., se puede confirmar por tanto que la

disminución detectada a lo largo del estudio en el título de anticuerpos

(de 1/400 a 1/200) estuvo relacionada con la eliminación de gran parte de

los animales afectados clínicamente. Esta asociación encontrada entre la

intensidad de la respuesta inmunitaria y la presencia de signos clínicos ha

sido descrita previamente por otros autores, quienes además sugieren la

hipótesis de que esta correspondencia puede ser debida a una estimulación

constante del sistema inmune proporcional a la presencia de quistes en los

tejidos (Liénard et al., 2011; Esteban-Gil et al., 2014). Estos resultados

refuerzan por tanto la propuesta de utilizar el título de anticuerpos como

posible indicador de la severidad de la enfermedad y más concretamente,

como herramienta para el cribado selectivo de los animales potencialmente

portadores de mayores cantidades de parásito para así lograr una

disminución de la presión de transmisión de la enfermedad en los rebaños

(Alzieu et al., 2011; Gollnick et al., 2015).

Dentro de este mismo análisis también se ha podido apreciar una asociación,

aunque no significativa, entre los niveles de anticuerpos y la raza de los

animales. Las vacas de la raza Parda de Montaña presentaron títulos algo

más bajos que las de raza Pirenaica. Este aumento de la intensidad de la

respuesta inmunitaria en la raza Pirenaica podría estar relacionado con una

presunta disminución de su resistencia genética a la parasitación debido a

que las poblaciones de esta raza se vieron sensiblemente reducidas e incluso

estuvieron próximas a la extinción en la década de los años 70.

Discusión

141

5.1.3-ESTUDIO DE LA DESCENDENCIA


MEDIDAS TRANSVERSALES

La seroprevalencia total detectada en los terneros en torno a los 6 meses de

edad fue del 15,17%. Según el trabajo de Shkap y cols., todos los terneros

hijos de madres afectadas de besnoitiosis analizados presentaban anticuerpos

calostrales y esta inmunidad podía durar hasta los 4 meses de edad (Shkap

et al., 1994). Si se considera que la detección de anticuerpos observada en

nuestro estudio fue debida a una transferencia de inmunidad maternal cabría

esperar que todos los terneros hijos de madres seropositivas presentaran

anticuerpos, sin embargo tan sólo la mitad de los individuos infectados

descendían de madres seropositivas (11/22). Además, todos los terneros

seropositivos incluidos en el análisis fueron mayores de 4 meses, lo que

sugiere que los rastros serológicos encontrados se correspondían con

infecciones recientes. En consecuencia, todo ello parece indicar que los

anticuerpos maternales no confieren a los terneros una respuesta inmunitaria

protectora frente a infecciones posteriores.

Sobre las hipótesis de las posibles vías de transmisión de la besnoitiosis a

estos terneros, en primer lugar se planteó una transmisión lactogénica. No

obstante, tal y como apuntan Hornok y cols. en un estudio reciente en el que

no se ha logrado evidenciar la emisión de B. besnoiti en el calostro de vacas

seropositivas (Hornok et al., 2015b), una transmisión de la infección por el

calostro parece poco probable. Por otro lado, Frey y cols. también exponen

como improbable una transmisión vertical de la enfermedad, como denunció

previamente Nobel y cols. (Nobel et al., 1981), ya que no obtuvieron

evidencias de la presencia del parásito en el tracto superior de los órganos

reproductores de las hembras (Frey et al., 2013). Basándonos en estudios

similares realizados en neosporosis bovina (Schares et al., 1998; Davison et

al., 1999), considerar una transmisión vertical transplacentaria o congénita

de la enfermedad en este caso también parece poco probable ya que casi un

70% de las hembras seropositivas dio lugar a descendencia sana, y a la

Discusión

142

inversa, un 10% de las hembras sanas produjo descendencia infectada, lo

que mayoritariamente sugiere una transmisión post-natal de la enfermedad.

Con respecto a los dos periodos de nacimientos diferenciados en el análisis,

se observa que entre los terneros nacidos en la primavera de 2010 hubo más

seropositivos que en los nacidos en el periodo de otoño de 2009. Dentro de

los aspectos que diferencian a los terneros de uno u otro periodo de

nacimiento hay que considerar la subida o no a los pastos de puerto y la edad

de los animales en el momento del muestreo. Si consideramos la edad de los

terneros seropositivos, la media de edad de los nacidos en primavera fue casi

mes y medio mayor que la de los de otoño, siendo 6,5 y 5,2 meses

respectivamente. Por lo tanto, en el caso de los terneros nacidos en

primavera, la subida de estos animales a los pastos de puerto, el aumento de

la actividad de los vectores durante los meses de verano o simplemente la

diferencia de edad pudo implicar un mayor riesgo de infección, lo que

explicaría el aumento de prevalencia detectado con respecto a la de aquellos

nacidos en otoño (25,81% frente al 7,23%), coincidiendo además estos

resultados con los observados en la población adulta.

Cabe destacar que de los terneros seropositivos nacidos en otoño, los cuales

ninguno superó los 6 meses de edad en el momento del análisis, uno de los

seis animales que presentaron anticuerpos tan solo tenía 4 meses. La

infección de este ternero reafirma un hallazgo similar referido por García-

Álvarez y cols. en el que señalan la infección en un ternero de 4 meses

(García-Álvarez et al., 2014b). Sin embargo, en este estudio no solo se ha

puesto en evidencia la infección si no también la enfermedad al observarse

quistes en la esclera conjuntival compatibles con B. besnoiti en tres terneros.

Todos ellos eran animales nacidos en primavera de 2010, seropositivos y con

una edad en torno a los 6 meses en el momento del análisis. Alzieu y cols.

ya puntualizan en uno de sus trabajos que todos los bovinos,

independientemente de su edad, parecen ser susceptibles de padecer la

enfermedad como se ha demostrado al detectar quistes tisulares en terneros

jóvenes desde los 4-5 meses (Alzieu et al., 2011). En referencia a los tres

terneros de este trabajo, todos ellos fueron además hijos de madres

seropositivas con signos clínicos indicativos de besnoitiosis en fase crónica

(todas presentaban quistes oculares e incluso una de ellas alteraciones

Discusión

143

cutáneas) en el momento del parto y la lactación. En consecuencia, este

hallazgo plantea el estrecho contacto directo que ocurre entre la madre y el

ternero durante la lactación como una de las posibles vías de transmisión de

la besnoitiosis a la descendencia.

En cuanto a los títulos de anticuerpos observados en los terneros

seropositivos, se ha encontrado que hubo una leve diferencia entre periodos.

Las titulaciones de los animales nacidos en primavera fueron ligeramente

superiores, coincidiendo con la presencia de terneros con signos clínicos de

enfermedad. Al igual que en la población adulta, los terneros afectados

clínicamente fueron los que presentaron las respuestas inmunitarias de

mayor intensidad (título 1/400 o superior).



-Análisis de la seroconversión de los terneros:

En relación al análisis de los posibles factores de riesgo asociados a la

probabilidad de seroconvertir que tuvo un ternero se ha observado que

aquellos terneros descendientes de madres seropositivas presentaron el

doble de riesgo de infectarse que los hijos de madres seronegativas. Este

riesgo también fue algo más del doble para el caso de los terneros nacidos en

el periodo de primavera que para los de otoño, sin embargo ni la raza ni el

sexo parecen haber actuado como factores de riesgo. La asociación

encontrada entre el riesgo de seroconversión de un ternero y la serología de

su madre parece indicar que las infecciones de los terneros fueron debidas a

una transmisión post-natal de la enfermedad por el estrecho contacto que

mantuvieron madres e hijos al compartir los mismos alojamientos durante el

periodo de lactación. Según un reciente estudio, en aquellos casos en los

que una hembra gestante sea seropositiva, una separación del ternero

inmediatamente después de la ingestión del calostro y una posterior

alimentación artificial podría ser una estrategia de éxito para interrumpir esta

posible transmisión (Hornok et al., 2015b).

Discusión

144

Al analizar las seroconversiones por periodos, se ha podido comprobar que en

el segundo periodo hubo más infecciones que durante el primero. Las

posibles causas de este aumento del número de infecciones podrían ser,

como hemos comentado anteriormente, la subida de los animales a los

pastos de puerto, el aumento de la actividad de los vectores durante los

meses de verano o la simple diferencia de edad. No obstante, en el primer

periodo de otoño, donde el número de infecciones fue menor pero los

terneros permanecieron todo el tiempo con la madre y sin subir a puerto, la

relación entre la serología de la madre y la del ternero parece ser algo más

marcada que en el segundo periodo de primavera (66,6% y 43,8% de

terneros seropositivos hijos de madres seropositivas en otoño y primavera

respectivamente). Esto explicaría que para el segundo periodo, a pesar de

observarse más infecciones, el hecho de encontrar una relación menos fuerte

entre las serologías de los terneros y sus madres podría estar indicando que

los terneros pudieron infectarse tanto al compartir alojamientos con las

madres infectadas como posteriormente al subir a los pastos de puerto. En

este sentido, cabe señalar especialmente el caso de cinco terneros de raza

Pirenaica nacidos en primavera de 2010 que resultaron seropositivos siendo

todos ellos hijos de madres seronegativas y compartiendo el mismo

alojamiento, lo que apunta que en el caso de este grupo de terneros la

infección pudo ocurrir durante el tiempo que estuvieron en los pastos de

puerto.

Al profundizar en el papel que pudo desempeñar una madre seropositiva

afectada clínicamente de besnoitiosis en la probabilidad de seroconvertir que

tuvieron los terneros no se encontró ninguna asociación. Esto podría indicar

que, al igual que en el estudio realizado en la población adulta, la transmisión

de la enfermedad a los terneros también está garantizada a partir de madres

seropositivas con infección subclínica.

Finalmente, es importante tener en cuenta que la capacidad explicativa de los

modelos ajustados en este trabajo para el riesgo de seroconversión, el

desarrollo clínico de la enfermedad o la intensidad de la respuesta

inmunitaria de los animales ha sido relativamente baja, siendo incluso la

devianza o varianza explicada por alguno de ellos inferior al 10%

(6,9%-32,5%). Este tipo de limitación suele ser inherente a los estudios

Discusión

145

observacionales de campo, y en el caso de este trabajo, posiblemente sea

debido a la simplicidad de las aproximaciones a las que hubo que recurrir

para tratar de estudiar la dinámica de la infección y la aparición de casos de

enfermedad en el brote. Este fue el caso, por ejemplo, de intentar modelizar

el riesgo de seroconvertir que tuvo un animal conociendo sólo el número de

vacas seropositivas con las que había compartido alojamiento en

determinados momentos. Otro de los inconvenientes encontrado a la hora de

plantear estos análisis fue la descompensación entre los dos periodos

establecidos en el estudio en cuanto a su duración, a la distribución de las

épocas de partos-cubriciones o a el hecho de que durante el primer periodo

los animales pasaron de 2 a 4 meses en los pastos de puerto bajo

condiciones de manejo extensivas. No obstante, a pesar de que estas

aproximaciones fueron las únicas disponibles en este análisis para tratar de

modelizar las relaciones existentes entre las variables dependientes y los

factores de riesgo estudiados, estos resultados constituyen un primer paso en

la identificación de aquellos factores presentes en una explotación afectada

de besnoitiosis que actúan como elementos predictivos de la transmisión de

la infección. Al margen de estas aproximaciones, tal vez existan otros

factores de riesgo que no se han podido controlar en este trabajo, como

podrían ser algunos factores relacionados con el ambiente o asociados al

manejo de la explotación, y que sería muy recomendable incluir en futuros

estudios.

5.2-ESTUDIO REPRODUCTIVO

En la bibliografía existen evidencias sobre las pérdidas productivas que la

besnoitiosis bovina puede ocasionar en los rebaños debido a las lesiones que

ésta provoca en el aparato reproductivo de los sementales y por

consiguiente, el impacto en su fertilidad (Kumi-Diaka et al., 1981; Cortes et

al., 2005; López et al., 2011). Además, en un estudio propio realizado en

una explotación lechera intensiva de Navarra se pudo observar también un

marcado efecto de la enfermedad sobre la producción láctea de las vacas

(datos no publicados). Teniendo en cuenta estos indicios, se planteó la

Discusión

146

evaluación del efecto de la infección y la enfermedad causada por B. besnoiti

sobre la eficiencia reproductiva del rebaño a estudio.

En un primer momento se valoró también estudiar la posible transmisión

horizontal de la enfermedad mediante la monta natural, sin embargo, esto no

se ha podido llevar a cabo ya que no fue posible definir con exactitud si la

transmisión observada durante la época de cubriciones pudo ser debida

exclusivamente a la monta natural o a la presencia de otros factores como el

simple contacto directo entre los animales al compartir alojamientos por lotes

de cubrición o a la actividad de los vectores. No obstante, es importante

remarcar que todos los machos involucrados en las cubriciones llevadas a

cabo en la explotación mediante monta natural en primavera de 2010

seroconvirtieron durante el primer periodo del estudio, lo que parece sugerir

que los toros podrían presentan un riesgo de infectarse mayor, posiblemente

a causa de los repetidos y estrechos contactos que tienen con múltiples vacas

durante la época de montas (en el caso de esta explotación cada macho

entra en un lote de cubrición con 15-20 vacas durante 2-3 meses). Por otro

lado, a pesar de que durante el segundo periodo la monta natural fue

sustituida por IAr como estrategia de control de la enfermedad, se ha podido

comprobar que la besnoitiosis siguió transmitiéndose de manera eficaz por el

rebaño, lo que refuerza la hipótesis de la importancia de la transmisión

horizontal de la enfermedad vía contacto directo.


DEL REBAÑO

En primer lugar se realizó un análisis de los datos históricos de la explotación

en relación a los IEP de las vacas. El alargamiento de los IEP puede ser uno

de los principales factores limitantes de la eficiencia reproductiva de un

rebaño. Por lo general, en el ganado vacuno de carne se estima que el valor

teórico óptimo del IEP es de 365 días, es decir, el equivalente a un parto por

vaca al año (Serrano, 2015a). No obstante en la práctica, en condiciones

incluso de ausencia de problemas específicos de fertilidad, es difícil lograr

este valor ideal y habitualmente se sitúa en torno a los 395 días (Peters,

Discusión

147

1995). Según Serrano, los valores de IEP del ganado vacuno de carne en

España en aquellas explotaciones con parideras o cubriciones concentradas

suelen oscilar entre los 410 y 430 días (Serrano, 2015b). Si se toma como

referencia la media del conjunto de IEP anuales del rebaño a estudio desde el

año 2000 hasta el 2013 se observa que éste se sitúa en 447 días,

ligeramente por encima de los valores establecidos, siendo el dato del año

2010, correspondiente al momento en el que el brote estaba en plena

transmisión, el IEP más elevado (527 días). Por tanto, los datos observados

en el rebaño parecen indicar un alargamiento anormal del valor medio del IEP

durante el año del estudio con respecto a sus propios datos históricos.

Dentro de los posibles factores que influyen en el aumento del IEP se pueden

encontrar factores endógenos de las vacas, como son la genética, la raza, la

edad, la condición corporal o la producción láctea, y factores exógenos, como

la alimentación, la presencia del ternero durante la lactación, las distocias o

el estado sanitario (Serrano, 2015b).

Con respecto a la fertilidad histórica de los toros presentes en la explo tación

desde el año 2009 al 2013 se observa que su valor medio es muy variable y

suele oscilar entre un 70% y un 90% (porcentajes considerados normales),

siendo la fertilidad media de la cubrición por monta natural llevada a cabo en

la explotación en el periodo del estudio un 60% (primavera 2010). Un

descenso en la fertilidad de los sementales podría estar relacionado con la

presencia de alguna enfermedad, como en este caso la besnoitiosis, si bien

pueden influir también otros factores como la genética de los individuos, la

existencia de algún problema congénito o físico (como por ejemplo una

cojera), algunos factores ambientales o de manejo e incluso el ciclo ovárico

de las vacas.

A parte de los problemas de fertilidad en los machos, varios autores señalan

en la bibliografía que durante la fase aguda de la besnoitiosis pueden

aparecer abortos en las vacas (Pols, 60; Juste et al., 1990). Si tenemos en

cuenta los abortos ocurridos en la explotación, donde se aisló el patógeno

L. interrogans, los resultados parecen indicar que la besnoitiosis bovina no

fue la responsable de los abortos registrados en nuestro estudio. Este

resultado se ve confirmado por la ausencia de detección de ADN de

Discusión

148

B. besnoiti en los tejidos de fetos abortados hijos de vacas seropositivas

descrita recientemente por Hornok y cols. (Hornok et al., 2015b).

Con el objetivo de determinar la posible influencia de la besnoitiosis tanto en

el alargamiento de los IEP de las vacas como en el descenso de la fertilidad

de los machos observados se planteó un análisis posterior centrado en

aquellos individuos involucrados en las cubriciones del año 2010.


EFICIENCIA REPRODUCTIVA DEL REBAÑO


HEMBRAS

-Análisis de la tasa de gestación:

Al analizar las tasas de gestación alcanzadas en la explotación en las dos

cubriciones realizadas durante el periodo de estudio, es decir, la de

primavera de 2010 mediante monta natural y la de otoño de 2010 mediante

IAr, se observa que el porcentaje de hembras gestantes para la primera

cubrición no alcanzó el 50% frente al 80% obtenido mediante IAr en la

segunda época de cubriciones. En aquellos casos de cubriciones mediante

monta natural, el porcentaje óptimo de tasa de gestación en vacas suele

situarse en torno al 70-90%, si bien para las cubriciones realizadas con IAr

este porcentaje puede variar del 60-80% (Sanz, 2014). Al comparar estos

valores con los porcentajes observados en el rebaño se puede sospechar que

el porcentaje relativo a la primera cubrición se encuentra por debajo de los

valores esperados, sin embargo el de otoño se sitúa en el extremo superior

del rango óptimo, probablemente debido a un mayor éxito de cubrición

logrado mediante la IAr.

Pese a estos hallazgos, si tenemos en cuenta el estado serológico y clínico

frente a la besnoitiosis de estas vacas, las diferencias observadas en el

porcentaje de hembras que quedaron gestantes o vacías en función de su

estado serológico o clínico no fueron significativas, incluso analizando los dos

periodos de cubriciones por separado. Esto parece indicar que el hecho de

Discusión

149

que una vaca estuviera infectada de forma subclínica o incluso clínica no

influyó en que ésta quedara gestante o no. Esta hipótesis se confirmó al no

encontrarse un modelo que relacionara la capacidad de concepción de las

hembras para las dos cubriciones a estudio con su estado serológico o clínico

frente a la besnoitiosis. Estos resultados se aproximan a los publicados por

Nobel y cols. quienes apuntaban en su trabajo que ni la presencia de quistes

tisulares de B. besnoiti en el útero de las vacas infectadas estudiadas ni el

desarrollo de granulomas inflamatorios a su alrededor parecían provocar

alteraciones suficientes que interfirieran en el funcionamiento normal de los

órganos afectados (Nobel et al., 1981).

Además, el análisis multivariante también nos permitió descartar la posible

influencia de la fertilidad del macho sobre las tasas de gestación alcanzadas

al no encontrar evidencias que relacionaran estas tasas con el macho

involucrado en cada cubrición.

Por tanto, esta disminución detectada en la tasa de gestación en la época de

cubriciones de primavera podría corresponderse con un alargamiento anormal

del anestro postparto a causa de desequilibrios nutricionales o de una baja

condición corporal de las vacas en el momento del parto. Más

concretamente, este descenso en la tasa de gestación también podría ser

debido al carácter experimental de esta explotación donde, de manera

frecuente, se llevan a cabo ensayos sobre la repercusión que tiene la

alimentación recibida por las vacas durante la gestación en la reproducción.

-Análisis los IEP:

Los valores medios de IEP fueron similares para las dos cubriciones a estudio,

lo que parece indicar que no hubo un efecto de la IAr sobre el alargamiento

del IEP observado en el año 2010. Con respecto al estado serológico de las

hembras, el ligero aumento de la media del IEP del año 2010 de las vacas

seropositivas con respecto a las seronegativas podría estar indicando un

efecto de la infección sobre esos valores, no obstante estas diferencias no

fueron significativas. Contrariamente a lo que cabría esperar, el IEP medio

de las vacas aparentemente sanas fue ligeramente superior al de aquellas

que mostraron signos clínicos de la enfermedad, si bien este hallazgo

tampoco fue significativo.

Discusión

150

Al realizar un análisis multivariante teniendo en cuenta todos estos factores

conjuntamente no se han logrado encontrar evidencias suficientes que

establecieran una asociación del alargamiento del IEP del año 2010 con el

estado serológico o clínico de las vacas frente a la besnoitiosis. Por lo tanto,

según estos resultados, el incremento detectado en el índice reproductivo IEP

podría estar relacionado con otro tipo de factores como algunos de los

descritos anteriormente. En parte, esta variación podría verse explicada por

el elevado porcentaje de vacas que quedaron vacías en la cubrición de

primavera que, al pasar a ser cubiertas en la siguiente época de cubriciones,

en consecuencia alargaron su valor de IEP de ese año.


MACHOS

El efecto que el brote de besnoitiosis bovina pudo tener sobre la fertilidad de

los machos involucrados en las cubriciones de primavera de 2010 no pudo

analizarse estadísticamente ya que todos los sementales que participaron en

las montas se infectaron durante ese periodo, por lo que no fue posible

disponer de un grupo de toros seronegativos con el que comparar. No

obstante, dos de los tres toros que presentaron una fertilidad ≤ 50%

presentaron a su vez signos clínicos de enfermedad (quistes en la esclera

conjuntival). Esta disminución de la fertilidad en los toros afectados de

besnoitiosis crónica severa ha sido relacionada en varias ocasiones en la

bibliografía con una degeneración y necrosis progresiva de los testículos

causada por el parásito (Kumi-Diaka et al., 1981; Cortes et al., 2005).

A pesar de no encontrar un efecto aparente de la besnoitiosis bovina sobre la

eficiencia reproductiva del rebaño, si se puede señalar que, como

consecuencia de la enfermedad, se ha observado un desvieje precoz de los

animales en plena edad reproductiva y un reposición forzada en torno al 25%

de la población, siendo que la tasa de reposición anual recomendada para

este tipo de explotaciones es del 10% (Serrano, 2015a). Además, a esto

habría que sumar los gastos que conlleva la realización de la IAr.

Considerando todas estas observaciones, se puede deducir las importantes

Discusión

151

pérdidas económicas que soportan aquellas explotaciones que conviven con

la enfermedad. Por último, para poder determinar con más exactitud el

impacto de la enfermedad sobre la reproducción de los rebaños sería muy

necesaria la realización de más estudios a este respecto incluyendo otros

índices reproductivos como por ejemplo el peso del ternero al nacimiento o

su ganancia media de peso durante la lactación.

5.3-ESTUDIO MOLECULAR

5.3.1-DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LA FASE AGUDA

Varios autores han descrito en sus trabajos la capacidad de la técnica de PCR

cuantitativa para detectar de manera temprana la infección por B. besnoiti al

evidenciar la presencia de su ADN en biopsias de piel entre 1 y 4 días

después del inicio de la fase aguda febril (Schares et al., 2013; Gollnick et

al., 2015). Siguiendo la línea de estos autores y en base al hecho de que

durante la etapa aguda de la besnoitiosis existe una fase de parasitemia que

puede durar de 2 a 10 días, en este trabajo se propuso adaptar la técnica de

PCR cuantitativa para la detección de ADN del parásito en sangre durante la

fase inicial aguda de la infección.

Según los resultados obtenidos, un 1,5% y 2,7% de los animales analizados

en el estudio presentaron ADN de B. besnoiti en muestras de sangre en el

muestreo de enero de 2010 y febrero de 2011 respectivamente. Estas

prevalencias de detección de ADN observadas en muestras de sangre están

en concordancia con los valores teóricos previamente estimados y son

bastante similares en ambos muestreos, si bien la prevalencia en febrero de

2011 fue ligeramente superior. El valor de las cargas parasitarias observadas

también fue similar en ambos muestreos, oscilando entre 1 y 88 parásitos

por reacción. Además, se ha podido comprobar que los animales que

resultaron positivos en febrero de 2011 eran diferentes con respecto a los de

enero de 2010, lo que probablemente indica que se trataba de nuevas

infecciones.

Discusión

152

Todas las muestras de sangre que presentaron ADN del parásito parecen ser

compatibles con animales en fase aguda de parasitemia salvo el caso de una

hembra en enero de 2010 que resultó ser seropositiva y presentaba

alteraciones cutáneas. Es esperable que aquellos animales en la fase crónica

de la enfermedad no presenten rastros de ADN del parásito en sangre ya

que, a pesar de que la ruptura de los quistes tisulares es posible, la llegada

de parásitos al torrente circulatorio parece complicada debido a que éstos se

encuentran generalmente rodeados de un halo inflamatorio (Schares et al.,

2011; Langenmayer et al., 2015). En consecuencia, cabe plantear que lo de

esta vaca fuese un caso de enfermedad crónica y su resultado positivo podría

corresponderse con una contaminación de la muestra de sangre al atravesar

la piel durante la extracción, lo que señalaría un posible inconveniente de la

técnica.

Así pues, los resultados indican que la técnica de PCR cuantitativa es capaz

de detectar el ADN de B. besnoiti en muestras de sangre, y por tanto, de

identificar la fase aguda de la infección. Esta técnica parece ser incluso más

sensible que el examen directo de frotis de sangre al microscopio ya que

Gollnick y cols. describen en su trabajo la ausencia de observación de

taquizoítos libres o intracelulares en extensiones de sangre en cuatro

animales en fase aguda. No obstante, sería interesante poder validar

nuestros resultados en muestras de sangre procedentes de animales con

signos clínicos aparentes de la fase aguda.

A la luz de estas observaciones, y como también sugiere Gutiérrez y cols.

(Gutiérrez-Expósito et al., en prensa), en futuros trabajos sería

recomendable utilizar la técnica de PCR cuantitativa para investigar el papel

que puede tener la sangre en la transmisión de la enfermedad.

5.3.2-DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LA FASE CRÓNICA

Los resultados observados parecen demostrar la utilidad de la PCR

cuantitativa para confirmar la presencia del parásito B. besnoiti en muestras

de piel de animales con signos clínicos compatibles con la fase crónica de la

Discusión

153

enfermedad. Además, esta técnica es la que mayor sensibilidad presentó

para el diagnóstico de la besnoitiosis crónica en comparación con el

diagnóstico serológico y el examen microscópico directo de muestras de piel

(100%, 92,8% y 25% respectivamente). El valor de Ct medio en estas

muestras de piel se situó en torno a 25. Estos resultados son notablemente

superiores a los descritos por Schares y cols. quienes demostraron que un

65,1% de los animales con signos clínicos de besnoitiosis analizados

mediante la técnica de PCR cuantitativa resultaron positivos en biopsia de

piel, con un valor medio de Ct próximo a 27 (Schares et al., 2011). En el

presente trabajo también se ha podido observar la presencia de dos animales

con signos crónicos de enfermedad y evidencias de ADN del parásito en piel

pero seronegativos (con valores de Ct de 19,8 y 31,5). Del mismo modo,

Schares y cols. detallan en su estudio la detección de dos animales con

signos clínicos, positivos por PCR cuantitativa en biopsia de piel y

seronegativos (Schares et al., 2011). El posible papel que tienen estos

animales afectados crónicamente de besnoitiosis pero seronegativos

necesitaría ser estudiado en profundidad. Como ya se ha planteado con

anterioridad en esta memoria, estos animales con signos clínicos y cargas

parasitarias medias-altas en piel podrían actuar como individuos

inmunotolerantes o recuperados serológicamente portadores de la

enfermedad.

Con respecto a la obtención de las muestras de piel, las zonas de elección

para hacer una biopsia en animales con sospecha clínica de besnoitiosis son

aquellas áreas con alteraciones cutáneas. Sin embargo, en ausencia de

lesiones, la elección de la zona puede suponer una limitación ya que en la

actualidad no existe un consenso sobre cuál es la zona preferente para

analizar. En el caso de este estudio, la muestra se tomó de la zona del

cuello, obteniendo unos resultados satisfactorios.

Asimismo, en estos análisis se ha podido comprobar que un animal presentó

quistes tisulares visibles al microscopio cuando su resultado de PCR en piel se

situó por debajo de 30 Ct, lo que equivale al ADN de más de 100 parásitos

por reacción. Según el trabajo de Schares y cols., los animales que

presentaban quistes tisulares observables por histología mostraron un valor

medio de Ct cercano a 21 (Schares et al., 2011). Ambos hallazgos parecen

Discusión

154

indicar que para que los quistes tisulares sean visibles al microscopio los

animales deben presentar importantes cargas parasitarias en la piel.

Por otro lado, la correlación encontrada en el presente trabajo entre el

resultado de PCR en piel y las titulaciones de anticuerpos de los animales

reveló que aquellos animales que presentaron mayores cargas parasitarias

presentaron a su vez las respuestas inmunitarias más intensas. Otros

autores que han observado resultados similares apuntan la hipótesis de que,

en presencia de quistes parasitarios, hay una estimulación constante del

sistema inmune (Schares et al., 2011; Schares et al., 2013). Esto parece

corresponderse con la observación descrita en el apartado de estudio

seroepidemiológico donde se demuestra que la intensidad de la respuesta

inmunitaria desarrollada por los animales estuvo estrechamente relacionada

con la presencia de signos clínicos de enfermedad.

Para finalizar, la principal ventaja que aporta esta prueba es que permite

confirmar la presencia de ADN del parásito en la piel de cualquier animal con

sospecha de signos clínicos compatibles con la besnoitiosis bovina. Además,

esta técnica permite también identificar aquellos animales que son

“portadores eficaces” del parásito, independientemente de su estado

serológico o clínico, lo que puede servir como criterio de selección de

individuos para establecer medidas de separación y así minimizar la

transmisión de la enfermedad por contacto directo, o incluso como sugiere

Alzieu y cols., para eliminar completamente el parásito de un rebaño (Alzieu

& Jacquiet, 2012). No obstante, puesto que la técnica de PCR es tan

sensible, antes de establecer un posible punto de corte sería recomendable

evaluar primero la capacidad de transmisión que tienen los animales en

función de su carga parasitaria.

5.4-RECOMENDACIONES

En base a todos los resultados obtenidos en el presente trabajo parece

interesante añadir un último apartado con algunas recomendaciones que

podrían ser de ayuda para planificar y establecer un sistema de control y

Discusión

155

prevención de la transmisión de la infección en aquellas explotaciones

afectadas. Estas medidas deberían ir fundamentalmente dirigidas a dos

niveles:

1. Medidas extra-explotación:

Para evitar la entrada del parásito en la explotación sería necesario realizar

un análisis serológico y examen clínico previo a la llegada de todos los

animales nuevos a partir de los 4 meses de edad para identificar aquellos que

pudieran estar infectados o enfermos. Sería aconsejable evitar la entrada de

cualquier animal con la mínima sospecha de infección o enfermedad, incluso

si fuera posible, se recomendaría su eliminación. Los animales que

resultasen negativos, sería conveniente mantenerlos en cuarentena y/o

repetir los análisis a los dos meses, sobre todo si procediesen de una zona

endémica. Para la realización de estos análisis se deberían utilizar pruebas

serológicas de cribado (son las que mayor sensibilidad diagnóstica

proporcionan) pero, siempre que sea posible, se deberían complementar con

PCR cuantitativa de biopsia de piel para descartar el potencial de estos

animales como posibles portadores sanos del parásito.

2. Medidas intra-explotación:

Dentro del rebaño, los esfuerzos deberían centrarse en minimizar, incluso si

es posible interrumpir, la transmisión de la enfermedad. Para ello se

propondrían las siguientes acciones:

En primer lugar, se recomendaría la identificación y eliminación de

todos aquellos animales enfermos con desarrollo clínico de la

enfermedad, ya que serían los portadores de mayores cargas del

parásito. Para la confirmación diagnóstica de la enfermedad en estos

individuos se podría recurrir a pruebas más sensibles y específicas

como la PCR cuantitativa en muestras de piel. A la hora de organizar

el plan de eliminación, podrían merecer un trato prioritario aquellos

machos con infección crónica severa ya que, por lo general, su

fertilidad puede verse drásticamente reducida.

En segundo lugar, se recomendaría la eliminación de aquellos animales

seropositivos con infección subclínica para evitar que actuasen como

foco de infección. Si la seroprevalencia de la explotación fuese baja

Discusión

156

(<10%), sería preferible una eliminación de estos animales lo más

rápida posible. Si por el contrario la seroprevalencia fuese alta

(>30%), podría asumirse un programa progresivo de eliminación

durante el cual habría que poner en marcha una serie de medidas

basadas en el manejo como las que se indican a continuación.

-Realizar serología de cribado previa a las épocas de partos-

cubriciones y a la bajada de puerto para ver el estado de la infección

en el rebaño. En función de los resultados, se deberían establecer

medidas de control basadas en el agrupamiento de los lotes y la

distribución de los alojamientos. Una opción para evitar la transmisión

podría ser hacer lotes por grupos de animales seropositivos y

seronegativos, con una separación mínima de 20 m entre infectados y

sanos.

-Si es posible, separación de los terneros hijos de madres

infectadas inmediatamente después de la ingestión del calostro y

posterior alimentación artificial. En el resto de los casos, se

aconsejaría el control serológico y clínico de todos los terneros nacidos

en la explotación a partir de los 4 meses de edad. Si se detectasen

casos de enfermedad, sería recomendable su confirmación mediante la

técnica de PCR en biopsia de piel.

Además, en aquellos rebaños libres o con baja prevalencia de

besnoitiosis en los que se realizasen cubriciones mediante monta

natural, sería recomendable establecer un sistema rutinario de

vigilancia sobre los machos para evitar la presencia de animales

infectados que pudiesen actuar multiplicando eficazmente la

transmisión de la enfermedad entre las vacas.

Por último, ante la mínima sospecha de un animal en la fase aguda de

infección, sería aconsejable realizar PCR cuantitativa para la detección

de ADN de B. besnoiti en muestras de sangre. Una detección precoz

de los casos en la etapa incipiente de la infección incrementaría las

opciones para su tratamiento.

CONCLUSIONES

Conclusiones

157

6-CONCLUSIONES

La realización del presente trabajo ha permitido llegar a las siguientes

conclusiones:

1. Pese a la eliminación progresiva de gran parte de los animales con signos

clínicos de besnoitiosis bovina llevada a cabo en la explotación a lo largo del

estudio, la prevalencia observada al final sugiere que B. besnoiti puede

trasmitirse de forma efectiva a partir de aquellos animales infectados de

manera subclínica.

2. La probabilidad de seroconversión frente a B. besnoiti de un animal estuvo

directamente relacionada con el número de animales serológicamente

positivos con los que había compartido alojamiento durante el periodo de

estabulación, así como con la duración de éste, confirmando la importancia

de la transmisión horizontal por contacto como una de las principales rutas

de difusión de la enfermedad.

3. El riesgo de desarrollar la forma clínica de la besnoitiosis bovina estuvo

directamente relacionado con la edad de los animales, mientras que la

presencia de signos clínicos de la enfermedad estuvo asociada a las

respuestas inmunitarias más intensas.

4. La prevalencia de anticuerpos y los signos clínicos observados en los

terneros apuntan que B. besnoiti es capaz de infectar y causar enfermedad

en animales por debajo de los 6 meses de edad. El riesgo de seroconversión

de los terneros estuvo relacionado con el estado serológico de las madres,

sugiriendo una transmisión post-natal por contacto al compartir alojamientos

durante el periodo de lactación.

5. Las tasas de incidencia estimadas para los dos periodos de puerto y valle

son compatibles con una tasa de transmisión constante del parásito a lo largo

de todo el estudio. Ello podría ser indicativo de que la mayor prevalencia de

infección detectada para el periodo que incluyó la subida a puerto tanto de la

población adulta como en los terneros pudo ser debida, sobre todo, a un

Conclusiones

158

efecto acumulativo del tiempo y no a la concurrencia de otros factores

epidemiológicos diferenciales entre ambos periodos.

6. No se han encontrado evidencias suficientes que determinen un posible

efecto de la infección por B.besnoiti o del desarrollo clínico de la enfermedad

sobre los índices de eficiencia reproductiva de las vacas evaluados en el

estudio (intervalo entre partos y tasa de gestación).

7. La detección mediante la técnica de PCR cuantitativa de ADN de B. besnoiti

en la sangre y la piel de los animales muestreados demuestra la utilidad de

esta prueba para la identificación de la fase aguda y la confirmación de la

fase crónica de la enfermedad. Además, las cargas parasitarias observadas

en las muestras de piel presentaron una marcada correlación con la

intensidad de la respuesta inmune desarrollada por los animales.

8. Según los resultados obtenidos, el control de la enfermedad en una

explotación debería implementarse a dos niveles. Por un lado, evitando la

entrada del parásito mediante la realización de rigurosos controles a la

llegada de nuevos animales. Por otro, en aquellas explotaciones que

conviven con la enfermedad, evitando la transmisión mediante la vigilancia

serológica de los individuos junto con la eliminación progresiva de los

animales infectados, manteniendo durante el proceso medidas de manejo que

los separen físicamente de los animales sanos hasta completar la erradicación

de todos los animales seropositivos.

CONCLUSIONS

Conclusions

159

7-CONCLUSIONS

The present work allows us to draw the following conclusions:

1. Despite the progressive culling of the majority of clinically infected animals

carried out in the herd throughout the study, the seroprevalence observed at

the end suggests an effective B. besnoiti transmission by subclinically

infected animals.

2. The seroconversion probability of B. besnoiti infection was directly

associated with the number of seropositive affected cows with whom an

animal had been stabled as well as the housing period duration, supporting

horizontal transmission by close contact as one of the most important ways

of disease spread.

3. The risk of developing the bovine besnoitiosis clinical course increased with

the age of animals. In addition, the presence of disease clinical signs

apparently corresponded with higher antibody responses.

4. The prevalence of antibodies and the clinical signs recorded in calves

points out the ability of B. besnoiti to infect and even cause disease in

animals below 6 months old. The risk of calf seroconversion was positively

related to the serological status of the cows, suggesting a postnatal

transmission between dams and offspring by close contact during suckling

period.

5. The incidence density estimated for both mountain and valley periods

seems to be according to a continuous parasite transmission throughout the

study. Thus, it should be noted that the higher seroprevalence detected in

the mountain period, which implied the supraforestal-grazing season of cows

and calves, could be mainly due to a cumulative effect associated with time

and not to the concurrence of any other differentiating epidemiological

aspects between periods.

6. An apparent impact of the subclinical or clinical course of bovine

besnoitiosis infection on reproductive efficiency of cows (calving interval and

pregnancy rate) could not be demonstrated in the study.

Conclusions

160

7. Real-time PCR analyses were successful on identifying the acute stage of

infection and confirming chronic disease by B. besnoiti DNA detection in blood

and skin samples. Furthermore, parasite loads in skin were positively

correlated with the intensity of the immune response developed by

seropositive animals.

8. According to the results, disease control measures in farms should be

based on two main strategies. On the one hand, avoiding the parasite

entrance to herds by rigorous controls at new animal arrivals. On the other

hand, in those affected farms, avoiding parasite transmission by focusing on

serological analyses coupled with progressive culling of infected animals and

following management measures by physical separation between infected and

healthy cattle until the total eradication of seropositive animals.

RESUMEN

Resumen

161

8-RESUMEN

La besnoitiosis bovina es una enfermedad parasitaria causada por el protozoo

Besnoitia besnoiti (Besnoit & Robin, 1912), tradicionalmente endémica en

países del África subsahariana y Asia. Descrita hace varias décadas en

algunos países europeos como Francia y Portugal, en los últimos años se está

observando una importante expansión de la enfermedad por Europa. El

comercio con animales infectados de manera subclínica, que en el caso de la

besnoitiosis bovina son la mayoría, con fines de mejora genética, podría estar

jugando un papel importante en la transmisión de la enfermedad entre

explotaciones, incluso entre países. En la actualidad, el limitado

conocimiento disponible sobre la epidemiología de la enfermedad dificulta la

puesta en práctica de medidas adecuadas para su control. Además, tampoco

se conoce con exactitud el impacto real de la enfermedad en los rebaños, y

en consecuencia, las pérdidas económicas que ésta conlleva.

Por este motivo, los objetivos del presente trabajo han sido la identificación

de los principales factores de riesgo involucrados en la dinámica de la

infección y en la aparición de casos de enfermedad en un brote de

besnoitiosis bovina, el estudio del efecto de la enfermedad sobre la eficiencia

reproductiva del rebaño y por último, la evaluación de la técnica de PCR

cuantitativa como herramienta para mejorar el diagnóstico de la besnoitiosis

bovina.

El estudio fue llevado a cabo desde enero de 2010 hasta febrero de 2011, en

una explotación bovina de carne de carácter extensivo localizada en una zona

endémica del Pirineo aragonés. La población estudiada estuvo constituida

por 276 animales de las razas Parda de Montaña y Pirenaica, además de 145

terneros nacidos y destetados en la explotación durante el periodo del

estudio. Para caracterizar la dinámica de la infección, se establecieron tres

puntos de muestreo: enero de 2010, septiembre de 2010 y febrero de 2011,

lo que permitió dividir el estudio en dos periodos: puerto (7,3 meses) y valle

(5 meses). Durante el desarrollo del trabajo se recogieron datos relativos a

los individuos (raza, sexo, edad), al manejo (lotes y tiempo de alojamiento

de los animales) y relacionados con su eficiencia reproductiva (registro de las

Resumen

162

cubriciones, fertilidad de los machos, tasa de gestación e intervalo entre

partos de las hembras y control de las paternidades). La metodología

empleada se basó principalmente en el examen clínico de los animales, la

búsqueda de anticuerpos séricos frente a la infección por B. besnoiti

mediante la técnica de Inmunofluorescencia indirecta (IFI) y la detección del

ADN del parásito con la ayuda de la PCR cuantitativa (Real-Time PCR) en

muestras de sangre y piel. Para identificar aquellas variables que pudieran

estar actuando como factores riesgo asociados a la dinámica de la infección y

la aparición de casos de enfermedad se procedió a la realización de análisis

multivariantes mediante el ajuste de modelos lineales generalizados.

La seroprevalencia global del estudio en la población adulta fue del 38,34%

(IC95%: 34,53-42,07), presentando un 18,54% de los animales signos

clínicos de besnoitiosis bovina. En el periodo de puerto hubo un 34,57% de

nuevas infecciones entre la población susceptible, frente al 24,59% detectado

para el periodo de valle. Mientras que la tasas de incidencia fueron 0,058 y

0,061 nuevos infectados por animal-mes respectivamente.

El estudio seroepidemiológico mostró que la probabilidad de seroconversión

de un animal frente a B. besnoiti estuvo directamente relacionada con el

número de animales serológicamente positivos con los que había compartido

alojamiento durante el periodo de estabulación, así como con la duración de

éste, confirmando la importancia de la transmisión horizontal por contacto

como una de las principales rutas de difusión de la enfermedad. Además, el

riesgo de desarrollar la forma clínica de la enfermedad estuvo directamente

asociado a la edad de los animales, mientras que la presencia de signos

clínicos presentó también una relación directa con las respuestas inmunitarias

más intensas. Pese a la eliminación progresiva de gran parte de los animales

con signos clínicos de besnoitiosis bovina llevada a cabo en la explotación, la

prevalencia detectada al final sugiere que B. besnoiti puede trasmitirse de

forma efectiva a partir de animales infectados de manera subclínica.

En el caso de los terneros (entre 3,1 y 7,1 meses de edad), la

seroprevalencia global fue del 15,17% (IC95%: 9,36-21,04), observándose

tres animales con signos clínicos de enfermedad, lo que apunta que

B. besnoiti es capaz de causar infección y enfermedad en animales por

Resumen

163

debajo de los 6 meses de edad. Además, la probabilidad de seroconversión

que tuvo un ternero estuvo relacionada con el estado serológico de la madre,

lo que podría ser compatible con una transmisión post-natal por contacto al

compartir el mismo alojamiento durante el periodo de lactación.

Para todo el rebaño, el riesgo de seroconversión fue mayor para el periodo en

el que se incluyó la subida de los animales a los pastos de puerto. Esto pudo

ser debido a la presencia de algún factor de riesgo no determinado en el

estudio que favoreció la transmisión de la enfermedad durante ese periodo, o

simplemente, a la mayor duración de éste en comparación con el periodo de

valle.

En cuanto a los índices de eficiencia reproductiva del rebaño evaluados en el

presente estudio, el intervalo entre partos y la tasa de gestación de las

hembras no se mostraron aparentemente afectados a causa de la infección

por B.besnoiti o del desarrollo clínico de la enfermedad. No obstante, sí se

observó que la fertilidad de los toros afectados de besnoitoisis crónica no

superó el 50%.

El ADN de B. besnoiti detectado mediante la técnica de PCR cuantitativa en la

sangre y la piel de los animales muestreados confirma la utilidad de esta

prueba para la identificación de la fase aguda y la confirmación de la fase

crónica de la enfermedad. Asimismo, se ha podido observar que las cargas

parasitarias encontradas en la piel presentaron una marcada correlación con

la intensidad de la respuesta inmune desarrollada por los animales.

Finalmente, en base a los resultados obtenidos en el presente trabajo se han

recomendado una serie de medidas que podrían ser de ayuda para planificar

y establecer un posible sistema de control de la infección en las explotaciones

afectadas.

SUMMARY

Summary

165

9-SUMMARY

Bovine besnoitiosis is a parasitic disease caused by the protozoan Besnoitia

besnoiti (Besnoit & Robin, 1912), traditionally endemic in Africa and Asia.

The disease was described many decades ago in some European countries as

France and Portugal, whereas recent epidemiological studies reveal an

important spread of the disease within Europe in the last few years. Cattle

trading with subclinically infected animals with the purpose of genetic

improvement could play an important role in disease transmission across

herds and even between countries. To date, some epidemiological aspects

related to the disease still remain unclear hence the establishment of

appropriate strategies for the bovine besnoitiosis control is difficult.

Moreover, the real impact of B. besnoiti infection on cattle continues

unknown and consequently, the economic losses due to the disease are

uncertain as well.

Thus, the aim of the present study has been to identify the main risk factors

involved in the infection dynamics and the disease occurrence in a bovine

besnoitiosis outbreak reported in a farm managed under extensive

conditions. Also, the work investigates the effects of the disease on the

reproductive efficiency of this herd. Finally, an assessment of the real-time

PCR tool for the improvement of the bovine besnoitiosis diagnosis has been

addressed.

The study was performed from January 2010 to February 2011 in a beef

cattle farm located in an endemic area of the central Pyrenees (Aragon,

Spain). The study population consisted of 276 animals of Brown Swiss and

Pirenaica breeds and, in addition, 145 calves born and weaned in the farm

during the study. Three times of sampling were designed in order to

characterize infection dynamics: January 2010, September 2010 and

February 2011, which made possible to differentiate two periods in the study

designated as mountain and valley. Data related to animals (breed, sex and

age), herd management measures (groups and time in housing) and

reproductive efficiency (natural services, fertility of bulls, pregnancy rate and

calving interval of cows and progenitor history of calves) were recorded

Summary

166

throughout the study. Methodology was mainly based on clinical

examinations, defining the serological status against bovine besnoitiosis of

animals by the immunofluorescent antibody test (IFAT) and detection of

B. besnoiti DNA by Real-Time PCR in blood and skin samples. Multivariable

logistic regression models were used to identify variables acting as risk

factors associated with the infection dynamics and disease occurrence in the

study.

The total prevalence in the study for the adult population was 38,34%

(IC95%: 34,53-42,07), with an 18,54% of seropositive animals showing

bovine besnoitiosis clinical signs. In regard to the cumulative incidence,

34,57% of new infections were detected within the susceptible population

during the mountain period in contrast to the 24,59% observed in the valley

one. Whereas, the incidence density found in the study was 0,058 and 0,061

new infections per animal month for mountain and valley periods

respectively.

According to the seroepidemiological study, the seroconversion probability of

B. besnoiti infection was directly associated with the number of seropositive

affected cows with whom an animal had been stabled as well as the housing

period duration, supporting horizontal transmission by close contact as one of

the most important ways of disease spread. In addition, the risk of

developing the bovine besnoitiosis clinical course increased with the age of

animals and the presence of clinical signs resulted in higher antibody

responses. Despite the progressive culling of the majority of the clinically

infected animals carried out in the herd throughout the study, the

seroprevalence observed at the end suggests an effective B. besnoiti

transmission by subclinically infected animals.

In the case of calves (between 3,1 and 7,1 months old), the total

seroprevalence revealed in the study was 15,17% (IC95%: 9,36-21,04) and

the chronic stage of bovine besnoitiosis could be noted in three animals,

supporting the ability of B. besnoiti to infect and even cause disease in

animals below 6 months old. Furthermore, the risk of calf seroconversion

was positively related to the serological status of cows, according to a likely

Summary

167

postnatal transmission between dams and offspring by close contact during

suckling period.

For all the animals included in the study, the probability of seroconversion

was higher in the mountain than in the valley period. It could be due to a

transmission favoured by the presence of some risk factor in the mountain

period not determined in the investigation or just to the higher mountain

period duration compared to the valley one.

Concerning the reproductive efficiency parameters evaluated, an effect of

B. besnoiti infection even in the chronic stage of the disease on calving

interval and pregnancy rate of cows could not be demonstrated in the study.

Nevertheless, fertility of chronically infected bulls showed an important

decrease.

B. besnoiti DNA detection by real-time PCR in blood and skin samples proves

the efficacy of this tool to identify the acute stage of infection and confirm

chronic disease. Moreover, parasite loads evidenced in skin were positively

correlated with the intensity of the immune response developed by

seropositive animals.

To conclude, an approach of accurate measures to control the diffusion of the

infection in herds based on these results is recommended in the study.

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169

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Universidad de Zaragoza.

ÍNDICE DE FIGURAS

Índice de figuras

187

11-ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: Árbol filogenético realizado mediante análisis de parsimonia

representando las relaciones entre varios géneros y especies de coccidios

formadores de quistes (Ellis et al., 2000). En el cuadro, géneros incluidos

dentro de la subfamilia Toxoplasmatinae...................................................11

Figura 2: Imagen de microscopía electrónica de ooquistes de Toxoplasma

gondii aislados de heces de gato. (a, b) ooquistes esporulados con

esporoquistes y esporozoítos. (c) ooquiste no esporulado. (d) ooquiste

esporulado con dos esporoquistes en su interior (Ferguson, 2009). .................13

Figura 3: Imagen obtenida mediante microscopía electrónica (TEM) de un

ooquiste sin esporular de B. darlingi observado en las heces de un gato

infectado de forma natural (Dubey et al., 2002). .......................................13

Figura 4: (a) Taquizoítos de B. besnoiti en cultivo de células Vero

observados al microscopio electrónico (nuc: núcleo, mito: mitocondria, mic:

micronemas, api: complejo apical, rho: roptrias) (Cortes et al., 2006b). (b)

Cultivo de células Vero infectado con vacuolas parasitóforas y taquizoítos de

B. besnoiti. ..............................................................................................14

Figura 5: (a) Imagen microscópica de quistes tisulares de B. besnoiti en la

dermis de una vaca infectada. (b) Corte histológico de piel con quistes de B.

besnoiti: pared quística (PQ), célula hospedadora (CH) y vacuola parasitófora

(VP). .......................................................................................................16

Figura 6: Imagen de microscopía electrónica de un corte longitudinal (a) y

transversal (b) de bradizoítos en el interior de un quiste tisular: película (PE),

microporo (MP), núcleo (N), microtúbulos subpeliculares (ST), conoide (C),

roptrias (RH), micronemas (MN), amilopectina (A) (Mehlhorn et al., 2009). 17

Figura 7: (a) Distribución mundial de las especies de Besnoitia que afectan a

ungulados. Rojo: B. besnoiti, azul: B. tarandi, gris: B. caprae y amarillo: B.

bennetti. (b) Evolución cronológica de la besnoitiosis bovina en Europa.

Cruces: antes de 1990, triángulos: 1991-2000, círculos: 2001-2014

(adaptado de Álvarez-García et al., 2013). ................................................21

Figura 8: Ciclo biológico de Besnoitia besnoiti (Álvarez-García et al., 2014).31

Figura 9: Potencial vector de la besnoitiosis bovina (Stomoxys calcitrans)

(fuente: http://www.naturespot.org.uk/species/stable-fly, fecha de consulta:

07/09/2015)............................................................................................35

Figura 10: Animales en fase aguda de besnoitiosis bovina con epífora (a) y

descarga nasal serosa (b) (Alzieu et al., 2011). .........................................40

Índice de figuras

188

Figura 11: Animales infectados por B. besnoiti en fase subaguda con edemas

en extremidades (a) y mamas (b) (Alzieu et al., 2011).............................. 41

Figura 12: (a) Engrosamiento, endurecimiento, plegamiento e

hiperqueratosis de la piel en un animal infectado por besnoitiosis bovina en

fase crónica. (b) Engrosamiento de la piel de la zona escrotal causado por la

formación de quistes de B. besnoiti en un toro infectado en fase crónica. (c)

Quistes de B. besnoiti presentes en la conjuntiva esclerótica de un animal con

enfermedad crónica. ................................................................................ 44

Figura 13: Mapa comarcal de Aragón con la situación de la localidad donde

se encuentra la explotación a estudio, Bescós de la Garcipollera (adaptado del

repositorio de mapas del Portal de las comarcas de Aragón). ..................... 61

Figura 14: Diagrama con las épocas de partos-cubriciones de otoño y

primavera realizadas en la explotación (adaptado de Casasús-Pueyo, 1998). 62

Figura 15: Esquema del diseño y cronología del estudio seroepidemiológico

en base a las dos épocas de partos-cubriciones establecidas en la

explotación.............................................................................................. 66

Figura 16: Gráfico resumen del estudio seroepidemiológico en la población

adulta. .................................................................................................... 67

Figura 17: Gráfico resumen del estudio seroepidemiológico en la población

de terneros. ............................................................................................ 68

Figura 18: Cultivo de taquizoítos de B. besnoiti sobre células MARC-145

observado al microscopio óptico. .............................................................. 70

Figura 19: Reacción de inmunofluorescencia indirecta frente a B. besnoiti

positiva (a) y negativa (b). ...................................................................... 72

Figura 20: Distribución de los sueros y visualización de la placa tras la

realización de la técnica de ELISA frente a B. besnoiti. .............................. 74

Figura 21: Esquema con los animales involucrados en las cubriciones

llevadas a cabo en la explotación durante el estudio. ................................. 80

Figura 22: Esquema donde se muestra la cronología y el diseño de las dos

partes en las que se dividió el estudio molecular, fase aguda y fase crónica.. 82

Figura 23: Curva estándar de amplificación del ADN correspondiente a

7.5x10-¹-7.5x10⁴ taquizoítos de B. besnoiti. ............................................. 86

Figura 24: Observación de la biopsia de piel de un animal en fase crónica de

esclerodermia mediante placa de compresión (a) al microscopio óptico (b). 87

Figura 25: Evolución de la mediana, rango intercuartil, mínimo y máximo de

la edad de los animales a lo largo del estudio............................................ 93

Índice de figuras

189

Figura 26: Edad (años) de los animales en estudio distribuida en función del

sexo. .......................................................................................................94

Figura 27: Distribución de los títulos de anticuerpos estimados mediante la

técnica de IFI a lo largo del estudio. ...................................................... 100

Figura 30: Diagrama de Venn representativo de la partición de la varianza

del modelo ajustado para la probabilidad de seroconversión. .................. 106


del modelo ajustado para el riesgo de desarrollar signos clínicos. ............ 108

Figura 32: Edad (años) de los animales que seroconvirtieron en el periodo

de puerto distribuida en función del desarrollo o no de signos clínicos de

besnoitiosis bovina................................................................................ 109


del modelo ajustado para la intensidad de la respuesta inmunitaria

desarrollada. ........................................................................................ 110

Figura 34: Títulos de anticuerpos desarrollados por los animales

seropositivos a lo largo del estudio distribuidos en función de la presencia o

no de signos clínicos de besnoitiosis bovina............................................ 111

Figura 35: Titulación de anticuerpos de los terneros seropositivos distribuida

según su periodo de nacimiento. ........................................................... 115

Figura 36: Diagrama de Venn representativo de la partición de la varianza del

modelo ajustado para la probabilidad de seroconversión de los terneros.... 117

Figura 37: IEP medio anual de las vacas durante el periodo 2000-2013. 119

Figura 38: Fertilidad (%) global de los machos de la explotación durante el

periodo 2009-2013. ....................................................................... 120

Figura 39: Tasa de gestación (%) para las dos cubriciones a estudio. .... 121

Figura 40: Valor medio del resultado de PCR (Ct) en biopsia de piel en

función de la presencia o no de quistes tisulares observables al microscopio

óptico................................................................................................... 128

Figura 41: Correlación entre el resultado de Ct en piel y las titulaciones de

anticuerpos estimadas por IFI. .............................................................. 128

ÍNDICE DE TABLAS

Índice de tablas

191

12-ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1: Primera descripción, hospedadores, distribución geográfica y

localización de los quistes tisulares de las distintas especies conocidas del

género Besnoitia (Marcén-Seral, 2011). ....................................................20

Tabla 2: Frecuencia relativa de las entradas y salidas de animales con

respecto al total de la explotación para cada punto de muestreo del estudio. 91

Tabla 3: Composición (%) del rebaño adulto a lo largo del estudio con

respecto a la raza. ...................................................................................92

Tabla 4: Composición (%) del rebaño adulto a lo largo del estudio con

respecto al sexo.......................................................................................92

Tabla 5: Proporción (%) de terneros de las razas Parda de Montaña y

Pirenaica nacidos en los dos periodos incluidos en el estudio. .....................95

Tabla 6: Proporción (%) de terneros macho y hembra nacidos en los dos

periodos incluidos en el estudio. ...............................................................95

Tabla 7: Valores (%) de sensibilidad, especificidad e índice J de Youden de

las técnicas de IFI y ELISA empleadas en el estudio estimados frente al

diagnóstico clínico. ...................................................................................97

Tabla 8: Tabla de contingencia con la frecuencia de resultados positivos y

negativos obtenida mediante las pruebas de IFI y ELISA al inicio del estudio.97

Tabla 9: Coeficiente de correlación Rho de Spearman entre el logaritmo del

título de anticuerpos de IFI y el % de RIPC de ELISA al inicio del estudio. ..98

Tabla 10: Medida transversal de la infección: distribución de la

seroprevalencia (%) aparente y real en los tres puntos de muestreo

establecidos en el estudio.........................................................................99

Tabla 11: Incidencia acumulada (IA) (% de nuevos casos entre la población

susceptible) y tasa de incidencia (TI) (nuevos infectados por animal-mes)

para los periodos de puerto y valle. ....................................................... 100

Tabla 12: Frecuencia de aparición y prevalencia (%) de animales con signos

clínicos de besnoitiosis en el rebaño a lo largo del estudio....................... 101

Tabla 13: Modelo final ajustado para las variables asociadas a la prevalencia

de anticuerpos detectada al inicio del estudio (enero 2010). ................... 102

Tabla 14: Modelo final ajustado para los factores de riesgo asociados a la

probabilidad de seroconversión que tuvo un animal a lo largo del estudio. 103

Índice de tablas

192


probabilidad de desarrollar signos clínicos que tuvo un animal seropositivo a

lo largo del estudio. ...............................................................................107


intensidad de la respuesta inmunitaria desarrollada por los animales

seropositivos a los largo del estudio........................................................110

Tabla 17: Seroprevalencia (%) aparente y real en terneros para las dos

épocas de nacimientos incluidas en el estudio. ........................................112

Tabla 18: Características (sexo, raza y edad) de los terneros seropositivos

en otoño de 2009 y primavera de 2010. .................................................113

Tabla 19: Frecuencia de aparición y prevalencia (%) de anticuerpos frente a

B. besnoiti en los terneros para los dos periodos de nacimientos del estudio

en función de la serología de sus madres. ...............................................113

Tabla 20: Frecuencia de aparición y prevalencia (%) de signos clínicos de

besnoitiosis en terneros para los dos periodos de nacimientos del estudio en

función del estado serológico y clínico de las madres. ..............................114

Tabla 21: Modelo final de regresión ajustado para la probabilidad de

seroconversión que tuvieron los terneros en el estudio. ...........................116

Tabla 22: Frecuencia y prevalencia (%) de vacas gestantes y vacías en

función de su estado serológico y clínico frente a la besnoitiosis bovina para

las dos épocas de cubriciones estudiadas. ...............................................122

Tabla 23: Media del IEP en las dos cubriciones a estudio clasificado en función

del estado serológico de las hembras frente a la besnoitiosis bovina. .........123

Tabla 24: Media del IEP en las dos cubriciones a estudio clasificado en

función del estado clínico de las hembras frente a la besnoitiosis bovina. .123

Tabla 25: Fertilidad (%), estado serológico y clínico de los toros antes y después

de la cubrición de primavera de 2010 realizada mediante monta natural........124

Tabla 26: Estimación del porcentaje esperado de animales en fase aguda de

parasitemia para los dos puntos de muestreo establecidos. .....................125

Tabla 27: Características de los animales que resultaron positivos mediante

la técnica de PCR cuantitativa en el muestreo de enero de 2010. .............125

Tabla 28: Características de los animales que resultaron positivos mediante

la técnica de PCR cuantitativa en el muestreo de febrero de 2011. ...........126

Tabla 29: Comparación del diagnóstico molecular (PCR cuantitativa),

microscópico y serológico de la besnoitiosis bovina frente al diagnóstico

clínico. ..................................................................................................127

ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS

Abreviaturas y símbolos

193

13-ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS

ADN: Ácido desoxirribonucleico

ANOVA: Analysis of variance/Análisis de la varianza

ARN: Ácido ribonucleico

AST: Aspartato aminotransaminasa

CITA: Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón

CK: Creatin quinasa

CO2: Dióxido de carbono

Ct: Threshold cycle/Ciclo umbral

DAT: Técnica de aglutinación directa

DMEM: Dulbecco´s Modified Eagle Medium/Modificación del medio Basal

Medium Eagle (BME)

DO: Densidad óptica

DS: Desviación estándar

DSe: Sensibilidad diagnóstica

DSp: Especificidad diagnóstica

EFSA: European Food Safety Authority/Autoridad Europea para la Seguridad

Alimentaria

ELISA: Enzimoinmunoensayo

Et al.: Et alii/y otros

G: Medida del calibre de las agujas

HD: Hospedador(es) definitivo(s)

HI: Hospedador(es) intermediario(s)


194

IA: Incidencia acumulada

IAr: Inseminación artificial

IBR: Rinotraqueitis infecciosa bovina

IC: Intervalo de confianza

IEP: Intervalo(s) entre partos

IFI: Inmunofluorescencia indirecta

Ig: Inmunoglobulina

ITS: Internal transcribed spacer/Espaciador transcribible interno

kDa: Kilodalton(s)

l/m³: Litro(s) por metro cúbito

Log: Logartimo

m: Metro(s)

M: Molar

mg: Miligramo(s)

ml: Mililitro(s)

mm: Milímetro(s)

mM: Milimolar

n: tamaño de la muestra

Nº: Número

nm: Nanómetro(s)

nM: Nanomolar

ºC: Grado(s) Celsius

OIE: World Organisation for Animal Health/Organización Mundial de Sanidad

Animal


195

p: p-valor

PA: Prevalencia aparente

PBS: Phosphate buffered saline/Tampón fosfato salino

PI: Post-infección

PMSF: Phenylmethyl sulfony fluoride/Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (inhibidor

enzimático de proteasas)

PR: Prevalencia real

R²: Coeficiente de determinación

Real-time PCR/qPCR/PCR cuantitativa: Real Time Polymerase Chain

Reaction/Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real

Ref.: Referencia

Rpm: Revoluciones por minuto

S: unidad de Sverdberg

SFB: Suero Fetal Bovino

Sig.: Significación

Spp.: todas las especies individuales dentro de un género

tª: Temperatura

TEM: Microscopio electrónico de transmisión

TI: Tasa de incidencia

TRIS: tris(hidroximetil)aminometano

Tween-20: polisorbato 20

U: Unidad

WB: Western blot o inmunoblot

xg: Unidades de la fuerza de centrifugación relativa (RCF)


196

Y cols.: y colaboradores

μl: Microlitro(s)

µg/ml: Microgramo(s) por mililitro

µm: Micrómetro(s)

μM: Micromolar

% RIPC: Relative index per cent/Porcentaje de índice relativo

%: Porcentaje

≤: Menor o igual que

≥: Mayor o igual que

Besnoitiosis bovina: descripción y análisis de un brote … · Al laboratorio Saluvet de la...

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