Beeinflussung der TNBS-induzierten Colitis im Tiermodell ... · Etwa die Hälfte aller Lymphozyten...

Aus der Medizinischen Klinik 1 der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. med. M. F. Neurath

Beeinflussung der TNBS-induzierten Colitis im Tiermodell durch Modulation des

Cannabinoidsystems

Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde

der Medizinischen Fakultät der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

vorgelegt von Kellermann Carla

aus Cugir (Rumänien)

Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Univ ersität

Erlangen-Nürnberg

Dekan: Prof. Dr. J. Schüttler Referent: Prof. Dr. P. Konturek Korreferent: Prof. Dr. E. G. Hahn Tag der mündlichen Prüfung: 03. August 2011

Meinen Eltern, in Dankbarkeit

Inhaltsverzeichnis 5

Inhaltsverzeichnis

Zusammenfassung .................................... .......................................... 7

Abstract ........................................... ..................................................... 9

1. Einleitung ..................................... ................................................ 11

1.1 Chronisch entzündliche Darmerkrankungen........................... 14

1.1.1 Colitis ulcerosa ............................................................ 17

1.1.2 Morbus Crohn.............................................................. 20

1.1.3 Therapie der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen...................................................... 24

1.2 Zytokine in der Pathogenese der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen................................................................. 26

1.3 Das Endocannabinoid System ............................................... 28

1.4 Die Rolle des Endocannabinoidsystems im Gastrointestinaltrakt................................................................ 32

1.5 Das Modell der TNBS-induzierten murinen Colitis ................. 36

2. Hintergründe und Ziele .......................... ........................................ 37

3. Material und Methoden ........................... ....................................... 39

3.1 Versuchstiere ......................................................................... 39

3.2 Induktion der TNBS Colitis ..................................................... 39

3.3 Therapeutisches Colitis Modell............................................... 40

3.4 Beendigung der Versuche ...................................................... 40

3.5 Darmpräparation und Gewinnung von Gewebematerial......... 41

3.6 Score Systeme ....................................................................... 41

3.7 Histologische Evaluation ........................................................ 44

3.8 Extraktion der Gesamt-RNA ................................................... 44

3.8.1 Substanzen für die RNA-Extraktion ............................. 44

3.8.2 Praktische Durchführung der RNA-Extraktion.............. 44

3.8.3 Quantifizierung der Gesamt-RNA ................................ 45

3.9 Reverse Transkription (RT-PCR) ........................................... 46

3.9.1 Substanzen für die RT-PCR ........................................ 46

3.9.2 Praktische Durchführung der RT-PCR......................... 47

Inhaltsverzeichnis 6

3.10 Konventionelle PCR ............................................................... 47

3.10.1 Substanzen für die konventionelle PCR ...................... 47

3.10.2 Praktische Durchführung der PCR............................... 48

3.11 Gel-Elektrophorese ................................................................ 49

3.12 Statistische Methoden ............................................................ 50

4. Ergebnisse ..................................... ................................................ 51

4.1 Auswirkungen von Anandamid auf die TNBS-induzierte Colitis ..................................................................................... 51

4.1.1 Makroskopische Evaluierung....................................... 51

4.1.2 Histologische Analyse.................................................. 53

4.1.3 RT-PCR Analyse ......................................................... 56

4.2 Experimentelle Colitis in Cannabinoidrezeptor defiziente Mäuse..................................................................................... 58

4.2.1 Makroskopische Evaluierung....................................... 58

4.2.2 Histologische Analyse.................................................. 59

4.2.3 RT-PCR Analyse ......................................................... 63

5. Diskussion ..................................... ................................................ 65

5.1 Zusammenfassung der Ergebnisse........................................ 65

5.1.1 Anandamidapplikation lindert die TNBS-induzierte Colitis........................................................................... 65

5.1.2 CB-Rezeptor defiziente Mäuse entwickeln eine schwerere Colitis ......................................................... 65

5.2 Diskussion .............................................................................. 66

5.2.1 Anandamidapplikation lindert die TNBS-induzierte Colitis........................................................................... 66

5.2.2 CB-Rezeptor defiziente Mäuse entwickeln eine schwerere Colitis ......................................................... 69

5.3 Klinische Relevanz ................................................................. 72

6. Abkürzungsverzeichnis ........................... ...................................... 75

7. Literaturverzeichnis ............................ ........................................... 76

Vorpublikation..................................... ................................................. 82

Danksagung ......................................... ................................................ 83

Zusammenfassung 7

Zusammenfassung

Anfang der 90er Jahre wurde ein neues körpereigenes System ent-

deckt, welches anti-nocizeptive und anti-inflammatorische Eigenschaften

besitzt, das Endocannabinoid System. Bisher sind zwei Endocannabinoid

Rezeptoren bekannt, der CB1- und der CB2-Rezeptor, sowie zwei endo-

gene Liganden, das Anandamid und das 2-Arachidonylglycerol. Beide Re-

zeptoren sind an das Gi/o-Protein gekoppelt und deren Aktivierung bewirkt

eine zelluläre Aktivitätsabnahme. Während sich der CB1-Rezeptor über-

wiegend auf Zellen des zentralen und des peripheren Nervensystems be-

findet, wird der CB2–Rezeptor bevorzugt von Zellen des Immunsystems

exprimiert. Ihm wird eine immunmodulatorische Rolle zugeschrieben.

Ziel dieser Arbeit war es die Effekte des Endocannabinoid Systems auf

die experimentellen TNBS-induzierten Colitis im Tiermodell zu untersu-

chen. Man ist zum einen der Frage nachgegangen, ob durch eine Erhö-

hung des endogenen Cannabinoids Anandamid eine Entzündungslinde-

rung zu erreichen ist. Zum anderen ist der Verlauf der experimentellen Co-

litis in CB-Rezeptor defizienten Mäusen untersucht worden, um eine

eventuelle führende Rolle einer der beiden Rezeptoren im Entzündungs-

geschehen herauszuarbeiten.

Methoden: Die Colitis ist mittels der transrektalen Applikation von 150

µl einer TNBS-Lösung (2, 4, 6-Trinitrobenzen-Sulfonsäure) induziert wor-

den. Die haptenisiernde Substanz ist für diesen Zweck in 50%igem Etha-

nol gelöst worden, dabei erhielten die unterschiedlichen Mäusestämmen,

je nach Suszeptibilität entsprechende TNBS Konzentrationen. In der ers-

ten Versuchsreihe bekamen AKR Mäuse zur Colitisinduktion 5 mg TNBS.

Anschließend wurde einem Teil der AKR Mäusen Anandamid intraperito-

neal injiziert. In der zweiten Versuchsreihe sind C57BL/6 Wildtypmäusen

sowie die drei möglichen CB-Rezeptoren Knockoutvarianten CB1-/-,

CB2-/- und CB1+2-/- verwendet worden. Hier waren 7 mg TNBS zur Coli-

tisinduktion notwendig. In beiden Versuchsreihen erhielten die Kontroll-

tiere nur die Vehikellösung mit 50%igen Ethanol und Wasser transrektal.

Die Versuche wurden 3 Tagen nach der TNBS Applikation beendet. Das

Kolon wurde präpariert und auf makroskopische und histologische Verän-

Zusammenfassung 8

derungen hin mit Hilfe von entsprechenden Scores untersucht. Auf der

molekularen Ebene ist die mRNA-Expression der pro-inflammatorischen

Zytokine TNF-α und IL-1β mittels der konventionellen PCR analysiert wor-

den.

Ergebnisse: in der ersten Versuchsreihe führte die intraperitoneale

Anandamidapplikation zu einer signifikanten Reduktion der Entzündungs-

ausprägung. In der zweiten entwickelten alle CB-Rezeptor Knockout-

stämmen eine signifikant stärkere Colitis verglichen mit den C57BL/6

Wildtypen. Allerdings konnte keine prädominante Rolle einer der beiden

Rezeptoren festgestellt werden.

Zusammengefasst, sind in dieser Studie anti-inflammatorische Effekte

des systemisch applizierten Anandamids bei der TNBS-induzierten Colitis

nachgewiesen worden. Die Tatsache, dass alle Knockout Mäusen eine

verstärkte Colitis entwickelt hatten, spricht für den protektiven Effekt der

CB-Rezeptoren im Entzündungsgeschehen. Hiermit ergibt sich eine be-

rechtigte Hoffnung, dass ein therapeutischer Ansatz, der die Aktivierung

des Endocannabinoid Systems beinhaltet künftig klinisch bei Patienten mit

chronisch entzündlichen Darmerkrankungen genutzt werden kann.

Abstract 9

Abstract

At the beginning of the 90`s a new endogenous system called the En-

docannabinoid System was discovered, which possesses anti-nociceptive

and anti-inflammatory effects. To date, two endocannabinoid receptors are

known, the CB1- and the CB2-receptor, as well as two endogenous ligands

called anandamide and 2-Arachidonylglycerol. Both receptors are coupled

through the Gi/o-protein. Their activation leads to inhibition of cellular ac-

tivity. Whereas CB1-receptors are mostly located on central and peripheral

neurons, CB2-receptors are preferably expressed by cells of the immune

system having immunomodulatory roles.

Aim of this study was to investigate the effects of the endocannabinod

system on the experimentally TNBS-induced colitis in a.murine model.

One aspect was the consideration whether less inflammation can be

evoked by the application of the endogenous ligand anandamide. To fur-

ther characterize the cannabinoid receptors involved in inflammatory proc-

esses we examined the experimental colitis in CB-receptors deficient

mice.

Methods: The colitis was induced by the transrectal application of 150

µl TNBS-solution (2, 4, 6-trinitrobenzene-sulfonic acid). For that the hapte-

nating substance was solved in 50% ethanol. The different strains of mice

were given different concentrations according to their susceptibility. In the

first experiment AKR mice got 5 mg of TNBS for colitis induction.

Following some of the AKR mice were injected anandamide

intraperitonealy. In the second experiment C57BL/6 wild type mice as well

as the three possible knockout types CB1-/-, CB2-/- and CB1+2-/- were

used. In this case 7 mg of TNBS were necessary to induce colitis. In both

experiments the control mice received only 50% ethanol and water

transrectally. The experiments ended 3 days after TNBS application. The

mice colon was dissected and a scoring system was used to describe

macroscopical and histological changes. Messenger RNA-expression of

TNF-α and IL-1β as pro-inflammatory markers was measured by

conventional PCR.

Abstract 10

Results: In the first experiment intraperitoneally administered anan-

damide significantly reduced inflammation occurance. In the second series

of experiments all three knockout strains showed increased susceptibility

to TNBS colitis in comparison to the C57BL/6 wild type animals. However

a predominant role of one of the both cannabinoid receptors couldn’t be

assessed.

Summarized, in this study anti-inflammatory effects of systemically ad-

ministered anandamide on the TNBS-induced colitis were demonstrated.

The fact, that all knockout mice developed aggravated colitis shows pro-

tective effects of CB-receptors in inflammation occurrence. Therefore

modulation of the endocannabinoid system might be a significant option to

treat patients suffering from chronic inflammatory diseases of the colon.

Einleitung

11

1. Einleitung

Das intestinale Verdauungssystem stellt vom Magenausgang bis zum

After einen etwa 5-6 m langen Nahrungstransportschlauch dar. Dieser be-

ginnt mit dem Duodenum und setzt sich als Jejunum und Ileum fort. Die

drei Abschnitte bilden den etwa 3-4 m langen Dünndarm. Im rechten Un-

terbauch beginnt an der Ileo-coecal-Klappe der etwa 1,2-1,5 m lange

Dickdarm, welcher anatomisch in vier Abschnitte unterteilt wird: Colon as-

cendens (der aufsteigende Teil), Colon transversum (der querverlaufende

Teil), Colon descendens (der absteigende Teil) und Colon sigmoideum

(das Sigma). Im Bereich des kleinen Beckens folgt nun auf das Kolon das

Rektum (Enddarm), welches 12 bis 15 cm lang ist und in dem Canalis

analis (Afterkanal) mündet.

Durch seinen anatomischen Aufbau aus makroskopisch erkennbaren,

ca. 1cm hohen Falten von Mukosa und Submukosa, mikroskopisch sicht-

baren Zottenfaltung des Epithels und den fingerartigen Ausstülpungen der

Epithelzellen (Mikrovilli) besitzt der Darm eine Oberfläche von ca. 200 m²

[Deetjen, Physiologie (2005)]. Dabei ergeben vor allem die mikroskopi-

schen Faltungen die effektivste Oberflächenvergrößerung. Diese enorme

Fläche macht durchaus Sinn, wenn man die Hauptaufgaben bedenkt

nämlich die Verdauung und Absorption großer Mengen von Nahrungs-

stoffen. Gleichzeitig ist das Darmepithel eine hochselektive Barriere zwi-

schen Körperaußenseite und Körperinnerem. Im Kolon befindet sich zu-

dem die Darmflora. Diese besteht aus der beachtlichen Zahl von 13 1510 10− Bakterien, der etwa 7500 verschiedenen Spezies angehören

[Vijay-Kumar et al. (2008)]. Die meisten sind anaerobe Keime wie Escheri-

chia coli (E.coli), Bacteroides und Enterokokken [Deetjen (2005)].

Somit stellt die Darmschleimhaut eine besondere Grenzfläche für die

Auseinandersetzung des Wirtes mit seiner Umwelt dar und besitzt neben

einer physikalisch-chemischen Barriere bestehend aus Tight junctions

zwischen den Enterozyten sowie epitheliale Sekretionsprodukte, wie Mu-

zine, ein leistungsfähiges, spezialisiertes Immunabwehrsystem [Hoffmann,

Chronisch entzündliche Darmerkrankungen (2004)]. An dieser Stelle sollte

Einleitung

12

erwähnt werden, dass man zwischen angeborenem und adaptiertem oder

erworbenem Immunsystem unterscheidet.

Zu der angeborenen Immunabwehr des Darmes gehören zum einen die

Epithelzellen selber, vor allem die so genannten Paneth-Zellen, die De-

fensine, bestimmte anti-mikrobielle Peptide, produzieren [Strober et al.

(2007)]. Zum anderen werden noch die natürlichen Killerzellen (NK) und

Phagozyten wie Makrophagen und neutrophile Granulozyten dazugezählt.

Die adaptive/erworbene Immunantwort erfolgt durch Zellen, die als Gut

Associated Lymphoreticular Tissue (=GALT) organisiert sind. Zu den

lymphatischen Geweben des GALT gehören die mesenterialen Lymph-

knoten, die Payer’schen Plaques des Dünndarms, die sich direkt unter

dem Epithel befinden und die Lymphfollikel des Kolons [Hoffmann (2004)].

Die Immunzellen, um die es sich hier handelt, sind antigenpräsentiernde

dendritische Zellen, CD4-T-Helferlymphozyten, zytotoxische CD8-T-Lym-

phozyten und B-Lymphozyten, die vor allem IgA Antikörper sezernieren.

Etwa die Hälfte aller Lymphozyten und ca. 75% aller antikörperprodu-

ziernden Immunozyten des gesunden Organismus befinden sich in der

Darmmukosa [Deetjen (2005), Hoffmann (2004)]. Damit gilt das Intestinum

als das größte Immunorgan.

Die Anforderungen an das intestinale Immunsystem sind immens: Es

soll einerseits auf krankmachende Antigene im Darmlumen mit entspre-

chenden Antikörpern oder zellulären Immunreaktionen so antworten, dass

keine systemische Entzündung im Organismus entsteht. Andererseits

muss es gegenüber Antigenen der natürlichen Darmflora und der Nahrung

weniger reagierfreudig sein.

In diesem Sinne muss das Immunsystem eine gewisse Hyporeaktivität

aufweisen, die sicherstellt, dass „die permanente physiologische Antigen-

präsentation nicht zu einer lokalen Immunantwort mit dem Ergebnis der

Darmentzündung führt“ [Hoffmann (2004)]. Dieser Mechanismus ist als

komplexe Interaktion zwischen der humoralen und zellulären Abwehr zu

verstehen und scheint auf aktiver Hemmung der Entzündungszellen zu be-

ruhen.

Vor allem die Darmflora scheint als antigener Stimulus für eine kontrol-

lierte physiologische Entzündung der Mukosa zu fungieren [Danese et al.

Einleitung

13

(2006)] und die Homöostase des intestinalen Immunsystems zu unterstüt-

zen.

Bestimmte bakterielle Oberflächenstrukturen, so genannte Lipopoly-

saccharide (LPS), auf allen gramnegativen Bakterien, und Teichonsäuren

auf grampositiven Keimen werden mittels Toll-Like-Rezeptoren (TLR) vom

Typ 2 oder 4 (TLR2 / TLR4) von der angeborenen Immunabwehr erkannt

und den Lymphozyten der spezifischen Abwehr präsentiert. Diese werden

allerdings über komplizierte Mechanismen und spezifische Mediatoren

(z.B. anti-inflammatorische Interleukine) gehemmt, so dass die kontrol-

lierte physiologische Entzündung lokal begrenzt bleibt [Hoffmann (2004)]

Von der Hyporeaktivität ist die orale Toleranz abzugrenzen. Diese be-

schreibt das Ausbleiben einer Immunantwort auf ein orales Antigen. Hier

spielen vor allem die Nahrungsantigene eine Rolle, die für den Organis-

mus keine potentielle Gefahr darstellen. Die Entzündungszellen scheinen

ihnen gegenüber eine passive Toleranz zu besitzen. Aber damit die

gastrointesinale Antigenprozessierung funktioniert und es zu einer oralen

Toleranzinduktion kommt, bedarf es der Integrität der mukosalen Barriere

[Hoffmann (2004)].

Folglich führen Störungen in der Homöostase des Immunsystems oder

der Zusammenbruch der Schleimhautbarriere zu einer Entzündung. Diese

kann akut auftreten und wieder vergehen oder persistieren und chronisch

werden. Deswegen werden im Folgenden die chronisch entzündlichen

Darmerkrankungen, ihre Ursachen, Symptomen und Therapieoptionen

dargestellt.

Einleitung

14

1.1 Chronisch entzündliche Darmerkrankungen

Unter einer Entzündung versteht man per definitionem den Abwehrme-

chanismus des Organismus gegen eine mechanische, chemische oder

physikalische Noxe [Bühling, Intensivkurs Allgemeine und spezielle Pa-

thologie (2004)]. Diese kann entweder exogener (z.B. Bakterien, Viren)

oder endogener (eigenes Gewebe, im Sinne einer Autoimmunerkrankung)

Natur sein. Dem Organismus steht zur Abwehr ein humorales (Komple-

mentsystem, Antikörper) sowie ein zelluläres (Leukozyten) System zur

Verfügung. Die klinischen Zeichen einer Entzündung sind: Calor (Wärme)

- Rubor (Rötung), beides sind Zeichen der erhöhten Durchblutung - Tumor

(Schwellung, ödematöse Aufquellung) - Dolor (Schmerz, durch die Frei-

setzung von Entzündungsmediatoren) - Functio lesa (eingeschränkte

Funktion des betroffenen Organs). Nach dem zeitlich-klinischen Verlauf

wird eine Entzündung von akut bis chronisch eingeteilt.

Die chronische Entzündung geht dabei aus der akuten Form hervor,

verläuft schubweise und heilt üblicherweise nicht mehr ab [Bühling

(2004)].

Zu den chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) werden die

zwei große Entitäten der Morbus Crohn (MC) und die Colitis Ulcerosa

(CU) gezählt. Eine dritte Form, die weder zum Morbus Crohn noch zur Co-

litis Ulcerosa zugeordnet werden kann, nennt man Colitis indeterminata.

Über die Ätiologie der CED weiß man trotz des Fortschritts der letzten

Jahrzehnte immer noch recht wenig. Sowohl Podolsky (2002) als auch

Danese et al. (2006) definieren die CED als das Resultat einer inadequa-

ten und ständigen Aktivierung des Immunsystems in der Darmmukosa.

Diese abweichende Immunantwort beruht auf einer genetischen Disposi-

tion und ist als Ergebnis einer komplexen Interaktion zwischen Umwelt-

faktoren, Darmflora und dem intestinalen Immunsystem anzusehen.

Eine Reihe von Umweltrisikofaktoren wie geographische Lage, sozialer

Status, Stress, Rauchen, verschiedene Medikamente und vieles mehr

werden für das Auftreten von chronisch entzündlichen Erkrankungen ver-

antwortlich gemacht.

Einleitung

15

Danese et al. (2006) postulieren eine „Hygienehypothese“, mit der sie

die hohe Inzidenzrate der CED in Nordwesteuropa und Nordamerika erklä-

ren. In diesen Zusammenhang sehen sie das vermehrte Auftauchen von

chronischen Autoimmunerkrankungen (Allergien und CED inbegriffen) mit

dem sozialen Status und wirtschaftlichen Fortschritt verbunden.

Unter dem Risikofaktor Medikamente werden von den erwähnten Auto-

ren die oralen Kontrazeptiva (Frauen, die die Antibaby-Pille nehmen ha-

ben ein zweifach höheres Risiko an CED zu erkranken) und die nichtste-

roidalen Antiphlogistika (z.B. Ibuprofen, Diclofenac) aufgezählt.

Bei Rauchern wird eine geringere Prävalenz der CU beobachtet, hinge-

gen ist das Auftreten des MC bei Rauchern erhöht. Zudem treten bei Pati-

enten mit MC häufiger schwere Schübe auf [Danese et al. (2006), Herold

(2007)].

Eine weitere Hypothese zur Entstehung von CED beruht auf einer ge-

störten funktionellen Integrität des intestinalen Immunsystems [Strober et

al. (2007), Danese et al. (2006), Bouma et al. (2003)]. In diesem Fall ge-

hen die Autoren davon aus, dass die immunologische Toleranz gegenüber

den gewöhnlichen Antigenen der Darmflora nicht mehr gegeben ist. Die

Ursache liegt entweder an einer vermehrten Expression von TLR 2 und

TLR 4 auf Immunozyten der angeborenen Abwehr, welche zu einer stärke-

ren Aktivierung der Zellen führt, die dadurch mehr pro-inflammatorische

Zytokine produzieren oder an einer Imbalance zwischen effektorischen

(oder Helfer-) T-Lymphozyten und Suppressor-T-Lymphozyten [Danese et

al. (2006), Strober et al. (2007), Bouma et al. (2003) ] (Abb.1 ).

Einleitung

16

Abbildung 1 Links liegt eine Überaktivität der Th1- bzw. Th2-Lymphozyten (rot) bei

normaler Aktivität der Suppressor-T-Zellen vor (blau). Rechts sind die Suppressor-T-Lymphozyten vermindert bei normaler Aktivität der Th1-/Th2-Lymphozyten. [nach Bouma et al. (2003)]

Eine weitere Rolle wird den kommensalen Darmbakterien zugeschrie-

ben. Studien mit Tiermodellen für CED zeigen, dass das Vorhandensein

einer Darmflora für die Entwicklung oder die Aufrechterhaltung einer Coli-

tis durchaus wichtig ist. So entwickelten Tiere, die in einer keimfreien Um-

welt aufgezogen wurden, im Gegensatz zu den Tieren aus der konventio-

nellen Aufzucht, keine Darmentzündung [Danese et al. (2006) , Bouma et

al. (2003)].

Weiterhin wird auch der Verlust der Integrität der Schleimhautbarriere

diskutiert. Eine verminderte Defensinproduktion kann zur vermehrten Ko-

lonisation mit Keimen führen, die wiederum eine verstärkte Immunantwort

zur Folge hat [Strober et al. (2007)].

Die Abbildung 2 stellt die bisher beschriebenen allgemeinen Erklä-

rungsansätze zur Pathogenese der CED dar:

Einleitung

17

Abbildung 2 Die spezielle Architektur des Epithels mit Tight Junctions, die von den

Becherzellen produzierte Mucin-Glycoproteine und die Defensine der Paneth-Zellen bil-den eine effektive Barriere gegen luminale Agenzien (kleines Bild, links). Die Integrität des Epithels kann gestört werden durch genetische Variationen in Schlüsselstrukturen, durch verminderte Reparaturvorgänge nach Verletzung oder durch exogene Noxen. Eine chronische Entzündung kann aus der Stimulation des intestinalen Immunsystems durch Antigene der commensalen Keime resultieren. (Nahrungsantigene können auch dazu beitragen.) Die Bakterien penetrieren die Mukosabarriere und aktivieren so direkt anti-genpräsentierende Zellen, wie dendritische Zellen was zu einer klassischen Immunant-wort führt. Alternativ, stimulieren Bakterien die Epithelzellen, die ihrerseits Zytokine und Chemokine produzieren und dadurch weitere Immunozyten anlocken und aktivieren. Die antigenpräsentiernden dendritische Zellen führen zu einer Differenzierung von Th1-Lym-phozyten im Falle von Morbus Crohn (wie hier dargestellt) oder von Th2-Lymphozyten bei Colitis ulcerosa. In einem selbst unterhaltenden Zyklus stimulieren sich nun Th1-Zellen und Makrophagen gegenseitig. Dabei produzieren und sezernieren Makrophagen pro-inflammatorische Zytokine, wie Interleukin-1, Inteleukin-6 und Tumor nekrose Faktor alpha. [nach Podolsky (2002)]

Da sich die Pathogenese, Klinik und Therapie des Morbus Crohn und

der Colitis ulcerosa im Detail unterscheiden, werden diese getrennt be-

handelt.

1.1.1 Colitis Ulcerosa

Laut der „Leitlinie der deutschen Gesellschaft für Verdauungs- und

Stoffwechselerkrankungen“ [AWMF.de] liegt die Inzidenz der Colitis ulce-

rosa in Deutschland bei 6/100.000 Einwohner pro Jahr. Daraus errechnet

sich eine Prävalenz von ca. 2,1/1000 Einwohner, was eine Zahl von

168.000 Betroffenen ergibt. Der Häufigkeitsgipfel der Erkrankung liegt bei

Einleitung

18

den 20 bis 40jährigen [Herold, Innere Medizin (2007)] und somit befinden

sich die meisten Betroffenen im beruflichen Leben.

Die genaue Ätiologie der CU ist unbekannt. Ein Suszeptibilitätsgen

wurde von Fisher et al. im Jahr 2008 beschrieben. Die Gruppe konnte eine

Assoziation zwischen der CU und dem ECM1-Locus auf dem Chromosom

1q21.2 (lies: Chromosom 1, langer Arm = q, Region 2, Bande 1 und Sub-

bande 2) zeigen. ECM1 kodiert für das extrazelluläre Matrixprotein 1, ein

Glycoprotein, das sowohl im Dünn- als auch im Dickdarm vorkommt, mit

der Basalmembran interagiert und ein Enzym namens Metalloproteinase-9

hemmt. Zudem ist ECM1 bei der Zellproliferation und Differenzierung so-

wie Angiogenese beteiligt und kann proinflammatorische Zytokine aktivie-

ren [Fisher et al. (2008)].

Die meisten Risikofaktoren und pathogenetische Ansatzpunkte sind

weiter oben besprochen worden. Klinische und tierexperimentelle Studien

weisen darauf hin, dass die Helfer-T-Lymphozyten vom Typ 2 (Th2) eine

Hauptrolle in der Pathologie der CU spielen [Bouma et al. (2003), Po-

dolsky (2002)]. Die Effektorzelle Th2 sezerniert Cytokine wie Interleukin-4

und -5 und TGF-β (Tissue growth factor). Außerdem aktivieren Th2-Lym-

phozyten die B-Zellen, die Immunglobuline wie pANCA (=antineutrophiler

cytoplasmatischer Antikörper mit perinukleärem Immunfloureszenzmuster)

und Anti-Tropomyosin- Antikörper, was die Autoimmunerkrankung unter-

hält [Bouma et al. (2003)].

Die Erkrankung beginnt stets distal im Rektum und breitet sich konti-

nuierlich nach proximal im Kolon aus (Abb.3). Dabei werden die Kolonab-

schnitte unterschiedlich befallen: das Rektum ist stets betroffen, nur Rek-

tum und Sigma in 50%, eine linksseitige Colitis kommt in 25% und eine

Pancolitis ebenfalls in 25% der Fälle vor [Herold (2007)]. Die CU ist zudem

häufig mit einer primär sklerosierenden Cholangitis (PSC) assoziiert. Etwa

zwei Drittel der Patienten mit PSC haben gleichzeitig eine CU [Bühling

(2004)].

Einleitung

19

Abbildung 3 Entzündungsausdehnung bei Colitis ulcerosa von distal nach

proximal [Kompetenznetz-CED.de]

Das morphologische Bild erlaubt die Einteilung in zwei Stadien: ein

Frühstadium oder frisches Stadium und ein Spätstadium oder chronisch-

fortgeschrittenes Stadium. Ersteres ist charakterisiert durch eine entzünd-

lich gerötete und ödematös geschwollene Schleimhaut, die bei Kontakt

leicht blutet. Man sieht zudem kleine Mukosaulzerationen mit Fibrinbelä-

gen. Histologisch dominieren so genannte Kryptenabszesse, d.h. Granu-

lozyteninfiltrationen mit Anhäufung in den Krypten der Schleimhaut

(Abb. 4).

Im Spätstadium führen rezidivierende Ulzerationen zur Mukosazerstö-

rung mit Verlust des normalen Faltenreliefs. Eine überschießende Rege-

neration der restlichen Schleimhautinseln führt zur Bildung von Pseudo-

polypen.

Histologisch zeigen sich vermehrt Lymphozyten und Histiozyten und

eine Mukosaatrophie mit stark reduzierter Becherzellzahl.

Die Patienten berichten über blutig-schleimige Durchfälle mit unter-

schiedlicher Frequenz (von 3-4mal pro Tag bis hin zu Stuhlentleerungen

im Abstand von 1 bis 2 Stunden, was einer Frequenz von etwa 20mal pro

Tag entspricht) [Hoffmann (2004)]. Zudem klagen sie über Abdominal-

schmerzen, die zum Teil krampfartig vor der Defäkation auftreten.

Gefürchtet wird vor allem die Tumorentstehung auf dem Boden einer

Dysplasie-Karzinom-Sequenz. Das Karzinomrisiko korreliert dabei mit dem

Ausmaß der Kolonbeteiligung und der Dauer der Erkrankung. Das kumu-

Einleitung

20

lative Risiko beträgt nach 20 Jahren 8% und nach 30 Jahren 18% [Herold

(2007)].

Extraintestinale Symptome, wie Haut-, Augen-, und Gelenkbeteiligun-

gen treten bei der CU seltener auf als beim M, Crohn [Herold (2007)].

Abbildung 4 Links : ein lichtmikroskopisches Bild einer Biopsie von einem Patienten mit Morbus

Crohn. Man erkennt, dass sich die Entzündung über die gesamte Darmwand erstreckt, unterhalb der Muscularis befinden sich Granulome.

Rechts : Übersichtvergrößerung eines Präparates von einem Patienten mit Colitis ul-cerosa. Man erkennt die Entzündung der Mukosa und Erosionen. Bei höherer Vergröße-rung würde man zusätzlich die Entzündungszellen sehen. [nach Bouma et al. (2003)]

1.1.2 Morbus Crohn

Die Inzidenz für den M. Crohn liegt in Deutschland derzeit bei

5,2/100.000 Einwohner pro Jahr. Die Prävalenz wird mit 120 bis 200 pro

100.000 angegeben [AWMF.de]. Laut der Statistik des „Kompetenznetzes

für chronisch entzündliche Darmerkrankungen“ sind zurzeit etwa 300.000

Menschen in Deutschland an einer Form der CED erkrankt. Wenn man

davon die an Colitis ulcerosa Leidende abzieht, so erkennt man, dass

etwa 130.000 vom Morbus Crohn betroffen sind. Der Häufigkeitsgipfel liegt

ebenfalls zwischen dem 20. und 40. Lebensjahr.

Ähnlich wie bei der Colitis ist auch für den MC die Ätiologie unbekannt.

Die allgemein vermuteten Pathomechanismen sind weiter oben schon be-

schrieben worden (siehe dazu auch die Abbildungen 1 und 2).

Während des letzten Jahrzehnts wurde mithilfe der Microsatelliten-DNA

eine Reihe von Genloci entdeckt, die die genetische Prädisposition für den

Morbus Crohn belegen.

Einleitung

21

So hat man bei MC-Patienten ein Susceptibilitätsgen auf dem Chromo-

som 16 gefunden, dass man IBD1 (inflammatory bowel disease = engl. für

CED) nannte [Strober et al. (2007), Bouma et al. (2003), Podolsky (2002)].

Die genaue Nomenklatur des Genlocus lautet 16q12 (lies: Chromosom 16,

langer Arm = q, Region 1, Bande 2) [Strober et al. (2007)]. Dieses Gen

kodiert ein cytoplasmatisches Protein, das man als NOD2 oder CARD15

(für: Caspase activation and recruitment domain 15) kennt. Das Protein

NOD2/CARD15 wird in Makrophagen [Podolsky (2002)] und anderen anti-

genpräsentierenden Zellen [Strober et al. (2007)] exprimiert und spielt eine

Rolle bei der Erkennung von LPS, bei der Aktivierung des nukleären Fak-

tors κB (=NF-κB), welches eine Hauptfigur bei Entzündungsreaktionen

darstellt (Abb. 5) und ebenso bei der Regulierung der Apoptose (kontrol-

lierter Zelltod) [Strober et al. (2007), Bouma et al. (2003), Podolsky

(2002)]. Überraschenderweise führen aber Mutationen im NOD2-Gen eher

zu einer reduzierten Aktivität der Makrophagen. Wie kann man sich also

die Entzündung erklären? Strober et al. (2007) vermuten zum einen eine

NOD2 unabhängige Aktivierung des NF-κB und zum anderen erlauben

Einschränkungen der Immunabwehr eine stärkere Kolonisierung der

Darmwand mit Bakterien, welche über andere Mechanismen ebenfalls

eine Entzündung auslöst.

Ca. 50% der Crohn-Patienten besitzen Mutationen des NOD2/

CARD15-Gens. Die Hauptmutationen sind Arg702Trp, Gly908Arg und die

Frameshift-Mutation Leu1007. Heterozygote Träger haben ein etwa 2fach

höheres Risiko zu erkranken. Im Vergleich dazu besitzen homozygote

Träger ein 40fach höheres Risiko [Strober et al. (2007)].

Bekannt ist weiterhin, dass im Entzündungsmechanismus des Morbus

Crohn die TH1-Lymphozyten eine dominierende Rolle einnehmen (Abb. 2)

[Bouma et al. (2003), Podolsky (2002)]. Diese sezernieren vor allem

Zytokine wie Interleukin 12, Interferon γ und Tumor-Nekrose-Faktor α.

Dadurch werden andere Immunozyten aktiviert und der Entzündungs-

vorgang wird aufrechterhalten.

Einleitung

22

Abbildung 5 Die Aktivierung des regulatorischen Transkriptionsfaktors NF-κB ist

wichtig für die Produktion verschiedener pro-inflammatorischer Mediatoren. Zudem wird der Weg des programmierten Zelltodes (=Apoptose) gestoppt. NF-κB kann auf verschie-dene Weisen aktiviert werden: Zytokine wie IL-1 oder TNF-α können durch die Bindung an ihren Rezeptoren die NIK (=NF-κB-induzierende Kinase) oder die MEKK1 bzw.3 (=Mitose aktivierende Proteinkinasen 1 und 3) stimuliern oder mittels direkter Bindung an das inhibitorische κB-Kinase-Komplex IKK zu einer Dissoziation des NF-κB führen. Der Inhibitor IκB wird dabei phosphoryliert und abgebaut. Toll-like-Rezeptoren genauso wie NOD2 können ebenfalls nach Bindung von LPS eine Dissoziation bewirken. NF-κB wan-dert schließlich in den Zellkern, wo er als Transkriptionsfaktor für Entzündungsmediatoren fungiert. (MyD88= myeloid differentiation factor 88) [nach Podolsky (2002)]

Der Morbus Crohn kann sich im Gegensatz zur Colitis ulcerosa im ge-

samten Gastrointestinaltrakt (Abb. 6) manifestieren. Die Entzündung tritt

diskontinuierlich segmental auf und kann auch die tiefen Wandschichten

mit einbeziehen. Die häufigste Lokalisation ist jedoch das terminale Ileum

(=Ileitis terminalis) und das proximale Kolon. Dabei befindet sich ein iso-

lierter Ileumbefall in 30% und nur Kolon in 25% der Fälle. Ileum und Kolon

zusammen sind in 45% der Fälle betroffen.

Einleitung

23

Abbildung 6 Diskontinuierliche Entzündungsausdehnung beim Morbus Crohn [Kompetenznetz-CED.de]

Makroskopisch erkennt man eine transmurale Entzündung der seg-

mental betroffenen Darmabschnitte. Die Darmwand ist ödematös und

fibrotisch verdickt, wodurch sich segmental Stenosen ausbilden. Typisch

ist vor allem das Pflastersteinrelief (Abb. 7). Durch die lymphofollikuläre

Hyperplasie entsteht ein „Gänsehautaspekt“ [Herold (2007)].

Abbildung 7 Endoskopische Aufnahmen [Kompetenznetz-CED.de] Links: Gesunder Darm. Rechts: Pflastersteinrelief bei M. Crohn und typische Schneckenspurulzera

Histologisch dominieren in 40% der Fälle Epitheloidzellgranulome und

mehrkernige Riesenzellen (vgl. Abb.4) [Herold (2007)]. Die Granulome be-

sitzen keine zentrale Nekrose und setzen sich aus Histiozyten, Lympho-

zyten und eosinophilen Granulozyten zusammen [Bühling (2004)].

Die Patienten berichten über Gewichtsverlust und eventuell Fieber, sie

klagen über Abdominalschmerzen und Durchfälle (meist ohne Blutbei-

mengung) allerdings mit einer niedrigeren Frequenz als bei der CU [Hoff-

Einleitung

24

mann (2004)]. Die Symptome ähneln denen einer Appendicitis: kolikartige

Schmerzen im rechten Unterbauch und unter Umständen ist eine druck-

schmerzhafte Resistenz zu tasten (Konglomerattumor, durch miteinander

verklebte Darmabschnitte). Typisch ist auch eine Neigung zur Bildung von

aphtenähnlichen Geschwüren, Fisteln (in 40% d. F.) und anorektalen Abs-

zesse (in 25% d. F.) [Herold (2007)].

Häufiger als bei der CU findet sich ein extraintestinaler Befall. Dies be-

trifft die Haut (Zinkmangeldermatosen, Erythema nodosum, Aphten), die

Augen (in 7% d. F.: Episkleritis, Iritis, Uveitis) und die Gelenke (Arthritis in

25% d. F.).

1.1.3 Therapie der chronisch entzündlichen Darmerkr ankungen

Weder für die Colitis ulcerosa noch für den Morbus Crohn existieren

kausale Therapieansätze. Mittels Optionen empirischer Natur versucht

man durch Verringerung der Entzündungsaktivität die klinische Sympto-

matik möglichst langfristig zu verbessern, die Lebensqualität des Patienten

zu steigern und einen Verlust der Darmfunktion zu verhindern [AWMF.de].

In erster Linie wird eine konservative Therapie durchgeführt. Diese

beinhaltet neben den antiinflammatorischen und immunsuppressiven

Pharmaka auch Diäten, z.B. ballaststofffreie Kost im akuten Schub oder

Probiotika.

Die Colitis ulcerosa wird, laut den Leitlinien der deutschen Gesellschaft

für Verdauungs- und Stoffwechselerkrankungen, der Aktivität der Erkran-

kung entsprechend behandelt.

Bei leichten bis mittelschweren Schüben genügt in der Regel die lokale

Applikation von Aminosalizylate (Mesalazin, 5-ASA). Beim Nichtanspre-

chen auf einer Kombinationstherapie (oral und rektal) mit Aminosalizylate

sollen zusätzlich Steroide (NF-κB-Antagonisten) lokal als Klysma verwen-

det werden. Der schwere Schub hingegen wird mit oralen systemisch

wirksamen Steroiden in Kombination mit lokalen Aminosalizylate behan-

delt. Beim chronisch aktiven Verlauf und zur Remissionserhaltung nach

dem Abklingen des akuten Schubes besteht die Möglichkeit einer stärke-

Einleitung

25

ren immunsuppressiven Therapie mit Azathioprin (falscher DNS-Baustein),

um eine langfristige Einnahme von systemischen Cortisonpräparaten, auf-

grund der Nebenwirkungen zu vermeiden.

Eine weitere Therapieoption ist die chirurgische Intervention, da die CU

in der Regel auf das Kolon beschränkt bleibt. Die Kolektomie kommt beim

therapierefrakteren Verlauf in Frage. Absolute Operationsindikationen

stellen Komplikationen (toxisches Megakolon) und das Auftreten eines

kolorektalen Karzinoms im Rahmen der CU dar.

Beim Morbus Crohn sind die Aminosalizylate weniger wirksam. Bei

leichter und örtlich begrenzter Entzündungsaktivität genügen lokalwirk-

same Steroide (Budesonid). Im Falle einer mittleren oder hohen Aktivität

sind die systemisch wirksamen Cortisonpräparate die Mittel der Wahl. Bei

steroidrefraktären Verläufen und ebenfalls zur Remissionserhaltung wird

das Immunsupperessivum Azathioprin oder Methotrexat (Fölsäure-Anti-

metabolit), bei Unverträglichkeiten des ersteren eingesetzt.

Neuere Therapieansätze sind die so genannten Biologika. Diese sind

TNF-α Antikörper meist chimärer oder humaner Natur. Für den Morbus

Crohn sind zurzeit Infliximab, ein chimärer (humane und murine Anteile)

Antikörper und Adalimumab, ein humaner Antikörper zugelassen. Da

diese zum Teil schwerwiegenden Nebenwirkungen verursachen, wie die

Reaktivierung latenter Erkrankungen (z.B. Tuberkulose) werden sie als

Reservemittel eingesetzt. Das heißt, erst beim Versagen der Steroid- oder

der Azathioprintherapie [AWMF.de].

Chirurgische Interventionen kommen beim Morbus Crohn erst beim

Auftreten von Komplikationen (Stenosen, Perforationen, Abszessen, Fis-

teln) in Betracht.

Einleitung

26

1.2. Zytokine in der Pathogenese der chronisch entz ündlichen Darm-

erkrankungen

Zytokine werden von den meisten Körperzellen nach Stimulation syn-

thetisiert und sezerniert. Sie wirken in der Regel lokal über Oberflächenre-

zeptoren und aktivieren Signaltransduktionskaskaden, die zu veränderter

Genexpression, Stoffwechselaktivität, Zelldifferenzierung, Proliferation,

Migration und Apoptose führen können [Löffler, Biochemie & Pathobio-

chemie (2003)].

Im Darm sind es vor allem Lymphozyten (Th1 und Th2), Monozyten,

Makrophagen, Granulozyten, Epithelzellen, Endothelzellen und

Fibroblasten, die Zytokine produzieren [Rogler et al. (1998)]. Nach ihren

biologischen Funktionen werden sie in Wachstumsfaktoren, Interleukine,

Interferone und Chemokine, sowie als pro- oder anti-inflammatorisch ein-

geteilt.

In der Pathogenese der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

scheint ein gewisses Ungleichgewicht zwischen anti- und pro-inflammato-

rische Interleukine ein Hauptfaktor zu sein. Die Interleukine sind Peptid-

hormone und funktionell eine sehr heterogene Gruppe. Bis heute kennt

man etwa 23 verschiedene, die entweder anti- oder pro-entzündliche Wir-

kung besitzen [Löffler (2003)]. Zu den letzteren gehören das Interleukin-1

und der Tumor-Nekrose-Faktor-α, welche im Folgendem genauer be-

schrieben werden.

Die Interleukin-1 Familie ist komplex aufgebaut. Zu ihr gehören das

Zytokin Interleukin-1 (IL-1), vorkommend in zwei Isoformen, IL-1α und IL-

1β, die sich in Ihren biologischen Wirkungen kaum unterscheiden [Löffler

(2003), Dinarello (1994)], aus einem IL-1 Antagonisten, welcher die

Wirkung der ersteren abschwächt und aus zwei Interleukin-Rezeptortypen

I und II [Rogler et al. (1998), Dinarello (1994)]. Der genetische Code für

die gesamte Familie befindet sich auf Chromosom 2 [Dinarello (1994)].

Das IL-1α wird direkt als aktives Peptid sezerniert, während das inak-

tive Vorläufer proIL-1β mittels eines Interleukin-1β-converting Enzyms erst

zum IL-1β aktiviert werden muss [Dinarello, (1994)].

Einleitung

27

IL-1α/ IL-1β wirken am Interleukin-Rezeptor Typ I (IL-Ra I), welcher

konstitutiv auf den meisten Zellen exprimiert wird. Nach Ligandenbindung

und Oligomerisierung des Rezeptors werden verschiedene Signalmoleküle

rekrutiert [Löffler (2003)]. Am Ende der Kaskade liegt die Aktivierung des

Transkriptionsfaktors NF-κB (der Signalweg ist in der Abb. 5 dargestellt).

Die Folge ist die Transkription wichtiger pro-inflammatorischer Zielgene

[Löffler (2003)]. Diese kodieren für andere Zytokine wie Interleukin-6 und

Interferon-γ, für iNOS (=inducible nitric oxide synthase), für die Phospholi-

pase A2 und die Cyclooxygenase 2. Letzteren sind Enzyme aus der

Prostaglandinsynthese.

Der Rezeptortyp II ist ein löslicher Rezeptor, welcher IL-1β bindet und

dessen Wirkung antagonisiert [Dinarello (1994)]. Da die Hemmmechanis-

men vor allem auf das IL-1β abzielen, vermutete Dinarello (1994), dass

dieses eine relevante Rolle bei Entzündungssituationen spielt. In der Tat

hat man wie im Falle der CED, eine höhere Konzentration an aktivem IL-

1β gefunden [Rogler (1998)]. Hier wird es von Makrophagen in der ent-

zündeten Mukosa produziert, während der IL-Ra I hauptsächlich auf

Darmepithelzellen exprimiert wird.

Der Tumor-Nekrose-Faktor α (TNF-α) ist ein wichtiger Mediator im

Rahmen der chronisch entzündlichen Erkrankungen und teilt sich viele

Aufgaben mit dem oben beschriebenen IL-1β [Rogler (1998)].

So ist TNF-α ein sehr wirksames Zytokin, welches Fieber hervorruft

(= Pyrogen) und in hohen Konzentrationen sogar zum septischen Schock

führen kann.

Der TNF existiert in einer Membran-gebundenen sowie in einer lösli-

chen Form. Das Enzym TNF-α-converting-enzyme (TACE) überführt den

Membran-gebundenen Liganden in die lösliche Form [Löffler (2003)].

Es existieren zudem zwei TNF-Rezeptoren Typ I und Typ II. Während

der lösliche TNF ausschließlich über den TNF-Rezeptor Typ I wirkt, kann

der gebundene TNF beide Rezeptorkomplexe stimulieren. Ähnlich wie in

der IL-1-Signaltransduktion ist der TNF-Rezeptor I in der Lage NF-κB zu

aktivieren (s.Abb.5).

Einleitung

28

Im Kontrast dazu, kann er auch nach Ligandenbindung bestimmte Ef-

fektorproteine, die so genannte „death-domains“ enthalten, rekrutieren und

den programmierten Zelltod, die Apoptose induzieren[Löffler (2003)].

1.3 Das Endocannabinoid System

Anfang der 90er Jahre wurde ein neues körpereigenes System ent-

deckt, welches neuro- und immunomodulatorische Eigenschaft besitzt,

das Endocannabinoid System.

Mit der Erforschung der Pflanze Cannabis sativa hat man schon früh im

19ten Jahrhundert begonnen. Mechoulam et al. (1998) berichten, dass der

erste große Schritt jedoch erst 1940 gemacht wurde, als Lord Todd in

England und Roger Adams in den USA, unabhängig voneinander Canna-

binol und Cannabidiol aus der Pflanze extrahierten. Während letzteres

keine psychoaktiven Eigenschaften aufweist, besitzt Cannabinol, dessen

chemische Struktur 1960 entschlüsselt wurde, eine sehr schwache psy-

choaktive Komponente.

Die am stärksten psychoaktive Substanz, Delta-9-Tetrahydrocannabinol

( 9∆ -THC) konnte erst 1964 isoliert und chemisch entschlüsselt werden

[Mechoulam et al. (1998)]. Mittlerweile sind mehr als 60 Bestandteile der

Pflanze Cannabis sativa bekannt [Pertwee (2001)].

9∆ -THC Cannabinol

Abbildung 8 Legende: Strukturformel der der beiden wichtigsten Cannabinoide, die aus der Pflanze Cannabis sativa isolietr wurden.

Nachdem die wichtigsten Substanzen entdeckt waren, begann man

sich für die pharmakologischen Effekte zu interessieren. Laut Mechoulam

Einleitung

29

et al. (1998) glaubte man anfangs, dass die Wirkung der Cannabinoide

ähnlich der der Anästhetika sei. Man stellte sich vor, dass diese aufgrund

ihrer Lipophilie mit der Zellmembran interagieren und durch eine Änderung

der Fluidität der Membran ihre Wirkung entfalten.

Spätestens Mitte der 80er Jahre entdeckte man, dass nur geringe Ver-

änderungen im THC-Molekül zu einem Aktivitätsverlust führen. Diese Tat-

sache passt nicht zu dem Membran-Fluiditäts-Erklärungsmodell. Ferner

führte diese Entdeckung zu der Annahme, dass die Cannabinoide durch

Rezeptoren ihre Wirkung entfalten müssen.

Die weitere Forschung in diese Richtung führte letztendlich zur Klonie-

rung des Cannabinoid-Rezeptors (CB1) Typ1 [Matsuda et al. (1990), Ge-

rard et al. (1991)] und des CB2–Rezeptors [Munro et al. (1993)].

Mit der Entdeckung der beiden Rezeptoren, begann auch die Suche

nach endogenen Liganden.

Devane et al. gelang es im Jahre 1992 Anandamid (Arachidonyletha-

nolamin) als erstes Endocannabinoid aus Schweinegehirnen zu isolieren.

Schließlich schaffte es die Gruppe um Mechoulam 1995 aus Hundedarm

ein zweites Endocannabinoid, das 2-Arachidonylglycerol (2-AG) zu extra-

hieren. Dieses konnte später durch Sugiura et al. (1995) und durch Stella

et al. (1997) ebenfalls im Zentralnervensystem nachgewiesen werden.

Kurze Zeit später konnte die Isolation der beiden Endocannabinoiden

auch aus anderen Geweben wie Milz, Niere und Leber erfolgen [Mechou-

lam et al. (1998)].

Anandamid

2-Arachidonylglycerol

Abbildung 9 Legende: Strukturformel der beiden Endocannabinoide, die bisher am

besten erforscht sind.

Einleitung

30

Sowohl Anandamid, als auch 2-AG werden aus der Arachidonsäure

(eine ω-6-Fettsäure) gebildet. Die Biosynthese und die Freisetzung erfolgt

„on demand“ nach einer 2+Ca -abhängigen Signaltransduktion [Mechoulam

et al. (1998), Di Marzo (1994)], ähnlich den üblichen Neurotransmittern

oder Zytokinen.

Für die Wiederaufnahme in die Zelle und der anschließende enzymati-

sche Abbau sind zwei verschiedene Mechanismen vorgeschlagen worden.

Für Di Marzo et al. war es schon 1994 offensichtlich, dass ein Membran-

transporter (so genannter Carrier-Protein) involviert sein muss, nachdem

sie beobachtet hatten, dass die Wiederaufnahme schnell, temperaturab-

hängig, selektiv für Anandamid verläuft und einer Sättigungskinetik unter-

liegt. Obwohl dieser Transporter erfolgreich mit Antagonisten blockiert

wurde, bleibt er bis heute in seiner Struktur unentdeckt [Glaser et al.

(2005)]. Als zweiten Mechanismus stellt man sich, aufgrund der Lipophilie

der Endocannabinoide, eine passive Diffusion (ähnlich der der langketti-

gen Fettsäuren) durch die Zellmembran vor [Di Marzo et al. (1994), Glaser

et al. (2005)].

Die Inaktivierung des Anandamids erfolgt mittels der FAAH (= fatty acid

amide hydrolase), welche dieses zu Arachidonsäure und Ethanolamin ab-

baut. 2-AG wird hingegen durch eine Monoacylglycerol-Lipase (MAGL) zu

Arachidonsäure und Glycerol gespalten [Mechoulam et al. (1998), Di

Marzo (2006)]. Letztendlich gibt es auch Studien, die darauf hinweisen,

dass die Endocannabinoide mittels der Cyclooxygenase 2 (COX2) zu

Prostanoiden oxidiert werden, deren Aufgaben man noch nicht gänzlich

untersucht hat [Simmons et al. (2004)]. Die COX2 ist ein Enzym, das bei

der Entzündungsinduktion und –aufrechterhaltung eine entscheidende

Funktion bekommt. Sie unterliegt einer vielfältigen Regulation und wird

durch Entzündungsmediatoren wie IL-1β und TNF-α aktiviert [Simmons et

al. (2004)].

Die Wirkung der Endocannabinoide wird über die oben erwähnten

Cannabinoidrezeptoren CB1 und CB2 vermittelt. Anandamid besitzt eine

Affinität vor allem für den CB1-Rezeptor, während 2-AG auf beide Rezep-

toren agonistisch wirkt [Izzo et al. (2001].

Einleitung

31

Der CB1-Rezeptor befindet sich überwiegend auf Zellen des zentralen

und des peripheren Nervensystems, ein Vorkommen auf Adipozyten, En-

dothelzellen und Epithelzellen des Kolons ist ebenfalls beschrieben wor-

den [Massa et al. (2005), Izzo et al. (2008)]. An den präsynaptischen Ner-

venendigungen erfolgt über den CB1–Rezeptor die Modulation der Neu-

rotransmitterauschüttung. Dies betrifft unter anderem die Botenstoffe γ-

Amino-Buttersäure, Glutamat und Acetylcholin [Pertwee (2001), Massa et

al. (2005)].

Der CB2–Rezeptor wird bevorzugt von Zellen des Immunsystems

exprimiert. Ihm wird eine immunmodulatorische Rolle zugeschrieben

[Pertwee (2001), Massa et al. (2005), Di Marzo et al. (2006), Izzo et al

(2008)].

Beide Rezeptoren sind an das Gi/o-Protein gekoppelt [Izzo et al. (2001),

Massa et al. (2005), Di Marzo et al. (2006)]. Nach der Ligandenbindung

hemmt das heterotrimere Gi/o-Protein die Adenylatcyclase, wodurch weni-

ger cAMP gebildet wird (cAMP = cyclisches Adenosinmonophosphat, lie-

fert Energie für biochemische Vorgänge). Andererseits werden Enzyme

des Zellzyklus, so genannte mitogenaktivierte Proteinkinasen wie die ERK

(extracellular signal-regulated kinase), die Proteinkinase B, die p38 Kinase

und die Jun-Kinase aktiviert. Unabhängig davon kann der CB1-Rezeptor

über das Gi/0-Protein den einwärtsgerichteten +K ir –Kanal (inwardly

rectifying +K -Kanal) aktivieren, was zu einer Stabilisierung des

Ruhemembranpotentials führt. Zudem kann der CB1-Rezeptor direkt einen

nach innen gerichteten spannungsabhängigen 2+Ca -Kanal von N- oder

P/Q-Typ hemmen, wodurch die intrazelluläre Calziumkonzentration

abnimmt. Insgesamt bewirken diese Mechanismen eine Hyperpolarisation

der Zellmembran und eine zelluläre Aktivitätsabnahme [Izzo et al. (2001),

Massa et al. (2005)] (s. Abb.10).

In den letzten Jahren nimmt die Evidenz zu, dass die Endocannabi-

noide außer den beiden oben beschriebenen Cannabinoidrezeptoren auch

andere Rezeptoren aktivieren. Diese sind der TRPV1-Rezeptor (transient

receptor potential vanilloid type 1) und der GPR55 (orphan G-protein

coupled receptor 55) [Duncan et al. (2005), Di Marzo et al. (2006), Sanger

(2007), Izzo et al. (2008)]. Der TRPV1 gehört zur Familie der Transient

Einleitung

32

Receptor Potential (TRP) Kanäle und ist ein nicht-selektiver Kationenkanal

bestehend aus sechs Transmembrandomänen. Der Rezeptor wird nor-

malerweise durch Capsaicin (scharfe Substanz der roten Chilischote),

Hitze und Protonen aktiviert [Ahluwalia et al. (2003)]. Die genaue Wirkung

der Endocannabinoide über diese Rezeptoren ist aktuell Gegenstand der

Forschung.

Abbildung 10 Signaltransduktion der Cannabinoidrezeptoren nach deren Aktivierung

durch Agonisten. Erklärung siehe weiter oben im Text. [nach Izzo et al. (2001)]

1.4 Die Rolle des Endocannabinoid Systems im Gastro intestinaltrakt

Mit der Entdeckung des Endocannabinoidsystems im Darm begann die

immer noch andauernde Erforschung seiner Funktion unter physiologi-

schen und pathophysiologischen Bedingungen.

Die Lokalisation der Rezeptoren konnte mit Hilfe der Immunhistochemie

dargestellt werden. Der CB1-Rezeptor wird überall im Darmtrakt exprimiert,

vor allem auf Zellen des enterischen (oder intrinsischen) Nervensystems

(ENS) [Duncan et al. (2005), Izzo et al. (2008)]. Dieses besteht aus Neu-

ronen, die mit ihren Fortsätzen den Darm innervieren. Die Zellkörper be-

finden sich in den beiden großen Darmplexus, Plexus myentericus (Auer-

Einleitung

33

bach) und Plexus submucosus (Meissner). Das erstere liegt zwischen der

äußeren Längsmuskelschicht und der inneren Ringmuskulatur. Das Ple-

xus submucosus liegt in der Tela submucosa. Der CB1-Rezeptor ist nach-

gewiesen worden auf parasympatischen cholinergen Nervenfasern, auf

motorischen Neuronen und auf sensorischen Afferenzen, die Substanz P,

CGRP oder vasoactives intestinales Peptid (VIP) enthalten (Nozizepto-

ren). Auch die Zellkörper in den dem ENS übergeordneten Zentren expri-

mieren den CB1-Rezeptor. Diese sind die Perikaryen im Ganglion inferius

im Hirnstamm (viscerosensibler Kern des Nervus vagus) und die Spinal-

ganglienzellen des Rückenmarks [Duncan et al. (2005), Izzo et al. (2008)]

(s. Abb. 11).

Abbildung 11 Schematische Darstellung der Lokalisation der Cannabinoidrezeptoren

im GI-Trakt! Legende: Brainstem = Hirnstamm; Nodose ganglion = Ganglion inferius; Spinal cord = Rückenmark; Dorsal root ganglion = Spinalganglion (Afferenzen projezieren in die hintere Wurzel des Rückenmarks); LM = äußere Längsmuskelschicht; MP = Plexus myentericus; CM = circular muscle/ innere Ringmuskulatur; SM = Plexus submucosus; MM = Muscularis mucosae; MUC = Mucosa; Das ZNS bekommt Informationen aus dem GI-Trakt und umgekehrt über den N. vagus (Vagal primary afferent neuron) und über spi-nale Afferenzen (Spinal primary afferent neuron). Excitatorische und inhibitorische Moto-neurone kontrollieren die Motilität des Darmes. Ascendierende Interneurone wirken bei den lokalen Motilitätsreflexen, die descendierenden Interneurone kontrollieren zusätzlich die secretomotorische Reflexe. Die intrinsischen primären Afferenzen antworten auf chemische Stimuli oder Dehnungen der Darmwand. Immunzellen infiltrieren die Mucosa auch unter physiologische Bedingungen. [Nach Izzo et al. (2008)]

Einleitung

34

Außer auf den Neuronen, befindet sich der CB1-Rezeptor auch auf den

Darmepithelzellen und auf den Muskelzellen der Muscularis mucosae

(dünne Muskelschicht der Schleimhaut) [Izzo et al. (2008)].

Die CB2–Rezeptoren werden von Plasmazellen (aktivierte B-Lympho-

zyten) und Makrophagen in der Lamina propia der Darmschleimhaut expri-

miert. Eine eventuelle Expression auf den Epithel- und den Plexusgang-

lienzellen ist nicht auszuschließen [Izzo et al. (2008)].

Bei den endogenen Liganden sind starke Konzentrationsunterschiede

festgestellt worden. 2-AG liegt in einer ca. 200fach höheren Konzentration

als Anandamid vor. Interessanterweise sind laut Izzo et al. (2008) unter in-

flammatorischen Bedingungen vor allem die Anandamidspiegel erhöht.

Die genannten Autoren hatten dies in Biopsien von Patienten mit Diverti-

kulitis, Zöliakie und kolorektales Karzinom festgestellt.

Mit Hilfe von Tiermodellen und einer Reihe von synthetischen CB1-

bzw. CB2–Rezeptor Agonisten und Antagonisten hat man wichtige Effekte

des Endocannabinoidsystems auf den Gastrointestinaltrakt (GI-Trakt) ent-

deckt.

Über den CB1-Rezeptor wird zentral (Limbisches System) und peripher

(GI-Trakt und Adipozyten) das Essverhalten reguliert. Der CB1-Rezeptor-

Antagonist Rimonabant diente als Appetitzügler bei der Behandlung des

Übergewichts, musste jedoch im Oktober 2008 wegen nachgewiesen

vermehrt auftretender Depression und Suizidgefahr vom Markt genommen

werden [emea.europa.eu]. Weitere Effekte des CB1-Antagonisten sind

Übelkeit, erhöhte intestinale Motilität, Bauchschmerzen und Diarrhö [Dun-

can et al. (2005)].

Studien mit CB1-Rezeptor-Agonisten (Z.B. WIN 55, 212-2) berichten

über Appetitsteigerung, Abnahme der gastointestinalen Motilität und Sek-

retion, Hemmung der Magensäuresekretion und Relaxierung des unteren

Ösophagussphinkter. Die antiemetischen Effekte entstehen zum einen

durch Modulation der Rezeptoren in der Area postrema (zuständig für die

Entstehung des Übelkeitsgefühls) oder durch die Aktivierung der CB1-Re-

zeptoren des dorsalen Kernkomplexes des Nervus vagus (N. vagus) im

Hirnstamm oder auf dessen peripheren abdominellen Efferenzen. Zum

anderen trägt dazu auch die Abnahme des intragastrischen Drucks und

Einleitung

35

der Pyloruskontraktionen bei [Izzo et al. (2001), Massa et al. (2005), Dun-

can et al. (2005), Izzo et al. (2008)]. Die Aktivierung der CB2–Rezeptoren

und der TRPV1-Rezeptoren im Hirnstamm kann ebenfalls einen antiemeti-

schen Effekt induzieren [Izzo et al. (2008)].

Weiterhin spielen die Cannabinoidrezeptoren auch bei der visceralen

Schmerzwahrnehmung eine Rolle. Laut Izzo et al. (2008) bewirkt die Akti-

vierung der CB1-Rezeptoren als auch der CB2–Rezeptoren eine vermin-

derte Sensitivität gegenüber Dehnungsreizen. Relevant wird der antinozi-

zeptive Effekt unter pathophysiologischen Bedingungen.

Es konnte gezeigt werden, dass im entzündeten Darm die Hyperalgesie

nach Aktivierung der Cannabinoidrezeptoren abnimmt. Demzufolge beein-

flussen die Endocannabinoide den Verlauf und die Folgen einer Darment-

zündung. Im Zusammenhang mit den CED hat man erhöhte Anandamid-

konzentrationen in Biopsien von Patienten mit Colitis ulcerosa entdeckt

[Sanger (2007), Izzo et al. (2008)]. Die Expression der Rezeptoren ist

ebenfalls hochreguliert. Über den CB1-Rezeptor wird die epitheliale Re-

generation stimuliert (Wundheilung), hingegen wirkt der CB2–Rezeptor

eher immunmodulatorisch.

Tabelle 2 Einflüsse der Endocannabinoide im GI-Trakt [nach Izzo et al. (2008)]

� Tonus des untern Ösophagus-sphinkter

� Magnsäureproduktion � Magenulcera � Magenentleerung � Intestinale Motlität � Intestinale Sekretion � Viscerale Nozizeption � Tumorzellwachstum � Entzündung

� Viscerale Nozizeption � Entzündung � Motilität im entzündeten Darm

CB1 CB2

Einleitung

36

1.5 Das Modell der TNBS-induzierten murinen Colitis

Die TNBS (2, 4, 6-Trinitrobenzen-Sulfonsäure) – induzierte Colitis gilt

als zuverlässiges Modell entzündlicher Darmerkrankungen [Wirtz et al.

(2007)]. Es ist kostengünstig und sicher reproduzierbar. Durch die intra-

rektale Applikation von TNBS gelöst in 35-50%igen Ethanol kann in dafür

empfindlichen Mäusestämmen, ebenso in Ratten- oder Kaninchenstäm-

men eine Darmentzündung induziert werden [Wirtz et al. (2000)].

Da nicht jeder Stamm die gleiche Empfindlichkeit besitzt eine Colitis zu

entwickeln, sind Vorstudien notwendig, um die TNBS-Dosis zu finden, mit

der man im jeweiligen Stamm eine reproduzierbare Entzündung induzie-

ren kann. Z.B. reagieren SJL/J-Mäuse viel empfindlicher auf TNBS als

C57BL/6-Mäuse, deshalb muss die TNBS-Dosis der jeweiligen Mikroum-

welt „Maus“ angepasst werden [Wirtz et al. (2000)].

Das oben erwähnte 50%ige Ethanol dient der Durchbrechung der

Darmbarriere. Die Wirkungsweise des TNBS wird folgendermaßen erklärt:

TNBS bindet als Hapten an autologe Darmbakterien oder Proteine und

macht diese immunogen. Das heißt, dass sie nun in der Lage sind das

Immunsystem zu aktivieren. Eine prominente Rolle spielen dabei CD4-T-

Lymphozyten vom TH1-Typ. Dies und die Tatsache, dass die TNBS-Colitis

als transmurale granulomatöse Entzündung mit Diarrhöen und Verdickung

der Darmwand charakterisiert ist, spricht für ein Morbus Crohn ähnliches

Modell. Die erhöhten Konzentrationen an IL-12 und TNF-α bestätigen dies

zusätzlich (s.Abb.2) [Wirtz et al. (2000)].

In den meisten Studien, die das TNBS-Modell verwenden, wird über ein

Maximum der Entzündung nach 3-5 Tagen nach Applikation berichtet.

Diese ist histologisch durch infiltrierende Granulozyten, Macrophagen und

Lymphozyten charakterisiert [Wirtz et al. (2000), Wirtz et al. (2007)].

Hintergründe und Ziele

37

2. Hintergründe und Ziele

Vorarbeiten von Massa et al. (2004) zeigten, dass die DNBS1- und

DSS2-induzierte Colitis durch Gabe des synthetischen CB1 Agonisten

HU210 oder durch Hemmung der FAAH signifikant abgeschwächt wurden.

Von der gleichen Gruppe ist außerdem noch nachgewiesen worden, dass

CB1-knockout Mäuse, sowie Wildtypen, die mit einem synthetischen CB1-

Rezeptor Antagonisten behandelt wurden eine ausgeprägtere Colitis, ver-

glichen mit den Kontrolltieren, entwickelten [Massa et al. (2004)]. Dieses

Ergebnis suggeriert einen tonischen anti-inflammatorischen Effekt des

ECS via CB1.

Kürzlich hatten Storr et al. (2008) im Modell der TNBS-induzierten Coli-

tis in Mäusen durch die Gabe des Membrantransporter Inhibitors VDM113

und ebenfalls durch FAAH Hemmung eine Entzündungsabschwächung er-

reicht. Hingegen blieb die Blockade des Endocannabinoid Abbaus bei den

CB1- und CB2-Rezeptor Knockoutstämmen wirkungslos [Storr et al.

(2008)], woraus geschlossen wurde, dass beide CB-Rezeptoren eine anti-

inflammatorische Rolle spielen.

Hieraus ergaben sich für uns noch zwei unbeantwortete Fragestellun-

gen:

1) Ist allein durch Erhöhung des endogenen physiologischen

Cannabinoids Anandamid eine Entzündungslinderung in gleichem Aus-

maß wie durch synthetische Agonisten zu erreichen? Wenn ja welche

Konzentration wäre hierfür notwendig? Zu diesem Zweck hatten wir in der

ersten Versuchsreihe (Kap. 4.1) unmittelbar nach der Induktion der TNBS

Colitis, den Mäusen intraperitoneal Anandamid injiziert.

2) Über den Verlauf einer experimentellen Colitis, ohne die

Beeinflussung des Anandamid Wideraufnahmemechanismus, in CB2-defi-

zienten (CB2 -/-) Mäusen und in Mäusen denen sowohl der CB1 als auch

der CB2-Rezeptor fehlt, war bis dato nichts bekannt. Dies wurde von uns

1 DNBS: 2,4-Dinitrobenzen-Sulfonsäure; Dass Modell ist der TNBS-induzierten Colitis ähnlich. 2 DSS: Dextransulfatsodium; Ebenfalls eine haptenisierende Substanz, die aber als Trink-flüssigkeit den Mäusen verabreicht wird. 3 VDM11: Anandamidwiederaufnahme Inhibitor: Chemische Formel: (5Z, 8Z, 11Z, 14Z) - N - (4-hydroy-2-methylphenyl) - 5, 8, 11, 14 – Eicosatetraenamid)

Hintergründe und Ziele

38

in der zweiten Versuchsreihe (Kap. 4.2) untersucht. Um eine eventuelle

führende Rolle einer der beiden CB-Rezeptoren im Entzündungsgesche-

hen herauszuarbeiten, untersuchten wir alle drei möglichen genetischen

KO Varianten CB1 -/-, CB2 -/- und CB1 und 2 Doppelknockouts. Dabei

war insbesondere die Frage relevant, ob die Colitis bei Mäusen, denen

beide CB-Rezeptoren fehlen, schwerer verläuft, als bei den Mäusen, de-

nen nur einer der beiden Rezeptoren fehlt. Würde sich also eine Disinhibi-

tion neurogener (CB1) und immunogener (CB2) Mechanismen summieren

oder gar potenzieren?

Material und Methoden

39

3. Material und Methoden

3.1 Versuchstiere

Für das Vorhaben wurde ein Tierversuchsantrag an die Regierung von

Mittelfranken in Würzburg gestellt und genehmigt.

Als Versuchstiere wurden ca. 8-10 Wochen alte und 30 g schwere

männliche AKR Mäuse von Charles River Wiga GmbH (Sulzfeld, Deutsch-

land)) eingesetzt. Des Weiteren kamen männliche C57BL/6 Mäuse (20-25

g) zum Einsatz. Diese erhielten wir freundlicherweise von dem Institut für

Physiologie und Pathophysiologie der Friedrich-Alexander- Universität Er-

langen-Nürnberg. Die genetischen Knockout Varianten CB1 -/-, CB2 -/-

und CB1+2 -/- (männlich und weiblich, 20-30 g) bekamen wir von Prof. Dr.

A. Zimmer (Bonner Universität, Deutschland) zur Verfügung gestellt. Die

KO Stämme wurden mittels im Handel erhältliche konventionellen Primern

(Metabion) genotypisiert.

Die Tiere wurden im Tierstall des Instituts für Physiologie und Patho-

physiologie unter Standardbedingungen mit einer Raumtemperatur von

22° C, einer Luftfeuchtigkeit von 65% und einem 12- stündigen hell-dunkel

Rhythmus gehalten und erhielten Wasser und Futter ad libitum.

3.2 Induktion der TNBS Colitis

Vor Versuchsbeginn wurde den Tieren für 24 h das Futter entzogen,

damit der Darm möglichst stuhlleer ist. Mittels eines Polyethylenkatheters

(äußerer Durchmesser 2 mm) wurde den Tieren transrektal, 4 cm vom

Anus entfernt eine TNBS Lösung appliziert. Anschließend wurden die

Tiere für 5 Min mit dem Kopf nach unten gehalten, damit die Lösung von

der Darmschleimhaut absorbiert werden konnte. Zu diesem Zweck wurden

die Mäuse mit Ketamin (40mg/kg) leicht anästhesiert. Die Anästhesiedau-

er betrug etwa 15 Min.


40

Zur Herstellung der Lösung wurde TNBS (Sigma-Aldrich, Seelze.

Deutschland) in 50%igem Ethanol gelöst. Das Gesamtvolumen des Ein-

laufs betrug 150 µl, dabei war die TNBS-Konzentration dem jeweiligen

Tierstamm angepasst.

Da die AKR Mäuse eine erhöhte Suszeptibilität gegenüber TNBS auf-

weisen, erhielten sie 5 mg TNBS, die C57BL/6 und die Knockout Mäuse

hingegen 7 mg. Die TNBS Dosis ist in Vorversuchen ermittelt worden. Bei

der jeweiligen Dosierung entwickelten die verwendeten Mäusestämmen

eine reproduzierbare Colitis.

Die Kontrolltiere erhielten eine 150 µl Lösung mit 50%igen Ethanol und

Wasser.

3.3 Therapeutisches Colitis Modell

Ein Teil der mit TNBS behandelten AKR Mäuse erhielten täglich intra-

peritoneal eine 5 mg/kg Anandamidapplikation (Tocris Bioscience, Mis-

souri, USA). Die erste Spritze bekamen die Tiere 30 Min, die zweite 24 h

und die dritte schließlich 48 h nach der TNBS Applikation. Die Injektion

erfolgte im linken unteren Quadranten des Abdomens.

3.4 Beendigung der Versuche

Drei Tage nach der Kolitisinduktion wurden die Mäuse in einer

100%igen CO2–Atmosphäre betäubt und anschließend durch zervikale

Dislokation getötet. Diese Methode ist in Übereinstimmung mit den deut-

schen Tierschutzgesetzen geeignet, den Tod der Maus in Bruchteilen von

Sekunden herbeizuführen.


41

3.5 Darmpräparation und Gewinnung von Gewebemateria l

Nach dem Tod der Maus wurde das Abdomen eröffnet, das Kolon prä-

pariert, gewogen und mit einem Lineal seine Länge bestimmt. Das Kolon

wurde anschließend in einer physiologischen Kochsalzlösung gereinigt

und es wurden 4 cm ab ano mehrere 0,5 cm lange Stücke für weitere Un-

tersuchungen entnommen.

Für die histologische Analyse wurde ein Stück aus dem distalen Kolon

in Formaldehyd eingelegt. Die für die mRNA-Extraktion isolierten 0,5 cm

Darmstücke kamen in Eppendorf Reaktionsgefäße und wurden sofort in

flüssigem Stickstoff schockgefroren und anschließend bei -80° C bis zur

Analyse aufbewahrt.

3.6 Score Systeme

Für die Beurteilung der Darmentzündung wurden ein makroskopischer

und ein histologischer Score verwendet. Die beiden Score Systeme sind in

älteren Studien beschrieben [Kimball et al. (2004), Dieleman et al. (1998)].

Für unsere Zwecke sind sie leicht modifiziert worden.

Der makroskopische Score beinhaltet die Kolonlänge (gemessen 0,5

cm oberhalb des Anus bis zum Zäkum), das Kolongewicht und die Kon-

sistenz des Stuhls im Kolon (s. Tab.3). Diese Parameter werden zum

makroskopischen Score (MS) mit einem Maximum von 12 Punkten ad-

diert.


42

Tabelle 3 Makroskopischer Score max. 12 Punkte

Stuhlbeurteilung Score

Normal 0

Weich, geformt 1

Weich, amorph und klebrig 2

Diarrhö 3

Hämoccult positiv +1

Kolongewichtzunahme Score

< 10% 0

10 – 50% 1

> 50 – 100% 2

> 100 – 150% 3

> 150% 4

Kolonlängenabnahme Score

< 5% 0

5 – 14% 1

15 – 24% 2

25 – 35% 3

> 35% 4

Zur Evaluierung mikroskopischer Veränderungen im entzündeten Darm

dient der histopathologische Score. Dieser beschreibt die Entzündungs-

ausdehnung, die Kryptenarchitektur, Hyperämie oder Ödem, die Infiltration

mit Immunozyten und das Vorhandensein von Ulzera oder Kryptenabs-

zesse (s. Tab. 4). Die Parameter werden zum histopathologischen Colitis

Score (HCS) mit einem Maximum von 11 Punkten addiert.


43

Tabelle 4 Histopathologischer Colitis Score (HCS) max. 11 Punkte

Parameter Beschreibung Score

Keine Entzündung 0

Mucosa 1

Entzündungsausdehnung

Mucosa + Submucosa 2

Intakt 0

Regeneriert 1

Kryptenarchitektur

Zerstört 2

Keine 0

Wenig 1

Moderat 2

Hyperämie / Ödem

Stark 3

Keine 0

Wenig 1

Moderat 2

Infiltration mit Immunozyten

Stark 3

Ulzera / Kryptenabszess 1

Um die Schwere der Darmentzündung insgesamt beurteilen zu können,

wurden die beiden oben beschriebenen Scores zu einen Gesamtscore mit

einem Maximum von 23 Punkten addiert (s. Tab.5), den Major Colitis

Score (MCS).

Tabelle 5 Major Colitis Score (MCS) max. 23 Punkte

Beschreibung Score

Keine Entzündung 0

Milde Colitis 7≤

Moderate Colitis 14≤

Schwere Colitis >14


44

3.7 Histologische Evaluation

Die für die Histologie in Formaldehyd eingelegten Darmsegmente wur-

den in Paraffin eingebettet, geschnitten und mit Hämatoxylin/Eosin ge-

färbt. Diese Schritte wurden freundlicherweise von Mitarbeitern des pa-

thologischen Instituts der Universität Erlangen-Nürnberg übernommen.

Die Beurteilung der Schnitte wurde nach Verblindung von einem Pa-

thologen anhand des oben beschriebenen histologischen Scores (s. Tab.

4) durchgeführt. Dafür ist ein Lichtmikroskop verwendet worden (Olympus

Model BX-50 microscope, Olympus Instruments, Melville, NY, USA). An-

schließend wurden Photographien mit einem Leitz Laborlux S Mikroskop

(Wild Leitz, Wetzlar, Deutschland) mit einem 4fach Objektiv und einer

SPOT RT Digitalkamera (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI,

USA) gemacht.

3.8 Extraktion der Gesamt-RNA

3.8.1 Substanzen für die RNA-Extraktion

• TRIZOL-Reagens von Invitrogen (Deutschland)

• Chloroform, Isopropanol und Ethanol (Carl-Roth GmbH, Deutsch-

land)

• DEPC (DiethylenePyrocarbonate) behandeltes Wasser (=RNAse

freies Wasser) von BIO-Rad (Deutschland)

3.8.2 Praktische Durchführung der RNA-Extraktion

Die tief gefrorenen Darmsegmenten wurden jeweils in einem 1,5 ml Ep-

pendorf-Reaktionsgefäß mit 300 µl TRIZOL homogeniziert. Die Suspensi-

onen wurden anschließend für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert,

damit die Nukleus-Proteinkomplexe komplett dissoziieren.


45

Als nächstes wurde 50 µl Chloroform in die Reaktionsgefäße gegeben.

Diese wurden kräftig geschüttelt, weitere 3 Minuten bei Raumtemperatur

inkubiert und anschließend bei 4°C für 15 Minuten m it 12.000 U/min

zentrifugiert.

Als Folge des Zentrifugierens hatten sich drei Schichten gebildet: eine

untere rosa Phenol-Chlorophormschicht (mit lipophilen Anteilen), eine

mittlere weiße Schicht mit Proteinen und eine obere farblose Schicht mit

RNA. Letztere ist abpippetiert und in ein neues Reaktionsgefäß zur Wei-

terverarbeitung gegeben worden. Die beiden unteren organischen Phasen

wurden für eine eventuelle Proteinisolierung bei -20°C aufbewahrt.

Um eine Präzipitation der RNA zu erreichen, wurde zu der farblosen

Fraktion 250 µl 100%iges Isopropanol gegeben und die Suspension für 10

Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde diese bei 4°C

für 15 Minuten mit 12.000 U/min zentrifugiert. Die präzipiterte RNA hatte

am Boden des Reaktionsgefäßes ein weißliches Pellet gebildet. Der Über-

stand wurde verworfen, das Pellet mit 75%igem Ethanol gewaschen und

erneut bei 4°C für 7 Minuten mit 10.000 U/min zentr ifugiert. Der Wasch-

schritt mit Ethanol und die anschließende Zentrifugation erfolgten noch

zweimal.

Nach dem letzten Waschschritt wurde der Ethanolüberstand vorsichtig

abpippetiert und verworfen und das Pellet für 5-10 Minuten getrocknet.

Danach wurde die RNA im RNAse freiem Wasser gelöst. Um den Löse-

vorgang zu beschleunigen wurde die Suspension für maximal 10 Minuten

bei 55°C inkubiert. Anschließend wurde die RNA bis zur cDNA-Synthese

bei -20°C aufbewahrt.

3.8.3 Quantifizierung der Gesamt-RNA

Die Bestimmung der RNA-Konzentration erfolgte durch spektrometri-

sche Messung bei einer Wellenlänge von 260 nm (A260) und 280 nm (A280).

Das Absorptionsmaximum der Nucleotidbasen der RNA liegt bei 260 nm,

deshalb entspricht die gemessene Extinktion bei dieser Wellenlänge im

etwa der Menge an in der Probe vorhanden Nucleotidbasen.


46

Für die Messung wurde eine 1 cm breite Quartz-Küvette benützt. In

diesem Fall ist der Extinktionskoeffizient der Nukleotide 20.

Basierend auf diesen Extinktionskoeffizienten errechnet sich für die Ab-

sorption einer 40 µg/ml Single-Strang RNA-Lösung bei 260 nm in einer

1cm breiten Küvette eine Eins.

Daraus wird die Gesamt-RNA-Konzentrarion wie folgt berechnet:

RNA-Konzentration (µg/ml)= (A260) x (Lösungsfaktor) x (40 µg RNA/ml)

In unserem Fall betrug der Lösungsfaktor 70. Dazu wurde 1µl der RNA-

Lösung mit 69 µl Wasser versetzt. Zur Kalibrierung des Photometers wur-

den 70 µl Wasser verwendet.

Die Reinheit der RNA-Extraktion ergibt sich aus der Ratio der Absorp-

tion bei 260 nm und 280 nm (A260/ A280). Die Extinktion bei 280 nm ent-

spricht einer eventuellen Proteinkontamination. In unserem Fall betrug die

Ratio 1.7-1.9, was den Reinheitsgrad der Extraktion bestätigt.

3.9 Reverse Transkription (RT-PCR)

Unter reverser Transkription versteht man die Umschreibung der RNA

in einen complementären DNA Strang (cDNA). Dies ist notwendig, da die

PCR-Technik (Polymerase chain reaction) nur mit cDNA funktioniert.

Die Transkription erfolgt mittels reverser Transkriptasen. Dies sind En-

zyme, die in Retroviren (z.B. HIV, HBV) entdeckt wurden.

3.9.1 Substanzen für die RT-PCR

AffinityScript Multiple Temperature cDNA Synthesis Kit von Stratagene

(Niederlande). Dieses beinhaltet: AffinityScriptTM Multiple Temperature Re-

verse Trascriptase, 10x AffinityScriptTM RT buffer, RNAse Block Ribonuc-

lease Inhibitor, Oligo(dt) primer, Random primers, 100 mM dNTPs (Deso-

xyadenosintriphosphat = dATP, Desoxythymidintriphosphat = dTTP, De-

soxyguanidintriphosphat = dGTP, Desoxycytosintriphosphat = dCTP)

RNAse freies Wasser.


47

3.9.2 Praktische Durchführung der RT-PCR

Für die cDNA Synthese wurden 2 µg der Gesamt-RNA mit RNAse

freiem Wasser bis zu einem Volumen von 15,7 µl versetzt. Danach wurde

1 µl Oligo(dt) primer hinzugefügt, die Mischung bei 65°C für 5 Minuten in-

kubiert und anschließend für 10 Minuten auf Raumtemperatur abgekühlt,

damit die Primer an den RNA-Strang andocken können.

Nach dem Abkühlen wurden noch nacheinander folgende Substanzen

bis zu einem Gesamtvolumen von 20 µl pro Reaktionsgefäß dazugege-

ben: 2 µl 10x AffinityScript RT buffer, 0,8 µl dNTPmix (25 mM von jedem

dNTP), 0,5 RNAse Block Ribonuclease Inhibitor und 1 µl AffinityScript

Multple Temperature RT. Die Mischung wurde anschließend für 60 Minu-

ten bei 42°C inkubiert.

Danach wurde die cDNA bis zur PCR bei -20°C aufbewa hrt.

3.10 Konventionelle PCR

Mittels der konventionellen PCR (polymerase chain reaction = Polyme-

rase-Ketten-Reaktion) kann eine bestimmte DNA-Sequenz beliebig oft

amplifiziert werden.

3.10.1 Substanzen für die konventionelle PCR

• 10x PCR-Puffer (HotMasterTaq buffer von Eppendorf)

• dNTP (10 mM) von TaKaRa (Japan)

• Taq DNA Polymerase von 5-Prime (Deutschland). Diese ist ein

thermostabiles Enzym, welches aus dem thermophilen Bakte-

rium Thermus aquaticus isoliert wurde.

• Primer (s. Tabb. 6) von Invitrogen (Deutschland)


48

Tabelle 6 Primer Sequenzen

Murines β-Actin Sense Antisense

210bp Annealing Temp. 56°C 5’- AGACCTCTATGCCAACACAGTG -3’

5’- TCCTGCTTGCTGATCCACATC -3’

Murines TNF- α Sense Antisense

204bp Annealing Temp. 57°C 5’- AGCAAGCAGCCAACCAGG -3’

5’- GCCACAAGCAGGAATGAGAAG -3’

Murines IL-1 β Sense Antisense

240bp Annealing Temp. 56°C 5’- CTCGCAGCAGCACATCAAC -3’

5’- TGTTCATCTCGGAGCCTGTAG -3’

3.10.2 Praktische Durchführung der PCR

Ein PCR-Reaktionsansatz mit einem Gesamtvolumen von 25 µl wurde

wie folgt hergestellt:

• 19,9 µl Wasser

• 2,5 µl 10x PCR-Puffer

• 0,5 µl dNTP (10 mM)

• 0,5 µl Primer (Sense)

• 0,5 µl Primer (Antisense)

• 0,1 µl Taq DNA Polymerase

• 1 µl cDNA

Nach der Präparation der Mischung wurde die PCR mit einem Thermal

Cycler von Eppendorf durchgeführt. Das PCR-Zyklusprofil gibt die Tabelle

7 wider. Für jedes Gen, das amplifiziert wurde, sind die spezifischen Pri-

mer aus Tabelle 6 verwendet worden. Dabei gilt β-Actin als Standard-

oder Kontrollgen, da es von jeder Zelle exprimiert wird.


49

Tabelle 7 PCR –Zyklusprofil

Anmerkung: Die Annealing Temperatur t°C ist Primer spezifisc h. Diese ist in Tabelle 6 angegeben.

Der Zyklus II ist in Falle von β-Actin 27 mal wiederholt worden, die Ge-

samtzyklenzahl betrug hier 28. Für TNF-α sind insgesamt 39 und für IL-1β

35 PCR-Zyklen durchgeführt worden. Bei diesen Zyklenzahlen ergab sich

die beste Trennschärfe zwischen den einzelnen Banden im Agarosegel.

3.11 Gel-Elektrophorese

Die Gel-Elektrophorese ist eine Methode zur Auftrennung von Makro-

molekülen, Nucleinsäuren oder Proteinen aufgrund ihrer Größe oder elekt-

rischen Ladung. Wir benutzten die Gel-Elektrophorese um die cDNA auf-

zutrennen. Die DNA ist ein negativ geladenes Molekül und bewegt sich

dabei in einem elektrischen Feld durch eine Agarosematrix. Die Migrati-

onsweite ist dabei von der DNA-Ladung und ihrer Länge in bp (Basenpaa-

ren) abhängig.

Für die Herstellung von 50 ml Gel wurde 0,75 g Agarose mit 50 ml 1x

TBE-Puffer aufgekocht. In die noch warme Lösung wurde 4 µl Ethidi-

umbromid gegeben. Anschließend wurde die Agaroselösung zum Erkalten

in eine Form gegossen.

10 µl des PCR-Reagens wurden mit 2 µl Gelauftragspuffer vermischt

und in die Taschen des Agarosegels überführt. In einer Elektrophorese-

Phase Zeit Temperatur

I 3 Min.

94°C

Denaturierung 30 Sec. 94°C

Primerhybridisierung (Annealing) 40 Sec. t°C

II

Elongation 40 Sec. 72°C

III

5 Min.

72°C


50

kammer wurde das Gel für 30 Minuten einer Spannung von 90 Volt aus-

gesetzt.

Im Anschluss wurden die Banden in der Dunkelkammer unter UV-Licht

begutachtet und photographiert. Zur weiteren Auswertung wurde die opti-

sche Dichte der Banden digital bestimmt.

3.12 Statistische Methoden

Die Daten werden im Folgendem als Mittelwerte ± SEM (standard er-

ror of the mean) angegeben. Die Berechnung statistischer Signifikanz zwi-

schen den einzelnen Gruppen erfolgte mittels des Mann-Whitneys U Tests

für unabhängige Verteilungen. Für abhängige Variablen wurde der Wilko-

xon matched pair’s Test verwendet. Statistische Signifikanz von Differen-

zen wurde für p-Werte unter 0.05 angenommen und mit (*) gekennzeich-

net. Für die Statistik wurde das Programm Statistika (StatSoft, USA) ver-

wendet für die weitere Datenaufbereitung Microsoft Excel 2003. Als Text-

verarbeitungsprogramm diente Microsoft Word 2003. Zur Erstellung von

Grafiken wurde Microsoft Power Point 2003 eingesetzt.

Ergebnisse

51

4. Ergebnisse

4.1 Wirkungen von Anandamid auf die TNBS-induzierte Colitis

Um den Einfluss des Endocannabinoidliganden Anandamid auf die

Darmentzündung zu untersuchen, haben wir uns des Modells der TNBS-

induzierten Colitis bedient. Zu diesem Zweck haben wir 15 AKR Mäuse im

Versuch eingeschlossen. 6 der Mäuse erhielten lediglich die transrektale

TNBS Applikation (5 mg TNBS/150 µl pro Maus), während 6 weiteren

Mäusen zusätzlich 5 mg/kg Anandamid intraperitoneal (i.p.) injiziert wurde

(30 Min, 24 h und 48 h nach der TNBS Applikation). Die nur mit TNBS be-

handelten Mäusen stellen die Kontrollgruppe dar. Die restlichen 3 Mäuse

bekamen nur das Trägermittel Ethanol (50%ig) und Wasser transrektal.

Diese Gruppe soll ab jetzt Vehikelgruppe bezeichnet werden.

Tabelle 8 Experimentelle Anordnung

Anzahl der AKR Mäusen

Mittel

6 TNBS

6 TNBS + Anandamid (i.p.)

3 Trägermittel Ethanol 50%ig

4.1.1 Makroskopische Evaluierung

Nach dem Tod der Maus sind die makroskopischen Veränderungen

des Kolons beurteilt worden. Dies beinhaltet die im Kap. 3.6 in der Tab. 3

beschriebenen Parameter: Stuhlbeschaffenheit, Kolonlänge und Kolonge-

wicht.

Die Mäuse aus der Vehikelgruppe zeigten keine pathologischen Verän-

derungen, was bedeutet, dass Ethanol alleine keine Entzündung hervor-

ruft.

Die mit TNBS behandelte Gruppe (3.17 ± 0.31, n=6, p<0,05) zeigte, im

Vergleich zur Gruppe, die zusätzlich Anandamid (i. p.) erhielt (1.33 ± 0.33,

Ergebnisse

52

n=6, p<0.05), starke pathologische Stuhlkonsistenzveränderungen

(Fig. 1a).

Fig. 1a Stuhl-Score

Zusätzlich zeigte sich insgesamt eine Kolongewichtszunahme (auf-

grund der Darmwandverdickung, siehe unten) in der TNBS-Gruppe vergli-

chen mit der Anandamid-Gruppe (3.5 ± 0.22 vs. 0.83 ± 0.4, n=6, p<0.05; s.

Fig. 1b).

Fig. 1b Kolongew icht-Score

Letztendlich wies die TNBS-Gruppe als Folge der Entzündung eine

verkürzte Kolonlänge im Vergleich zur Anandamid-Gruppe auf (0.50 ± 0.22

vs. 2.00 ± 0.26, n=6, p<0.05; s. Fig. 1c)

Ergebnisse

53

Fig. 1c Kolonlängen-Score

Wenn man die drei Parameter zusammengefasst betrachtet, so wird

deutlich, dass die mit Anandamid behandelte Gruppe weniger makrosko-

pisch sichtbare Entzündungszeichen aufwies (s. Fig. 2).

Fig. 2 Makroskopischer Score

4.1.2 Histologische Analyse

Wie im Kap. 3.6 in der Tab. 4 dargestellt, erfolgte die histologische

Evaluation anhand der Kriterien Entzündungsausbreitung, Zerstörung der

Kyptenarchitektur, Hyperämie/Ödem, Infiltration mit Immunozyten, Ulzera

und Kryptenabszesse.

In der TNBS-Gruppe zeigten sich histologisch ausgeprägte Entzün-

dungszeichen (8.83 ± 0.75, n=6, p<0.05). In der Abbildung 12 ist ein reprä-

sentatives Bild dargestellt. Man sieht eine zerstörte Epithelarchitektur mit

Nekrosen und Infiltration mit neutrophile Granulozyten und Lymphozyten.

Dabei breitet sich die Entzündung über die Submukosa bis in die Muskel-

schicht (Lamina muscularis oder Muscularis propria) aus. Das Gesamtbild

Ergebnisse

54

entspricht einer durch TNBS induzierten transmuralen Entzündung mit

Verdickung der Darmwand (s. auch Kap. 1.5).

Abbildung 12 Kolonquerschnitt einer mit TNBS behandelten AKR Maus. Legende: M = Mukosa; SM = Submukosa; LM = Lamina muscularis Im Rahmen der TNBS-induzierten Colitis erkennt man die zerstörte Epithelarchitektur. Krypten sind kaum mehr zu erkennen, die Entzündungszellen haben ein dichtes Infiltrat gebildet (12a; 20fache Vergrößerung). Die Darmwand ist dementsprechend verdickt. 12b zeigt den weiß umrahmten Bereich in 12a in einer 40fachen Vergrößerung. Es ist gut er-kennbar, dass die Lamina muscularis mucosae durchbrochen ist.

Im Vergleich dazu hatten die mit Anandamid behandelten AKR Mäusen

keine ausgeprägte Entzündung entwickelt (3.67 ± 0.56, n=6, p<0.05). Die

Abbildung 13 stellt zwei repräsentative histologische Bilder dar. Man sieht

keine Nekrosen und nur eine geringe Entzündungszellinfiltration. Das

Epithel ist intakt, die Kryptenarchitektur ist erhalten, die große Anzahl er-

haltener Becherzellen deuten auf eine funktionelle Integrität.

Abbildung 13 Kolonquerschnitte zweier AKR Mäuse nach TNBS Gabe mit begleitender Anandamidtherapie. (13a: 10fache Vergrößerung; 13b: 40fache Vergrößerung). Die Entzündungszellinfiltration ist deutlich geringer als in der TNBS-Gruppe (vgl. Abb. 12). Man erkennt an der großen Anzahl erhaltener Becherzellen, dass die Struktur der Krypten, sowie die Epithelbarriere unbeschadet sind.

Ergebnisse

55

Die oben beschriebenen Parameter sind quantitativ in der Fig. 3 als

Histopathologischer Colitis Score (HCS) dargestellt. Es ist ersichtlich, dass

die Entzündung in der Anandamid-Gruppe deutlich geringer ist.

Fig. 3 Histopathologischer Score

Insgesamt betrachtet, ergab sich für die Anandamid-Gruppe ein gerin-

gerer Major Colitis Score (MCS) im Vergleich zur TNBS-Gruppe

(6.33 ± 0.92 vs. 16.50 ± 0.99, n=6, p<0.05; Fig.4). Der MCS setzt sich aus

dem makroskopischen und dem histologischen Score zusammen und er-

laubt eine Gesamtbeurteilung der klinischen Schwere der Darmentzün-

dung (vgl. Kap. 3.6). Vereinbar mit dem Score System konnte gezeigt

werden, dass Anandamid die TNBS Colitis signifikant abmilderte.

Fig. 4 Major Colitis Score (MCS)

Ergebnisse

56

4.1.3 RT-PCR Analyse

Auf der molekularen Ebene ist die mRNA (messenger RNA) Expression

zweier pro-inflammatorischer Zytokine untersucht worden, IL-1β und TNF-

α. Ihre Rolle bei Entzündung wurde in der Einleitung (Kap. 1.2) behandelt.

Zur Kontrolle wurde die Expression von β-Actin mit untersucht, da die-

ses als „housekeeping gen“ von jeder Zelle exprimiert wird. Um quantitati-

ve Aussagen treffen zu können, wurde die optische Dichte der jeweiligen

Zytokinbanden im Agarosegel in Relation zur β-Actin Bande gesetzt.

In der Vehikelgruppe war eine geringe mRNA Expression bei beiden

Zytokinen als schwach helle Bande im Agarosegel nachweisbar.

Die Colits als Folge der TNBS Applikation war mit einer stark erhöhten

Expression der mRNA für IL-1β und TNF-α im Kolongewebe assoziiert.

Diese ist als Bande mit einer stärkeren optischen Dichte im Agarosegel zu

erkennen. Im Vergleich dazu war die mRNA Expression für IL-1β und

TNF-α in der Anandamid-Gruppe geringer, was auf eine Abschwächung

der Entzündung hinweist.

Nachfolgend sind in Fig. 6 repräsentative Gel-Elektrophorese Beispiele

(links), sowie die PCR Gesamtauswertung (unten) sind nachfolgend

dargestellt.

Ergebnisse

57

Fig. 6 Oben: Darstellung der PCR-Produkte mittels der Gel-Elektrophorese; Unten: Statistische Gesamtauswertung der Zytokinexpression. In der

TNBS Gruppe war die Entzündungsausprägung signifikant stärker im Vergleich zur Vehikel (*) und zur Anandamid (**) Gruppe. Die Zytokinexpression in den zuletzt erwähnten Gruppen ergab keinen signifikanten Unterschied.

ß-actin

1 2 3

1 2 3

1 2 3

IL-1ß

TNF-αααα

• 1 = Vehikel

• 2 = TNBS

• 3 = TNBS + Anandamid

•

Ergebnisse

58

4.2 Experimentelle Colitis in Cannabinoidrezeptor d efizienten Mäusen

Mit Hilfe des Modells der TNBS-induzierten Colitis haben wir als

nächstes untersucht, welcher der beiden Endocannabinoidrezeptoren den

stärksten Einfluss auf die Entzündung besitzt. Zu diesem Zweck bedienten

wir uns der C57BL/6 Cannabinoidrezeptor Knokcout Stämme CB1-/-

(n=9), CB2-/- (n=11) und CB1+2-/- (Doppel Knockout; n=10)). Des Weite-

ren wurden noch 13 C57BL/6 Wildtyp Mäuse im Versuch eingeschlossen.

Die Cannabinoidrezeptor defizienten Mäusen und 9 C57BL/6 Tiere er-

hielten eine transrectale TNBS Applikation mit 7 mg TNBS/150 µl pro

Maus. Diese Dosis war notwendig, da die C57Bl/6 Mäuse weniger sus-

zeptibel sind. Die geringe Empfindlichkeit der Wildtypen erlaubte uns au-

ßerdem die Entzündungsverstärkung in den KO Stämmen überhaupt zu

entdecken. Die restlichen 4 C57BL/6 Mäuse erhielten nur das Trägermittel

Ethanol (50%ig) und Wasser. Diese Gruppe wird in Folgendem als Vehi-

kelgruppe bezeichnet.

Tabelle 9 Experimentelle Anordnung

Maus Anzahl Mittel

C57BL/6 9 TNBS (transrektal)

CB1-/- 9 TNBS (transrektal)

CB2-/- 11 TNBS (transrektal)

CB1+2-/- 10 TNBS (transrektal)

C57BL/6 4 Ethanol 50% (transrektal)

Die Auswertung erfolgte anhand makroskopischer, histologischer und

molekularer (PCR) Kriterien. Die Daten werden nachfolgend gesondert

dargestellt.

4.2.1 Makroskopische Evaluierung

Die makroskopischen Veränderungen wurden anhand des im Kap. 3.6

beschriebenen Scores evaluiert.

Ergebnisse

59

In der Vehikelgruppe ergaben sich nach 3 Tagen keine makroskopi-

schen Veränderungen, im Sinne einer Entzündung (0.3 ± 0.3, n=4).

Im Vergleich zu den mit TNBS behandelten C57BL/6 Wildtyp-Mäusen,

entwickelten alle CB-Rezeptor defizienten Stämme stärkere pathologische

Stuhlkonsistenzveränderungen. Als Folge der Entzündung nahm das Ko-

longewicht zu und ebenso verkürzte sich seine Länge. Dabei unterschied

sich der makroskopische Score zwischen der CB1-/- Gruppe und der

CB2-/- Gruppe untereinander nur geringfügig. Einen signifikanten Unter-

schied ergab sich interessanterweise bei der CB1+2-/- Gruppe, verglichen

mit den anderen beiden Knockout Gruppen untereinender. (C57BL/6:

3.9 ± 0.5, n=9 vs. CB1-/-: 6.4 ± 0.6, n=9; CB2-/-: 6.7 ± 0.6, n=11; CB1+2-/-:

8.6 ± 0.5, n=10; p<0.05; Fig.7).

Fig. 7 Makroskopischer Score (Erläuterung weiter oben im Text)

4.2.2 Histologische Analyse

Der histologische Colitis Score setzt sich aus den 5 Kriterien zusam-

men, die im Kap. 3.6 beschrieben sind.

In der Vehikelgruppe zeigten sich geringfügige Entzündungszellinfiltra-

tionen, die Epithelstruktur und die Kryptenarchitektur der Mukosa waren

intakt, was sich in den zahlreichen Becherzellen widerspiegelt. (Abb.14).

Ergebnisse

60

Abbildung 14 Transversalschnitt des Darmes einer C57BL/6 Maus aus der Vehikelgruppe (Vergrößerung: 40fach). Legende: M = Mukosa; SM = Submukosa; LM = Lamina muscularis Normale Krypten- und Epithelarchitektur.

In der C57BL/6 Gruppe war eine moderate Infiltration mit neutrophilen

Granulozyten zu sehen. Dabei dehnte sich die Entzündung bis in die

Submukosa aus. Die Epithelstruktur war, von manchen Abschnitten abge-

sehen, noch gut erhalten (Abb. 15).

Im Gegensatz dazu fand sich bei allen CB-Rezeptor defizienten Mäu-

sen eine ausgeprägte Entzündung mit Nekrosen, zerstörte Krypten- und

Epithelarchitektur, Ödemen und einer starken Entzündungszellinfiltration in

allen Darmwandabschnitten (Abb.16, 17, 18).

Abbildung 15 Kolonquerschnitt einer mit TNBS behandelten C57BL/6 Maus Legende: M = Mukosa; SM = Submukosa; LM = Lamina muscularis. Man erkennt eine moderate Entzündungszellinfiltration und eine relativ intakte Mukosa. 15b ist ein 40faches Vergrößerungsbild aus dem Bereich der Mukosa und Submukosa im Bild 15a (10fache Vergrößerung).

Ergebnisse

61

Abbildung 16 Kolonquerschnitt einer mit TNBS behandelten CB1-/- Maus. Legende: M = Mukosa; SM = Submukosa; LM = Lamina muscularis 16b ist die 40fache Vergrößerung des markierten Abschnitts im Bild 16a (20fache Ver-größerung).Man beachte die starke Entzündungszellinfiltration in 16b. Die Krypten- und die Epithelstruktur sind zerstört, die Becherzellzahl ist vermindert.

Abbildung 17 Kolonquerschnitt einer mit TNBS behandelten CB2-/- Maus Legende: M = Mukosa; SM = Submukosa; LM = Lamina muscularis Der mit weiß einquadrierte Abschnitt im Bild 17a (20fache Vergrößerung) ist im 17b 40fach vergrößert dargestellt. Man erkennt die Diskontinuität des Epithels als Folge von Erosionen. Entzündungszellen infiltrieren die gesamte Darmwand.

Abbildung 18a/18b Kolonquerschnitte zweier mit TNBS behandelten CB1+2-/- Mäuse. Legende: M = Mukosa; SM = Submukosa; LM = Lamina muscularis 18a: 5fache Vergrößerung. 18b: 40fache Vergrößerung. Man erkennt hier die Durchset-zung der Mukosa und der Submukosa mit Entzündungszellen. Die Epithelstruktur ist zer-stört.

Ergebnisse

62

Zusammenfassend, wurde in den histologischen Schnitten in allen vier

verschiedenen Mausgruppen eine Entzündung nachgewiesen, verglichen

mit der Vehikelgruppe (HCS 0.8 ± 0.8, n=4).

Die C57BL/6 Wildtypgruppe entwickelte, wie oben beschrieben, eine

eher milde bis moderate Entzündung. Im Vergleich dazu war der errech-

nete Histopathologische Colitis Score für die jeweiligen CB-Rezeptor defi-

zienten Mäusegruppen signifikant höher. ( C57BL/6: 4.7 ± 0.6, n=9 vs.

CB1-/-: 6.9 ± 0.8, n=9, p<0.05; CB2-/-: 8.2 ± 0.5, n=11, p<0.05; CB1+2-/-:

7.4 ± 0.8, n=10, p<0.05; Fig. 8). Allerdings wurde, beim Vergleich der HCS

Werte der Knockout Gruppen untereinander, kein Unterschied festgestellt.

Fig. 8 Histopathologischer Colitis Score

Wenn man die makroskopischen und die histologischen Parameter ins-

gesamt betrachtet, ergibt sich ein ähnliches Bild. Der Major Colitis Score

(MCS) ist für die vier TNBS behandelten Gruppen signifikant höher vergli-

chen mit der Vehikelgruppe (1 ± 1, n=4; Fig. 9). Der MCS war für die

Knockout Stämme ebenso höher als für die Wildtypgruppe (CB1-/-:

13,6 ± 1.4, n=9; CB2-/-: 14.6 ± 0.8, n=11; CB1+2-/-: 16.0 ± 1.0, n=10 vs.

C57BL/6: 8.6 ± 0.9, n=9, p<0.05; Fig.9).

Interessanterweise ergab sich nach dem Errechnen des MCS kein Un-

terschied in der Entzündungsausprägung zwischen den einzelnen Knock-

out Gruppen untereinander.

Ergebnisse

63

Fig. 9 Major Colitis Score (MCS)

4.2.3 RT-PCR Analyse

Die Expression der pro-inflammatorischen Zytokine TNF-α und IL-1β

wurde mit Hilfe der konventionellen PCR untersucht. Als Referenzgen

diente, wie oben beschrieben β-Actin. Um die Ergebnisse zu quantifizie-

ren, wurde die optische Dichte der jeweiligen Zytokinbande im Agarosegel

gemessen und in Relation zur β-Actin Bande gesetzt.

In der Vehikelgruppe zeigten sich schwache Banden für IL-1β bezie-

hungsweise für TNF-α.

Die Behandlung mit TNBS führte zu einem signifikanten Anstieg der

mRNA Expression für die beiden pro-inflammatorischen Zytokinen in allen

Mäusegruppen. Dabei war die Expression in der CB1-/- Gruppe, in der

CB2-/- Gruppe und in der CB1+2-/- Gruppe jeweils verglichen mit der Ex-

pression in der C57Bl/6 Wildtypgruppe signifikant höher, was für eine ver-

stärkte Entzündungsausprägung in den drei Knockout Stämmen spricht.

Allerdings ergab der interindividuelle Vergleich der drei KO Gruppen kei-

nen Unterschied in der Zytokinexpression (Fig. 10).

Ergebnisse

64

Fig. 10 Oben: beispielhafte Darstellung von PCR-Produkte Unten: Statistische Gesamtauswertung der Zytokinexpression in Rela-

tion zu β-Actin. Die Expression von IL-1β und TNF-α in den drei Knockoutstämmen war signifikant stärker verglichen mit der C57BL/6 Wildtypgruppe, was für eine verstärkte Entzündungsausprägung spricht. Der Vergleich der Knockoutgruppen untereinander ergab keinen signifikanten Unterschied.

• 1 = CB1+2 -/-

• 2 = CB2 -/-

• 3 = CB1 -/-

• 4 = C57BL/6

• 5 = Vehikel

TNF-αααα

IL-1ß

ß-Actin

Diskussion

65

5. Diskussion

5.1 Zusammenfassung der Ergebnisse

5.1.1 Anandamidapplikation lindert die TNBS-induzie rte Colitis

In dieser Studie untersuchten wir den Einfluss des Endocannabinoidli-

ganden Anandamid auf die TNBS-induzierte Colitis in AKR Mäusen. Zu

diesem Zweck hatten wir einem Teil der Mäuse nach TNBS Applikation

intraperitoneal 5mg/kg Anandamid injiziert. Wir konnten zeigen, dass so-

wohl die Entzündungsparameter, im Sinne von makroskopischen und his-

tologischen Kriterien, als auch die Expression der pro-inflammatorischen

Zytokine, IL-1β und TNF-α, in den untersuchten Kolonabschnitte der be-

handelten Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant reduziert wa-

ren.

5.1.2 CB-Rezeptor defiziente Mäuse entwickeln eine schwerere Colitis

In den Versuchsreihen zur Evaluierung der Rolle der einzelnen Endo-

cannabinoidrezeptoren bei Colitis, hatten wir CB1-/- und zum ersten Mal

CB2-/- sowie CB1+2-/- Mäuse untersucht. Im Vergleich zu den C57BL/6

Wildtypmäusen entwickelten die Knockout Stämme eine stärkere Entzün-

dung als Folge der TNBS Applikation. Die Colitis wurde mittels makrosko-

pischer und histologischer Scores evaluiert. Zudem wurde die Zytokin-

expression (IL-1β und TNF-α) gemessen. Es zeigte sich eine erhöhte

Suszeptibilität aller drei KO Stämme verglichen mit den Wildtypen, jedoch

konnten wir keinen Unterschied in der Entzündungsausprägung zwischen

den einzelnen Knockout Gruppen untereinander feststellen.

Diskussion

66

5.2 Diskussion

5.2.1 Anandamidapplikation lindert die TNBS-induzie rte Colitis

Massa et al. zeigten 2004, dass das endogene Cannabinoidsystem in

der Modulation der akuten Phase der experimentellen DNBS- und DSS-

induzierten Colitis involviert ist. Hierbei stellten die Autoren eine erhöhte

Transkriptionsrate für die den CB1-Rezeptor kodierende mRNA in den

Wildtypmäusen nach Entzündungsinduktion fest [Massa et al. (2004)]. Da-

bei schien die Zahl der CB1-exprimierenden Zellen signifikant erhöht zu

sein, ohne dass sich an der Gesamtzahl der Neurone etwas änderte. Aus

diesem Grund nahm man an, dass Neurone, die unter basalen/normalen

Bedingungen nur eine geringe oder nicht-nachweisbare Expression an

CB1-Rezeptoren aufweisen, die Expression bei Entzündung im Kolon stark

hochregulieren, um den endocannabinoiden Signalweg zu verstärken

[Massa et al. (2004)].

Basierend auf diesen Beobachtungen, war es sehr wahrscheinlich,

dass der exogen zugeführte CB1-Agonist Anandamid in unserem Experi-

ment, im aktivierten Status des Endocannabinoid Systems während der

Entzündung, anti-inflammatorische Eigenschaften besaß.

Des Weiteren wurden im Darm der mit DNBS behandelten Mäuse, in

der Kolonsubmukosa von TNBS behandelten Ratten sowie in Biopsien

von Patienten mit Colitis ulcerosa stark erhöhte Anandamidkonzentratio-

nen gefunden. (Hingegen war die Konzentration von 2-AG unverändert

geblieben [D’Argenio et al. (2006)]). Die Hypothese über den antientzünd-

lichen Effekt des aktivierten Endocannabinoid Systems wird weiterhin

durch Studien mit dem AMT Blocker VDM-11 unterstützt. Durch den Inhi-

bitor konnten die endogenen Anandamidkonzentrationen im Darm soweit

erhöht werden, dass sich die DNBS-induzierte Entzündung in Mäusen lin-

derte [D’Argenio et al. (2006)]. Wir konnten hier ebenfalls eine Linderung

der TNBS-induzierten Colitis zeigen, allerdings erhöhten wir die Ananda-

midspiegel durch exogene Applikation. Die von uns ermittelte deutlich

wirksame Dosis lag bei 5 mg/kg.

Diskussion

67

Zur Quantifizierung unserer Beobachtungen wurden verschiedene Pa-

rameter der akuten Colitis ausgewertet, unter anderem die Kolonverkür-

zung und das Kolongewicht. Letzteres ist ein Indikator für glanduläre Hy-

persekretion, Muskelhypertrophie und ödematöse Schwellung der Darm-

wand, während die Kolonverkürzung auf einer neuromuskulären Kontrak-

tion der glatten Muskulatur beruht [Diaz-Granados et al. (2000), Egger et

al. (2000)]. Gerade während der frühen Phasen der Entzündung ist die

erwähnte Muskelkontraktion sehr ausgeprägt und lässt schließlich in den

späten Phasen nach [Hosseini et al. (1999), De Man et al. (2001)]. Mittels

intrazellulärer Potenzialableitung konnten Massa et al. (2004) zeigen, dass

in der inneren Ringmuskelschicht im Kolon von CB1-/- Mäusen nach der

Induktion der DNBS Colitis eine erhöhte Spontanaktivität herrschte, vergli-

chen mit den Ableitungen aus dem Kolon von Wildtypmäusen. Dies er-

laubt die Annahme, dass der Gi/0-Protein gekoppelte CB1-Rezeptor

(s. Kap. 1.3) bei der tonischen Muskelkontraktion der glatten Darmmus-

kulatur eine prominente Rolle spielt [Massa et al. (2004)]. Unsere Ergeb-

nisse deuten darauf hin, dass Anandamid die Kontraktionen der glatten

Muskulatur im entzündeten Kolon reduzierte, denn in der Behandlungs-

gruppe konnten wir im Vergleich zu TNBS Gruppe starke Kolonverkürzun-

gen verhindern.

Weitere Studien haben gezeigt, dass Endocannabinoide auch über an-

dere Rezeptoren als den CB1-Rezeptor wirken können. Die Stimulation

der Cannabinoidrezeptoren mit dem potenten synthetischen Agonisten

HU210 linderte ebenfalls die DNBS Colitis [Massa et al. (2004)]. HU210 ist

allerdings in der Lage, neben den CB1-Rezeptor auch den CB2-Rezeptor

zu aktivieren [Howlett et al. (2002), Howlett et al. (1990)]. Anandamid, ob-

wohl es die höchste Affinität gegenüber dem CB1-Rezeptor besitzt,

(s. Kap.1.4), kann demzufolge auch den, ebenfalls Gi/0-Protein gekoppel-

ten, CB2-Rezeptor, der überwiegend von Immunzellen exprimiert wird,

stimulieren [Eisenstein et al. (2007)]. Somit ist es nicht auszuschließen,

dass ein immunmodulatorischer Effekt des Anandamids zur Linderung der

Colitis in unserer Versuchsreihe geführt hat.

Diskussion

68

Ein möglicher weiterer Zielrezeptor für Anandamid über den wir unsere

entzündungshemmende Wirkung erklären können ist der TRPV1-Rezeptor

(transient receptor potential vanilloid 1) [Di Marzo et al. (2002)]. Ebenso

wie der CB1-Rezeptor ist der TRPV1 auf Neuronen des intrinsischen und

extrinsischen Nervensystems des Gastrointestinaltraktes exprimiert

(s. auch Kap.1.5) [Kimball et al. (2004)]. Im menschlichen Kolon wird der

Vanilloid-Rezeptor Typ 1 während einer Entzündung sowohl von den nozi-

zeptiven Afferenzen als auch von den Epithelzellen überexprimiert [Sartor

et al. (1991)]. Anandamid ist ein TRPV1-Rezeptor Agonist und kann durch

dessen Aktivierung eine neurogene Entzündung4 induzieren [Ahluwalia et

al. (2003)]. Interessanterweise, entwickeln TRPV1 defiziente Mäuse eine

erhöhte Suszeptibilität gegenüber der DNBS-induzierten Colitis, was dafür

spricht, dass die neurogene Entzündung bei der Colitis eine protektive

Wirkung haben könnte [Massa et al. (2006)]. Der TRPV1 Agonist Capsai-

cin zeigte nach topischer Applikation einen protektiven Effekt bei der

TNBS-induzierten Colitis [Goso et al. (1993)]. Durch weitere Versuche

wurde festgestellt, dass die durch den TRPV1-Rezeptor mediierten schüt-

zenden Effekte durch die Freisetzung des Neuropeptids CGRP (Calcitonin

Gene related Peptide) aus den Nervenendigungen hervorgerufen werden

[Eysselein et al. (1991), Renzi et al. (1992)]. Folgerichtig konnten Reins-

hagen et al. (1998) zeigen, dass sich die TNBS-induzierte Colitis nach der

subkutanen Applikation eines CGRP-Antagonisten verstärkte. Für weitere

protektive Eigenschaften des Anandamids bei der TNBS Colitis könnten

ebenfalls die vasodilatatorischen Effekte, die über den EP4-Rezeptor me-

diiert werden, verantwortlich sein. Der EP4-Rezeptor wird von den glatten

Muskelzellen in der Media der Gefäße exprimiert und seine Aktivierung

führt zur Muskelrelaxation [Herradon et al. (2007)]. Es wird zudem vermu-

tet, dass Anandamid über endotheliale non-CB1/non-CB2-Rezeptoren die

NO (Stickstoffmonoxid)-Synthese induzieren und folglich ebenfalls eine

Vasorelaxation bewirken kann [Herradon et al. (2007)]. Jedoch wird die

4 Neurogene Entzündung: die Aktivierung dünner sensorischer Nervenfasern durch noxi-sche Reize bewirkt die Freisetzung der Neuropeptiden Substanz P und CGRP (Calcitonin Gene related Peptide). Diese Peptide steigern die Permeabilität des Gefäßendothels (=Plasmaextravasation= Schwellung) bzw. führen zur Erschlaffung glatter Gefäßmusku-latur (=Vasodilatation). Der Vorgang bleibt örtlich begrenzt und wird durch die Gefäßwir-kungen anderer Entzündungsmediatoren ergänzt.

Diskussion

69

Rolle des NO in der Pathogenese der entzündlichen Darmerkrankungen

kontrovers diskutiert. Hohe NO-Konzentrationen, synthetisiert durch die

iNOS (inducible Nitric Oxide Synthase) sind mit der Colitis ulcerosa asso-

ziiert [Cross et al. (2003)] und korrelieren mit deren Aktivität [Guihot et al.

(2000)]. Außerdem ist die iNOS-Expression sowohl beim Morbus Crohn

als auch in der experimentellen Colitis hochreguliert [Grisham et al.

(2002)]. Dennoch, während eine Reihe von tierexperimentellen Studien

eine Besserung der induzierten Colitis durch die iNOS-Hemmung be-

schreiben [Menchen et al. (2001), Kankuri et al. (2001)], berichten andere

über Ineffektivität [Vardareli et al. (2003), Armstrong et al. (2000)] oder so-

gar schädliche Wirkungen der iNOS-Inhibition [Diskopoulos et al. (2001),

Yoshida et al. (2000)]. Zudem ist von Aoi et al. (2008) gezeigt worden,

dass NO, hauptsächlich durch die iNOS und teils durch die eNOS (endo-

theliale NO-Synthase) synthetisiert, zur epithelialen Wundheilung im Ko-

lon, im Rahmen der DSS-induzierten Colitis, durch die Hochregulierung

von VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) beiträgt.

Zusammengefasst, haben wir in unserer Studie anti-inflammatorische

Effekte des systemisch applizierten Anandamids bei der TNBS-induzierten

Colitis nachweisen können. Hiermit ergibt sich eine berechtigte Hoffnung,

dass ein therapeutischer Ansatz, der die Aktivierung des ECS beinhaltet

künftig klinisch bei Patienten mit CED genutzt werden kann.

5.2.2 CB-Rezeptor defiziente Mäuse entwickeln eine verstärkte Colitis

Bisher fokusierten sich viele Studien hauptsächlich auf die Aktivierung

des Endocannabinoid Systems (ECS) im Rahmen der Entzündung. Der

Hauptgrund liegt wohl darin, dass der therapeutische Nutzen mit der Akti-

vierung des Systems korreliert. Die Stimulation der beiden Endocannabi-

noid-Rezeptoren resultiert in einer Linderung der Darmentzündung. Syn-

thetische und endogene Cannabinoide reduzieren die Neurotransmit-

terfreisetzung, was die intestinale Motilität und Sekretion während einer

Entzündung beeinflusst und folglich zur Verminderung der Diarrhö führt.

Wir konnten in der vorausgegangenen Studie (siehe oben) zeigen, dass

Diskussion

70

die systemische Anandamidapplikation zu einer verminderten Freisetzung

der inflammatorischen Mediatoren IL-1β und TNF-α sowie zu verbesserten

makroskopischen und histologischen Colitis Scores führt. Zusätzlich ist

von Wright et al. (2005) demonstriert worden, dass der CB1-Rezeptor eine

Funktion in der epithelialen Wundheilung besitzt. Sowohl für den CB1- als

auch für den CB2-Rezeptor gibt es gute Studien, die eine protektive Wir-

kung einem der beiden Rezeptoren zuordnen. Allerdings zeigten die ver-

schiedenen Colitis Modelle eine Diskrepanz der Ergebnisse im Hinblick

auf die Frage, welcher der beiden Rezeptoren die prädominante Rolle im

anti-inflammatorischen Geschehen spielt. Um ein besseres Verständnis

für die Pathogenese der Colitis, und damit auch für die chronisch entzünd-

lichen Darmerkrankungen und nicht zuletzt für die Rolle des ECS unter

normalen und pathologischen Bedingungen zu erlangen, sind Untersu-

chungen notwendig, ob eine Störung im Rezeptor-System die Colitis

aggraviert. Eine solche Störung wird hier durch das Fehlen eines oder

beider CB-Rezeptoren simuliert.

In unserer Versuchsreihe konnten wir nachweisen, dass das Fehlen je-

weils des einen und der beiden CB1- und CB2-Rezeptoren zusammen in

einer Aggravation der experimentellen Colitis resultiert. Diese ging einher

mit einer erhöhten Expression der pro-inflammatorischen Zytokine TNF-α

und IL-1β und spiegelte sich in der verstärkten Ausprägung der makro-

skopischen und histologischen Entzündungsparameter der Colitis wider.

Wie bereits erwähnt, berichteten Massa et al. (2004) über eine ver-

stärkte Entzündungsantwort in CB1-Rezeptor defizienten Stämmen und in

Mäusen, die mit dem selektiven CB1-Antagonisten SR141716A behandelt

wurden in den Modellen der DNBS- und DSS-induzierten Colitis. Diese

Ergebnisse konnten wir mit den Daten aus der TNBS-induzierten Colitis in

CB1-/- Mäusen bestätigen. Wir konnten aber auch zum ersten Mal de-

monstrieren, dass die Deletion des CB2-Rezeptors ebenfalls die Suszepti-

bilität für die TNBS Colitis erhöht, und zwar in einer ähnlichen Ausprägung

wie bei den CB1-Knockout Mäusen. Die Verstärkung der Colitis bei den

CB2-/- Mäusen spricht für einen tonischen anti-inflammatorischen Effekt

des ECS via CB2.

Diskussion

71

Es gibt Hinweise dafür, dass unter verschiedenen inflammatorischen

Bedingungen, in vitro und in vivo, synthetische und endogene CB-Rezep-

tor Agonisten über den CB2-Rezeptor die Aktivität von Mastzellen und

Granulozyten herunterregulieren, was zu einer reduzierten Zytokinfreiset-

zung führt [Parolaro et al. (1999), Klein et al. (2000), Massi et al. (2000)].

In TNBS- und DSS-induzierten Colitis Modellen limitierte die Stimulation

des CB2-Rezeptors die Immunzellenrekrutierung, verminderte dadurch die

Zytokin- und Chemokinfreisetzung und verbesserte folglich makroskopi-

sche und histologische Scores [Wright et al. (2008)]. Hier schien die pro-

phylaktische selektive CB2-Rezeptor Aktivierung in der OM (Oil of mustard

= Senföl)-induzierten Colitis viel effektiver zu sein [Kimball et al. (2006)].

Die Autoren vermuteten, dass der CB2-Agonismus primär eine Hemmung

der Immunzellinfiltration auslöst. Vorher wurde der selektive CB2-Agonist

AM1241 auf seine protektiven Eigenschaften hin in dem Modell der akuten

DSS-induzierten Colitis und in einem immunologischen Colitis Modell

(Gαi2-/- T-Zellen induzierte Colitis) getestet [Ziring et al. (2007)]. Während

AM1241 keinen Effekt auf die DSS Colitis aufwies, wirkte es im immunolo-

gischen Modell protektiv. Über dies hinaus, fanden Ziring et al (2006) her-

aus, dass CB2-defiziente Mäuse eine unzureichend entwickelte splenische

Marginalzone sowie mangelhafte peritoneale B1a-Lymphozyten, spleni-

sche CD4+-Gedächtnis-T-Zellen, intestinale natürliche Killerzellen und zy-

totoxische T-Zellen aufwiesen. Dies lässt vermuten, dass über den CB2-

Rezeptor die Entwicklung und die Aktivität der immunregulatorischen Zell-

populationen moduliert werden und, dass das ECS generell für die Bildung

von T- und B-Zellsubpoulationen, die für die Immunhomöostase wichtig

sind, erforderlich ist [Ziring et al. (2006)]. Aktuelle Daten, gewonnen aus

Kolonepithelzelllinien (HAT-29) unterstreichen die Rolle des CB2-Rezep-

tors als Protektor gegen Darmentzündung. Hier hemmte ein selektiver

CB2-Agonist und nicht ein CB1-Agonist die TNF-α induzierte Freisetzung

des pro-inflammatorischen Zytokins IL-8 [Ihenetu et al. (2003)].

Zusammengefasst scheint der CB2-Rezeptor für ein funktionierendes

angeborenes und erworbenes Immunsystem verantwortlich zu sein. Das

Fehlen des CB2-Rezeptors in unserer Versuchsreihe könnte infolgedessen

zu einer Disinhibition der inflammatorischen Antwort geführt haben. Inte-

Diskussion

72

ressanterweise war die verbleibende Funktionalität des CB1-Rezeptors

nicht ausreichend um die Colitis zu hemmen.

Als nächstes könnte man erwarten, dass in den CB1 und CB2 Doppel-

knockout Mäusen die Entzündung noch stärker abläuft, verglichen mit den

Stämmen, denen nur ein Rezeptor fehlte, da nun neurogene (CB1) und

immunologische (CB2) Mechanismen disinhibiert wurden. In unserer Ver-

suchsreihe war dies jedoch nicht der Fall. Diese Tatsache könnte man

sich durch die Annahme erklären, dass die Endocannabinoidsynthese und

–freisetzung durch die Rezeptordeletion nicht beeinträchtigt war. Es kann

deshalb nicht ausgeschlossen werden, dass Nicht-Cannabinoidrezeptor

Effekte den Entzündungsverlauf beeinflusst haben. Wie oben

beschrieben, wirkt Anandamid über andere Rezeptoren, wie TRPV1 oder

EP4 protektiv. Dies würde erklären, warum eine überschießende

Entzündungsantwort in den CB1+2-/- Mäusen ausblieb.

Schließlich spricht die Tatsache, dass alle Knockout Stämme, vergli-

chen mit den TNBS behandelten C57BL/6 Wildtypen, eine verstärkte Coli-

tis entwickelt hatten, für den protektiven Effekt der Cannabinoid-Rezepto-

ren im Entzündungsgeschehen und dieser übersteigt quantitativ Nicht-CB-

Rezeptor vermittelte protektive Effekte funktionell in vivo.

5.3 Klinische Relevanz

Mit Hilfe der Tiermodelle, für entzündliche Darmerkrankungen, konnten

in den letzten Jahren viele Informationen über die immunpathogeneti-

schen Mechanismen und die sich daraus herleitenden therapeutischen

Möglichkeiten gewonnen werden. Obwohl man die Entzündungserschei-

nungen im Maus Modell nicht auf den Menschen übertragen kann, gilt das

Modell der TNBS-induzierten Colitis als etabliert, wenn es darum geht den

Morbus Crohn in der Maus zu studieren [Storr et al. (2008); Wirtz et al.

(2007)].

Diskussion

73

Laut Izzo et al. (2001) wurden noch vor einem Jahrhundert Extrakte der

Pflanze Cannabis sativa zur Behandlung von gastrointestinalen Schmer-

zen, Gastroenteritiden und Diarrhoe verwendet. Ebenso gibt es anekdoti-

sche Berichte über Patienten mit Morbus Crohn, die eine Besserung der

Symptomatik nach dem Konsum von Cannabis verspürten [Storr et al.

(2008); Izzo et al. (2001)].

Die wachsende Evidenz über die modulatorischen Effekte des Endo-

cannabinoid Systems auf den Gastrointestinaltrakt bezüglich Motilität,

Sekretion, Entzündung, Gewebsproliferation und Karzinogenese, sowie

die zentralen appetitstimulierenden und antiemetischen Wirkungen, lassen

das ECS als einen neuen therapeutischen Ansatzpunkt in der Gastroente-

rologie attraktiv erscheinen [Di Marzo et al. (2006)].

Im Rahmen der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen könnten

die anti-inflammatorischen und anti-sekretorischen Effekte des ECS ge-

nützt werden. Zudem wird über den CB1-Rezeptor durch die Abnahme der

Muskelkontraktionen und der Darmmotilität eine krampflösende und damit

analgetische Wirkung erzielt. Die epitheliale Regeneration induziert durch

denselben Rezeptor ist ebenfalls vorteilhaft.

Ein möglicher therapeutisch eingesetzter Agonist sollte jedoch nicht li-

quorgängig sein, um keine zentrale Effekte auszulösen [Duncan et al.

(2005), Di Marzo et al. (2006), Izzo et al. (2001)]. Di Marzo et al. (2006)

schlugen einen unselektiven CB1/CB2 Agonisten vor, da die protektive

Wirkung vielmehr durch beide Rezeptoren induziert wird. Unsere Ergeb-

nisse untermauern diesen Vorschlag.

Eine weitere Option liegt zum einen in der Hemmung des Abbaus der

endogenen Liganden durch FAAH-Inhibitoren und zum anderen in der

Hemmung des Rücktransports. Dies würde laut Di Marzo et al (2006) den

Anstieg der Anandamidkonzentration an den Stellen hervorrufen, wo seine

Synthese aufgrund der inflammatorischen Bedingungen schon gesteigert

ist. Diese Art des äußeren Eingriffs in das Endocannabinoid System ist

zudem selektiver und physiologischer. In diesem Zusammenhang könnte

die nicht resorbierbare topische Anandamidapplikation (Klysmen, Einläufe

oder lokal wirkende orale Pharmaka) zur Behandlung eines akuten Schu-

bes einer chronisch entzündlichen Darmerkrankung Wirkung zeigen.

Diskussion

74

Eine zufrieden stellende Therapie des Morbus Crohn oder der Colitis

ulcerosa gibt es bislang nicht. Die langfristige Cortisongabe und die neue-

ren Anti-Zytokin Therapeutika, wie TNF-α Antikörper besitzen ein zu gro-

ßes Nebenwirkungsspektrum. Deshalb wäre eine spezifischere Therapie

wünschenswert. Das Endocannabinoid System spielt bei den CED eine

prominente Rolle. Der Beweis, dass seine Aktivierung beim Menschen

während eines akuten Schubes oder in der Remission therapeutisch wirk-

sam ist, kann jedoch nur durch größere klinische Studien erbracht werden.

Zudem zeigen unsere Ergebnisse aus den CB-Rezeptor Knockout Ver-

suchen, dass Medikamente, die eine antagonistische Wirkung auf CB1-

oder CB2-Rezeptoren besitzen, ausführlicheren vorklinischen Studien un-

terzogen werden sollten, da die Induktion einer Colitis durch diese denk-

bar ist.

Abkürzungsverzeichnis

75

Abkürzungsverzeichnis

2-AG: 2-Arachidonylglycerol

CB-Rezeptor: Cannabinoid-Rezeptor

CB-/-: Cannabinoid-Rezeptor Knockout

CD (4/8): Cluster of Diferentiation (4 oder 8)

cDNA: Comptementär-DNA

CED: Chronisch Entzündliche Darmerkrankungen

CGRP: Calcitonin Gene related Peptide

CU: Colitis Ulcerosa

DNBS: 2,4-Dinitrobenzen-Sulfonsäure

DSS: Dextransulfatsodium

ECM1: Extrazelluläres Matrixprotein 1

ECS: Endocannabinoid System

ENS: Enterisches Nervensystem

FAAH: Fatty Acid Amide Hydrolase

GALT: Gut Associated Lymphoreticular Tissue

GI-Trakt: Gastrointestinaltrakt

IL-1β: Interleukin-1β

iNOS: inducible Nitric Oxide Synthase

KO: Knockout

LPS: Lipopolysaccharide

MAGL: Monoacylglycerol-Lipase

MC: Morbus Crohn

mRNA: messenger RNA

NF-κB: Nukleärer Faktor κB

NK: Natürliche Killerzellen

PCR: Polymerase Chain Reaction

RT: Reverse Transkription

Th-Lymphozyt: T-Helfer-Lymphozyt

TLR: Toll-Like-Rezeptoren

TNBS: 2, 4, 6-Trinitrobenzen-Sulfonsäure

TNF-α: Tumor-Nekrose-Faktor α

TRPV1-Rezeptor: Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1

Literaturverzeichnis

76

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Vorpublikation

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Danksagung

83

Danksagung

An dieser Stelle, möchte ich allen danken, die zum Entstehen dieser Arbeit

beigetragen haben. Insbesondere gilt mein Dank meinem Betreuer Herrn

Dr. med. M. Engel, der mir von Anfang an zur Seite gestanden hat. Die

Zusammenarbeit mit ihm habe ich als sehr angenehm empfunden. Die in-

haltlichen Diskussionen haben stets eine Dynamik aufrechterhalten.

Ebenfalls danke ich G. Burnat, der mich mit viel Geduld in die Labortätig-

keit eingearbeitet hat. Mein Dank gilt auch den Mitarbeitern des pathologi-

schen Instituts der FAU Erlangen-Nürnberg für die Anfertigung der histolo-

gischen Schnitten und v. a. Herrn Dr. med. T. Rau, der mich bei der histo-

logischen Auswertung unterstützt hat.

Nicht zuletzt möchte ich Herrn Prof. Dr. med. P. Konturek für seine tatkräf-

tige Unterstützung und für die Aufnahme in seinem Labor danken.

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