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BCR, Microenvironnement et LLC

Florence CYMBALISTAService d’hématologie biologique, Hopital Avicenne, AP-HP

INSERM UMR978, Université Paris13

U978

Les questions importantes dans la LLC

• Pas de difficultés diagnostiques

– La cytométrie est un outil majeur

• Evolution clinique très variable

– Difficile de distinguer formes graves et stables au diagnostic

– Comprendre cette hétérogénéité pour comprendre les déterminants de la progression

• Pas de traitement curateur (hormis allogreffe)

– Importance de comprendre la physiopathologie pour trouver de nouvelles cibles thérapeutiques

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Progression LLC = pool prolifératif

• Jusqu'en 2005 : accumulation clone = défaut apoptose

• 2005 : étude in vivo avec eau lourde (Messmer 2005)

Prolifération = composante majeure de l'accumulation chez les patients progressifs

(renouvellement jusqu'à 1% du clone par jour)

• Au sein du clone LLC existe une sous –population de cellules prolifératives (Callissano 2011)

� surexpriment gènes pro-survie et anti-apoptotique

Pool prolifératif

Progression LLC

Pool prolifératif

Progression LLC

Importance de la stimulation antigénique

Capacité signalisation BCR

Antigène interagitavec BCR

Antigène interagitavec BCR

Microenvironnementganglionnaire

Ganglion = site d’exposition à l’antigène

Ganglion = site d’exposition à l’antigène

Antigène

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Le devenir des cellules B normales est déterminé par l’exposition à l’antigène

• Les cellules B immatures doivent traverser 2 checkpoints – Dans la moelle, où elles sont générées et sont sélectinnées négativement – Dans la rate, où les cellules qui ont survécu à la sélection négative vont

renconrer les antigènes du soi conduisant à l’anergie et la mort

• Après ces deux checkpoints, les cellules B maturent and et sont capables de migrer dans les ganglions, via les venules endothéliales

• Les cellules B matures répondent alors à l’antigène par une activiation, une prolifération et une différenciation

• Le binding de l’antgène about it à la foramtion d’une signalosome formé d’un complexe de kinases et centré sur le récepteur B

Gonzalez S, Annu. Rev. Immunol. 2011

Les mutations somatiques des immunoglobulines

• Phénomène physiologique au cours de la différenciation des lymphocytes B :

- centres germinatifs des organes lymphoïdes secondaires

- mutations des gènes des immunoglobulines dans les parties variables des

anticorps dans le but d’obtenir une meilleure affinité de l ’anticorps pour l ’antigène

manteau Follicule secondaire

Cellule B naïve

Rencontre avec Ag

GC

B

B

T

B

Cellule B mémoire

Absence de mutations somatiques

Présence de mutations somatiques

CD38+

CD38 -Zone claire

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Mécanismes de diversité des immunoglobulines dans les cellules B normales

• Acquisition de la diversité des immunoglobulines– Diversité des gènes VH– Réarrangement VDJ– CDR3– Mutations somatiques

Ces réarrangements aboutissent à environ 1011 possibilités

CDR3

Statut mutationnel dans les LLC

manteau Follicule secondaire

Rencontre avec Ag

GC

B

B

T

B

Absence de mutations somatiques

Présence de mutations somatiques

CD38+

CD38 -Zone claire

Le statut mutationnel est plus discriminant que la classification de Binet sur la PFS

0

,2

,4

,6

,8

1

Sur

vie

Cum

.

0 50 100 150 200 250 300Temps

mutés

non mutés

médiane NA

Médiane98 mois

Stades Asurvie

0

,2

,4

,6

,8

1

Sur

vie

Cum

.

0 20 40 60 80 100 120 140Temps

médiane NA

Médiane79 mois

mutés

non mutés

Stades B et C

survie

Pronostic défavorable

Pronostic favorable

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Rôle de l’antigène dans la LLCRépertoire restreint

• Plusieurs arguments pour un rôle fort de l’antigène dans la physiopathologie de la LLC

– Répertoire biaisé : utilisation restreinte à quelques dizaines de VH– CDR3 stéréotypés retrouvés jusque dans 20% des LLC– Chaines légères stéréotypées– Mutations somatiques biaisées

• Restriction très importante des possibilités de diversité– Jusqu’à 1% de BCR identiques

• Exposition à l’antigène dans les LLC mutées– Exposition T dépendante– Dans le centre germinatif

• Exposition à l’antigène dans les LLC non mutées– Exposition T indépendante– Probablement répétées de faible intensité en dehors du centre

germinatif– Antigènes polyréactifs, autoantigènes?

• Expression de surface du BCR est faible, mais moins faible chez les non mutées

• Réponse à la stimulation différente

Hétérogénéité des LLC Rôle de l’antigène

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• Signature génomique de la LLC très forte et différente des autres hémopathies lymphoides

• Signature :

• inactivation de voies d’apoptose

• Seulement une centaine de gènes différemment exprimés entre les deux formes,

• Les gènes les plus discriminants des études génomiques comparant mutées et non mutées sont des gènes d'activation B

• L'expression du gène ZAP-70 en particulier, est très fortement corrélée à l'absence de mutations

Différences entre mutés et non mutés: même maladie?

Hétérogénéité des LLC Rôle de la signalisation B

Hétérogénéité des LLC ZAP-70

• ZAP-70 ne remplace pas la protéine syk dans la signalisation en aval du BCR

•ZAP-70 potentialise la signalisation BCR et semble impliqué dans le maintien du BCR à la membrane

•Sur le plan pronostique:

– Marqueur pronostique de substitution pour le statut mutationnel ?

– Valeur pronostique indépendante Complète l’information pronostique du statut mutationnel

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

ZAP70ZAP70ZAP70ZAP70++++ /Mutated */Mutated */Mutated */Mutated *

ZAP70ZAP70ZAP70ZAP70NegNegNegNeg /Unmutated*/Unmutated*/Unmutated*/Unmutated*

Années

ZAP70ZAP70ZAP70ZAP70++++ /Unmutated/Unmutated/Unmutated/Unmutated

ZAP70ZAP70ZAP70ZAP70NegNegNegNeg /Mutated/Mutated/Mutated/Mutated

(n = 307)

L Rassenti NEJM 2004

10 205 15

• Kinase de la signalisation dans les cellules T et NK, 2è membre de la famille Syk• En 2001 : 1ere description de l’expression de ZAP-70 dans une cellule lymphoïde B mature

•Zap-70 exprimée dans une partie des LLC

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Hétérogénéité des LLCCapacité de signalisation BCR

Pool prolifératif

Capacitésignalisation BCR

Progression LLC

?

Réponse à la stimulation antigénique in vitro(expérience utilisant anti-µ immobilisé)� 2 profils de réponses

Capacité de signalisation

� survie cellulaire in vitro

Pas de capacité

RépondeursBCR

RépondeursBCR

Non répondeursBCR

Non répondeursBCR

EvolutifsEvolutifs StablesStables

Survie globale

Répondeurs

Non répondeurs

Le Roy C (U978)

Deglesne PA et al. Survival response to B-cell receptor ligation isrestricted to progressive chronic lymphocytic leukemia cells irrespectiveof Zap70 expression. Cancer Res. 2006, 66(14):7158-66.

• Apoptose spontanée in vitro

• Co-culture avec cellules stromales prolonge la survie cellules LLC

• Infiltration médullaire présente à tous les stades de la maladie

• Infiltration ganglionnaire = patient progressif

Lagneaux, Blood,1998Schmid, Histopathology, 1994Osorio, Med Oncol, 1998

Relations microenvironnement – cellules LLC ?

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• La moelle� Atteinte médullaire constante� Infiltration médullaire massive = mauvais pronostic

MAIS………….

� Moelle ne semble pas être un site préférentiel de prolifération (2H2O) (van Gent 2008)

� Comparatif profil expression gènes cellules ganglion versus moelle (Herishanu 2011)

� cellule ganglion = Profil expression cellules activées/prolifératives

Deux sites de prolifération : moelle et ganglions

Pool prolifératif

Microenvironnementtissulaire

Progression LLC

• Ganglion = site de la stimulation antigénique

• Ganglion = site préférentiel de prolifération

� Adénopathies= patient progressif

� Pseudo-follicules dans ganglion LLC = site de prolifération

� Fraction cellules LLC qui sort des gg = fraction proliférative (Vandewoestyne 2011, Callissano 2011)

Pool prolifératif

Progression LLC

Au total

Capacité signalisation BCR

Survie cellulairepatients évolutifsSurvie cellulairepatients évolutifs

Microenvironnementganglionnaire

Ganglion = site de prolifération

Ganglion = site de prolifération

Capacité de signalisation BCR �rétention ganglionnaire cellules LLC ?

Capacité de signalisation BCR �rétention ganglionnaire cellules LLC ?

Impact microenvironnement ganglionnairesur l'accumulation du clone LLC

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Microenvironnement ganglionnaire

1) Ganglion normal• Molécules interagissant avec le ME ganglionnaire • Cellules du ME ganglionnaire• Organisation cellules du ME dans ganglion

2) Trajet du Ly B normal• Entrée (sang � ganglion)

• Trafic intra-ganglionnaire • Devenir du Ly B en fonction de la rencontre antigénique• Sortie du Ly B (ganglion � vaisseau efférent)

3) Trajet de la cellule de LLC• Altération de la structure du ganglion LLC• Entrée : adhésion – transmigration• Trafic intra-ganglionnaire• Présentation antigénique

4) Interaction ME ganglionnaire – cellules de LLC• Impact du ME ganglionnaire sur la survie cellules LLC • Les cellules de LLC modifient le ME à leur profit

5) Impact de la stimulation Ag des cellules LLC sur effecteurs ME ganglionnaire

Architecture du ganglion

T zone

Donnée personnelle

T zone

• Ganglion organisé en zone B, zone T et zone médullaire- Ly B localisés dans la zone B (follicule)- Ly T localisés dans la zone T (région para-corticale)- Médulla connectée au vaisseau efférent- Ganglion irrigué par vaisseaux sanguins

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1) Ganglion normal• Molécules impliquées dans le ME ganglionnaire • Cellules du ME ganglionnaire• Organisation cellules du ME dans ganglion

2) Trajet du Ly B normal• Entrée (sang � ganglion)

• Trafic intra-ganglionnaire • Devenir du Ly B en fonction de la rencontre antigénique• Sortie du Ly B (ganglion � vaisseau efférent)

3) Trajet de la cellule de LLC• Altération de la structure du ganglion LLC• Entrée : adhésion – transmigration• Trafic intra-ganglionnaire• Présentation antigénique

4) Interaction ME ganglionnaire – cellules de LLC• Impact du ME ganglionnaire sur la survie cellules LLC • Les cellules de LLC modifient le ME à leur profit

5) Impact de la stimulation Ag des cellules LLC sur effecteurs ME ganglionnaire

Sélectines

• Selectines : famille de molecules d'adhesion

• L-selectin (CD62L) seule exprimée par les lymphocytes

• Ligands

• Venules endothéliales: glycanes S

• cellules endothéliales lymphatiques: récepteur au mannose Endothélium

Impliqués dans entrée et sortie du ganglion (traversée de l'endothélium)Clivage rapide permet le « rolling »

Rolling

Grailer JJ, J Dermato Sci, 2009Vlad A, Cancer Res, 2009

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Intégrines

EndothéliumCellule stromaleLymphocyte T

Lymphocyte B

• Glycoprotéines transmembranaires• (αβ hétérodimères)

• Intégrines (VLA4, LFA1) exprimés lymphocytes B

• Ligands (VCAM, ICAM) exprimés :- Cellule endothéliale- Cellule stromale- Lymphocyte T

Impliqués dans :- Entrée des cellules B dans ganglion- Interaction avec cellules de la matrice- Synapse immunologique

Batista , Immunol Rev, 2007Abram C, Immunol Rev, 2007Evans R, J Cell Sci, 2009Arana E, J Cell Sci, 2008

Chimiokines

B

T

CXCL12

CXCR4

• Chimiokines (CXCL, CCL) � sécrétées par cellules stromales

• Récepteurs des chimiokines (CXCR, CCR) � lymphocytes T et B

• Couples chimiokine/récepteur� CXCR4 – CXCL12� CXCR5 – CXCL13� CCR7 – CCL19/21 CS

CCR7 CCL19/21

Impliqués dans :- Entrée des cellules B dans ganglion- Migration des lymphocytes B et T dans le ganglion dans leurs zones respectives

CXCL13

CXCR5

Schrotter P, Ann Hematol, 2010u Cyster J, AnnRev Immunol, 2005Johnson SA, Ann NY Acad Sci, 2008

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Cytokines pro-survie Ly B

• Cytokines de la famille du TNF

� BAFF, APRIL� Membranaires ou sécrétés par cellules stromales� effet pro-survie T-indépendant

� CD40L � membranaire ou sécrété par lymphocytes T� effet pro-survie T-dépendant

B

CS

T

CD40L

CD40

IL4

IL4-R

• Interleukines : IL4 notamment� sécrétées par cellules T

BAFF, APRILBCMA, TACI

Elgueta R, Immunol Rev, 2009Ceruti A, Trends in Immunol, 2011

1) Ganglion normal• Molécules interagissant avec le ME ganglionnaire

• Cellules du ME ganglionnaire• Organisation cellules du ME dans ganglion

2) Trajet du Ly B normal• Entrée (sang � ganglion)

• Trafic intra-ganglionnaire • Devenir du Ly B en fonction de la rencontre antigénique• Sortie du Ly B (ganglion � vaisseau efférent)

3) Trajet de la cellule de LLC• Altération de la structure du ganglion LLC• Entrée : adhésion – transmigration• Trafic intra-ganglionnaire• Présentation antigénique

4) Interaction ME ganglionnaire – cellules de LLC• Impact du ME ganglionnaire sur la survie cellules LLC • Les cellules de LLC modifient le ME à leur profit

5) Impact de la stimulation Ag des cellules LLC sur effecteurs ME ganglionnaire

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LymphocytesT folliculaires helper

• They are a subset of CD4+– Different from Treg , and TH1, 2, 17– Follicular location,– High expression of

• CXCR5• Bcl6,• T cell inhibitory receptor PD-1• IL-21

• Required for the production of memory Bcells in the GC

• Numerous interactions between B and TFH

• B cells act as antigen presenting cells– Interaction TCR, Ag-MHC– Upregulation CD40L– ICOS (inducible co-stimulator) – Secretion IL21

Nutt SL, Nature immunol, 2011Crotty S, Annu Rev Immunol, 2010

CD40L

ICOS

IL-21CD40

B

TCR

AgMHC

IL21R

Les cellules dendritiques (DC)

DC

• Rôle mal connu chez l’homme, car la plupart des notions viennent de l’expérimentation chez la souris

• Cellules localisées dans zone para-corticale

• Différents types avec différents roles– DC "migratoires" (HEV, vaisseaux lymph)– DC "résidentes" (zone T)

• Capture, mature et présente l'Ag auxcellules T

TCR

T

Ag

El Shikh M, Trends in Immunol 2010Gonzalez S, Annu. Rev. Immunol. 2011

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FDC

Les cellules dendritiques folliculaires (FDC)

• Cellules "stromales" localisées dans follicules (zone B)

• Forment un réseau dans le follicule

• Expriment ligand intégrine (VCAM, ICAM)� adhésion FDC – cellule B

• Sécretent chimiokines CXCL12/CXCL13 � attraction cellules B dans zone B

• Sécrètent des cytokines Il-6 et BAFF� survie cellules B dans zone B

• Présentent l'Antigène au BCR� stimulation Ag T-indépendante

BAdhesion

Attraction

Ag presentation

Survival

Les fibroblastes réticulaires (FRC)

• Cellules stromales localisées dans zone T

• Infrastructure avec fibres rétiulaires riches en collagène aidant à la migeation des cellules B, T et DC

• Sécrètent chimiokines CCL19/21� attraction cellule T dans la zone T

• Forme un réseau sur lequel migrent lymphocytes T et DC

• Forme un "conduit " dans lequel circulent les antigènes

DC

conduit

Ag

CCL19/21

CCR7

Allen C, Seminars Immunol, 2008El Shikh M, Trends in Immunol 2010Gonzalez S, Annu. Rev. Immunol. 2011

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Les cellules endothéliales

TB

Cellules endothéliales Vasculaires(HEV)

Sang

Ganglion

Entrée

Cellules endothéliales lymphatiques

TBGanglion

SortieSinus

lymphatique

Autres cellules

• Medullary Fibroblasts – ill characterized– Might play a role in attracting lymphocytes

and DC (by CXCL12?)

• Subcapsular sinus lining macrophages – Capture particulate antigens and Ics– Relay them to B cells in the underlying

follicles.

Turley S, Immunology, 2010

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1) Ganglion normal• Molécules interagissant avec le ME ganglionnaire • Cellules du ME ganglionnaire

2) Trajet du Ly B normal• Entrée (sang � ganglion)• Trafic intra-ganglionnaire • Devenir du Ly B en fonction de la rencontre antigénique• Sortie du Ly B (ganglion � vaisseau efférent)

3) Trajet de la cellule de LLC• Altération de la structure du ganglion LLC• Entrée : adhésion – transmigration• Trafic intra-ganglionnaire• Présentation antigénique

4) Interaction ME ganglionnaire – cellules de LLC• Impact du ME ganglionnaire sur la survie cellules LLC • Les cellules de LLC modifient le ME à leur profit

5) Impact de la stimulation Ag des cellules LLC sur effecteurs ME ganglionnaire

1) Ganglion normal• Molécules interagissant avec le ME ganglionnaire • Cellules du ME ganglionnaire• Organisation cellules du ME dans ganglion

2) Trajet du Ly B normal• Entrée (sang � ganglion)• Trafic intra-ganglionnaire • Devenir du Ly B en fonction de la rencontre antigénique• Sortie du Ly B (ganglion � vaisseau efférent)

3) Trajet de la cellule de LLC• Altération de la structure du ganglion LLC• Entrée : adhésion – transmigration• Trafic intra-ganglionnaire• Présentation antigénique

4) Interaction ME ganglionnaire – cellules de LLC• Impact du ME ganglionnaire sur la survie cellules LLC • Les cellules de LLC modifient le ME à leur profit

5) Impact de la stimulation Ag des cellules LLC sur effecteurs ME ganglionnaire

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Capture : CD62L on B cells interacts with selectin ligand on HEV

Rolling : Rapid cleavage induces fast rolling

CD62L

Integrin

Chemokine

receptor

Selectin ligand

Integrin ligand

Chemokine

Adhesion and transmigration

Involve Integrins, selectin and CXCR4/CXCL12

HEV lumen

Lymph node

Integrin CD49d interacts with its receptor ICAM1

Stops rolling

Adhesion of lymphocyte

CD62L

Integrin

Chemokine

receptor

Selectin ligand

Integrin ligand

Chemokine

Adhesion and transmigration

HEV lumen

Lymph node

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Adhering lymphocyte expresses the chemokine receptor CXCR4 and is attracted by its ligand

CXCL12 secreted underneath the HEV

CD62L

Integrin

Chemokine

receptor

Selectin ligand

Integrin ligand

Chemokine

Adhesion and transmigration

HEV lumen

Lymph node

Lymphocyte transmigrates the HEV and gets into the lymphnode

CD62L

Integrin

Chemokine

receptor

Selectin ligand

Integrin ligand

Chemokine

Adhesion and transmigration

Batista F Immunol Rev, 2007

HEV lumen

Lymph node

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Trafficking of B and T cells into the lymph node

B and T cells enter through HEV and are immediately in contact with FRC

B cells migrate along the FRC conduit network to B follicles in response to CXCL13 secreted by FDC

T cells move to T zone along FRC reticular fibers in response to CCL19 and CCL21

B cells

T cells

B zone

Ex vivo migrationPersonal dataMueller S, Nat Rev Immunol, 2009

Ag presentation to B cells

Small Ag and IC captured by SLM

IC

FRC

conduit

HEV

B follicle

FDC

Migratory DC present

Ag to T cells

Afferentlymphatic

Several pathways for transport and presentation of Ag .

Small Ag and IC through FRC

conduits to FDC

SLM

FDC

T independent

T dependent

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Devenir Ly B en fonction rencontre Ag

Cellule B activée

Centre germinatif

TFH

CD40L CD40

B

TCR Ag CMH

FDC

BCR

Ag

� Prolifération intense Ly B� Mutations somatiques des IGHV� Switch de classe des Ig

Plasmocyte Cellule B mémoire

Follicule

Sortie Lymphocytes du ganglion

• Processus mal connu• Met en jeu la L-sélectine CD62L

Lymphocyte

CD62L

Récepteur mannoseganglion

Sinus lymphatique

ganglion

Sinus lymphatique

Lymphocyte

Vaisseau lymphatique efférent

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1) Ganglion normal• Molécules interagissant avec le ME ganglionnaire • Cellules du ME ganglionnaire• Organisation cellules du ME dans ganglion

2) Trajet du Ly B normal• Entrée (sang � ganglion)

• Trafic intra-ganglionnaire • Devenir du Ly B en fonction de la rencontre antigénique• Sortie du Ly B (ganglion � vaisseau efférent)

3) Trajet de la cellule de LLC• Altération de la structure du ganglion LLC• Entrée : adhésion – transmigration• Trafic intra-ganglionnaire• Présentation antigénique

4) Interaction ME ganglionnaire – cellules de LLC• Impact du ME ganglionnaire sur la survie cellules LLC • Les cellules de LLC modifient le ME à leur profit

5) Impact de la stimulation Ag des cellules LLC sur effecteurs ME ganglionnaire

Structure ganglion LLC

• Ganglion de LLC présente une architecture désorganisée

• Présence de Pseudofollicules– Contiennent cellules stromales, B et T– Structures proches de follicules secondaires normaux– site préférentiel de prolifération des cellules LLC (Vandewoestyne ML, 2011)

• Peu de données sur localisation des cellules du ME au sein d'un

ganglion LLC et sur expression des molécules du ME

Vandewoestyne ML, Leukemia, 2011

Personal data

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Entrée des cellules LLC

• Mécanismes adhésion/trans-migration similaires à ceux des cellules B normales

• Mais "capacité" de homing diffèrent entre LLC stable et LLC évolutive

expression variable CD49d

Expression normale CD62L

Expression normale CXCR4 et CXCL12

CLL

LLC évolutiveLLC évolutive

� Expression CD49d� Adénopathies

CLL

LLC stableLLC stable

� Expression CD49d diminuée� Homing réduit dans ganglion

Lagneaux L, Blood, 1998Zuchetto A, Cancer Res, 2009Buchner M, Blood, 2010

• High expression of chemokines receptors

– CXCR4 • Higher in the blood CLL cells than in

lymph node CLL

– CXCR5• Highly expressed on CLL cells

– CCR7• Expression on CLL cells, ligands

CCL19 and 21 by FRC.• CCR7 higher on CLL when ZAP-70+,

• Similar to normal B cells

Trafficking of CLL cells into the lymph node

CLL

Burger J, Sem Cancer Biol, 2010Vlad A, Cancer Res, 2009Calpe E, Blood, 2011Feretti E, Leukemia, 2011

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CLL have both T dependent and independent Ag presentation

IC

FRC

conduit

HEV

pseudo follicle

FDC

T dependent Ag presentation

Afferentlymphatic

CLL

CLL

CLL

T independent

Ag presentation

Pseudo follicles are likely to play the role of B follicle but disorganized architecture hinder analysis

Different according to IGHV status

Litterature poor on the role of microenvironment cells

Impact ME ganglionnaire sur cellule LLC

• Modèle basé sur études in vitro

� Attraction des cellules de LLC par cellules stromales (pseudo-follicules ?)

� Adhésion des cellules de LLC aux cellules stromales

� Signaux survie cellules de LLC émanant des cellules stromales

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Les "Nurse-like cells" (NLC)

• "Nurse-like cells" (NLC) = bon modèle d'étude des interactions microenvironnement – cellules LLC

• Chez le patient, présentes dans la moelle et (probablement) le ganglion

• NLC = Cellule d'origine monocytaire du sang de patient LLC Se différencie in vitro en cellule adhérente "stromale"

NLC

CD31

BAFFAPRIL

CXCL12

CXCL13

1) Ganglion normal• Molécules interagissant avec le ME ganglionnaire • Cellules du ME ganglionnaire• Organisation cellules du ME dans ganglion

2) Trajet du Ly B normal• Entrée (sang � ganglion)

• Trafic intra-ganglionnaire • Devenir du Ly B en fonction de la rencontre antigénique• Sortie du Ly B (ganglion � vaisseau efférent)

3) Trajet de la cellule de LLC• Altération de la structure du ganglion LLC• Entrée : adhésion – transmigration• Trafic intra-ganglionnaire• Présentation antigénique

4) Interaction ME ganglionnaire – cellules de LLC• Les "Nurse-like cells" (NLC)• Impact du ME ganglionnaire sur les cellules LLC • Les cellules de LLC modifient le ME à leur profit

5) Impact de la stimulation Ag des cellules LLC sur effecteurs ME ganglionnaire

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Supportive role of the microenvironment for the CLL clone survival

• Same prosurvival cytokines provided by microenvironment– BAFF APRIL

• Receptors BCMA and TACI expressed on CLL cells• BAFF and APRIL produced by stromal cells and NLC• CLL Survival factor

– CD40L• CD40 ligation provides a survival signal to B-CLL cells in vitro• Even if CD40/CD40L is not fully functional in CLL

– Other cytokines, IL4…

von Bergwelt-Baildon M, Ann Oncol, 2004Schrottner P, Ann Hematol, 2010Haiat S, Immunology, 2006

But CLL is also able to modulate the microenvironment and imm uneresponse to favor survival and progression of the clone

CLL cells shape the microenvironment1. Chemokines secreted by CLL

• Secretion of chemokines by CLL cells is induced – CCL3 and CCL4

• after BCR ligation or in the presence of NLC,

• Fonction ? Likely to attract T lymphocytes through their receptor CCR5

• Also after CD38-CD31 interaction

• High CCL3 blood levels bad prognostic parameter in CLL

– CCL22 • Expressed on CLL cells from SLO

• After CD40 ligand exposure

• Attract Treg expressing the receptor CCR4

• These chemokines are likely to create a microenvironment favorable to the survival of the CLL clone

Burger J, Sem Cancer Biol, 2010Zucchetto A, Cancer Res, 2009Sivia M, Blood 2011Ghia P, Eur J Immunol, 2002

CLL

CCL3CCL4 CCL22

CD40Lexposure

CD38

BCR ligation

CD31

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CLL cells shape the microenvironment 2. Abnormal T cell functions

• Increased numbers of CD4+ cells in CLL lymph nodes

• But functionally deficient– Impaired expression of CD40L (CLL bad APC)– Impaired immunological synapse.– Altered expression of genes involved in cell differentiation and

cytoskeletal formation– Suppressed T cell activation and effector responses.

• Induction of the same alterations in normal T cells co cultured with CLL cells

• CLL cells secrete immunomodulatory cytokines, such as interleukin-6, interleukin-10, and TGFbeta,

Ramsay A, JCI, 2008Riches J, Sem Cancer Biol, 2010

CLL cells shape the microenvironment 3. Incidence of CD38 expression

• CD38+ in 1/3 patients, worse outcome

• CD38 interact with ligands, including CD31 and hyaluronic acid, which regulate cell-cell and cell-matrix contacts.

• NLC and FDC express CD31

• CD38 /CD31 interaction – Rapid release of CCL3 and CCL4 by CLL cells– Strongly promotes chemotactic responses to CXCL12

• CD38+ on the proliferating fraction, on cells exiting SLO

• CD38 major constituant of invadosome

Malavesi F, Blood, 2011Deaglio S, Hematologica 2009

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1) Ganglion normal• Molécules interagissant avec le ME ganglionnaire • Cellules du ME ganglionnaire• Organisation cellules du ME dans ganglion

2) Trajet du Ly B normal• Entrée (sang � ganglion)

• Trafic intra-ganglionnaire • Devenir du Ly B en fonction de la rencontre antigénique• Sortie du Ly B (ganglion � vaisseau efférent)

3) Trajet de la cellule de LLC• Altération de la structure du ganglion LLC• Entrée : adhésion – transmigration• Trafic intra-ganglionnaire• Présentation antigénique

4) Interaction ME ganglionnaire – cellules de LLC• Les "Nurse-like cells" (NLC)• Impact du ME ganglionnaire sur les cellules LLC • Les cellules de LLC modifient le ME à leur profit

5) Stimulation Ag des cellules LLC et effecteurs ME

The BCR microenvironment cross talk

• BCR signaling plays a central role in CLL proliferation• Lymph node is the major site of CLL proliferation• Comparative GEP shows that BCR signaling signature in the lymph node• BCR engagement plays a major role in the crosstalk between

microenvironment and CLL

Buchner, Blood, 2010Vlad, Cancer Res, 2009

Proliferative pool

BCR Signaling Capacity

Microenvironment Interaction

Disease evolution

• This modulation is restricted to BCR responsive cases whether defined as unmutated, ZAP-70+ or with downstream signaling capacity

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• Migration: CLL cells remain at the proliferation site– In vitro BCR engagement down regulates CXCR4 expression

• only BCR responsive cases down regulate CXCR4. • CXCR4 downregulation decreases migration• Those CLL experience shorter PFS

– Concomittant and parallel down regulation of CD62L• Decreased adhesion to lymphatic endothelial cells through mannose

receptor: less exit from lymph node

– In vivo, CXCR4 is low on the proliferative subset of CLL cells exiting the lymphnode

• Attraction of T cells and DC in contact with activated B cells– BCR ligation induces secretion of chemoattractants for T cells and DC

(CCL3, CLL4)

The BCR microenvironment cross talk1. Influence of BCR signaling capacity on trafficking

Vlad A, Cancer Res, 2009Calissano C, Mol Medicine, 2011Burger J, Sem Cancer Biol, 2010

The BCR microenvironment cross talk2. Influence of BCR signaling on CLL cell survival

• BCR engagement induces a differential secretion of autocrine activating cytokines– IL-6, IL-10…..

• Proteins regulating actin dynamics or actin polymerisation such as HS1 modulate the shape of the cells and are differentially regulated by BCR signaling capacity

Scielzo C, Blood, 2011Callissano C, Mol Med, 2011

• Clinical consequence :BCR signaling capacity segregates 2 subgroups with strikingly different outcome

Overall Survival

Responders

Non responders

Le Roy C, poster IWCLL 2011

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Conclusion

• De nombreuses données soulignent le rôle prépondérant du ME

ganglionnaire dans l'évolutivité de la LLC

• Capacité de signalisation BCR � rôle important dans l'accumulation

du clone (survie, rétention) chez patient évolutif

• Signalisation BCR = cible thérapeutique d'intérêt

� Inhibiteurs de Syk, Btk, PI3K,

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Stimulation Ag LLC et effecteurs du ME

EvolutifsEvolutifs StablesStables

Survie cellulaire in vitro

RépondeursBCR

RépondeursBCR

Non répondeursBCR

Non répondeursBCR

Survie globale

Répondeurs

Non répondeurs

• Expression membranaire effecteurs trafic ganglionnaire

• Corrélation avec caractère stable/évolutif

Impact stimulation BCR?

- CXCR4- CXCR5- CD62L

Vlad A, et al. Down-regulation of CXCR4 and CD62L in CLL is triggered by B-cell receptor ligation and associated with progressive disease. Cancer Res.2009; 69, 6387-6395

Stimulation Ag LLC et effecteurs du ME

1er groupe de cellules LLC

CXCR4

CD

19

NON stimulé

Stimulation BCR

13% 87%

85% 15%

CXCR5 CD62L

� Migrationin vitro

� Adhésionin vitro

Cellules LLC Répondeur au BCR

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CXCR4

CD

19

NON stimulé

Stimulation BCR

CD62L

Pas de modification de la migration

Pas de modification de l'adhésion

CXCR5

Cellules LLC NON répondeur au BCR

2ème groupe de cellules LLC

Stimulation Ag LLC et effecteurs du ME

La capacité de répondre au BCR est associée à l'évolutivité de la LLC

ZAP -70 IgVHBCR-induced cell survival

CD38

Facteur favorable

Facteur défavorable

Répondeur

LLC EVOLUTIVE

LLCSTABLE

RépondeurIntermediaire

LLCINTERMEDIAIRE

Analyse PFS

NONrépondeur

Stimulation Ag LLC et effecteurs du ME

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AgAg CXCR4

?

BCR

Intermédiaires de signalisation : BCR � internalisation CXCR4/CXCR5 ?

CXCR5

PKD

CXCR4

Unstimulated anti-IgM

Untreated

CX

CR

5

CID

CID

Stimulation Ag LLC et effecteurs du ME

Circulation sanguine

Vaisseaux Lymphatiques

Sang

Interprétation des résultats au regard de la LLC

AccumulationB-LLC

AccumulationB-LLC

MaladieEVOLUTIVE

MaladieEVOLUTIVE

Sortie

Deglesne PA et al. Cancer Res. 2006 , 66(14):7158-66.Vlad A, et al. Cancer Res. 2009, 69; 6387-95

EntréeLy-B

RétentionRétention

B-LLC

�SurvieSurvie

Antigène

Stimulation Ag et accumulation LLC

Ganglion LLCPatient évolutif