BCM 2504J.W. Keillor - Inhibition enzymatique Enzymologie Inhibition enzymatique.
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BCM 2504 J.W. Keillor - Inhibition enzymatiqueUniversité de MontréalFaculté des arts et des sciencesDépartement de chimie
Enzymologie
Inhibition enzymatique
BCM 2504 J.W. Keillor - Inhibition enzymatiqueUniversité de MontréalFaculté des arts et des sciencesDépartement de chimie
Prof. Jeffrey W. Keillor
• courriel : [email protected]• site-web : http://www.esi.umontreal.ca/~keillorj/
• tél : 343-6219
• local : F-516
• période de disponibilité : par rendez-vous
• notes de cours et diapos disponibles sur ma page web
BCM 2504 J.W. Keillor - Inhibition enzymatiqueUniversité de MontréalFaculté des arts et des sciencesDépartement de chimie
Inhibition enzymatique
• inactivation d’une enzyme (ralentissement de la réaction enzymatique) par la liaison d’une petite molécule– différente que la dénaturation
BCM 2504 J.W. Keillor - Inhibition enzymatiqueUniversité de MontréalFaculté des arts et des sciencesDépartement de chimie
Types d’inhibition
• réversible– compétitive– incompétitive– noncompétitive
• irréversible– par marqueur d’affinité– par inhibition suicide
BCM 2504 J.W. Keillor - Inhibition enzymatiqueUniversité de MontréalFaculté des arts et des sciencesDépartement de chimie
Inhibition compétitive
• la liaison de l’inhibiteur, à l’enzyme libre, empêche la liaison du substrat
S
Enz
SEnz
IEnz
I
E E•S E + P k1, S k2
E•I
ki, I
k-1
k-i
BCM 2504 J.W. Keillor - Inhibition enzymatiqueUniversité de MontréalFaculté des arts et des sciencesDépartement de chimie
Inhibition compétitive alternative• la liaison de l’inhibiteur, près du site actif, empêche la
liaison du substrat par encombrement stérique• la liaison de l’inhibiteur, près du site actif, induit un
changement conformationnel qui empêche la liaison du substrat
S
I
Enz
Enz
S
I
Enz
a)
Enz
b)
S Enz
S
I
Enz
I
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Exemple de l’inhibition compétitive
• l’acide malonique ressemble à l’acide succinique et inhibe la déhydrogénase de succinate lors de sa liaison :
HO2C CH2 CH2 CO2H
acide succiniqueHO2C
CHCH
CO2H
acide fumarique
Enz•FAD + Enz-FADH2
HO2C CH2 CO2H
acide malonique
Enz•FAD•Succ
Enz•FAD•Mal
l’oxaloacétate est aussi un inhibiteur compétitif:
HO2C-CO-CH2-CO2H
BCM 2504 J.W. Keillor - Inhibition enzymatiqueUniversité de MontréalFaculté des arts et des sciencesDépartement de chimie
J. Biol. Chem. (2006) 281, 5965-5972.
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Équations pour l’inhibition comp.
• conservation de masse : [E]0 = [E] + [E•S] + [E•I]
• substitution en fonction de E•S :
– état stationnaire :
– constante d’inhibition :
S]•[E
[E][S]
1
12
k
kk
I]•[E
]I][E[i K
E E•S E + P k1, S k2
E•I
ki, I
k-1
k-i
i1
12
1
120 [S]
]I[1
[S]S]•[E]E[
Kk
kk
k
kk
i1
12
02
i1
12
02
]I[1]S[
]S[]E[
]I[1
[S]1
]E[
Kk
kk
k
Kk
kk
kv
KM augmente
BCM 2504 J.W. Keillor - Inhibition enzymatiqueUniversité de MontréalFaculté des arts et des sciencesDépartement de chimie
Graphique d’inhibition compétitive
[S]
Vit
ess
e,
v
Vm
ax
/ 2
KM
v = Vmax = kcat [E]0
KMapp
[I] = 2 Ki
[I] = Ki
[I] = 0
KMapp'
Graphique Michaelis-Menten d'inhibition compétitive
i
M
max
]I[1]S[
]S[
KK
Vv
BCM 2504 J.W. Keillor - Inhibition enzymatiqueUniversité de MontréalFaculté des arts et des sciencesDépartement de chimie
Graphique d’inhibition compétitive
1/[S]
1/v
0
pente = KM / Vmax
1 / Vmax
-1 / KM
Graphique Lineweaver-Burk d'inhibition compétitive
-1 / KMapp'
-1 / KMapp
[I] = 0
[I] = Ki
[I] = 2 Ki
maxmax
M1
S][
1
]I[1
1
VV
KK
vi
lignes se croisentsur l’axe-y (1/Vmax)
BCM 2504 J.W. Keillor - Inhibition enzymatiqueUniversité de MontréalFaculté des arts et des sciencesDépartement de chimie
Graphique d’inhibition compétitive
lignes se croisentsur l’axe-y (Vmax)
v / [S]
v
Graphique Eadie-Hofstee d'inhibition compétitive
pente = -KM
Vmax
Vmax / KM
[I] = 0[I] = Ki[I] = 2 Ki
Vmax / KMapp
Vmax / KMapp'
pente = -KMapp
pente = -KM app
'
maxi
M S][
]I[1 V
v
KKv
BCM 2504 J.W. Keillor - Inhibition enzymatiqueUniversité de MontréalFaculté des arts et des sciencesDépartement de chimie
[I]-Ki
KMapp
KM/Ki
KM
0[I]
-Ki
KMapp
KM/Ki
KM
0
Détermination de Ki (compétitive)
• équation pour l’augmentation de KM :
]I[]I[
1i
MM
iM
appM K
KK
KKK
ou les pentes LB(KM/Vmax)
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Équation pour IC50 (compétitive)
• équations de vitesse lorsque [Icomp] = IC50 :
N.B. : IC50 > Ki
i
50M
max
M
max2
1
IC1]S[
]S[
]S[
]S[
KK
V
K
V
iM
i50 ]S[IC K
K
K
Mi
50M ]S[2
IC1]S[ K
KK
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Inhibition incompétitive
• l’inhibiteur est lié par le complexe E•S
S
EnzEnz
S
I
Enz
S
I
produits
E E•S E + P k1, S k2
k-1
k-i ki, I
E•S•I
ne mène pas aux produits
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Exemple de l’inhibition incompétitive
• inhibition de la phosphatase alkaline par la L-phénylalanine:
5'-ADN -2O3P Enz 5'-ADN•Enz-2O3P 5'-ADNHO HOPO3-2 +
H2O
+
L-Phe
5'-ADN•Enz•Phe-2O3P
ne mène pas aux produits
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J. Mol. Biol. (2005) 350, 441–451
BCM 2504 J.W. Keillor - Inhibition enzymatiqueUniversité de MontréalFaculté des arts et des sciencesDépartement de chimie
E E•S E + P k1, S k2
k-1
k-i ki, I
E•S•I
i
1
12
i
02
1
12
i
022
]I[1
[S]
]I[1
[S][E]
[S]]I[
1
[S][E]]S•E[
K
k
kkK
k
k
kk
K
kkv
Équations pour l’inhibition incomp.
• conservation de masse : [E]0 = [E] + [E•S] + [E•S•I]
• substitution en fonction de E•S :
– état stationnaire :
– constante d’inhibition :
S]•[E
[E][S]
1
12
k
kk
KM et Vmax
diminuent
I]•S•[E
]I][S•E[i K
[E]0 = [E•S] +
[S]
S]•[E
1
12
k
kk
i
]I[S]•[E
K+
BCM 2504 J.W. Keillor - Inhibition enzymatiqueUniversité de MontréalFaculté des arts et des sciencesDépartement de chimie
Graphique d’inhibition incompétitive
[S]
Vit
ess
e, v
Vm
ax
/ 2
KM
v = Vmax = kcat [E]0
KMapp
[I] = 2 Ki
[I] = Ki
[I] = 0
KMapp'
Graphique Michaelis-Menten d'inhibition incompétitive
Vm
axa
pp /
2V
ma
xap
p' /
2
i
M
i
max
]I[1
]S[
]I[1
]S[
K
K
K
V
v
BCM 2504 J.W. Keillor - Inhibition enzymatiqueUniversité de MontréalFaculté des arts et des sciencesDépartement de chimie
1/[S]
1/v
0
pente = KM / Vmax
1 / Vmax
-1 / KM
Graphique Lineweaver-Burk d'inhibition incompétitive
-1 / KMapp'
-1 / KMapp
[I] = 0
[I] = Ki
[I] = 2 Ki
1 / Vmaxapp
1 / Vmaxapp'
Graphique d’inhibition incompétitive
lignes parallèles
iK
VV
K
v
]I[1
1
S][
11
maxmax
M
BCM 2504 J.W. Keillor - Inhibition enzymatiqueUniversité de MontréalFaculté des arts et des sciencesDépartement de chimie
Graphique d’inhibition incompétitive
lignes se croisentsur l’axe-x (Vmax/KM)
v / [S]
v
Graphique Eadie-Hofstee d'inhibition incompétitive
pente = -KM
Vmax
Vmax / KM
[I] = 0
[I] = Ki
[I] = 2 Ki
Vmaxapp
Vmaxapp'
pente = -KMapp
pente = -KM
app'
i
max
i
M
]I[1
S][]I[1
K
Vv
K
Kv
BCM 2504 J.W. Keillor - Inhibition enzymatiqueUniversité de MontréalFaculté des arts et des sciencesDépartement de chimie
[I]-Ki
1/Vmaxapp 1/Vmax•Ki
1/Vmax
0[I]
-Ki
1/Vmaxapp 1/Vmax•Ki
1/Vmax
0
Détermination de Ki (incompétitive)
• équation pour la diminution de Vmax :
ou bien 1/KM
i
maxappmax ]I[
1K
VV
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Équation pour IC50 (incompétitive)
• équations de vitesse lorsque [Iincomp] = IC50 :
N.B. : IC50 > Ki
Mi
max
[S]]I[
1
[S]
KK
Vv
M
max2
1
]S[
]S[
K
V
Mi
50M [S]IC
1
2
]S[
1
KK
K
[S]IC Mi
i50
KKK
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Inhibition non-compétitive
• l’inhibiteur est lié par l’enzyme libre et par le complexe E•S
ne mène pas aux produits
S
Enz Enz
S
I
Enz
S
I
produits
Enz
I
S
I Ki'Ki
E E•S E + P k1, S k2
k-1
Ki'
E•S•I
Ki II
E•Ik1', S
k-1'
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Enz Enz•FBP
Enz•AMP Enz•FBP•AMP
AMP AMP
fructose-1,6-bisphosphate(FBP) H2O
Enz + fructose-6-phosphate
Exemple de l’inhibition non-comp.
• inhibition de la bisphosphatase de fructose par le AMP :
ne mène pas aux produits
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Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91, 12482-12486
BCM 2504 J.W. Keillor - Inhibition enzymatiqueUniversité de MontréalFaculté des arts et des sciencesDépartement de chimie
'i
iM
'i
max
]I[1
]I[1
]S[
]I[1
]S[
K
KK
K
V
v
Équations pour l’inhibition noncomp.
• conservation de masse :
[E]0 = [E] + [E•S] + [E•S•I] + [E•I]
• substitution en fonction de E•S :
– état stationnaire, constantes d’inhibition (Ki et Ki')
Vmax diminue;KM peut augmenter ou diminuer
E E•S E + P k1, S k2
k-1
Ki'
E•S•I
Ki II
E•Ik1', S
k-1'
BCM 2504 J.W. Keillor - Inhibition enzymatiqueUniversité de MontréalFaculté des arts et des sciencesDépartement de chimie
Inhibition non-compétitive simple
• l’affinité de l’inhibiteur est indépendante de la présence de substrat (i.e. Ki = Ki')
– KM n’est pas affecté
– Vmax est diminué par le facteur de
E E•S E + P k1, S k2
k-1
Ki'
E•S•I
Ki II
E•Ik1', S
k-1'
'i
]I[1
K
'i
iM
'i
max
]I[1
]I[1
]S[
]I[1
]S[
K
KK
K
V
v
BCM 2504 J.W. Keillor - Inhibition enzymatiqueUniversité de MontréalFaculté des arts et des sciencesDépartement de chimie
Graphique d’inhibition non-compétitive simple
[S]
Vit
ess
e,
v
Vm
ax
/ 2
KM
v = Vmax = kcat [E]0
[I] = 2 Ki
[I] = Ki
[I] = 0
Graphique Michaelis-Menten d'inhibition noncompétitive simple
Vm
axap
p' /
2V
ma
xapp
/ 2 M
i
max
]S[
]I[1
]S[
K
K
V
v
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1/[S]
1/v
0
pente = KM / Vmax
1 / Vmax
-1 / KM
Graphique Lineweaver-Burk d'inhibition noncompétitive simple
[I] = 0
[I] = Ki
[I] = 2 Ki
1 / Vmaxapp
1 / Vmaxapp'
pente = KM / Vmaxapp
pente = KM / Vmaxapp'
Graphique d’inhibition non-compétitive simple
lignes se croisentsur l’axe-x (-1/KM)
i
i
K
VKV
K
v
]I[1
1
S][
1]I[1
1
maxmax
M
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v / [S]
vGraphique Eadie-Hofstee d'inhibition noncompétitive simple
pente = -KM
Vmax
Vmax / KM
[I] = 0[I] = Ki
[I] = 2 Ki
Vmaxapp
Vmaxapp'
Vmaxapp / KM
Vmaxapp' / KM
Graphique d’inhibition non-compétitive simple
lignes parallèles
i
maxM
]I[1
S][
K
VvKv
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[I]-Ki
1/Vmaxapp 1/Vmax•Ki
1/Vmax
0[I]
-Ki
1/Vmaxapp 1/Vmax•Ki
1/Vmax
0
Détermination de Ki (non-compétitive simple)
• équation pour la diminution de Vmax :
i
maxappmax ]I[
1K
VV
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Inhibition non-compétitive mixte
• l’affinité de l’inhibiteur dépend de la présence de substrat (i.e. Ki Ki')
– Vmax est toujours diminué par le facteur de
– KM est affecté selon Ki et Ki'
E E•S E + P k1, S k2
k-1
Ki'
E•S•I
Ki II
E•Ik1', S
k-1'
'i
]I[1
K
'i
iM
'i
max
]I[1
]I[1
]S[
]I[1
]S[
K
KK
K
V
v
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Inhibition non-compétitive mixte
• lorsque Ki < Ki', KM augmente et l’inhibition ressemble à l’inhibition compétitive :
1/[S]
1/v
0
pente = KM / Vmax
1 / Vmax
-1 / KMapp
Graphique Lineweaver-Burk d'inhibition noncompétitive mixte
[I] = 0
[I] = Ki
[I] = 2 Ki
1 / Vmaxapp
1 / Vmaxapp'
pente = KMapp
/ Vmaxapp
pente = KMapp'
/ Vmaxapp'
Ki' = 2 Ki
-1 / KM
-1 / KMapp'
lignes se croisententre les axes
BCM 2504 J.W. Keillor - Inhibition enzymatiqueUniversité de MontréalFaculté des arts et des sciencesDépartement de chimie
1/[S]
1/v
0
pente = KM / Vmax
1 / Vmax
-1 / KMapp
Graphique Lineweaver-Burk d'inhibition noncompétitive mixte
[I] = 0
[I] = Ki
[I] = 2 Ki
1 / Vmaxapp
1 / Vmaxapp'
pente = KMapp
/ Vmaxapp
pente = KMapp'
/ Vmaxapp'
Ki = 2 Ki'
-1 / KM
-1 / KMapp'
Inhibition non-compétitive mixte
• lorsque Ki > Ki', KM diminue et l’inhibition ressemble à l’inhibition incompétitive :
lignes se croisenten-dessous l’axe-x
BCM 2504 J.W. Keillor - Inhibition enzymatiqueUniversité de MontréalFaculté des arts et des sciencesDépartement de chimie
[I]-Ki
1/Vmaxapp 1/Vmax•Ki
1/Vmax
0[I]
-Ki
1/Vmaxapp 1/Vmax•Ki
1/Vmax
0
Détermination de Ki' (non-compétitive mixte)
• équation pour la diminution de Vmax :
'i
maxappmax ]I[
1K
VV
'
'
BCM 2504 J.W. Keillor - Inhibition enzymatiqueUniversité de MontréalFaculté des arts et des sciencesDépartement de chimie
Détermination de Ki (non-compétitive mixte)
• équation pour la variation de KM :
imax
M
i
max
i
iM
appmax
appM ]I[
1
]I[1
]I[1
]I[1
KV
K
K
VK
KK
V
K
[I]-Ki
pente du graphique LB,KM
app/Vmax
KM/Vmax•Ki
KM/Vmax
0[I]
-Ki
pente du graphique LB,KM
app/Vmax
KM/Vmax•Ki
KM/Vmax
[I]-Ki
pente du graphique LB,KM
app/Vmax
KM/Vmax•Ki
KM/Vmax
0
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Équation pour IC50 (non-comp. simple)
• équations de vitesse lorsque [Inoncomp] = IC50 :
N.B. : seulement Vmax est affecté par I; cet effet est indépendant de [S]
M
i
50
max
M
max2
1
]S[
IC1
]S[
]S[
]S[
K
K
V
K
V
2IC
1i
50
K
i50IC K
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Graphiques de Dixon
• façon alternative pour déterminer la valeur de Ki en faisant un graphique de 1/v vs [I]
• pour l’inhibition compétitive et non- compétitive simple, les lignes se crosient où [I] = -Ki
• pour inhibition incompétitive, les lignes sont parallèles et c’est impossible de mesurer la valeur de Ki de cette façon
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Graphique de Dixon (compétitive)
[I]
1/v
0-Ki
Graphique Dixon d'inhibition compétitive
[S] = KM
[S] = 2 KM
[S] = 3 KM
max
M
maxi
M 11
]S[]I[
]S[
1
V
K
VK
K
v
lignes se croisentoù [I] = -Ki
BCM 2504 J.W. Keillor - Inhibition enzymatiqueUniversité de MontréalFaculté des arts et des sciencesDépartement de chimie
[I]
1/v
0-Ki
Graphique Dixon d'inhibition noncompétitive (simple)
[S] = KM
[S] = 2 KM
[S] = 3 KM
Graphique de Dixon (non-comp. simple)
lignes se croisentoù [I] = -Ki
max
MM
maxi
11
S][]I[1
S][
11
V
KK
VKv
BCM 2504 J.W. Keillor - Inhibition enzymatiqueUniversité de MontréalFaculté des arts et des sciencesDépartement de chimie
[I]
1/v
0
Graphique Dixon d'inhibition incompétitive
[S] = KM
[S] = 2 KM
[S] = 3 KM
Graphique de Dixon (incomp.)
lignes ne secroisent pas
max
M
maxi
11
S][]I[
11
V
K
VKv
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Mécanisme d’inhibition
• le mode d’inhibition peut donner des informations sur le mécanisme d’inhibition
• faisons l’analyse cinétique détaillée du schéma suivant :
E
I
S
E' E'•S E P
E•I
k1 k2
k3
k4
k5
k6
+k7
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Mécanisme d’inhibition
• état stationnaire pour E'•S :
• état stationnaire pour E' :
• alors :
• donc :
E
I
S
E' E'•S E P
E•I
k1 k2
k3
k4
k5
k6
+k7 • vitesse : v = k7 [E'S]
• conservation de masse : [E]T = [E] + [E'] + [E'•S] + [E • I]
• cste d’inhibition : 1
2i I]•[E
]I][E[
k
kK
E'•S][]S[
]E'[5
76
k
kk
]S[
]S[E'•S][]E[
53
75764
kk
kkkkk
]S[
]I][S[]I[E'•S][]I•E[
53i
75764
kkK
kkkkk
763i
764i
7553
537
T
7
T ]I[1
]I[1]S[
]S[
]E[
E'•S][
]E[kkk
Kkkk
Kkkkk
kkk
kv
BCM 2504 J.W. Keillor - Inhibition enzymatiqueUniversité de MontréalFaculté des arts et des sciencesDépartement de chimie
Mécanisme d’inhibition
• équation Michaelis-Menten pour inhibition :
E
I
S
E' E'•S E P
E•I
k1 k2
k3
k4
k5
k6
+k7 • d’où vient :
et :
73
73cat kk
kkk
735
7643M kkk
kkkkK
i7
73
i4
43
M
i7
73
Tcat
]I[1
]I[1
]S[
]I[1
]S[]E[
Kk
kk
Kk
kk
K
Kk
kk
k
v
inhibition non-compétitive!!
Vmax diminue;KM peut augmenter ou diminuer
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Mécanisme d’inhibition
• l’inhibiteur ne se lie pas à la forme de l’enzyme qui lie le substrat; donc, pas compétitif
• l’inhibiteur ne se lie pas au complexe enzyme-substrat; donc, pas incompétitif
• donc, l’inhibiteur est non-compétitif• on voit que les profils d’inhibition ne sont pas exclusifs
pour un seul type de mécanisme
E
I
S
E' E'•S E P
E•I
k1 k2
k3
k4
k5
k6
+k7
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Inhibition de réaction avec multiples substrats
• pour élucider un mécanisme enzymatique, on peut étudier l’effet cinétique de la variation des :– substrats : 1/v vs 1/[S1] en fonction de [S2];
1/v vs 1/[S2] en fonction de [S1]…
– produits : 1/v vs 1/[S1] en fonction de [P1], [P2];1/v vs 1/[S2] en fonction de [P1], [P2]…
– inhibiteurs : 1/v vs 1/[S1] en fonction de [I1], [I2];1/v vs 1/[S1] en fonction de [I1], [I2]…
• le patron d’inhibition observée aide surtout à déterminer l’ordre de liaison des substrats
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Inhibition d’un mécanisme ordonné
• par exemple, pour le schéma ci-dessus :– I1 est compétitif avec B et incompétitif avec A
• I1 lie la même forme de l’enzyme que B, et se lie après A
– I2 est compétitif avec A et non-compétitif avec B
• I2 lie la même forme de l’enzyme que A, et se lie avant B
E
A
E•A E•A•B
E•A•I1
B
E•P•Q
Q
E
P
E•P
E•I2
I2 I1
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Règles de Cleland
• dans le cas où I se lie à E avant S, l’inhibition est :– compétitive lorsque : i) I et S lient la même forme de E, ou
ii) I et S se lient à deux formes de E en équilibre rapide
– incompétitive lorsque : I et S se lient à des formes différentes de E séparées par
une étape irréversible– non-compétitive lorsque : I et S se lient à des formes
différentes de E reliées par une réaction réversible ou une
séquence de réactions réversibles
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Règles de Cleland
• dans le cas où I se lie à E après S, l’inhibition est :– incompétitive - toujours.
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Analyse selon les règles de Cleland
S et I lientla mêmeforme
d’enzyme?
compétitive
oui
non S se lieavant I?
incompétitive
oui
toutes étapesentre I et S
sont réversibles?
non nonincomp.
oui
non-compétitive
• inhibition par inhibiteur, I
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Inhibition d’un mécanisme ordonné
I2I1
E•I1
E•P•Q•R
E•A•I2
E•A•BE•AE P Q R E + + +
A B C
E•A•B•C
E•A•B•I3
I3
I1 I2 I3
1/v vs 1/[A] comp. incomp. incomp.
1/v vs 1/[B] non-comp. comp. incomp.
1/v vs 1/[C] non-comp. non-comp. comp.
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Exercice: Ordre de liaison de substrats
• dessinez le schéma mécanistique ordonné, en précisant l’ordre de liaison des substrats A et B et de l’inhibiteur I, étant donné le patron suivant de modes d’inhibition : I1
1/v vs 1/[A] comp.
1/v vs 1/[B] incomp.
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Règles de Cleland – étapes irrév.
• une étape est considérée d’être irréversible si elle implique :– la dissociation d’un produit (où [P] 0)– la liaison d’un substrat (où [S] saturante)– un grand changement d’énergie libre (où G°<<0)
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Inhibition d’un mécanisme ordonné
• aux concentrations non-saturantes de substrats :
E•R E E•Q•RE•A•BE•A
A
E
A
B
B
F•P
P
P
F
C
C
F•C
Q
Q R
R
Si I se lie à : 1/v vs 1/[A] 1/v vs 1/[B] 1/v vs 1/[C]
E comp. non-comp. incomp.
E•A incomp. comp. incomp.
E•A•B incomp. incomp. incomp.
F incomp. incomp. comp.
E•Q•R incomp. incomp. incomp.
E•R incomp. incomp. incomp.
irréversible
non-comp.
non-comp.
non-comp.
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Règles de Cleland
• dans le cas où E est inhibée par les produits de la réaction ([P] 0 !), l’inhibition est :– compétitive lorsque : P et S se lient à la même forme de E– incompétitive lorsque : P et S se lient à des formes
différentes de E séparées par une étape irréversible
– non-compétitive lorsque : P et S se lient à des formes différentes de E reliées par
une réaction réversible ou une séquence de
réactions réversibles
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Analyse selon les règles de Cleland
• inhibition par produit, P– vers la fin d’une réaction, où [P] 0
S et P lientla mêmeforme
d’enzyme?
compétitive
oui
toutes étapesentre P et S
sont réversibles?
non nonincompétitive
oui
non-compétitive
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Q
QP
PB
B
A
E
A
E•A E•A•B E•P•Q E E•Q
Inhibition d’un mécanisme ordonné
Inhibition par produit:
Substrat variable :
Profils aux conc. non-saturantes :
Si [A] est saturante :
Si [B] est saturante :
Q A comp. comp.
Q B non-comp. pas d’inhib.
P A non-comp. incomp.
P B non-comp. non-comp.
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Inhibition d’un mécanisme ping-pong
Inhibition par produit:
Substrat variable :
Profils aux conc. non-saturantes :
Si [A] est saturante :
Si [B] est saturante :
Q A comp. comp.
Q B non-comp. pas d’inhib.
P A non-comp. pas d’inhib.
P B comp. comp.
E•Q E E-X•PE•A E
A
A
B
BP
P Q
Q
E-X E-X•B
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Inhibition de liaison lente
• parfois l’équilibre de liaison d’inhibiteur est lent à atteindre– pour les inhibiteurs lents, ça prend des
secondes ou minutes pour atteindre l’état stationnaire, plutôt que des millisecondes
– l’affinité peut quand même être forte (Ki faible) mais les constantes de vitesses pour les étapes de liaison et dissociation sont petites
E I E•I +k1
k2
Ki = k1
k2
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Effet cinétique de la liaison lente
• établissement lent de l’équilibre entre l’enzyme libre et le complexe E•I :
Temps
[P]
sans I
+ I
+ I
Sans pré-incubation avec inhibiteur; réaction initiée avec enzyme
Enzyme pré-incubée avec inhibiteur; réaction initiée avec substratFormation
de E•I
Dissociationde E•I
(cf liaison rapide)
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Inhibition par liaison lente à forte affinité
• inhibition classique : – ça prend beaucoup de I– [I] et [S] >> [E]– [I] [I] ajoutée (équilibre rapide et constant)– v [E], en absence et en présence de l’inhibiteur
• inhibition de forte affinité : – ça prend peu de I– [I] [E]– [I] [I] ajoutée (la formation de E•I réduit [I] libre)
– v vs [E] n’est pas linéaire+ E•I I E
Ki
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Exemple de l’inhibition lente à forte affinité
• les enzymes effectuent la catalyse en stabilisant l’état de transition d’un réaction; alors, elles ont beaucoup d’affinité pour des analogues d’état de transition
• 5'-méthylthioadenosine/S-adenosylhomocystéine nucléosidase (MTAN) catalyse l’hydrolyse du nucléoside en base et thioribose :
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Exemple de l’inhibition lente à forte affinité
• des études mécanistiques suggèrent l’allure que devrait avoir l’état de transition de la réaction, et la modélisation a aidé la conception des analogues :
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Exemple de l’inhibition lente à forte affinité
• des analogues d’état de transition donnent souvent l’inhibition lente parce que l’enzyme ajuste sa conformation comme elle ferait lors de la catalyse :
E
I
E•I E*•I
EE•S P+ S +
K i =[E][I]
[E•I]
K i* =[E][I]
[E*•I]
très stable
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J. Biol. Chem. 2005, 280, 18274
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Identification de l’inhibition à forte affinité
1. les concentrations (mesurées) de l’enzyme et de l’inhibiteur sont similaires
2. le Ki est très faible et/ou la régénération de l’enzyme est lente (petite k-i)
3. l’inhibiteur est difficile à séparer de l’enzyme (par dialyse ou filtration de gel)
4. le degré d’inhibition varie avec la concentration d’enzyme (IC50 avec [E])
5. les courbes de Ackermann-Potter (v vs [E]) ne sont pas linéaires
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Exemple de l’inhibition de forte affinité
• le methotrexate est un analogue de l’acide folique qui inhibe très fortement et de manière compétitive la réductase de dihydrofolate (DHFR)
• Ki est de 6 × 10-11 M et la demi-vie de E•I est de plusieurs heures in vivo
DHFR
DHF
MTX
DHFR•MTX
Ki k1
MTX
k2
DHFR•DHF DHFR THF +
N
N
N
NH2N
NH2
C
O
NH
CO2H
CO2H
N
CH3
methotrexate
C
O
NH
CO2H
CO2H
HNN
N
N
HNH2N
O
acide folique, DHF
, MTX
à calculer !
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J. Mol. Biol. (2000) 295, 307-323
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Courbes de Ackermann-Potter
Inhibition classique[I]>>[E] ;
à [I] constante, v [E]
[E]T
vi
Ki élevé
[I]=0[I]=x
Ki très faible
+ E•I I EKi
[I]=x
perte d'activité dueà la formation de E•I
[I]>[E]
[I][E]
[I]<[E]
x
Inhibition de forte affinité[I][E] ;
à [I] constante, v vs[E] non-linéaire à cause du déplacement de l'équilibre
concs. similaires
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Courbes de Ackermann-Potter
• à Ki > [E] et [I], faible déviation de la linéarité :
0 1 2 3 4
[E]T (nM)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
v n
orm
alis
ée
Ki = 6 nM
[I] = 0 nM 1.5 nM
4.5 nM
3.0 nM
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Courbes de Ackermann-Potter
• à Ki < [E] et [I], forte déviation de la linéarité :
0 1 2 3 4
[E]T (nM)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
v n
orm
alis
ée
Ki = 0.6 nM
[I] = 0 nM
1.5 nM
4.5 nM
3.0 nM
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Courbes de Ackermann-Potter
• à Ki << [E] et [I], très forte déviation de la linéarité :
0 1 2 3 4
[E]T (nM)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
v n
orm
alis
ée
Ki = 0.06 nM
[I] = 0 nM
1.5 nM
4.5 nM
3.0 nM
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Courbes de Ackermann-Potter
• à Ki <<< [E] et [I], on a le titrage stoechiométrique :
0 1 2 3 4
[E]T (nM)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
v n
orm
alis
ée
Ki = 0.006 nM
[I] = 0 nM
1.5 nM
4.5 nM
3.0 nM
pas d’inhibition;v [E] à [E]>[I]
ligne décaléepar [I]
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Équations pour IC50 (forte affinité)
• équations pour les trois modes d’inhibition réversible :
N.B. : IC50 ½ [E]T
iM
iT2
150 ]S[]E[IC K
K
K
[S]]E[IC Mi
iT21
50
KKK
iT21
50 ]E[IC K
Mode d’inhibition Équation
compétitif
incompétitif
non-compétitif (simple)
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Tableau sommaire des inhibiteurs réversibles
Classe d’inhibiteur
Relation entre
[E]T et [I]T
Atteint de l’équilibre entre E,
I et E•I
Traites caractéristiques
classique [I]T >> [E]T rapide · IC50 ne dépend pas de
[E]T ; v vs [E]T linéaire
· [P] vs temps linéaire
« tight-binding » [I]T [E]T rapide · IC50 dépend de [E]T ;
v vs [E]T non-linéaire
· [P] vs temps linéaire
« slow-binding » [I]T >> [E]T lent · IC50 ne dépend pas de
[E]T ; v vs [E]T linéaire
· [P] vs temps non-linéaire
« slow, tight-binding »
[I]T [E]T lent · IC50 dépend de [E]T ;
v vs [E]T non-linéaire
· [P] vs temps non-linéaire
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Inhibition irréversible
• pour des inhibiteurs réversibles, on utilise le Ki comme un indice de l’efficacité de l’inhibition
• pour les inhibiteurs irréversibles, on utilise le kinact et le KI
• il y a deux types d’inhibiteurs irréversibles :– réactifs du site actif (marquage par affinité)– inhibiteurs basés sur le mécanisme
(substrats « suicide »)
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Marqueurs par affinité
• démontrent la spécificité envers un groupement fonctionnel des acides aminés du site actif– analogues de substrat pour favoriser sa liaison dans
les site actif– comprennent aussi un groupement réactif
(pharmacophore) – typiquement un électrophile qui réagit avec un nucléophile dans le site actif
• possèdent un seul site saturable et réagissent de manière stœchiométrique (1 mol de I/mol de E)
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Marquage par affinité
• l’enzyme est protégée contre cette inhibition par le substrat (ou co-facteur)
• la perte d’activité suit une cinétique de premier ordre, parce que l’enzyme est consommée comme un réactif pendant la réaction
• l’inhibition est accompagnée de la modification covalente de l’enzyme :– l’enzyme demeure inactive après la séparation de
l’excès de l’inhibiteur– l’inhibiteur reste lié à la protéine après dialyse ou
filtration sur gel (ou sur membrane) même après la dénaturation de l’enzyme
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Exemples de marquage par affinité
TPCK (Tosyl phenylalanine chloromethyl ketone)• ressemble un amide de la phénylalanine, mais le
groupement chlorométhyle cétone effectue l’alkylation de la His57 de la chymotrypsine :
O
CH2
Cl
NH
S OO
CH3
N NH
Enz
N N
O
CH2
NH
S OO
CH3
Enz
Cl
H
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Exemples de marquage par affinité
DIFP (diisopropyl phosphofluoridate)
• réagit avec le groupement hydroxyle des résidus de sérine :
Enz
HO
P
O
F
OO
Enz
O
P
O
OO
F
H
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Exemples de marquage par affinité
PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)
• utilisé pour inhiber des protéases et réagit aussi avec des résidus de sérine :
Enz
HOF
H
CH2 S
O
F
O
Enz
O
CH2 S
O
O
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Exemples de marquage par affinité Autres exemples :
H2C HO
O
CH2
OPO3-2
H2C I
O
CH2
OPO3-2
CHCH
OH
CH2
OPO3-2 O
CHCH2
OPO3-2
H2C
O
OCH2OH
OH
NHAc
OR
RO
OCH2OH
OH
NHAc
OCH2CH
RO
CH2
O
Ile-tRNAIle
Ile-tRNAIle CH2C Br
O
Enzyme Substrat Marqueur par affinité
Triosephosphate isomerase
Triosephosphate isomerase
Lysozyme
Isoleucyl-tRNA synthetase
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Marquage par photoaffinité
• on utilise des inhibiteurs qui sont stables en absence de lumière et activés par la photolyse après association avec l’enzyme
• deux exemples :– les groupes diazo qui génèrent des carbènes :
– les azotures qui génèrent des nitrènes :
R
O
CH N2
hvR
O
CH
carbone à six électrons
azote à six électrons
hvN3 R NR
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Réactions du groupement nitrène
(peut réagir avec n’importe quoi !!)
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Analyse cinétique
• liaison rapide à l’équilibre de l’inhibiteur suivie de la formation lente et irréversible d’un complexe inactif :
k1 k-1KI =
E I E•I E I+k1
k-1
kinact
complexe covalentinactif
• la proportion d’enzyme sous forme E•I augmente avec la concentration de I
• E•I s’inactive suivant une cinétique du premier ordre
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Mesure de kinact
• kinact peut être déterminée en mesurant la perte d’activité en fonction du temps (kobs) à différentes concentrations d’inhibiteur :
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% a
ctiv
ité
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Temps (min)
[I] = 0
[I] = 0.2 × KI
[I] = 0.5 × KI
[I] = 2 × KI
[I] = KI
constante de vitesse = kobs
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Mesure de kinact
• l’activité qui reste à un moment donné est proportionnelle à la concentration totale des formes d’enzyme qui ne sont pas inactivées : = [E] + [E•I]
• vitesse d’inactivation :
• constante d’inhibition :
• alors et
• après intégration :
I]•[E
]I][E[
1
1I
k
kK
]I•E[t inactk
d
d
]I[1I]•[EI]•[E
]I[
I]•[E II KK
]I[1
I]•[EIK
]I[1 I
inactobs
K
kk relation hyperbolique;
cf équation M-M
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-1 0 1 2 3 4 5
1/[I]
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1/k o
bs (
min
)
1/kinact
-1/KI
pente = KI / kinact
Mesure de kinact
• forme double réciproque :
• graphique linéaire :
]I[
111
inact
I
inactobs
k
K
kk
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0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% a
ctiv
ité
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Temps (min)
en absence de substrat
en présence de substrat
Mécanisme d’inactivation• si la cinétique d’inactivation est de seconde ordre,
l’inactivation se fait entre E et I en solution• si la cinétique d’inactivation est de premier ordre,
l’inactivation a lieu à partir du complexe E•I• si l’enzyme est protégé par le substrat, l’inhibiteur
se lie au site actif de l’enzyme :
protection partielle;inhibition irréversible
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0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
mole de I par mole de E
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% a
ctiv
ité
re
stan
te a
prè
s ré
acti
on
Modification sélective• indiquée par :
– la formation d’un complexe stœchiométrique (1:1) entre E et I
– correspondance entre les cinétiques d’inhibition et le degré d’incorporation covalente de l’inhibiteur sur l’enzyme :
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Inhibiteurs basés sur le mécanisme
• aussi appelés des « substrats suicides », ils doivent être activés par l’enzyme :
E I E•I E•I* E I +kcat rapide
• la plupart ont des kcat de 103 à 105 fois plus faibles que le substrat naturel (étape lente)
• même cinétiques de saturation et la réaction d’inactivation du premier ordre que celles des réactifs du site actif (marqueurs par affinité)
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Démonstration de kcat au mécanisme
• deux critères pour impliquer le mécanisme d’action d’une enzyme au mécanisme d’inactivation :
1. l’inactivation est dépendante de la présence de cofacteur ou d’un deuxième substrat
2. d’autres informations mécanistiques de la réaction d’inactivation concordent avec celles déterminées pour la réaction normale du substrat naturel– par exemple : effets isotopiques, profil pH-vitesse,
etc.
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Groupements activésC l a s s e S t r u c t u r e
a c é t y l è n e R R
o l é f i n e s ( a l c è n e s ) C H C H R R
s u b s t r a t s c o n t e n a n t d e s h a l o g è n e s R X
c y c l o p r o p a n e s R R
q u i n o n e s O O
a n a l o g u e s d e p é n i c i l l i n e N
SRH H
O
C H 3
C H 3
C O O N a
c o m p o s é s t h i o n o ( = S ) C
S
R RP
S
R R
typiquementélectrophiles
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Exemple de réactions « suicide »
• inhibition de la déshydrase de thiolester -hydroxydécanoyle par un analogue acétylène :– réaction normale avec son substrat:
C R
H
H
C
OH
H
C C
O
SR'
H
H
B
B H
H2O-CR
H
H
C
H
C C
O
SR'
H
thiolestertrans-,-décènoyle
CR
H
C C C
O
SR'
H
H
H
réarrangementallylique
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Exemple de réactions « suicide »
• inhibition de la déshydrase de thiolester -hydroxydécanoyle par un analogue acétylène :– réaction suicide avec un analogue acétylène:
même effet isotopique;même mécanisme
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N
SHH H
O
CH3
CH3
CO2
OO
sérine du site actif
Enz
OH
HN
SHH H
O
CH3
CH3
CO2
OO
O
Enz
B
HN
SHH
O
CH3
CH3
CO2
OO
O
Enz
hydrolysenormale
Enz
OH
HN
SHH H
O
CH3
CH3
CO2
OO
O
Nuc
Enz
B H
piégeagecovalent
enzyme inactive
Nuc
Enz
HN
SH H
O
CH3
CH3
CO2
OO
O
Enz
H
Exemple de réactions « suicide »
• inhibition de la -lactamase par des analogues de pénicilline :
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Exemple de réactions « suicide »
• inhibition des transaminases par un analogue d’acide aminé :
formesinactives
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Inhibition et formation de produit
• typiquement, une certaine quantité d’inhibiteur est transformée en produit, sans inactivation de l’enzyme
• le rapport r = k3/k4 représente la proportion molaire pour l’inactivation; le nombre de fois que le substrat est transformé en produit pour chaque fois qu’il inhibe plutôt
• r est constante et indépendante de la concentration de substrat ou d’enzyme; elle représente le partage d’un intermédiaire commun, E•I
k2+
E I
E•I*E•II E E P +k1
k-1
k3
k4
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Tableau sommaire des modificateurs chimiques
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Tableau sommaire des modificateurs chimiques
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Tableau sommaire des modificateurs chimiques
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Tableau sommaire des modificateurs chimiques