新規BBBモデルの機能評価 - pharmacocell.co.jp 448 . passive lipophilic + 53: haloperidol....
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ｖ ○中川慎介 1,2 、 Mária A. Deli 2,5 、 川口裕子 3 、 清水谷健志 3 、 下野貴宣 2 、 山口万貴子 2 、 片岡泰文 2,4 、 丹羽正美 1,2 e‐mail: shin3@nagasaki‐u.ac.jp 1. 長崎大院・医歯薬・薬理学1（医）、 2. ファーマコセル㈱ 3. 大日本住友製薬・薬物動態研究所・探索薬物動態研究部 4. 福岡大・薬・薬学疾患管理学、 5. ハンガリーサイエンスアカデミー 新規BBBモデルの機能評価 A New BBB Model: Testing Specific Function 第81回日本薬理学会年会03,17‐19,2008 Elimination of nuclear arms ! No more Nagasaki, no more Hiroshima ! . ｖ ｖ ｖ ｖ Transwell ® Permeable Supports # membrane Pore size Pore density 3460 Polyester (PE) 0.4μm 4×10 6 pores/cm 2 3401 Polycarbonate (PC) 0.4μm 1×10 8 pores/cm 2 3462 Polyester (PE) 3.0μm 2×10 6 pores/cm 2 3402 Polycarbonate (PC) 3.0μm 2×10 6 pores/cm 2 Evans' Blue Albumin FITC-Dextran 4,000 sodium fluorescein 0 10 20 30 40 50 60 70 80 PE-3.0μm PC-3.0μm PE-0.4μm PC-0.4μm membrane Pe (10 -6 cm/s) 0 100 300 500 700 TEER (Ω×cm 2 ) polycarbonate (PC) membrane BBB kit polyester (PE) membrane ** 6 Transwell ® membraneの検討 Polycarbonate membrane の 3.0μm の pore sizeを 持つ Transwell ® は大分子の透過性にも対応した membrane であり、その TEER 値は polyester membrane よりも高値を示した。 brain capillary astrocytes endothelial cells pericytes Transwell® compounds Filter abluminal luminal e‐mail : [email protected] URL:http://www.pharmacocell.co.jp PharmaCo‐Cell Company Ltd. 7 Conclusion Transwell ® 内での長期保存が可能な凍結方法を構築した。 BBBキットで得られた化合物の透過係数と文献値より得られた in vivo Papp 値は良好な相関関係を示し、 実用的な薬物脳内移行性検定システムであることが実証できた。 ｖ ｖ ｖ E00 0 100 200 300 400 TEER (Ω×cm 2 ) Day 5 TEER EAP a, b EP0 a, b, c EPA a E0P a, b, c EA0 a, b, c, f E0A b, c, d, e ap < 0.01 vs. E00 bp < 0.01 vs. EPA cp < 0.01 vs. EAP dp< 0.01 vs. EP0 ep < 0.01 vs. E0P fp < 0.05 vs. EP0 背景・目的 3週齢Wistarラットより前脳を摘出後、酵素・遠心処理し、毛細血管片を分離し、collagene type4 と fibronectine でコーティングした dish で培養した。培養液には、10% plasma‐derived bovine serum (PDS )/DMEM‐F12 に1.5 ng/mL basic fibroblast growth factor(bFGF), 100μg/mL heparin, insulin (5 μg/ml), transferrin (5 μg/ml), sodium selenite (5 ng/ml) (insulin‐transferrin‐ sodium selenite media supplement)を加えた. 毛細血管片には一部ペリサイトが含まれており、コーティングなしの培養皿で10%FBS/DMEM にて培養するとペリサイトのみが増殖する。 ペリサイトは突起を有する多角形をしており形態的に内皮細胞と識別可能である。 アストロサイトは生後2日齢のラットよりshaking methodを用いて分離した。 培養液には10%FBS/DMEMを用いた。 Rat cerebral endothelial cells Rat cerebral pericytes Rat cerebral astrocytes 初代培養細胞 astrocytes (A) endothelial cells (E) pericytes (P) EPA in vitro BBB 再構成系 ～BBB キット～ In vitro で作用が発見された中枢神経性疾患の治療薬候補であっても、実験動物に 投与すると、その多くは脳に存在する関門である血液脳関門（Blood‐Brain Barrier; BBB）のために脳内に移行できず、実際の治療薬になり得ない。 薬物の BBB 透過性は化学構造や分子量などから予め判断できず、脳内への移行性に 一定の法則性を見出すことはできない。 中枢神経作用薬の開発、適正な薬物治療のためには、生体の複雑な BBB と等価の システムを用いて、薬物の透過性を予測することが重要である。 脳内移行性を簡便に検定する検査キット（BBBキット）があれば、膨大な費用と時間 をかけて行われている創薬研究の効率化が図られ、より即応的で確実な創薬のスク リーニングが達成でき、中枢神経作用薬の開発に貢献できる。 臨床試験 創薬研究 2～3年 前臨床試験 3～5年 5～10年 化合物 の数 薬物標的 の同定 リード 化合物 発見 リード 化合物 最適化 前臨床 試験 臨床試験 申請 承認 5,000～ 10,000化合物 5 ～10化合物 10,000 1 化合物 10,000 Blood Brain Carrier mediated transport Receptor‐mediated transport Hexose LAT1 CNT2 nucleosides amino acid glucose LDL, insulin, transferrin MDR MRP OATP OAT Efflux transporters Paracellular transport water‐soluble agents Adsorptive transcytosis albumin, other plasma proteins vinca alkaloids, cyclosporin A Tight junction MRP1 RAGE LDL receptor MDR GLUT1 claudin‐5 ZO‐1 astrocyte pericyte 脳側 効果発揮 候補薬 血管側 OATP 中枢神経作用薬の開発 BBBの構成細胞である脳毛細血管内皮細胞、ペリサイト、ア ストロサイトを共培養し、生体内のBBB に近似したBBB in vitro 再構成モデル（BBBキット）を構築した。 Take off the astrocytes Shaking methods GFAP vWF LDL receptor α‐SM actin endothelial cells pericytes 3‐week rats 2‐day rats astrocyte endothelial blood cell pericyte 遠心後 Capillary NG2 proteoglycan nestin 3 2 1 5 結果 2~ Drug permeability assay~ name MW CNS transport Recovery rate (%) risperidone 410 + efflux 69.8 fluvoxamine 434 + lipophil and high protein binding 63.6 trazodone 408 + passive lipophilic 63.1 fluoxetine 346 + lipophil and high protein binding 62.3 hydroxyzine 448 + passive lipophilic 53 haloperidol 376 + passive lipophilic 52.1 vincristine 923 - efflux 64.6 digoxin 781 - efflux 62.7 prazosin 420 - efflux: ABCG2 57.7 vinblastine 909 - efflux 53.5 verapamil 491 - efflux 51.2 nortriptyrine 300 + Influx: NET 44.4 paroxetine 375 + lipophil and high protein binding, Pgp inhibitor but not Pgp substrate, lipid soluble 39.7 buspirone 422 + passive hydrophilic 39.4 chlorpromazine 355 + efflux, Pgp substrate/inhibitor 32.3 sertraline 343 + lipophil and high protein binding, Pgp inhibitor 18.7 paclitaxel 854 - efflux 38.4 loperamide 514 - efflux 38.3 loratadine 383 - efflux 16 amiodarone 682 - efflux 4 cyclosporin 1,203 - efflux 1.6 PS e 1 PS total 1 PS mem 1 P e (cm/min) A PS e name MW CNS transport Recovery rate (%) sulpiride 341 ± efflux: Pgp, influx: OCTN1, OCTN2, PEPT1 91.7 phenytoin 252 + lipophil and high protein binding 99.6 antipyrin 188 + passive lipophilic 90 carisoprodol 260 + passive lipophilic 89.6 indomethacin 358 + passive hydrophilic 87.6 caffeine 212 + passive lipophilic 87.5 carbamazepine 236 + passive lipophilic 85.1 midazolam 326 + passive lipophilic, highly permeable, Pgp substrate 84.2 propranolole 296 + passive lipophilic 81.9 zolpidem 382 + passive lipophilic 71.7 atenolol 226 - passive hydrophilic, weak base 97.1 cimetidine 252 - efflux 95.4 acetylsalicilic acid 180 - organic anion, efflux (Oat1, Oat2) 94.2 epinastine 286 - efflux 94 prednisone 358 - efflux (Pgp) 93.2 fexofenadine 538 - efflux: Pgp, OATP1A2 93.1 hydrocortisone 362 - efflux (Pgp) 88.2 warfarin 346 - lipophil and high protein binding 79.8 quinidine 783 - efflux 72.8 [luminal t=60 ] + [abluminal t=60 ] [luminal t=0 ] Recovery rate (%) = ×100 既存薬物40種類の透過性検定 薬物の溶解性や吸着等の問題による判定ミスを防ぐため、回収率（recovery rate)を算出した。 0 100 200 300 400 20 40 60 80 ｔime (min) Volume(μL) membrane BBB kit PS total PS mem [C]A× VA [C]L Volume (μL) = [C]A– abluminal tracer concentration VA – volume of abluminal chamber [C]L – initial luminal tracer concentration PStotal – slope of the clearance curve for BBB kit PSmem – slope of the clearance curve for cell-free filter PS dimension: μl/min = 10 -9 m 3 /min A - membrane surface area 12-well Transwell clear insert: A = 1 cm 2 = 10 -4 m 2 Pe = PSe (μl/min) / A (cm 2 ) = 10 -9 m 3 / min / 10 -4 m 2 = 10 -5 m/min = 10 -3 cm/min= Pe / 60 = cm/s 透過係数の算出 0.01 0.1 1.0 10 zolpidem caffeine phenytoin carisoprodol antipyrin carbamazepine midazolam indomethacin quinidine hydrocortisone prednisone sulpiride cimetidine epinastine acetylsalicilic acid fexofenadine in vitro Pe (10 -6 cm/s) CNS + drugs CNS - drugs warfarin (high protein binding ）100 ※文献値より 0.001 0.01 0.1 1 10 0.01 0.10 1.0 10 in vivo Papp ※ (10 -6 cm/s) in vitro Pe (10 -6 cm/s) caffeine propranolol indomethacin quinidine hydrocortisone paroxetine cimetidine vinblastine vincristine digoxin 100 R 2 = 0.813 回収率（recovery rate)の算出 BBBキットの精度を確認するために、既存薬物 40 種類を用いて透過性検定を行った。 検定化合物（各 1μM）を管腔側に入れ、20,40,60 分後に脳側に漏れ出てきた薬物濃度を測 定し、回収率及び透過係数を算出した。 BBBキットは新薬開発、薬物相互作用による副作用判定、既存薬の改良による脳内移行性の判定、 病態モデルを用いた病態解析などに利用でき、理想的な BBB in vitro 再構成モデルである。 解凍後のTEERの 経時変化 TEER （Ω×cm 2 ） 解凍後の時間 (Day) 0 100 200 300 400 3 4 5 6 7 8 (C) 60 80 100 120 1 4 12 24 保存期間 (week) TEER （% of time-0） 0 凍結BBBキットの 保存期間 (A) (D) 0 100 150 200 300 Day2 Day3 非凍結BBBキット 凍結BBBキット TEER （Ω×cm 2 ） 凍結、非凍結 BBBキットの比較 E00 EPA EOA EP0 0 100 200 300 ** TEER (% of E00) ** ** ## ** p<0.01 vs E00 ## p<0.01 凍結BBBモデル (B) 凍結によるBBBキット 構成細胞機能への影響 内腔側にsodium fluorescein （Na‐F , MW:376Da ）及び Evans’ blue albumin（EBA , MW:67kDa）を入れその透過性を検討した。 Na‐F は細胞間隙を透過する物質の指標で、EBA は経細胞性輸送の指標である。 TEER をEVOM resistance meter (World Precision Instruments)を用いて測定した。測定値はΩ×cm 2 で表した。TEERはイオン移動 の指標であり、その値が高いもの程バリア機能が高いことを示している。 Transendothelial electrical resistance (TEER) EVOM 4 結果 1~ 凍結・解凍~ Na‐F EBA 0 2 4 6 8 10 0 150 200 250 300 350 TEER (Ω×cm 2 ) Pe (10 -6 cm/s) (F) TEERとPe相関 0 100 200 300 400 Lot.1 Lot.2 Lot.3 Lot.4 Lot.5 Lot.6 Lot.7 Lot.8 Lot.9 Lot.10 150 TEER （Ω×cm 2 ） Day 4 (E) Lot間におけるTEERのばらつき 0 100 200 300 400 500 0 2 4 6 8 10 4 day 5 day 6 day Na‐F Pe TEER TEER (% of E00) Na-F Pe (10 -6 cm/s) 150 (G) 解凍後4,5,6日目のTEERとPe 凍結BBBキットは、非凍結BBBキットのTEER値と同レベルであり、凍結による機能障害はなかった。(A) 凍結による、内皮細胞及びアストロサイト、ペリサイトの機能障害はみられなかった。(B) 凍結BBBキットは解凍後8日目まで高いTEER値を保っており、4日目以降は200 Ω×cm 2 以上を示した。(C) 凍結BBB キットは24週間保存しても、TEER値に変化がなく、半年間の保存が可能であった。(D) 凍結BBBキットのロット間でのTEER値は、 150～320 Ω×cm 2 であったが、このTEER値の差は、 sodium fluorescein とEvans’ blue albumin の透過性に大きな影響を与えなかった。(E, F) 凍結BBBキットを解凍後、4～6日目でTEER値及びsodium fluorescein の透過性に大差はなかった。(G) Transcellular transport and paracellular transport Evans’ blue albumin (EBA, 67kDa) sodium fluorescein (Na‐F, 376Da) 機能評価 中枢作用性薬物と非中枢作用性薬物は透過係数により判別可能である。 BBBキットで得られた化合物の透過係数と文献値より得られた in vivo 値は良好な相関関係を示した。 BBB キットの凍結と解凍 凍結BBBキット BBBキットの解凍 ‐80℃ 約2時間後、RBEC培養液1に交換 RBEC培養液2に交換 37℃に温めた培地を加える 4日後、使用可能 Isolation of Rat brain microvascular endothelial cells (RBEC) + puromycin (4μg/mL) BBB キットの凍結 Day astrocytes pericytes RBEC 0 1 +hydrocortisone (500nM) 2 3 4 5 0 1 2 3 4 保存（‐80℃） （1 week ~ 24 week) BBB キットの解凍 pericyte BBBキットの凍結 ディープリーザーへ ‐80℃ ディープフリザー コーティング ペリサイトの播種 内皮細胞、アストロサイトを 凍結保存液で懸濁して播種 BBBキットの長期保存および輸送を可能とするため、凍結保存方法を構築し、 その機能評価を行った。 凍結/解凍方法 luminal abluminal 解凍後の時間
Transcript of 新規BBBモデルの機能評価 - pharmacocell.co.jp 448 . passive lipophilic + 53: haloperidol....
ｖ中川慎介1,2、 Mária A. Deli2,5、 川口裕子3、 清水谷健志3、 下野貴宣2、 山口万貴子2、 片岡泰文2,4、 丹羽正美1,2
e‐mail: shin3@nagasaki‐u.ac.jp1. 長崎大院・医歯薬・薬理学1（医）、 2. ファーマコセル
3. 大日本住友製薬・薬物動態研究所・探索薬物動態研究部
4. 福岡大・薬・薬学疾患管理学、 5. ハンガリーサイエンスアカデミー
新規BBBモデルの機能評価A New BBB Model: Testing Specific Function
第81回日本薬理学会年会 03,17‐19,2008
Elimination of nuclear arms !No more Nagasaki, no more Hiroshima !
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ｖ
ｖ ｖ
Transwell® Permeable Supports# membrane Pore size Pore density
3460 Polyester (PE) 0.4μm 4×106 pores/cm2
3401 Polycarbonate (PC) 0.4μm 1×108 pores/cm2
3462 Polyester (PE) 3.0μm 2×106 pores/cm2
3402 Polycarbonate (PC) 3.0μm 2×106 pores/cm2
Evans' Blue Albumin FITC-Dextran 4,000sodium fluorescein
0
10
20
30
40
50
60
70
80
PE-3.0μm PC-3.0μmPE-0.4μm PC-0.4μm
membrane
Pe(1
0-6cm
/s)
0
100
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500
700
TEER
(Ω×
cm2 )
polycarbonate (PC)
mem
brane
BBB kit
polyester (PE)m
embrane
**
6Transwell® membraneの検討
Polycarbonate membrane の 3.0μm の pore sizeを持つ Transwell® は大分子の透過性にも対応したmembrane であり、その TEER 値は polyester membrane よりも高値を示した。
brain capillary
astrocytes
endothelial cells
pericytes
Transwell® compounds
Filter
abluminal
luminale‐mail : [email protected]
URL:http://www.pharmacocell.co.jp
PharmaCo‐Cell Company Ltd.
7ConclusionTranswell®内での長期保存が可能な凍結方法を構築した。
BBBキットで得られた化合物の透過係数と文献値より得られた in vivo Papp値は良好な相関関係を示し、実用的な薬物脳内移行性検定システムであることが実証できた。
ｖ ｖ ｖE00
0
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400
TEER
(Ω×
cm2 )
Day 5 TEER
EAP
a, b
EP0
a, b
, c
EPA
a
E0P
a, b
, c
EA0
a, b
, c, f
E0A
b, c
, d, e
ap < 0.01 vs. E00bp < 0.01 vs. EPAcp < 0.01 vs. EAPdp < 0.01 vs. EP0ep < 0.01 vs. E0Pfp < 0.05 vs. EP0
背景・目的
3週齢Wistarラットより前脳を摘出後、酵素・遠心処理し、毛細血管片を分離し、collagenetype4 と fibronectine でコーティングした dish で培養した。培養液には、10% plasma‐derived bovine serum (PDS )/DMEM‐F12 に1.5 ng/mL basic fibroblast growth factor(bFGF), 100μg/mLheparin, insulin (5 μg/ml), transferrin (5 μg/ml), sodium selenite (5 ng/ml) (insulin‐transferrin‐sodium selenite media supplement)を加えた.
毛細血管片には一部ペリサイトが含まれており、コーティングなしの培養皿で10%FBS/DMEMにて培養するとペリサイトのみが増殖する。ペリサイトは突起を有する多角形をしており形態的に内皮細胞と識別可能である。
アストロサイトは生後2日齢のラットよりshaking methodを用いて分離した。培養液には10%FBS/DMEMを用いた。
Rat cerebral endothelial cells
Rat cerebral pericytes
Rat cerebral astrocytes
初代培養細胞
astrocytes (A)
endothelial cells (E)
pericytes (P)
EPA
in vitro BBB 再構成系 ～BBB キット～
In vitro で作用が発見された中枢神経性疾患の治療薬候補であっても、実験動物に投与すると、その多くは脳に存在する関門である血液脳関門（Blood‐Brain Barrier; BBB）のために脳内に移行できず、実際の治療薬になり得ない。
薬物の BBB 透過性は化学構造や分子量などから予め判断できず、脳内への移行性に一定の法則性を見出すことはできない。
中枢神経作用薬の開発、適正な薬物治療のためには、生体の複雑な BBB と等価のシステムを用いて、薬物の透過性を予測することが重要である。
脳内移行性を簡便に検定する検査キット（BBBキット）があれば、膨大な費用と時間をかけて行われている創薬研究の効率化が図られ、より即応的で確実な創薬のスクリーニングが達成でき、中枢神経作用薬の開発に貢献できる。
臨床試験
創薬研究
2～3年前臨床試験
3～5年5～10年
化合物の数
薬物標的の同定
リード化合物発見
リード化合物最適化
前臨床試験
臨床試験申請承認
5,000～10,000化合物
5 ～ 10化合物10,000
1 化合物10,000
Blood
Brain
Carrier mediated transport
Receptor‐mediated transport
Hexose
LAT1
CNT2
nucleosidesaminoacid
glucose LDL, insulin,transferrin
MDR
MRP
OATP
OAT
Efflux transporters
Paracellulartransportwater‐soluble
agents
Adsorptive transcytosis
albumin, otherplasma proteins
vinca alkaloids,cyclosporin A
Tight junction
MRP1RAGE LDL receptor MDRGLUT1 claudin‐5ZO‐1
astrocyte
pericyte
脳側効果発揮
候補薬
血管側
OATP
中枢神経作用薬の開発
BBBの構成細胞である脳毛細血管内皮細胞、ペリサイト、アストロサイトを共培養し、生体内の BBB に近似した BBB in vitro再構成モデル（BBBキット）を構築した。
Take off the meninges
Percoll
astrocytes
Shaking methods
GFAP
vWF LDL receptor
α‐SM actin
endothelial cells
pericytes
3‐week rats
2‐day rats
astrocyte
endothelial bloodcell
pericyte
TJ
遠心後
Capillary
NG2 proteoglycan
nestin
321
5結果 2~ Drug permeability assay~
name MW CNS transport Recoveryrate (%)
risperidone 410 + efflux 69.8fluvoxamine 434 + lipophil and high protein binding 63.6
trazodone 408 + passive lipophilic 63.1fluoxetine 346 + lipophil and high protein binding 62.3
hydroxyzine 448 + passive lipophilic 53haloperidol 376 + passive lipophilic 52.1vincristine 923 - efflux 64.6
digoxin 781 - efflux 62.7prazosin 420 - efflux: ABCG2 57.7
vinblastine 909 - efflux 53.5verapamil 491 - efflux 51.2
nortriptyrine 300 + Influx: NET 44.4
paroxetine 375 +lipophil and high protein binding, Pgp inhibitor but not Pgp substrate, lipid soluble 39.7
buspirone 422 + passive hydrophilic 39.4chlorpromazine 355 + efflux, Pgp substrate/inhibitor 32.3
sertraline 343 + lipophil and high protein binding, Pgp inhibitor 18.7paclitaxel 854 - efflux 38.4
loperamide 514 - efflux 38.3loratadine 383 - efflux 16
amiodarone 682 - efflux 4cyclosporin 1,203 - efflux 1.6
PS e
1
PS total
1
PS mem
1
Pe (cm/min)A
PSe
name MW CNS transport Recoveryrate (%)
sulpiride 341 ±efflux: Pgp, influx: OCTN1, OCTN2, PEPT1 91.7
phenytoin 252 + lipophil and high protein binding 99.6antipyrin 188 + passive lipophilic 90
carisoprodol 260 + passive lipophilic 89.6
indomethacin 358 + passive hydrophilic 87.6
caffeine 212 + passive lipophilic 87.5carbamazepine 236 + passive lipophilic 85.1
midazolam 326 + passive lipophilic, highly permeable, Pgp substrate 84.2propranolole 296 + passive lipophilic 81.9
zolpidem 382 + passive lipophilic 71.7atenolol 226 - passive hydrophilic, weak base 97.1
cimetidine 252 - efflux 95.4acetylsalicilic acid 180 - organic anion, efflux (Oat1, Oat2) 94.2
epinastine 286 - efflux 94prednisone 358 - efflux (Pgp) 93.2
fexofenadine 538 - efflux: Pgp, OATP1A2 93.1hydrocortisone 362 - efflux (Pgp) 88.2
warfarin 346 - lipophil and high protein binding 79.8quinidine 783 - efflux 72.8
[luminalt=60 ] + [abluminal t=60]
[luminal t=0 ]Recovery rate (%) = ×100
既存薬物40種類の透過性検定
薬物の溶解性や吸着等の問題による判定ミスを防ぐため、回収率（recovery rate)を算出した。
0
100
200
300
400
20 40 60 80ｔime (min)
Volu
me(μL
)
membrane BBB kit
PS total
PS mem
[C]A × VA
[C]L
Volume (μL) =
[C]A – abluminal tracer concentrationVA – volume of abluminal chamber[C]L – initial luminal tracer concentration
PStotal – slope of the clearance curve for BBB kitPSmem – slope of the clearance curve for cell-free filterPS dimension: µl/min = 10-9 m3/min
A - membrane surface area 12-well Transwell clear insert: A = 1 cm2 = 10-4 m2
Pe = PSe (µl/min) / A (cm2) = 10-9 m3 / min / 10-4 m2
= 10-5 m/min = 10-3 cm/min= Pe / 60 = cm/s
透過係数の算出
0.01
0.1
1.0
10
zolpidemcaffeinephenytoincarisoprodolantipyrincarbam
azepinem
idazolamindom
ethacin
quinidinehydrocortisone
prednisonesulpiride
cimetidine
epinastineacetylsalicilic acid
fexofenadine
in v
itro
Pe(1
0-6cm
/s)
CNS+ drugs
CNS- drugs
warfarin
(high protein binding
）
100
※文献値より
0.001
0.01
0.1
1
10
0.01 0.10 1.0 10
in v
ivo
Papp
※(1
0-6cm
/s)
in vitro Pe (10-6 cm/s)
caffeine
propranololindomethacin
quinidine
hydrocortisone
paroxetine
cimetidine
vinblastine
vincristinedigoxin
100
R2 = 0.813
回収率（recovery rate)の算出
BBBキットの精度を確認するために、既存薬物 40 種類を用いて透過性検定を行った。検定化合物（各 1μM）を管腔側に入れ、20,40,60 分後に脳側に漏れ出てきた薬物濃度を測定し、回収率及び透過係数を算出した。
BBBキットは新薬開発、薬物相互作用による副作用判定、既存薬の改良による脳内移行性の判定、病態モデルを用いた病態解析などに利用でき、理想的な BBB in vitro 再構成モデルである。
解凍後のTEERの
経時変化
TEER
（Ω×
cm2 ）
解凍後の時間 (Day)
0
100
200
300
400
3 4 5 6 7 8
(C)
60
80
100
120
1 4 12 24
保存期間 (week)
TEER
（%
of t
ime-
0）
0
凍結BBBキットの保存期間
(A)
(D)
0
100150
200
300
Day2 Day3
非凍結BBBキット
凍結BBBキット
TEER
（Ω×
cm2 ）
凍結、非凍結BBBキットの比較
E00
EPA
EOA
EP00
100
200
300 **
TEER
(% o
f E00
)
** **
##
** p<0.01 vs E00## p<0.01
凍結BBBモデル
(B) 凍結によるBBBキット構成細胞機能への影響
内腔側にsodium fluorescein （Na‐F , MW:376Da ）及び Evans’ blue albumin（EBA , MW:67kDa）を入れその透過性を検討した。Na‐F は細胞間隙を透過する物質の指標で、EBA は経細胞性輸送の指標である。
TEER をEVOM resistance meter (World Precision Instruments)を用いて測定した。測定値はΩ×cm2で表した。TEERはイオン移動の指標であり、その値が高いもの程バリア機能が高いことを示している。
Transendothelial electrical resistance (TEER)EVOM
4結果 1~ 凍結・解凍~
Na‐FEBA
0
2
4
6
8
10
0 150 200 250 300 350TEER (Ω×cm2)
Pe(1
0-6cm
/s)
(F) TEERとPe相関
0
100
200
300
400
Lot.1
Lot.2
Lot.3
Lot.4
Lot.5
Lot.6
Lot.7
Lot.8
Lot.9
Lot.1
0
150
TEER
（Ω×
cm2 ）
Day 4
(E) Lot間におけるTEERのばらつき
0
100
200
300
400
500
0
2
4
6
8
10
4 day 5 day 6 day
Na‐F Pe TEER TEER (%
of E00)Na-
F Pe
(10-6
cm/s
)
150
(G) 解凍後4,5,6日目のTEERとPe
凍結BBBキットは、非凍結BBBキットのTEER値と同レベルであり、凍結による機能障害はなかった。(A)
凍結による、内皮細胞及びアストロサイト、ペリサイトの機能障害はみられなかった。(B)
凍結BBBキットは解凍後8日目まで高いTEER値を保っており、4日目以降は200 Ω×cm2以上を示した。(C)
凍結BBB キットは24週間保存しても、TEER値に変化がなく、半年間の保存が可能であった。(D)
凍結BBBキットのロット間でのTEER値は、 150～320 Ω×cm2 であったが、このTEER値の差は、sodium fluorescein とEvans’ blue albumin の透過性に大きな影響を与えなかった。(E, F)
凍結BBBキットを解凍後、4～6日目でTEER値及びsodium fluorescein の透過性に大差はなかった。(G)
Transcellular transport and paracellular transport Evans’ blue albumin(EBA, 67kDa)
sodium fluorescein(Na‐F, 376Da)
機能評価
中枢作用性薬物と非中枢作用性薬物は透過係数により判別可能である。BBBキットで得られた化合物の透過係数と文献値より得られた in vivo 値は良好な相関関係を示した。
BBB キットの凍結と解凍
凍結BBBキット
BBBキットの解凍
‐80
約2時間後、RBEC培養液1に交換
RBEC培養液2に交換
37に温めた培地を加える
4日後、使用可能
Isolation ofRat brain microvascularendothelial cells (RBEC)
+ puromycin (4μg/mL)
BBB キットの凍結
Day
astrocytes
pericytes
RBEC
0 1
+hydrocortisone (500nM)
2 3 4 50 1 2 3 4
保存（‐80）（1 week ~ 24 week)
BBB キットの解凍
pericyte
BBBキットの凍結
ディープリーザーへ
‐80ディープフリザー
コーティング
ペリサイトの播種
内皮細胞、アストロサイトを凍結保存液で懸濁して播種
BBBキットの長期保存および輸送を可能とするため、凍結保存方法を構築し、その機能評価を行った。
凍結/解凍方法
luminal
abluminal
解凍後の時間
