BASES MOLECULARES DE LA ACTIVIDAD …
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UNIVERSIDAD TECNICA FEDERICO SANTA MARIA PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE VALPARAÍSO PROGRAMA CONJUNTO DE DOCTORADO EN BIOTECNOLOGIA BASES MOLECULARES DE LA ACTIVIDAD BIOCONTROLADORA DE LA BACTERIA Pseudomonas veronii R4 SOBRE EL NEMÁTODO Xiphinema index Fabiola Alejandra Altimira Passalacqua Tesis presentada para la obtención del Grado Académico DOCTOR EN BIOTECNOLOGIA Director de Tesis: Dr. Michael Seeger Pfeiffer Co-Director de Tesis: Dr. Humberto Prieto Encalada Junio, 2017
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UNIVERSIDAD TECNICA FEDERICO SANTA MARIA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE VALPARAÍSO
PROGRAMA CONJUNTO DE DOCTORADO EN BIOTECNOLOGIA
BASES MOLECULARES DE LA ACTIVIDAD
BIOCONTROLADORA DE LA BACTERIA Pseudomonas veronii R4
SOBRE EL NEMÁTODO Xiphinema index
Fabiola Alejandra Altimira Passalacqua
Tesis presentada para la obtención del Grado Académico
DOCTOR EN BIOTECNOLOGIA
Director de Tesis: Dr. Michael Seeger Pfeiffer
Co-Director de Tesis: Dr. Humberto Prieto Encalada
Junio, 2017
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COMISIÓN EVALUADORA INTEGRADA POR
DR.: RICARDO SIMPSON RIVERA
DR.: JAMES ROBESON CAMUS
DR.: PATRICIO HINRICHSEN RAMÍREZ
DR: JUAN PABLO MARTÍNEZ CASTILLO
DR: HUMBERTO PRIETO ENCALADA
DR: MICHAEL SEEGER PFEIFFER
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Dedicada a mis padre, Fabiola y Alejandro por su cariño, comprensión y apoyo.
4
Resumen
Bases moleculares de la actividad biocontroladora de la bacteria Pseudomonas veronii R4
sobre el nemátodo Xiphinema index
La bacteria Pseudomonas veronii R4 aislada desde la rizósfera de vid, presenta alta actividad
nematicida sobre Xiphinema index. Este nemátodo es el vector del virus de la hoja de abanico de la vid,
el agente viral más importante que afecta este cultivo.
P. veronii R4 está relacionado filogenéticamente con cepas de P. fluorescens promotoras del
crecimiento de plantas. Las cuales secretan una batería de enzimas extracelulares que podrían estar
participando en su actividad biocontroladora. En esta tesis, se postuló que la cepa R4 ejerce su actividad
nematicida sobre X. index mediante la secreción de enzimas hidrolíticas. Se propusieron como objetivos
específicos: (i) identificar los genes del genoma de P. veronii R4 que podrían estar participando en su
actividad nematicida, (ii) evaluar los genes que son diferencialmente expresados en esta cepa por la
interacción con X. index (iii) evaluar el rol nematicida sobre X. index de las enzimas extracelulares
codificadas por los genes candidatos de P. veronii R4. Mediante el análisis del genoma secuenciado de
P. veronii R4 se determinaron los genes que codifican enzimas extracelulares junto con sistemas de
secreción que podrían participar en la exportación de estas enzimas. La secuenciación y análisis del
transcriptoma de P. veronii R4 expuesta a extracto de X. index indicó que esta cepa es capaz de sensar
las proteínas y azucares del nemátodo como fuente de C y N, induciendo los genes relacionados con su
transporte. Se observó la inducción del gen que codifica la fosfolipasa extracelular ExoU, que podría
participar en la degradación de la matriz celular de nemátodos. Mediante zimografía en geles de gelatina
se determinó la secreción de una proteasa de 49 kDa. Zimografía en geles de tributirina, demostraron la
secreción de dos lipasas (50 kDa y 69 kDa). Análisis de espectrometría de masas (MALDI-TOF) permitió
la identificación de la proteasa AprA y de las lipasas, LipA y ExoU. Ensayos de exposición de X. index
con el extracto de proteínas del sobrenadante durante 3 h produjo la muerte del nemátodo. Estudios de
microscopía de barrido demostraron que los nemátodos sufrieron distintos grados de destrucción de su
cutícula. Posteriormente, se clonaron los genes que codifican estas enzimas en vectores de entrada y
expresión de la serie Gateway, utilizando como huésped heterólogo la bacteria Escherichia coli
BL21(DE3). Ensayos enzimáticos de extractos de enzimas recombinantes, AprA, LipA y ExoU, en los
sustratos gelatina, tributirina y sangre, respectivamente, evidenciaron la funcionalidad de estas enzimas.
La exposición de los extractos de proteínas enriquecidos con las enzimas AprA (500 µg/mL), LipA (50
µg/mL) y ExoU (50 µg/mL) recombinantes sobre X. index provocaron pérdida de movilidad mayor a
90% después de 2 h de incubación a temperatura ambiente. Se observaron, mediante microscopía
electrónica de barrido, daños estructurales en la cutícula, deshidratación y exposición de tejidos internos
de los nemátodos incubados con los extractos de enzima recombinante. Estos resultados permitieron
confirmar que, al menos, uno de los mecanismos empleados por la cepa R4 para ejercer su actividad
nematicida está dado por la secreción de enzimas extracelulares. Las lipasas, ExoU y LipA, no han sido
previamente descritas como factores nematicidas en Pseudomonas.
5
Abstract
Molecular basis of biocontrol activity of the bacterium Pseudomonas veronii R4 on the
nematode Xiphinema index
The bacterium Pseudomonas veronii R4 isolated from grapevine rhizosphere, possess high nematicide
activity against Xiphinema index. This nematode is the vector of the grapevine fanleaf virus, the most
significant viral agent that affects this crop. P. veronii R4 is phylogenetically related to P. fluorescens
strains, that secrets a set of extracellular enzymes that are involved in their biocontrol activity. The
hypothesis of the thesis is that the strain R4 exerts its nematicide activity against X. index by means of
the secretion of hydrolytic enzymes. The specific aims are: (i) to identify the genes in P. veronii R4
genome that could participate in its nematicidal activity; (ii) to identify differentially expressed genes in
this strain by the interaction with X. index; (iii) to evaluate nematicidal activity of strain R4 candidate
genes. The analysis of the P. veronii R4 sequenced genome revealed the genes encoding extracellular
enzymes and proteins from a secretion system. The sequencing and analysis of the P. veronii R4
transcriptome exposed to X. index extract indicated that this strain can sense the nematode proteins and
sugars as carbon and nitrogen sources, inducing transport genes. The induction of the gene encoding the
extracellular phospholipase ExoU was observed. Gelatin gels zymography indicated the presence of a
49 kDa protease. Tributyrine gels zymography demonstrated the secretion of two lipases (50 kDa y 69
kDa). Identification of the protease AprA and the lipases LipA and ExoU was done by MALDI-TOF
Mass spectrometry analysis. X. index incubated during 3 h with the protein extract from the supernatant
induced nematode death. Scanning electron microscope studies showed cuticle damage in the nematodes.
The genes encoding these enzymes (aprA, lipA, exoU) were cloned in Gateway entry and destination
vectors, using Escherichia coli BL21 (DE3) as heterologous host. Enzymatic assays of the recombinant
enzymes extract, AprA, LipA y ExoU, in gelatin, tributyrine and blood respectively, confirmed the
functionality of these enzymes. The incubation of the protein extracts enriched with the recombinant
enzymes AprA (500 µg/mL), LipA (50 µg/mL) and ExoU (50 µg/mL) with X. index induce a motility
loss > 90% after 2 h of incubation at room temperature. Structural damage to the cuticle, dehydration
and exposition of the internal tissue of the nematodes incubated with the recombinant enzyme extract
were observed by scanning electron microscope. These results confirmed that the strain R4 exerts its
nematicidal activity by the secretion of extracellular enzymes. The lipases ExoU and LipA, have not
been previously described as nematicidal factors in Pseudomonas.
6
Agradecimientos
En la culminación de esta etapa de mi formación académica quisiera expresar mis
agradecimientos a Dios por brindarme la portunidad y darme las herramientas de desarrollar una de las
grandes pasiones de mi vida, trabajar en ciencias. También de agradecer por haberme permitido conocer
a las personas que me han guiado en este trayecto, como lo han sido mis tutores de tesis, el Dr. Michael
Seeger y el Dr. Humberto Prieto. Sus distintas visiones para abordar las problemáticas del quehacer
científico me han entregado un panorama más completo de las distintas estrategias que se pueden
desarrollar en ciencias para lograr los objetivos planteados.
Quisiera dar un especial agradecimiento al Laboratorio de Biotecnología de INIA-La Platina
integrado por el Dr. Humberto Prieto y su equipo, por ser un pilar fundamental en el desarrollo de mi
tesis. De forma individual expreso mis palabras de agradecimiento a parte de los integrantes que
formaron parte de este equipo de trabajo en el periodo de desarrollo de mi tesis. A Eduardo Tapia, por
su constante apoyo y entrega de conocimientos en el desarrollo de esta tesis. Gracias por generar un
ambiente de mutua colaboración que fue para mi tan enriquecedor y motivador. A Evelyn Sanchez, por
ser mi instructora en el manejo del mundo del RNA, por su paciencia, entrega de conocimiento y
excelente voluntad y disposición ¡¡Muchas gracias Eve!!. A Christian Montes por su tiempo y dedicación
en desarrollar el análisis de transcriptómico que fue la base para mi posterior análisis e interpretación de
resultados. Muchas gracias Christian por tu compromiso y tiempo, a pesar de estar en esos momentos
batallando en otros frentes. Quisiera también destacar el apoyo y cariño entregado por Julia Rubio,
Denisse Carvajal y Catalina Álvarez, porque fue fundamental en aquellos momentos difíciles que tuve
que enfrentar en este periodo, ¡¡Muchas Gracias chiquillas!!. Aprovecho de dar mis agradecimientos a
Victoria Barrientos, Daniela Quiroz, Marisol Muñoz, Blanca, Ísela, Alavaro Sequeida (¡¡Chubi!!),
Sebastian Godoy, Carlos Aguirre, Philip y Daniel por su cariño y apoyo.
Quisiera también agradecer al Laboratorio de Microbiologia Molecular y Biotecnología
Ambiental de la UTFSM integrado por el Dr. Michael Seeger y su equipo. Especialmente, Agustina
Undabarrena, Paulina Vega, Guillermo Bravo, Beatriz Cámara y Valentina Mendez, por su cariño, apoyo
y aportes a mi trabajo en los seminarios.
A mis queridos amigos Giannina Espina, Naria Oyanedel, Claudia d´Alençon, Ta-Ying, José
Jiménez, y Fabián Salazar, por su apoyo y por su entrega en el desarrollo de la ciencia, lo cual es para
mi fruto de inspiración y motivación. A mi querida amiga Jennylee Chameng, por su cariño y apoyo.
Y mi más grande agradecimiento a mis padres, Fabiola Passalacqua y Alejandro Altimira por
brindarme su apoyo, amor y cariño incondicional, que ha sido vital para terminar esta etapa de mi
formación.
Finalmente, quisiera agradecer a los fondos que financiaron el desarrollo de mi tesis, Beca
CONICYT, Beca de extensión de tesis de la UTFSM, Consorcio Biofrutales S.A. y Fondo
CORFO 13CTI- 21520-SP7.
7
Índice general
Resumen............................................................................................................................................. 4
Abstract .............................................................................................................................................. 5
Agradecimientos ................................................................................................................................ 6
Índice general ..................................................................................................................................... 7
I. Introducción .................................................................................................................................. 12
1.1 Características del grupo P. fluorescens en relación a su actividad PGPR .................................. 12
1.2 Factores biocontroladores de amplio espectro de cepas del grupo P. fluorescens ....................... 15
Poliquétidos ..................................................................................................................................... 15
Péptidos no ribosomales ................................................................................................................... 16
Ácido cianhídrico ............................................................................................................................. 17
1.3 Cepas de Pseudomonas que presentan actividad nematicida ...................................................... 21
II. Hipótesis ...................................................................................................................................... 25
III. Objetivos .................................................................................................................................... 25
Objetivo General .............................................................................................................................. 25
Objetivos Específicos ....................................................................................................................... 25
IV. Materiales y Métodos ................................................................................................................. 26
4.1 Reactivos .................................................................................................................................... 26
4.2 Cepas bacterianas y su medio de cultivo .................................................................................... 26
4.3 Análisis bioinformático del genoma Pseudomonas veronii R4 ................................................... 26
4.4 Ensayo de inducción de la cepa R4 con extracto de X. index ...................................................... 27
4.5 Secuenciación del transcriptoma de la cepa R4 .......................................................................... 27
4.6 Análisis del transcriptoma .......................................................................................................... 28
4.7 Evaluación de la secreción de lipasas y proteasa de P. veronii R4 .............................................. 28
4.8 Detección de actividad enzimática en el sobrenadante de la cepa R4 ......................................... 28
4.9 Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida ................................................................ 29
4.10 Zimografía de la actividad proteolítica ..................................................................................... 29
4.11 Zimografía de la actividad lipasa .............................................................................................. 30
4.12 Identificación de proteínas por análisis de espectrometría de masa .......................................... 30
4.13 Extracción de nemátodos para la evaluación de la actividad nematicida................................... 31
4.14 Evaluación de la actividad nematicida de extractos proteínas ................................................... 31
4.15 Construcción de vector de entrada ............................................................................................ 31
4.16 Construcción de vector de expresión para E. coli BL21 (DE3) ................................................. 32
4.17 Expresión de proteínas recombinantes en E. coli ...................................................................... 32
4.18 Evaluación de la actividad enzimática obtenidas de extractos de proteínas totales de E. coli ... 34
8
4.19 Evaluación de la actividad proteolítica ..................................................................................... 34
4.20 Evaluación de la actividad lipolítica en fase acuosa ................................................................. 34
4.21 Evaluación de la actividad fosfolipasa ...................................................................................... 35
4.22 Evaluación de la actividad nematicida de extractos totales ....................................................... 35
4.23 Microscopía electrónica de barrido (SEM) ............................................................................... 35
4.24 Análisis estadístico ................................................................................................................... 36
V. Resultados ................................................................................................................................... 37
5.1 Análisis bioinformático de genes que codifican factores nematicidas en el genoma de P. veronii
R4 .................................................................................................................................................... 37
5.2 Evaluación de la expresión diferencial de genes de P. veronii R4 por la interacción con el nemátodo
X. index ............................................................................................................................................ 41
Sistema de transporte de tricarboxilatos ........................................................................................... 41
Sistema de transporte de carbohidratos ............................................................................................ 41
Sistema de transporte de aminoácidos y derivados ........................................................................... 42
Sistema de eflujo CZC ..................................................................................................................... 42
Adquisición y metabolismo de Fe .................................................................................................... 42
Metabolismos de carbohidratos ........................................................................................................ 42
Metabolismo de rutas centrales ........................................................................................................ 43
Síntesis de exopolisacarido .............................................................................................................. 43
Exoenzimas ...................................................................................................................................... 43
5.3 Secreción de proteasas y lipasas por la cepa R4 ......................................................................... 46
5.4 Secuenciación de enzimas detectadas por espectrometría de masas ............................................ 46
5.5 Actividad nematicida de las enzimas secretadas por la P. veronii R4 ......................................... 49
5.6 Expresión de enzimas recombinantes en E. coli ......................................................................... 50
5.7 Secuenciación de las enzimas recombinantes por MALDI-TOF ................................................. 50
5.8 Renaturalización de enzimas recombinantes de la fracción insoluble ......................................... 52
5.9 Evaluación de actividad enzimática en placas con sustrato ......................................................... 52
5.10 Evaluación de la actividad nematicida de las enzimas recombinantes ...................................... 54
VI. Discusión ................................................................................................................................... 58
6.2 Análisis del transcriptoma de la cepa R4 expuesta a extracto de nemátodos X. index ................. 60
6.3 Secreción de enzimas de P. veronii R4 con actividad nematicida ............................................... 64
VII. Conclusiones ............................................................................................................................. 69
VIII. Proyecciones............................................................................................................................ 70
IX. Bibiografía ................................................................................................................................. 71
X. Anexo .......................................................................................................................................... 80
XI Productividad científica .............................................................................................................. 99
9
Índice de figuras
Figura 1. Organización de genes y enzimas que partifcipan en biosíntesis de 2,4 DAPG ................ 16
Figura 2. Agrupamiento de genes y enzimas que participan en la biosíntesis del NRP Orfamida .... 17
Figura 3. Agrupamiento de genes y enzimas que participan en la biosíntesis de ácido cianhídrico. . 18
Figura 4. Agrupamiento de genes y enzimas que participan en la biosíntesis de fenazina ............... 19
Figura 5. Vecindario génico de aprA y lipA y modelo de la ubicación espacial de las enzimas que
codifican. ......................................................................................................................................... 20
Figura 6. Morfolología de la cepa P. veronii R4 .............................................................................. 22
Figura 7. Ensayo antagonista de P. veronii R4 contra nemátodos X. index ...................................... 22
Figura 8. Árbol filogenético de cepas secuenciadas del grupo de Pseudomonas fluorescens. ........... 23
Figura 9. Genes o agrupamientos de genes que codifican factores biocontroladores en cepas del grupo
de P. fluorescens .............................................................................................................................. 24
Figura 10. Esquema de armado de vectores con las secuencias de los genes aprA, lipA y exoU ...... 33
Figura 11. Vencidario génico de los genes que codifican a AprA y LipA y representación lineal de la
secuencia aminoacidicas de estas enzimas ....................................................................................... 39
Figura 12. Vencidario génico del gen exoU y representación lineal de la secuencia aminoacídica de la
enzima ExoU .................................................................................................................................... 40
Figura 13. Gráficos que representan los genes inducidos de P. veronii R4 expuesta al extracto de
nemátodo ......................................................................................................................................... 44
Figura 14. Gráficos que representan los genes reprimidos de P. veronii R4 expuesta al extracto de
nemátodo ......................................................................................................................................... 45
Figura 15. Evaluación de la secreción de proteasas de P. veronii R4. ............................................. 47
Figura 16. Evaluación de la secreción de lipasas de P. veronii R4 .................................................. 47
Figura 17. Secuenciación de exoenzimas de P. veronii R4 mediante MALDI-TOF ........................ 48
Figura 18. Efecto del extracto de proteínas del sobrenadante del cultivo de células de P. veronii R4
sobre los nemátodos X. index ........................................................................................................... 49
Figura 19. Extractos de proteínas de E. coli BL21(DE3) que presentan las proteínas recombinantes
AprA, LipA y ExoU ......................................................................................................................... 50
Figura 20. Secuenciación de enzimas recombinantes mediante espectrometría de masas MALDI-TOF
......................................................................................................................................................... 51
Figura 21. Extractos de proteína enriquecidas con las enzimas recombinantes de la fracción insoluble
renaturalizada ................................................................................................................................... 52
Figura 22. Actividad enzimática de los extractos de proteínas enriquecidas con las enzimas
recombinantes AprA, LipA y ExoU ................................................................................................. 53
Figura 23. Cuantificación de la actividad enzimática de extractos de la fracción de proteínas insolubles
......................................................................................................................................................... 54
Figura 24. Actividad nematicidida de extractos de proteínas de la fracción insoluble renaturalizada
enriquecida con las enzimas recombinantes .................................................................................... 55
Figura 25. Efecto de las proteínas recombinantes sobre los nemátodos X. index ............................. 57
10
Figura 26. Modelo metabólico de la cepa R4 en base a la expresión diferencial de genes en la condición
de exposición con X. index ............................................................................................................... 63
Figura S1. Secuencia aminoácidica de la metaloproteasa AprA predicha de P. veronii R4 y su
alineamiento con secuencias del grupo de Pseudomonas fluorescens cercanas filogeneticamente .. 82
Figura S2. Secuencia aminoácidica de la metaloproteasa LipA predicha de P. veronii R4 y su
alineamiento con secuencias del grupo de Pseudomonas fluorescens cercanas filogeneticamente. .. 84
Figura S3. Secuencia aminoácidica de la exofosfolipasa ExoU predicha a partir del genoma de P.
veronii R4 y su alineamiento con secuencias del grupo de Pseudomonas fluorescens cercanas
filogeneticamente. ............................................................................................................................ 86
Figura S4. Esquemas de los vectores de destino pDEST17-aprA, pDEST-lipA y pDET17-exoU. ... 95
Figura S5. Curva de calibración de la concentración azocaseina (0 a 6,23 mg/mL). ........................ 96
Figura S6. Curva de calibración de concentración p-nitrofenol (0 a 22 mM). ................................. 96
Figura S7. Curva estándar de calibrado de la concentración de enzima fosfolipasa v/s intensidad de
fluorescencia .................................................................................................................................... 97
Figura S8. Análisis de la región nucleotídica que se encuentra río arriba de la transcripción de aprA de
P. veronii R4 .................................................................................................................................... 98
11
Índice de Tablas
Tabla 1. Bacterias PGPR pertenecientes a los géneros Pseudomonas y Bacillus registradas como
biopesticidas en la EPA .................................................................................................................... 12
Tabla 2. Características del genoma ................................................................................................ 22
Tabla 3. Proteasas y lipasas extracelulares predichas mediante el análisis bioinformático del genoma
de P. veronii R4 ............................................................................................................................... 38
Tabla S1. Lecturas obtenidas luego de aplicar filtro de calidad y de Rrna ........................................ 87
Tabla S2. Lecturas mapeadas en el genoma de P. veronii R4 ........................................................... 87
Tabla S3. Genes inducidos en P. veronii R4 expuestos a extracto de nemátodos X. index (log2 (fold
change) ≥ 1, p-value < 0,05) ........................................................................................................... 88
Tabla S4. Genes reprimidos en P. veronii R4 expuestos a extracto de nemátodos X. index (log2 (fold
change) ≤ -1, p-value < 0,05) .......................................................................................................... 90
Tabla S5. Expresión diferencia de genes que codifican a enzimas extracelulares en P. veronii R4 .. 94
12
I. Introducción
El cultivo de la vid presenta grandes desafíos, siendo el control de la infección por fitopatógenos
uno de los más relevantes (Kortekamp, 2006). Entre los principales fitopatógenos que afectan este cultivo
se encuentra el nemátodo Xiphinema index, que está presente en el 48% de la superficie de suelo que se
emplea para el cultivo de la vid en Chile (Meza et al., 2012; Castañeda-Alvarez et al., 2016). La mayor
densidad de la población de X. index se encuentra alrededor de raíces y raicillas a una profundidad de
30-40 cm, con una densidad promedio de 300-400 ejemplares por 250 cc de suelo (González, 1993;
González, 2007). Este fitopatógeno daña las raíces, ocasionando deformaciones, agallas y menor vigor
en las plantas. X. index transmite los virus mosaico amarillo (GYMV, Grape yellow mosaic virus), hoja
en abanico (GFLV, Grapevine fanleaf virus) y venas en bandas (GVBV, Grape vein banding virus)
(González, 2007; Meza et al., 2012). Estos tres virus están serológicamente relacionados entre sí y son
transmitidos a las células de las raíces de la planta mediante la saliva del estilete de X. index (González
2007). Una de las potenciales alternativas para el control de este nemátodo, es el empleo de bacterias
promotoras del crecimiento de plantas (PGPR, plant growth promoting rhizobacteria), que a diferencia
de los agroquímicos presentan la ventaja de restituir el equilibrio ecológico de las poblaciones de
fitopatógenos, sin producir efectos dañinos al medio ambiente (Bellows, 2001; Van Driesche et al., 2016).
Bacterias PGPR pertenecientes a los géneros Pseudomonas y Bacillus, han sido descritas como
antagonistas de importantes patógenos que afectan a cultivos de importancia económica (Hallmann &
Berg, 2007) y han sido utilizados como agentes biocontroladores contra hongos, bacterias y nemátodos
(Adhikari et al., 2015). En la tabla 1, se presentan cepas PGPR del género Pseudomonas y Bacillus que
han sido registradas en la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA) para su
comercialización en el control de fitopatógenos (Tabla 1).
1.1 Características del grupo P. fluorescens en relación a su actividad PGPR
El género Pseudomonas pertenece a la subclase de ץ-Proteobacterias y está constituido por más
de 100 especies bacterianas que han sido clasificadas, mediante análisis de multilocus (rRNA 16S, gyrB,
rpoB y rpoD) en linajes, grupos y subgrupos (Mulet et al., 2010; Loper et al., 2012). Dentro de este
género, el grupo de Pseudomonas fluorescens presenta un relevante rol en el biocontrol de fitopatógenos
y de promoción del crecimiento vegetal (Loper et al., 2012). Las cepas PGPR del grupo P. fluorescens
presentan características comunes tales como: (i) colonizar las superficies de las plantas, específicamente
el área de infección de los patógenos; (ii) producir enzimas extracelulares y metabolitos secundarios que
afectan la viabilidad de los fitopatógenos, (iii) inducir respuestas de resistencia sistémica en la planta
13
(Haas & Keel, 2003; Haas & Defago, 2005). (iv) producir fitohormonas o metabolitos que influyen
directamente en el crecimiento y desarrollo de las plantas.
Tabla 1. Bacterias PGPR pertenecientes a los géneros Pseudomonas y Bacillus registradas
como biopesticidas en la EPA
Agente biocontrolador
(año de registro)
Organismo
blanco o
enfermedad
Cultivo o uso Producto Manofacturado
o distribuido
P. fluorescens A506
(1992)
Daños por
heladas,
fuego
bacteriano,
putrefacción
Frutales,
almendros,
papas y cultivo
de tomates
BlighBan
A506,
Frostban
Frost
Techology;
Plant Health
Technologies,
EE.UU.
P. chlororaphis 63-28
(2001)
Phytium
Rhizoctonia
solani,
Fusarium
oxysporum
Vegetales y
plantas
ornamentales
en invernadero
AtEze EcoSoil
Systems,
EE.UU.
B. pumilus GB34
(2002)
Rhizoctonia,
Fusarium
Hoja de soja GB34 Gustafson,
EE.UU.
B. lincheniformis
SB3086
(2003)
Patógenos
foliares
Plantas
ornamentales
Ecoguard
Novozy-
mes
Green
Relief
Novozymes
Biological,
EE.UU.
P. fluorescens
AFS009
(2017)
Fungicida
Césped,
plantas
ornamentales,
cultivos
agrícolas y
ciertas plantas
en áreas
residenciale
___ AFS009 Plant
Protection
EE.UU.
P. fluorescens
ACK55
(2017)
Herbicida Control del
fuego
___ USDA-ARS
B. subtilis GBO3
(1992)
Rhizoctonia,
Fusarium,
Aspergillus
Semillas de
cultivos de
algodón,
cacahuetes,
soja, trigo,
cebada,
guisantes y
frijoles
Kodiak
Compa-
nion
Gustafson;
Growth
Products,
EE.UU.
14
Tabla 1. Bacterias PGPR pertenecientes a los géneros Pseudomonas y Bacillus registradas
como biopesticidas en la EPA (continuación).
La capacidad del grupo de P. fluorescens de secretar una amplia gama de factores
biocontroladores y estimuladores del crecimiento de las plantas, está dada por la gran diversidad de este
grupo, constituido por más de 50 especies (e.g., P. fluorescens, P. veronii, P. gessardi, P. fragi, P.
mandelii, P. jesseni, P. koreensis, P. corrugata, P. chlororaphis y P. asplenii) (Mulet et al., 2010; Loper
et al., 2012). Análisis del genoma de cepas de las especies P. fluorescens (SBW25, A505, SS101), P.
protegens (Pf-5), P. chlororaphis (30-84, O6), P brassicacearum (Q8r1-96) y P. synxantha (BG33R)
que pertenecen al grupo P. fluorescens indican que sólo comparten el 45 al 50% de los genes, presentando
sus genomas una estructura tipo mosaico, constituido por regiones altamente conservadas a nivel de
Agente biocontrolador
(año de registro)
Organismo
blanco o
enfermedad
Cultivo o uso Producto Manofacturado
o distribuido
B. subtillus MB1600
(1994)
Fuzarium,
Rhizoctonia,
Alternaria y
Aspergillus
Algodón,
frijoles,
cebada, trigo,
maíz,
guisantes,
cacahuates y
Habas de soja
Subtilex,
Histick
N/Y
Becker
Underwood;
Premier
Horticulture,
EE.UU.
P. aureofanciens Tx-1
(1999)
Sclerotinia
Homeocarpa,
Colletotrichum
graminícola,
Pythium
aphanadermatum,
Michrodochium
nivale
Césped de
campo de golf
Bio-Ject,
Spot-Less
EcoSoil Systems,
EE.UU.
B. amyloliquefanciens
FZB24
(2000)
Rhrizoctonia
Fusarium
Bosque,
árboles
ornamentales y
arbustos
Taegro Earh
BioSciences,
EE.UU.
B. subtilis QST 713
(2000)
Patógenos foliares,
pudrición
Cerezas,
cucurbitáceas
uvas, hojas
vegetales,
pimientos,
patatas,
tomates y
Nueces
Serenade,
Rhapsod
Bayern Crop
Science
15
género con regiones que varian entre cepas (Loper et al., 2012). La gran mayoría de los genes asociados
con las interacciones multitróficas se distribuyen en regiones genómicas presentes en sólo un
subconjunto de cepas o en una única cepa en específico. Ejemplo de ésto son algunos genes que codifican
factores biocontroladores tales como el lipopéptido cíclico orfamida A (Gross et al., 2007), los derivados
de rhizoxina (Brendel et al., 2007; Loper et al., 2008), la bacteriocina LlpA (Parret et al., 2005) y la
toxina de insectos FitD (Pechy-Tarr et al., 2009), que están presentes en regiones específicas del genoma
de P. protegens Pf-5. También se han encontrado ciertos grupos de genes que están presentes en
subclados específicos del grupo de P. fluorescens, tales como los genes que codifican el sistema de
secreción de tipo III y sus efectores (Loper et al., 2012).
1.2 Factores biocontroladores de amplio espectro de cepas del grupo P. fluorescens
Una amplia variedad de factores biocontroladores están codificados en los genomas de cepas
PGPR pertenecientes al grupo P. fluorescens. Entre estos factores se encuentran los poliquétidos (e.g.,
2,4-diacetilfloroglucinol), péptidos no ribosomales (e.g., pioverdina y lipopéptidos), ácido cianhídrico,
fenazinas (e.g., ácido fenazina-1-carboxílico y piocianina), pioluteorina, pirrolnitrina, pioquelina, y
exoenzimas (Haas D & Defago, 2005, Loper & Gross, 2009; Loper et al., 2012). A continuación, se
describen los principales factores de amplio espectro de acción.
Poliquétidos
Los poliquétidos (PKs) son parte de una gama de metabolitos secundarios producidos por cepas
del grupo P. fluorescens. Están conformados por unidades de monómeros acilos unidos mediante
progresivas condensaciones de Claisen que son catalizadas por la enzima poliquétido sintetasa (PKS).
Las PKSs están compuestos por dominios aciltransferasa (AT), tiolación (T o ACP) y el cetosintasa (KS)
(Yuzawa et al., 2012). El dominio AT selecciona los sustratos, generalmente acetil-CoA, malonil-CoA
y metilmalonil-CoA, y los transfiere al dominio T donde son ensamblados covalentemente. El dominio
KS cataliza la formación del enlace carbono-carbono que permite la elongación del PK. Otros dominios
que aportan diversidad estructural a los diferentes PKs sintetizados, pero que no siempre están presentes
en un módulo, son los dominios cetoreductasa (KR), deshidratasa (DH), enolreductasa (ER), dominio de
ciclación (Cy) y dominio tioesterasa (TE) (Dreier & Khosla, 2000; Vargas, 2012). Los dominios que
componen los módulos de las diferentes PKS presentes en el dominio Bacteria permite la generación de
diversos compuestos con actividad antibiótica sobre diferentes blancos. Uno de los poliquétidos de
amplio espectro producido por cepas del grupo P. fluorescens es el 2,4-diacetilfloroglucinol (2,4-
DAPG). Este poliquétido posee actividad bactericida, fungicida y nematicida. Estudios en
Saccharomyces cerevisiae sugieren que el 2,4-DAPG interfiere en la función mitocondrial (Gleeson et.
16
al., 2010). El floroglucinol es sintetizado por una poliquétido sintetasa de tipo III, que es codificada por
el gen phlD (Fig. 1A). Enzimas, que son codificadas por los genes phlACB, participan en la acetilación
de floroglucinol para formar 2,4-DAPG (Fig. 1B) (Mavrodi et al., 2010). El operón phlACB es regulado
transcripcionalmente por la proteína PhlF, que es miembro de la familia de reguladores TetR. El gen
phlF se encuentra río arriba del operón phlACBD y se transcribe divergentemente (Haas & Defágo,
2005). La proteína PhlF dimérica se une a la región promotora pHLA reprimiendo la transcripción
(Schnider-Keel et al., 2000). Esta unión se inhibe en presencia de DAPG. El salicilato, pioluteorina y
ácido fusárico (toxina producida por Fusarium oxysporum) antagonizan el efecto del DAPG,
promoviendo la represión transcripcional mediada por PhlF (Schnider-Keel et al., 2000). En
Pseudomonas protegens CHA0 y Pf-5 se ha identificado un segundo regulador de la síntesis de 2,4-
DAPG de tipo-TetR, PhlH. El gen que codifica PhlH se encuentra río abajo del gen phlF. La inactivación
insercional de phlH provoca una disminución de la expresión del operón phl, sugiriendo que PhlH podría
funcionar como un activador o antirepresor (Haas & Keel, 2003; Loper & Gross, 2007).
Figura 1. Organización de genes y enzimas que partifcipan en biosíntesis del poliquétido 2,4
DAPG. A. Se presentan la organización de los genes relacionadas con la síntesis (rojo), genes accesorios
(naranja), regulación (verde) y transporte (amarillo) de 2,4-DAPG en P. protegens Pf-5. B. Síntesis de
2,4-DAPG (Adaptada de Loper & Gross, 2007).
Péptidos no ribosomales
Los péptidos no ribosomales (NRPs) son metabolitos secundarios con propiedades antibióticas.
Son sintetizados por sintetasas de péptidos no ribosomales (NRPS), que catalizan la formación de enlaces
peptídicos entre diferentes sustratos aminoacídicos gracias a su organización proteica en forma de
módulos biosintéticos. Los módulos están compuestos a lo menos por los dominios de adenilación (a),
tiolación (t) y condensación (c) (Fig. 2). Los péptidos sintetizados pueden sufrir modificaciones de
epimerización, glicosilación, acilación, metilación, formilación, halogenación, hidroxilación, ciclación,
17
reducción y oxidación entre otras, presentando diversas actividades biológicas. Las sintetasas de péptidos
no ribosomales han sido descritas por sintetizar NRP con amplio espectro de actividad antibiótica. En la
Fig. 2 se ejemplifica la organización génica y biosíntesis del lipopéptido orfamida secretado por P.
protegens Pf-5.
Figura 2. Agrupamiento de genes y enzimas que participan en la biosíntesis del NRP Orfamida. Se
presentan la organización de los genes relacionadas con la síntesis (rojo), genes accesorios (naranja),
regulación (verde) y transporte () del lipopeptido orfamida en P. protegens Pf-5. B. Modulos (m1-m10)
y dominios (a, adenilación; c, condensación y t, tiolación) que componen las NRPS codificadas en los
genes ofA, ofB y ofC. C. Ensamblaje lineal de péptidos no ribosomales de acuerdo a la estructura
multimodular de la enzima NRPS. El dominio adenilación es responsable de la selección del sustrato y
del ensamblaje covalente con el dominio de tiolación. El dominio de condensación es el que cataliza la
formación del enlace peptídico entre dos aminoácidos de dos módulos contiguos para la elongación del
péptido (Adaptada de Loper & Gross, 2007).
Ácido cianhídrico
El ácido cianhídrico (HCN) es un compuesto de amplio espectro de acción, (Fig.3), que inhibe
la actividad catalítica de la citocromo C oxidasa y de diversas metaloenzimas (Haas & Defago, 2005;
Blumer & Haas, 2000). Este compuesto es generado por la HCN sintasa, una flavoenzima unida a la
membrana, que oxida la glicina produciendo HCN y CO2 (Fig. 3B) (Blumer & Haas, 2000). Esta enzima
es codificada por los genes estructurales hcnABC, que presentan una organización tipo operón (Fig. 3A).
La regulación de la expresión de estos genes a nivel transcripcional es ejercida por el regulador ANR
18
(regulador anaeróbico de la arginina desaminasa y nitrato reductasa), en condiciones limitantes de O2 y
no limitantes de Fe (Blumer & Haas, 2000).
…………………………………………………………………………………………………...
Figura 3. Agrupamiento de genes y enzimas que participan en la biosíntesis de ácido cianhídrico.
A. Se presentan la organización de los genes relacionadas con la síntesis (rojo) de ácido cianhídrico y de
regulación (verde) en P. fluorescens F113. HK corresponte al gen que codifica un regulador histidina
quinasa, RT corresponde al gen que codifica a un regulador transcripcional. B. Sintesis de ácido
cianhídrico a partir de glicina.
…………………………………………………………………………………………..
Fenazinas
Las fenazinas son un amplio grupo de compuestos que están constituidas por anillos
heterocíclico, que difieren en sus propiedades físicas y químicas de acuerdo a la naturaleza y posición
de sus sustituyentes. Las fenazinas secretadas por cepas del grupo P. fluorescens inhiben el crecimiento
de bacterias, oomicetes, hongos, nemátodos, células de plantas y animales. Estos compuestos inhiben la
cadena transportadora de electrones. Catalizan la formación de radicales hidroxilos, en presencia de
ferripioquelina, promoviendo la perooxidación de lípidos y otras macromoléculas. Adicionalmente,
reducen el Fe desde formas insolubles, Fe3+(OH-)3, a formas solubles Fe+2 (Haas & Defago, 2005; Pierson
& Pierson, 2010). Las enzimas que participan en la síntesis de fenazina en Pseudomonas spp. son
codificadas por el operón phzABCDEFG (Fig. 4). Genes adicionales codifican enzimas que participan
en la derivatización de esta molécula generando fenazina-1-carboxamida, ácido 2-hidroxifenazina-1-
carboxílico y piocianina (Mavrodi et al., 2010). Los genes phzI y phzR participan en la regulación de la
expresión de los genes estructurales y de quorum sensing. El gen phzI codifica para la síntesis de la
molécula señal de baja masa molecular (tipo N-acil-homoserina lactona), que interaccionan con el
represor PhzR permitiendo la transcripción del operón de biosíntesis de fenazina (Mavrodi et al., 2010)
19
……………………………………………………………………………………………………
Figura 4. Agrupamiento de genes y enzimas que participan en la biosíntesis de fenazina. Se
presentan la organización de los genes relacionadas con la síntesis (rojo) y regulación (verde) de fenazina
en P. chlororaphis 30-84 (Adaptada de Pierson & Pierson, 2010).
……………………………………………………………………………………………………
Exoenzimas
Pseudomonas ssp. secretan enzimas extracelulares (exoenzimas), que participan en la
adquisición de nutrientes y en la interacción con otros procariontes y eucariontes (Loper et al., 2012). La
quitinasa producida por P. protegens Pf-5 y CHA0 hidroliza paredes de hongos, contribuyendo al control
biológico de hongos fitopatógenos. La enzima AprA es una exoproteasa que presenta hacia el extremo
C-terminal una señal de secreción, que permite el transporte de la enzima hacia el espacio extracelular
(Fig. 5) (Duong et al., 1996; Chenal et al., 2009). AprA inhibe la eclosión de huevos de nemátodos de
la especie Meloidogyne incognita y provoca la muerte de nemátodos juveniles (Siddiqui et al., 2005). Su
producción ha sido descrita en cepas del grupo P. fluorescens. La lipasa extracelular LipA ha sido
descrita en P. aeruginosa y P. fluorescens. LipA posee un tamaño aproximado de 50 kDa (Kojima et al.,
2003; Snellman et al., 2002) y una señal de secreción que participa en la exportación de esta proteína
hacia el espacio extracelular mediante el sistema de secreción tipo I (SST1) (Fig. 5) (Duong et al., 1994).
La enzima extracelular ExoU es una fosfolipasa A2, que cataliza la hidrólisis de ácidos grasos en la
posición sn-2 de los glicerofosfolípidos, produciendo ácidos grasos y lisofosfolípidos. Estructuralmente
presenta una señal de destinación hacia el espacio extracelular en sus 60 primeros residuos del N-terminal,
que permiten su transporte por el sistema de secreción SST3 hacia la célula blanco (Galle et al., 2012;
Hauser, 2009; Rabin et al., 2005). En el C-terminal presentan un dominio conservado que direcciona a
20
ExoU hacia la membrana plasmática de la célula blanco, región de la célula con alta concentración de
fosfolípidos en donde ejerce su actividad catalítica, provocando la muerte celular (Rabin et al., 2006).
Figura 5. Vecindario génico de aprA y lipA y modelo de la ubicación espacial de las enzimas que
codifican. Se presentan la organización de los genes que forman parte del vecindario génico de la
proteasa AprA (rojo) y de la lipasa LipA (rojo oscuro) en P. fluorescens A506. Rio arriba del gen aprA,
se encuentra los genes que codifica un regulador tipo LuxR (amarillo), una permeasa (verde) y una
peptidasa (naranja). Rio abajo de aprA se encuentra los genes que codifican el inhibidor AprI (cafe), el
sistema de secreción AprDEF (verde) y la lipasa LipA.
Los factores biocontroladores anteriormente mencionados, son sintetizados por el metabolismo
secundario de las bacterias. Este metabolismo se estimula en condiciones de crecimiento restringido para
la bacteria (limitación de nutrientes o alta densidad celular), con el objetivo de mantener su
competitividad en su entorno. La producción de metabolitos secundarios es regulada a nivel
transcripcional, post-transcripcional y por condiciones medioambientales. Entre las condiciones
medioambientales se incluyen el contenido de minerales, la tensión de oxígeno, las condiciones
osmóticas, el fosfato, el fierro, las fuentes de carbono y el nitrógeno. También sa ha descrito que
metabolitos fúngicos, bacterianos y de la planta, participan en regular la expresión de metabolismo
secundario bacteriano (Haas & Keel, 2003).
21
1.3 Cepas de Pseudomonas que presentan actividad nematicida
La PGPR P. protegens CHA0 ejerce actividad antagonista sobre el nemátodo M. incognita. Su
actividad está mediada por la secreción de la proteasa extracelular AprA y de los metabolitos
secundarios, HCN y 2,4-DAPG (Siddiqui et al., 2005; Siddiqui et al., 2006). La cepa Pseudomonas
putida 1A00316 aislada desde muestras extraídas en la Antártica, presenta alta actividad nematicida
contra el mismo nemátodo M. incognita. Análisis de genómica comparativa de esta cepa con los genomas
secuenciados del grupo P. fluorescens, revelaron que P. putida 1A00316 secreta factores
biocontroladores similares a los descritos en cepas del grupo P. fluorescens, tales como la metaloproteasa
AprA y los metabolitos secundarios, ácido cianhídrico y ciclo-(L-isoleucina-L-prolina) (Guo et al., 2016).
Aballay et al. (2011) aislaron 400 bacterias desde la rizósfera de vid infestadas con X. index para evaluar
el efecto nematicida contra este nemátodo. De estos aislados 4 cepas pertenecientes a las especies P.
fluorescens y P. chlororaphis presentaron actividad nematicidas en ensayos antagonista.
Canchignia et al. (2016) aislaron 13 cepas del género Pseudomonas desde la raíz y rizósfera de
vid. Ensayos in vitro permitieron determinar que la cepa R4 (Fig. 6) generaba la mayor actividad
nematicida junto con la cepa de referencia P. protegens CHA0 (Fig. 7). La cepa R4 presenta la capacidad
de colonizar raíces y de promover el crecimiento de raíces secundarias mediante la producción de ácido
indol acético (Canchignia, 2013). En base al genoma secuenciado y anotado de la cepa R4 (Tabla 2) se
realizó un análisis in sílico de hibridación genoma-genoma junto con un análisis filogenético de 31
proteínas ortólogas altamente conservadas (Montes et al., 2016). Los resultados de estos análisis
indicaron que la cepa R4 pertenece a la especie P. veronii y que está filogenéticamente relacionada con
las cepas P. fluorescens SBW25, P. fluorescens SS10, P. fluorescens A506 y P. synxantha BG33R (Fig.
8) (Loper et al., 2012). Estas Pseudomonas spp. han sido caracterizadas por su actividad biocontroladora
de fitopatógenos y codifican en su genoma una batería enzimática extracelular (proteasas, quitinasas,
fosfolipasas) junto con sistemas de secreción que participan en la exportación de estas enzimas (Fig 9)
(Loper et al., 2012). Estas enzimas son los potenciales factores nematicidas, que podría estar secretando
P. veronii R4. El análisis del genoma secuenciado de esta cepa, junto con el análisis de su transcriptoma
en interacción con X. index, podrían evidenciar los mecanismos implicados en la actividad nematicida
de la cepa R4.
…………………
………………………
22
Figura 6. Morfolología de la cepa P. veronii R4. A. Celulas de la cepa R4 obtenidas por análisis de
microscopia electrónica de barrido (SEM). Colonia de la cepa R4 crecida en medio King's B a 28 °C por
24 h (Montes et al., 2016).
……………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………….
Figura 7. Ensayo antagonista de P. veronii R4 contra nemátodos X. index. Se incubó 5,8 x 106 células
bacterianas de cada aislado con 10 nemátodos durante 3h en agar semisólido. La viabilidad de los
nemátodos se determinó mediante la evaluación de la movilidad en agua destilada posterior a la
incubación con la cepa R4. A. Nemátodos en agua destilada, incubados previamente en medio King's B
(control). B. Nemátodos en agua destilada expuestos, previamente, por 3 h a la cepa R4 con actividad
nematicida. Fotografía representativa de ensayo realizado en triplicado (Canchignia et al., 2017).
………………………………………………………………………………………………………………..
Tabla 2. Características del genoma (Montes et al., 2016)
Atributo Valor % del total
Tamaño del genoma (bp) 6.649.820 100,0
DNA codificante (bp) 5.735.337 86,2
Scaffolds de DNA 2 -
Genes totales 5967 100,0
Genes que codifican proteinas 5906 99,0
Genes que codifican rRNA 61 1,0
Genes con función predicha 4.894 82,9
Genes que codificaran
proteínas con péptido señal 557 9,4
23
Figura 8. Árbol filogenético de cepas secuenciadas del grupo de Pseudomonas fluorescens. Análisis
realizado en base al alineamiento de 31 proteínas ortólogas concatenadas altamente conservadas descrita
por Cicarelli et al. (2006). El árbol filogenético se construyó empleando el método de máxima
verosimilidad y el modelo de sustitución de Dayhoff. La confiabilidad de las ramas se evaluó con la
aproximación Shimodaira-Hasegawa. Se destacan con recuadros de colores las ramas que contienen
cepas de Pseudomonas spp. relacionadas filogenéticamente, previamente, caracterizadas como PGPR
(Loper et al., 2012). En círculos negros se destacan las cepas que son filogenéticamente cercanas a R4 y
han sido descritas como PGPR (Figura adaptada de Montes et al., 2016).
24
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..
Figura 9. Genes o agrupamientos de genes que codifican factores biocontroladores en cepas del grupo de P. fluorescens. Las cepas se agruparon
mediante el análisis de inferencia filogenética Bayeasiana generado en base al concatenamiento de diez genes de mantencion celular (acsA, aroE,
dnaE, guaA, gyrB, mutL, ppsA, pyrC, recA y rpoB). Los rectángulos coloreados representan la presencia de genes dentro de un genoma, mientras
que su ausencia está representado por un círculo; los números dentro de una caja representan el número de copias de un gen o agrupamiento génico.
Los genes que se encuentran dentro de regiones de contenido trinucleotídico atípico tienen la mitad de sus cajas ennegrecidas. a. Cepas bacterianas:
P. protegens Pf-5, P. chlororaphis 30-84, P. chlororaphis O6, P. fluorescens Pf0-1, P. brassicacearum Q8r1-96, P. fluorescens Q2-87, P. fluorescens
SBW25, P. synxantha BG33R, P. fluorescens A506 y P. fluorescens SS101 (Figura adaptada de Loper et al., 2012).
‘u
25
II. Hipótesis
Pseudomonas veronii R4 ejerce su actividad biocontroladora sobre el nemátodo Xiphinema index
mediante enzimas hidrolíticas extracelulares, cuyos genes son diferencialmente expresados.
III. Objetivos
Objetivo General
Identificar y caracterizar los genes y enzimas extracelulares de P. veronii R4 responsables de la
actividad biocontroladora sobre el nemátodo X. index.
Objetivos Específicos
1. Identificar los genes del genoma de P. veronii R4 que podrían estar participando en su actividad
nematicida sobre X. index.
2. Evaluar los genes que son diferencialmente expresados en P. veronii R4 por la interacción con
el nemátodo X. index.
3. Evaluar el rol nematicida sobre X. index de las enzimas extracelulares codificadas por los genes
candidatos de P. veronii R4.
26
IV. Materiales y Métodos
4.1 Reactivos
La solución de tributirina y los compuestos isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG), Triton
X-100, p-nitrofenilpalmitato y carbenicilina se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Steinheim, San Luis, MI,
EE.UU.).
4.2 Cepas bacterianas y su medio de cultivo
Se utilizaron las cepas P. veronii R4, que forma parte del cepario del Laboratorio de
Biotecnología INIA La Platina (Canchignia et al., 2017), y la cepa biocontroladora P. protegens CHA0,
donada por el Dr. Dieter Haas y Dr. Ientse van der Sluis (Keel et al., 1992).
Los medios de cultivos que se emplearon para el crecimiento de estas cepas fueron el caldo de
cultivo Luria Bertani (LB) (Sambrook et al., 1989) que contiene triptona 10 g/l, extracto de levadura 5
g/l y NaCl 5 g/l. Medio LB suplementado con agar-agar al 1,5 % p/v. Medio King's B (King et al. 1954)
que contiene peptona 20 g/L, glicerol 15 mL/L, K2HPO4, 1,5 g/L, MgSO4 x 7H2O 1,5 g/L, pH 7,2. Medio
King’s B suplementado con agar-agar al 1,5 % p/v. King's B modificado que contiene peptona 2 g/L,
glicerol 4 mL/L, K2HPO4 1,5 g/L, MgSO4 x 7H2O 1,5 g/L, pH 7,2. Medio agar gelatina (Smith &
Goodner, 1958) que contiene peptona 4 g/L, extracto levadura 1 g/L, gelatina 12 g/L, agar 15g/L. Medio
agar Spirit blue (Starr, 1941) que contiene agar spirit blue 35 g/L (Sigma-Aldrich) y tributirina 3 mL/L.
Se utilizaron las células quimiocompetentes One Shot Escherichia coli TOP10 (Invitrogen,
Irvine, Ca, EE.UU.) y E. coli BL21(DE3) (New England Biolabs, Ipswich, Ma, EE.UU.). Estas se
crecieron en medio LB.
4.3 Análisis bioinformático del genoma Pseudomonas veronii R4
En el genoma secuenciado, ensamblado y anotado de la cepa R4 (número de acceso GenBank
NZ_JXWQ02000001) se buscaron los genes que codifican para las enzimas que participan en la síntesis
de factores nematicidas (enzimas hidrolíticas extracelulares, enzimas que participan en la síntesis de
fenazina-1-carboxamida, fenazina-1-carboxilato, 2,4-diacetilfloroglucinol y ácido cianhídrico) mediante
análisis de genómica comparativa con cepas del grupo de P. fluorescens, utilizando los servidores de
EMBL Nucleotide Sequence Database (http://www.ebi.ac.uk/embl/) y NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Se empleó la herramienta BLASTP de NCBI
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/), teniendo como restricción que la identidad entre la secuencia
27
aminoacídica modelo y blanco (P. veronii R4) debe ser mayor a 40%, con un 70% de cobertura y mostrar
un número de gaps inferior al 3%. Se identificaron los genes que codifican PKS y NRPS en el genoma
de Pseudomonas veronii R4 empleando la herramienta bioinformática Antismash
(http://antismash.secondarymetabolites.org/) (Weber et al., 2015). Adicionalmente, se identificaron los
genes que codifican enzimas extracelulares en el genoma de la cepa R4 empleando las herramientas
pSORT (http://www.psort.org/psortb/) (Yu et al., 2011) y signal-P
(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) (Bendtsen et al., 2004). Estos servidores permitieron
encontrar en las proteínas predichas los dominios de secreción y péptido señal, respectivamente. Se
realizó una búsqueda de los genes que codifican los sistemas de secreción (I, II, III, IV, V, VI), que
podrían estar participando en la exportación de las enzimas extracelulares y compuestos predichos
bioinformáticamente.
4.4 Ensayo de inducción de la cepa R4 con extracto de X. index
La cepa R4 se creció en medio King's B a 20 °C, 180 rpm por 5 h (inicio de fase exponencial,
turbidez λ600nm = 0,58 ± 0,03). Posteriormente, 500 μL del cultivo se sembró en un pocillo de microplacas
de 24 pocillos (Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria) que contenían una película de 300 μL de agar
phytagel (Sigma-Aldrich) con 0,1 μg/mL de extracto de proteína de nemátodos X. index. Luego se incubó
el microcultivo a 20°C, 150 rpm por 3,5 h. Posteriormente, se realizó la extracción de RNA. Se empleó
como control, cultivos bacterianos expuestos a agar phytagel sin extractos de nemátodos. Los ensayos
control y experimental se realizaron con 3 réplicas técnicas y 3 réplicas biológicas.
4.5 Secuenciación del transcriptoma de la cepa R4
A los microcultivos expuestos a extracto de X. index y control se les realizó la extracción de
RNA mediante el protocolo descrito por Chomczynski & Sacchi (2006). La integridad del RNA se evaluó
mediante la visualización de los rRNA 16S y rRNA 23S a través de electroforesis en gel de agarosa
desnaturalizante y mediante electroforesis capilar, empleando el instrumento Fragment Analyzer
(Advanced Analytical Technologies, Ankeny, IA, EE.UU.) (Aranda et al., 2009). Los RNAs que
presentaron un índice de calidad de RNA (RQN, RNA quality number) > 8, se seleccionaron para el
tratamiento con DNAsa I siguiendo las instrucciones del fabricante (Zymo Research, Irvine, Ca,
EE.UU.). La ausencia de DNA genómico, luego del tratamiento, se determinó mediante amplificación
por PCR del gen rpoB (Case et al., 2000). Se cuantificaron los RNAs y se les realizó la depleción de los
rRNAs mediante el kit Quant-iTTM RiboGreen Assay (Invitrogen) y Ribo-Zero rRNA removal kit
(Epicentre, Madison, WI, EE.UU.), respectivamente, siguiendo las instrucciones del fabricante.
Finalmente, se hicieron las librerias empleando la tecnología Truseq RNA® química V2 (Illumina, Irvine,
28
Ca, EE.UU.). La generación de la biblioteca consistió en cinco pasos: (1) fragmentación del RNAs
mediante la acción de cationes divalentes a 94°C por 6 min (2) transcripción reversa con partidores
aleatorios, que permitieron la síntesis de la primera hebra de cDNA y posterior síntesis de la segunda
hebra de DNA, (3) reparación de los extremos 5´ y 3´, para convertir los extremos cohesivos resultantes
de la fragmentación en corte romos, (4) adenilación de los extremos 3´, (5) ligación de adaptadores y (6)
amplificación por PCR de los fragmentos de DNA que están ligados a los adaptadores. Finalmente, las
librerías que presentaron un tamaño promedio entre 300-450 pbs, fueron programadas para ser
secuenciadas en el secuenciador Miseq (Illumina), siguiendo las instrucciones del fabricante.
4.6 Análisis del transcriptoma
Las lecturas obtenidas del secuenciador Miseq se filtraron de acuerdo a su calidad (Q ≥ 30, es
decir cada base secuenciada presenta 99,9% de exactitud) y tamaño empleando el software Trimmomatic
versión 0.36 (Bolger et al., 2014). Posteriormente, se eliminaron aquellas lecturas que correspondieron
a rRNA y tRNA mediante el software sortmeRNA versión 2.1 (Kopylova et al., 2012). Las lecturas
filtradas se alinearon contra el genoma de P. veronii R4 empleando el software TopHat versión 2.1.0
(Trapnell et al., 2009). El recuento de las lecturas por gen se realizó utilizando el software HTseq versión
0.61 (Anders et al., 2014). La normalización se realizó respecto al largo del gen y a la profundidad de la
secuenciación (transcrito por millón de kilobase, TPM). La expresión diferencial del conteo se llevó a
cabo usando el software estadístico DESeq2 R package (Love et al., 2014). Los genes que presentaron
un log (fold change) > 1 y < -1 y p-value < 0,05 se consideraron diferencialmente expresados respecto a
la condición control. Se clasificaron funcionalmente los genes expresados diferencialmente, empleando
las bases de datos COG (Clusters of Orthologous Group) y KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and
Genomes).
4.7 Evaluación de la secreción de lipasas y proteasa de P. veronii R4
Se creciron las cepas R4 y CHA0 en medio King's B durante 16 h (turbidez λ600 nm ~ 2). Una
alícuota de 10 µL se sembró en medio sólido de gelatina y en agar Spirit blue para evaluar la actividad
proteolítica y lipolítica, respectivamente. Luego de una incubación de 48 h y de 12 h a 25°C en medio
gelatina (Smith & Goodner, 1958) y Spirit blue (Starr, 1941), respectivamente, se evaluó el halo de
degradación alrededor del área de inoculación.
4.8 Detección de actividad enzimática en el sobrenadante de la cepa R4
Se crecieron las cepas R4 y CHA0 en medio King's B modificado suplementado con 1% leche
29
por 72h a 20°C. Posteriormente, se centrifugó a 23.000 x g por 15 min a 4°C. El sobrenadante se colectó,
se filtró a través de filtros de 0,45 µm de tamaño de poro (Millipore, Billerica, Ma, EE.UU.), y se incubó
con tres volúmenes de acetona fría por 1 h a -20°C. Posteriormente, se centrifugó a 23.000 x g por 15
min a 4 °C. El pellet se resuspendió en 1 mL de tampón fosfato de potasio 50 mM (pH 7,4). El extracto
de proteínas se cuantificó a través del método de Bradford et al. (1976) con Coomassie Plus (Bradford)
Assay Kit (PIERCE, Rockford, IlEE.UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante. Veinte
microgramos del extracto se inocularon en placas de agar suplementado con gelatina y tributirina para
evaluar la actividad proteolítica y lipolítica, respectivamente. Los halos de degradación se evaluaron
después de 24 h de incubación a 25°C.
4.9 Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida
Los extractos de proteínas se sometieron a electroforesis en condiciones desnaturalizantes (SDS
-PAGE) utilizando la cámara vertical Mini-Protean System Casting Stand (Bio-Rad, Hercules, Ca,
EE.UU.). Las muestras (20 µg) se mezclaron con tampón de carga 5X (Tris/HCl 60 mM, glicerol 25%
v/v, SDS 2% p/v, y azul de bromofenol 0,1% p/v, pH 6,8), posteriormente se cargaron en geles SDS-
PAGE al 12% de acrilamida:bisacrilamida 29:1 (Laemmli, 1970). Se empleo el marcador de masa
molecular SeeBlue® Plus2 (Thermo Fisher Scientific, Walthmant, Ma, EE.UU.). La electroforesis se
realizó bajo voltaje constante de 90 V durante 3 h con el tampón de corrida Tris-Gli-SDS (Tris 25 mM,
glicina 192 mM y SDS al 0,1% p/v). Posteriormente, el gel se incubó durante 1 hora en solución de
tinción (1 g/L de azul de Coomassie, 45% v/v de metanol, 10% v/v de ácido acético), para luego incubarlo
con solución de destinción (10% v/v de metanol, 10% v/v de ácido acético). Finalmente, el gel se lavó
con agua destilada y se registró fotográficamente.
4.10 Zimografía de la actividad proteolítica
Las proteínas de los geles SDS-PAGE se renaturalizaron por inmersión en una solución de Triton
X-100 0,25% (50 mM Tris-HCl, pH =7,4) por 1 h, realizando recambios de la solución cada 15 min.
Posteriormente, el gel se posó sobre un gel de gelatina al 0,2% (12% poliacrilamida). Se realizó la
electrotransferencia de las proteínas desde el gel de poliacriacrilamida al gel de gelatina a 20 V por 20
min usando la cámara Mini-Protean II Cell (Bio-Rad). Después de la transferencia, el gel de gelatina se
incubó por 12 h en tampón de desarrollo (30 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 0,005 mM ZnCl2, 5 mM
CaCl2 and 0,3 mM NaN3; pH 7.4) a 25°C y se tiñió con azul de Coomassie. La actividad proteasa se
evaluó mediante la visualización de una zona transparente en el fondo azul de la gelatina teñida (Choi et
al., 2009).
30
4.11 Zimografía de la actividad lipasa
El gel de poliacrilamida se renaturalizó mediante incubación con la solución de Triton X-100 al
0,25% por 1 h, realizando recambios de la solución cada 15 min. Posteriormente, se colocó el gel
directamente sobre un gel de tributirina al 2% (12% de acrilamida). La transferencia se realizó por
capilaridad usando el tampón de desarrollo (30 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, and 0.02 % w/v NaN3; pH
7.4) durante 16h a temperature ambiente. La actividad lipasa se evaluó mediante la visualización de una
banda clara en el gel (Choi et al., 2009).
4.12 Identificación de proteínas por análisis de espectrometría de masa
Las bandas de proteínas del sobrenadante del medio de cultivo de la cepa R4 que presentaron
actividad enzimática, se cortaron desde el gel poliacrilamida SDS-PAGE para ser posteriormente lavadas
y desteñidas en una solución de bicarbonato de amonio 200 mM en acetonitrilo 50% v/v. Posteriormente,
las proteínas se proteolizaron con 0,042 µg/µL de tripsina (Promega Corp., Madison, WI, EE.UU.). Los
péptidos generados de la proteólisis fueron extraídos con acetonitrilo 60% v/v y ácido fórmico 0,1% v/v
y se resuspendieron en ácido fórmico 0,1% v/v y metanol 3% v/v. Posteriormente, se mezcló 1 µL de
cada muestra con 1 µL de la matriz ácido α-ciano-4-hidroxicinámico en una placa porta muestra micro
scout (Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA, EE.UU.). La adquisición de espectros de masas se realizó
en un equipo MALDI-TOF Microflex (Bruker Daltonics Inc.) en modo ión positivo mediante detección
por reflexión. Previo a la obtención de los espectros se realizó una calibración del equipo con un estándar
externo correspondiente a una mezcla de péptidos de masas 1000-3000 Da. Para el control del
espectrómetro se utilizó el programa flexControl 3.0 (Bruker Daltonik GmbH). Los espectros finales
correspondieron a la suma de 15 barridos de 30 impactos de láser aplicados en diferentes puntos tomados
al azar de cada muestra depositada en la placa porta muestra. Para el análisis de los espectros se utilizó
el programa flexAnalysis versión 2.2 (Bruker Daltonik GmbH). Para la detección de las señales m/z
monoisotópicas se utilizó el algoritmo SNAP (sophisticated numerical annotation procedure) utilizando
una razón señal/ruido de 6 (SN6). Una vez generadas las listas de señales m/z monoisotópicas se realizó
una calibración interna utilizando las señales producto de la autoproteólisis de la tripsina. Para la
identificación se utilizaron las listas procesadas de señales m/z (intervalo m/z 400-4000) las que se
procesaron en la base de datos en línea Mascot (http://www.matrixscience.com/
cgi/search_form.pl?FORMVER=2&SEARCH=PMF) considerando los siguientes parámetros: base de
datos, NCBI; enzima de proteólisis, tripsina; pérdida de cortes, 1; modificación fija, carbamido
31
metilación (alquilación con yodoacetamida); modificación variable, oxidación de metionina; masa,
monoisotópica; tolerancia de masa, 0,1 Da. Se realizaron búsquedas sin restricción por taxonomía y
acotadas a Proteobacteria. Este análisis se realizó en el Laboratorio de Espectrometría de Masas del
Centro de Estudios para el Desarrollo de la Química (CEPEDEQ) de la Universidad de Chile.
4.13 Extracción de nemátodos para la evaluación de la actividad nematicida
Se extrajeron 400 g de suelo desde una piscina de reproducción de nemátodos X. index diseñada
en el Laboratorio de Biotecnología INIA-La Platina. Las muestras se tamizaron utilizando tamices de
tamaños de poro de 850 µm y 250 µm (Aballay & Insunza, 2002; Meza et al., 2011). Las muestras
obtenidas se filtraron por 24 h a través de género de visillo en agua destilada. Luego de su recolección,
los nemátodos se almacenaron a 4°C en agua destilada en un periodo no mayor a 3 d. Se identificaron
los nemátodos X. index en base a sus características morfológicas (Meza et al., 2011), bajo una lupa
Nikon 10X.
4.14 Evaluación de la actividad nematicida de extractos proteínas
Se expusieron 20 nemátodos X. index a 20 µg de proteínas provenientes del sobrenadante del
cultivo de la cepa R4 crecida en medio King's B suplementado con leche durante 72 h de incubación.
Luego de un periodo de 3 h de incubación de los nemátodos con los extractos de proteínas, se determinó
la pérdida de viabilidad mediante evaluación de la reducción de la movilidad. El tratamiento
experimental y control (expuesto a tampón K2HPO4/KH2PO4, pH 7,5) se realizó en triplicado.
4.15 Construcción de vector de entrada
Los genes que codifican las enzimas extracelulares secretadas por la cepa R4, que fueron
identificadas por secuenciación se clonaron en vectores de entrada (vectores de clonamiento) del sistema
Gateway (Katzen, 2007). Se amplificaron los genes (aprA, lipA y exoU) que codifican estas enzimas
desde 20 ng de DNA genómico empleando los partidores attB1F (5’-AAAAAGCACGGCTNN-3’) y
attB2R (5’-AGAAAGCTGGGTNNN-3’) donde NNN representan los nucleótidos específicos de la
secuencia. Cada reacción de PCR se realizó con: 5 µL 5X KAPA HiFi Fidelity reaction buffer (KAPA
Biosystem, Carlsbad, CA, EE.UU.), 0,75 μL de cada partidor (10 μM cada uno), 0,75 μL
desoxirribonucleótidos trifosfato (10 mM cada dNTP), 0,5 μL KAPAHiFi DNA Polimerasa (2,5 U/μL;
KAPA Biosystem) y 16,25 μL de H2Odd. El perfil térmico de las amplificaciones de los genes consistió
en una desnaturalización inicial a 95 °C por 3 min, seguido de 35 ciclos de amplificación
(desnaturalización a 98°C por 20 s, alineamiento a 60°C por 15 s y una extensión a 72 °C por 45 s) y una
32
extensión final a 72 °C por 5 min. El producto de PCR se utilizó como templado para una segunda
amplificación empleando los partidores attB1F (5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-
3’) y attB2R (5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3’) bajo las mismas condiciones
amplificación previamente descritas. Los resultados de la amplificación se visualizaron por electroforesis
en gel de agarosa al 1% y tinción con bromuro de etidio (Sambrook et al., 1989). La banda
correspondiente al tamaño esperado se cortó y purificó con QIAexII Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden,
Alemania) bajo las instrucciones del fabricante. El fragmento purificado de esta reacción se utilizó para
la recombinación con el vector pDONR207 (Invitrogen). Para ello, se empleó la mezcla de enzimas BP
clonase (Gateway cloning, Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante (Nakagawa et al.,
2009). Posteriormente, cada vector (pDONOR207-aprA, pDONOR207-lipA, pDONOR207-exoU) se
clonó en E. coli Top10 y seleccionaron 10 colonias que crecieron en medio LB con 25 mg/L de
gentamicina. Un set de 10 colonias E. coli TOP10 transformadas con los vectores de interés
(pDONOR207-aprA, pDONOR207-lipA, pDONOR207-exoU) que crecieron en LB gentamicina se
seleccionaron y se les realizó una extracción plasmidial con QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden,
Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los vectores se digirieron con la enzima de
restricción Bsp14071 (Thermo Fisher Scientific), la cual corta los sitios de recombinación attB
permitiendo la liberación de cada uno de los genes de interés. Los vectores que presentaron el patrón de
restricción esperado se secuenciaron (Macrogen, Seúl, Corea).
4.16 Construcción de vector de expresión para E. coli BL21 (DE3)
Para la construcción del vector de expresión, se recombinaron los vectores pDONR207-aprA,
pDONR207-lipA y pDONR207-exoU, respectivamente, con el vector de destino pDEST17 (Invitrogen),
empleando la tecnología Gateway RP clonase mediante las instrucciones del fabricante (Nakagawa et
al., 2009). La estrategia de armado de los vectores se presenta en la Fig. 10. Finalmente, los vectores
revisados por secuenciación se clonaron en E. coli BL21 (DE3) y las células transformadas se
seleccionaron en medio LB con 100 µg/mL de carbenicilina.
4.17 Expresión de proteínas recombinantes en E. coli
Se inocularon células de E. coli BL21 (DE3) transformadas con los vectores pDEST17-aprA,
pDEST17-lipA y pDEST17-exoU, respectivamente, en medio LB con de carbenicilina (100 µg/mL) y se
incubaron a 180 rpm y 37°C por 3 h. Posteriormente, se suplementaron los medios de cultivo con IPTG
0,1 mM para la inducción de los genes que codifican las proteínas recombinantes. Los cultivos se
incubaron durante 3 h y finalmente se centrifugaron a 5000 x g por 3 min. A la biomasa húmeda se le
realizó una extracción de proteínas empleando el reactivo B-PER suplementado con enzimas (Thermo
33
Fisher Scientific) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se obtuvieron dos fracciones, una soluble
en el tampón de lisis y otra insoluble. Esta última se resuspendió en tampón 8 M urea durante 30 min.
Las fracciones de proteínas solubles e insolubles se cuantificaron a través del método de Bradford et al.,
(1976) con Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit (PIERCE). La fracción de proteínas insolubles
resuspendidas en urea 8 M se renaturalizaron mediante diálisis (Rudolph y Lilie, 1996) en tampón Tris
25 mM NaCl, pH 7,5.
Las muestras de los extractos de proteínas (20 µg) de la fracción soluble, insoluble e insoluble
renaturalizada, se sometieron a electroforesis en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) siguiendo
el protocolo previamente descrito en la sección 4.9. Se cortaron las bandas del gel que presentaron las
masas moleculares de las enzimas recombinantes de la fracción insoluble y se secuenciaron e
identificaron mediante análisis de espectrometría de masas siguiendo el protocolo previamente descrito
en la sección 4.12.
Figura 10. Esquema de armado de vectores con las secuencias de los genes aprA, lipA y exoU. Se
realizó reacción de recombinación entre el vector de entrada (pDONR207) y gen de interés (aprA,
lipA y exoU) mediante la mezcla de enzimas BP clonase, que catalizan la recombinación específica entre
los sitios attB que acotan el gen de interés y los sitios de recombinación attP del vector de entrada
(pDONR207). La siguiente reacción de recombinación se llevó a cabo entre el vector de entrada
(pDONR207-aprA, pDONR207-lipA y pDONR207-exoU) y el vector de destino (pDEST17) mediante
la mezcla de enzimas LR clonase. Los vectores, pDONR207 y pDEST17, presentan el gen de
contraselección ccdB, el cual codifica una tóxina que afecta a la girasa provocando la mortalidad de las
células transformadas con el vector sin recombinar. El marcador de selección de pDONR207 y pDEST17
es gentamicina (GnR) y ampicilina o carbenicilina (AmpR), respectivamente.
34
4.18 Evaluación de la actividad enzimática obtenidas de extractos de proteínas totales de
E. coli
Se evaluó la actividad enzimática mediante la inoculación de 10 µg de extracto de proteínas de
los extractos de la fracción soluble e insoluble renaturalizada en agar suplementado con 0,2% de gelatina,
2,0% de tributirina y 5% de sangre bovina, respectivamente (McDade y Weaver, 1959; Shimuta et al.,
2009; Starr, 1941). Los halos de degradación se evaluaron después de 24-48 h de incubación a
temperatura ambiente.
4.19 Evaluación de la actividad proteolítica
Se determinó la actividad proteolítica de los extractos de proteínas de la fracción insoluble
renaturalizada mediante el protocolo descrito por Secades & Guijarro (1999). Se incubaron 22 µg de
extracto de proteínas con 160 µL de azocaseina (3,125% p/v) y 300 µL de tampón (25 mM Tris, Ph 7,4;
5 mM MgCl2) en un volumen de reacción de 500 µL. La mezcla se incubó a 25°C. La reacción se detuvo
mediante la incubación con 600 μL de ácido tricloroacético al 10% (v/v) en hielo, por 5 min.
Posteriormente, la reacción se centrifugó a 15.000 x g por 10 min. Ochocientos microlitros del
sobrenadante se neutralizaron por la adición de 200 μL de NaOH 1,8 N (Secades & Guijarro, 1999). La
absorbancia de la reacción se midió a 420 nm en el espectrofotómetro Biochrom WPA Biowave DNA
(Biochrom Ltd, Cambridge, UK). La digestión en solución de azocaseina libera un grupo cromogénico
soluble en ácido tricloroacético, presentando un color anaranjado rojizo. La intensidad de esta coloración,
se correlaciona con la cantidad de azoproteína digerida (Coelho et al., 2016). En base a esta correlación
se determinó la actividad enzimática del extracto de proteínas enriquecido en AprA.
4.20 Evaluación de la actividad lipolítica en fase acuosa
Se determinó la actividad lipasa de los extractos de proteínas totales de la fracción insoluble en
fase acuosa, mediante el protocolo de Zivkovic et al. (2009) con algunas modificaciones. Se realizó una
solución madre de 3 mg/mL de sustrato p-nitrofenilpalmitato (p-NFP) en isopropanol y una solución
tampón de ensayo que contiene Tris/HCl 20 mM pH 8, Triton X-100 4 mg/mL y goma arábica 1,1
mg/mL. La solución sustrato/tampón se preparó con: 0,875 mL de tampón de ensayo y 0,025 mL de
solución madre de sustrato. Posteriormente, se mezcló la solución sustrato/tampón con la muestra (1 µg)
en una proporción 9:1 y se incubó a 25°C. La actividad enzimática se detuvo mediante la adición de una
mezcla de etanol:acetona (1:1). Finalmente, la reacción se midió espectrofotométricamente a 405 nm en
35
el lector de placas. Se definió como unidad de actividad lipasa (U) como los µmoles de p-nitrofenol
formados por minuto de reacción.
4.21 Evaluación de la actividad fosfolipasa
Se realizó el ensayo de actividad enzimática del extracto de proteínas enriquecido en la
fosfolipasa recombinante empleando el kit EnzChek® Phospholipase A2 Assay (Invitrogen). El
ensayo se llevó a cabo siguiendo las instrucciones el fabricante a 25°C, pH 8,9. La
cuantificación de la actividad del extracto enzimático enriquecido en la fosfolipasa A2 recombinante se
realizó mediante la interpolación de la intensidad de fluorescencia del sustrato hidrolizado en una curva
estándar de calibración de intensidad de fluorescencia de sustrato digerido versus concentración de
enzima (U/mL).
4.22 Evaluación de la actividad nematicida de extractos totales
Se expusieron 20 nemátodos X. index a concentraciones crecientes de extracto de proteínas
totales (50 µg/mL, 100 µg/mL, 500 µg/mL y 1000 µg/mL) provenientes de las fracciones insolubles de
proteínas enriquecidas con las enzimas recombinantes AprA, LipA y ExoU, respectivamente. Luego de
un periodo de 2 h de incubación de los nemátodos a los extractos de proteínas, se determinó la mínima
concentración de extracto de proteína enriquecida en AprA, LipA y ExoU que provocan una pérdida de
movilidad mayor a 90%. Posteriormente, se hicieron mezclas de los extractos enzimáticos de acuerdo a
la concentración nematicidas determinadas. Se realizaron los tratamientos control que consistieron en la
incubación de los nemátodos a extracto de proteínas de E. coli BL21 (DE3) y a tampón de
renaturalización (Tris 50 mM, NaCl 150 mM pH 7,5), respectivamente. Tanto los tratamientos
experimentales y los controles se realizaron en triplicado.
4.23 Microscopía electrónica de barrido (SEM)
Se expusieron 15 nemátodos a la menor concentración de extractos de proteínas de la fracción
insoluble enriquecida con AprA, LipA y ExoU. También se realizaron mezclas de estos extractos.
Después de 2 h de incubación se evaluó daños estructurales de los nemátodos por microscopía electrónica
de barrido. La muestra se fijó en una solución de 0,268 M de cacodilato de sodio 3% de glutaraldehido
(pH 7,0), posteriormente se bañó en oro y se secó a punto crítico sobre una membrana de policarbonato
de 0,22 μm. Las muestras se visualizaron empleando el microscopio electrónico de barrido TM 3000
(Hitachi, Tokio, Japón). Este análisis se realizó en el Laboratorio de Microscopía Electrónica de Barrido
(SEM) de la Pontificia Universidad Católica de Chile.
36
4.24 Análisis estadístico
De acuerdo con el diseño experimental, se realizaron los análisis de varianza ANDEVA basado
en la prueba de F, con un comparador de p-value = 0,05 para determinar el efecto de la exposición de los
nemátodos a los extractos de proteínas recombinantes. Finalmente, se determinaron las diferencias
estadísticas significtivas a través de la prueba de Tuckey HSD, p-value = 0,05.
37
V. Resultados
5.1 Análisis bioinformático de genes que codifican factores nematicidas en el genoma de
P. veronii R4
En base al genoma secuenciado de la cepa R4 se realizó una búsqueda de los genes
o agrupamientos genéticos que codifican enzimas que participan en la síntesis de factores
nematicidas, previamente descritos en Pseudomonas. Adicionalmente, se realizó la búsqueda de
genes que codifican enzimas con señales de secreción, sintetasas de poliquétidos y síntetasa de péptidos
no ribosomales que podrían participar en la síntesis de factores nematicidas no descritos. Mediante este
análisis se predijeron cinco potenciales enzimas con señales de exportación hacia al espacio
extracelular (Tabla 3). De las proteínas predichas, una proteasa y lipasa están codificadas dentro
de un agrupamiento génico junto con un sistema de secreción de tipo I (Fig. 11A). La proteasa
predicha (WP_046383347.1) presenta una identidad de 68% con la metaloproteasa extracelular
AprA (WP_015635227.1) de P. protegens CHA0. El alineamiento de la secuencia aminoacídica de esta
enzima con exoproteasas del grupo P. fluorescens cercanas filogenéticamente con la cepa R4, reveló
dominios y motivos altamente conservados (Fig. S1, Fig. 11B). La secuencia nucleotídica de AprA
codifica en el N-terminal un dominio proteolítico que contiene el motivo canónico HEXXHXXGXXH.
En el C-terminal presenta tres repeticiones en tándem del motivo RTX (repeat in toxin) de unión a Ca2+,
constituido por nueve residuos, GGXGXDXUX (U, residuo hidrofóbico y X corresponde a cualquier
residuo) (Fig. S1, Fig 11B). Se predijo una secuencia anfifílica conservada de 50 residuos en el extremo
C-terminal, que ha sido caracterizada en Pseudomonas por interaccionar con el sistema de secreción de
tipo I para el transporte de esta enzima (Duong et al., 1996) (Fig. S1). El vecindario génico del gen aprA
es altamente conservado en el grupo de P. fluorescens (Fig. 11A). En la región río arriba presenta genes
que codifican una aminopeptidasa (WP_046383346.1), una permeasa de aminoácidos
(WP_046383345.1) y un regulador tipo LuxR (WP_017845709.1). En la región río abajo presenta genes
que codifican un inhibidor de proteasa (WP_017845713.1), un sistema de secreción de tipo I
(WP_046383348.1, WP_046383349.1 y WP_017845716.1) y una lipasa (WP_046383350.1) (Fig. 11A).
Esta última presenta una secuencia aminoacídica predicha que comparte un 75% de identidad con
la lipasa LipA (WP_015635753.1) de Pseudomonas protegens CHA0. Alineamientos de secuencias de
LipA de R4 con enzimas del grupo fluorescens reveló alta identidad con lipasas miembros de la familia
I.3 (Duong et al., 1994; Angkawidjaja, et al., 2007). La lipasa LipA predicha a partir del análisis del
genoma de la cepa R4 contiene en su dominio N-terminal los residuos Ser207, Asp255 y His313, que
componen la triada catalítica y residuos conservados Asp153, Asp157, Gln120, Thr118 y Ser144, que participan
38
en la coordinación de Ca+2. Al igual que Apra, en el dominio carboxilo posee 3 repeticiones del motivo
RTX y una señal de secreción en el C-terminal reconocida por el sistema SST1 (Fig. S2, Fig. 11B).
El análisis del genoma de la cepa R4 reveló la presencia de un gen que codifica una
exofosfolipasa (WP_046381780) que presenta un 47% de identidad con la fosfolipasa ExoU de P.
aeruginosa. ExoU es un efector del sistema de secreción de tipo III (SST3), que provoca citotoxicidad
en células eucariontes (Sato et al, 2003; Phillip et al., 2003). El Análisis de secuencia aminoacídica de
esta enzima con la fosfolipasa ExoU caracterizadas en P. aeruginosa, permitió identificar dominios y
motivos comunes que son relevantes en su actividad catalítica, su secreción y su localización (Figura S3,
Figura 12B). Entre los residuos His61 y Phe315 de la enzima ExoU predicha en R4 se encontró el dominio
fosfolipasa A2 tipo patatina, que posee tres motivos conservados, los cuales son: (i) un “agujero oxianión”
constituido por GGAR, (ii) un motivo hidrolasa, GXSXG y (iii) un motivo aspartato catalítico, DXG.
También presenta conservado C-terminal (desde la A550 hasta la V643), que ha sido descrito por su
participación en la localización de esta enzima en membranas celulares de la célula blanco de
Pseudomonas aeruginosa (Fig. 12A). El vecindario génico de exoU en el genoma de la cepa R4 no
mostró un contexto génico que tuviera una evidente relación funcional con la enzima ExoU (Fig. 12A).
La comparación de éste con Pseudomonas sp. filogenéticamente relacionadas mostró menor grado de
conservación que el de los genes aprA y lipA (Fig. 11A).
Se predijeron otras exoproteasas a partir del análisis del genoma de R4. Estas presentan los
números de acceso GenBank, WP_052735808.1 y WP_052735781.1, respectivamente. Ambas
enzimas predichas presentan hacia el N-terminal el motivo catalítico, HEXXHXXGXX, de unión a Zn
y hacia el C-terminal el motivo de unión a calcio, GGXGXDXUX (Fig. S3). Estos motivos están
presentes en las exoenzimas reconocidas por el sistema de secreción tipo I. Ambas enzimas presentan
identidad (< 40%) con la exoproteasa AprA de Pseudomonas. El análisis del vecindario génico de los
genes que codifican estas enzimas, indica que el contexto génico no está relacionado con la función
proteolítica extracelular de estas enzimas predichas (e.g., sistema de secreción, inhibidor de proteasa)
como se exhibe en el caso de aprA y lipA.
Tabla 3. Proteasas y lipasas extracelulares predichas mediante el análisis bioinformático del
genoma de P. veronii R4
Locus Producto Nº aminoacidos Masa molecular (kDa)
WP_046383347.1 Metaloproteasa alcalina AprA 477 52
WP_052735808.1 Metaloproteasa alcalina 502 55
WP_052735781.1 Metaloproteasa alcalina 424 46
WP_046383350.1 Lipasa LipA 474 52
WP_046381780.1 Fosfolipasa ExoU 643 71
39
Metaloproteasa depediente de Zinc
ZZIIZNzinc
A.
B. Sito activo Motivo RTX Dominio de secreción
1 70 183 193 258 344 385 425 477 FEFDFD _C
1 120 118 137 153 157 207 255 260 313 360 413 474
Figura 11. Vecindario génico de los genes que codifican para las enzimas AprA y LipA y
representación lineal de las secuencias aminoacídicas de estas enzimas. A. Comparación del
vecindario génico de los genes que codifican para Apra y LipA en la cepa R4 con cepas filogeneticamente
relacionadas. B. Representacion lineal de secuencias aminoacidica de las AprA ( ) y LipA ( ).
PeptidasaM_10C
Lipasa 3
Dominio de secreción Residuos de unión a Ca Residuos catalítico
40
A.
B Agujero Motivo Motivo
Oxianión hidrolasa catalítico
1 61 67 70 95 98 239 298 300 315 550 562 578 643
Figura 12. Vencidario génico del gen exoU y representación lineal de la secuencia aminoacídica de
la enzima ExoU. A. Comparación del vecindario génico del gen que codifican a la fosfolipasa ExoU en
la cepa R4 con cepas filogeneticamente relacionadas. B. Representacion lineal de secuencias
aminoacidica de ExoU.
En el análisis del genoma de la cepa R4 se detectaron dos agrupamientos génicos de 53 y 64 kb
de largo, que codifican sintetasas de péptidos no ribosomales (NRPS) que presentan alta identidad
(>80%) con los NRPS que participa en la síntesis del sideróforo pioverdina. Además, se encontró otro
agrupamiento de 52 kb que están involucrados en la síntesis de pioquelina. Ambos siderósforos han sido
descritos en el grupo P. fluorescens y presentan actividad bacteriostática.
Dominio de secreción Dominio tipo Patatina PLA2 Dominio de localización
41
5.2 Evaluación de la expresión diferencial de genes de P. veronii R4 por la interacción con
el nemátodo X. index
Se secuenció y comparó el transcriptoma de P. veronii R4 expuesta a extracto de X. index con
respecto a la condición control (sin exposición) para determinar los genes que son diferencialmente
expresados en esta cepa por la interacción con extracto del nemátodo.
Se obtuvieron de la secuenciación de las bibliotecas de la condición experimental y control, 20,5
y 24,9 millones de lecturas de 150 pb, respectivamente. Después del procesamiento de las lecturas
(eliminación de las lecturas correspondientes a rRNA y de baja calidad) se conservaron 18,9 y 19,6
millones por condición (Tabla S1). El porcentaje de lecturas que se alineó contra el genoma de P. veronii
R4 se detalla en la Tabla S2. La cuantificación y normalización de las lecturas junto con el posterior
análisis de la expresión diferencial mostró la inducción de 38 genes (log2 (fold change) ≥ 1, p-value <
0,05) (Fig. 13, Tabla S3) y la represión de 89 (log2 (fold change) ≤ -1, p-value < 0,05) (Fig. 14 y Tabla
S4). Los genes diferencialmente expresados junto con su clasificación funcional se presentan en la
gráfica de volcano (Fig. 13 y 14). Los genes mayoritariamente inducidos codifican transportadores (47%),
enzimas relacionadas con el metabolismo de aminoácidos (8%) y la síntesis de expolisacáridos (8%)
(Fig. 13). Por otra parte, los genes reprimidos codifican principalmente para enzimas que participan en
el metabolismo de aminoácidos y derivados (12%), adquisición de Fe (12%) y metabolismo redox (12%)
(Fig. 14). A continuación, se detallan los genes de algunos de los subsistemas metabólicos y sistemas de
transporte que mostraron mayor inducción (log2 (fold change) ≥1, p-value < 0,05) y represión (log2 (fold
change) ≤ -1, p-value < 0,05) en P. veronii R4 al interaccionar con extracto de X. index.
Sistema de transporte de tricarboxilatos
Se encontraron inducidos los genes tctA (fig|286.116.peg.3714) y tctB (fig|286.116.peg.3713),
que codifican proteínas de transmembrana de la familia de transportadores periplasmáticos de
tricarboxilatos (TC 2.A.56), junto con el gen que codifica el cotransportador de citrato y Mg+2, CitM
(fig|286.116.peg.14) (Tabla S3).
Sistema de transporte de carbohidratos
Se observó la inducción de un agrupamiento génico de 7,2 kb constituido por el gen que codifica
la maltoporina LamB (fig|286.116.peg.5652) y los componentes IIC (fig|286.116.peg.5654), IIB
(fig|286.116.peg.5656) y IIA (fig|286.116.peg.5655) del sistema fosfotransferasa (PTS) que participan
en el transporte de trehalosa y glucosa (Tabla S3). La maltoporina LamB ha sido descrita como un barril
beta antiparalelo que permite la difusión de maltodextrinas por la membrana externa hacia el espacio
periplasmático. El sistema de transporte PTS participa en el transporte y fosforilación del carbohidrato
42
para impedir su difusión hacia el espacio extracelular y para mantener un gradiente de concentración que
favorece el transporte del azucar hacia el espacio intracelular.
Adicionalmente, se indujo el gen xylG (fig|286.116.peg.2027) que codifica la proteína de
membrana de unión a ATP del sistema de transporte de xilosa de tipo ABC (XylFGH) (Tabla S3).
Sistema de transporte de aminoácidos y derivados
Los genes livF (fig|286.116.peg.5332), livH (fig|286.116.peg.5329) y livM
(fig|286.116.peg.5330), que forman parte del operón livFGHKM, se observaron inducidos en la cepa R4
en presencia del extracto de nemátodos (Tabla S3). El operón livFGHKM codifica un sistema de
transporte de aminoácidos apolares de tipo ABC. Además, se detectó la inducción de los genes gltQ
(fig|286.116.peg.4149) y gltK (fig|286.116.peg.4150), que forman parte del operón gltIKJL que codifica
al sistema de transporte de aminoácidos polares (glutamato/aspartato). Así también, se observó la
inducción del gen gadP (fig|286.116.peg.4932), que codifica la permeasa que participa en el transporte
de γ-aminobutirato (GABA) desde el periplasma hacia el citoplasma.
Sistema de eflujo CZC
Los genes czcA (fig|286.116.peg.4585) y czcB (fig|286.116.peg.4586) se encontraron inducidos
en R4. Estos genes forman parte del agrupamiento genético czcABCD que codifican para una bomba
de eflujo de cationes de la familia RND (Tabla S3). Esta bomba otorga resistencia a Co+2, Zn+2 y Cd+2
mediante la expulsión de estos metales hacia el espacio extracelular e incorporación de protones
hacia el citoplasma (sistema antiporter).
Adquisición y metabolismo de Fe
El gen pchB (fig|286.116.peg.2115) que participa en la síntesis del sideróforo pioquelina,
presentó un nivel de expresión en la cepa R4, al menos, dos veces mayor con respecto a la condición
control. Los otros genes que participan en la síntesis de este sideróforo presentaron una menor inducción
(log2(fold_change) 0,5 ≥ x ≤ 1, p < 0,05). Por otra parte, se reprimieron los genes que codifican el
sideróforo pioverdina, el trasportador periplasmático de alta afinidad a Fe (EfeO) y una permeasa que
permite el tranporte de Fe por la membrana interna (Tabla S3).
Metabolismos de carbohidratos
Los genes, treC (fig|286.116.peg.5653) y UGDH (fig|286.116.peg.2877), que participan en el
metabolismo de carbohidratos presentaron una inducción, al menos dos veces mayor en R4
43
expuesta al extracto de X. index v/s. el control. El gen treC codifica para la trehalosa-6-fosfato
hidrolasa (EC 3.2.1.93) que cataliza la conversión de trehalosa-6P en glucosa y glucosa-6-fosfato. El gen
UGDH codifica UDP-glucosa deshidrogenasa que cataliza la conversión de UDP-glucosa a UDP-
glucuronato. Estos azúcares se emplean en la síntesis de exopolisácaridos (Tabla S3).
Metabolismo de rutas centrales
A pesar de la inducción de transportadores de carbohidratos y aminoácidos, se observó la
represión de las vías de degradación de aminoácidos y de los genes que codifican la maquinaria central
del metabolismo de la cepa R4, tales como las enzimas involucradas en el metabolismo del piruvato, del
ciclo de Krebs y de enzimas que participan en la cadena transportadora de electrones. Adicionalmente,
se reprimieron los genes que participan en la degradación de fuentes de carbono de reserva
(almidón/glicógeno) y de ácidos grasos (Tabla S4).
Síntesis de exopolisacarido
Los genes que participan en la síntesis de exopolisacarido, wzX (fig|286.116.peg.2876) y wzB
(fig|286.116.peg.2879), mostraron una inducción de su expresión de al menos dos veces mayor en R4
expuesta a extracto de X. index con respecto al tratamiento control, mientras que los otros genes, wzXZ
y wzAC presentaron un menor grado de inducción (Tabla S3). La flipasa WzX transporta las unidades
repetidas de polisacárido del citoplasma hacia el periplasma a través de la membrana interna para la
posterior polimerización del polisacarido. La proteína WzB participa en la exportación del polisacárido
hacia el espacio extracelular.
Exoenzimas
El gen que codifica para la fosfolipasa ExoU presentó una leve inducción (Tabla S5). Esta
enzima ha sido descrita por su alta efectividad como factor de virulencia, debido a que pocas moléculas
(300 a 600) son requeridas para provocar muerte celular (Phillips et al., 2003). Estos antecedentes
sugieren que un discreto aumento en el nivel de expresión y síntesis de esta enzima podría tener un efecto
significativo sobre su molécula blanco, que en este caso correspondería a la membrana celular de extracto
de nemátodo.
44
Figura 13. Gráficos que representan los genes inducidos de P. veronii R4 expuesta al extracto de nemátodo. Se presentan los genes inducidos
en el cuadrante izquierdo (log2 (fold change) ≥ 1; p-value < 0,05) y su clasificación funcional en el gráfico de torta.
45
Figura 14. Gráficos que representan los genes reprimidos de P. veronii R4 expuesta al extracto de nemátodo. Se presenta los genes reprimidos
en el cuadrante derecho (log2 (fold change) ≤ -1; p-value < 0,05) y su clasificación funcional en el gráfico de torta
46
.
5.3 Secreción de proteasas y lipasas por la cepa R4
La cepa R4 se creció en agar gelatina (Fig. 15A) y Spirit Blue suplementado con tributirina (Fig.
16A) para evaluar su capacidad de secretar proteasas y lipasas, respectivamente. Después de la
incubación a 25°C durante 24 y 48 h, respectivamente, se detectaron halos de degradación alrededor de
los inóculos en ambos medios de cultivos, demostrándose la capacidad de la cepa R4 de secretar
proteasas y lipasas. Se comparó la actividad enzimática extracelular de la cepa R4 con la cepa P.
protegens CHA0. La cepa R4 presentó un menor halo de degradación de gelatina y un mayor halo de
degradación de tributirina alrededor del área de inoculación, dando cuenta de una menor actividad
proteolítica y mayor actividad lipolítica que la cepa CHA0 (Fig. 15A y 16A). Se evaluó la secreción de
enzimas del extracto de proteínas (20 µg) del sobrenadante de los cultivos de la cepa R4 crecida por 72
h en medio líquido King's B y King's B modificado suplementado con leche al 1%. El extracto proteico
proveniente del sobrenadante del medio de cultivo de la cepa R4 en medio King's B sumplementado con
leche, presentó mayor actividad proteolítica que el extracto obtenido del sobrenadante del cultivo crecido
en King's B (Fig. 15B). En ambos casos la actividad proteolítica del extracto de proteínas del
sobrenadante fue menor en la cepa R4 que en la cepa CHA0 (Fig. 15B). También se evaluó la presencia
de lipasas del sobrenadante de R4 en ambos medios de cultivo, presentando actividad lipolítica solamente
el extracto proveniente del medio King's B suplementado con leche (Fig. 16B). En estas condiciones, la
actividad lipolítica extracelular de cepa R4 fue mayor a la de la cepa CHA0.
Se determinó las masas moleculares de las enzimas secretadas por P. veronii R4 en medio de
cultivo King's B suplementado con leche, mediante ensayos de zimografía. Se detectó la secreción de
una proteasa de 49 kDa (Figura 15C) y de lipasas de 50 kDa y 69 kDa. (Fig. 16C).
5.4 Secuenciación de enzimas detectadas por espectrometría de masas
La identificación de las enzimas secretadas por P. veronii se realizó mediante secuenciación por
espectrometría de masas. El análisis de la huella peptídica de la proteasa de 49 kDa permitió identificar
a la metaloproteasa AprA (WP_046383347.1). La cobertura de los péptidos secuenciados correspondió
a un 14% de la secuencia aminoacídica de la enzima (Fig. 17A). Por otra parte, el análisis de la huella
peptídica de las lipasas de 50 y 69 kDa permitió la identificación de la lipasa LipA (WP_046383350.1)
y ExoU (WP_046381780.1), repectivamente, con una cobertura de 41% y 32% (Figura 17B y 17C). Los
tamaños de las enzimas detectadas experimentalmente fueron consistentes con los tamaños de las
enzimas predichas por análisis bioinformático (Tabla 3).
47
Figura 15. Evaluación de la secreción de proteasas de P. veronii R4. A. Secreción de proteasas en el
medio de cultivo gelatina (1%). Evaluación la secreción de proteasas de la cepa R4 luego de 48 h de
incubación a 25ºC. B. Evaluación de la actividad proteolítica del extracto de proteínas (20 µg) del
sobrenadante del medio de cultivo de la cepa R4 crecida en King's B y King's B suplementado con leche
(+ L). La actividad enzimática sobre el agar gelatina se evaluó a las 48 h de incubación a 25°C. C.
Zimografías del extracto de proteínas del sobrenadante de la cepa R4 crecida en medio King's B
suplementado con leche. Se empleó en los análisis la cepa Pseudomonas protegens CHA0 como control
positivo.
Figura 16. Evaluación de la secreción de lipasas de P. veronii R4. A. Secreción de proteasa en el
medio de cultivo agar gelatina (1%). Evaluación de la secreción de proteasas de la cepa R4 luego de 48
h h de incubación a 25ºC. B. Actividad proteolítica del extracto de proteínas (20 µg) del sobrenadante
del medio de cultivo de la cepa R4 crecida en King's B y King's B suplementado con leche (+ L). La
actividad enzimática sobre el agar tributirina se evaluó a las 24 h de incubación a 25°C. C. Zimografías
del extracto de proteínas del sobrenadante de la cepa R4 crecida en medio King's B suplementado con
leche. Se empleó en los análisis la cepa Pseudomonas protegens CHA0 como control positivo.
48
Figura 17. Secuenciación de exoenzimas de P. veronii R4 mediante MALDI-TOF. Los péptidos secuenciados de las enzimas extraidas del gel
SDS-PAGE y digeridas con tripsina se encuentran destacados en rojo con respecto a la secuencia predicha de AprA (A, WP_046383347.1), LipA
(B, WP_046383350.1) y ExoU (C, WP_046381780.1). Se destacan los dominios, motivos y aminoácidos que participan en la actividad catalítica
(residuos subrayado), secreción (italica), union a calcio (cajas y subrayado punteado) que han sido descritos en enzimas de Pseudomonas spp. A la
derecha de la secuencia se muestra la representación de la estructura lineal de las proteínas con sus respectivos dominios, motivos y aminoácidos de
importancia catalítica y de plegamiento.
49
5.5 Actividad nematicida de las enzimas secretadas por la P. veronii R4
Se expusieron 30 nemátodos X. index a extractos de proteínas (20 µg) que contenía las tres
enzimas. Después de un periodo de 3 h de incubación con el extracto, los nemátodos no presentaron
movimiento al ser estimulados mediante punciones, lo cual indicó su muerte. Análisis mediante
microscopía electrónica, revelaron que estos nemátodos presentaron degradación cuticular,
deshidratación y exposición de los órganos internos (e.g., intestinos) (Fig. 18 B-D). Por el contrario, los
nemátodos expuestos a tampón no presentaron daños estructurales (Fig. 18 A). Estos resultados sugieren
que las enzimas AprA, LipA y ExoU presentes en el extracto de proteínas secretado por P. veronii R4
presentan un efecto nematicida sobre X. index.
Figura 18. Efecto del extracto de proteínas del sobrenadante del cultivo de células de P. veronii R4
sobre los nemátodos X. index. Daños en la cutícula de los nemátodos expuestos a extractos de proteínas
(20 µg) del sobrenadante del medio de cultivo de la cepa R4 crecida en King's B suplementado con leche,
durante 3 h. A. Control, sin exposición al extracto de proteínas. B-F, Nemátodos expuestos a extractos
de proteínas del sobrenadante del medio de cultivo de R4. Se indica con una flecha las zonas en donde
se generó degradación cuticular y exposición de los organos internos y tejidos del nemátodo.
50
5.6 Expresión de enzimas recombinantes en E. coli
Tres clones bacterianos transformados con los vectores de expresión (Fig. S4) para cada uno de
los genes de interés (aprA, lipA, y exoU), se crecieron y sometieron a condiciones de inducción con IPTG
durante 3 h. De estos cultivos inducidos, se obtuvieron extractos de proteínas solubles e insolubles.
Análisis electroforéticos mostraron en la fracción soluble, la presencia de bandas proteicas de 52 kDa,
52 kDa y 69 kDa, respectivamente, que podrían corresponder a las enzimas recombinantes (Fig. 19A).
De forma complementaria, extractos de proteína de la fracción insoluble mostraron mayoritariamente
bandas que corresponderían a estas proteínas (Fig. 19B).
Figura 19. Extractos de proteínas de E. coli BL21(DE3) que presentan las proteínas recombinantes
AprA, LipA y ExoU. Electroforesis de proteínas de la fracción soluble (20 µg) obtenida de la extracción
de proteínas de E. coli BL21(DE3) transformadas con los vectores de expresión y crecidas en medio de
cultivo LB con 100 µg/mL de carbenicilina. Carriles: 1, E. coli BL21(DE3) transformadas con
pDEST17-aprA antes de la incubación con IPTG 1mM (t = 0) y luego de 3 horas (t = 3) de incubación.
2, E. coli BL21(DE3) transformadas con pDEST17-lipA antes de la incubación con IPTG 1mM y luego
de 3 horas de incubación. 3, E. coli BL21(DE3) transformadas con pDEST17-lipA antes de la incubación
con IPTG 1mM y luego de 3 horas de incubación. MM, marcador de masa molecular (3-198 kDa). B.
Electroforesis de proteínas de la fracción insoluble (20 µg) obtenidas de la extracción de proteínas de E.
coli BL21(DE3), transformadas con los vectores de expresión y crecidas en medio de cultivo LB con
100 µg/mL de carbenicilina, e incubadas por 3 h con IPTG 1mM. Carriles: 1, E. coli BL21(DE3)
transformadas con pDEST17-aprA. 2, E. coli BL21(DE3) transformadas con pDEST17-lipA. 3, E. coli
BL21(DE3) transformadas con pDEST17-exoU.
5.7 Secuenciación de las enzimas recombinantes por MALDI-TOF
Las bandas del extracto de proteínas de la fracción insoluble que presentaron el tamaño de las
proteínas recombinantes (Figura 19B) se cortaron y se secuenciaron mediante espectrometría de masas
MALDI-TOF. La huella peptídica obtenida del procesamiento de las señales m/z permitió deterque las
proteínas recombinantes correspondían a AprA (WP_046383347.1), LipA (WP_046383350.1) y ExoU
(WP_046381780.1) de P. veronii R4 (Fig. 20). La cobertura que presentaron los péptidos secuenciados
con respecto a la secuencia aminoacídica de AprA, LipA y ExoU fue de 42%, 26% y 55%,
respectivamente.
51
.
Figura 20. Secuenciación de enzimas recombinantes mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. Se realizó una electroforesis en gel de
poliacrilamida SDS-PAGE del extracto de proteínas la fracción insoluble. Las bandas de proteínas que presentaron la masa molecular de las enzimas
AprA, LipA y ExoU se cortaron, procesaron y secuenciaron. Los péptidos secuenciados de las enzimas se encuentran destacados en rojo con respecto
a la secuencia predicha de AprA (A, WP_046383347.1), LipA (B, WP_046383350.1) y ExoU (C, WP_046381780.1). Se destacan los dominios,
motivos y aminoácidos que participan en la actividad catalítica (residuos subrayados), secreción (itálica), union a calcio (cajas y subrayado punteado)
que han sido descritos en enzimas de Pseudomonas spp. A la derecha de la secuencia se muestra la representación de la estructura lineal de las
proteínas con sus respectivos dominios, motivos y aminoácidos de importancia catalítica y de plegamiento.
52
5.8 Renaturalización de enzimas recombinantes de la fracción insoluble
Para obtener las enzimas Apra, LipA y ExoU funcionales se realizó la renaturalización mediante
diálisis de las fracciones de proteínas solubilizadas en urea 8 M. Luego del proceso de renaturalización,
se observó, mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE, un perfil de expresión similar
para los extractos de proteínas que contenían LipA y ExoU recombinantes. Sin embargo, se observó una
disminución en la concentración de AprA recombinante (Fig. 21).
Figura 21. Extractos de proteína enriquecidas con las enzimas recombinantes de la fracción
insoluble renaturalizada. Electroforesis de proteínas de la fracción insoluble renaturalizada (20 µg)
obtenidas de la extracción de proteínas de E. coli BL21 (DE3), transformadas con los vectores de
expresión (pDEST17-aprA/pDEST17-lipA/ pDEST17-exoU). Carriles: 1, E. coli BL21 (DE3)
transformadas con pDEST17-aprA. 2, E. coli BL21 (DE3) transformadas con pDEST17-lipA. 3, E. coli
BL21 (DE3) transformadas con pDEST17-exoU. MM, marcador de masa molecular (3-198 kDa).
5.9 Evaluación de actividad enzimática en placas con sustrato
Se evaluó y comparó la actividad enzimática de los extractos de proteínas totales de las
fracciones solubles e insolubles mediante ensayos de actividad proteasa, lipasa y fosfolipasa en agar
suplementado con gelatina, tributirina y sangre, respectivamente. Se obtuvo mayor actividad enzimática
en las fracciones insolubles renaturalizadas que estaban enriquecida con AprA y LipA, respectivamente,
que en las fracciones solubles (Fig. 22). En el caso de los extractos de proteínas enriquecidas con ExoU,
se observó similar actividad en ambas fracciones (Fig. 22).
53
Figura 22. Actividad enzimática de los extractos de proteínas enriquecidas con las enzimas
recombinantes AprA, LipA y ExoU. Se inoculó en agar con sustrato (gelatina, tributirina y sangre) 10
µg de extracto de proteínas obtenidas de la fracción soluble e insoluble renaturalizada. La primera fila
indica la enzima (Apra, LipA, ExoU) en la que se encuentra enriquecida cada fracción. La última fila
indica el sustrato que se empleó para determinar la actividad enzimática. La incubación del extracto de
proteínas en el agar con sustrato fue de 48 h a 25°C. Se utilizó como control el extracto de proteínas de
lisado de E. coli BL21(DE3) y tampón Tris (25 mM, pH =7,5) que se utilizó en la renaturalización de la
fracción de proteínas insolubles.
La actividad enzimática del extracto de proteínas enriquecido en AprA de la fracción insoluble
renaturalizada fue de 9,58 U/mg a 25 °C (Fig. S5, Fig. 23A). La actividad lipolítica del extracto de
proteínas enriquecido en LipA se evaluó mediante la cuantificación del p-nitrofenol liberado por la
reacción enzimática sobre el sustrato p-nitrofenilpalmitato. La actividad lipolítica fue de 115 U/mg a
25°C, pH 7,5 (Fig. S6, Fig. 23B). La cuantificación de la actividad del extracto enzimático enriquecido
en ExoU se realizó mediante la interpolación de la intensidad de fluorescencia del sustrato hidrolizado
en una curva estándar de calibración de intensidad de fluorescencia de sustrato digerido v/s concentración
54
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
0 10 20
Ab
sorb
an
cia (
A4
20)
Tiempo (min)
de enzima (25 U/mL) (Fig. S7). El extracto de proteínas insoluble enriquecido en ExoU presentó una
actividad de U/mL a 25°C, pH 7,5.
A. B.
Figura 23. Cuantificación de la actividad enzimática de extractos de la fracción de proteínas
insolubles. A. Medición de la degradación de azocaseina (1% p/v) a 25 °C a pH 7,5, empleando extracto
de la fracción insoluble enriquecido en Apra ( ). B. Determinación de la actividad del extracto de la
fracción insoluble enriquecido LipA (0,001 mg) a 25 °C a pH 7,5, mediante la cuantificación de la
liberación de p-nitrofenol ( )obtenido de la degradación de. p-nirofenilpalmitato. Se empleó el extracto
de proteína de lisado de E. coli BL21 como control en la medición de actividad enzimática ( ).
5.10 Evaluación de la actividad nematicida de las enzimas recombinantes
Debido a que la fracción insoluble mostró mayor concentración de enzimas recombinantes y
también mayor actividad que la fracción soluble, se utilizó esta fracción renaturalizada para la evaluación
del efecto de las enzimas sobre X. index. Se evaluó el efecto nematicida de concentraciones crecientes
de extracto de proteínas (50 µg/mL, 100 µg/mL, 500 µg/mL y 1000 µg/mL) enriquecidas con las enzimas
recombinantes AprA, LipA y ExoU, respectivamente. Se determinó el efecto nematicida mediante la
evaluación de la pérdida de movilidad de los nemátodos expuestos a los extractos durante 2 h a
temperatura ambiente. La concentración mínima de extracto enriquecido en AprA, LipA y ExoU que
produjo un efecto nematicida mayor a 90% fue de 500 µg/mL, 50 µg/mL y 50 µg/mL, respectivamente
(Fig. 24). Posteriormente, se expusieron entre 15 a 20 nemátodos a mezclas de proteínas recombinantes.
Luego de 2 h de incubación se obtuvo el 100% de mortalidad. Se utilizó como control el tratamiento con
tampón de renaturalización (Tris 25 mM, NaCl 100 mM, pH=7,5) y el tratamiento con extracto de
proteínas obtenidos de la extracción de proteínas de E. coli BL21 (DE3). El tampón no presentó efecto
sobre X. index, registrando completa movilidad de los nemátodos hasta el final de la evaluación. El
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 10 20
p-n
itro
fen
ol
(mM
)
Tiempo (min)
55
extracto de proteínas de E. coli BL21(DE3) ejerció un efecto antagonista significativamente menor que
los tratamientos experimentales (Fig. 24).
Mediante análisis de microscopía electrónica de barrido (SEM) se determinaron los daños
estructurales de los nemátodos, por la exposición de estos a los extractos enzimáticos. Los nemátodos
expuestos a los extractos de proteína enriquecida con LipA (Fig. 25D), ExoU (Fig. 25E), LipA:ExoU
(Fig. 25H) y AprA:LipA:ExoU (Fig. 25 I-J), respectivamente, mostraron degradación de la cutícula y
exposición de tejidos de órganos internos, mientras que los nemátodos expuestos a AprA (Fig. 25C),
AprA:LipA (Fig. 25F) y Apra:ExoU (Fig. 25G), junto con los tratamientos control, no presentaron daño
estructural visible (Fig. 25).
Figura 24. Actividad nematicidida de extractos de proteínas de la fracción insoluble renaturalizada
enriquecida con las enzimas recombinantes. Se expusieron 15 a 20 nemátodos X. index a un rango de
concentración de extractos de proteínas recombinantes (50 a 1000 µg/mL). Luego de 2 horas de
incubación a temperatura ambiente se evaluó la movilidad de los nemátodos. La falta de movimiento
después de estimularlos mediante punción fue el criterio para determinar su mortalidad. Se empleó como
control, la incubación de los nemátodos con tampón (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH=7,5) (barra
blanca) y la incubación con 50 µg/mL de extracto de proteínas de lisado de E.coli BL21(DE3) (barra
negra). Se expresan los promedios de los valores ± SD de los tratamientos realizados en triplicados. Los
arteríscos indican que hay diferencias significativas (p-value < 0,05, ANDEVA, Tuckey HSD).
56
57
Figura 25. Efecto de las proteínas recombinantes sobre los nemátodos X. index.
Micrografías representativas de nemátodos X. index expuestos a extractos de enzimas recombinantes
durante 16 h a temperatura ambiente. A. X. index expuesto a extracto de E. coli BL21(DE3) (50 µg/mL).
B, X. index expuesto a tampón (Tris 25 mM, NaCl 100 mM, pH=7,5). C. X. index expuesto a extracto de
proteína enriquecida en AprA (500 µg/mL). D, X. index expuesto a extracto de proteína enriquecida en
LipA (50 µg/mL). E. X. index expuesto a extracto de proteína enriquecida en ExoU (50 µg/mL). F. X.
index expuesto a extracto de proteína enriquecida en Apra: LipA (50 µg/mL:50 µg/mL). G, X. index
expuesto a extracto de proteína enriquecida en AprA:ExoU (50 µg/mL:50 µg/mL). H, X. index expuesto
a extracto de proteína enriquecida en LipA:ExoU (50 µg/mL:50 µg/mL). I, X. index expuesto a extracto
de proteína enriquecida en AprA:LipA:ExoU (500 µg/mL: 50 µg/mL:50 µg/mL). J, X. index expuesto a
extracto de proteína enriquecida en AprA:LipA:ExoU (500 µg/mL 50 µg/mL: 50 µg/mL).
58
VI. Discusión
Pseudomonas veronii R4 es una cepa bacteriana aislada desde la rizósfera de vid de la zona
central de Chile que, previamente, ha sido caracterizada por su actividad antagonista sobre X. index. En
esta Tesis se propone que la actividad nematicida de R4 esta dada por una bateria de enzimas
extracelulares (i.e. proteasa, lipasas y fosfolipasa), siendo este mecanismo diferente al descrito en cepas
nematicidas del grupo P. fluorescens. Para corroborar esta hipótesis, se analizó su genoma y
posteriormente, su transcriptoma en presencia de extracto de nemátodos. Los genes candidatos se
clonaron para evaluar su rol en la actividad nematicida.
6.1 Análisis de los potenciales factores nematicidas codificados en el genoma de la cepa R4
En base al genoma secuenciado de P. veronii R4 se efectuó una búsqueda de los genes que
codifican factores nematicidas descritos en el grupo de P. fluorescens, junto con la búsqueda de enzima
con señales de secreción, sintetasas de poliquétidos y péptidos no ribosomales, que podrían estar
participando en la síntesis de factores nematicidas no descritos. En base a este análisis, se predijeron 5
enzimas extracelulares (Tabla 3). Análisis de la secuencia aminoacídica predicha a partir de los genes
que codifican estas enzimas, permitió encontrar potenciales motivos y dominios que podrían estar
participando en su funcionalidad y mecanismo de secreción hacia el espacio extracelular. Tres de estas
enzimas (WP_046383347.1, WP_052735808.1 y WP_052735781.1) presentaron el motivo catalítico
HEXXHXXGXXH que es característico de las metaloproteasas. Las histidinas (H) de este motivo
coordinan Zn+2, que junto con el ácido glutámico (E) participan en la actividad proteolítica. Las tres
proteasas presentan hacia el C-teminal repeticiones en tándem del motivo RTX, GGXGXDXUX. Este
motivo ha sido descrito por participar en la coordinación de Ca+2, mediante la interacción del grupo
carboxilato del Asp (D) y carbonilo de la Gly (G), facilitando el plegamiento y estabilidad de la proteína
(Zhang et al., 2012). La proteasa WP_046383347.1 posee adicionalmente una secuencia anfifílica de 50
residuos en el extremo C-terminal (Fig. 11, Fig. S1). Esta secuencia ha sido caracterizada en otras
metaloproteasas extracelulares por ser una señal de secreción reconocida por el sistema de secreción de
tipo I (SST1), que permite el transporte de la enzima hacia el espacio extracelular (Duong et al., 1996;
Chenal et al., 2009). La proteasa WP_046383347.1 presenta alta identidad (87%) con la proteasa AprA
de P. protegens CHA0 descrita por su actividad nemáticida sobre Meloidogyne incognita (Siddiqui et
al., 2005). Esta enzima junto a la lipasa LipA están codificadas en el genoma de la cepa R4 dentro
de un agrupamiento génico conservado en las especies bacterianas del grupo P. fluorescens (Fig.
11). Río abajo de aprA se encontró el regulador transcripcional de tipo LuxR. Reguladores de esta
familia juegan un rol clave en señales de quorum sensing, coordinando la expresión de una gran
59
variedad de genes. Adyacente a este gen se encontraron los genes que codifican una permeasa y
peptidasa con señales de destino hacia la membrana interna e intracelular, respectivamente. Río
abajo del gen aprA yace el gen aprI que codifica un inhibidor competitivo de la proteasa Apra
(Bardoel et al., 2012). Este inhibidor podría salvaguardar a la célula de una potencial autolisis.
Adyacenta al gen aprI, están los genes aprDEF, que codifican un sistema de secreción tipo I, que
ha sido descrito en P. fluorescens por su participación en la secreción de AprA y LipA (Duong et
al., 1994; Loper et al., 2012). Junto a aprDEF, se ecuentra el gen lipA. La lipasa (WP_046383350.1)
codificada por este gen presenta la triada catalítica, Ser207, Asp255 y His313, motivos RTX de unión a
calcio y una señal de secreción hacia el C-terminal reconocida por SSTI (Fig. 11 y Fig. S2). A pesar de
que esta enzima ha sido caracterizada en P. fluorescens, no se ha descrito como un factor nematicida o
de virulencia contra células eucariontes.
Mediante análisis de genómica comparativa se encontró el gen que codifica otra exoenzima
(WP_046381780.1) que presentó alta identidad con la fosfolipasa extracelular ExoU de Pseudomonas
aeruginosa UCBPP-PA14. Esta enzima es un efector del sistema de secreción de tipo III que genera una
rápida muerte de células eucariontes. La enzima ExoU de la cepa R4, presentó en su secuencia
aminoacídica los motivos, “agujero oxianión” (GGAR), hidrolasa (GXSXG) y el motivo aspartato
catalítico (DXG) característicos de una fosfolipasa A2 de P. aeruginosa (Fig. 12 y Fig. S3). Además de
estos motivos que forman parte del dominio catalítico, la secuencia predicha presenta otros residuos que
han sido descritos como esenciales en la citotoxidad de ExoU en P. aeruginosa, tales como el residuo
G240 que forma parte del dominio patatina y los residuos que componen el C-terminal desde la Ala562 a
la Arg578. También presenta conservado el C-terminal (desde la A550 hasta la V643), que ha sido estudiado
por su participación en la localización de esta enzima en membranas celulares de la célula blanco de P.
aeruginosa (Fig. 12). Los primeros 60 aminoacidos del N-terminal de ExoU de la cepa R4 no presentan
alta identidad con ExoU de P. aeruginosa (Fig. S3). Esta región ha sido descrita en P. aeruginosa, por
interaccionar con la chaperona SpcU que direcciona la secreción de ExoU por el sistema SST3 (Finck-
Barbançon et al., 1998). Las fosfolipasas predichas en el grupo P. fluorescens, también presentaron en
esta región una baja identidad con ExoU de P. aeruginosa. Sin embargo, mostraron un alto grado de
conservación con el N-terminal de ExoU de R4, junto con aminoácidos característicos del N-terminal de
efectores del SST3 (abundancia de Ser y residuos polares en los extremos N-terminal, solo un residuo
ácido en las primeras 12 posiciones y un aminoácido alifático en la posición 3 o 4) (Fig. 3S).
Concordantemente, Loper et al. (2012) también predijeron en base a análisis de genómica comparativa
la presencia de gen exoU en P. fluorescens SBW25, P. synxantha BG33R, P. fluorescens A506 y P.
fluorescens SS101 que son filogenéticamente cercanas a la cepa R4.
60
El vecindario génico en dirección rio arriba del gen exoU es bastante conservado entre las cepas
del grupo fluorescens que están relacionada filogenéticamente a R4 (Fig. 12). Sin embargo, el grado de
conservación del vecindario génico fue menor rio abajo de este gen. El contexto génico de exoU de P.
aeruginosa, es distinto al del grupo P. fluorescens, presentando transposasas que sugieren la obtención
de los genes por transferencia horizontal (Fig. 12). El vecindario génico del gen exoU a diferencia de
aprA y lipA, no sugiere su función.
Los genes que codifican o participan en la síntesis de los metabolitos secundarios pirrolnitrina,
fenazinas, 2,4-DAPG y ácido cianhídrico no se encontraron en el genoma de R4. No obstante, mediante
análisis bioinformático se detectaron exoenzimas y sistemas de secreción junto con los siderósforos
pioquelina y pioverdina, que han sido descrito por presentar actividad bacteriostática al disminuir el Fe
biodisponible. Consistentemente, Loper et al. (2012) encontrarón que cepas del grupo Pseudomonas
fluorescens presentaban genes que codificaban una batería enzimática extracelular constituidas por
proteasas, quitinasas y fosfolipasas, junto con sistemas de secreción.
6.2 Análisis del transcriptoma de la cepa R4 expuesta a extracto de nemátodos X. index
Para analizar los potenciales genes que podrían estar participando en la interacción de la cepa
R4 con el nemátodo se analizó su transcriptoma luego de 3,5 h de exposición al extracto del nemátodos
X. index. El análisis diferencial de los transcritos mostró la inducción de los determinantes genéticos que
codifican sistemas de transporte de tricarboxilatos, carbohidratos, aminoácidos y sus derivados,
sugiriendo que la cepa R4 sensó el extracto de nemátodos como una fuente adicional de carbono y
nitrógeno, gatillando la inducción de sistemas de transporte de tipo PTS y ABC (Fig. 26).
Paradójicamente, al analizar la expresión génica de las rutas metabólicas, se observó la represión de
genes asociados a las vías catabólicas de aminoácidos (apolares y polares), carbohidratos de reserva
(glicógeno) y ácidos grasos (Fig. 26). Adicionalmente, se observó la represión de genes relacionados con
el metabolismo central (ie. glicólisis, ciclo de Krebs) y la cadena transportadora de electrones (Fig. 27).
Por otra parte, se observó la inducción de genes relacionados con la síntesis de exopolisacáridos,
procesamiento de t-RNAs y de biosíntesis de ácidos grasos (Fig 26). Estos resultados sugieren que los
carbohidratos, glicoproteínas, lípidos y proteínas del exudado y de la matriz estructural de los nemátodos
generaron la represión de genes que codifican para enzimas del metabolismo energético, y la inducción
de genes que codifican para enzimas que participan en la síntesis de polímeros tales como
exopolisacaridos, potenciales ácidos grasos y proteínas. Esta respuesta del transcriptoma de la cepa R4
podría deberse a que los requerimientos energéticos estaban siendo abastecidos por los nutrientes
presentes en el medio de cultivo mientras que la fuente adicional de C y N suministrada por el extracto
de nemátodo se está empleando para las rutas biosintéticas. Análisis complementarios del nivel de la
61
carga energética (AMP, ADP y ATP) y de cAMP, del cultivo celular de R4 en la condición experimental
y control podrían otorgar mayores antecedentes acerca de su estado metabólico y de este modo poder
corroborar esta hipotesis. Una baja concentración de cAMP, dado por la presencia de fuentes de carbono
de rápida degradación, incide en la represión de rutas metabólicas relacionadas con el catabolismo de
carbohidratos (Görke & Stülke, 2008; Rojo, 2010, Altamirano & Illanes, 2011). Por otra parte, una alta
carga metabólica del cultivo celular expuesto al extracto de nemátodo con respecto a la condición control,
sería indicativo de que las enzimas catabólicas están siendo inhibidas, mientras que las enzimas
biosintéticas estarían activadas.
Los genes, aprA y lipA que codifican las exoenzimas, presentaron una leve represión en la cepa
R4 expuesta a extracto de nemátodos. En cepas de P. fluorescens, estos determinantes genéticos forman
parte del operón aprAIDEF-lipA (Kawai et al., 1999; Woods et al., 2001), cuya transcripción está
regulada por la concentración de fierro (McKellar et al., 1986; Woods et al., 2001; Maunsell et al., 2006).
Cuando el nivel intracelular de fierro es alto, el represor transcripcional Fur forma un complejo con Fe
(II) y se une al promotor de los genes aprA y pdvS, reprimiendo la transcripción (Maunsell et al., 2006).
A baja concentración de Fe intracelular, la represión mediada por Fur no se lleva a cabo y su transcripción
es inducida por el factor sigma PdvS (Maunsell et al., 2006). El análisis de la secuencia del promotor del
gen aprA de la cepa R4 evidenció la presencia de secuencias consenso asociadas con la deprivación Fe
(Fig. S8), sugiriendo que la regulación transcripcional de los genes del operón aprAIDEF-lipA, estaría
bajo la regulación de este metal. El factor sigma PdvS de la familia ECF (ECF, extra cytoplasmic
function), también se encuentra reprimido en la cepa R4 expuesto al extracto de nemátodos. PdvS induce
la transcripción de los genes que codifican las sintetasas de péptidos no ribosomales que participan en la
síntesis del sideróforo pioverdina (Ambrosi et al., 2002; Visca et al., 2007). Al analizar la expresión de
los genes relacionados con la adquisición de Fe en el transcriptoma de R4, se observó la represión de
genes relacionados con el transporte de Fe y síntesis de pioverdina. La pioverdina (también llamado
pseudobactina), es un sideróforo fluorescente producido por especies del grupo I del género
Pseudomonas (Ambrosi et al., 2002). Debido a su alta afinidad por el ion férrico, la pioverdina suprime
el crecimiento de fitopatógenos, que carecen de la capacidad de captar complejos de ferri-pioverdinas,
contribuyendo de este modo al biocontrol de fitopatógenos (Ambrosi et al., 2002; Visca et al., 2007). A
pesar de la represión de genes asociados a la síntesis de este sideróforo, los genes que participan en la
síntesis del sideróforo pioquelina se encuentran inducidos en R4 expuesta a X. index. Este sideróforo
presenta una baja solubilidad en agua y su constante de afinidad (Ka 108 M-1 en metanol) (Mislin et al.,
2006) es bastante menor a la de pioverdina (Ka 1032 M-1 en agua) (Braud et al., 2009). Este antecedente
sugiere que el requerimiento de estos siderósforos podría estar diferencialmente regulado en la cepa R4,
de acuerdo, a los niveles intracelulares de Fe.
62
Se observó una leve inducción de la fosfolipasa extracelular ExoU. Esta enzima ha sido
escasamente descrita en P. fluorescens. Sin embargo, ha sido ampliamente estudiada en P. aeruginosa,
por ser un importante factor de virulencia (Sato et al., 2003; Shaver & Hauser, 2004). El análisis de la
expresión del gen exoU en la cepa P. aeruginosa PA99 inoculada en ratones por aspiración intranasal,
mostró un aumento de la expresión transcripcional a las 3 h postinfección (Howell et al., 2013). La
inducción fue significativamente mayor a las 4,5 h postinfección en comparación con el caldo de cultivo
(log (fold change) > 2) (Howell et al., 2013). Este antecedente, sugeriría que un tiempo mayor de
incubación de la cepa R4 con el extracto de nemátodo podría generar una mayor inducción del gen exoU.
La síntesis y secreción de esta enzima favorecería la degradación de tejido de nemátodos, siendo este un
importante factor nematicida. Por otra parte, la inducción de genes relacionados con la síntesis de
exopolisacarido podría actuar como barrera de autoprotección de la membrana celular bacteriana.
Los resultados obtenidos en el análisis del transcriptoma sugieren que los componentes
estructurales del nemátodo X. index son sensados por la cepa R4, provocando la inducción de genes
relacionados con el transporte de nutriente junto con el gen que codifica la fosfolipasa extracelular ExoU.
Estos resultados sugieren que el extracto de nemátodo puede ser utilizado como una fuente de carbono
y nitrógeno para el crecimiento de P. veronii R4, favoreciendo la actividad biocontroladora de esta cepa
sobre X. index.
63
Figura 26. Ilustración del metabolismo de la cepa R4 en base a la expresión diferencial de genes en la condición de exposición con extracto
de nemátodos X. index. Las proteínas codificadas por los genes inducidos (log2 (fold change) ≥ 1, p-value < 0,05) y reprimidos (log2 (fold change)
≤ -1, p-value < 0,05) se destacan en borde verde obscuro y rojo, respectivamente. Las flechas en negro indican la potencial ruta en donde deberían
ser metabolizados los compuestos.
64
6.3 Secreción de enzimas de P. veronii R4 con actividad nematicida
La capacidad de la cepa R4 de secretar enzimas ha sido descrita en el género Pseudomonas,
principalmente en cepas de P. fluorescens caracterizadas por su capacidad de degradar caseína y
descomponer productos lacteos (Rahmohan et al., 2002; Boran & Ugur, 2010; Martins et al., 2015).
Concordantemente, P. veronii R4 presentó una mayor actividad proteolítica y lipolítica en el
sobrenadante al suplementar con leche el medio de cultivo (Fig. 15B y Fig. 16B). Estos resultados
sugieren, que la expresión y secreción de estas enzimas es inducida por la presencia de determinados
nutrientes en su medio de cultivo. La actividad proteolítica extracelular de la cepa R4 fue menor que las
de la cepa P. protegens CHA0 (Fig. 15A). Sin embargo, la cepa de R4 presentó mayor actividad lipolítica
que esta última, mostrando una lipasa adicional de 69 kDa (Fig. 16C). Análisis de espectrometría de
masas permitió identificar las enzimas detectadas por zimografía, las cuales correspondían a AprA
(WP_046383347.1, 49 kDa), LipA (WP_046383350.1, 50 kDa) y ExoU (WP_046381780.1, 68 kDa)
(Fig. 17). Estos resultados fueron concordantes con la predicción bioinformática realizada en base al
genoma de R4 y demuestran la funcionalidad de estas enzimas y de los sistemas de secreción que
permitieron su exportación hacia el espacio extracelular.
La diferencia en la actividad proteolítica y lipolítica extracelular de P. veronii R4 y P. protegens
CHA0 demuestra la diversidad de los potenciales factores biocontroladores secretados por ambas cepas.
En el análisis de genómica compartativa de cepas del grupo P. fluorescens realizado por Loper et al.
(2016), se evalúo la capacidad de secretar enzimas en las cepas, P. protegens Pf-5, P. chlororaphis 30-
84, P. chlororaphis O6, P. fluorescens Pf0-1, P. brassicacearum Q8r1-96, P. brassicacearum Q2-87, P.
fluorescens SBW25, P. synxantha BG33R, P. fluorescens A506 y P. fluorescens SS101. Todas estas
cepas secretaron proteasas y lipasas extracelulares con menor o mayor grado de actividad. Sin embargo,
solamente, P protegens Pf-5, P. fluorescens SBW25 y P. fluorescens SS101 fueron capaces de producir
hemolisis en agar sangre, sugiriendo su capacidad de secretar fosfolipasas, una característica distintiva
entre otras Pseudomonas pertenecientes a este grupo.
El extracto de proteína del sobrenadante del medio de cultivo de R4 provocó la pérdida de
movilidad y degradación cuticular de los nemátodos, sugiriendo que su efecto nematicida está dado por
la actividad catabólica de las enzimas (Fig. 18).
Los genes de las proteínas secretadas por P. veronii R4 se expresaron en un sistema de expresión
bacteriano heterólogo, para determinar su rol en la actividad nematicida de forma individual y en mezclas.
Las fracciones solubles de proteínas obtenidas de los clones bacterianos transformados con los vectores,
pDEST17-aprA, pDEST17-lipA y pDEST17-exoU, mostraron la sobreexpresión de proteínas con las
masas moleculares esperadas para AprA, LipA y ExoU (Fig. 19A). Sin embargo, las fracciones
65
insolubles (Fig. 19B) presentaron una proporción de proteínas recombinantes significativamente mayor.
La mayor cantidad de proteínas recombinantes en la fracción insoluble se puede deber al alto nivel de
expresión generado por la inducción con IPTG de la RNA polimerasa T7. Esto pudo provocar un alto
nivel de síntesis de enzimas recombinantes, favoreciendo la interacción entre las regiones o dominios
hidrófobos de las enzimas (Eiberler y Jungbauer, 2010). Esto conlleva a la agregación de las proteinas
formando cuerpos de inclusión (CI), los cuales han sido descritos por presentar un gran porcentaje de la
proteína de interés (90%) (García et al., 2013). Estos antecedentes, sugieren que los agregados insolubles
de las enzimas recombinantes AprA, LipA y ExoU podrían corresponder a CI, generados por la
agregación del exceso de proteínas recombinantes por efecto de la inducción con IPTG y por las
condiciones del microambiente citosólico de E. coli. Las ventajas de la formación de CI es que las
proteínas recombinantes son protegidas de degradación proteolítica y pueden ser acumulados en el
citoplasma en una mayor proporción que en su forma soluble. El CI resguarda a la célula contra la
toxicidad de la proteína recombinante, ya que no presentan actividad biológica (De Santi et al., 2010;
Singh et al., 2015; Ventura & Villaverde 2006). Estas son ventajas para la expresión de las enzimas
recombinantes AprA, LipA y ExoU cuya sobre expresión en forma soluble podría provocar la citotoxidad
celular por la degradación de la matriz celular rica en proteínas, lípidos y fosfolípidos. La formación de
CI por la expresión heteróloga de la proteasa AprA en E. coli BL21 (DE3) ha sido descrita en el estudio
de Zhang et al., (2012). Los autores evaluaron la importancia del cofactor Ca (II) en el plegamiento y
funcionalidad de la proteasa AprA de P. aeruginosa expresada heterolagemente en E. coli.
Para obtener las enzimas recombinantes funcionales se realizó la renaturalización mediante la
diálisis de las fracciones de proteínas solubilizadas en urea (Fig. 21). Al comparar el perfil de proteínas
previo y posterior a la renaturalización (Fig. 19B y Fig. 21) no se observó degradación de las enzimas
LipA y ExoU. Sin embargo, se observó una disminución significativa de la proteína AprA, sugiriendo la
degradación de esta enzima durante el proceso de renaturalización. Estudios de la actividad catalítica de
AprA en P. aeruginosa indican que esta enzima degrada un amplio rango de sustratos y que no presentan
una clara especificidad por cierto tipo de aminoácidos en el sitio de corte (Louis et al., 1998; Louis et
al., 1999). Estos antecedentes sugieren que AprA puede ser susceptible a la autodegradación.
Los extractos de proteínas totales de las fracciones insolubles renaturalizada y enriquecidas con
las enzimas recombinantes Apra y LipA presentaron una mayor actividad enzimática sobre los sustratos
gelatina y tributirina, respectivamente (Fig. 22). Esto sugiere que la fracción insoluble presentó una
mayor cantidad de enzima activa que la fracción soluble y demostró que el proceso de renaturalización
generó una conformación tridimensional activa de las proteínas. Por otra parte, las fracciones solubles e
insolubles de ExoU recombinantes presentaron similar actividad (Fig. 22), a pesar de la significativa
66
menor cantidad de ExoU en la primera fracción con respecto a la segunda. Esta diferencia pudo deberse,
por ejemplo, a que la renaturalización de las enzimas no generó la suficiente cantidad de enzima activa.
Análisis de actividad enzimática de las fracciones insolubles renaturalizadas mostró una alta
actividad lipasa (115 U/mg) y una discreta y baja actividad fosfolipasa (25 U/ml) y proteasa (9,58 U/mg),
respectivamente (Fig. 23).
La cutícula de los nemátodos está constituida por una capa externa lipídica de 100 Å, y por una
matriz compuesta por proteínas similares a la queratina y colágenos, junto con proteínas fibrilares de
tipo elastina y fibrina que son susceptibles a la degradación por enzimas hidrolíticas (Davies & Curtis,
2011). Al interior se encuentran la hipodermis constituida por grasa y glicógenos y el tejido muscular.
Enzimas secretadas por bacterias del género Pseudomonas y Bacillus han sido caracterizadas por su
capacidad de degradar componentes estructurales de la cutícula de nemátodos (proteínas, quitina y
lípidos), permitiendo la penetración y colonización de bacterias en los tejidos internos de éstos (Tian et
al., 2007; Yang et al., 2013). En base a estos antecedentes, se evaluó mediante criterios de pérdida de
movilidad y daños estructurales la actividad nematicida de las enzimas recombinantes proveniente de las
fracciones insolubles renaturalizadas. Se requirió una concentración 10 veces mayor de extracto de
proteínas enriquecida en AprA (500 µg/mL) que de las otras lipasas (50 µg/mL de LipA y 50 µg/mL de
ExoU) para lograr la pérdida de movilidad después de 2 h de incubación (Fig. 24). La menor actividad
nematicida de AprA se podría deber a la menor cantidad de esta enzima en el extracto de proteínas debido
a su autodegradación. Consistentemente, con los resultados de los extractos de enzimas individuales, las
mezclas de enzimas mostraron igual o mayor efecto nematicida a las 2 horas de incubación. El extracto
de proteínas totales de E. coli BL21(DE3) empleado como control ejerció un efecto antagonista
significativamente menor sobre X. index (33%) que los extractos enzimáticos.
Análisis de microscopía electrónica de barrido mostraron los daños estructurales sobre la cutícula,
deshidratación y exposición de tejidos internos de los nemátodos X. index expuestos a los extractos
enriquecidos con las enzimas LipA (Fig. 25D) y ExoU (Fig. 25E) respectivamente, y por las mezclas de
enzimas, LipA-ExoU (Fig. 25H) y LipA-ExoU-AprA (Fig. 25I y Fig. 25J). En las micrografías no se
evidenciaron daños estructurales de la cutícula en los nemátodos expuestos a AprA (Fig. 25C), LipA-
AprA (Fig. 25F) y ExoU-AprA (Fig. 25G). Esto se podría deber a la menor cantidad de enzima AprA
presente en los extractos por consecuencia de su autolisis y a la degradación que podría estar ejerciendo
sobre las lipasas. La metaloproteasa AprA secretada por P. protegens CHA0 ha sido descrita por su
actividad nematicida en contra M. incognita. La deleción del gen aprA en la cepa CHA0 mostró una
significativa reducción de su actividad biocontroladora contra M. incognita, demostrando que la
actividad protolítica es un importante factor nematicida para esta cepa (Siddiqui et al., 2005). También,
P. putida 1A00316, que se aisló en la Antártica, demostró una alta eficiencia nematicida sobre M.
67
incognita en ensayos in vitro y de invernadero (Guo et al, 2016). Análisis del genoma permitieron
determinar que esta cepa presenta la proteasa AprA y el sistema de secreción que permite su exportación.
Análisis experimentales demostraron que este sistema es funcional y que podría estar participando junto
con otros dos metabolitos secundarios (ácido cianhídrico y ciclo-(I-isoleucil-I-prolina) en la actividad
nematicida (Guo et al., 2016). Enzimas hidrolíticas producidas por bacterias Gram positivas han sido
descritas por participar en la degradación de componentes estructurales de los nemátodos. Las serin
proteasas alcalinas secretadas por Brevibacillus laterosporus G4 (30 kDa) y Serratia A88copa13 (70
kDa) presentan actividad nematicida contra el fitopatógeno Bursaphelenchus xylophilus y el nemátodo
de vida libre Panagrellus redivivus (Huang et al., 2005; Paiva et al., 2013). El estudio de Gen et al.,
(2016) determinó que la cepa Bacillus firmus DS-1 comercializada por su actividad nematicida, secreta
una serin proteasa llamada Sep1 que demostró alta toxicidad contra el nemátodo fitopatógeno M.
incognita. Ensayos de exposición de Sep1 a nemátodos M. incognita mostraron la degradación de tejidos
intestinales de los nemátodos y una discreta degradación de la cutícula. La concentración de enzima que
ejerció actividad nematicida significativa fue de 500 µg/mL, la misma concentración de enzima que
mostró efecto nematicida en los ensayos realizado en esta tesis. Estas proteasas no fueron el único factor
nematicida que secretan estas bacterias, pero demostraron ser importantes factores de virulencia, debido
a que los microdaños producidos por las enzimas en la cutícula del nemátodo hacen que sean susceptible
a otros metabolitos tóxicos secretados por la misma bacteria u otros microorganismos, generando un
efecto sinérgico entre los distintos mecanismos nematicidas.
Por otra parte, la actividad lipolítica como factor biocontrolador de nemátodos ha sido
escasamente descrita. El estudio de Paiva et al., (2013) determinó la presencia de lipasas en exudados
de cepas de P. lutea y P. putida que colonizan nemátodos y presentan actividad nematicida sobre B.
xylophilus. Catañeda-Álvarez et al., (2016) establecieron que las cepas que presentaron mayor actividad
nematicida en contra Xiphinemas index fueron aquellas que secretaron adicionalmente lipasas además
de proteasas y ácido sulfhídrico. El rol de la fosfolipasa ExoU sobre la actividad biocontroladora de
fitopatógenos no ha sido estudiado, a pesar de que esta enzima esta codificada en el genoma de cepas
de P. fluorescens que son comercializadas por su actividad biocontroladora y promotora del crecimiento
(e.g. P. fluorescens SBW25) (Loper et al., 2012). ExoU ha sido ampliamente caracterizada en P.
aeruginosa por ser un factor de virulencia. Esta enzima es una proteína efectora del sistema de secreción
tipo III y provoca daños en la membrana de diferentes organelos y fragmentación vacuolar en levadura
(Sato & Frank, 2004). En células de mamíferos provoca daños irreversibles en la membrana
citoplasmática y una rápida necrosis celular (Banerji & Flieger et al., 2004; Bleves et al., 2010; Feltman
et al., 2001). Además, se ha determinado que se requieren de 300 a 600 moléculas/ células de ovario de
hámster chino (Chinese hamster ovary, CHO) para provocar citoxicidad (Phillips et al., 2003; Rabin et
68
al., 2006). Estos antecedentes indican que una baja concentración de esta enzima podría provocar
importantes daños en la membrana celular del nemátodo. Concordantemente, la exposición a ExoU
generó los mayores daños estructurales (Fig 25E) en comparación con la incubación con las otras
enzimas (Fig. 25C y 25D). Los resultados presentados indican que la actividad proteolítica de AprA y
lipolítica de las enzimas LipA y ExoU tienen un rol relevante en la actividad biocontroladora de P.
veronii R4.
En la actualidad se comercializa en Chile, el biopesticida 3Tac, de Avance Biotechnologies Chile
S.A, un fungicida de amplio espectro, que está formulado en base a quitinasas, xylanasas, peptidasas y
glucanasas extraídas y estabilizadas desde tres especies de Trichoderma spp. La comercialización de
este producto sienta precedente del empleo de enzimas como biopesticidas en Chile.
69
VII. Conclusiones
1. El genoma de P. veronii R4 contiene genes que codifican enzimas extracelulares como la
proteasa AprA, la lipasa LipA y la fosfolipasa ExoU y sistemas de secreción, que participarían
en la exportación de estas enzimas para cumplir su rol nematicida. Estos factores nematicidas
son altamente conservados en cepas filogenéticamente cercanas a la cepa R4.
2. El análisis del transcriptoma permitió determinar que P. veronii R4 es capaz de sensar las
proteínas y azúcares del extracto de X. index como fuente de C y N, induciendo los genes
relacionados con su transporte y metabolismo. Se observó la inducción del gen que codifica la
fosfolipasa extracelular ExoU, que podría participar en la degradación de la matriz celular del
nematodo X. index.
3. El análisis del sobrenadante del medio de cultivo de la cepa R4 permitió determinar la secreción
de la proteasa AprA, la lipasa LipA y la fosfolipasa ExoU. La expresión heteróloga de los genes
que codifican estas enzimas permitió la obtención de enzimas funcionales de P. veronii R4 con
actividad nematicida, confirmando el rol de éstas en la actividad biocontroladora sobre X. index.
4. Uno de los mecanismos empleados por la cepa R4 para ejercer su actividad nematicida estaría
dado por la secreción de enzimas hidrolíticas extracelulares. Las lipasas ExoU y LipA son
factores nematicidas relevantes que no habían sido descritos en en género Pseudomonas.
70
VIII. Proyecciones
El análisis de transcriptoma de la cepa R4 en interacción con el extracto de X. index debería ser
validado cuantitativamente, mediante RT-qPCR y ser complementado con análisis proteómico para
comprender mejor como sensa la cepa R4 la presencia de X. index.
La caracterización bioquímica de las enzimas recombinantes (e.g., temperatura y pH óptimo de
actividad e inhibidores) permitirá optimizar sus actividades y sus potenciales aplicaciones
biotecnológicas.
Evaluar la actividad nematicida de las enzimas sobre otros nemátodos fitopatógenos tales como
Meloidogyne spp., Pratylenchus spp. y X. americanum.
En base a la actividad nematicida que presentan las enzimas AprA, LipA y ExoU se podría
formular un biopesticida en base a las enzimas o la cepa R4 para el control del nemátodo X. index.
71
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80
X. Anexo
81
82
Figura S1. Secuencia aminoácidica de la metaloproteasa AprA predicha de P. veronii R4 y su
alineamiento con secuencias del grupo de Pseudomonas fluorescens cercanas filogeneticamente.
En salmon se destaca el dominio proteolítico, en rosado los motivos de unión a calcio y en verde los
aminoácidos consevados del dominio de secreción.
83
84
Figura S2. Secuencia aminoácidica de la metaloproteasa LipA predicha de P. veronii R4 y su
alineamiento con secuencias del grupo de Pseudomonas fluorescens cercanas filogeneticamente.
En salmon se destaca el dominio proteolítico, en rosado los motivos de unión a calcio y en verde los
aminoácidos consevados del dominio de secreción.
85
86
Figura S3. Secuencia aminoácidica de la exofosfolipasa ExoU predicha a partir del genoma de P.
veronii R4 y su alineamiento con secuencias del grupo de Pseudomonas fluorescens cercanas
filogeneticamente. En salmon se destacadominios cataliticos, en plomo se destaca residuos
conservados en el dominio de localización.
87
Tabla S1. Lecturas obtenidas luego de aplicar filtro de calidad y de rRNA
Libreria N° total de
lecturas
N° de lecturas obtenidas
luego de aplicar filtro
calidad
N° de lecturas luego de
eliminar rRNA (23S y 16S) % de lecturas
utilizados
Pares simple Pares simple
Control R1 9514822 9514822 0 6649762 0 70
Control R2 6428606 6428606 0 4140612 0 64
Control R3 8983376 8983376 0 8778222 0 98
Experimental R1 6500614 5987744 225301 5948158 223999 92
Experimental R2 8051772 7542464 222386 7489962 221323 93
Experimental R3 5964760 5536762 188179 5447120 185840 91
Tabla S2. Lecturas mapeadas en el genoma de P. veronii R4
Librería Lectura Lectura mapeadas % Lectura mapeadas
Izquieda Derecha Izquieda Derecha Izquieda Derecha
Control 1 3324881 3324881 3161791 1928133 95,1 58,0
Control 2 2070306 2070306 1957426 1185721 94,5 57,3
Control 3 4389111 4389111 4176307 2692925 95,2 61,4
Inducido 1 2974079 2974079 2906942 2621023 97,7 88,1
Inducido 2 3744981 3744981 3655081 3248954 97,6 86,8
Inducido 3 2723560 2723560 2657786 2408061 97,6 88,4
88
Tabla S3. Genes inducidos en P. veronii R4 expuestos a extracto de nemátodos X. index (log2 (fold change) ≥ 1, p-value < 0,05)
ID Producto del gen Subclasificación log2(fold change) p-value
Transporte
fig|286.116.peg.14 Transportador de citrato Transportadores de tricarboxilatos 1,76 3,24E-12
fig|286.116.peg.3713 Transportador de tricarboxilato, TctB Transportadores de tricarboxilatos 1,15 8,65E-05
fig|286.116.peg.3714 Transportador de tricarboxilato, TctA Transportadores de tricarboxilatos 1,39 1,29E-07
fig|286.116.peg.2027 Proteina de unión a ATP transportadora de D-xilosa, XylG Transporte de carbohidratoss 1,05 4,99E-05
fig|286.116.peg.4085 Transportador de azucares Transportadores de carbohidratos 1,13 7,87E-07
fig|286.116.peg.5654 Maltoporina Transportadores de carbohidratos 1,47 1,73E-12
fig|286.116.peg.5652 Sistema PTS específico para la trehalosa, componente IIB
(EC 2.7.1.69) Transportadores de carbohidratos 1,21 6,94E-07
fig|286.116.peg.5655 Sistema PTS para la glucosa, componente IIA específico EC
2.7.1.69) Transportadores de carbohidratos 1,08 1,19E-07
fig|286.116.peg.5656 Sistema PTS para la glucosa, componente IIB específico Transportadores de carbohidratos 1,21 1,80E-07
fig|286.116.peg.4149 Componente ATPasa de sistema de tranporte de tipo ABC de
aminoácidos polares
Transportadores de aminoacidos y
derivados 1,16 4,39E-10
fig|286.116.peg.4150 Sistema de transporte de glutamato aspartato, GltK
(TC 3.A.1.3.4)
Transportadores de aminoacidos y
derivados 1,02 2,02E-05
fig|286.116.peg.4932 Permeasa de gamma-aminobutirato
Transportadores de aminoacidos y
derivados 1,03 3,67E-08
fig|286.116.peg.5329 Sistema de transporte de aminoácidos ramificados, LivH
(TC 3.A.1.4.1)
Transportadores de aminoacidos y
derivados 1,36 1,19E-08
fig|286.116.peg.5330 Sistema de transporte de aminoácidos ramificados, LivM
(TC 3.A.1.4.1)
Transportadores de aminoacidos y
derivados 1,18 1,83E-06
fig|286.116.peg.5332 Sistema de transporte de aminoácidos ramificados, LivF
(TC 3.A.1.4.1)
Transportadores de aminoacidos y
derivados 1,11 6,20E-05
fig|286.116.peg.4582 Porina de membrana externa, familia OprD Transporte 2,01 2,16E-12
fig|286.116.peg.4585 Proteina de resistencia del sistema de eflujo cadmio-zinc-
cobalto, CzcA Cobalt-zinc-cadmium resistance 1,22 7,10E-06
89
Tabla S3. Continuación
ID Producto del gen Subclasificación log2(fold change) p-value
fig|286.116.peg.4586 Proteina sistema de eflujo cobalto/zinc/cadmium, CzcB Cobalt-zinc-cadmium resistance 1,52 1,08E-05
Metabolismo de aminoácido y derivados
fig|286.116.peg.2115 Isocorismato piruvato-liasa (EC 4.-.-.-) Síntesis de triptofano 1,03 1,01E-04
fig|286.116.peg.5326 Shikimato 5-deshidrogenasa I alfa (EC 1.1.1.25) Síntesis de triptofano 1,27 9,22E-08
fig|286.116.peg.5328 Proteina de unión a Leucina-, isoleucina-, valina-, threonina-,
y alanina Complejo deshidrogenasa 1,30 4,89E-07
Metabolismo de carbohidratos
fig|286.116.peg.5653 Trehalosa-6-fosfato hidrolasa (EC 3.2.1.93) Metabolismo de carbohidratos 1,22 4,11E-12
fig|286.116.peg.2877 UDP-glucosa dehidrogenasa (EC 1.1.1.22) Metabolismo de carbohidratos 1,17 2,21E-10
Metabolismo de nitrógeno
fig|286.116.peg.3715 Ammonio monooxygenasa
Transportadores de azucares y
derivados 1,10 9,87E-06
Metabolismo de ácidos grasos
fig|286.116.peg.5325 Reductasa 3-oxoacil-[acil-proteina carrier] (EC 1.1.1.100)
Biosíntesis de acidos grasos
FASII 1,26 6,88E-08
fig|286.116.peg.4083 Oxidoreductasa, cadena corta deshidrogenasa/reductasa
Biosíntesis de acidos grasos
FASII 1,09 4,93E-06
fig|286.116.peg.4084 Oxidoreductasa, cadena corta deshidrogenasa/reductasa
Biosíntesis de acidos grasos
FASII 1,10 1,30E-05
Procesamiento del t-RNA
fig|286.116.peg.5680 tRNA (Guanine37-N1) -methyltransferasa (EC 2.1.1.31) RNA methylation 1,04 1,20E-07
Síntesis de exopolisacarido
fig|286.116.peg.4086 Deacetilasa de polisacaridos Biosíntesis de exopolisacarido 1,16 1,48E-08
fig|286.116.peg.2876 Flipasa Wzx Biosíntesis de exopolisacarido 1,20 4,78E-08
fig|286.116.peg.2879 Fosfatasa Wzb (EC 3.1.3.48) Biosíntesis de polisacaridos 1,01 7,67E-06
Respuesta a estrés
fig|286.116.peg.3847 Proteina de shock frío CspA 1,05 1,05E-05
fig|286.116.peg.4623 Chaperona Homeostasis del cobre 1,44 1,09E-08
90
Tabla S3. Continuación
ID Producto del gen Subclasificación log2 (fold change) p-value
Biosíntesis de flagelo
fig|286.116.peg.5570 Proteina de biosíntesis flagelar, FliT Flagelo 1,75 2,33E-09
fig|286.116.peg.5582 Proteina de motor flagelar, FliM Flagelo 1,04 3,21E-03
Proteinas hipotéticas
fig|286.116.peg.2126 Proteina hipotética #N/A 1,02 4,16E-04
fig|286.116.peg.2617 Proteina hipotética #N/A 1,03 3,93E-06
fig|286.116.peg.4111 Proteina hipotética #N/A 1,07 4,79E-07
Tabla S4. Genes reprimidos en P. veronii R4 expuestos a extracto de nemátodos X. index (log2 (fold change) ≤ -1, p-value < 0,05)
ID Producto del gen Subclasificación log2 (fold change) p-value
Metabolismo de aminoacidos y derivados
fig|286.116.peg.1892 Oxidasa gamma-glutamil-putrescina (EC1.4.3.-), PuuB Vía de catabolismo de putrecina -1,12 8,79E-06
fig|286.116.peg.331 Agmatinasa (EC 3.5.3.11) Metabolismo poliaminas -1,32 1,25E-07
fig|286.116.peg.5470 Dehidrogenasa metilmalonate-semialdehido (EC 1.2.1.27) Degradación de valina -1,04 7,63E-06
fig|286.116.peg.5471 Deshidrogenasa-3-hydroxyisobutyrato (EC 1.1.1.31) Degradación de valina -1,13 3,68E-06
fig|286.116.peg.5803 Carbamato kinasa (EC 2.7.2.2) Metabolismo poliaminas -1,42 1,85E-08
fig|286.116.peg.5804 Ornithina carbamoiltransferasa (EC 2.1.3.3) Degradación de arginina y ornitina -1,24 1,62E-07
fig|286.116.peg.5805 Arginina deiminasa (EC 3.5.3.6) Degradación de arginina y ornitina -1,08 2,15E-06
fig|286.116.peg.611 Subunidad larga 3-isopropilmalato dehydratasa
(EC 4.2.1.33)
Biosíntesis de Aminoácidos de
Cadena Ramificada -1,51 7,91E-18
fig|286.116.peg.612 Subunidad pequeña 3-isopropylmalato dehydratasa
(EC 4.2.1.33)
Biosíntesis de Aminoácidos de
Cadena Ramificada -1,35 3,05E-09
fig|286.116.peg.2900 Amidohidrolasa Degradación de aminoácidos y
derivados -1,20 1,77E-05
fig|286.116.peg.1863 Metionil-tRNA ligasa tRNA aminoacylation, Met -1,79 1,98E-12
91
Tabla S4. Continuación
ID Producto del gen Subclasificación log2 (fold change) p-value
Metabolismo de Carbohidratos
fig|286.116.peg.1898 Dihidrolipoamida deshidrogenasa del complejo piruvato
dehidrogenasa (EC 1.8.1.4)
Metabolismo piruvato, formación
acetyl-CoA -1,31 3,45E-05
fig|286.116.peg.219 Deshidratasa 2-metilcitrato (EC 4.2.1.79) Ciclo metilcitrato -1,03 0,00021462
fig|286.116.peg.2396 Glicogeno sintasa, ADP-glucosa transglucosilasa (EC
2.4.1.21) Metabolismo glicogeno -1,35 2,32E-10
fig|286.116.peg.2399 4-alfa-gluconotransferasa (amilomaltasa) (EC 2.4.1.25)
Catabolismo maltosa y
maltodextrina -1,32 1,67E-08
fig|286.116.peg.2402 Catabolismo de glicogeno (EC 3.2.1.-) Biosíntesis de trehalosa -1,59 3,99E-10
fig|286.116.peg.2626 Aldolasa clase II fructosa-bisfosfato (EC 4.1.2.13) Glicolisis y Gluconeogenesis -1,44 6,80E-10
fig|286.116.peg.2739 2,3-butanodiol dehidrogenasa (EC 1.1.1.76)
Metabolismo de acetoina y
butanediol -1,13 1,27E-05
fig|286.116.peg.3625 Aconitato hidratasa (EC 4.2.1.3) Ciclo de Krebs -1,02 4,57E-06
fig|286.116.peg.4271 Clase II fumarato hidratasa (EC 4.2.1.2) Ciclo de Krebs 1,77 4,85E-14
fig|286.116.peg.1897 Dihidrolipoamida deshidrogenasa del complejo piruvato
dehidrogenasa (EC 2.3.1.12)
Metabolismo piruvato, formación
acetyl-CoA -1,31 2,69E-05
Metabolismo de nucleotidos
fig|286.116.peg.1212 Deshidrogenasa dihidropirimidina [NADP+] (EC 1.3.1.2) Catabolismo de pirimidina -1,38 7,03E-07
fig|286.116.peg.1213 Pyridine nucleotide-disulphide oxidoreductase associated
with reductive pyrimidine catabolism Catabolismo de pirimidina -1,31 1,95E-06
fig|286.116.peg.1218 Beta-ureidopropionasa (EC 3.5.1.6) Catabolismo de pirimidina -1,10 4,97E-06
Metabolismo de ácidos grasos, lípidos e isoprenoides
fig|286.116.peg.2403 Deshidrogenasa/oxidasa Acil-CoA Catabolismo de los acidos grasos -1,28 4,23E-05
fig|286.116.peg.1 L-carnitina deshidratasa Metabolismos lipidos -1,25 2,24E-06
fig|286.116.peg.2596 Proteina hemolisina de membrana, HylD -1,28 0,0002652
Metabolismo de los aromaticos
fig|286.116.peg.1506 arilesterasa (EC 3.8.1.5) -1,10 6,17E-05
92
Tabla S4. Continuación
ID Producto del gen Subclasificación log2 (fold change) p-value
fig|286.116.peg.2667 Hidrolasa Beta-ketodipato enol-lactona (EC 3.1.1.24) Vía de degradación de
cloroamáticos -1,01 8,96E-05
Metabolismo y adquisición de fierro
fig|286.116.peg.808 L-ornitina-5-monoxigensa (EC 1.13.12.-), PvdA Biosintesis de pioverdina -1,12 0,00021901
fig|286.116.peg.1601 Permeasa de fierro de alta afinidad Transporte de fierro -1,44 3,32E-09
fig|286.116.peg.1840 Proteina de transporte de fierro periplasmático EfeO Transporte de fierro -1,29 1,55E-08
fig|286.116.peg.2768 Sintetasa de pioverdina, PvdF Biosintesis de pioverdina -1,02 0,0034483
fig|286.116.peg.2770 Receptor de membrana externa de ferripioverdina, FpvA Biosintesis de pioverdina -1,72 1,05E-10
fig|286.116.peg.3161 Receptor ferricromo Receptor de Fe -1,48 7,56E-12
fig|286.116.peg.3262 Componente periplasmatico del sistema de transporte tipo
ABC de fierro Transporte de Fe -1,08 1,27E-08
fig|286.116.peg.4339 Receptor de ferricromo unido a fierro Transporte de Fe -2,98 1,67E-32
fig|286.116.peg.4668 Proteina de receptora de membrana externa implicada en el
transporte de fierro Transporte de Fe -1,65 2,67E-10
fig|286.116.peg.4669 Factor PiuB de captación de fierro Biosintesis de pioverdina -1,12 4,81E-07
fig|286.116.peg.5831 Precursor de proteina A regulada por fierro Biosintesis de pioverdina -1,02 1,85E-06
Metabolismo de Potasio
fig|286.116.peg.3481 Cadena ATPasa A transportadora de potasio (EC 3.6.3.12) Homeostasis de potasio -2,59 2,31E-20
fig|286.116.peg.3480 Cadena ATPasa B transportadora de potasio (EC 3.6.3.12) Homeostasis de potasio -1,33 2,24E-05
Modificacion prostraduccional
fig|286.116.peg.4393 Proteina quinasa de serina ( PrkA ) -1,12 3,19E-07
fig|286.116.peg.5810 Chaperona periplamatica CpxP -1,39 2,83E-08
fig|286.116.peg.182 Transglutaminasa -1,19 7,91E-06
Quimiotaxis bacteriana
fig|286.116.peg.3147 Proteina de quimiotaxis aceptora de metilos -1,29 2,29E-08
fig|286.116.peg.3146 Regulador positivo de la actividad de la proteina CheA,
CheW -1,24 4,31E-05
fig|286.116.peg.3148 Histidina kinasa CheA (EC 2.7.3.-) -1,08 3,53E-05
93
TablaS4. Continuación
ID Producto del gen Subclasificación log2 (fold change) p-value
Transporte
fig|286.116.peg.3834 Precursor de proteina A de membrana externa -1,23 1,04E-10
fig|286.116.peg.3916 Precursor de lipoproteina de membrana externa Omp 16 -1,46 8,41E-12
fig|286.116.peg.1859 Transportador de la superfamilia MFS_1 -1,25 2,57E-08
División celular
fig|286.116.peg.3915 Proteina ParA División celular -1,30 5,81E-11
Transformación bacteriana
fig|286.116.peg.3486 Proteina de competencia ComEA -1,22 9,53E-08
Síntesis de biofilm
fig|286.116.peg.5067 Biofilm PGA synthesis deacetylase PgaB (EC 3.-) -1,13 1,61E-06
Otros
fig|286.116.peg.1861 Cupina, dioxigenasas dependiente de Fe -1,83 7,90E-09
fig|286.116.peg.1862 Glicina oxidasa ThiO (EC 1.4.3.19) -1,95 2,27E-11
fig|286.116.peg.1864 Subunidad beta de sarcosina oxidase beta subunit
(EC 1.5.3.1) -1,35 5,12E-06
fig|286.116.peg.1860 L-lisine 6-monooxigenase [NADPH] (EC 1.14.13.59) -2,21 6,38E-21
Proteinas hipotéticas
fig|286.116.peg.2397 Proteinas hipotéticas Proteinas hipotéticas -1,21 0,00012628
fig|286.116.peg.2401 Proteinas hipotéticas Proteinas hipotéticas -1,02 1,97E-05
fig|286.116.peg.3096 Proteinas hipotéticas Proteinas hipotéticas -1,19 0,00078927
fig|286.116.peg.3672 Proteinas hipotéticas Proteinas hipotéticas -1,19 3,29E-06
fig|286.116.peg.4270 Proteinas hipotéticas Proteinas hipotéticas -1,01 0,00194286
fig|286.116.peg.4330 Proteinas hipotéticas Proteinas hipotéticas -1,06 4,20E-06
fig|286.116.peg.4551 Proteinas hipotéticas Proteinas hipotéticas -1,05 0,00061366
fig|286.116.peg.4666 Proteinas hipotéticas Proteinas hipotéticas -1,04 0,00092247
94
Tabla S4. Continuación
ID Producto del gen Subclasificación log2 (fold change) p-value
fig|286.116.peg.510 Proteinas hipotéticas Proteinas hipotéticas -1,30 2,25E-07
fig|286.116.peg.5276 Proteinas hipotéticas Proteinas hipotéticas -1,05 0,00047515
fig|286.116.peg.5499 Proteinas hipotéticas Proteinas hipotéticas -1,18 3,92E-06
fig|286.116.peg.692 Proteinas hipotéticas Proteinas hipotéticas -1,03 0,00251294
fig|286.116.peg.755 Proteinas hipotéticas Proteinas hipotéticas -1,01 2,10E-06
fig|286.116.peg.819 Proteinas hipotéticas Proteinas hipotéticas -1,14 7,76E-05
fig|286.116.peg.1437 Proteinas hipotéticas Proteinas hipotéticas -1,12 0,00106955
fig|286.116.peg.2286 Proteinas hipotéticas Proteinas hipotéticas -1,06 1,86E-07
fig|286.116.peg.5277 Proteinas hipotéticas Proteinas hipotéticas -1,39 5,04E-06
fig|286.116.peg.1376 Proteinas hipotéticas Proteinas hipotéticas -1,33 1,90E-06
fig|286.116.peg.5440 Proteinas hipotéticas Proteinas hipotéticas -1,12 9,00E-09
fig|286.116.peg.4392 Proteinas hipotéticas Proteinas hipotéticas -1,45 2,25E-13
Tabla S5. Expresión diferencia de genes que codifican a enzimas extracelulares en P. veronii R4
ID Producto del gen Subclasificación Log2(FoldChange) p-value
Metabolismo de aminoacidos y derivados
fig|286.116.peg.2610 ExoU Enzimas extracelulares 0,63 8,46E-03
fig|286.116.peg.331 LipA Enzimas extracelulares -0,29 2,57E-01
fig|286.116.peg.1998 AprA Enzimas extracelulares -0,41 5,5E-02
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Figura S4. Esquemas de los vectores de destino pDEST17-aprA, pDEST-lipA y pDET17-
exoU. Cada vector está constituido por: el promotor T7, sitio de unión al ribosoma, codón de
inicio (AUG), seis histidinas (6xHis), sitio de recombinación attB1, gen de interés
(aprA/lipA/exoU), sitio de recombinación attB2, terminador de la transcripciónT7, promotor del
gen de resistencia a ampicilina (Amp (R)), gen de resistencia a la ampicilina (Amp(R)), origen
de replicación del vector, gen ROP que codifica para una proteína homodimérica que participa
en la mantención de un bajo número de copias del plasmidio.
96
Figura S5. Curva de calibración de la concentración azocaseina (0 a 6,23 mg/mL).
Figura S6. Curva de calibración de concentración p-nitrofenol (0 a 22 mM).
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 2 4 6 8
Den
sid
ad
óp
tica
(A
42
0)
Azocaseina (mg/mL)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
0 5 10 15 20 25
Den
sid
ad
óp
tica
(A
40
5)
ρ-nitrofenol (mM)
97
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 2 4 6
inte
nsi
dad
de
flu
ore
scen
cia
Concentración fosfolipasa A2 (U/mL)
Figura S7. Curva estándar de calibrado de la concentración de enzima fosfolipasa v/s
intensidad de fluorescencia. Gráfica de intensidad de emisión de fluorescencia v/s
concentración de fosfolipasa A2 a 10 minutos a 25 °C. La fluorescencia se midió excitando a
460 nm y midiendo a 575nm.
98
Figura S8. Análisis de la región nucleotídica que se encuentra río arriba de la transcripción de
aprA de P. veronii R4. Se alineó la secuencia río arriba del codón de inicio de la traducción de aprA de
la cepa R4 con la secuencia de P. fluorescens M114. Esta última ha sido descrita por presentar sitios de
unión para el regulador Fur en su región promotora y elements de respuesta Fe (Maunsell et al., 2006).
La caja café y azul indica el inicio de la transcripción y traducción de aprA, respectivamente. Las cajas
putativas de unión a Fur se encuentan solapadas y están destacadas con una línea solida y con puntos.
Las cajas rojas indican las secuencias consensos presentes en los promotores reguladas por Fe. La caja
verde es una putativa secuencia consenso de reconocimiento del factor sigma dependiente de Fe, PbrA
(Maunsell et al., 2006).
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XI Productividad científica
Publicaciones
Canchignia H, Altimira F; MontesC; Sánchez E; Tapia E; Miccono MA; Espinoza D, Aguirre C,
Seeger M, Prieto H. 2017. Candidate nematicidal proteins in a new Pseudomonas veronii isolate
identified by its antagonic properties against Xiphinema index. J Gen Appl Microbiol. 63:11-21.
Montes C; Altimira F; Canchignia H; Castro A; Sánchez E; Miccono MA, Tapia E; Sequeida, A;
Valdés J; Tapia P; González C; Prieto H. 2016. A draft genome sequence of Pseudomonas veronii R4:
a grapevine (Vitis vinifera) root associated isolate with high biocontrol potential. Stand Genomic Sci
11:76.
Presentaciones a Congresos
Altimira F, Canchignia H, Tapia E, Montes C, Valdés J, Tapia P, González C, Seeger M, Prieto H.
2015. Identification and genome analysis of a novel Pseudomonas veronii isolate with biocontrol
activity against the nematode Xiphinema index. XIII Symposium on Bacterial Genetics and Ecology.
Milan, Italia.
Altimira F, Tapia E, Canchignia H, Montes C, Valdés J, Tapia P, González C, Seeger M, Prieto H.
2015. Molecular basis of Pseudomonas veronii R4 biocontrol activity on Xiphinema index. XXXVI
Congreso Chileno de Microbiología. La Serena, Chile.
Altimira F, Barrientos V, Tapia E, Montes C, Sánchez E, Seeger M, Prieto H. 2017. Estudio del
mecanismo de la actividad nematicida de Pseudomonas veronii R4sobre el nematodo Xiphinema index
XIX Congreso Latino Americano de Fitopatología - LVII APS Caribbean Division Meeting. Chillán,
Chile.
