SVEUILITE U ZAGREBU

Sveuilite u ZagrebuPrehrambeno-biotehnoloki fakultet

Laboratorij za procese konzerviranje i preradu voa i povra

BIOLOKI AKTIVNE KOMPONENTE U HRANI I MEHANIZMI DJELOVANJAVJEBE

Zagreb, oujak, 2009.VJEBA 1.

Utjecaj temperature na stabilnost vitamina C u plodovima voa (ili u sokovima)UvodVitamin C (C6H8O6) uobiajenog naziva askorbinska kiselina, spada u skupinu vitamina topljivih u vodi. U znaajnim koliinama nalazi se u vou, povru i manje u njihovim preraevinama. Vrlo je nestabilan, a na njegovu stabilnost utjeu visoka koncentracija kisika, temperatura, itd. Za odreivanje vitamina C koriste se razliite metode, a budui da brojni spojevi interferiraju s kiselo-baznim svojstvima vitamina C, koliina vitamina C u veini uzoraka odreuje se oksido-redukcijskom titracijom. Oksidacijsko sredstvo 2,6-diklorfenolindofenol (DCPI) esto se koristi za titraciju vitamina C u vonim sokovima. DCPI oksidira askorbinsku kiselinu u dehidroaskorbinsku (slika 1.)

Slika 1. Oksidacija askorbinske kiseline u dehidroaskorbinsku uz DCPITijekom postupka odreivanja askorbinske kiseline interferiraju proteini koje treba ukloniti. Stoga se prije titracije DCPI-om uzorak zakiseli metafosfornom kiselinom (HPO3)n ili octenom kiselinom. Osim to slui za taloenje proteina dodatkom kiseline utjee se i na stabilizaciju molekule askorbinske kiseline. Standradizirana otopina DCPI-a je tamno plave boje, pri niim pH vrijednostima (kiseli medij) plava boja prelazi u crvenu, dok je reducirani oblik DCPI-a bezbojan.

.Eksperimentalni dioAparatura i pribor:

1) analitika vaga2) termostatirana vodena kupelj

3) magnetska mjealica

4) sokovnik5) odmjerne tikvice: 100 mL, 250 mL6) 2 birete, 50 mL

7) Erlenmeyer-eve tikvice: 100 mL, 250 mL8) pipeta, 10 mL, 20 mLReagensi:

1) askorbinska kiselina

2) 2,6-diklorfenolindofenol (DCPI)3) 10% octena kiselina (v/v) Materijali: Svjee iscjeeni sok voa. Priprema uzoraka: Iz plodova citrusa (narana, limun i sl.) iscijediti sok. Podijeliti ga na 4 jednaka dijela. Prvi uzorak (kontrolni) odmah analizirati, a preostala 3 termiki tretirati na slijedei nain: 50oC/15 min; 70oC/15 min; 85oC/15 min. U svim uzorcima odrediti koncentraciju vitamina C.Standardizacija otopine 2,6-diklorindofenola (DCPI)

Standradizacija otopine DCPI-a provodi se titracijom standardne otopine askorbinske kiseline, poznate koncentracije. 1. Otopina askorbinske kiseline. Na analitikoj vagi odvagati 0,02-0,03 g askorbinske kiseline, otopiti je u 50 mL destilirane vode i prebaciti u odmjernu tikvicu od 100 mL, te nadopuniti do oznake destiliranom vodom. Odpipetirati po 5 mL otopine askorbinske kiseline u 2 Erlenmeyerove tikvice. Nakon toga u svaku tikvicu dodati 150 mL destilirane vode i 5 mL 10% octene kiseline2. Otopina DCPI-a. 200 mg DCPI-a otopiti u 8 ml vrue destilirane vode i kvantitativno prenijeti u odmjernu tikvicu od 500 mL te do oznake nadopuniti vodom (cca 1 ml DCPI= 0,24 mg askorbinske kisline). Otopina je postojana 3-4 dana.3. Otopinom DCP-a napuniti biretu, te tono oitati volumen otopine DCP-a u bireti. Potom titrirati otpinu askorbinske kiseline pripremljenu u toki 1. Titracija se provodi do prve pojave ruiaste boje u uzorku, koja mora biti postojana najmanje 30 s, to ujedno oznaava zavretak titracije. Nakon zavretka titracije tono oitati volumen DPC-a utroenog za titraciju otopine askorbinske kiseline. Slijepa proba. Odpipetirati 5 mL destilirane vode umjesto uzorka, dodati 150 mL destilirane vode i 5 mL 10% octene kiseline. Titrirati otopinom DCPI-a kao i otopinu askrobinske kiseline do prve pojave ruiaste boje.

fDCPI= 5mL/ml DCPI

Slika 2. Titracija askorbinske kiseline (vitamin C) otopinom DCP-a4. Odreivanje vitamina C u sokovima. Odpipetirati 5 mL prethodno profiltriranog soka, dodati 150 mL destilirane vode i 5 mL 10% octene kiseline. Titrirati otopinom DCPI-a kako je opisano u toki 3.

Raun:

a)Izraunavanje koncentracije vitamina C u uzorku

Koncentracija vitamina C (mg/mL)= (VDCPI x fDCPIx 0,24)/ V uzorka1ml DCPI= 0,2-0,3 mg askorbinske kiseline (npr 0,24)

V1-volumen DCPI utoren za titraciju uzorka, mLV2- volumen DCPI utoren za titraciju slijepe probe, mLVDCPI= V1-V2, mL

V uzorka, mL

b)Izraunavanje koliine uzorka koja zadovoljava preporuene dnevne doze (RDI) vitamina C za odrasle zdrave osobe.

Volumen soka C (mL)= (Vanaliziranog soka(ml)x RDI/ mAA Vitamin C: RDI-ene-75, mukarci 90 mg/danV analiziranog soka,- volumen soka uzet za tiraciju, mLmAA- masa askorbiske kiseline odreena u analiziranom volumenu soka, mgIme i prezime:Naslov vjebe:Datum:

Zadatak:

Na temelju provedenog eksperimenta odredi

a) Koncentraciju vitamina C u 100 mL soka.

b) Volumen soka potrebnog za podmirivanje minimalne preporuene dnevne doze (RDA) od 60 mg (ml) vitamina C dnevno.c) Usporedi koncentracije vitamina C u kontrolnom (netretiranom) soku i termiki tretiranim sokovima. SokKonc. Vit. C, mg/100 mL% RDA u 125 mL soka

netretirani

50oC/15 min

70oC/15 min

85oC/15 min

Zakljuak a) objasniti utjecaj temperature na stabilnost vitamina C:

b) Koji od ispitivanih sokova je bio bolji i na temelju ega ste to procjenili?c) Da li je dnevno konzumiranje 125 mL soka________________ podmiruje dnevne potrebe za vitaminom C? (upisati vrstu soka)VJEBA 2.

Izolacija i odreivanje polifenola u plodovima voa ili preraevinama

I dio- odreivanje ukupnih fenola (TP)UvodEksperimentalni dio

Princip odreivanja:

Odreivanje ukupnih fenola provodi se u etanolnom ekstraktu uzorka. Princip odreivanja se temelji na kolornoj reakciji koja nastaje kao posljedica reakcije fenola s Folin Ciocalteu-ovim reagensom te se spektrofotometrijski mjeri intenzitet nastalog obojenja pri 765 nm (Ough i Amerine, 1988). Rezultati se izraavaju kao mg ekvivalenta galne kiseline na 100 g jestivog dijela uzorka (mg GAE/100 g).Aparatura i pribor:1. aa volumena 50 mL,

2. analitika vaga (METTLER),

3. Erlenmeyerova tikvica, 250 mL,

4. pipete: 5 mL, 10 mL, 20 mL i 25 mL,

5. tronoac,

6. plamenik,

7. azbestna mreica,

8. povratno hladilo,

9. stakleni lijevak,

10. filter papir,

11. odmjerne tikvice, 50 mL, 100 mL i 1000 mL,

12. menzura, 1000 mL,

13. kivete,

14. spektrofotometar (UV UNICAM HELIOS ).Reagensi:

1. 80 %-tna vodena otopina etanola (v/v),

2. 96 %-tni etanol,

3. Folin Ciocalteu reagens ( razrijeen destiliranom vodom u omjeru1:2)4. zasiena otopina natrijeva karbonata (m/v), Na2CO3,

Priprema: 200 g anhidrida natrijeva karbonata se otopi u 800 mL vrue destilirane vode, u odmjernoj tikvici volumena 1000 mL, a zatim ohladi na sobnu temperaturu. Doda se nekoliko kristalia natrijeva karbonata, te se nadopuni destiliranom vodom do oznake. Pripremljena otopina treba odstajati 24 sata te se nakon toga profiltrira.

5. galna kiselina,

Priprema: 500 mg galne kiseline otopi se u tikvici volumena 100 mL u 96 %-tnom etanolu te se istim etanolom nadopuni do oznake.Priprema uzorka:

Uzorak voa usitni se u mikseru, te se odvae 5 g s tonou 0,01 g i prebaci u Erlenmeyerovu tikvicu s ubruenim grlom u koju se doda 20 mL 80 %-tne vodene otopine etanola. Smjesa se homogenizira 5 minuta na magnetskoj mjealici te se prikljui na povratno hladilo. Ekstrakcija traje 10 minuta od trenutka kljuanja smjese. Dobiveni ekstrakt se nakon hlaenja na sobnu temperaturu filtrira preko lijevka i filter papira u tikvicu volumena 50 mL, a preostali talog se zajedno s filter papirom vrati natrag u Erlenmeyerovu tikvicu uz dodatak 25 mL 80 %-tne vodene otopine etanola te se ekstrahira jo 10 minuta uz povratno hladilo. Dobiveni ekstrakt se profiltrira u tikvicu u kojoj se nalazi prvi filtrat te nadopuni 80 %-tnom vodenom otopinom etanola do oznake. Postupak odreivanja:

U odmjernu tikvicu volumena 50 mL otpipetira se redom: 0,5 mL uzorka, 30 mL destilirane vode, 2,5 mL F. C. reagensa (F. C. reagens mijea se s destiliranom vodom u omjeru 1:2 neposredno prije mjerenja) i pomijea. Smjesi se potom doda 7,5 mL zasiene otopine natrijeva karbonata, nadopuni vodom do oznake i ostavi stajati 2 sata na sobnoj temperaturi ili 30 minuta pri 50 oC.

Slijepa proba. Na isti nain se pripremi slijepa proba, ali se umjesto uzorka uzima destilirana voda. Nakon 2 sata (ili 30 minuta) mjeri se apsorbancija pri valnoj duljini od 765 nm.Izrada badarnog pravca:

Iz pripremljene otopine galne kiseline rade se razrjeenja, u odmjernim tikvicama volumena 100 mL, tako da koncentracije galne kiseline iznose: 0, 50, 100, 150, 250, 500 mg/L.

Razrjeenja se prirede tako to se u odmjerne tikvice volumena 100 mL redom doda: 0, 1, 2, 3, 5 i 10 mL otopine galne kiseline i nadopuni destiliranom vodom do oznake.

Iz svake tikvice se otpipetira 0,5 mL uzorka u odmjerne tikvice volumena 50 mL te se postupa po propisu za odreivanje ukupnih fenola.

Badarni pravac se nacrta tako da se na apscisu nanesu koncentracije galne kiseline (mg/L), a na ordinatu vrijednosti apsorbancija mjerene pri 765 nm.

Raun:

Koncentracija ukupnih fenola izraunava se prema jednadbi pravca.

y = 0,0009 x

R2 = 0,99

gdje je:

y apsorbancija pri 765 nm

x koncentracija galne kiseline (mg/L)

R2 koeficijent determinacije

II dio- odreivanje ukupnih flavonoida

Uvod

Flavonoidi predstavljaju veliku skupinu fenolnih spojeva od preko 4000 spojeva. U veini biljnih vrsta prisutni su u velikim koncentracijama, a znaajni su zbog izrazitih antioksidativnih, antimikrobnih, protuupalnih i drugih svojstava. Ukupni flavonoidi odreuju se spektrofotometrijski, dok se za odreivanje pojedinanih flavonoida koriste kromatografske metode, najee HPLC UV/VIS PDA metoda.

Jedna od spektrofotometrijskih metoda koja se koristi za odreivanje flavonoida je kompleksacija sa aluminijevim (III) kloridom. Kao posljedica reakcije ALClc sa molekulama flavonoida nastaje ukasto obojeni kompleks iji intenzitet obojenja se mjeri pri 420 ili 510 nm ovisno o grupi flavonoida koji prevladavaju u ispitivanom uzorku. Za voe u kojem su dominantna skupina flavonoida antocijani mjerenje se provodi pri 510 nam, a za sve ostale skupine pri 420 nm.

Princip odreivanja:

Odreivanje flavonoida temelji se na svojstvu flavonoida da s aluminijevim kloridom (AlCl3) (1:10) tvore kompleks, a intenzitet obojenja proporcionalan je koliini prisutnih flavonoida.Aparatura i pribor:

1. aa,50 mL,2. analitika vaga3. odmjerne tikvice, 5 mL, 10 mL, 50 mL i 100 mL,

4. pipete, 1 mL, 2 mL, 5 mL i 10 mL,

5. mikropipete, 300 L,

6. centrifuga7. stakleni lijevak,

8. epruvete,

9. kivete,

10. spektrofotometar (UV UNICAM HELIOS ).Reagensi:

1. otopina natrijeva nitrita (1:20) (m/v), NaNO2,

Priprema: 0.5 g natrijeva nitrita, NaNO2, se otopi u destiliranoj vodi, u odmjernoj tikvici volumena 10 mL, te nadopuni destiliranom vodom do oznake.

2. otopina aluminijeva klorida (1:10) (m/v), AlCl3,

Priprema: 5 g aluminijeva klorida, AlCl3, se otopi u destiliranoj vodi, u odmjernoj tikvici volumena 50 mL, te nadopuni destiliranom vodom do oznake.

3. 1 M otopina natrijeva hidroksida, NaOH,

4. 80 %-tna vodena otopina etanola (v/v),

5. rutin,

Priprema: 250 mg rutina se otopi u tikvici volumena 100 mL u 80 %-tnoj vodenoj otopini etanola te se nadopuni do oznake.

Priprema uzorka:Ukupni flavonoidi odreuju se u etanolnom ekstraktu dobivenom za odreivanje ukupnih fenola (postupak je opisan u I-dijelu vjebe).Postupak odreivanja:

1 mL uzorka se otpipetira u odmjernu tikvicu volumena 10 mL. Zatim se doda 4 mL destilirane vode te 300 L natrijeva nitrita (1:20). Nakon 5 minuta smjesi se doda 3 mL aluminijeva klorida (1:10) te nakon 6 minuta 2 mL 1 M otopine natrijeva hidroksida. Sve se dobro promijea i stavi na centrifugiranje 5 minuta. Nakon centrifugiranja sadraj kiveta se dekantira u epruvete.

Na isti nain se pripremi slijepa proba, ali se umjesto uzorka uzima ista koliina destilirane vode. Zatim se mjeri apsorbancija pri valnoj duljini od 420 ili 510 nm.Izrada badarnog pravca:

Iz pripremljene otopine rutina rade se razrjeenja, u odmjernim tikvicama volumena 5 mL, tako da koncentracije rutina iznose: 50, 100, 150, 200 i 250 mg/100 mL.

Razrjeenja se prirede tako to se u odmjerne tikvice volumena 5 mL redom doda: 1, 2, 3, 4 i 5 mL otopine rutina i nadopuni 80 %-tnom vodenom otopinom etanola do oznake.

Iz svake tikvice se otpipetira 1 mL uzorka u odmjerne tikvice volumena 10 mL te se postupa po propisu za odreivanje flavonoida.

Badarni pravac se nacrta pomou raunala pri emu se na apscisu nanesu koncentracije rutina (mg/100 mL), a na ordinatu vrijednosti apsorbancija mjerene pri 510 nm.Raun:

Koncentracija flavonoida izrauna se prema jednadbi pravca:y = 0,0029 x

R2 = 0,99

gdje je:

y apsorbancija pri 510 nm

x koncentracija rutina (mg/100 mL)

R2 koeficijent determinacijeIme i prezime:Naslov vjebe:Datum:

Zadatak:

Na temelju provedenog eksperimenta odredi

a) Koncentraciju ukupnih fenola u 100g uzorka izraenu u mgGAE.b) Koncentraciju flavonoida u 100 g uzorka izraenu u mg RE

c) Usporedite koliine ukupnih fenola (TP) i ukupnih flavonoida (TF) u ispitivanim uzorcima.

UzorakKoncentracija TP,

mg GAE/100 g fwKoncentracija TF,

mg GAE/100 g dwUdio TF u ukupnoj koliini fenola, %

Koji uzorak je sadravao najvie polifenola?Koji uzorci imaju visok udjel flavnoida? Zato je to znaajno?

c) Koji je nedostatak primjenjene metode odreivanja ukupnih fenola, odnosno ukupnih flavonoida?Zakljuak

a) Usporedite koncentracije ukupnih fenola u ispitivanim uzorcima. Istaknite koji uzorci su bolji izvori polifenola.

b) Objasnite zato je potrebno izraunati vrijednosti TP na suhu tvar uzorka.c) Koja skupina fenolnih spojeva dominira u ispitivanim uzorcima?

VJEBA 3.

ODREIVANJE ANTIOKSIDACIJSKOG KAPACITETAUvod

Antioksidansi su molekule koje mogu donirati jedan elektron ili vodikov atom nekom reaktivnom, slobodnom radikalu. Vre ulogu neutralizacije slobodnih radikala i na taj nain tite ljudski organizam od moguih bolesti, ali i usporavaju kvarenje hrane bogate lipidima.

Tvari kao to su vitamin C, E, karoten, fenolni spojevi, estrogeni biljnog podrijetla imaju antioksidativnu sposobnost, a prirodni izvor antioksidacijskih tvari su uljarice, cjelovite itarice, povre, voe, lie, korijen, mirodije i zeljaste biljke.

Fenolni spojevi su grupa sekundarnih aromatskih metabolita biljke, za koje se zna da posjeduju viestruka bioloka djelovanja kao to su antioksidativna aktivnost i antimikrobna aktivnost.

Da bi se odredio antioksidacijski kapacitet razvijen je velik broj metoda koje se temelje na razliitim mehanizmima obrambenog sistema antioksidanasa, poput uklanjanja ili inhibicije slobodnih radikala ili kelacije metalnih iona, koji bi u suprotnom doveli do nastajanja slobodnih radikala.

Zbog kompleksnih oksidacijskih procesa, potrebno je vie metoda za odreivanje antioksidacijskog kapaciteta, jer na osnovi samo jedne metode, dobivene rezultate ne moemo tono interpretirati i konano ih potvrditi. Za odreivanje antioksidacijskog kapaciteta koriste se direktne metode (ORAC metoda, odreivanje antioksidacijskog kapaciteta s -karotenom) i indirektne metode (DPPH, ABTS+, FRAP).

FRAP metoda

FRAP metodu razvili su Benzie (1996) i Benzie i Strain (1996). Metoda se bazira na reakciji redukcije uto obojenog kompleksa eljezo-2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) pri emu nastaje plavo obojeni produkt (slika 1). Reakcija se odvija u kiselom mediju, pri pH=3,6 kako bi se zadrala dobra topljivost eljeza. Pri niim pH vrijednostima smanjuje se ionizacijski potencijal koji omoguuje prijenos elektrona, a ujedno e se poveati redoks potencijal, koji e dodatno omoguiti pomak reakcije u smjeru transfera elektrona (Hagerman i sur., 1998; Simic i Jovanovic, 1994). Redoks potencijal reakcije Fe(III)/Fe(II) iznosi 0,77V i svi spojevi sa niim redoks potencijalom, ulazit e u reakciju redukcije eljeza te tako doprinjeti konanom rezultatu antioksidacijskog kapaciteta.

Slika 1. Reakcija redukcije eljezo-2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) Princip odreivanja:

Metoda se temelji na sposobnosti ekstrakta da reducira Fe ione u Fe ione u otopini 2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) pri niem pH. Redukcija se prati mjerenjem promjene apsorbancija pri 595 nm. Rezultati su izraeni kao mol Fe ekvivalenta (FE)/mL uzorka.

Aparatura i pribor:

1. odmjerna tikvica, volumena 10ml, 50 ml, 100 ml,

2. automatska pipeta,

3. pipeta 2 ml, 5 ml, 10ml, 25 ml, 50 ml,

4. aa, volumena 50 ml,

5. analitika vaga (METTLER),

6. kivete,

7. spektrofotometar (UV UNICAM HELIOS ).

Reagensi:

1. 40 mM vodena otopina klorovodine kiselina, HCl

Priprema: 330 L 12 M HCl (konc. HCl = 35 %) razrijedi se u odmjernoj tikvici od 100 mL destiliranom vodom te nadopuni do oznake.

2. 0,3 M acetatni pufer, pH 3,6

Priprema: 1,55 g natrijevog acetata trihidrata otopi se u 8 mL ledene octene kiseline u odmjernoj tikvici od 500 mL i nadopuni destiliranom vodom do oznake.

3. 20 mM otopina eljezovog(III)-klorida, FeCl3Priprema: 0,0541 g FeCl3 6 H2O otopi u 10 mL destilirane vode, otopina se priprema svjea.

4. 10 mM otopina 2,4,6-tripiridil-s-triazina, TPTZ

Priprema: 0,0312 g TPTZ otopi se u odmjernoj tikvici od 10 mL sa 40 mM HCl te se istom klorovodinom kiselinom nadopuni do oznake. Otopina se uvijek priprema svjea tj. na dan odreivanja.

5. 20 mM otopina FeSO4 7H2O,

6. 30 %-tna vodena otopina etanola,

7. 30 %-tna vodena otopina metanola.

Priprema FRAP reagensa:

PomIjea se 50 mL acetatnog pufera, 5 mL TPTZ reagensa i 5 mL FeCl3 (omjer 10:1:1).

Priprema uzorka:

Ekstrakti fenola, dobiveni prilikom odreivanja ukupnih fenola, razrijede se u omjeru 1:10.

Postupak odreivanja:

U odmjernu tikvicu od 10 ml otpipetira se redom: 240 L destilirane vode, 80 L uzoraka te 2080 L FRAP reagensa, dobro se promijea te termostatira 5 minuta u vodenoj kupelji na 37C. Slijepa proba sadrava sve osim uzorka, a umjesto uzorka stavlja se otapalo kojim je uzorak ekstrahiran.

Nakon 5 minuta, izmjeri se apsorbancija pri 595 nm.

Izrada badarnog pravca:

Za izradu badarnog pravca pripreme se standardne otopine FeSO4 7H2O, tako da koncentracije u odmjernim tikvicama iznose: 0, 25, 100, 250, 500 i 750 mM. Postupak je isti kao i za uzorak, samo to se umjesto uzorka dodaju prireene koncentracije otopine FeSO4 7H2O.

Iz izmjerenih vrijednosti apsorbancija nacrta se badarni pravac pomou raunala tako to se na apscisu nanesu koncentracije standardne otopine FeSO4 7H2O (mM), a na ordinatu izmjerene vrijednosti apsorbancija pri 595 nm.

Raun:

Na temelju podataka dobivenih u ovom radu jednadba badarnog pravca glasi:

y = 0,00053372 x

R2 = 0,99

gdje je:

y apsorbancija pri 595 nm

x koncentracija standardne otopine FeSO4 7H2O (mM)

R2 koeficijent determinacije

Ime i prezime:Naslov vjebe:Datum:

Apsorbancija A 595nm

Jednadba pravca

AOC

mol Fe2+ekvivalenta (FE)/mL uzorka

Raun:

1. Koje se metode mogu koristiti za odreivanje antioksidacijskog kapaciteta?2. Na kojem se principu zasniva FRAP metoda?

3. Usporedite vrijednosti antioksidacijske aktivnosti ispitivanih uzoraka. Istaknite koji uzorci imaju veu antioksidacijsku aktivnost. 4. Kakva je korelacija izmeu koliine ukupnih fenola i flavonoida i odreene antioksidacijske aktivnosti? VJEBA 4.Razdvajanje frakcija antocijana i fenolnih kiselina primjenom ekstrakcije na vrstoj fazi (Solid-Phase Extraction SPE)

Uvod

Po kemijskoj strukturi antocijani su derivati 2-fenilbenzopirilijevih (flavilijevih) soli koje se nalaze u biljkama u obliku glikozida, dok se njihovi aglikoni nazivaju antocijanidini. Na svom centralnom (C) prstenu imaju pozitivan naboj te imaju svojstvo iona (flavijum iona) i po tome se razlikuju od svih ostalih flavonoida. U prirodi je pronaeno oko dvadeset razliitih antocijanidina, a najvaniji su: cijanidin, pelargonidin, delfinidin, peonidin, petunidin i malvidin (slika 1). Antocijani su biljni pigmenti koji se nalaze u vakuolama povrinskog tkiva cvijea, voa i povra, a mogu se nai i u mesnatom dijelu te im daju ruiastu, crvenu, plavu i ljubiastu boju (Mazza i Maniati, 1993). Postoje u razliitim kemijskim formama, obojenom ili bezbojnom, to ovisi o pH. esto se koriste u prehrambenoj industriji kao prirodna bojila.

Za odreivanje antocijana koriste se spektrofotometrijske metode kao npr. metoda izbjeljivanja bisulfita, pH-diferencijalna metoda itd. Uz spektrofotometrijske metode sastav i koliina antocijana uinkovito se mogu odrediti primjenom visokodjelotvorne tekuinske kromatografije uz UV/Vis PDA detekciju (HPLC UV/Vis PDA). Vaan korak u analizi biolokih molekula predstavlja proiavanje uzorka, tj uklanjanje interferirajuih spojeva. Uz klasine metode proiavanja kao to su taloenje proteina, uklanjanje organskih kiselina i eera, znaajna je primjena tzv. ekstrakcije na vrstoj fazi (Solid-phase extraction-SPE).

Slika 1. Osnovna kemijska struktura antocijanaEksperimentalni dioPrincip odreivanja:

Razdvajanje frakcije antocijana od ostalih fenolnih spojeva primjenom SPE metode temelji se na razliitoj topljivosti antocijana i fenolnih kiselina u organskim otapalima. Antocijani se dobro otapaju i eluiraju primjenom slabo zakiseljene otopine metanola (0,01% HCl u MeOH), dok se fenolne kiseline eluiraju primjenom etil acetata. Na temelju razliite topljivosti antocijana i fenolnih kiselina u navedenim otapalima provodi se njihovo frakcioniranje na SPE kolonama. Odreivanje koncentracije antocijana u frakciji nakon proiavanja na SPE kolonama provodi se primjenom pH diferencijalne metode ili metode izbjeljivanja bisulfita. Fenolne kiseline izolirane su u etil acetatnoj frakciji. Etil acetat se upari do suha te se dobiveni ostatak otopi u 80 % metanolu, a ukupni fenolni spojevi odreuju se primjenom kolorne reakcije koja nastaje kao posljedica reakcije fenola s Folin Ciocalteu-ovim reagensom te se spektrofotometrijski mjeri intenzitet nastalog obojenja pri 765 nm Aparatura i pribor:1. aa volumena 50 mL,2. analitika vaga (METTLER),3. Erlenmeyerova tikvica, 250 mL,4. pipete: 5 mL, 10 mL, 20 mL i 25 mL,5. tronoac,6. plamenik,7. azbestna mreica,8. povratno hladilo,9. stakleni lijevak,10. filter papir,11. odmjerne tikvice, 50 mL, 100 mL i 1000 mL,12. menzura, 1000 mL,13. kivete,14. spektrofotometar (UV UNICAM HELIOS )15. kolonice za SPE

16. Ureaj za SPE (Supelco vacuum manifold)Reagensi:

1. 80 %-tna vodena otopina metanola (v/v),2. Folin Ciocalteu reagens ( razrijeen destiliranom vodom u omjeru1:4)

3. zasiena otopina natrijeva karbonata (m/v), Na2CO3, Priprema: 200 g anhidrida natrijeva karbonata se otopi u 800 mL vrue destilirane vode, u odmjernoj tikvici volumena 1000 mL, a zatim ohladi na sobnu temperaturu. Doda se nekoliko kristalia natrijeva karbonata, te se nadopuni destiliranom vodom do oznake. Pripremljena otopina treba odstajati 24 sata te se nakon toga profiltrira.4. galna kiselina, Priprema: 500 mg galne kiseline otopi se u tikvici volumena 100

mL u 96 %-tnom etanolu te se istim etanolom nadopuni do oznake.

5. 2% vodena otpina HCl (v/v),Priprema: u odmjernu tikvicu od 1000 mL otpipetira se 54,05 mL koncentrirane klorovodine kiseline i nadopuni destiliranom vodom do oznake.6. 15 %-tna otopina natrijeva hidrogensulfita (v/v), NaHSO3,

Priprema: u odmjernu tikvicu od 100 mL otpipetira se 38,5 mL koncentriranog natrijeva hidrogensulfita i nadopuni destiliranom vodom do oznake.7. 0,01 % otopina HCl u MeOH (v/v)8. 0,01 % otopina HCl u vodi (v/v)Priprema uzorka:

Uzorak voa (vinje, borovnice, jagode, trenje i sl.) usitni se u mikseru, te se odvae 5 g s tonou 0,01 g i prebaci u Erlenmeyerovu tikvicu s ubruenim grlom u koju se doda 20 mL 0,1 % otopine HCl u metanolu (v/v) i 0,1 % askorbinske kiseline (m/v). Smjesa se homogenizira 5 minuta na magnetskoj mjealici te se prikljui na povratno hladilo. Ekstrakcija traje 10 minuta od trenutka kljuanja smjese. Dobiveni ekstrakt se nakon hlaenja na sobnu temperaturu filtrira preko lijevka i filter papira u tikvicu volumena 50 mL, a preostali talog se zajedno s filter papirom vrati natrag u Erlenmeyerovu tikvicu uz dodatak 25 mL 0,1 % otopine HCl u metanolu (v/v) te se ekstrahira jo 10 minuta uz povratno hladilo. Dobiveni ekstrakt se profiltrira u tikvicu u kojoj se nalazi prvi filtrat te nadopuni do oznake otapalom koritenim za ekstrakciju. Razdvajanje frakcija antocijana i fenolnih kiselina

Ekstrakt ukupnih fenola sadri razliite skupine fenolnih spojeva antocijane, fenolne kiseline i ostale flavonoide. Na SPE kolonama provodi se razdvajanje frakcija antocijana i fenolnih kiselina. Proiavanje se provodi uz uporabu tzv. SPE vakuum manifolda.

Slika 2. SPE vakuum manifold, ureaj za provoenje ekstrakcije na vrstoj fazi.

Postupak proiavanja provodi se na SPE kolonicama koje se montiraju na gornji dio kuita SPE vakuum manifolda (slika 2) koji se potom spoji na vakuum pumpu. Postupak proiavanja uzorka (razdvajanja frakcija antocijana i fenolnih kiselina) provodi se kako slijedi:POSTUPAK 1

1. SPE kolone se kondicioniraju (aktiviraju) s 5 mL 0,01% otopine HCl u MeOH (uz mali protok); 2 mL 0,01% otopine HCl u vodi.

2. Nakon kondicioniranja SPE kolonica nanese se 1-2 mL centrifugiranog uzorka-ekstrakta polifenola (centrifugiranje se provodi samo ako se procjeni da je potrebno). Prolazak uzorka preko kolonica mora se odvijati uz mali protok.3. Frakcija antocijana eluira se sa 5 mL 0,01 % otopine HCl u MeOH (uz mali protok). Ekstrakt se upari do suha i otopi u 5 mL 2% vodene otopine HCl (v/v). U frakciji antocijana spektrofotometrijski se odrede ukupni antocijani.4. Fenolne kiseline eluiraju se sa 5 mL etil acetata. Frakciju etil acetata upariti do suha te nakon toga otopiti u 2 mL 80 % metanola i u dobivenom ekstraktu odrediti ukupne fenole spektrofotometrijski primjenom Folin-Ciocalteu metode.POSTUPAK 2

1. SPE kolone se kondicioniraju (aktiviraju) s 5 mL etil acetata; 5 mL 0,01% otopine HCl u MeOH; 5 mL 0,01% otopine HCl u vodi (uz mali protok)

2. Nakon kondicioniranja SPE kolonica nanese se 1-2 mL centrifugiranog uzorka-ekstrakta polifenola (centrifugiranje se provodi samo ako se procjeni da je potrebno). Prolazak uzorka preko kolonica mora se odvijati uz mali protok.3. SPE kolonica ispere se sa 5 ml 0,01% vodenom otopinom HCl, kolonica se osui inertnim plinom (duik)/3 minute.4. Fenolne kiseline eluiraju se sa 5 mL etil acetata. Frakciju etil acetata upariti do suha te nakon toga otopiti u 2 mL 80 % metanola i u dobivenom ekstraktu odrediti ukupne fenole spektrofotometrijski primjenom Folin-Ciocalteu metode.5. Frakcija antocijana eluira se sa 5 mL 0,01 % otopine HCl u MeOH (uz mali protok). Ekstrakt se upari do suha i otopi u 5 mL 2% vodene otopine HCl (v/v). U frakciji antocijana spektrofotometrijski se odrede ukupni antocijani.

Slika 3. Postupak provoenja ekstrakcije na vrstoj fazi (SPE)

Postupak odreivanja ukupnih fenola:

U odmjernu tikvicu volumena 25 mL otpipetira se redom: 0,25 mL uzorka, 15 mL destilirane vode, 1,25 mL F. C. reagensa (F. C. reagens mijea se s destiliranom vodom u omjeru 1:4 neposredno prije mjerenja) i pomijea. Smjesi se potom doda 3,75 mL zasiene otopine natrijeva karbonata, nadopuni destiliranom vodom do oznake i ostavi stajati 30 minuta pri 50 oC. Nakon 30 minuta mjeri se apsorbancija pri valnoj duljini od 765 nm.

Slijepa proba. Na isti nain se pripremi slijepa proba, ali se umjesto uzorka uzima otapalo koriteno za ekstrakciju.

Raun:

Koncentracija ukupnih fenola izraunava se prema jednadbi pravca.

y = 0,0009 x

R2 = 0,99

gdje je:

y apsorbancija pri 765 nm

x koncentracija galne kiseline (mg/L)

R2 koeficijent determinacije

Postupak odreivanja ukupnih antocijana:

U dvije epruvete odpipetira se po 5 mL ekstrakta antocijana dobivenog nakon proiavanja na SPE kolonicama. U jednu se doda 2 mL destilirane vode, a u drugu 2 mL 15 %-tnog natrijeva hidrogensulfita. Epruvete stoje 15 minuta na sobnoj temperaturi, nakon ega se mjeri apsorbancija pri 520 nm. Za slijepu probu uzima se %-tna vodena otopina HCl (v/v).Raun:

Koliina antocijana u ispitivanom uzorku rauna se po formuli:

A0 (mg/kg) = 615 * (A1 - A2)

gdje je:

A0 koliina antocijana u ispitivanom uzorku

615 faktor preraunavanja

A1 apsorbancija uzorka kojem je dodana voda

A2 apsorbancija uzorka kojem je dodana 15 %-tna otopina natrijeva hidrogensulfita.Ime i prezime:Naslov vjebe:Datum:

1. Odrediti koncentraciju ukupnih antocijana u analiziranom uzorku (u mg/100 g ili mg/100 mL analiziranog uzorka)2. Odrediti koncentraciju preostalih fenolnih spojeva (fenolnih kiselina) u analiziranom uzorku (mg/100 g ili mg/100 mL analiziranog uzorka)

3. Koji spojevi su dominirali u analiziranom uzorku?

4. Koja je svrha provoenja ekstracije na vrstoj fazi?

5. Zato je bilo potrebno upariti etil acetat te fenolne spojeve otopiti u 80% vodenoj otopini MeOH?

6. Koji parametri mogu utjecati na uinkovitost provoenja postupka ekstrakcije na vrstoj fazi?

Cilj eksperimenta:

Utvrditi utjecaj temperature na stabilnost vitamina C u svjeem vou ili sokovima.

Izraunati volumen soka potreban za zadovoljavanje preporuene dnevne doze (RDI) vitamina C za odrasle zdrave osobe.

PAGE 32Bioloki aktivni spojevi u hrani i mehanizmi djelovanja-vjebe

_1261064115.unknown

_1261064138.unknown

_1261064139.unknown

_1261064140.unknown

_1261064113.unknown

_1261064114.unknown

_1261064108.unknown