A. Lý thuyết

Phương pháp phổ khối lượng (Mass Spectrometry - MS) là một phương pháp phân tích

dụng cụ quan trọng trong phân tích thành phần và cấu trúc các chất. Bắt đầu từ cuối thế kỷ

XIX, Goldstein (1886) và Wein (1898) thấy rằng một chùm tia ion dương có thể tách ra khỏi

nhau dưới tác dụng của một điện trường và từ trường. Năm 1913, F.W Aston (nhà bác học đạt

giải Nobel năm 1922 cho các nghiên cứu đồng vị) đã nghiên cứu thấy khí neon tự nhiên gồm

2 loại có khối lượng nguyên tử khác nhau (isotope) là 20 và 22 (g/mol). Hàng loạt các nghiên

cứu về phương pháp phổ khối lượng như cơ chế và kỹ thuật ion hoá, thiết bị phân tích phổ

khối và các ứng dụng của phương pháp phổ khối lượng trong các lĩnh vực hoá học, vật lý,

sinh học, …đã được thực hiện như máy GC/MS ra đời những năm 1950, máy HPLC/MS được

phát minh những năm 1970…

Ngày nay, phương pháp phân tích phổ khối lượng có ứng dụng rộng rãi trong nhiều

ngành với các ứng dụng chính như: Xác định khối lượng, cấu trúc phân tử; Nhận dạng, định

danh và cấu trúc chuỗi peptip, protein; Nghiên cứu đồng vị; Định tính, định lượng các chất

nồng độ vết và vi lượng trong các mẫu sinh học, thực phẩm, nông thuỷ sản, môi trường...

1. Cơ sở lý thuyết của phương pháp khối phổ

- Phương pháp phổ khối lượng là một kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích

của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Tỷ số này

được biểu thị bằng đơn vị khối lượng nguyên tử (Atomic mass unit) hoặc bằng Dalton. 1 amu

= 1 Da và bằng khối lượng của nguyên tử hydro.

Sơ đồ cấu tạo thiết bị khối phổ kế

(mass spectrometer)

Thí nghiệm xác định đồng vị Neon

của F.W Aston năm 1913

- Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phận

phân tích khối trước khi đến bộ phận phát hiện (detector). Quá trình phân tích khối và phát

hiện được thực hiện trong môi trường chân không (áp suất khoảng 10-5 đến 10-8 Torr).

- Đối với các hợp chất hữu cơ: Cơ sở của phương pháp MS là sự ion hoá phân tử trung

hoà thành các ion phân tử mang điện tích hoặc sự bắn phá, phá vỡ cấu trúc phân mảnh phân tử

trung hoà thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích (có khối lượng nhỏ hơn) bằng các phần

tử mang năng lượng cao theo sơ đồ sau:

+ Ion hoá phân tử trung hoà thành các ion phân tử mang điện tích:

ABCD + e ABCD+ + 2e (> 95%)

ABCD2+ + 3e

ABCD-

+ Phân mảnh phân tử trung hoà thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích:

ABCD + e* ABn+ + C + Dm-

Sự phân mảnh phân tử trung hoà thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích tuân theo

định luật bảo toàn khối lượng. Năng lượng bắn phá (năng lượng ion hoá) là một yếu tố quyết

định sự phân mảnh các hợp chất. Khi năng lượng bắn phá mẫu (khoảng 10eV) bằng với năng

lượng ion hóa phân tử sẽ gây nên sự ion hóa phân tử. Nếu năng lượng ion hóa tăng lên (30-

50eV) sẽ bẻ gẫy một số liên kết trong phân tử, tạo ra nhiều mảnh. Đó là các ion hoặc phân tử

trung hòa có khối lượng bé hơn.

Quá trình phân mảnh đặc trưng cho cấu trúc của phân tử và chỉ ra sự có mặt của những

nhóm chức đặc thù, cung cấp cho người phân tích những thông tin hữu ích về cấu tạo hoặc

nhận dạng của chất phân tích. Quá trình phân mảnh là cơ sở giúp ta biện giải phổ, nhận dạng

hoặc khẳng định cấu trúc của chất phân tích.

2. Cấu tạo và nguyên lý vận hành của một phổ kế và phổ kế kết nối HPLC

Sơ đồ khối cấu tạo các bộ phận của một khối phổ kế

Một khối phổ kế bao gồm các phộ phận chính: Bộ nạp mẫu – đưa mẫu vào (inlet), Bộ nguồn

ion hoá (ion source), bộ phân tích khối (mass analyzer), bộ phát hiện ion (detector) và ghi/ xử

lý số liệu (data system).

2.1. Bộ phận nạp mẫu:

Chuyển các mẫu cần phân tích vào nguồn ion hoá của thiết bị khối phổ. Có hai phương

pháp nạp mẫu chính, tuỳ thuộc vào trạng thái vật lý của chất cần phân tích:

− Nạp mẫu dạng khí: Áp dụng đối với các chất khí, chất lỏng (dễ bay hơi) bằng syringe

tiêm mẫu hoặc kết nối với hệ sắc ký khí (GC/MS), sắc khí lỏng (LC/MS).

− Nạp mẫu trực tiếp: Áp dụng với các rắn, tinh thể, sơn hoặc keo. Mẫu đựng trong cối

chuyên dụng (Φ # 1mm), gắn trên thanh đốt được đưa vào buồng chân không. Sau khi hút

chân không, cối đựng mẫu được làm nguội và đưa vào buồng ion hoá, ở đâu nó được đốt nóng

từ từ cho đến khi bay hơi.

Sự ra đời của các kỹ thuật ion hoá tiên tiến (ion hoá mềm) như ion hoá bằng chùm tia

laser hay phản hấp thụ/ ion hoá mẫu bằng chùm tia laser (MALDI - Matrix-assisted laser

desorption/ionization) hoặc bắn phá nhanh nguyên tử (FAB - fast atom bombardment), quá

trình nạp mẫu của các chất rắn không cần phải sử dụng các cối chuyên dụng và tương tự như

quá trình nạp mẫu đối với chất khí và lỏng.

Do quá trình nạp mẫu từ áp suất thường (760mmHg) vào buồng chân không cao (10-5-

10-8 Torr) phải không được ngắt chân không của bộ phận phân tích khối (mass analyzer) và

phát hiện (detector) nên bộ phận nạp mẫu cũng như nguồn ion hoá của GC/MS và LC/MS có

khác biệt:

− Với GC/MS, đầu ra của GC có thể được đưa trực tiếp vào nguồn ion hoá của khối phổ

kế và nguồn ion hoá được gắn liền với thiết bị phân tích khối. Giao diện kết nối giữa GC vào

MS tương đối đơn giản.

Sơ đồ khối cấu tạo thiết bị GC/MS-MS (kiểu tứ cực chập ba)

− Với LC/MS, đầu ra của LC là dòng dung môi pha động nếu đưa trực tiếp và toàn bộ

dòng dung môi vào khối phổ kế sẽ làm giảm chân không ảnh hưởng đến độ nhạy và vận hành

của thiết bị. Mặt khác, khi đó các ion có trong thành phần dòng dung môi dễ dàng va chạm

với các phân tử, nguyên tử trung hòa làm lệch hướng di chuyển, và bị bơm chân không của

khối phổ kế hút thải ra ngoài. Do vậy, quá trình nạp mẫu từ LC vào MS thường phải có các

giao diện ghép nối phù hợp (đai chuyển, chia dòng, phun sương,…). Một ghép nối LC/MS

cần có các đặc tính: Cho phép chuyển mẫu hiệu quả và chính xác từ LC sang MS mà không

làm phá hủy hay mất chất phân tích, loại bớt dung môi rửa giải, giảm pha loãng mẫu và làm

mất chất phân tích; cho phép nhiều lựa chọn phương pháp cho LC và điều kiện vận hành cho

MS; dễ dàng bảo dưỡng và vận hành; thời gian lưu của píc sắc kí đồng nhất và giảm thiểu tối

đa sự doãng píc. Với thiết bị LC/MS, bộ phận ion hoá sẽ được thiết kế phù hợp với giao diện

kết nối LC với MS và thường được đặt ở phía ngoài MS (vùng áp suất giảm). Dòng ion hình

thành ở nguồn ion đi vào thiết bị phân tích khối (vùng chân không) thông qua các hệ thống

mao quản kết nối.

Sơ đồ khối cấu tạo thiết bị LC/MS-MS (nguồn ion hoá kiểu ESI – kết nối phun sương)

Giao diện kết nối đai chuyển (moving belt) Giao diện kết nối chia dòng liên tục (nguồn ion FAB)

2.2. Nguồn ion hoá (ion source):

Ion hoá phân tử trung hoà thành các ion phân tử mang điện tích hoặc sự bắn phá, phân

mảnh phân tử trung hoà thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích bằng các phần tử mang

năng lượng cao. Những tiểu phân không bị ion hóa sẽ bị hút ra khỏi buồng ion qua bơm chân

không của thiết bị MS. Các ion phân tử tạo thành sẽ được tăng tốc độ và thu gọn (hội tụ).

Việc tăng tốc được thực hiện bởi một điện thế (2-10 kV), khi ra khỏi buồng ion hóa các

ion phân tử có tốc độ đạt cao nhất. Việc thu gọn thành chùm ion được thực hiện bởi một điện

trường phụ để khi vào phần phân tích khối (mass analyzer) là một dòng ion tập trung, đồng

nhất. Có nhiều loại nguồn ion hoá sử dụng các kỹ thuật ion hoá khác nhau được dùng trong

các máy GC/MS và LC/MS.

1. Kĩ thuật ion hóa va chạm điện tử (Electron Impact ionization): Trong nguồn ion

electron tạo ra từ một sợi dây tóc đèn được đốt nóng, sau đó được tăng tốc hướng tới anode và

va chạm với các phân tử khí của mẫu phân tích được tiêm vào nguồn ion. Nếu các electron có

đủ năng lượng, khi va chạm nó sẽ làm một electron của phân tử bị bắn ra theo phương trình:

R+ e- R.+ + 2e-. Các ion được hình thành sau khi va chạm sẽ đi qua một điện trường

khoảng 400 – 4000V để tăng tốc khi đi vào bộ phận phân tích khối. Tốc độ chuyển động của

các ion tỷ lệ với khối lượng của chúng. Trong kỹ thuật ion hoá va chạm điện tử, khí và các

mẫu có áp suất hóa hơi cao được nạp trực tiếp vào nguồn ion. Các mẫu lỏng hoặc rắn phải

được làm nóng để làm tăng áp suất hóa hơi.

Sơ đồ cấu tạo nguồn ion hoá kiểu va chạm điện tử

2. Kĩ thuật ion hóa hóa học (Chemical ionization): Trong nguồn ion hóa hóa học, các

ion được tạo ra thông qua sự va chạm của các phân tử chất phân tích với các ion sơ cấp (thuốc

thử) được cho vào nguồn ion. Trong nguồn ion, đầu tiên các electron sẽ ion hóa thuốc thử

(các phân tử H2, CH4, H2O, CH3OH, NH3, …) sau đó các ion của thuốc thử lại va chạm với

nhau và va chạm với phân tử trung hoà của chất cần phân tích tạo ra một môi trường ion hóa

qua một loạt các phản ứng. Cả hai dạng ion âm và dương của chất phân tích sẽ được tạo ra

thông qua các phản ứng hóa học với các ion trong môi trường này.

3. Kĩ thuật ion hóa điện trường (Field ionization): Là kĩ thuật sử dụng một điện trường

mạnh (8-12 kV) giữa hai điện cực để tạo ra các ion từ các phân tử pha khí. Các phân tử mẫu ở

pha khí tiến gần tới bề mặt điện cực có điện thế (+) cao. Khi điện trường ở bề mặt này đủ

mạnh (107-108 Vcm-1), một điện tử của phân tử mẫu sẽ chuyển vào điện cực, kết quả là tạo

thành cation gốc M+. Ion này bị điện cực đẩy về phía điện cực âm với một khe nhỏ để các ion

có thể đi vào bộ phận phân tích khối. FI là kĩ thuật ion hóa mềm, các ion có nội năng thấp nên

ít phân mảnh. Tuy nhiên do cần sử dụng nhiệt để hóa hơi mẫu nên kĩ thuật này tương tự EI,

CI là chỉ thích hợp với các hợp chất dễ bay hơi và bền với nhiệt.

Sơ đồ kĩ thuật ion hóa điện trường.

4. Kĩ thuật bắn phá nhanh nguyên tử (Fast Atom Bombardment): Trong kĩ thuật này,

một chùm tia sơ cấp các nguyên tử/ phân tử trung hòa hoặc ion được tập trung lên bề mặt mẫu

chứa hoạt chất cần phân tích (chất cần phân tích được hòa tan trong một nền là chất lỏng

không bay hơi). Khi chùm tia sơ cấp có năng lượng cao bắn vào bề mặt dung dịch mẫu sẽ đẩy

ra các ion từ dung dịch đi ra. Các ion được tăng tốc nhờ điện thế để đi vào bộ phận phân tích

khối. Kĩ thuật này không gây ra sự ion hóa mà chỉ đẩy các ion có sẵn trong dung dịch vào pha

khí.

Sơ đồ hình thành ion trong kỹ thuật FAB.

5. Kĩ thuật phản hấp thụ và ion hoá bằng tia laser: Là kĩ thuật hiệu quả để tạo các ion ở

pha khí. Các xung nhịp laser được tập trung trên bề mặt của mẫu (thường là rắn) gây chia cắt

bề mặt và tạo các tiểu plasma của ion và phân tử trung tính. Chúng sẽ phản ứng với nhau ở

pha hơi dày đặc gần bề mặt mẫu. Các xung laser vừa có tác dụng làm bay hơi mẫu vừa ion

hóa mẫu. Một trong những kỹ thuật phản hấp thụ và ion hoá bằng tia laser được ứng dụng

rỗng rãi trong nguồn ion hoá của các thiết bị là kĩ thuật MALDI (Matrix-assisted laser

desorption/ionization). Kĩ thuật ion hóa MALDI, được thực hiện qua 2 bước: Bước đầu tiên,

chất phân tích được hòa tan trong dung môi chứa dung dịch chất hữu cơ phân tử nhỏ, được

gọi là nền. Các phân tử đó phải hấp thụ mạnh ánh sáng laser. Hỗn hợp này được làm khô và

loại dung môi trước khi phân tích. Các phân tử chất phân tích được gắn vào nền để phân cách

các phân tử đó với nhau.

Sơ đồ hình thành ion trong kỹ thuật MALDI.

Bước thứ hai xảy ra dưới điều kiện chân không liên quan tới sự chia cắt các phần của dung

dịch rắn bởi cường độ xung nhịp laser trong thời gian ngắn. Việc chiếu laser làm nóng nhanh

chóng các tinh thể bởi sự tích tụ một lượng lớn năng lượng trong pha đặc thông qua sự kích

thích các phân tử nền. Làm nóng nhanh gây ra sự thăng hoa cục bộ của tinh thể nền, gây chia

cắt bề mặt tinh thể và sự phát triển của nền vào pha khí, vận chuyển chất phân tích nguyên

vẹn trong chùm nền. Phản ứng ion hóa có thể xảy ra dưới điều kiện chân không trong suốt quá

trình: ion hóa bằng ánh sáng trong pha khí, chuyển proton ở trạng thái kích thích, phản ứng

ion-phân tử,…Các ion được tạo thành sẽ được tăng tốc bởi trường tĩnh điện hướng tới chất

phân tích. Kỹ thuật MALDI ít gây phân mảnh và có khả năng giải hấp và ion hóa các phân tử

rất lớn tới 100.000 Da. Có thể tạo ra cả 2 dạng ion âm hoặc dương.

6. Kĩ thuật ion hóa phun sương điện (Electron Spray Ionization): ESI là một kỹ thuật

ion hóa được ứng dụng cho những hợp chất không bền nhiệt, phân cực, có khối lượng phân tử

lớn. ESI có khả năng tạo thành những ion đa điện tích (dương hoặc âm, tùy thuộc vào áp cực

điện thế), được xem là kỹ thuật ion hóa êm dịu hơn APCI, thích hợp cho phân tích các hợp

chất sinh học như protein, peptide, nucleotide… hoặc các polyme công nghiệp như polythylen

glycol. Trong ESI, tại đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện thế cao và sự hỗ trợ

của khí mang, mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang tích điện tại bề mặt. Khí ở

xung quanh các giọt này tạo nhiệt năng làm bay hơi dung môi ra khỏi giọt sương, khi đó, mật

độ điện tích tại bề mặt hạt sương gia tăng. Mật độ điện tích này tăng đến một điểm giới hạn

(giới hạn ổn định Rayleigh) để từ đó hạt sương phân chia thành những hạt nhỏ hơn vì lực đẩy

lúc này lớn hơn sức căng bề mặt. Quá trình này được lặp lại nhiều lần để hình thành những

hạt rất nhỏ. Từ những hạt rất nhỏ mang điện tích cao này, các ion phân tích được chuyển

thành thể khí bởi lực đẩy tĩnh điện sau rồi sau đó đi vào bộ phân tích khối. Trong kỹ thuật

ESI, phân tử nhất thiết phải được biến thành chất điện ly, tan trong dung dịch dùng để phun

sương. Điều này phụ thuộc vào: dung môi sử dụng, pKa của chất điện ly và pH của dung dịch.

Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI

7. Kĩ thuật ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI – Atmospheric pressure

chemical ionization): APCI dựa trên phản ứng ion-phân tử ở pha khí. APCI chủ yếu sử dụng

cho các chất phân cực hoặc không phân cực có khối lượng phân tử dưới 1500 Da và thường

tạo ion điện tích đơn. Chất phân tích trong dung dịch được đưa trực tiếp hoặc qua cột sắc ký

lỏng ở tốc độ 0,2-1,0 mL/phút vào bộ phận phun sương, tạo ra sương mỏng nhờ dòng khí

nitrogen tốc độ cao. Các giọt sương sau đó được làm nóng để loại dung môi và được chuyển

tới một điện cực phóng hồ quang (corona needle) để ion hóa. Tại đây có sự trao đổi proton để

biến thành ion dương [M+H]+ và trao đổi electron hoặc proton để biến thành ion âm [M–H]-.

Sau đó, các ion sẽ được đưa vào bộ phân tích khối. APCI là kỹ thuật ion hóa thường được sử

dụng để phân tích những hợp chất có độ phân cực trung bình, phân tử lượng nhỏ, dễ bay hơi.

Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn APCI

8. Kĩ thuật ion hóa ánh sáng ở áp suất khí quyển (APPI – Atmospheric Pressure

Photoionization): APPI sử dụng các photon để ion hóa các phân tử pha khí. Mẫu trong dung

dịch được bay hơi nhờ phun sương nhiệt, sau đó chất phân tích tương tác với các photon phát

ra từ một đèn. Các photon đó gây ra một loạt các phản ứng ở pha khí dẫn đến ion hóa mẫu.

Sơ đồ tạo ion bằng nguồn APPI

Các kỹ thuật ion hoá như EI, CI và FI thường được sử dụng trong các máy GC/MS; còn các

kỹ thuật FAB, MALDI, ESI, APCI thường được sử dụng trong các máy LC/MS.

2.3. Bộ phận phân tích khối (mass analyzer):

Các ion hình thành ở nguồn ion hoá có khối lượng m và điện tích z (tỷ số m/z được gọi

là số khối) sẽ đi vào bộ phận phân tích khối. Bộ phận phân tích khối được coi là quả tim của

máy khối phổ, có nhiệm vụ tách các ion có số khối m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt

nhờ tác dụng của từ trường, điện trường trước khi đến đến bộ phận phát hiện và xử lý số liệu.

Có thể phân bộ phân tích khối thành 4 loại: Bộ phân tích từ; bộ phân tích tứ cực; bộ

phân tích thời gian bay; bộ phân tích cộng hưởng ion cyclotron.

1. Bộ phân tích từ: Bao gồm thiết bị khối phổ hội tụ đơn (Single Focusing Magnetic

Deflection hay Sector mass analyser) và thiết bị khối phổ hội tụ kép (Double focusing

magnetic sector mass spectrometer hay double focusing sector field mass spectrometer).

Các ion tr ớc khi ra khỏi buồng ion hóa đã được tăng tốc nhờ một điện trường có thế U,

đi qua nam châm hình ống có từ trường H. Các ion sẽ chuyển động theo hình vòng cung bán

kính r trong từ tr ờng này. Với r:

Hz

mUr

2=

UrH

zm

2. 22

=

Vậy với giá trị U và H nhất định thì số khối m/z tỷ lệ với bán kính r. Từ biểu thức trên

nhận thấy các ion có m/z khác nhau sẽ được tách ra khỏi nhau do giá trị r của vòng cung

chuyển động của chúng khác nhau. Một máy hội tụ đơn thường có độ phân giải thấp (1000 –

5000) trong khi đó thiết bị khối phổ hội tụ thường có độ phân giải rất cao (10.000 – 100.000)

do bộ tách ion được thiết kế thêm 1 điện tr ờng bên cạnh từ tr ờng của nam châm. Các ion

tr ớc khi qua từ tr ờng hình quạt, sẽ đi qua 1 điện tr ờng tĩnh điện để tách biệt nhau một lần

nữa do vậy thiết bị khối phổ hội tụ kép có độ phân giải cao hơn so với thiết bị khối phổ hội tụ

đơn.

Sơ đồ cấu tạo và nguyên lý phân tách các ion của thiết bị phân tích khối hội tụ đơn.

22 frVK

zm =

Sơ đồ cấu tạo thiết bị phân tích khối hội tụ kép.

2. Bộ phân tích tứ cực: Bao gồm bộ phân tích tứ cực đơn, bộ phân tích tứ cực chập ba

và bẫy ion kiểu tứ cực.

*Bộ tứ cực (quadrupole): Gồm có 4 cực bằng kim loại đặt song song và sát nhau. Có một

khoảng không giữa 4 cực để các ion bay qua. Dòng điện một chiều (DC) và điện thế xoay

chiều cao tần được đặt vào từng cặp đối diện của tứ cực. Cả 2 trường đều không làm tăng tốc

dòng ion từ nguồn đi ra nhưng làm chúng dao động quanh trục trung tâm khi chuyển động và

chỉ các ion có số khối nhất định mới đến bộ phận phát hiện. Các ion đi vào trường tứ cực theo

hướng trục z đồng thời dao động theo hướng trục x, y dưới ảnh hưởng của một trường điện

tần số cao. Chỉ các dao động của các ion có m/z đặc biệt không tăng lên theo biên độ dao

động và có thể đi qua tâm tứ cực dọc theo trục. Các ion khác có biên độ dao động tăng sẽ va

đập vào thành các điện cực trước khi có thể vượt qua các điện cực đi vào detector. Phương

trình tổng quát của phổ tứ cực như sau:

Trong đó K: hằng số, V: điện áp tần số cao, r: khoảng cách 2 điện cực đối nhau, f: tần số dao

động ion. Bằng cách thay đổi tần số và thế của các cực, các ion có tỷ số m/z khác nhau có thể

vượt qua khoảng không để đến detector với khoảng thời gian khác nhau (các ion được tách

theo số khối của chúng).

Sơ đồ nguyên tắc phân tích khối của phổ kế tứ cực.

Độ phân giải phổ kế tứ cực thông th ờng đạt từ 500 – 1000, muốn nâng cao Rs, thường phải

nối 2 – 3 bộ tứ cực với nhau (Rs có thể đạt tới 20.000). Phổ khối tứ cực kiểu chập ba, gồm 3

bộ tứ cực nối tiếp nhau Q1, Q2 và Q3. Q1 sẽ tách các ion và lựa chọn một số ion ban đầu (ion

mẹ) đưa vào tứ cực Q2. Trong buồng Q2 với áp suất cao, ion mẹ bị phân mảnh do va chạm

với các khí trơ có mặt trong buồng như nitơ, agon, heli. Nhờ va chạm này năng lượng động

học của các ion chuyển thành nội năng nên chúng phân mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ hơn (ion

con). Các ion con mới hình thành được dẫn đến Q3 phân tích khối tách riêng và đến detector

Sơ đồ cấu tạo thiết bị phổ kế tứ cực kiểu chập ba.

*Bẫy ion tứ cực (ion trap): Hoạt động theo nguyên lý của bộ phân tích khối tứ cực, chỉ có một

điểm khác là các ion được lưu giữ và đưa dần ra khỏi bẫy. Các ion sau khi đi vào bẫy ion theo

một đường cong ổn định được bẫy lại cho đến khi một điện áp RF được đặt trên điện cực

vòng. Các ion trở nên không ổn định, dao động có hướng đi về phía detector. Do điện áp RF

khác nhau trong hệ thống này mà thu được một phổ khối lượng đầy đủ. Các ion tồn tại trong

bẫy có thể được chọn riêng và phân tích theo sự khác nhau về m/z, đồng thời có thể chọn

riêng và thực hiện quá trình bắn phá để thu đượccác mảnh ion con, từ đó thực hiện phân tích

theo m/z của ion con (khối phổ 2 lần).Về nguyên tắc các ion có thể tồn tại trong bẫy thời gian

đủ lâu có thể thực hiện đến MSn lần, tuy nhiên trong thực tế thường chỉ có khả năng thực hiện

đến khối phổ 3 lần.

Sơ đồ cấu tạo và phân tích khối của phổ kế bẫy ion.

3. Bộ phân tích thời gian bay (Time of flight): Các ion ra khỏi buồng ion hóa được gia

tốc nhờ thế 10-20 kV bay qua 1 ống phân tích (không có trường điện từ) có chiều dài đến 2m

của bộ phận phân tích khối. Phân tích thời gian bay dựa trên cơ sở gia tốc các ion tới detector

với cùng một năng lượng. Do các ion có cùng năng lượng nhưng lại khác nhau về khối lượng

nên thời gian đi tới detector sẽ khác nhau. Các ion nhỏ hơn sẽ đi tới detector nhanh hơn do có

vận tốc lớn hơn còn các ion lớn hơn sẽ đi chậm hơn, do vậy, thiết bị này được gọi là thiết bị

phân tích thời gian bay do tỉ số m/z được xác định bởi thời gian bay của các ion. Thời gian

bay của một ion tới detector phụ thuộc vào khối lượng, điện tích và năng lượng động học của

các ion. Độ phân giải của bộ phân tích thời gian bay thấp nhưng nó có ưu điểm là khối lượng

ion có thể phân tích không bị hạn chế. Để tăng độ phân giải của thiết bị có thể kéo dài thời

gian bay của ion (thiết bị W-TOF) hoặc ghép nối TOF với TripleQuad hoặc iontrap.

Sơ đồ nguyên tắc phân tích khối của phổ kế TOF.

Phổ kế TOF đơn và TOF kép (W-TOF, TOF độ phân giải cao).

4. Bộ phân tích cộng hưởng ion (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance mass

spectrometry): Các ion được giữ trong một buồng cộng hưởng dưới một từ trường mạnh ở

bên và một điện trường theo hướng trục. Giống như cộng hưởng từ hạt nhân, tất cả các ion

trong buồng được kích thích bởi một xung tần số radio băng rộng. Các ion sẽ hấp thu năng

lượng phù hợp để cộng hưởng. Các ion cùng loại khi hấp thu năng lượng (cộng hưởng)

chuyển động đồng nhất tạo ra một tần số nhất định phụ thuộc vào m/z. Tất cả các tần số của

các ion tạo ra sẽ được ghi nhận dưới dạng các dao động cảm ứng tự do tắt dần theo thời gian

và sau đó được biến đổi Fourier để trở thành dạng phổ khối truyền thống.

Thiết bị khối phổ FT-ICR và nguyên tắc phân tích khối.

2.4. Bộ phận phát hiện (detector):

Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân tích khối lượng, các ion được đưa tới phần cuối của

thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận phát hiện cho phép khối phổ tạo ra một tín

hiệu của các ion tương ứng từ các electron thứ cấp đã được khuếch đại hoặc tạo ra một dòng

do điện tích di chuyển. Có hai loại bộ phận phát hiện phổ biến: bộ phận phát hiện nhân

electron (electron multiplier) và bộ phận phát hiện nhân quang (photomultiplier). Bộ phận

phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến nhất, có độ nhạy cao. Các ion

đập vào bề mặt dinot làm bật ra các electron. Các electron thứ cấp sau đó được dẫn tới các

dinot tiếp theo và sẽ tạo ra electron thứ cấp nhiều hơn nữa, tạo thành dòng các electron. Bộ

phận phát hiện nhân quang cũng giống như thiết bị nhân electron, các ion ban đầu đập vào

một dinot tạo ra dòng các electron. Khác với detector nhân electron, các electron sau đó sẽ va

đập vào một màn chắn phospho và giải phóng ra các photon. Các photon này được phát hiện

bởi một bộ nhân quang hoạt động như thiết bị nhân electron. Ưu điểm của phương pháp này

là các ống nhân quang được đặt trong chân không nên loại bỏ được các khả năng nhiễm bẩn.

Sơ đồ hoạt động của detector electron multiplier (trái) và photomultiplier (phải)

3. Một số thông số đặc trưng của phổ khối lượng và ý nghĩa.

3.1. Phổ đồ:

Cách biểu diễn phổ khối lượng thông thường nhất là dùng các vạch thẳng đứng có độ

cao tỉ lệ với cường độ và có vị trí trên trục nằm ngang (trục hoành) tương ứng với tỉ số m/z

của mỗi ion. Cường độ chỉ ra trên trục thẳng đứng (trục tung) là cường độ tương đối. Thông

thường người ta chọn pic mạnh nhất làm pic cơ bản và quy cho nó có cường độ là 100/100.

Cường độ các pic khác được tính ra % so với pic cơ bản. Các pic được sắp xếp theo giá trị

m/z từ thấp đến cao, trên một số pic có thể ghi rõ giá trị m/z.

Phổ khối của ethyl benzen (MW = 106)

3.2. Độ phân giải của phổ khối:

Độ phân giải là khả năng tách 2 số khối liền nhau M và M + ΔM.

Độ phân giải R của MS được tính

theo công thức:

MMR

Δ=

Nếu R càng lớn thì M và M + ΔM càng gần nhau, nghĩa là nếu máy có R càng lớn thì có thể phân biệt các hạt có khối lượng càng gần nhau

Ví dụ : Với M = 28 có thể có bốn chất ứng với khối lượng M ≈ 28 là CO, C2H4 , N2 ,CH2N.

Giá trị chính xác của bốn hợp chất cho ở bảng dưới.

Công thức Khối lượng ΔM

CH2N 28.031300 0.012576

0.012576

0.011233

0.025152

0.036385

0.023809

C2H4 28.081724

N2 28.006148

CO 27.994915

Để phân biệt được hai tín hiệu của CH2N và CO thiết bị phải có độ phân giải:

770036385.0

28 ==Δ

=M

MR

Nhưng để phân biệt được hai tín hiệu của N2 và CO thiết bị cần phải có độ phân giải:

2493011233.0

28 ==Δ

=M

MR

Các thiết bị có R< 1000 là các thiết bị có độ phân giải thấp. Thiết bị có R > 10000 là các thiết

bị có độ phân giải cao. Tuỳ theo từng hãng, SOP thẩm định lắp đặt thiết bị với giá trị độ phân

giải thường được tiến hành trên một chất chuẩn có M nhất định và thường xác định độ phân

giải ở vị trí ½ chiều cao của píc

Trường hợp chỉ có 1 ion, R được xác định tại ½ chiều cao pic (FHHM) hoặc tại 5% chiều cao.

Xác định độ phân giải khi có xen phủ píc.

3.3. Độ chính xác phổ khối (mass accuracy):

Độ chính xác phổ khối là đại lượng đo mức độ chênh lệch giữa số khối thực nghiệm của phân

tử và khối lượng thực:

measuredreal mmm −=Δ

Độ chính xác của phổ khối thường được biểu thị bằng giá trị ppm:

measuredmmppm /106 Δ×=

Ví dụ: Khối lượng lý thuyết (theoretical mass) = 1000; khối lượng đo được (measured mass)

= 999.9 thì độ chính xác phổ khối hoặc độ sai lệch phổ khối (mass error) = 100ppm

Giá trị độ chính xác phổ khối có mối quan hệ với giá trị độ phân giải. Một thiết bị có độ phân

giải thấp thì không thể có độ chính xác phổ khối cao được.

Phổ khối của cùng một mẫu thử đo với thiết bị có độ phân giải thấp (trái) và độ phân giải cao (phải)

3.4. Phổ khối của các ion nguyên tử đồng vị:

Đa số các nguyên tố trong thiên nhiên gồm hỗn hợp nhiều đồng vị. Do đó các ion phân tử

ngoài tín hiệu của ion M+ còn có các ion phân tử có khối lượng [M-1]+, [M+1]+ , [M+2]+…

làm cho khối phổ có nhiều tín hiệu lân cận M+. Các nguyên tử đồng vị của một nguyên tố có

cùng số điện tích hạt nhân, chỉ khác nhau về số nơtron trong nhân do đó khác nhau về khối

lượng nguyên tử. Vì tính chất của các đồng vị tuyệt đối giống nhau, nên hàm lượng tương đối

các đồng vị của một nguyên tố trong các hợp chất hóa học cũng giống như bản thân nguyên tố

đó. Do vậy các nguyên tố tinh khiết như 19F, 31P, 127I trên phổ đồ chỉ có 1 vạch, nguyên tố C

(12C và 13C) trên phổ đồ có 1 vạch chính (tương ứng với 12C) sẽ có 1 vạch bên cạnh (m/z+1,

tương ứng với 13C), các nguyên tố Cl (35Cl và 17Cl), Br (79Br và 81Br) trên phổ đồ sẽ tồn tại 2

vạch cạnh nhau (m/z và m/z+2).

Phổ đồ của Benzen (vạch đồng vị Carbon) Phổ đồ của Benzyl chloride (vạch đồng vị Cl)

3.5. Phổ khối của các ion đa điện tích:

Thiết bị khối phổ hoạt động dựa trên đo tỷ số khối lượng chia điện tích (m/z). Phổ khối

thường được gán bởi mảnh đơn/1 điện tích. Tuy nhiên đối với một số hợp chất (các peptid,

protein…) và một số kỹ thuật ion hoá như ESI, laser… thì ion phân tử có thể mang nhiều điện

tích khi đó: mảnh khối ứng với điện tích đơn là M/z, mảnh khối ứng với điện tích đôi là

[M+1]/(z+1), với điện tích 3 là [M+2]/(z+2)…

Phổ đồ myoglobin tim ngựa

Xác định số khối tương ứng với các ion đa điện tích dựa vào: tính chất của chất cần phân tích

(nếu biết); đặc điểm của thiết bị khối phổ và kỹ thuật ion hoá; dựa vào các vạch phổ chính

trên phổ đồ và các vạch phổ đồng vị. Ví dụ, với trường hợp đơn điện tích thì vạch đồng vị của

C hơn kém nhau 1,0 amu, đối với trường hợp điện tích đôi vạch đồng vị của C sẽ hơn kém

nhau 0,5 amu.

4. Một số kỹ thuật ghi phổ

Phổ khối 1 lần (MS) và phổ khối nhiều lần (2 lần – MS/MS): Trong phân tích khổ phối,

việc xác định chính xác 1 ion (M+ hay các chất phân mảnh) rất quan trọng cho việc xác định

được hợp chất cần phân tích. Một hợp chất xác định trong những điều kiện nhất định sẽ cho 1

ion có số khối xác định trên phổ đồ. Tuy nhiên, một ion có số khối xác định trên phổ đồ lại có

thể xuất phát từ nhiều hợp chất khác nhau. Trong phân tích một hỗn hợp bằng phương pháp

sắc ký – khối phổ, nếu điều kiện sắc ký chưa đảm bảo việc phân tách thì việc nhận định các

ion thông qua số khối trên phổ đồ có thể bị ảnh hưởng. Đối với những trường hợp này, MS

một lần có thể cho kết quả không chính xác so với kỹ thuật khối phổ nhiều lần do có tính chọn

lọc khối cao hơn.

Giản đồ so sánh khối phổ 1 lần (MS) và khối phổ 2 lần (MS/MS)

Hình vẽ dưới là ví dụ cho thấy cần chất phân tích và tạp chất có cùng số khối (m/z = 325)

song có cơ chế phân mảnh khác nhau. Nếu phân tích bằng sắc ký – khối phổ 1 lần với điều

kiện sắc ký mà hai chất đồng rửa giải thì sẽ không xác định được phân biệt trên khối phổ 1 lần

(MS) chỉ có thể phân biệt được trên khối phổ 2 lần (MS/MS).

4.1. Quét toàn phổ (Full Scan)

Khi thao tác với chế độ scan, MS sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho phổ đồ toàn

ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích. Thường dùng để nhận danh hay phân

tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn. Đối với MS tứ cực chập ba, chế độ Full scan MS

thường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ, chế độ Full scan MS/MS quét tất cả các ion con tạo

thành thường được sử dụng để xác định ion con cho tín hiệu ổn định và bền nhất.

Cơ chế ghi phổ full scan MS của phổ kế tứ cực

Cơ chế ghi phổ full scan MS/MS của phổ kế tứ cực chập ba.

4.2. Selected Ion Monitoring (SIM)

Trong chế độ SIM, MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc trưng cho chất cần xác

định. Phổ đồ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựa chọn trước đó, do vậy không thể

dùng để nhận danh hay so sánh với các thư viện có sẵn. Đối với MS tứ cực chập ba, chế độ

SIM thường được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ.

Cơ chế ghi phổ SIM của phổ kế tứ cực.

4.3. SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction Monitoring)

Đối với MS tứ cực chập ba, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS/MS), 2 kỹ thuật ghi phổ

MS/MS có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM.

+ SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh ion sinh

ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện.

+ MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi lượng nên các

ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ MRM thông dụng hơn

SRM. Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ

cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con

cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện.

Cơ chế ghi phổ SRM của phổ kế tứ cực chập ba.

5. Một số ứng dụng cơ bản của phương pháp khối phổ

5.1. Xác định khối lượng nguyên tử và khối lượng phân tử

* Xác định nguyên tử các đồng vị: Phổ khối lượng ban đầu được dùng để xác định khối lượng

nguyên tử của các đồng vị. Dùng máy phổ khối lượng người ta xác định được không những

khối lượng mà cả hàm lượng % của các đồng vị. Đại đa số các đồng vị đã được tìm ra và được

xác định bằng phương pháp phổ khối lượng. Ví dụ: Khi khảo sát khí xenon bằng phương pháp

phổ khối lượng ta tìm được 9 đồng vị với hàm lượng tự nhiên giảm dần theo trật tự sau: 123Xe, 129Xe, 131Xe, 134Xe, 136Xe, 130Xe, 128Xe, 124Xe, 126Xe.

* Xác định khối lượng phân tử: Nếu ion phân tử tạo ra mà đủ bền thì khối lượng phân tử được

xác định trực tiếp từ các pic có giá trị m/z cao nhất và có cường độ không phụ thuộc vào áp

suất. Có những trường hợp mà khối lượng phân tử không thể xác định được bằng các phương

pháp thông thường (do đặc điểm của chất, hoặc do lượng chất quá ít...) thì phương pháp phổ

khối lượng là giải pháp tối ưu. Ví dụ nhờ có pic ion phân tử trong phổ khối lượng người ta đã

xác định được Fe(CO)4(CF2CF2CF2CF2) không ở dạng polime mà là monome với M=368u.

Đối với trường hợp hợp chất không đủ bền, bằng cách sử dụng các kỹ thuật ion hoá khác

nhau, ion hoá mềm, giảm năng lượng ion hoá và phân rã người ta cũng có thể xác định được

khối lượng phân tử trong một số trường hợp.

5.2. Xét đoán cấu trúc phân tử

Phân tích khối phổ có thể cho rất chính xác khối lượng các ion phân tử M+ và khối

lượng các mảnh ion. Bên cạnh cũng xác định được đó xem xét thêm các pic đồng vị [M+1]+,

[M+2]+ và tỷ số cường độ của chúng cùng so với M. Đồng thời thông qua phân tích phổ cũng

xác định được hiệu số khối lượng của ion phân tử và các mảnh ion cũng như thế hiệu xuất

hiện các mảnh ion. Từ các thông tin này có thể xác định được công thức nguyên của chất

phân tích. Sau khi phân tích định tính công thức nguyên của chất phân tích cần phải tiếp tục

nghiên cứu kỹ hơn phổ khối và kết hợp với phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phổ IR,… để xác

định công thức cấu tạo của chất phân tích.

Một số ví dụ, nguyên tắc xét đoán công thức nguyên dựa vào phổ khối lượng:

- Nếu gặp pic [M+1]+ có cường độ bằng 3,3% cường độ của M+ thì ta có thể suy đoán

trong phân tử có 3 nguyên tử C, ion [M+1]+ do sự đóng góp của 13C, vì hàm lượng của 13C trong tự nhiên là 1,1% và cường độ của pic [M+1]+ gần bằng n.1,1% (nếu số C

trong hợp chất là n).

- Nếu trên phổ đồ có các pic m/z = 94 và m/z = 96 có cường độ gần bằng nhau, ta có thể

nghĩ các pic này tương ứng với phân tử CH3Br vì 79Br (50,54%), 81Br(49,96%).

Ví dụ: Quá trình xét đoán công thức nguyên của chất cần phân tích dựa trên khối phổ

5.3. Ứng dụng của phương pháp khối phổ trong kiểm nghiệm thuốc

Đặc tính nổi bật của khối phổ là tính chọn lọc và độ nhạy cao. Vì vậy mà khối phổ

thường được sử dụng để xác định lượng siêu vết trong mẫu có thành phần phức tạp như định

tính, định lượng thuốc và các chất chuyển hoá trong dịch sinh học, độc chất học; định lượng

dư lượng thuốc trừ sâu, chất bảo quản, chất cấm trong các mẫu thực phẩm, mỹ phẩm, dược

liệu, thuỷ hải sản và môi trường…

- Định tính: Tiến hành so sánh phổ của chất cần phân tích so với phổ chuẩn trong thư

viện phổ hoặc so với phổ của chất chuẩn.

- Định lượng: Dựa vào tương quan đáp ứng của mẫu thử so với đáp ứng của mẫu chuẩn

đã biết nồng độ.

Ngoài ra, phương pháp khối phổ còn có thể được sử dụng để xác định mức độ tinh

khiết của chất chuẩn hoặc mẫu chất cần phân tích.

5.4. Ứng dụng của phương pháp khối phổ trong công nghệ sinh học

* Peptid Mass Fingerprinting (PMF):

Cả ba protein 1, 2, 3 đều có cùng số khối (m/z = 4842.5) nhưng có trật tự sắp xếp các acid

amin khác nhau. Do vậy khi sử dụng các emzym cắt phù hợp hoặc sử dụng năng lượng phân

mảnh phù hợp các protein này sẽ phân mảnh thành các ion con có số khối khác nhau đặc

trưng cho mỗi chất, do vậy thông qua phổ khối có thể nhận dạng và định danh được từng

protein.

* Proteomic và Peptid Sequencing:

6. Xây dựng phương pháp LC/MS với thiết bị khối khổ kiểu tứ cực chập ba (TSQ)

Để định tính, định lượng thuốc trong dịch sinh học, trong mẫu độc chất, cũng như xác

định dư lượng chất cấm trong các mẫu thuỷ hải sản, thực phẩm, dược liệu và môi trường, các

phòng thí nghiệm thường sử dụng thiết bị TSQ với nguồn ion hoá kiểu API (Ion hóa áp suất

thường năng lượng thấp - Atmospheric Pressure ionization - low energy) ghép nối với thiết bị

HPLC hoặc UPLC do một số ưu điểm sau:

GC-MS:

• Hợp chất bay hơi;

• Lưu lượng khí 1-5mL/min;

• Phân cực thấp;

• Nguồn ion háo năng lượng cao (va chạm điện tử Electron Impact ionization - EI, gây

phân mảnh tại nguồn ion).

LC-MS:

• Hợp chất không bay hơi không bền nhiệt;

• Phân cực trung bình đến cao;

• Tốc độ dòng 1mL/min (tương ứng lưu lượng khí 1.000mL/min);

• Ion hóa áp suất thường năng lượng thấp (ion hoá mềm, không gây phân mảnh tại

nguồn ion) thường sử dụng nguồn ESI hoặc APCI.

Phạm vi ứng dụng của GC và LC và các nguồn ion hoá.

Do đặc điểm của ghép nối LC và MS, dòng ra của LC không được kết nối trực tiếp

vào MS mà thông qua bộ giao diện và nguồn ion hoá, do vậy việc sử dụng điều kiện sắc ký và

nguồn ion hoá phụ hợp cho hiệu suất ion hoá cao, vừa có tác dụng loại bỏ tạp chất, không làm

pha loãng mẫu cũng như chuyển lượng mẫu tối đa và MS sẽ quyết định rất nhiều đến độ đặc

hiệu đặc biệt là độ nhạy của thiết bị và phương pháp.

- Khi kết nối LC - MS xây dựng các điều kiện HPLC cần lưu ý các điểm sau:

o Dung môi pha động không chứa các thành phần đệm vô cơ; chỉ chứa các thành

phần đệm dễ bay hơi, có sức căng bề mặt thấp.

o Tốc độ dòng pha động để ở mức tối ưu nhỏ nhất nếu có thể. Tốc độ dòng pha

động càng cao, thì tốc độ khí cung cấp cho nguồn ion hoá để bay hơi dung môi

càng phải lớn ảnh hưởng đến khả năng chuyển mẫu vào MS (quá trình

chuyển mẫu vào MS đối với nguồn ion hoá phun sương chủ yếu thực hiện theo

nguyên tắc chênh lệch áp suất)

o Tỉ lệ nước, các chất trong pha động càng cao, thì cần thiết phải cung cấp nhiệt

cho nguồn ion hoá để hỗ trợ quá trình bay hơi dung môi.

o Đối với các mẫu phức tạp có thể ra hiện tượng suy giảm hiệu suất ion hoá của

nguồn ion (ion suppression – matrix effect) của các tạp chất đồng rửa giải. Do

vậy, nên lựa chọn được các điều kiện sắc ký có thể phân tách chất đồng rửa

giải gây ảnh hưởng nếu có.

- Lựa chọn nguồn kiểu nguồn ion hoá cần căn cứ vào các đặc điểm như:

o Khối lượng, mức độ phân cực khả năng ion hoá, khả năng solvat hoá, tạo cặp

ion, …của chất cần phân tích (phân tử lượng lớn, độ phân cực cao nên lựa

chọn nguồn ESI, phân tử lượng nhỏ, độ phân cực trung bình có thể lựa chọn

nguồn APCI);

o Đặc điểm của dung môi pha động: Lực ion, sức căng bề mặt, khả năng bay hơi

của pha động, pH, thành phần tỷ lệ của pha động, tỷ lệ của nước trong pha

động, tốc độ dòng pha động,…

- Lựa chọn kiểu khối phổ MS hoặc MS-MS: Căn cứ vào đặc điểm của hoạt chất cần

phân tích, phương pháp xử lý mẫu và nền mẫu, yêu cầu định tính hay định lượng.

* Các thông số cần tối ưu hoá đối với phương pháp LC-MS:

- Nguồn ion hoá:

+ Thế ion hoá;

+ Tốc độ khí của nguồn ion hoá (khí mang, khí bổ trợ, khí làm sạch nguồn);

+ Nhiệt độ của nguồn ion hoá.

- Nhiệt độ mao quản chuyển ion hoá;

- Thế của bộ phận hội tụ nguồn ion;

- Ion ban đầu (mảnh mẹ);

- Năng lượng để phân mảnh ion mẹ tạo thành ion con.

- Ảnh hưởng của nền mẫu.

B. Thực hành

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AMLODIPIN TRONG DỊCH SINH

HỌC BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC-MS/MS.

1. Thực hành quy trình tối ưu hoá các điều kiện sắc ký - khối phổ cho hoạt chất Amlodipin

và nội chuẩn.

2. Tiến hành phân tích các mẫu chuẩn amlodipin trong huyết tương người bằng phương

pháp HPLC-MS/MS (dựng đường tuyến tính, đánh giá độ đúng, độ chính xác trong

ngày).

QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

Điều kiện sắc ký:

Thiết bị phân tích: Thermo, VKN/TĐSH/53.02

Cột sắc ký: EC 50/2 nuclodur C18. Bảo vệ cột: Rp18, 4 x 3mm

Tốc độ dòng: 0,4 mL/p

Pha động: MeCN: MeOH: 2-propanol: CH3COONH4

Thể tích tiêm: 10 µL

Detector: TSQ quantum ultra

Nội chuẩn Felodipin gốc: Cân chính xác khoảng 25 mg Felodipine, hoà tan trong 100 mL

MeOH (A).Hút 1 mL (A)/50 mL MeOH : H2O (1:1) (B). Hút 1 mL (B)/20 mL MeOH : H2O

(1:1).

Chuẩn Amlodipine gốc: Cân chính xác khoảng 35 mg Amlodipine besilat, hòa tan trong 100

mL MeOH (A).

Dung dịch chuẩn làm việc: Hút 1 mL (A)/ 50 mL MeOH : H2O (1:1) (B). Hút 2 mL (B)/

100mL H2O (100ng/mL).

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn trong nước

Mẫu Blank Zero S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8

Nồng độ (ng/mL)

1 2 5 10 20 50 75 100

V HT trắng (mL)

0 0 1 1 1 2 4 10 15 (-)

Vbình (mL)

0 0 100 50 20 20 20 20 20

Chuẩn bị mẫu kiểm tra trong nước

Chuẩn bị tương tự như mẫu chuẩn làm việc để có được dung dịch WSQC có nồng độ

Amlodipine khoảng 100 ng/mL H2O.

Mẫu LQC MQC HQC

Nồng độ (ng/mL) 3 40 80

VWSQC (mL) 3 8 16

Vbình (mL) 100 20 20

Chuẩn bị đường chuẩn và mẫu kiểm tra QC trong HT: Phối hợp dung dịch chuẩn và mẫu

QC trong nước với HT theo tỷ lệ 1 : 9

Xử lý mẫu:

1mL HT + 100µL IS. Lắc xoáy 5s. Thêm 0,5mL NH3 0,1M. Lắc xoáy 15s. Thêm 6,5 mL

dung môi diethylether: cloroform (7:3). Lắc cơ học 10 phút. Ly tâm 4000 vòng/phút x 5 phút.

Hút 5mL dung môi cô N2. Hòa tan cắn trong 0,3 mL pha động rồi tiêm sắc ký.