YÊU CẦU PTN VI SINH THEO GLP

Trong quá trình hội nhập toàn cầu lĩnh vực dược phẩm, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) có một loạt các hướng dẫn GP (good practice) cho hệ thống sản xuất, kiểm soát chất lượng, bảo quản và phân phối thuốc. Đây là một trong những tài liệu cơ bản giúp các doanh nghiệp sản xuất và kinh doanh dược phẩm Việt Nam đảm bảo chất lượng thuốc tới tận tay người sử dụng.

Để nâng cấp và hoàn thiện hệ thống đảm bảo chất lượng thuốc của mình, các nhà máy dược phẩm đạt GMP (Thực hành tốt sản xuất thuốc) cũng đồng thời phải có được một hệ thống giám sát, kiểm tra chất lượng thuốc theo tiêu chuẩn GLP của WHO (Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm).

Trong phạm vi bài giảng này, chúng tôi xin giới thiệu những yêu cầu riêng đặt ra theo tiêu chuẩn GLP WHO cho một phòng (bộ phận) kiểm nghiệm Vi sinh, một lĩnh vực tương đối riêng trong hệ thống PTN.

I. Tổ chức - nhân sự - đào tạo

- Cán bộ phải có trình độ thích hợp (tốt nghiệp chuyên ngành như Dược hoặc Sinh), được đào tạo hoặc có kinh nghiệm về các phép thử có liên quan.

- Họ cũng cần được đào tạo để hiểu và nắm rõ các các tiêu chuẩn quy định, công nghệ sản xuất ra sản phẩm thử nghiệm.

- Nội dung đào tạo cần lưu ý:

Nhân viên phải được huấn luyện đầy đủ kể cả các kỹ thuật vi sinh căn bản.

Quá trình đào tạo phải thường xuyên cập nhật theo những yêu cầu mới hay bổ sung.

Phải xây dựng kế hoạch tái huấn luyện theo định kỳ hay khi thay đổi qui trình

Hồ sơ huấn luyện phải được lưu trữ

- Hàng năm, phải tổ chức đánh giá tay nghề KNV và đăng ký các chương trình TNTT liên phòng để đảm bảo chất lượng kết quả thử nghiệm.

II. Nhà xưởng và kiểm soát chất lượng môi trường

Ngoài việc phải đáp ứng các yêu cầu của một PTN, do tính chất riêng biệt của các thử nghiệm vi sinh, một số yêu cầu bổ sung được đưa ra như sau:

- Không gian cần được thiết kế đủ rộng cho làm việc và làm vệ sinh.- Bố trí mặt bằng PTN vi sinh phải phân biệt nơi nhận và bảo quản mẫu,

khu vực tắm rửa, nơi chuẩn bị môi trường nuôi cấy, khu vực thử nghiệm, khu vực bảo quản chủng vi sinh, nơi đọc kết quả, khử trùng, hủy mẫu.

- Việc phân chia và xác định các khu vực cho từng công việc thử nghiệm phải kiểm soát được khả năng nhiễm chéo. Chiều đi của mẫu thử cần tuân theo nguyên tắc 1 chiều (no way back), nghĩa là phải thiết kế các khu vực từ ngoài vào trong được phân bố theo sự tăng dần cấp độ sạch và có đường ra riêng, không trùng lắp với đường vô. Trường hợp tạm thời chưa đáp ứng được nguyên tắc trên, PTN cần có qui định, thực hiện và lưu hồ sơ chứng minh mẫu không bị nhiễm bẩn.

- Không di dời thiết bị giữa các vùng để tránh nhiễm chéo.

- Khu vực làm việc phải có thông gió và kiểm soát nhiệt độ phù hợp. Có thể dùng máy lạnh nhưng phải có lọc thích hợp. Giảm thiểu việc mở cửa sổ và cửa phòng khi thử nghiệm.

- Nguồn ánh sáng nên được cung cấp từ bên ngoài. Nếu không thể thiết kế bên ngoài thì phải thiết kế sao cho dễ làm vệ sinh.

- Màn sáo che nắng cũng nên đặt bên ngoài cửa, tránh ở trong sẽ gây tích lũy bụi và nhiễm bẩn.

- Cần phân tách khu vực thử nghiệm riêng cho từng thử nghiệm cơ bản (ví dụ: xác định hoạt lực kháng sinh, xác định giới hạn nhiễm khuẩn, thử nghiệm độ vô trùng…). Khu vực tắm rửa (sau khi đã thực hiện khử nhiễm) có thể sử dụng chung với các vùng khác nhưng phải có sự phòng ngừa cần thiết để tránh sự tiếp xúc các hóa chất gây ảnh hưởng lên sự phát triển của vi sinh vật.

- Các bàn, ghế trong phòng thử nghiệm, tủ và giá và tất cả các mặt bằng thử nghiệm (sàn, trần nhà, tường và cửa sổ) phải hạn chế tối đa sự nhiễm bẩn, không thấm nước, bề mặt phải dễ lau chùi và sát khuẩn.(Phủ kín và vo tròn các điểm nối).

- Có bồn rửa tay riêng cho từng phòng thí nghiệm, nên dùng loại vòi nước tắt mở tự động.

Người ta đã thống kê và xác định các nguồn gây nhiễm môi trường không khí như sau:

- Do con người : 75%- Do hệ thống cấp khí : 15%- Cấu trúc, bố trí thiết bị : 5%- Thiết bị : 5%

Vì thế, song song với việc thiết kế nhà xưởng như vậy, cần có các biện pháp để kiểm soát và duy trì độ sạch của PTN, nhằm đảm bảo chất lượng của các kết quả thử nghiệm vi sinh.

Yêu cầu về cấp độ sạch của các khu vực trong PTN vi sinh, phụ thuộc vào tính chất của phép thử nghiệm. Ví dụ như bảng sau:

Bảng 1: Yêu cầu về cấp sạch theo phép thử

Phép thử Cấp sạch

Thử vô khuẩn A trong B/C

Thử Giới hạn nhiễm khuẩn A trong D

Hoạt lực kháng sinh D

Các cấp sạch được quy định theo số lượng các tiểu phân bụi, tiểu phân vi sinh có mặt trong môi trường và phương pháp lấy mẫu kiểm soát môi trường.

Bảng 2 : Phân loại cấp độ sạch theo tiểu phân bụi

Cấp sạch Số lượng tiểu phân theo kích cỡ (tiểu phân/m3)

US 209E

ISO WHO/EC 0,1 µm 0,2 µm 0,3 µm 0,5 µm 1 µm 5 µm

N/A 1 10 2N/A 2 100 24 10 41 3 1 000 237 102 35 8

10 4 10 000 2 370 1 020 352 83100 5 A,B 100 000 23 700 10 200 3 520 832 291 000 6 1 000

000237 000

102 000

35 200 8 320 293

10 000 7 C 352 000 83 200 2 930100 000

8 D 3 520 000 832 000 29 300

N/A 9 35 200 000 8 320 000 293 000

Bảng 3: Phân loại cấp độ sạch theo giới hạn tiểu phân vi sinh (GMP EU-WHO)

Giới hạn tiểu phân vi sinh

Grade air sample cfu/m3

settle plates (diameter 90 mm)

cfu/4 hours

contact plates (diameter 55 mm)

cfu/plate

glove print 5 fingers cfu/glove

A < 1 < 1 < 1 < 1 B 10 5 5 5 C 100 50 25 -D 200 100 50 -

Để đảm bảo môi trường thử nghiệm có độ sạch như mong muốn, phải xây dựng quy trình làm vệ sinh phòng ốc, trong đó đề cập tới cả tần số làm vệ sinh định kỳ và trường hợp có sự cố, đồng thời thực hiện tốt sự giám sát chất lượng môi trường.

Điều đầu tiên của việc giám sát chất lượng môi trường là xây dựng một chương trình hành động rõ ràng, chi tiết thể hiện qua các thủ tục, quy trình và hướng dẫn công việc mà nội dung cần thể hiện:

- Các yếu tố cần giám sát, kiểm tra.- Kế hoạch và tần số lấy mẫu đối với từng yếu tố.- Phương pháp lấy mẫu, thiết bị sử dụng, phương pháp kiểm nghiệm sau

khi lấy mẫu và tiêu chuẩn chấp nhận.- Cách thức thiết lập giới hạn cảnh báo, giới hạn hành động, cách thức

phân tích xu hướng và các biện pháp xử lý thích hợp. - Công tác đào tạo, huấn luyện nhân viên.

Trong đó, các yếu tố chính cần kiểm soát là:

- các tiểu phân bụi trong không khí.- các tiểu phân vi sinh:

trong không khí.

trên bề mặt (nhà xưởng, phòng ốc, bàn làm việc, máy móc trang thiết bị có khả năng ảnh hưởng đến kết quả kiểm nghiệm).

ở tay, găng tay, trang phục của nhân viên.

Ngoài ra, có thể cần đánh giá một số chỉ tiêu khác như:

- nhiệt độ, độ ẩm.- tốc độ gió/ sự trao đổi khí.

- sự chênh lệch áp suất giữa các khu vực có cấp độ sạch khác nhau.

Tần số kiểm tra, giám sát phụ thuộc vào:

Yêu cầu về cấp sạch của khu vực Nguy cơ nhiễm bẩn tại vị trí cần kiểm tra.

Bản chất của qui trình kiểm nghiệm, của mẫu cần kiểm tra.

Bảng 4: Phương pháp và tần số kiểm soát các yếu tố môi trường

Yếu tố Thiết bị - phương pháp

Tần số Ghi chú

Tiểu phân bụi Máy đếm tiểu phân không khí (air borne particle)

A, B: 6 tháng

C, D: 12 tháng

Lấy mẫu động

Lấy mẫu tĩnh

Không khí Đặt hộpA, B: mỗi lần làm việc

C, D: 6 thángThiết bị lấy mẫu (air sample)

Bề mặt Hộp RODAC Bề mặt phẳng

Swab Bề mặt ghồ ghề

Rửa ngâm Chai lọ, đồ đựng

Tiể u

Găng tay Đĩa petri có TSA Nhân viên

Nhiệt độ, độ ẩm Nhiệt ẩm kế Hàng ngày25 ± 5 oC; ẩm ≤ 75%.

Tốc

độ

gió

/ tra

o đổ

i khí LAF Thiết bị đo tốc độ gió 6 tháng

LAF ngang: 0,45 m/sLAF dọc: 0,3 m/s

Phòng 12 tháng

Chênh áp Áp kế 12 tháng 10 – 15 Pa

Kế hoạch và vị trí lấy mẫu

Phải xác định vị trí lấy mẫu ngay từ khi khu vực có yêu cầu kiểm soát được đưa vào hoạt động. Các vị trí lấy mẫu nàu phải được thể hiện cụ thể trên sơ đồ và có đánh số/dấu. Số vị trí lấy mẫu được thiết lập tùy thuộc vào diện tích khu vực cần lấy mẫu, cách bố trí trang thiết bị và cửa của từng khu vực. Việc xác định vị trí lấy mẫu phải được xác định theo nguyên tắc:

- Ưu tiên chọn các vị trí mà không khí có tiếp xúc với các sản phẩm hở, gọi là khu vực có nguy cơ cao và vùng phụ cận.

- Ưu tiên chọn những vị trí có khả năng nhiễm bẩn cao nhất trong khu vực cần giám sát như khu vực bên trong hay xung quanh những khu vực mà hoạt động sản xuất hay kiểm nghiệm diễn ra với cường độ cao nhất.

- Đối với các khu vực sạch cần cấp khí, cần phải kiểm tra các vị trí có tốc độ trao đổi khí thấp nhất hay nơi mà không khí bị xáo trộn nhiều nhất như cửa ra vào, hộp chuyển dụng cụ. cửa thoát hay hồi lưu không khí, giữa 2 lọc HEPA, các góc phòng…

Bảng 5: Ví dụ về vị trí lấy mẫu

Hệ thống Vị trí lấy mẫu

Các khu vực có hệ thống cấp khí Góc phòng, cửa, cửa thoát

Phòng/ bàn làm việc Tại vị trí công việc thực hiện nhiều

nhất

Nước Tại vòi/nơi sử dụng

Bề mặt (nhà xưởng, PTN) Sàn nhà, tay nắm cửa, tường

Bề mặt (thiết bị) Đường dẫn nguyên liệu, bảng điều

khiển

Máy nén khí Nơi xa nhất của máy nén khí

LAF, BSC Ngay vị trí làm việc

Người vận hành Trang phục, bàn tay

III. Phương pháp thử

Các phương pháp thử thường sử dụng trong phòng thí nghiệm vi sinh vật:

- Phương pháp tiêu chuẩn: Dược điển, của các Hiệp hội khoa học có uy tín (như AOAC, APHA, BAM...)

- Phương pháp đăng tải trên các tạp chí khoa học

- Phương pháp của các nhà sản xuất

- Phương pháp do phòng thí nghiệm tự biên soạn

Đối với các phương pháp thử tiêu chuẩn, chúng ta chỉ cần thẩm định một vài thông số chính trước khi đưa vào sử dụng. Khi sử dụng cần thường xuyên cập nhật và bổ sung theo các văn bản mới nhất.

Nhưng đối với các phương pháp thử đăng tải trên tạp chí khoa học hay tự biên soạn (còn gọi là phương pháp thử nội bộ) cần thẩm định toàn bộ các thông số trước khi sử dụng và lưu ý quy trình thẩm định này có những điểm khác biệt so với các phép thử hóa lý.

Tài liệu thử phải luôn luôn có sẵn ở gần vị trí làm việc để tiện tham khảo.

Những yêu cầu riêng trong phép thử vi sinh cần lưu ý:

- Yếu tố kiểm soát môi trường cần được đưa vào test slips.- Luôn cần mẫu chứng âm và chứng dương

- Cách trả lời kết quả với chỉ tiêu “không được có vi sinh vật gây bệnh X/ 1 g mẫu” sẽ là: phát hiện/ không phát hiện hoặc tìm thấy/ không tìm thấy vi sinh vật X/ 1 g mẫu (không trả lời là “âm tính”)

- Cách trả lời kết quả với chỉ tiêu định lượng vi sinh vật:

Phương pháp plate count: ở nồng độ pha loãng đầu tiên (10 -1), số khuẩn lạc đếm được là 0 thì trả lời sẽ là < 10 cfu/g.

Phương pháp MPN: trả lời là 50 MPN vi sinh vật X/ g hoặc mL mẫu (không viết 50 cfu)

IV. Thiết bị

Thiết bị của PTN vi sinh cũng được quản lý tương tự như các thiết bị của PTN khác. Tuy nhiên, do đặc thù công việc, PTN vi sinh sẽ có một số thiết bị chuyên dụng. Dưới đây là một số lưu ý về quản lý thiết bị - dụng cụ trong PTN Vi sinh:

- Tủ cấy vô trùng (Laminar Air Flow- LAF)/ Tủ an toàn sinh học (Bio Safety Cabinet-BSC): Phải đạt cấp sạch A và phải được kiểm tra hiệu chuẩn định kỳ theo phần kiểm tra giám sát chất lượng môi trường: kiểm tra số tiểu phân bụi, số tiểu phân vi sinh, tốc độ gió, thẩm định màng lọc (nếu có thể). Thay lọc HEPA khi tốc độ gió giảm (nghẹt màng lọc) hoặc khi thẩm định màng lọc không đạt yêu cầu.

- Tủ ấm ổn nhiệt: Tùy vào mục đích sử dụng mà chọn tủ có độ chính xác khác nhau. Tủ dùng trong xác định hoạt lực kháng sinh và vitamin bằng phương pháp vi sinh thường có yêu cầu cao về độ chính xác và độ đồng đều nhiệt độ (0,10C - 0,50C). Cần chú ý độ phẳng của các khay chứa trong tủ khi thử nghiệm hoạt lực kháng sinh. Tủ ấm phải được kiểm tra, hiệu chuẩn định kỳ về độ chính xác, độ đồng đều nhiệt độ.

- Nồi hấp: Dùng để hấp tiệt trùng môi trường và dụng cụ trong và sau thử nghiệm. Nồi hấp phải được kiểm tra khả năng tiệt trùng, kiểm tra đồng hồ áp suất và độ an toàn của vỏ nồi định kỳ theo quy định của Nhà nước.

- Thiết bị đếm khuẩn lạc: Tùy theo nguyên tắc của thiết bị mà đề ra những yêu cầu cho từng thiết bị. Ví dụ như nếu là thiết bị đếm khuẩn lạc tự động thì phải có hiệu chuẩn, kiểm tra định kỳ và phải thẩm định phần mềm đếm khuẩn lạc.

- Thiết bị đo đường kính vòng vô khuẩn: Phải định kỳ kiểm tra, hiệu chuẩn và tính độ không đảm bảo đo của thước. Nếu thiết bị có bao gồm phần thiết kế thí nghiệm và tính kết quả thì phải tiến hành thẩm định cả phần này.

- Thiết bị đếm tiểu phân không khí: Định kỳ kiểm tra hiệu chuẩn đầu dò, zero test, tốc độ dòng…

Đối với dụng cụ của PTN vi sinh, cũng cần chú ý những điểm sau:

- Các dụng cụ phải đảm bảo “độ sạch” theo yêu cầu của từng phép thử.- Hộp petri: Tùy theo mục đích sử dụng mà chọn loại có đường kính và

chiều cao thích hợp.

- Các phương pháp sử dụng để tiệt trùng các dụng cụ chính xác phải không gây ảnh hưởng đến độ chính xác của dụng cụ.

- Các loại kéo, kẹp gắp, đục lỗ thạch: Phải chịu được nhiệt và các chất tẩy rửa.

- Thước kẹp (tối thiểu để đo đường kính vòng vô khuẩn nếu như không có những thiết bị khác): Phải được định kỳ kiểm tra/hiệu chuẩn để tính độ không đảm bảo đo.

- Khay đựng mẫu hoạt lực kháng sinh phải đảm bảo phẳng.

V. Thuốc thử - chất đối chiếu

Dung môi, hóa chất, thuốc thử:

- Tuân thủ chung các nguyên tắc về bảo quản, sử dụng dung môi hóa chất. Tuy nhiên, đối với một số hóa chất và thuốc nhuộm dùng để kiểm tra tính chất sinh hóa của chủng vi sinh, trước khi sử dụng phải kiểm tra với ít nhất một chủng cho phản ứng âm tính và một chủng cho phản ứng dương

tính theo từng lô thuốc thử - khi mới mua/mới pha và trong quá trình sử dụng.

- Vi sinh vật dùng để kiểm tra thuốc thử phải được nối chuẩn từ chủng đối chiếu do các bảo tàng giống quốc tế hay quốc gia có uy tín cung cấp.

Môi trường nuôi cấy:

- Phải có khu vực bảo quản môi trường đông khô và môi trường đã pha chế. Điều kiện bảo quản môi trường thường theo hướng dẫn của nhà cung cấp môi trường.

- Môi trường sau khi pha chế phải được kiểm tra độ vô trùng, khả năng dinh dưỡng và các phản ứng sinh:

- Pha chế: Dùng dụng cụ thủy tinh  « sạch » để pha chế môi trường. Phân phối một thể tích môi trường thích hợp vào các vật đựng thích hợp (thường là bình thủy tinh có nắp vặn chịu nhiệt). Cách pha chế và điều kiện hấp tiệt trùng tuân thủ chắt chẽ theo hướng dẫn của nhà cung cấp. Chú ý có một số loại môi trường không được phép hấp tiệt trùng và một số môi trường nên sử dụng ngay khi pha chế, cũng như có yêu cầu bảo quản đặc biệt sau khi pha.

- Kiểm tra độ vô trùng: Sau khi hấp tiệt trùng, lấy ngẫu nhiên 2 đơn vị đóng gói nhỏ nhất của lô môi trường ủ ở 35 - 370C trong 72 giờ và 20 -250C trong 5 ngày. Phải không có sự phát triển của vi sinh vật.

- Kiểm tra khả năng dinh dưỡng: Cấy vào môi trường kiểm tra các đại diện vi sinh vật chỉ thị phù hợp theo hướng dẫn của dược điển. Ủ ở nhiệt độ thích hợp và đọc kết quả mỗi ngày. Vi sinh vật phải phát triển tốt trong thời gian qui định.

- Kiểm tra tính chọn lọc của môi trường: Đối với môi trường phân lập, môi trường chọn lọc và môi trường thử phản ứng sinh hóa dùng trong định danh vi sinh vật, cần phải kiểm tra độ nhạy của môi trường bằng cách thử với đúng chủng vi sinh vật nhạy cảm (có phản ứng dương tính với môi trường đó) và một chủng cho phản ứng âm tính.

Quản lý chủng vi sinh vật

Chủng vi sinh vật dùng trong kiểm nghiệm vi sinh như một chỉ thị sinh học nhằm:

- Kiểm tra khả năng dinh dưỡng môi trường nuôi cấy.

- Kiểm tra khả năng kháng khuẩn/nấm/hiệu lực chất bảo quản.

- Dùng như chủng đối chiếu trong thử giới hạn nhiễm khuẩn.

- Xác định hoạt lực kháng sinh, vi tamin bằng phương pháp vi sinh.

Chủng vi sinh vật đối chiếu phải được nối chuẩn, được cung cấp từ các bảo tàng giống quốc gia hoặc quốc tế, hoặc phải có nguồn gốc rõ ràng và phải được chứng minh tương đương với các chủng trên.

Bảo quản và quản lý chủng vi sinh phải tuân thủ các nguyên tắc sau :

Đảm bảo chất lượng vi sinh vật :

- Kiểm tra tính thuần chủng: Cấy phân lập chủng cần kiểm tra lên môi trường chọn lọc thích hợp. Quan sát khuẩn lạc mọc trên đĩa Petri xem chúng có giống nhau về đặc điểm hình thể không như đặc điểm khuẩn lạc, màu sắc, kích thước…Lấy một ít vi sinh vật từ khuẩn lạc, đem làm tiêu bản nhuộm gram. Chủng được coi như thuần chủng khi chỉ có duy nhất một loại khuẩn lạc, tiêu bản vi sinh vật cho thấy hình thái vi sinh vật là đồng nhất.

- Định danh: Nhuộm gram, quan sát các đặc điểm hình thái, hình thể và thực hiện các phản ứng sinh hóa và các kỹ thuật khác để định danh.

Bảo quản vi sinh vật :

Vi sinh vật cần giữ giống một cách đặc biệt để đảm bảo độ sống và tính bền vững về di truyền. Các biện pháp bảo quản giữ giống thường được sử dụng:

- Phương pháp bảo quản không có sự trao đổi chất: Thường sử dụng phương pháp đông lạnh hay đông khô. Phương pháp đông lạnh là phương pháp giữ lạnh ở nhiệt độ thấp, trong nitơ lỏng ở nhiệt độ -135 đến -1400C. Phương pháp đông khô là phương pháp loại bỏ nước ở điều kiện và áp suất đặc biệt.

- Phương pháp bảo quản có sự trao đổi chất: Là phương pháp cấy chuyển. Phương pháp này có thể bảo quản giữ giống từ 1 tuần đến 1 tháng và có thể sử dụng ngay mà không cần phải cấy lại. Tuy nhiên cần lưu ý cấy chuyển nhiều lần có khả năng gây nên những biến đổi về đặc tính sinh học của chủng, vì thế theo quy định quốc tế, không được cấy chuyển quá 5 lần từ chủng vi sinh vật gốc.

Quản lý chủng vi sinh :

- Chủng vi sinh phải được bảo quản ở điều kiện phù hợp và phải được quản lý chặt chẽ.

- Cần phân công cụ thể người chịu trách nhiệm giữ chủng vi sinh trong PTN, tránh gây sai sót hay thất thoát chủng.

- Chủng vi sinh nên được bảo quản trong tủ lạnh có khóa và theo dõi nhiệt độ hàng ngày.

Bảng 5: Một số chủng vi sinh thường dùng trong phòng kiểm nghiệm vi sinh.

Chủng vi sinh Mã chủng Mục đíchBacillus subtilis

ATCC 6633 -Định lượng kháng sinh-Thẩm định phương pháp đếm-Xác định hiệu quả kháng khuẩn của chất bảo quản-Kiểm tra môi trường

Bacillus pumilus

ATCC 14884

-Định lượng kháng sinh-Kiểm tra môi trường

Bacillus cereus ATCC 11778

-Định lượng kháng sinh-Thẩm định phương pháp đếm-Xác định hiệu quả kháng khuẩn của chất bảo quản

-Kiểm tra môi trường-Chuẩn đối chiếu trong Thử Giới hạn nhiễm khuẩn

Eschirichia coli

ATCC 8739 -Định lượng kháng sinh-Thẩm định phương pháp đếm-Xác định hiệu quả kháng khuẩn của chất bảo quản-Kiểm tra môi trường-Chuẩn đối chiếu trong Thử Giới hạn nhiễm khuẩn

Staphylococcus aureus

ATCC 6538 -Định lượng kháng sinh-Thẩm định phương pháp đếm-Xác định hiệu quả kháng khuẩn của chất bảo quản-Kiểm tra môi trường-Chuẩn đối chiếu trong Thử Giới hạn nhiễm khuẩn

Pseudomonas aeruginosa

ATCC 6538 -Xác định hiệu quả kháng khuẩn của chất bảo quản-Kiểm tra môi trường-Chuẩn đối chiếu trong Thử Giới hạn nhiễm khuẩn

Salmonella sp -Kiểm tra môi trường-Chuẩn đối chiếu trong Thử Giới hạn nhiễm khuẩn

Candida albicans

ATCC 10231

-Thẩm định phương pháp đếm-Xác định hiệu quả kháng khuẩn của chất bảo quản-Kiểm tra môi trường-Chuẩn đối chiếu trong Thử Giới hạn nhiễm khuẩn

Aspergilus

niger

-Xác định hiệu quả kháng khuẩn của chất bảo quản

-Kiểm tra môi trường

Clostridium sporogenes

ATCC11437 -Thẩm định phương pháp đếm-Xác định hiệu quả kháng khuẩn của chất bảo quản-Kiểm tra môi trường

Clostridium perfringen

ATCC 13124

-Chuẩn đối chiếu trong Thử Giới hạn nhiễm khuẩn

VI. Lấy mẫu và quản lý mẫu thử nghiệm

Nguyên tắc của việc lấy mẫu vi sinh là phải đảm bảo không làm ảnh hưởng tới quần thể vi sinh vật hiện có trong mẫu, vì thế:

- Việc lấy mẫu để kiểm tra chất lượng vi sinh phải do nhân viên đã qua huấn luyện thực hiện.

- Thao tác lấy mẫu phải tuân thủ kỹ thuật vô trùng, sử dụng các dụng cụ lấy mẫu đã tiệt trùng.

- Thời gian lấy mẫu và điều kiện môi trường tại nơi lấy mẫu như nhiệt độ, chất lượng không khí, … phải được theo dõi và ghi vào biên bản lấy mẫu.

- Quần thể vi sinh vật trong mẫu thử có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường nên mẫu thử cần được vận chuyển và bảo quản trong điều kiện thích hợp để bảo đảm tính toàn vẹn của mẫu (ví dụ phải làm lạnh, nếu cần), cần ghi lại tình trạng của mẫu thử khi giao nhận tại phòng thí nghiệm.

Quản lý mẫu thử nghiệm:

- Mẫu thử vi sinh nên được kiểm nghiệm càng sớm càng tốt sau khi lấy mẫu.

- Nếu số lượng mẫu thử không đủ hay ở trong tình trạng bảo quản kém phòng thí nghiệm phải thảo luận với khách hàng trước khi nhận hay từ chối mẫu. Trong bất kỳ trường hợp nào, tình trạng của mẫu thử phải được thể hiện trong báo cáo kết quả thử nghiệm.

- Phòng thí nghiệm phải ghi chép lại tất cả các thông tin liên quan đến mẫu thử, đặc biệt là các thông tin sau:

ngày và, nếu cần, giờ nhận mẫu;

tình trạng của mẫu, niêm phong khi nhận và nhiệt độ của mẫu thử, nếu cần;

ngày lấy mẫu, điều kiện lấy mẫu và điều kiện vận chuyển mẫu từ nơi lấy mẫu tới phòng thí nghiệm, ...

điều kiện bảo quản trước và sau khi nhận mẫu,

đặc biệt đối với một số mẫu thực phẩm sống, mẫu nước… cần lưu ý điều kiện bảo quản và thời gian phân tích.

- Mẫu lấy để Thử vô khuẩn và Thử Giới hạn nhiễm khuẩn nếu có thể cần phải bao gói trong điều kiện vô trùng để có thể xử lý làm lại lần 2.

- Mẫu thử khi đang chờ kết quả phải được bảo quản trong điều kiện thích hợp để giảm đến mức tối đa sự thay đổi quần thể vi sinh vật có thể có trong mẫu cần kiểm tra.

- Điều kiện bảo quản đối với từng loại mẫu cụ thể phải được qui định rõ ràng và phải được ghi chép, lưu trữ.

- Bao bì và nhãn của mẫu thử có thể bị nhiễm khuẩn nặng, do đó cần được xử lý và bảo quản cẩn thận để tránh gây nhiễm chéo.

- Phải có qui trình lưu trữ và loại bỏ mẫu thử. Mẫu thử phải được lưu trữ cho đến khi có kết quả thử nghiệm hay lâu hơn, nếu cần.

- Những mẫu thử bị nhiễm khuẩn nặng phải được tiệt trùng trước khi loại bỏ.

VII. Vệ sinh An toàn PTN – nguyên tắc thực hành vi sinh chuẩn

Như trên đã đề cập, để đảm bảo chất lượng môi trường thử nghiệm, PTN cần xây dựng quy trình làm vệ sinh phòng ốc. Một vài lưu ý về chương trình vệ sinh này:

- Chất tẩy rửa phòng ốc: cần đảm bảo hiệu quả làm sạch và diệt khuẩn. Chú ý việc thay đổi hóa chất tẩy rửa theo định kỳ vệ sinh nhằm tránh hiện tượng vi sinh vật đề kháng với chất tẩy rửa.

- Các khu vực có độ sạch khác nhau cần được cung cấp đồ dùng làm vệ sinh riêng để tránh tình trạng nhiễm chéo.

- Thao tác vệ sinh luôn luôn được tiến hành theo thứ tự khu vực sạch trước.

An toàn PTN vi sinh

Khái niệm về các mức độ nguy hiểm sinh học

- Nhóm nguy cơ 1: (Không có hoặc có nguy cơ thấp cho cộng đồng) Là những tác nhân không có khả năng gây bệnh cho người và động vật.

- Nhóm nguy cơ 2: (Có nguy cơ tương đối với cá nhân và nguy cơ thấp cho cộng đồng). Là những tác nhân có thể gây bệnh cho người và động vật nhưng thường không phải là mối nguy hiểm cho nhân viên phòng thí nghiệm,cộng đồng, vật nuôi hay môi trường.

- Nhóm nguy cơ 3: (Có nguy cơ gây bệnh cao với cá nhân và nguy cơ thấp với cộng đồng) Là những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng cho người và động vật nhưng không lan truyền từ người sang người.

- Nhóm nguy cơ 4:(có nguy cơ cao với cá nhân và cộng đồng) Là những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng cho người và động vật.Có thể lan truyền trực tiếp/gián tiếp nhanh chóng từ người sang người. Chưa có các biện pháp phòng/điều trị hữu hiệu.

Trang thiết bị an toàn và bảo hộ lao động

- BSC ( Bio safety cabinet):

BSC cấp 1: Bảo vệ môi trường và người sử dụng.

BSC cấp 2: Bảo vệ mẫu, môi trường và người sử dụng. Có các kiểu khác nhau tùy mục đích sử dụng.(Type A1, A2, B1, B2)

BSC cấp 3: Hệ thống glove box cấp khí kín với lọc HEPA. Áp suất âm.

- Hệ thống rửa mắt khi gặp sự cố

- Thùng đựng chất thải sinh học: phải có ký hiệu cảnh báo chất thải sinh học

- Hộp đựng các vật liệu sắc nhọn.

- Các đồ bảo hộ cá nhân như găng tay, mũ trùm đầu, mặt nạ, khẩu trang, phủ giày…

Nguyên tắc thực hành vi sinh chuẩn

- Chỉ những người có trách nhiệm mới được ra vào khu vực thử nghiệm.- Luôn đóng của PTN.

- PTN phải sạch sẽ, ngăn nắp và chỉ để những thứ cần thiết cho công việc.

- Phải mặc đồ bảo hộ PTN trong suốt thời gian thử nghiệm. Không mang đồ bảo hộ sang khu vực khác.

- Phải mang găng tay khi tiếp xúc với mẫu có khả năng lây nhiễm. Phải rửa tay sau khi làm việc với mẫu, sau khi tháo găng tay và trước khi rời khu vực thử nghiệm.

- Không được phép ăn uống, hút thuốc, đeo kính áp tròng và dùng mỹ phẩm trong khu vực thử nghiệm. Không được cất giữ thực phẩm trong khu vực làm việc của PTN.

- Tất cả các chủng vi sinh vật, môi trường đã sử dụng và các chất thải sinh học khác phải được xử lý tiệt trùng bằng phương pháp thích hợp trước khi rửa hay đổ bỏ. Sau khi làm việc phải vệ sinh khu vực thử nghiệm.

- Phải có qui trình/thực hiện việc xử lý sự cố.

- Không để đồ bảo hộ với đồ dùng thông thường.

Thực hành vi sinh đặc biệt

- Những người nhạy cảm đặc biệt đối với vi sinh vật không được vào PTN khi đang làm việc với với vi sinh vật gây bệnh.

- KNV phải được huấn luyện về mức độ nguy hiểm, biện pháp phòng ngừa và khắc phục khi xảy ra sự cố.

- Phải treo biển “Biohazard” trước cửa phòng thí nghiệm khi đang làm việc với vi sinh vật gây bệnh.

- Thận trọng với các dụng cụ sắc nhọn. Phải có các hộp cứng đựng các dụng cụ sắc nhọn trước và sau khi sử dụng. Phải có hộp đựng và dụng cụ riêng để thu lượm các mảnh thủy tinh bể vỡ.

- Phải mang găng tay khi tay khi làm việc với tác nhân sinh học và tháo găng khi kết thúc hoặc khi găng tay bị nhiễm bẩn nặng/ bị rách. Xử lý găng tay đã qua sử dụng như đối với các rác thải sinh học. Phải rửa tay sau khi tháo găng tay.

- Các chủng vi sinh, các tác nhân sinh học khi di chuyển phải đựng trong bao bì đậy nắp kín, không bị rò rỉ.

- Phải xử lý vệ sinh khu vực làm việc ngay khi kết thúc/ có sự cố rơi vãi hoặc nhiễm. Các thiết bị bị nhiễm bẩn phải được xử lý sát trùng trước khi gởi đi sửa chữa, bảo trì.

- Các trường hợp sự cố cần phải báo cáo với phụ trách PTN.

Biện pháp xử lý khi có sự cố làm đổ, rơi vãi tác nhân sinh học

Sự cố làm rơi, đổ các tác nhân sinh học ở ngoài BSC có thể tạo khí dung vi sinh vật nguy hiểm làm giảm chất lượng môi trường phòng thí nghiệm.

Biện pháp xử lý khi có sự cố làm rơi ,đổ các tác nhân sinh học:

- Cởi bỏ quần áo đã bị nhiễm.- Rửa kỹ vùng da tiếp xúc với tác nhân sinh học bằng xà phòng.

- Chăm sóc y tế, nếu cần.

- Báo cáo với người phụ trách phòng thí nghiệm

Biện pháp xử lý đối với nhóm nguy cơ 1:

- Mang găng tay dùng một lần.- Dùng khăn tẩm chất sát trùng đặt lên khu vực cần xử lý để lau hút.

- Lau lại lần nữa với khăn mới tẩm chất sát trùng.

- Bỏ các khăn đã dùng vào túi nhựa và xử lý như với chất thải sinh học.

Biện pháp xử lý đối với nhóm nguy cơ 2:

- Cảnh báo cho tất cả những người trong khu vực bị đổ, rơi vãi.- Mang tất cả các trang phục bảo hộ như áo bảo hộ dài tay/kính/ khẫu

trang/găng tay/phủ giày.

- Phủ khu vực cần xử lý bằng khăn giấy hay vật liệu rút nước khác.

- Hút hết nước, lau sạch bằng khăn giấy tẩm chất sát trùng.

- Xử lý các khăn lau như đối với chất thải sinh học.

Xử lý rác thải sinh học

Chất thải sinh học nguy hại (Biohazard waste-BW) là những chất thải có chứa các tác nhân sinh học, bao gồm cả vi sinh vật gây bệnh, có thể gây nguy hiểm cho con người và môi trường sống.

Xử lý triệt để các chất thải sinh học để bảo vệ an toàn cho con người và môi trường, tránh tạo khí dung vi sinh vật gây ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm.

- Nếu chất thải sinh học cũng đồng thời là chất thải hóa học, cần phải xử lý theo yêu cầu của cả chất thải sinh học lẫn hóa học.

- Nếu chất thải sinh học đồng thời là chất thải phóng xạ, phải xử lý đồng thời theo yêu cầu của chất thải sinh học và phóng xạ.

- Trước khi bị xử lý, chất thải sinh học phải được đựng trong vật đựng màu đỏ có nhãn “Biohazard”.

- Không được đựng quá đầy.

- Không đặt vật đựng chất thải sinh học ở những nơi đông người qua lại.

- Phải xử lý tiệt trùng ngay khi có thể.

- Không được đổ chất thải sinh học vào rác thải sinh hoạt.

- Sau khi xử lý tiệt trùng, chất thải sinh học được xử lý như rác thải sinh hoạt.

Chất thải sinh học đã được xử lý là những chất thải vô hại hay trơ về mặt sinh học đã được tiệt trùng bằng một trong những biện pháp sau:

- Dùng nhiệt : Phương pháp hấp tiệt trùng, sấy, đốt.- Dùng hóa chất : Xử dụng các chất tẩy uế như cồn, ethylen oxide,

hydroperoxide, paraformaldehyde.

- Dùng bức xạ.