Bahan ajar mikroteknik hewan (Microtechnique of Animal)

BAHAN AJARMIKROTEKNIK HEWAN

OLEH :Dra. NETTY MARUSIN

PUTRA SANTOSO, M.Si

JURUSAN BIOLOGI FMIPA UNAND, PADANG

PENGANTAR

• Metode-metode yang dikaji adalahmetode dasar untuk pembuatan sediaanpermanen yang utuh maupun yang disayat.

• Penekanan pada metode parafin danpenggunaan zat kimia dan zat warnayang mudah didapat

Bahan ajar mikroteknik hewan

Pembuatan Sediaan Utuh

Pembuatan sediaan utuh dari sampelorganisme akan lebih sederhana daripadadengan sediaan yang disayat

Proses pembuatan sediaan utuh meliputibeberapa langkah sbb :

• Fiksasi-pencucian(jika perlu hidrasi)-pewarnaan “in toto”-diferensiasi-dehidrasi-penjernihan-ditutup


Sediaan yang Disayat

Proses pembuatan sediaan yang disayat lebih panjangdaripada sediaan utuh

Langkah-langkah penting dalam prosedur ini sbb :

Pengambilan jaringan-fiksasi-pencucian (khusus)-dehidrasi-penjernihan-infiltrasi-penanaman-penyayatan-penempelan pada kaca objek-melarutkan parafin-hidrasi-pewarnaan-dehidrasi-penjernihan-ditutup dengan kaca penutup


A. PROSES FIKSASI

• Bahan yang difiksasi harus segar

• tujuan pokok adalah untuk mengawetkanprotoplasma dengan seminimal mungkinuntuk terjadinya perubahan

• dapat dilakukan dengan menggunakanberbagai senyawa fiksatif sesuai sifatnya


Sifat-sifat fiksasi yang ideal

Dapat menghentikan proses-proses metabolismedengan cepat untuk mencegah terjadinyaperubahan-perubahan postmortemDapat masuk dengan cepat kedalam jaringanMengawetkan dan mengeraskan protoplasmaTidak mengubah bentuk semulaMenambah afinitas protoplasma terhadap zat

warnaBahan ajar mikroteknik hewan

Beberapa Larutan Fiksatif

Formalin : Formalin 10 ml + Aquadest90 ml

Larutan Bouin : larutan asam pikratjenuh 75 ml + formalin pekat 20 ml + asam asetat pekat 5 ml


Lanjutan ........

FAA (Formalin Alcohol Acetic) : Alkohol 70% 90 ml + formalin 10 ml + asam asetat pekat2 ml

Larutan Zenker : Kalium dikromat 2.5 g + HgCl2 5.0 g + Natrium sulfat 1.0 g + Aquadest 100 ml


Fiksatif Formalin

• Paling umum dipakai di laboratorium

• Objek dapat disimpan dalam waktu tak terbatastanpa adanya kerusakan

• Objek yang telah difiksasi dalam formalin jangandicuci dengan air karena jaringan dapatmenggembung

• Setelah difiksasi langsung didehidrasi


Fiksatif Bouin

• Juga umum dipakai di laboratorium zoologidengan perendaman sebaiknya 18-20 jam

• Larutan dicampur pada waktu akan dipaka

• i

• Setelah difiksasi objek langsung dimasukkankedalam alkohol 70% dan diganti beberapakali untuk menghilangkan kelebihan fiksatif


Fiksatif Zenker

• Campuran zenker pada waktu akan dipakaiharus ditambah dengan 0.5 ml asam asetatglasial untuk setiap 10 ml larutan stok

• Merupakan fiksatif khusus terutama untukjaringan ikat

• Sampel direndam selama 3-12 jam dalamfiksatif


Fiksatif FAA

• Umum dipakai untuk memfiksasi cacingintestinal terutama untuk sediaan utuh

• Jika objek akan diwarnai terlebih dahulu, masukkan kedalam alkohol 35% lalukedalam air dan selanjutnya diwarnai

• Fiksatif ini juga digunakan pada sampeltumbuhan


Hal-Hal Penting Dalam Fiksasi

• Fiksasi yang baik adalah dasar dari kesempurnaanhasil preparat selanjutnya, sehingga harusdigunakan fiksasi yang cocok dengan sampel

• Kesegaran jaringan sangat penting untukmenjamin terbentuknya preparat yang representatif

• Volume fiksatif yang dipakai sebaiknya 50 x volume objek yang difiksasi kecuali untuk fiksatifchrom dan osmium dipakai 5-10x volume objek


Lanjutan....

• Pencucian terhadap jaringan yang difiksasidalam formalin dan bouin dilakukan denganalkohol 50% atau 70%, jangan dalam air

• Jaringan yang difiksasi dengan osmium atauchrom dan K-dikromat perlu dicuci dengan air mengalir selama 2 kali waktu fiksasi

• Endapan merkuri klorida harus dikeluarkandari jaringan sebelum mewarnai jaringan


Lanjutan...

• Sering setelah memakai fiksatif zenkerdidapatkan endapan coklat pada tepijaringan yang disayat

• Ini adalah akibat pencucian yang kurangsempurna setelah fiksasi

• Dapat dihilangkan dengan merendamsayatan yang telah ditempel dengan 1% HCldalam alkohol 70% selama 15-30 menit


B. PROSES PENCUCIAN (WASHING)

Pencucian dengan air :• Dilakukan terhadap sampel yang difiksasi

dengan larutan yang mengandung K-dikromat, HgCl2, asam osmic dan cromat

• Pencucian dilakukan dengan air mengalir dandilakukan dua kali waktu fiksasi

• Dapat dilakukan juga dengan merendam dalamair dan menggantinya beberapa kali


Pencucian Jaringan segar

• Jaringan segar sebelum difiksasi dapat dicucidengan garam normal atau larutan buffer

• larutan gara normal mencegah terjadinyaperubahan osmotik atau plasmolitik

• larutan buffer selain bersifat seperti larutangaram normal juga menjaga kesetimbanganasam-basa protoplasma


Larutan Garam Normal (salin)• Garam NaCl : 7.5-8.0 g

• Aquadest : 1 liter

Larutan RingerUntuk hewan berdarah dingin :

• NaCl : 8.0 g KCl : 0.2 g

• CaCl2 : 0.2 g Na2CO3 : 0.2 g

• Aquadest : 1 literBahan ajar mikroteknik hewan

Larutan RingerUntuk hewan berdarah panas :

• NaCl : 9.0 g KCl : 0.42 g

• CaCl2 : 0.24 g K2CO3 : 0.20 g

• Aquadest : 1 liter


C. PROSES DEHIDRASI

• Tujuan dehidrasi adalah mengeluarkan air dari dalam jaringan dengan menggunakanmedium tertentu yang dapat mengganti ataumengisi tempat air di dalam jaringna

• Medim tersebut harus dapat bercampurdengan zat penjernih pada prosespenjernihan dan tidak boleh berlawanandengan kerja fiksatif


Alkohol Sebagai Zat Dehidrator

• Alkohol absolut dapat bercampur dengan zat-zatpenjernih maka dehidrator yang cocok adalahalkohol bertingkat (alkohol seri)

• Konsentrasi alkohol yang digunakan bertingkatkonsentrasinya dari rendah ke tinggi

• Biasanya dimulai dari 35%-50%-70%-80%-90% dan kemudian alkohol absolut

• Terkadang alkohol 35% dapat diabaikanBahan ajar mikroteknik hewan

• Dehidrasi dari alkohol 50% sampai 80% tidakboleh berhenti dan setelah sampai di alkohol80% jaringan dapat didiamkan dan disimpansampai proses selanjutnya

• Jika dipakai fiksatif yang mengandung HgCl2 maka pada alkohol 80% atau 70% ditambahdengan iodium agar endapan HgCl2 dalamjaringan hilang

• Selain alkohol ada beberapa zat dehidrator yaitu: dioxan, n-butyl alkohol dll


D. PROSES PENJERNIHAN

• Bahan penjernih yang umum dipakai adalahxilol, toluol, benzol dan kloroform

• Untuk objek yang tidak mengalami dehidrasitotal dipakai senyawa lain yaitu minyak cedar wood atau metyl salisilat

• Proses penjernihan dilakukan denganmerendam objek di dalam bahan penjernihselama beberapa waktu tertentu


Lanjutan .......

• Penjernih xylol dapat menggantikan alkoholdalam waktu singkat sehingga lama penjernihanlebih cepat

• Perendaman terlalu lama (lebih 24 jam) menyebabkan jaringan keras dan rapuh

• Toluol, chloroform dan minyak cedarwoodbekerja lambat sebagai penjernih

• Benzen (benzol) sangat baik karena sedikit sekalipengkerutan, mudah masuk dalam jaringan danmudah menguap dalam inkubator parafin


E. PROSES INFILTRASI

• Pada proses ini terjadi penggantian medium penjernih dengan medium penanaman didalam jaringan

• Untuk penaman dalam parafin, objekdipindahkan dari dalam penjernih kedalamparafin cair (dalam inkubator)

• Inkubator yang umum dipakai adalah suhu58-60 derajat celcius


Parafin yang umum dipakai dengan titik leleh :

• 48-50 derajat celcius (soft parafin)

• 52-54 derajat celcius (parafin sedang/medium)

• 58-60 derajat celcius (hard parafin)

Hal yang perlu diperhatikan pada waktu memilihparafin adalah :

Sifat objek (keras atau lunak)Suhu kamar tempat penyayatan


PROSES-PROSES SELANJUTNYA :

A. PENANAMAN OBJEK DALAM PARAFIN (EMBEDDING)

B. PENYAYATAN DENGAN MIKROTOM (SECTIONING)

C. PENEMPELAN SAYATAN PADA KACA OBJEK

D. PEWARNAAN (STAINING)

E. PENUTUPAN DAN PELABELAN (FINISHING)


Contoh preparat permanen sayatan jaringanhewan yang dibuat dalam mikroteknik


Bahan ajar mikroteknik hewan (Microtechnique of Animal)

Education

Transcript of Bahan ajar mikroteknik hewan (Microtechnique of Animal)