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BACTERIAS ENDOFITAS DE Cordia alliodora Oken Y Tabebuia rosea Bertold D.C: POTENCIAL COMO PROMOTORAS DE CRECIMIENTO

VEGETAL EN LA PROPAGACIÓN DE SU HOSPEDERO

SANDRA MARCELA CASTRO MARCIALES CARLOS ANDRES ROA BERMÚDEZ

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA BOGOTA D.C. JULIO DE 2006


VEGETAL EN LA PROPAGACION DE SU HOSPEDERO


TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial para optar el título de

MICROBIOLOGO AGRÍCOLA Y VETERINARIO

LUCIA ANA DIAZ DIRECTORA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA BOGOTA D.C.

JULIO DE 2006

NOTA DE ADVERTENCIA Articulo 23 de la resolución Nº 13 de julio de 1946. “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por

sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique

nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no

contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea

en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.




_____________________________ LUCIA ANA DIAZ, Microbióloga. M Sc Directora _____________________________ __________________________ Sandra Leyva, Ingeniera forestal Jairo Cuervo, Ingeniero Agrónomo Jurado Jurado



SANDRA MARCELA CASTRO MARCIALES CARLOS ANDRES ROA BERMUDEZ

_____________________ _____________________ ANGELA UMAÑA. M. Phil DAVID GOMEZ, M. Sc. Decana Académica Director de Carrera Facultad de Ciencias Microbiología Agrícola y Veterinaria

i

AGRADECIMIENTOS A la profesora Lucia Ana Díaz, por su comprensión, compañía y apoyo. A Carolina Vargas por su amistad, apoyo y constante colaboración. A la profesora Claudia Ramirez, por su colaboración y guia en fisiologia de semillas. A Jorge Matañana y Nixon Pérez por su alegría y colaboración incondicional. A Corpoica Tibaitata y en especial a Mauricio Barón por el aporte de la turba. A Cesar Cano por el suministro de los inóculos de hongos micorriza arbuscular. Al Ingeniero Rafael Sierra por su ayuda y colaboración A Olivo por el cuidado del material vegetal en su fase de vivero. A la Bacterióloga Sandra Caballero por su colaboración y Tiempo en la identificación de los aislamientos A Geoambiente LTDA, por su aporte de material vegetal, su colaboración y préstamo de espacio en la estación experimental Bambusa. A la Unidad de Biotecnología Vegetal de la Pontificia Universidad Javeriana por su colaboración en el préstamo de sus instalaciones. A la planta física de la Pontificia Universidad Javeriana por el préstamo de equipos.

ii

TABLA DE CONTENIDO

Página 1. INTRODUCCIÓN

1

2. MARCO TEORICO 3

2.1. Situación Actual de los Bosques en Colombia 3 2.2. Generalidades de Cordia alliodora Oken. 4 2.2.1. Distribución Geográfica 4 2.2.2. Clasificación Taxonómica 4 2.2.3. Descripción Botánica 5 2.2.4. Ecología 5 2.2.5. Manejo de La especie en Vivero 6 2.2.6. Semilla 6 2.2.7. Problemas Fitosanitarios en Vivero 7 2.3. Generalidades de Tabebuia rosea Bertold D.C. 7 2.3.1. Distribución Geográfica 7 2.3.2. Clasificación Taxonómica 8 2.3.3. Distribución Botánica 9 2.3.4. Ecología 9 2.3.5. Manejo de la Especie en Vivero 9 2.3.6. Semilla 10 2.3.7. Problemas fitosanitarios en Vivero 10 2.4. Bacterias Promotoras de Crecimiento vegetal, PGPB´s 11 2.4.1. Mecanismos de promoción de Crecimiento Vegetal Mediados

por PGPB´s 12

2.4.1.1. Fijación Biológica de Nitrógeno (FBN) 12 2.4.1.2. Producción de Fitohormonas 13 2.4.1.2.1. Auxinas: Ácido Indol Acético 13 2.4.2. Acción Bioprotectante de las PGPB`s 16 2.4.2.1. Competencia en la rizosfera 16 2.4.2.2. Resistencia Sistémica Inducida 16 2.4.2.3. Producción de sideróforos 17 2.4.2.4. Solubilización de Fósforo Inorgánico 18 2.4.2.5. Producción de Enzimas Líticas Extracelulares 19 2.5. Efectos de las PGPB`s Sobre el Crecimiento Vegetal 20 2.5.1. Aumento de la Germinación y Emergencia de Semillas 20 2.5.2. Aumento en la Toma de Nutrientes y Agua por las Raíces 20 2.6. Microorganismos Endófitos 21 2.7. Calidad de las Plantas Producidas en Vivero 22 2.7.1. Calidad de la Semilla 23 2.7.1.1. El Proceso de Germinación 24 2.7.2. Asociación con Microorganismos Benéficos en Especies

Forestales 25

2.8. Inoculantes Microbianos 26 2.8.1. Definición de Inoculante 26 2.8.2. Características y Tipos de Soporte

26

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 27

3.1. Planteamiento del Problema 27

iii

3.2. Justificación 27 4. Objetivos

30

5. MATERIALES Y METODOS 31

5.1. Población de estudio y muestra 34 5.2. Diseño Experimental de los Ensayos de Inoculación, Siembra

y Crecimiento y Desarrollo de Plantas Jóvenes de C. alliodora y T. rosea

34

5.2.1. Población de Estudio y Muestra 35 5.3. Ubicación Espacial 35 5.4. Fase Uno: Caracterización, Selección y Propagación de

PGPB`s de T. rosea y C. alliodora 36

5.4.1. Determinación de la Producción de Acido Indol Acético de los Aislamientos Seleccionados 36

5.4.1.1. Determinación Bioquímica y susceptibilidad a Antibióticos de los Aislamientos Seleccionados 37

5.4.1.2. Cuantificación de la Fijación Biológica de Nitrógeno de los Aislamientos Seleccionados 38

5.4.1.3. Crecimiento en Agar Pectina, solubilización de Fósforo y Producción de Sideróforos de los Aislamientos Seleccionados 38

5.4.2. Curva de Crecimiento del Aislamiento de C. alliodora CaIChRI41R1 y del Aislamiento TrMnPr248 de T. rosea 39

5.4.2.1. Preparación del Preinóculo de CaIChRI41R1 y TrMnPr248 39 5.4.2.2. Preparación de Inóculo y Curva de Crecimiento 40 5.4.3. Inmovilización de los Aislamientos Bacterianos Seleccionados

en Turba 40

5.4.3.1 Manejo del Portador Microbiano 40 5.4.3.2. Formulación de los Inoculantes de las PGPB`s

Endorizosféricas Seleccionadas para C. alliodora y T. rosea 41

5.4.3.3. Cultivo Secundario de CaIChRI41R1 42 5.4.3.4. Viabilidad de las Células Inmovilizadas 42 5.4.4. Prueba de Inocuidad de CaIChRI41R1 y de TrMnPR248

sobre Medicago sativa 42

5.4.4.1. Inóculos Bacterianos 43 5.4.4.2. Desinfección de las Semillas de Alfalfa 43 5.4.4.3. Germinación de las Semillas de Alfalfa 43 5.4.4.4. Inoculación de las Semillas de Alfalfa 43 5.4.4.5. Seguimiento y Muestreo de las Plantas Jóvenes de Alfalfa 44 5.4.5. Viabilidad e Imbibición de Semillas de C. alliodora y T. rosea 44 5.4.5.1. Selección de Semillas de C. alliodora y T. rosea 44 5.4.5.2. Curvas de Imbibición 44 5.4.5.3. Pruebas de Viabilidad de la Semillas de C. alliodora y

T. rosea 45

5.5. Fase dos: Efecto de CaIChRI41R1 y TrMnPR248 sobre la Germinación de su Hospedero 46

5.5.1. Desinfección de Semillas de C. alliodora y T. rosea 46 5.5.2. Inoculación y Siembra de las Semillas de C. alliodora y

T. rosea con CaIChRI41R1 y TrMnPR248 en Portador Sólido 47

5.5.2.1. Inoculación y Siembra de las Semillas de C. alliodora y T. rosea con CaIChRI41R1y TrMnPR248 en Cultivo Líquido 47

5.5.2.2. Evaluación de la Emergencia de C. alliodora y T. rosea en Cuarto de Crecimiento 48

iv

5.5.3. Evaluación Preliminar del efecto de Basamid® sobre las poblaciones Microbianas del Sustrato de siembra, sobre la viabilidad de CaChRL41R1 y TrMnpr41r248 y sobre el Crecimiento de una Planta Modelo

49

5.6. Fase tres: Efecto de CaIChRI41R1 y TrMnPR248 sobre el Crecimiento y Desarrollo de Plantas de C. alliodora y T. rosea Obtenidas a partir de Semilla

49

5.6.1. Siembra en Sustrato de Plantas Jóvenes de C. alliodora y T. rosea con el Hongo de Micorriza Glomus manihotis

50

5.6.2. Recuento de las Bacterias Inoculadas en portador Sólido Adheridas a Semillas y Raíces de C. alliodora y T. rosea en el momento de la siembra

51

5.6.3. Evaluación de Crecimiento y Desarrollo de plantas Jóvenes de C. alliodora y T. rosea 51

5.6.4. Porcentaje de Micorrización de plantas Jóvenes de C. alliodora y T. rosea y Recuento de Esporas de HMA en el sustrato de siembra

52

5.6.5. Reaislamiento de CaIChRI41R1 y TrMnPR248 de raíces y Suelo Asociado a Raíz de Plantas Jóvenes de C. alliodora y T. rosea

52

5.6.6. Análisis de la Información 53

6. RESULTADOS 55

6.1. Fase Uno: Caracterización, Selección y Propagación de PGPB`s de C. alliodora y T. rosea 55

6.1.1. Producción de Acido Indol Acético 55 6.1.2. Caracterización Bioquímica y susceptibilidad a Antibióticos de

los Aislamientos Seleccionados 56

6.1.3. Cuantificación de la Fijación Biológica de Nitrógeno: Análisis de Reducción del Acetileno (ARA) 56

6.1.4. Crecimiento en Agar pectina, Solubilización de Fósforo y producción de Sideroforos por los Aislamientos Seleccionados 56

6.1.5. Crecimiento de los Aislamientos CalChRI41R1 y TrMnpr41r248 57 6.1.6. Inmovilización de los Aislamientos Bacterianos CaChRI41R1 y

TrMnPR41R248 en Turba como Portador Microbiano 59

6.1.6.1. Evaluación de la Esterilidad del Portador Sólido Turba 59 6.1.6.2. Formulación de los Inoculantes de las PGPB´s

Endorizosféricas Seleccionadas para C. alliodora y T. rosea en el Portador Microbiano.

59

6.1.6.3. Cultivo Secundario de CalChRI41R1 y TrMnPR41R248 en Portador Microbiano Sólido 60

6.1.6.4. Viabilidad de Células Inmovilizadas en Turba Durante 120 días 60 6.1.7. Prueba de Inocuidad de los Aislamientos CalChRI41R1 y

TrMnPR41R248 sobre Medicago sativa Alfalfa 61

6.1.8. Viabilidad e Imbibición de Semillas de C. alliodora y T. rosea 62 6.1.8.1 Curva de Imbibición para Semillas de C. alliodora 62 6.1.8.2. Curva de Imbibición para Semillas de T. rosea 63 6.1.8.3. Prueba de viabilidad para Semillas de C. alliodora 64 6.1.8.4. Prueba de viabilidad para Semillas de T. rosea 65 6.2 Fase Dos: Efecto CalChRI41R1 y TrMnPR41R248 sobre

semillas de su hospedero 65

v

6.2.1. Germinación de Semilla de Cordia alliodora Tamaño Pequeño (6-8 mm) 65

6.2.1.1. Índice VG ( valor de germinación) para C. alliodora Pequeña 66 6.2.1.2. Germinación de Semilla de Cordia alliodora Fenotipo Grande

(8-10 mm) 67

6.2.1.3. Índice VG (Valor de Germinación) para C. alliodora Grande 68 6.2.1.4. Germinación de Semillas de Tabebuia rosea 69 6.2.1.5 Índice VG (Valor de Germinación) para T. rosea 70 6.2.2. Efecto del Fungicida Basamid® sobre las Poblaciones

Microbianas del Sustrato de Siembra 71

6.3. Fase Tres: Efecto de CalChRI41R1 y TrMnPR41R248 sobre el Crecimiento y Desarrollo de Plantas de C. alliodora y T. rosea Obtenidos a partir de Semilla

74

6.3.1. Crecimiento y Desarrollo de Plantas Jóvenes de C. alliodora 74 6.3.1.1. Altura 74 6.3.1.2. Peso Fresco de Raíz 75 6.3.1.3. Peso Seco de Raíz 76 6.3.1.4. Variables de Micorrización de C. alliodora 77 6.3.1.5. Aislamientos y Recuento de Esporas de Hongos de Micorriza

Arbuscular 77

6.3.2. Crecimiento y desarrollo de Plantas Jóvenes de T. rosea 79 6.3.2.1. Altura 79 6.3.2.2. Longitud de Raíz 80 6.3.2.3. Peso Fresco de Raíz 81 6.3.2.4. Peso Seco de Raíz 82 6.3.2.5. Peso Fresco de Aéreo 83 6.3.2.6. Peso Seco Aéreo 84 6.3.3. Variables de Micorrización de T. rosea 85 6.3.4. Recuento de las Bacterias Inoculadas Adheridas a Semillas y

Raíces en el Momento de la Siembra 86

6.3.5. Reaislamiento de CalChRI41R1 y TrMnPR41R248 de Raíces y Suelo Asociado a las Raíces de Plantas Jóvenes

87

7. DISCUSIÓN 90

7.1. Características Biológicas de CalChRI41R1 y TrMnPR41R248 90 7.2. Crecimiento de los Aislamientos CalChRI41R1 y

TrMnPR41R248 en Medio de Cultivo Líquido 96

7.3. Viabilidad de CalChRI41R1 y TrMnPR41R248 Inmovilizados en Turba 97

7.4. Inocuidad de CalChRI41R1 y TrMnPR41R248 sobre Medicago sativa Alfalfa 98

7.5 Viabilidad de Semillas de Cordia alliodora y Tabebuia rosea 99 7.6. Germinación de Semillas de cordia alliodora y Tabebuia rosea

Inoculadas 101

7.7. Crecimiento y Desarrollo Vegetal de Plantas Jóvenes de C. alliodora Inoculadas con el aislamiento endófito CalChRI41R1

103

7.8. Crecimiento y Desarrollo Vegetal de Plantas Jóvenes de T. rosea inoculadas con TrMnPR41R248

108

8. CONCLUSIONES 112

vi

9. RECOMENDACIONES 114

10. BIBLIOGRAFIA 116 ANEXOS 131

vii

INDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1 Individuo adulto de Cordia alliodora 5 Figura 2 Individuo adulto de Tabebuia rosea 8 Figura 3 Diagrama de Actividades realizadas en el estudio 32 Figura 4 Crecimiento en agar pectina y actividad solubilizadora

de fosfato de CaIChRI41R1 y TrMnPr41248 57

Figura 5 Curva de crecimiento de CalChRI41R1 en caldo nutritivo 58

Figura 6 Curva de crecimiento de TrMnPR41R248 en caldo nutritivo 59

Figura 7 Curva de imbibición de semillas de Cordia alliodora 63 Figura 8 Curva de imbibición de semillas de Tabebuia rosea 64 Figura 9 Embriones teñidos en la prueba de de viabilidad 64 Figura 10 Embriones teñidos en la prueba de de viabilidad. 65 Figura 11 Germinación de Cordia alliodora pequeña 66 Figura 12 Valor de germinación de semillas pequeñas de

Cordia alliodora 67

Figura 13 Germinación de Cordia alliodora grande 68 Figura 14 Valor de germinación de semillas grandes de

Cordia alliodora 69

Figura 15 Curva de germinación de Tabebuia rósea 70 Figura 16 Valor de germinación de semillas de T. rosea 71 Figura 17 Colonia de Bacilo gram negativo aislado del sustrato de

transplante De Cordia alliodora y Tabebuia rosea en fase vivero

71

Figura 18 Reaislamiento de CaIChRI41R1 y TrMnPR41R248 de suelo Tratado con Basamid® 73

Figura 19 Altura de plantas jóvenes de Cordia alliodora 120 dds 75 Figura 20 Peso fresco de raíz de Cordia alliodora 120 dds 76 Figura 21 Peso seco de raíz de Cordia alliodora 120 dds 77 Figura 22 Número de esporas de HMA/g de suelo de C. alliodora 78 Figura 23 Porcentaje de micorrización de plantas jóvenes de

C. alliodora 78

Figura 24 Altura de plantas jóvenes de Tabebuia rosea 120 dds 80 Figura 25 Longitud radical de Tabebuia rosea 120 dds 81 Figura 26 Peso fresco de raíz de Tabebuia rosea 120 dds 82 Figura 27 Peso seco de raíz de Tabebuia rosea 120 dds 83 Figura 28 Peso fresco aéreo Tabebuia rosea 120 dds 84 Figura 29 Peso seco Aéreo de Tabebuia rosea 120 dds 85 Figura 30 Número de esporas de HMA/g de suelo de T. rosea

120 dds 86

Figura 31 Porcentaje de micorrización de plantas jóvenes de T. rosea 120 dds 86

Figura 32 Aislamiento TrMnPR41R248 adherida a semillas de Tabebuia rosea 87

viii

INDICE DE TABLAS

Pág.

Tabla 1. Tratamientos aplicados sobre semillas grandes y pequeñas de Cordia alliodora y semillas de Tabebuia rosea 33 Tabla 2. Tratamientos aplicados sobre plantas jóvenes de C. alliodora y Sobre plantas jóvenes de Tabebuia rosea 35 Tabla 3. Viabilidad de los aislamientos de T. rosea y C. alliodora Inoculados en turba estéril 61 Tabla 4. Análisis de las variables de crecimiento evaluadas de Medicago sativa. 62 Tabla 5. Reaislamiento de bacterias a partir de raíces y suelo asociado

A raíz de CaChRI41R1 88 Tabla 6. Reaislamiento de bacterias a partir de raíces y suelo asociado A raíz de TrMnPR41248 89

ix

LISTA DE ANEXOS

ANEXO 1 Medios de cultivo Empleados en Este Proyecto ANEXO 2 Reactivo Salkowsky ANEXO 3 Curva Patrón Ácido Indol Acético ANEXO 4 Caracterización de Aislamientos de Cordia alliodora y

Tabebuia rosea Seleccionados ANEXO 5 Pruebas Bioquímicas Evaluadas por Microscan ® ANEXO 6 Curva de Calibración de ARA ANEXO 7 Caracterización de aislamiento CaIChRI41R1 por el sistema

Microscan ® ANEXO 8 Caracterización del Aislamiento TrMNPrr41R248 por el

sistema Microscan ® ANEXO 9 Patrón de viabilidad empleado en este proyecto ANEXO10 Composición de Fungicida Basamid® ANEXO 11 ANEXO 12

Composición de Fertilizantes Empleados en este Proyecto Aclarado y Tinción de Raíces

ANEXO 13 Producción de AIA en Medio sin Adición de Triptófano de Aislamientos Seleccionados de Raíz de Cordia alliodora y Tabebuia rosea

ANEXO 14 Producción de biomasa, viabilidad y AIA del Aislamiento CaIChRI41R1 en caldo nutritivo

ANEXO 15 Producción de biomasa, viabilidad y AIA del Aislamiento TrMnPR41R248 en caldo nutritivo

AXEXO 16 Peso de Semillas de Cordia alliodora Fenotipo Pequeño 6 a 8.mm y fenotipo Grande 8-10mm en imbibición

ANEXO 17 Peso de Semillas de Tabebuia Rosea en Imbibición ANEXO 18 Indice de Germinación Semillas de Cordia alliodora Fenotipo

pequeño ANEXO 19 Indice de Germinación Semillas de Cordia alliodora Fenotipo

Grande ANEXO 20 Valor de Germinación Semillas de Tabebuia Rosea ANEXO 21 Análisis Estadístico Variable VG Ensayo Semilla C. alliodora

Pequeña ANEXO 22 Análisis Estadístico Variable VG Ensayo Semilla C. alliodora

grande ANEXO 23 Análisis Estadístico Variable VG Ensayo Semillas T. rosea ANEXO 24 Análisis Estadístico No Paramétrico de Variables Evaluados

de Crecimiento Vegetal de Cordia alliodora ANEXO 25 Análisis Estadístico Variables de Crecimiento Vegetal

Ensayo Plantas Jóvenes de C. alliodora. ANEXO 26 Comparación de Medias de Dunnet para Crecimiento

vegetal Ensayo plantas Jóvenes de C. alliodora ANEXO 27 Prueba de Kruskall-Wallis para el Área Foliar de T. rosea ANEXO 28 Análisis Estadístico Variables de Crecimiento Vegetal

Ensayo de plantas Jóvenes de T. rosea ANEXO 29 Análisis de Varianza del porcentaje de Micorrización Para

Plantas Jóvenes de C. alliodora ANEXO 30 Comparación de Medias (Dunnet) del Porcentaje de

Micorrización Plantas Jóvenes de C. alliodora

x

ANEXO 31 Comparación de Medias (Dunnet) del Número de Esporas Ensayo Plantas Jóvenes de C.alliodora

ANEXO 32 Análisis de Varianza del Porcentaje de Micorrización Ensayo Plantas Jóvenes de T. rosea

ANEXO 33 Comparación de Medias (Dunnet) del Porcentaje de Micorrización Para Plantas Jóvenes de T. rosea

ANEXO 34 Análisis de Varianza de Numero de Esporas Ensayo Plantas Jóvenes de T. rosea

RESUMEN

Se seleccionaron los aislamientos CaIChRI41R1, endófito de C. alliodora

y TrMnPR41248 de T. rosea, con el fin de evaluar su efecto sobre la

germinación, crecimiento y desarrollo de su hospedero natural en etapa

de vivero. La evaluación de su actividad biológica mostró que los

aislamientos producen pigmentos difusibles en agar King B, crecen en

agar pectina y presentan halos de solubilización de fósforo en agar

SMRS. CaIChRI41R1 produjo 15.31 µg/ml de acido indol acético (AIA) y

TrMnPR41248 3.63 µg/ml de AIA en caldo nutritivo sin adición de

triptófano tras su reactivación en agar papa. De acuerdo al análisis de

reducción del acetelino (ARA), los dos aislamientos fijan nitrógeno:

CalChRl41r1, 2.74 µmol/frasco/hora y TrMnPR41248,

0.16 µmol/frasco/hora. La caracterización por Microscan® arrojo

presuntivo de P. fluorescens/putida (99.99%) para CaIChRI41R1 y

TrMnPR41248. Los dos microorganismos fueron inmovilizados en turba y

se evaluó su viabilidad en el portador hasta 180 dias. Para C. alliodora se

realizaron dos ensayos de germinación (semillas pequeñas: 6-8mm y

grandes: 8-10mm) y uno para T. rosea. A los tres grupos de semillas

se les evaluó la germinación hasta 48 días después de la siembra (DDS).

En un segundo grupo de ensayos, se evaluó el efecto de la inoculación de

CaIChRI41R1 y TrMnPR41248 sobre el crecimiento y desarrollo de

plantas jóvenes de C. alliodora y T. rosea respectivamente, a los 120

DDS. Los cinco ensayos siguieron un diseño unifactorial. Las

comparaciones estadísticas se realizarón con ANOVA, pruebas de

Duncan y Dunett (α=0.05). Se realizó reaislamiento de CaIChRI41R1 y

TrMnPR41248 120 DDS, a partir de la rizosfera y raíces de plantas de

C. alliodora y T. rosea inoculadas. Los resultados obtenidos para los tres

ensayos de germinación, no muestran diferencias estadísticamente

significativas entre los tratamientos para el valor de germinación (VG),

pese a lo cual la mejor tendencia sobre la germinación de las semillas la

tuvo CaIChRI41R1 para C. alliodora pequeñas y el control negativo para

C. alliodora grandes y T. rosea. En el ensayo de crecimiento y desarrollo

de C. alliodora se presentaron diferencias estadísticamente significativas

en altura (H), peso fresco de raíz (PFR) y peso seco de raíz (PSR). La

coinoculación de CaIChRI41R1 y Glomus manihotis tuvo un efecto

positivo sobre la altura de C. alliodora. El desarrollo radical de C. alliodora

mostró un mejor comportamiento bajo la inoculación de G. manihotis. El

porcentaje de micorrización de C. alliodora fue superior al 60% cuando se

inoculo con CaIChRI41R1 y G. manihotis. El ensayo de crecimiento y

desarrollo de T. rosea presentó diferencias estadísticamente significativas

para las variables altura (H), longitud de raíz (LR), peso seco aéreo (PSA),

peso seco raíz (PSR), peso fresco raíz (PFR) y peso fresco aéreo (PFA).

El mejor comportamiento para las variables PSA, H y LR lo mostró la

inoculación con TrMnPR41248. Para las variables NH, PFA, PFR y

micorrización, la coinoculación de TrMnPR41248 y G. manihotis tuvo un

efecto positivo. Glomus manihotis influyó positivamente sobre el PSR. Se

recuperaron colonias bacterianas con morfología similar a CaIChRI41R1 y

TrMnPR41248 de plantas de C. alliodora y T. rosea, respectivamente, 120

DDS.

ABSTRACT Isolates CalChRl41R1 and TrMnPR41248, endophytes of C. alliodora and

T. rosea respectively, were selected in order to evaluate the effect on

germination, growth and development of their natural hosts during the

nursery stage. Assessment of their biological activity showed that isolates

produce diffusible pigments on King B agar, grow on pectin agar and

exhibit phosphorous solubilization aureoles on SMRS agar. CalChRl41R1

produced 15.31 µg/ml indoleacetic acid (IAA) and TrMnPR41248

produced 3.63 µg/ml IAA on nutrient broth without tryptophane after

reactivation on potato agar. According to the acetylene reduction analysis

(ARA), nitrogen fixation rate of CalChRl41R1 is 2.74 µmol/flak/hour and

0.16 µmol/frasco/hora for TrMnPR41248. Microscan® characterization

suggests a presuntive P. fluorescens/putida (99.99%) for CalChRl41R1

and TrMnPR41248. Both microorganisms were immobilized with peat and

their viability within the holder was evaluated for 180 days. Two

germination assays were carried out with small (6-8 mm) and large (8-10

mm) seeds of C. alliodora and one with T. rosea. Germination was tested

on the three seed sets up to 48 days after sowing (das). In a second set of

assays, effect of inoculation of CalChRl41R1 and TrMnPR41248 on

growth and development of young plants of C. alliodora and T. rosea after

120 das respectively. The five experiments followed a unifactorial design.

Statistical comparisons were done with Anova, Duncan and Dunett tests

(α=0.05). CalChRl41R1 and TrMnPR41248 were reisolated 120 das from

rhizosphere and roots of inoculated C. alliodora and T. rosea plants.

Results obtained from the three germination assays do not show

statistically significant differences between treatments for the germination

value (GV) although the best tendency on germination was shown by

CalChRl41R1on small C. alliodora and the negative control for large C.

alliodora and T. rosea. The assay on growth and development of C.

alliodora revealed statistical significant differences on height (H), fresh root

weight (RFW) and dry root weight (DRW). Coinoculation of CalChRl41R1

and Glomus manihotis had a positive effect on height of C. alliodora. Root

development of C. alliodora showed a better performance after inoculation

with G. manihotis. Mychorrization percentage of C. alliodora was higher

than 60% when inoculated with CalChRl41R1 and G. manihotis. Growth

and development assay of T. rosea showed statistically significant

differences for variables height (H), root length (RL), leaf number (LN),

aerial dry weight (ADW), dry root weight (DRW), fresh root weight (FRW)

and aerial fresh weight (AFW). The best results on variables ADW, H and

RL were obtained after inoculation with TrMnPR41248. Coinoculation of

TrMnPR41248 and G. manihotis had a positive effect on variables LN,

AFW, FRW and mychorrization. Glomus manihotis had a favourable

influence on DRW. Bacterial colonies with morphology similar to

CalChRl41R1 and TrMnPR41248 were recovered from C. alliodora and T.

rosea plants 120 das respectively.

1

1. INTRODUCCIÓN

La creciente demanda del sector forestal por incrementar las plantaciones

de especies nativas de conservación y comerciales de alto valor

económico, ecológico y ambiental, ha impuesto a los viveros ser más

eficientes en los procesos de producción de material vegetal. Bajo este

contexto, y sabiendo que la propagación de este tipo de especies está

basada fundamentalmente en semilla se abordan múltiples estrategias

para favorecer la eficacia de los procesos de emergencia de plantas

jóvenes, dentro de las cuales se contempla el uso de microorganismos

promotores de emergencia radicular y de crecimiento vegetal.

En Colombia, Cordia alliodora Oken y Tabebuia rosea Bertold D.C son

dos especies forestales nativas de amplia aceptación en el mercado que

presentan durante su etapa de vivero, limitantes en las fases de

germinación, emergencia y sobrevivencia al transplante a bolsa a partir

de bancos de germinación. Una estrategia biotecnológica promisoria para

solucionar esta problemática y obtener plantas vigorosas, de mayor

competitividad y mejor establecimiento en campo es el uso de bacterias

promotoras de emergencia y de crecimiento vegetal, que favorezcan la

formación y crecimiento de raíces. Adicionalmente, bajo el desarrollo de

nuevas tecnologías de propagación forestal como la silvicultura clonal, el

uso de bacterias promotoras de crecimiento vegetal constituye una

estrategia potencial en el proceso de enraizamiento de estacas y de

material propagado in vitro de C. alliodora y T. rosea.

A partir de distintos tejidos vegetales en la Unidad de Biotecnología

Vegetal de la Pontificia Universidad Javeriana, se ha logrado el

aislamiento de bacterias endófitas de C. alliodora y T. rosea, de las cuales

se han caracterizado varios aislamientos con la capacidad de producir

hormonas de crecimiento vegetal y fijar nitrógeno atmosférico. Las

anteriores características biológicas hacen de estos microorganismos

2

potenciales promotores de crecimiento vegetal, y su reintroducción en el

sistema suelo-raíz durante la propagación de las especies podría

favorecer el crecimiento en vivero y la adaptación de T. rosea y

C. alliodora, a nuevas condiciones de cultivo.

El conocimiento y manipulación de algunos grupos funcionales

microbianos relacionados con estos árboles, favorecería el desarrollo de

técnicas capaces de reducir esfuerzos y costos del proceso de

reforestación disminuyendo los tiempos de permanencia de material en

vivero, mejorando la disponibilidad de nutrientes en el suelo y ayudando a

las plantas a tolerar las condiciones características de los suelos

tropicales.

Este trabajo hace parte del proyecto de investigación: Aislamiento y

caracterización de bacterias endófitas de C. alliodora y T. rosea,

financiado por la Pontificia Universidad Javeriana. Dentro de este

proyecto se aislaron y caracterizaron bacterias promotoras de crecimiento

vegetal asociados con las dos especies: Cordia alliodora y Tabebuia

rosea.

A partir de la determinación de su potencial como PGPB´s se planteó el

presente estudio con el fin de evaluar el posible beneficio de la

reintroducción de bacterias de origen endofítico en semillas y plantas

jóvenes de las dos especies forestales como estrategia para su manejo

inicial en vivero

3

2. MARCO TEÓRICO

2.1. Situación Actual de los Bosques en Colombia

Colombia presenta la deforestación indiscriminada como uno de sus más

importantes problemas ambientales, teniendo un promedio estimado de

deforestación de 600.000 hectáreas / año hasta 1987 y la tala de 43.3

millones de hectáreas entre 1960 y 1994, lo que ha generado una

sobreexplotación de los bosques y de las tierras forestales y por ende un

proceso de erosión que ha alcanzado el 20% del territorio nacional

(Niño, 1995).

En el año 2000 se formuló el Plan Nacional de Desarrollo Forestal

(PNDF), como una herramienta que permitiera lograr el máximo beneficio

económico y social para las poblaciones rurales cuya base productiva se

deriva del aprovechamiento forestal sostenible. Al aumentar el

componente social de la producción forestal en Colombia el PNDF busca

también aumentar la participación del sector forestal en la economía

nacional, favoreciendo la silvicultura y las actividades de transformación

con un criterio de manejo sostenible del recurso.

De este modo, El PNDF estimula la plantación de especies forestales

nativas y foráneas de alto valor comercial, con rápida y mediana

producción y fácil aplicación en sistemas de producción agroforestales.

Dentro de las especies nativas de dicho interés se encuentran el nogal

cafetero (Cordia alliodora Oken) (figura 1) y el roble o flor morado

(Tabebuia rosea Bertold DC) (figura 2) que cuentan con gran aceptación y

preferencia dentro de las especies forestales comerciales, gracias a que

poseen maderas semiduras y livianas con defectos moderados, con

buenas características de trabajabilidad y otros factores que las

convierten en especies con un alto potencial de explotación

(CONIF, 2002).

4

De Cordia alliodora hay plantadas en el país 422 hectáreas distribuidas en

los departamentos del Tolima, Santander, Cundinamarca, Risaralda,

Magdalena, Cauca, Valle del Cauca, Meta y Nariño, mientras que de

Tabebuia rosea hay establecidas 1.487 hectáreas en Antioquia, Atlántico,

Córdoba, Choco, Magdalena y Vichada (CONIF,1999).

2. 2. Generalidades de Cordia alliodora Oken.

2.2.1. Distribución Geográfica Es una especie nativa de América Tropical, que se encuentra distribuida

desde México hasta Argentina. En Colombia se halla desde el nivel del

mar hasta una altitud de1900 msnm, siendo muy frecuente en las zonas

cafeteras del país, donde es utilizada como sombrío del café. La especie

es característica de regiones de vida de bosque seco a bosque húmedo

tropical y en bosque húmedo y bosque muy húmedo premontano

(Tovar, 1978).

2.2. Clasificación Taxonómica División: Angiospermas

Clase: Dicotiledóneas

Familia: Boraginaceae

Genero: Cordia

Especie: Cordia alliodora

Sinónimos: Moho, Nogal cafetero, Canalete, Solera, Pardillo, Laurel, Vara

de Humo y Guácimo.

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Figura 1. Individuo adulto de Cordia alliodora Oken

Fuente: http://homepage.mac.com/ktanzi/Dendrology/PhotoAlbum46.html 2.2.3. Descripción Botánica Es un árbol que puede llegar a alcanzar alturas hasta de 40 metros, con

un tamaño común entre los 20 y 30 m y un diámetro a la altura del pecho

(DAP) de 80 cm. El fuste es recto y generalmente limpio de ramas a lo

largo de un 50 a 60% de la altura total. La corteza presenta color marrón

dorado pálido y cuando es jóven presenta color pardo oscuro

(CONIF, 1988).

2.2.4. Ecología Es una especie de fácil adaptación y es considerada una especie de

rápido establecimiento (Cuervo, 1997), encontrándose con frecuencia en

potreros y en vegetación secundaria proveniente de la selva alta, su

6

crecimiento es favorecido por la perturbación, por lo que se le considera

una especie pionera (Vanegas, 1983).

2.2.5. Manejo de la Especie en Vívero

Como mecanismo básico de producción de la especie en vivero se tiene

la propagación por semilla, debido al bajo éxito de los procedimientos de

propagación vegetativa. En Colombia se suele manejar para su

propagación por semilla sustrato de suelo, arena y cascarilla de arroz en

proporción 2:1:1, en el cual, transcurridos de 10 a 20 días después de la

siembra se logra la germinación de las semillas. La siembra de las

semillas se hace al voleo con una profundidad de siembra de 1 a 1.5cm,

sin tener establecido un proceso de selección de fuente semillera, en el

que se establezcan sus características genéticas, fitosanitarias y

fisiológicas (CATIE, 1997).

Según reportes de Caballero y Cortes (1991) y Cuervo (1997),

C. alliodora es una especie micótrofa asociada principalmente, con

hongos de los géneros Glomus y Entrophospora, así es una práctica

común en vivero la inoculación con hongos formadores de micorriza

arbuscular para obtener material micorrizado vigoroso para el transplante

a campo.

2.2.6. Semilla La semilla se encuentra en un fruto parecido a una nuez que cuando

madura toma una forma elipsoidal con paredes delgadas. La semilla mide

de 6 a 10 mm de largo y de 5 a 6 mm de ancho, carece de endospermo,

el embrión ocupa toda la cavidad y presenta una plúmula diferenciada con

la radícula prominente. Su peso es variable según su distribución natural.

En Colombia se ha reportado un porcentaje de pureza de 80 a 95%

(CATIE, 1997).

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La germinación de tipo hipogea de estas semillas se inicia dos semanas

después de la siembra y finaliza en la sexta semana. A los veintiséis días

de sembrada presenta un par de hojas cotiledoneales grandes de forma

orbicular, a los treinta y cinco días aparece el primer par de hojas

verdaderas, completándose el desarrollo de 6 a 9 semanas después de la

siembra (CATIE,1997).

2.2.7. Problemas Fitosanitarios en Vívero

Las semillas suelen ser dañadas por gorgojos del género Amblycers,

depredadores naturales que afectan las semillas desde el momento de

recolección en campo (Serrada, 1995).

En análisis fitosanitarios de semillas se han reportado hongos de los

géneros Fusarium y Cladosporium, con una incidencia del 83% y 66%

respectivamente y Epicocum, Curvularia y Nigrospora, con una incidencia

del 6%. Es una especie susceptible al daño por insectos a nivel de la

madera, el tallo, raíz y hojas, presentándose decoloración y caída

prematura debido al ataque de coleópteros e insectos defoliadores como

Dictyla monotripidia (Serrada,1995). Además, presenta interacción

biológica con la especie de hormigas Azteca longiceos, la cual forma

colonias en las ramas terminales, lo que se considera un mecanismo de

defensa contra plagas (Serrada, 1995).

2.3. Generalidades de Tabebuia rosea Bertold D.C

2.3.1. Distribución Geográfica

Se presenta naturalmente desde México, hasta Ecuador y Venezuela,

encontrándose en Colombia desde el nivel del mar hasta los 1900 msnm

en bosque seco y húmedo tropical. Para su desarrollo requiere una

temperatura superior a los 21ºC (Vanegas, 1983).

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2.3.2. Clasificación taxonómica

División: Angiospermas

Clase: Dicotiledóneas

Familia: Bignoniaceae

Genero: Tabebuia

Especie: Tabebuia rosea Bertold D.C

Sinónimos: Tabebuia pentaphyla, Tabebuia pallida, Tecota rosea,

Couralia rosea

Nombres Vulgares: Flormorado, Ocobo, Roble, Chicala, Guayacán Lila,

Guayacán Rosado, Guayacán flor Rosado, Guayacán Morado, Roble

Blanco y Roble de Sabana.

Figura 2. Individuo adulto de Tabebuia rosea Bertold D. C.

http://da-academy.org/images/pinkpoui1.jpg

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2.3.3. Descripción Botánica Es un árbol de talla alta mediana que alcanza alturas entre 20 y 30 m,

con una altura comercial entre 12 y 13 m y un DAP entre 50 y 70 cm

(Tovar,1978). La corteza del tronco es de color gris oscuro, con la

presencia de abundantes y largas fisuras o grietas verticales presentes

tanto en el tronco como en las ramas más gruesas (Trejo, 1978).

2.3.4 Ecología Tabebuia rosea resiste terrenos inundados como los del medio y bajo

Magdalena Colombiano, adaptándose a gran variedad de suelos en los

que se asocia naturalmente con C. alliodora, Cedrela odorata y Ceiba sp.,

entre otras (Cuervo, 1997).

2.3.5. Manejo de la Especie en Vívero

La especie se produce en vivero de diversas maneras. La germinación en

bolsas o en camas con el posterior transplante a bolsas es la más

utilizada. Es una especie que permite su propagación por técnicas

vegetativas a través de estacas y sexualmente por semilla, teniendo que

el tiempo de permanencia en vivero es de 4 a 5 meses, período en el cual

las plantas alcanzan de 25 a 45 cm de altura (CATIE, 1997). Los mayores

limitantes para la germinación óptima de las semillas de T. rosea en

vivero son la heterogeneidad de las semillas, el almacenamiento, la

utilización de semillas de fuentes semilleras no identificadas y la falta de

certificación de las mismas (Mendez y Soihet, 1997). Adicionalmente se

presentan bajos porcentajes de germinación asociados con la presencia

de enfermedades.

De acuerdo al estudio realizado por Cuervo (1997), T. rosea es una

especie micótrofa que se asocia con Glomus manihotis, G. occultum y

Entrophospora colombiana, lo que plantea la necesidad de la

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micorrización como práctica silvicultural en vivero, para lograr el

crecimiento normal de la especie y su adaptabilidad a suelos con diversas

limitantes para el desarrollo vegetal (Cuervo, 1997; CONIF, 1999).

2.3.6. Semilla

Sus semillas son blandas, comprimidas, discoidales y permeables,

provistas de dos alas membranosas laterales de color pardo claro; de 0.7

a 1.0 cm de largo y de 2.8 a 4.4 cm de ancho. Están dispuestas en gran

número dentro de vainas, las cuáles en el periodo de maduración durante

el tiempo seco se abren y liberan la semilla (CATIE, 1997).

Las semillas llegan a presentar un porcentaje de pureza entre el 74 y

95%, estas pueden tener una viabilidad óptima entre los 6 meses y los 2

años dependiendo del lote de semillas y del almacenamiento de las

mismas, se han obtenido porcentajes de germinación del 79 al 90% en

semillas recién colectadas. El tiempo para que inicie la germinación es de

25 dds (Mendez y Soihet, 1997).

2.3.7. Problemas Fitosanitarios en Vivero En las semillas se han reportado daños por coleópteros de la familia

Bruchidae y por gorgojos del género Amblycers. También se han aislado

hongos de la semilla, los cuales conllevan a un cambio de color de ésta,

pasando de coloración rosada a oscura cuando ya se han deteriorado. En

análisis fitosanitarios se han reportado los géneros Fusarium

Cladosporium, Nigrospora y Curvularia, con incidencia del 35% y

Phomosis y Ascochyta, con una incidencia del 12% (Serrada, 1995). La

especie es susceptible al ataque de nemátodos, principalmente

Meloidogyne incognita que ocasiona amarillamiento y secamiento de la

plántulas y la reducción del sistema radicular. En germinación se reporta

“damping off”, ocasionado por Rhizoctonia sp. y Phoma sp. (CATIE,

11

Dentro de la estrategias para el control de agentes fitopatógenos en

especies forestales, se ha descrito la inoculación con bacterias

promotoras de crecimiento vegetal que inducen resistencia sistémica y

disminuyen la presencia de la enfermedad.

Adicionalmente trabajos como el de Cruz y Neira (2004) y Zambrano

(2004) muestran que la inoculación de PGPB’s en especies forestales,

favorece el desarrollo vegetal y brinda un mayor vigor y adaptabilidad de

las plantas jóvenes a condiciones de campo.

2.4. Bacterias Promotoras de Crecimiento Vegetal, PGPB’s

El término de bacterias promotoras de crecimiento vegetal PGPB´s (Plant

growth promoting bacteria) fue acuñado por Joe Kloepper en 1980, en la

Universidad de Auburn de Estados Unidos de América, haciendo

referencia a un grupo de microorganismos benéficos para el desarrollo de

las plantas los cuales se pueden encontrar o no asociadas a diversos

tejidos vegetales (Tenuta, 2005).

Varios grupos de microorganismos del suelo como Azotobacter sp.,

Azospirillum sp., Azoarcus sp., Klebsiella sp., Bacillus sp.,

Pseudomonas sp., Arthrobacter sp., Enterobacter sp., Burkholderia sp.,

Serratia sp. y Rhizobium sp. son consideradas PGPB’s (Kloepper, 1983).

Se han encontrado y caracterizado microorganismos como Pseudomonas

putida y Pseudomonas fluorescens como potenciales PGPB’s gracias a

que poseen un metabolismo versátil y la capacidad de utilizar diversos

sustratos liberados por la planta para su desarrollo. Adicionalmente

poseen tiempos cortos de generación, alta movilidad, fijación biológica de

nitrógeno, capacidad para colonizar las raíces y producción

12

de.metabolitos secundarios que pueden regular el crecimiento vegetal y

regular la poblaciones microbianas rizosfericas (Kapulnik, 2002).

2.4.1. Mecanismos de promoción de crecimiento vegetal mediados por PGPB’s El efecto de las PGPB’s sobre el crecimiento y desarrollo vegetal se debe

a mecanismos de acción directos o indirectos. Entre los mecanismos

directos se encuentra la producción de hormonas como auxinas,

giberelinas, citoquininas y etileno, la producción de ácidos orgánicos, la

fijación de nitrógeno, la solubilización de fosfato y otros nutrientes y la

movilización de los mismos (Wall, 2001).

Dentro de los mecanismos indirectos están la protección frente a

patógenos por interacciones de antagonismo, producción de antibióticos,

liberación de enzimas como quitinasas y glucanasas, además de la

inducción de resistencia sistémica en la planta a virus, bacterias y hongos

patógenos, por lo cual se conocen como agentes de bioprotección

(Pal et al., 2000).

2.4.1.1 Fijación Biológica de Nitrógeno (FBN) El nitrógeno es uno de los nutrientes de mayor demanda por las plantas,

pero frecuentemente su baja disponibilidad es un factor limitante en la

producción de diversos cultivos de importancia agrícola y forestal; por lo

cual la aplicación y presencia en el sistema suelo – planta de

microorganismos capaces de fijar dicho elemento es de importancia en el

adecuado desarrollo de las plantas. El factor biótico que más condiciona

el proceso biológico de fijación de nitrógeno son las tensiones de oxígeno

que pueden inhibir la funcionalidad de la enzima nitrogenasa, razón por la

cual los microorganismos fijadores de nitrógeno han sido divididos en

cuatro grupos de acuerdo a su capacidad para tolerar diversas tensiones

13

de oxigeno sin limitar el funcionamiento de la enzima nitrogenasa

(Sylvia, 1999).

• Bacterias de vida libre fijadoras de nitrógeno heterotróficas

• Bacterias aeróbicas y microaerofilicas

• Anaerobios facultativos

• Anaerobios obligados

Dentro del grupo de las bacterias aeróbicas y microaerofílicas se

encuentran endófitos diazótrofos como Azotobacter diazotrophicus,

Herbaspirilum sp. y Azoarcus sp., los cuales se han encontrado en

concentraciones que varían entre 103 y 105 UFC/g de tejido y su

multiplicación suele presentarse en los vasos del xilema y en los espacios

intercelulares (Kapulnik, 2002).

Además de la capacidad de fijar nitrógeno muchos endófitos PGPB’s

cuentan con la capacidad biológica de sintetizar fitohormonas, las cuales

son aplicables para regular y promover el crecimiento y desarrollo vegetal.

2.4.1.2. Producción de Fitohormonas Muchas sustancias orgánicas son capaces de regular el crecimiento

vegetal debido a que afectan la fisiología de las plantas y sus procesos

morfológicos a muy bajas concentraciones. Dentro del término PGPB’s,

gran parte de la actividad promotora de crecimiento recae en la síntesis

por parte de los microorganismos de fitohormonas como auxinas,

citoquinas y giberelinas (Jagnow & David, 1991; Dobblelaere et al., 2003).

2.4.1.2.1. Auxinas: Ácido Indol Acético

La palabra auxina significa en griego 'crecer' y es dada a un grupo de

compuestos que estimulan la elongación de las células. De estos, el AIA

14

es la forma natural predominante. Aunque las auxinas se encuentran en

toda la planta, las más altas concentraciones se localizan en las regiones

meristemáticas que se encuentran en crecimiento activo, debido a que en

dichos sitios se da su síntesis dentro de la plantas (Hans, Walter & Heldt,

1997).

La principal auxina endógena es el ácido indol-3-acético (AlA). Es

sintetizada a partir del L-triptófano, que puede estar libre o formando parte

de proteínas. Por acción de una transaminasa se transforma en ácido

indolpirúvico, el cual se descarboxila por acción de una descarboxilasa

formándose indol-acetaldehído. Luego actúa una oxidasa que lo

transforma en ácido indol acético. Existen otras vías de síntesis que

conducen al compuesto mediante la formación intermedia de triptamina, o

bien mediante un intermediario nitrílico. El AIA se puede transformar en

ácido indol butírico por acción de una sintasa (Hans, Walter & Heldt et al.,

1997).

Los microorganismos que habitan en la rizosfera de varias plantas son

capaces de estimular en ellas la producción de auxinas, gracias a su

acción elicitora por la secreción de metabolitos secundarios producto de

la asimilación de diversos exudados producidos por las plantas (Waisel,

2002).

Así mismo, Los microorganismos también pueden producir AIA dentro de

su metabolismo secundario. Las vías de síntesis de AIA por parte de los

microorganismos son diversas y un gran número de genes está implicado

en su regulación y expresión; tal es el caso de la vía del indol-3-

acetamida (IAM), común de los organismos fitopatógenos. Las bacterias

benéficas sintetizan el AIA por la vía del ácido Indol 3 pirúvico (IpyA).

Donde el L-Triptófano es oxidado finalmente a ácido indol acético. Los

genes que codifican para la síntesis de AIA, se encuentran en plàsmidos

o integrados a los cromosomas (Kapulnik, 2002).

15

También existen evidencias de biosíntesis de AIA independiente del

L-triptófano (cuyos precursores son el indol y el indol-3-glicerol fosfato),

pero esta es poco conocida (Soberón et al., 2005).

• Modo de Acción de las auxinas en la planta

Las auxinas actúan a nivel génico regulando la expresión de múltiples

genes. El AIA se une a un receptor de naturaleza proteica, formando un

complejo receptor-hormona de carácter reversible, específico, con alta

afinidad y saturable. Este complejo activa un promotor que controla la

expresión de los genes que codifican la síntesis de las enzimas

catalizadoras de los compuestos de la pared (Hans et al., 1997).

• Efectos Fisiológicos en la Planta Dentro de la acción fisiológica de las auxinas podemos nombrar su

participación en la mitosis, alargamiento celular, formación de raíces

adventicias, dominancia apical, gravitropismo, floración, emergencia y

elongación radicular entre otros (Hans et al., 1997). Las auxinas

sintetizadas durante el proceso de germinación por el endospermo y el

embrión, hacen visible el proceso de emergencia, gracias a que este tipo

de hormonas inducen el alargamiento de los meristemos de la radícula

primero y del tallo después, con un rápido crecimiento determinando el

inicio de la diferenciación de los tejidos, así como el crecimiento

direccional del tallo hacia arriba, y de la raíz hacia abajo (Rojas, 1987).

2.4.2. Acción Bioprotectante de las PGPB`s La actividad bioprotectante se caracteriza por el control de organismos

causantes de enfermedad en especies vegetales. Esta actividad ha sido

reportada en géneros bacterianos como Bacillus, Streptomyces,

Pseudomonas, Burkholderia, Enterobacter y Agrobacterium (Ping, 2004).

16

Los mecanismos descritos para el control biológico abarcan diversos

grados de interacción entre los cuales la competencia por espacio y

nutrientes, la inducción de resistencia sistémica y la síntesis de

metabolitos secundarios, son los más importantes (Waisel et al., 2002).

2.4.2.1. Competencia en la Rizosfera Las PGPB´s, en general son colonizadoras altamente agresivas por lo

cual suelen desplazar microorganismos o especies deletéreas de la

microflora de la raíz desencadenando con ello un descenso de las

poblaciones de hongos y bacterias rizosféricas. Una bacteria altamente

competitiva tiene un rápido crecimiento, es movil y presenta quimotaxis

por los exudados radicales. Solamente del 8 al 20% de la superficie de las

raíces es colonizada por bacterias, siendo las zonas de mayor exudación

las que presentan mayor colonización (Kapulnik, 2002).

2.4.2.2. Resistencia Sistémica Inducida (ISR) En la década de los 80`s se sugiere por primera vez que las PGPB´s

podían inducir la ISR gracias a la síntesis de algunos metabolitos

antipatogénicos producto de su interacción con organismos fitopatógenos,

los cuales podían actuar como elicitores desencadenantes. Zhou y Paulitz

(1994, citados por Kapulnik, 2002), encontraron que la aplicación de

Pseudomonas fluorescens a los sistemas radicales de pepino lo protegía

del ataque de Phytium apanidermatum. Pero la aplicación de PGPB´s en

semillas o raíces no solamente induce resistencia en la raíces sino que

también produce efecto contra la enfermedad en hojas y brotes. También

se ha reportado que Pseudomonas putida y Serratia marcescens inducen

resistencia sistémica contra Fusarium sp. en pepino. Dentro de los

metabolitos sintetizados por las PGPB´s que tienen la capacidad de

actuar como elicitores se encuentran principalmente los sideróforos por lo

17

que las bacterias del género Pseudomonas tienen especial importancia

(Kapulnik, 2002).

2.4.2.3. Producción de Sideróforos El hierro es un elemento esencial para la mayoría de organismos. En el

suelo la concentración de hierro disponible puede constituir una limitación

para el desarrollo de las plantas, quienes desarrollan estrategias para

poder utilizar ese hierro no disponible. Una de esas estrategias es la

producción y excreción de sideróforos que son quelatos de bajo peso

molecular y alta especificidad por Fe3+, los cuales se solubilizan formando

un complejo Fe3–sideróforo. Estos complejos son reconocidos y

transportados hacia el citosol por una proteína receptora específica de

membrana externa (Mehta & Nautiyal, 2001; Instituto de Investigaciones

Biológicas Clemente Estable, 2003).

Por otro lado la capacidad que tienen muchos microorganismos de

internalizar el hierro no disponible es fundamental para la obtención de

este. Las formas en que lo logran son: la producción de sideróforos y

ácidos orgánicos que pueden formar complejos de hierro (Montie, 1998).

Los sideróforos pueden ser de varias clases: catecolatos, hidroxamatos e

hidroxicarboxilatos (Montie, 1998). Mientras que algunas bacterias

producen solo un tipo de sideróforos otras secretan múltiples tipos

haciéndolas más eficientes ya que les permite colonizar diferentes

hábitats. Por ejemplo, Escherichia coli produce dos tipos de sideróforos:

enterobactina y aerobactona. Estas también son consideradas los

sideróforos primarios de otras enterobacterias como Shigella sp.,

Salmonella sp., Klebsiella y Yersinia sp. (Farinati, 1999).

En el caso de los sideróforos producidos por Pseudomonas fluorescens,

se ha observado pioverdinas o piocianinas, que se producen en ausencia

18

de hierro soluble y son liberados al medio. Una forma de detectar su

presencia es la siembra en agar King B donde los pigmentos difusibles

(piverdinas o piocianinas) presentan o no fluorescencia y difusión en el

medio (Kapulnik, 2002).

2.4.2.4. Solubilización de Fósforo Inorgánico Muchos microorganismos tanto hongos como bacterias presentes en el

suelo son capaces de solubilizar fósforo inorgánico. Entre estos se

encuentran los géneros Pseudomonas, Mycobacterium, Micrococcus,

Bacillus, Flavobacterium, Streptomyces, Penicillium, Sclerotium,

Fusarium, Aspergillus y otros, que son capaces de solubilizar in vitro

fosfatos insolubles normalmente presentes en el suelo.

La solubilización debe ocurrir en la rizosfera por dos razones: 1. La lenta

difusión del fosfato en el suelo y 2. La falta de sustratos fuera de la zona

rizosférica. Los exudados radicales y residuos vegetales proveen el

sustrato energético para soportar la intensa actividad microbiológica

característica de la rizosféra y para llevar a cabo la solubilización de

fosfatos (Burbano, 1989).

La solubilización de fosfatos minerales insolubles, se da por la secreción

de ácidos orgánicos tales como el láctico, oxálico y cítrico por parte de los

microorganismos. En los medios utilizados para establecer actividad

fosfato solubilizadora in vitro se desarrollan zonas claras alrededor de las

colonias microbiales, las cuales indican un viraje en el pH del medio a

causa de la síntesis de los ácidos mencionados anteriormente (Mehta &

Nautiyal, 2001). Las bacterias fosfato solubilizadoras como

Bacillus megaterium y Pseudomonas fluorescens, producen fosfatasas o

ácidos orgánicos que solubilizan formas orgánicas e inorgánicas de

fósforo no disponible en la solución del suelo (Mehta & Nautiyal, 2001).

19

2.4.2.5. Producción de Enzimas Líticas Extracelulares

Las sustancias pépticas son polisacáridos en cadena, de alto peso

molecular, que están conformadas generalmente por L-arabinosa,

D-galactosa y ácido D-galacturónico como principales monosacáridos y

otros azucares en menor proporción, como L-ramnosa, L-fucosa, D-

glucosa y D-xilosa. Tres homopolisacáridos son constituyentes de la

triada péctica: poligalacturanos, galactanos y arabinos (Buchanan, 2003).

Las mismas plantas poseen la capacidad de hidrolizar sus polisacáridos

de pared. Las paredes transversales por ejemplo se degradan en la

formación de los vasos xilemáticos, la absición de hojas, caída de frutos y

en ocasiones la germinación de las semillas, van acompañados de la

degradación de la pared celular, a veces en zonas muy concretas

(Buchanan, 2003).

Las pectinas se degradan principalmente por la acción de la

pectinogalacturonasa y los metilésteres mediante la pectinmetilesterasa.

Las enzimas responsables de la hidrólisis de los polisacáridos de pared

celular tanto de origen bacteriano como fúngico y vegetal son muy

especificas para enlaces glucosídicos. Las pectinasas suelen ser una

mezcla de enzimas que se pueden separar y purificar (Gil, 1995). Los

microorganismos tanto patógenos como benéficos tienen también la

capacidad de producir pectinasas.

2.5. Efectos de las PGPB’s sobre el Crecimiento Vegetal Las bacterias asociadas o libres en el sistema planta-suelo presentan

diferentes efectos sobre el material vegetal, producen fitohormonas,

incrementan la velocidad de germinación de semillas, estimulan la

formación de raíces, fortalecen los mecanismos naturales de defensa de

la planta (resistencia sistémica), solubilizan nutrientes no disponibles para

20

las plantas, incrementan la respuesta a la fertilización química u orgánica,

reducen las pérdidas de N por lavado, aumentan la tolerancia al estrés

hídrico y al ataque de plagas o enfermedades, entre otros

(Kapulnik, 2002).

2.5.1. Aumento de la Germinación y Emergencia de Semillas En los años 70`s se demostró que la baja tasa de germinación de algunas

semillas de hortalizas podía ser aumentada mediante el tratamiento con

cepas de Pseudomonas sp. (Kapulnik, 2002). Eklund (1970), sugirió que

las quinonas sintetizadas por las PGPB’s son las responsables de este

fenómeno induciendo un incremento en la emergencia de las semillas.

Posteriormente el mismo evento fue reportado en Canadá en la

emergencia de semillas de soya y canola (Kapulnik, 2002).

2.5.2. Aumento de la Toma de Nutrientes y Agua por las Raíces La inoculación de plantas jóvenes de sorgo y maíz con Azospirillum sp. ha

tenido efectos marcados en la morfología de las raíces, favoreciendo la

proliferación de pelos radicales, el aumento de la superficie radical y en

términos generales un buen desarrollo del sistema de raíces. Este

aumento de la superficie radical le permite a la planta una mayor

exploración del suelo y por ende tener mayor acceso a nutrientes y agua

(Kapulnik, 2002).

Muchos de los microorganismos que son caracterizados como PGPB`s y

que cumplen las características mencionadas anteriormente, son aislados

tanto de suelo como de tejidos vegetales. Estos últimos son considerados

como microorganismos endófitos.

21

2.6. Microorganismos Endófitos Los endófitos son un grupo específico de microorganismos (bacterias,

actinomicetos y hongos) que pueden encontrarse en diferentes tipos de

tejidos vegetales incluyendo los de semillas, frutos, hojas, tubérculos,

tallos etc. Estos presentan una ocurrencia alta en los cultivos de

importancia agrícola y alta relevancia en sus sistemas de producción

(Surette & Sturtz, 2003).

En Colombia se han aislado diferentes microorganismos endófitos

colonizadores de raíces de árboles "élite" de la especie Alnus acuminata

var. Acuminata la mayoría de los aislamientos corresponden al

actinomiceto Frankia sp., (Botero, 1998), igualmente se han aislado

microorganismos endófitos de Cordia alliodora y Tabebuia rosea de

diferente material vegetal (Vargas, 2006).

Las bacterias endófitas han mostrado actividad promotora de crecimiento

vegetal en diferentes cultivos de importancia económica como papa,

tomate y arroz. Diversos aislamientos son capaces de inducir resistencia

frente a estreses tanto bióticos como abióticos en plantas inoculadas;

también se ha demostrado que las comunidades de endófitos disminuyen

el desarrollo de enfermedades y en algunas instancias la relación planta-

endófito ha mostrado especificidad por el tipo de tejido de colonización

(Surette & Sturtz, 2003).

Gran parte de los estudios de bacterias endófitas se han encaminado a

describir su relación con las raíces de las plantas y sus efectos sobre la

promoción de crecimiento vegetal, dejando a un lado la relación de los

endófitos con semillas y su posible acción sobre su germinación y

emergencia. Aunque las bacterias que promueven el crecimiento son

frecuentemente inoculadas sobre semillas, no se conoce si dichos

microorganismos pueden desarrollarse en sincronía con la planta y

22

colonizar tejidos aéreos o radicales, por lo que se ha planteado en

muchas ocasiones la reinoculación de estos organismos después del

desarrollo vegetal (Cankar et al., 2005).

Otro tipo de microorganismos endófitos ampliamente utilizados en la

agricultura son los hongos de micorriza, que establecen relaciones

simbióticas muy evolucionadas con raíces de plantas superiores, en las

cuales el hongo depende de la planta para la obtención de carbono y

energía, y a su vez la planta recibe del hongo diferentes nutrientes

minerales, gracias a una mayor exploración del suelo mediante el micelio

externo del hongo y tolerancia a estreses bióticos y abióticos

(Read, 1997).

Cankar et al (2005), reportaron efectos positivos de la inoculación de

algunos aislamientos de endófitos de Picea abies (L.) Karst sobre el

crecimiento y micorrización de plantas jóvenes de la misma especie.

2.7. Calidad de las Plantas Producidas en Vivero La producción de plantas en vivero requiere del aseguramiento de la

calidad y buenas prácticas de producción en cinco ejes fundamentales: la

calidad de la semilla, el sustrato que se utiliza en su propagación, su

estado sanitario, su desarrollo radical y la asociación con

microorganismos benéficos como bacterias y hongos (Montoya, 1996).

Por esta razón cualquier desarrollo de un paquete tecnológico que

involucre la inoculación con microorganismos benéficos debe integrarse

con cada uno de los elementos mencionados anteriormente, buscando en

la medida de lo posible que sus características se potencialicen por el uso

de los microorganismos introducidos (Montoya, 1996).

23

2.7.1 Calidad de la Semilla Las semillas de los árboles y arbustos constituyen una de las formas más

importantes de germoplasma primario, ya que a partir de ellas se lleva a

cabo la regeneración natural o artificial de los bosques (Niembro, 1988).

Una semilla de buena calidad debe ser gruesa y homogénea, presentar

una coloración uniforme, no presentar signos de descomposición como

mal olor y textura blanda, tener un embrión viable y estar en un grado

óptimo de maduración (Montoya, 1996). A nivel de vivero se busca que

los lotes de semillas que se emplean presenten una germinación

uniforme, lo que implica el desarrollo de prácticas de clasificación y

selección de recursos semilleros y de procesos biológicos que regulen la

germinación.

A nivel de laboratorio se pueden realizar pruebas que permitan medir la

viabilidad de los embriones, como la prueba de viabilidad con sales de

tetrazolio, método desarrollado en 1940 por el profesor Georg laxon en

Alemania. La prueba se fundamenta en la viabilidad del embrión gracias

a su respiración relativa y a su estado de hidratación. Se sabe que

durante el proceso de respiración muchas enzimas son activadas, en

especial las enzimas deshidrogenasas que indican la actividad

respiratoria y la viabilidad del embrión, debido a que utilizan como

sustrato las sales de tetrazolio, liberando iones que al ser oxidados

producen un cambio en la coloración de las semillas. Además de este

procedimiento se han descrito otras pruebas para medir la viabilidad de

las semillas: coloraciones vitales, métodos de actividad enzimática,

análisis de ácidos grasos libres, entre otros (Copeland, 1995).

24

2.7.1.1. El proceso de Germinación El proceso de germinación de acuerdo a Rojas (1987) se divide en seis

etapas:

1. La toma de agua del medio por la semilla en la cual tanto las células del

embrión como del endospermo se hidratan y entran en actividad.

2. La síntesis de acido giberélico (GA) el cual actúa sobre la capa de

aleurona que rodea al endospermo y la induce a secretar amilasa.

3. Por acción de la amilasa y la maltasa, el almidón pasa a glucosa

teniendo el embrión energía para su desarrollo.

4. El embrión empieza a producir citoquininas, hormonas que, junto con

el GA, inducen síntesis de enzimas y la aleurona pasa a proteína

soluble.

5. Por acción de las citoquininas y contando con la energía de la glucosa

y con proteínas solubles, las células del embrión se dividen activamente,

momento en el cual se inicia la germinación al romper la testa el primordio

de la raíz principal.

6. Las células del endospermo, y posteriormente las del embrión,

sintetizan auxinas que inducen el alargamiento de los meristemos, la

diferenciación de los tejidos y los procesos de dominancia apical y de

geotropismo.

Así, las hormonas de crecimiento vegetal juegan un papel importante en

el proceso de germinación, y su aplicación exógena mejora de forma

importante el proceso germinativo. Muchos microorganismos tienen la

capacidad de sintetizar fitohormonas y liberarlas al medio por lo que se

constituyen en una fuente potencial exógena de hormonas de crecimiento

vegetal.

25

2.7.2 Asociación con Microorganismos Benéficos en Especies Forestales A nivel del sector forestal se presenta una amplia cultura de la inoculación

del material vegetal con hongos de micorriza arbuscular, lo cual se ha

convertido en un parámetro de calidad para la elección de las plantas

jóvenes por parte de los compradores. La micorrización es un proceso

que puede ser afectado por diferentes microorganismos del suelo como

las PGPB´s (Montoya, 1996).

Bajo ese contexto el desarrollo de un paquete tecnológico que incluya un

factor biótico como bacterias debe contemplar su interacción con HMA y

su posible efecto sinérgico sobre la germinación y desarrollo de las

plantas jóvenes.

A nivel de inoculación de PGPB´s se ha utilizado Azopirillum lipoferum en

raíces inducidas in vitro de Cedrela montana donde se observó aumento

de la tasa de crecimiento de la raíz y de formación de raíces adventicias

(Baquero, 2002), por otro lado se han inoculado semillas y plantas

jóvenes de Cedrela montana, obteniéndose porcentajes de germinación

del 100% con la inoculación de Azospirillum lipoferum y promoción del

crecimiento gracias a su inoculación (Parra, 1996).

En Gmelina arborea se inocularon Azospirillum brasilense y HMA

evidenciándose sinergismo entre los microorganismos evaluados en el

proceso de micorrización y en el crecimiento vegetal (Zambrano, 2004).

Los microorganismos necesitan de un portador para ser reintroducidos

en el sistema suelo-raíz o en la semilla de diferentes especies vegetales.

Así, la evaluación de diferentes portadores y concentraciones a inocular

hacen parte del desarrollo de inoculantes microbianos.

26

2.8. Inoculantes Microbianos 2.8.1. Definición de Inoculante

Los inoculantes microbianos son el resultado de la formulación de uno o

más microorganismos benéficos en un material de soporte de fácil manejo

y económico. La formulación de los inoculantes dentro de sus múltiples

aplicaciones, mejora procesos como la toma de nutrientes y promoción de

desarrollo vegetal (Bashan, 1998).

2.8.2. Características y Tipos de Soporte La característica de todo soporte debe ser mantener viable y en altas

concentraciones los microorganismos en el momento de su inoculación,

por lo cual debe cumplir con una serie de características físicas y

químicas entre las cuales la esterilidad, la uniformidad del material, la

retención de agua y la compatibilidad con diferentes especies

microbianas son básicas. Además deben ser compuestos de baja

residualidad evitando de este modo la dispersión de células a la

atmósfera o a aguas subterráneas (Bashan, 1998).

Se conocen diferentes tipos de soportes: suelos como turba, suelo

inorgánico, el compost, aceites vegetales, vermiculita, roca fosfórica,

perlas de alginato y los liofilizados que son incorporados a un soporte

sólido o directamente al sustrato de siembra (Bashan, 1998).

27

3. FOMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 3.1. Planteamiento del Problema

Las plantaciones de Cordia alliodora y Tabebuia rosea, especies

maderables con alta aceptación y demanda en Colombia, alcanzan en la

actualidad una extensión superior a 1800 ha, las cuales se encuentran

distribuidas en los departamentos de Atlántico, Córdoba, Antioquia,

Risaralda, Quindío, Caldas y Valle entre otros. Sin embargo, su desarrollo

en vívero sigue presentando limitaciones en los procesos de germinación

y transplante, por lo cual una gran cantidad de material vegetal se pierde

en estas etapas y en muchas ocasiones no se llega a la producción

adecuada de lotes homogéneos de plantas jóvenes para satisfacer las

necesidades de reforestación tanto comercial como de conservación.

Habitualmente en vivero las semillas de ambas especies tienen como

tratamiento pregerminativo la inmersión en agua por 24 horas para

acelerar el inicio de la emergencia radicular y finalizar los procesos de

dormancia. A pesar de esto los porcentajes de germinación siguen siendo

bajos y la baja selección de recursos semilleros dificulta la obtención de

lotes homogéneos de semillas.

Además de esto la producción de plantas jóvenes bajo malas condiciones

de crecimiento y desarrollo dificulta su establecimiento y competencia en

campo por lo que se manejan altos porcentajes de pérdida de individuos,

lo que limita un adecuado establecimiento de plantaciones forestales con

especies nativas.

3.2. Justificación Con el crecimiento de la población mundial, la demanda de los diversos

bienes y servicios que producen los bosques como lo recursos

madereros, la producción de resinas, frutos, follaje, la captación de

carbono, la manutención de la cuencas de los ríos, entre otros, también

28

se incrementan. Así, la inversión en múltiples frentes, en especial en el

campo de la investigación técnica y científica en el sector forestal es

necesaria para consolidar el éxito de dicho sector. La creciente demanda

de productos del bosque, trae como tarea la recuperación de suelos hasta

ahora utilizados en esquemas intensivos de agricultura y ganadería; para

lo cual la disposición de material vegetal de la mejor calidad para

proyectos de reforestación es el punto inicial de la cadena de restauración

y de producción de los nuevos bosques.

Se ha observado, que la inoculación de semillas con bacterias promotoras

de crecimiento vegetal incide de forma positiva en su germinación y

emergencia, además, la aplicación de dichos microorganismos a plantas

jóvenes de especies forestales puede llevar a la obtención de plantas de

tamaño homogeneo, vigorosas y con un desarrollo radical adecuado para

su transplante a campo.

En estudios previos en el Laboratorio de Asociaciones Suelo-Planta

Microorganismo de la Unidad de Biotecnología Vegetal de la Pontificia

Universidad Javeriana se ha observado el efecto de PGPB`s en especial

Azospirillum brasilense, en la germinación y crecimiento de Retrophyllum

rospigliosii, Cedrela sp. y Gmelina arborea; evidenciándose en ellas un

efecto benéfico en las primeras etapas del desarrollo vegetal. Este efecto

es atribuido a la actividad biologica de los microorganismos,

especialmente a la producción de ácido indol acético y a la fijación

biológica de nitrógeno. Actualmente dicho laboratorio dentro de su

colección de microorganismos cuenta con aislamientos endorizosféricos

de C. alliodora y T. rosea productores de ácido indol acético y fijadores de

nitrógeno. Estas características biológicas son similares a las descritas

anteriormente lo que abre el camino a su reintroducción en los sistemas

de propagación de dichas especies.

29

Este proceso debe estar acompañado del desarrollo de una tecnología de

producción y formulación de inoculantes en portadores sencillos y

económicos que aseguren la viabilidad de los microorganismos en el

sistema suelo-planta.

30

4. OBJETIVOS

GENERAL Evaluar el efecto de la inoculación de bacterias endorizosféricas

promotoras de crecimiento vegetal de Cordia alliodora y Tabebuia rosea,

sobre la germinación y crecimiento y desarrollo de individuos de cada

especie en etapa vivero.

ESPECIFICOS

• Determinar semicuantitativamente la concentración de ácido

indol-acético en cultivos bacterianos endorizosféricos de

Cordia alliodora y Tabebuia rosea utilizando medio sintético con

y sin triptófano.

• Determinar el tiempo de máxima producción de biomasa y

actividad biológica (AIA y FBN) de los aislamientos

endorizosféricos seleccionados de C. alliodora y T. rosea.

• Evaluar la inocuidad de los aislamientos seleccionados sobre el

desarrollo y crecimiento de una planta modelo de rápido

crecimiento: Medicago sativa.

• Determinar la viabilidad de las PGPB´s inmovilizadas en turba

en diferentes períodos desde su inmovilización.

• Evaluar el efecto de la inoculación de los aislamientos

seleccionados sobre la germinación de semillas de la especie

de la cual se aisló.

• Evaluar el efecto de la inoculación de los aislamientos

seleccionados sobre el crecimiento y desarrollo de plantas

jóvenes de la especie de la cual se aíslo.

• Establecer el efecto de la inoculación de las PGPB´s

seleccionadas sobre la micorrización de C. alliodora y T. rosea

durante su establecimiento en bolsa.

31

5. MATERIALES Y METODOS El trabajo fue realizado en tres fases: una primera fase de laboratorio, en

la que se llevó a cabo la selección de los aislamientos endorizosféricos de

Cordia alliodora y de Tabebuia rosea, a partir de la colección de bacterias

endófitas de C. alliodora y T. rosea del Laboratorio de Asociaciones

Suelo - Planta – Microorganismo. Para ello se evaluó la capacidad de los

aislamientos de producir acido indol acético (AIA) y fijar nitrógeno (FBN).

Se realizaron curvas de crecimiento de los dos aislamientos

seleccionados y se formuló, a escala de laboratorio, un inoculante en

turba de cada uno de ellos. Adicionalmente se determinó la viabilidad de

semillas de C. alliodora y T. rosea y se realizó la curva de imbibición de

las semillas de cada especie y se evaluó el posible efecto fitopatógeno de

los aislamientos sobre un hospedero sustituto (Medicago sativa).

En una segunda fase se inocularon los aislamientos seleccionados

inmovilizados en turba y en formulación líquida sobre semillas de cada

una de las especies. Se evaluó su efecto en la germinación y emergencia

de semillas de C. alliodora y T. rosea.

Por último, en la tercera fase se inocularon los aislamientos inmovilizados

en turba sobre plantas jóvenes de C. alliodora y T. rosea en etapa de

vivero. Las actividades realizadas en cada fase se presentan en la

figura 3.

5.1. Diseño Experimental de los Ensayos de Inoculación, Siembra y Germinación de Semillas de C. alliodora y T. rosea Se realizarón dos ensayos para semillas de C. alliodora y uno para

semillas de T. rosea totalmente independientes. Las semillas de las dos

especies fuerón adquiridas en el Semillero Ltda. Para el ensayo con las

semillas de C. alliodora, se utilizaron dos grupos de semillas de diferentes

tamaños: pequeñas (6 – 8 mm) y grandes (8 – 10mm).

32

Figura 3. Diagrama de actividades realizadas en el estudio .Fase 1, caracterización selección y propagación de

bacterias endófitas; Fase 2: efecto de CaIchRI41R1 y TrMnPR41R248 sobre la germinación de su hospedero;

Fase 3: efecto de CaIchRI41R1 y TrMnPR41R248 sobre el crecimiento y desarrollo de plantas jóvenes de

C. alliodora y Tabebuia rosea.

Fase 1: Caracterización, selección, propagación de PGPB´sde C. alliodora y T. rosea

Prueba de viabilidad

Evaluación de la viabilidad de los microorganismos

inmovilizados

Análisis de Reducción del Acetileno (ARA) Instituto de

biotecnologia Un (lozano 2004; Witty & Michin, 1988

Caracterización Morfológica

Curva de imbibición semillas de las dos especies vegetales

Crecimiento en agar pectina, solubilización de

fósforo Agar SMRS

Determinación de AIA (Gordon & Weber, 1951)

Evaluación semillas de C. alliodora y T.

rosea

Curva de crecimiento de aislamientos

seleccionados

Caracterización bioquímica de los

aislamientos seleccionados por el sistema Microscan®

Formulacion inoculante microbiano en turba

Fase 2: Efecto de CaIChRI41R1 y TrMnPr41R248 sobre la germinación de su hospedero

Sustrato estéril: suelo + cascarilla de

arroz Peletización de las semillas de ambas especies

vegetales con el aislamiento bacteriano seleccionado para cada especie, AIB y GA

Sustrato estéril: suelo + cascarilla de arroz

Recuento de células bacterianas adheridas a

las semillas de las dos especies

Evaluación germinación diaria (40 dds)

Fase 3 : Efecto de CaIchRI41R1 y TrMnPr41R248 Sobre el Crecimiento y Desarrollo de Plantas de T. rosea y C. alliodora

Obtenidas a Partir de Semilla

Peletizacion de plantas jóvenes de C. alliodora y T. rosea con

inoculante bacteriano, HMA, GIB y GA

Transplante a bolsa Suelo + cascarilla de arroz +arena

Fertilización

15 dds

Fertilización humus 30 dds Recuento de células

bacterianas adheridas a raíces de plantas jóvenes de

las dos especies

Muestreo destructivo 120 dds

Medición variables crecimiento vegetal

Determinación variables de micorrización

Reaislamiento de microorganismos inoculados

33

En los dos ensayos de C. alliodora se evaluó el aislamiento

endorizosférico CalChRI41R1 en la germinación y emergencia de plantas

jóvenes de dicha especie, siguiendo para ello un diseño unifactorial

balanceado completamente aleatorio de la siguiente manera:

20 semillas (grandes o pequeñas) x 6 tratamientos x 3 repeticiones, para

un total de 360 unidades experimentales. En todos los tratamientos

(Tabla 1) se utilizó el agente adherente carboximetilcelulosa al 0.4%.

En el ensayo con semillas de T. rosea se evaluó el aislamiento

endorizosférico PGPB`s de T. rosea, TrMnpr41r248 en la germinación y

emergencia de plantas jóvenes de T. rosea, bajo un diseño unifactorial

balanceado completamente aleatorio de la siguiente manera:

20 semillas x 6 tratamientos x 3 repeticiones, para un total de 360

unidades experimentales. Al igual que en el caso anterior, en todos los

tratamientos (Tabla 1) se utilizó el agente adherente carboximetilcelulosa

al 0.4%.

Tabla 1. Tratamientos aplicados sobre semillas grandes y pequeñas de

C. alliodora y sobre de semillas de T. rosea

Nº DE TRATAMIENTOS DESCRIPCIÓN

1 PGPB`s Turba*

2 PGPB`s Caldo*

3 Ácido Naftalenacético (ANA)

4 Ácido Giberélico (GA3)

5 ANA + GA3

6 Control * PGPB’s para C. alliodora CalChRI41R1 y para T. rosea: TrMnpr41r248

34

5.1.1. Población de Estudio y Muestra La población de estudio estuvo compuesta por semillas de un mismo lote

tanto de C. alliodora como de T. rosea. En C. alliodora se trabajo con dos

poblaciones: semillas pequeñas y semillas grandes. La muestra

correspondió a cada una de las semillas evaluadas al determinar el

porcentaje de germinación.

5.2. Diseño Experimental de los Ensayos de Inoculación, Siembra y Crecimiento y Desarrollo de Plantas Jóvenes de C. alliodora y T. rosea

en Vivero

Se montó un ensayo para plantas jóvenes de C. alliodora y otro para

plantas jóvenes de T. rosea totalmente independientes. Las plantas

jóvenes de las dos especies vegetales fueron suministradas por

Geoambiente Ltda. Estas plantas provenían de un mismo lote de semillas

germinadas en bancos de germinación con sustrato suelo – cascarilla de

arroz.

En el ensayo de plantas jóvenes de C. alliodora se evaluó el aislamiento

endorizosférico PGPB`s de C. alliodora, CalChRI41R1, en el crecimiento y

desarrollo de plantas jóvenes de dicha especie. Para este ensayo se

utilizó un diseño unifactorial balanceado completamente aleatorio de la

siguiente manera:

20 plantas jóvenes x 6 tratamientos x 3 repeticiones, para un total de 216

unidades experimentales. En todos los tratamientos se utilizó como

agente adherente carboximetilcelulosa al 0.4% (Tabla 2).

Para el ensayo de plantas jóvenes de T. rosea se evaluó el aislamiento

endorizosférico PGBP´s de T. rosea, TrMnpr41r248, en el crecimiento y

desarrollo de plantas jóvenes de dicha especie. Para este ensayo se

35

utilizó un diseño unifactorial balanceado completamente aleatorio de la

siguiente manera:

20 plantas jóvenes x 6 tratamientos x 3 repeticiones, para un total de 234

unidades experimentales. Aquí también se empleó como agente

adherente carboximetilcelulosa al 0.4% en todos los tratamientos (Tabla

2).

Tabla 2. Tratamientos aplicados sobre plantas jóvenes de C. alliodora y T. rosea

en el momento de siembra en bolsa.

N° DE TRATAMIENTOS DESCRIPCIÓN

1 PGPB*

2 Glomus manihotis

3 Ácido Naftalenacetico (ANA)

4 PGPB *+ Glomus manihotis

5 Glomus manihotis + ANA

6 Control * Para C. alliodora CalChRI41R1. Para T. rosea: TrMnpr41r248

5.2.1. Población de Estudio y Muestra La población de estudio comprendió plantas jóvenes de C. alliodora en

un ensayo y de plantas jóvenes de T. rosea en el otro. Las plantas de

ambas especies habían sido propagadas por semilla. La muestra

correspondió a plantas jóvenes de C. alliodora o de T. rosea ciento veinte

días después de haber sido sembradas en bolsa.

5.3. Ubicación Espacial

• Fase uno: Esta fase se realizó en el Laboratorio de Asociaciones

suelo - planta - microorganismo de la Unidad de Biotecnología

36

Vegetal (UBV), Departamento de Biología de la Pontificia

Universidad Javeriana (PUJ).

• Fase dos: Inoculación, siembra y germinación de semillas de

C. alliodora y T. rosea: esta fase se desarrollo en el cuarto de

crecimiento de la UBV de la PUJ, bajo condiciones controladas

(T: 27°, humedad: 60% y fotoperíodo de 16 horas luz y 8 horas de

oscuridad).

• Fase tres: Inoculación, siembra y crecimiento y desarrollo de

plantas jóvenes de C. alliodora y T. rosea en vivero: esta última

etapa se realizó en la estación Bambusa, propiedad de

Geoambiente LTDA. La estación se encuentra en el Km. 8 de la vía

Pacho la Palma Cundinamarca, a una altura de 1350 msnm, con

una temperatura promedio de 24ºC y una zona de vida

característica de bosque seco.

5.4. Fase Uno: Caracterización, Selección y Propagación de PGPB´s de T. rosea y C. alliodora

5.4.1. Determinación de Producción de Ácido Indol Acético Se realizó la determinación semicuantitativa de la producción de

ácido Indol acético mediante la metodología de Salkowsky

(Gordon & Weber, 1954) a 20 aislamientos endófitos de raíz de

C. alliodora y a 20 de T. rosea, aislamientos que cumplían con los

parámetros de selección morfológica de colonia y lugar de aislamiento

previos, pertenecientes a la colección de bacterias endófitas del

laboratorio de Asociaciones Suelo – Planta – Microorganismo de la

Unidad de Biotecnología Vegetal de la Pontificia Universidad Javeriana.

Dichos microorganismos se sembraron en caldo nutritivo estéril (Difco ®)

sin triptófano y se incubaron durante 192 horas en total oscuridad en un

shaker rotatorio (Heidolph ®) a 32°C y 120 rpm (Pedroza, 2004).

37

Transcurrido este tiempo, se tomaron 3 ml del cultivo, se centrifugaron a

3000 rpm por 20 minutos, tras lo cual se tomo 1ml del sobrenadante, al

que se le adicionaron 2 ml del reactivo de Salkowsky (Anexo 2) agitando

la mezcla durante 15 segundos. La mezcla se dejó reposar por 30

minutos y luego se leyo su absorbancia a 540 nm en un

espectrofotómetro Beckman ® 560. La concentración de AIA se

determinó con la curva patrón de ácido indol acético desarrollada por Cruz

y Neira en 2004, la cual se desarrolló con los mismos reactivos y

espectrofotómetro utilizados en el presente ensayo (Anexo 3).

Así mismo se determinó la producción de AIA en caldo nutritivo estéril

(Difco ®) enriquecido con triptófano al 0.2%. Se incubaron los

aislamientos durante 24 y 48 horas a 32°C y total oscuridad, basados en

los resultados de Cruz y Neira (2004) para A. brasilense. Esta prueba se

realizó a los aislamientos que mostraron la mayor producción de AIA sin

la adición de triptófano al medio de cultivo.

Se seleccionaron dos aislamientos endorizosféricos productores de AIA,

de C. alliodora el aislamiento CalChRI41R1 y de T. rosea TrMnpr41r248.

Se tuvieron como criterios adicionales de selección su morfología

macroscópica y microscópica (Anexo 4), buscando microorganismos con

colonias mucoides, coloración Gram negativo, de morfología bacilar o de

coco-bacilos y su capacidad para producir pigmentos difusibles en medio

King B, características representativas de Pseudomonas sp. conocida

PGPB´s endorrizosférica (Cankar et al, 2005; Ahmad et al, 2005; Asghar,

2002; Patten & Glick, 2002; Surette & Sturtz, 2003).

5.4.1.1. Determinación Bioquímica y Susceptibilidad a Antibióticos de los Aislamientos Seleccionados Con base en los resultados de producción de AIA, los dos aislamientos

seleccionados fueron caracterizados por medio del sistema Microscan®

38

(anexo 5); utilizando para ello aislamientos sembrados en agar nutritivo e

incubados durante 24 horas a 32ºC.

5.4.1.2. Cuantificación de la Fijación Biológica de Nitrógeno de los Aislamientos Seleccionados Para esta determinación se evaluó la capacidad de la enzima nitrogenasa

para reducir el acetileno en un cultivo in vitro. Esta prueba se denomina

análisis de reducción de acetileno (ARA) y es una prueba cuantitativa de

la fijación de nitrógeno.

El análisis se realizó en un cromatógrafo de gases VARIAN 3400, con una

columna HayeSep N a una temperatura de 50º C, utilizando como gas de

arrastre nitrógeno (15 ml / min.), temperatura del inyector 100º C y un

detector de ionización de llama (Flame ionization detector) a 200º C. Los

aislamientos se incubaron 1 hora en una atmósfera del 5% de acetileno a

32º C en frascos de vidrio cerrados herméticamente con tapón de caucho,

transcurrido este tiempo se tomó 1 ml de gas de la atmósfera del frasco

con una jeringa desechable y se inyectó en el cromatógrafo de gases,

todo esto según el procedimiento propuesto por Witty & Minchin en 1988 y

adaptado por Lozano (1998). Previo a este análisis se realizó una curva

de calibración a partir de las áreas de picos obtenidas por la

cromatografía de un patrón de etileno puro con lo cual se logró determinar

la cantidad de etileno producido a partir del acetileno por cada uno de los

aislamientos evaluados (Anexo 6).

5.4.1.3. Crecimiento en Agar Pectina, Solubilización de Fósforo y Producción de Sideróforos

Dado que la identificación preliminar con el sistema Microscan®

(Anexo 7, 8), dio presuntivo para especies de bacterias reportadas como

pectinolíticas, solubilizadoras de fósforo y productoras de pioverdinas, se

39

hizo la siembra por agotamiento de los aislamientos CalChRI41R1 y

TrMnpr41r248 sobre los medios de cultivo Pectina, SMRS, y King B,

(Anexo 1). Como indicador de su actividad pectinasa se tomó el

crecimiento en medio sólido con pectina cítrica como única fuente de

carbono; como indicador de solubilización de fósforo se determinó la

formación de halos alrededor de la colonia por acidificación del medio y

como indicador de la producción de sideróforos la producción de

pigmentos fluorescentes difusibles al medio en agra King B.

5.4.2. Curva de Crecimiento del Aislamiento de C. alliodora

CalChRI41R1 y del Aislamiento TrMnPR41R248 de T. rosea Se realizó una fermentación discontinua en caldo nutritivo (Difco ®) de

cada uno de los aislamientos con el fin de determinar los picos de mayor

producción de biomasa y de ácido indol acético. Para ello se siguió la

siguiente metodología para cada uno de los dos aislamientos.

5.4.2.1. Preparación del Preinóculo de CalChRI41R1 y TrMnpr41r248

A partir de un cultivo puro de 24 horas de incubación, se hizo una

suspensión bacteriana en solución salina al 0.85 ajustando su

concentración al tubo 5 (108 UFC/ml) de la escala de Mac-farland.

Tras lo anterior, se tomaron 4 ml de la suspensión bacteriana y se

depositaron en un erlenmeyer de 250 ml con 36 ml de caldo nutritivo

estéril (Difco ®)

Este preinoculo de volumen final de 40 ml, se llevó a agitación continua

en un shaker rotatorio (Heidolph ®) a 32°C y 120 rpm, por 24 horas.

40

5.4.2.2. Preparación de Inóculo y Curva de Crecimiento Se dispuso la totalidad del preinóculo (40 ml) dentro de un erlenmeyer de

1000 ml con 360 ml de caldo nutritivo estéril (Difco ®); alcanzando un

volumen final efectivo de 400 ml.

El muestreo de la fermentación se llevó a cabo cada dos horas

determinando la concentración por turbidimetría en un espectrofotómetro

Beckman ® 560 a 540 nm (Cruz & Neira, 2004), viabilidad por recuento

en placa en agar nutritivo (Difco ®) y la concentración de AIA por la

metodología de Salkowsky descrita previamente utilizando el

espectrofotómetro Beckman ® 560 a 530 nm (Gordon & Weber, 1954).

5.4.3. Inmovilización de los Aislamientos Bacterianos CalChRI41R1 y TrMnpr41r248 en Turba Como Portador Microbiano 5.4.3.1. Manejo del Portador Microbiano

La turba utilizada para la inmovilización celular fue provista en bolsas de

500 g por el laboratorio de Microbiología de Suelos de Corpoica Tibaitata,

proveniente de turberas de Río Negro Antioquia. La turba fue dosificada

en 56 bolsas plásticas calibre número 3 de alta densidad, con un tamaño

de 9 cm x 20 cm de largo, en cantidades de 50 gramos por bolsa,

teniendo el cuidado que al sellar las bolsas con calor quedara la menor

cantidad de aire posible en su interior.

Las bolsas de turba empacadas fueron esterilizadas durante 60 minutos a

121°C y 15 libras de presión. Este proceso se repitió tres veces con

intervalos de 24 horas.

41

5.4.3.2. Formulación de los Inoculantes de las PGPB’s Endorizosféricas Seleccionada para C. alliodora y T. rosea

Una vez comprobado que el proceso de esterilización del portador

permitía tener el material de inmovilización libre de contaminación, se

procedió a su inoculación con los aislamientos CalChRI41R1 y

TrMnPr41R248. Para ello, se realizó un preinóculo de 50 ml en caldo

nutritivo (Difco ®) sin triptófano para cada uno de los aislamientos, los

cuales se incubaron durante 24 horas a 32°C en un shaker rotatorio a

120rpm, debido a que en dicha hora se presento el final de la fase

logarítmica del crecimiento de los dos aislamientos y se evidencio la

mayor producción de AIA por parte de estos. Luego cada uno de los

preinóculos se paso a 450 ml de caldo nutritivo (Difco ®) sin triptófano,

incubando los dos inóculos finales de un volumen efectivo de 500 ml

durante 24 horas a 32°C y 120 rpm en un shaker rotatorio, tiempo en el

cual se determinó la concentración bacteriana por el método de recuento

en placa de los dos inóculos preparados.

Tras esto, a 25 bolsas con turba se les inyectó con una jeringa estéril

15 ml a cada una, del cultivo bacteriano de CalChRI41R1 y a otras 25 el

aislamiento TrMnpr41r248, en el mismo volumen. Las bolsas inoculadas

fueron selladas con silicona en el punto de la inoculación e incubadas a

32°C.

En el proceso de inmovilización, generalmente las poblaciones

bacterianas disminuyen por lo cual se lleva a cabo un cultivo secundario

del inoculante ya formulado (Bashan, 1998).

42

5.4.3.3. Cultivo Secundario de CalChRI41R1 y TrMnPR41R248

Tras la inoculación de los aislamientos en el portador, se incubaron a

32°C con el propósito de favorecer su establecimiento en el nuevo

sustrato y evitar la pérdida de viabilidad de las células bacterianas. Cada

24 horas, durante 96 horas, se tomaron muestras para determinar la

concentración de bacterias en el inoculante. Las siembras se realizaron

en agar nutritivo (Difco ®), incubándolas a 32°C durante 24 horas.

5.4.3.4. Viabilidad de Células Inmovilizadas Para medir la viabilidad de las células bacterianas inmovilizadas en la

turba, bolsas inoculadas con cada bacteria y sometidas a cultivo

secundario durante 72 horas fueron refrigeradas a 4ºC durante un día,

dos días, tres días, siete días, 15 días, 30 días, 90 días y 180 días. Para

cada muestreo, se determinó la concentración bacteriana por el método

de recuento en placa en agar nutritivo (Difco ®), incubando las cajas a

32ºC por 24 horas. Además se evaluó la morfología de las colonias y el

comportamiento de las células bacterianas bajo la coloración de Gram.

5.4.4. Prueba de Inocuidad de CalChRI41R1 y de TrMnPR41R248, Sobre Medicago sativa Con el fin de constatar que los aislamientos seleccionados tanto para

C. alliodora como T. rosea no presentan efectos negativos sobre el

crecimiento y desarrollo vegetal, se realizó un ensayo de inocuidad de los

dos aislamientos sobre Alfalfa, especie vegetal de rápido crecimiento

susceptible a enfermedades causadas por microorganismos como;

Alternaria brassicae, Gibberella avenacea, Peronospora trifoliorum y

Pseudomonas sp., entre otros (Briggs, 1994).

43

5.4.4.1. Inóculos Bacterianos

Se prepararon dos inóculos líquidos en caldo nutritivo (Difco ®) (anexo1),

uno para el aislamiento seleccionado para C. alliodora, CalChRI41R1, y

otro para el aislamiento seleccionado para T. rosea, TrMnPR41R248,

siguiendo el mismo procedimiento descrito en el numeral 5.4.3.2.

5.4.4.2. Desinfección de las Semillas de Alfalfa

Se desinfectaron 180 semillas con hipoclorito de sodio al 1.5% (1 minuto)

y etanol al 70% (1 minuto). Luego se realizaron cuatro lavados

consecutivos de las semillas en agua destilada estéril (5 minutos cada

uno).

5.4.4.3. Germinación de las Semillas de Alfalfa

Las semillas desinfectadas fueron germinadas en cámaras húmedas

estériles previamente acondicionadas con papel filtro. Dentro de cada

cámara se dispusieron 20 semillas y se humedeció el papel filtro con

agua destilada estéril, manteniéndolas a una temperatura de 19+/-2°C.

5.4.4.4. Inoculación de las Semillas de Alfalfa

Tras la emergencia de la radícula las semillas pregerminadas se

inocularon con CalChRI41R1 y TrMnPR41R248 en cultivo líquido y agua

destilada estéril como control, a razón de 40µL por semilla. Cada

tratamiento se aplicó sobre 60 semillas distribuidas en tres repeticiones de

20 individuos. Los tres tratamientos se mantuvieron en cajas de petri

hasta el desarrollo del primer par de hojas, momento en el que se

transplantaron a turba.

44

5.4.4.5. Seguimiento y Muestreo de las Plantas Jóvenes de Alfalfa

Durante 60 días se observó la posible aparición de procesos patogénicos

sobre el material vegetal bajo condiciones de invernadero, prestando

atención a síntomas de clorosis, necrosis, pudriciones, manchas foliares y

la aparición de agallas en la base del tallo.

Al cabo de los sesenta días se realizó el muestreo de los individuos de

cada tratamiento, con el objetivo de evidenciar posibles efectos de

promoción o inhibición en el crecimiento de las plantas jóvenes de alfalfa

por los microorganismos inoculados. Se midieron: longitud de raíz (LR) y

altura (H).

5.4.5. Viabilidad e Imbibición de Semillas de C. alliodora y T. rosea

5.4.5.1. Selección Semillas de C. alliodora y T. rosea.

Se utilizaron 100 gramos de semillas de Cordia alliodora a partir de un

mismo lote colectado ocho meses antes de su siembra. Las semillas de

dicha especie se agruparon en pequeñas (6-8 mm) y grandes (8-10mm),

debido a que dentro del lote de semillas se notaba una clara distribución

dentro de estos intervalos de tamaño; por lo que se planteó un ensayo

independiente para cada uno de los grupos. En el caso de

Tabebuia rosea las semillas del lote utilizado presentaron un tamaño

uniforme por lo cual no fue necesario seleccionarlas.

5.4.5.2. Curvas de Imbibición Con el fin de conocer el tiempo necesario de activación de la respiración

de las semillas de C. alliodora y T. rosea se realizó una curva de

imbibición para cada especie, para lo cual se siguió la siguiente

metodología:

45

• Cordia alliodora:

Se realizó una curva de imbibición para cada uno de los grupos de

semillas seleccionados (pequeña y grande). De cada grupo de semillas se

tomaron 60 y se dividieron en 3 repeticiones cada una con 20 individuos.

Las semillas de cada repetición fuerón pesadas en una balanza analítica

(OHAUS®) para determinar su peso fresco total inicial. Se imbibieron en

agua destilada, manteniéndolas a temperatura ambiente y cada dos horas

se registró el peso fresco de cada repetición hasta que el peso se

estabilizó (Romero, 2000, citado por Cruz y Neira, 2004).

• Tabebuia rosea:

Se tomaron 60 semillas y de igual manera fueron divididas en 3

repeticiones de 20 individuos cada una y se siguió la misma metodología

utilizada para C. alliodora.

5.4.5.3. Prueba de Viabilidad de las Semillas de C. alliodora y T. rosea

La viabilidad de las semillas de ambas especies fue evaluada utilizando la

técnica de tinción con tetrazolio. Empleando para cada especie semillas

imbibidas y no imbibidas (Aguirre, 1992).

Cordia alliodora: El ensayo de viabilidad de semillas de esta especie

incluyó semillas pequeñas y grandes imbibidas y no imbibidas. En cada

ensayo se montaron 3 repeticiones de 15 individuos en 2,3,5 trifenil

tetrazolium al 0.1% a 32°C bajo condiciones de total oscuridad. Se

tomaron 5 semillas por repetición cada 24 horas y se observó la tinción

del embrión. El porcentaje de viabilidad de las semillas se determinó

siguiendo la metodología de Rodríguez y Nieto (1999) (Anexo 9).

46

Tabebuia rosea: se siguió el mismo procedimiento utilizado para

C. alliodora con un solo tamaño de semillas también imbibidas y no

imbibidas. Al igual que para C. alliodora se montaron 3 repeticiones cada

una de 15 individuos.

5.5. Fase Dos: Efecto de CalChRI41R1 y TrMnPR41R248 Sobre la Germinación de su Hospedero 5.5.1. Desinfección de Semillas de C. alliodora y T. rosea

• Semillas de Cordia alliodora

Ochocientas semillas de C. alliodora, 400 grandes y 400 pequeñas

fueron desinfectadas con hipoclorito de sodio al 1% durante 1 minuto,

etanol al 75% durante 1 minuto y seis lavados sucesivos en agua

destilada estéril. Luego las semillas grandes fueron imbibidas en agua

destilada estéril durante 22 horas y las pequeñas durante 23 horas

(tiempos determinados en la curva de imbibición de cada grupo).

• Semillas de Tabebuia rosea

Cuatrocientas semillas de T. rosea fueron desinfectadas con hipoclorito

de sodio al 1% durante 1 minuto, etanol al 75% durante 1 minuto y seis

lavados sucesivos en agua destilada estéril. Luego las semillas fueron

imbibidas en agua destilada estéril durante 19 horas (tiempo determinado

en la curva de imbibición).

Los tiempos y concentración de cada uno de los agentes de desinfección

se ajustaron al tamaño y consistencia de cada especie (Cruz y Neira,

2004).

Las semillas tratadas con las metodologías que se describen a

continuación se sembraron en bandejas de germinación de 72 alvéolos

47

previamente desinfectadas con etanol al 70% e hipoclorito de sodio al 6%

y llenadas con una mezcla estéril de suelo y cascarilla de arroz en una

proporción 2:1 humedecida con agua destilada estéril. Cada bandeja se

dividió en 3, obteniendo así bloques de 20 alvéolos, los cuales se

distribuyeron aleatoriamente entre las repeticiones de los seis

tratamientos.

En todos los tratamientos previstos para las dos especies se utilizó como

adherente carboximetilcelulosa (Merck®) 0.4%.

5.5.2. Inoculación y Siembra de las Semillas de C. alliodora y T. rosea con CalChRI41R1 y TrMnPR41R248 en Portador Sólido

C. alliodora: Sesenta semillas de cada tamaño (grandes y pequeñas) se

dispusieron durante 5 minutos en 50 ml del adherente, tras lo cual se

peletilizarón en 150 g del inóculo bacteriano de CalChRI41R1.

T. rosea: Se procedió del mismo modo del numeral anterior inoculando 60

semillas de esta especie con la bacteria de TrMnPR41R248. 5.5.2.1. Inoculación y Siembra de las Semillas de C. alliodora y

T. rosea con CalChRI41R1 y TrMnPR41R248 en Cultivo Líquido C. alliodora: Se seleccionaron sesenta semillas de cada tamaño y a cada

una se le aplico 1 ml de cultivo líquido bacteriano de CalChRI41R1 en

concentración de 108 UFC/ml. Previamente las semillas se habían

dispuesto durante 5 minutos en 50 ml del adherente.

T. rosea: A sesenta semillas se les aplicó 1 ml de cultivo líquido

bacteriano de TrMnPR41R248 en concentración de 107 UFC/ml. Las

semillas antes de la inoculación fueron dispuestas durante 5 minutos en

50 ml del adherente.

48

Una vez peletizadas con el adherente cada semilla se dispuso al azar en

un alveolo de la bandeja de germinación, se adicionó 1 ml de cultivo

líquido de CalChRI41R1 a las semillas de C. alliodora y TrMnPR41R248

a las semillas de T. rosea. Las hormonas comerciales GA3 y ANA fueron

diluidas en la solución de carboximetilcelulosa al 0.4%, obteniendo así

una concentración final de 20 ppm de GA3 y de 154 ppm de ANA (Anexo

11). Para el control absoluto las semillas fueron dispuestas durante 5

minutos en la solución de carboximetilcelulosa 0.4% y sembradas

inmediatamente después en la forma descrita anteriormente.

5.5.2.2 Evaluación de la Emergencia de C. alliodora y T. rosea, en Cuarto de Crecimiento

Se evaluó en intervalos de tres días la emergencia del gancho del

hipocótilo (ISTA, 1999) en los ensayos para C. alliodora pequeña,

C. alliodora grande y T. rosea. El seguimiento del proceso de emergencia

se siguió durante 41 dds, momento en el cual se logró la germinación del

33% de las semillas en los tres ensayos.

Con los datos colectados durante el proceso se determinaron tres índices

de germinación. La germinación diaria media (GDM) (final), que se calculó

como el porcentaje acumulado de semillas germinadas al final del ensayo

sobre el número de días trascurridos desde el día de la siembra hasta el

término del ensayo; el valor máximo (VM), el cual se halló como el

porcentaje de semillas germinadas que se alcanza en el máximo pico de

germinación en relación al número de días trascurridos hasta ese

momento. Con la obtención de estos dos índices se determinó el valor de

germinación (VG), el cual se calculó mediante la siguiente fórmula:

VG = GDM (final) X VM

49

Este último índice tiene como finalidad combinar en una sola cifra una

expresión de la germinación total al termino del ensayo y una expresión

de la energía o velocidad de germinación (Rodríguez, 2000).

5.5.3. Evaluación Preliminar del Efecto de Basamid® sobre las Poblaciones Microbianas del Sustrato de Siembra, sobre la Viabilidad de CaChRl41R1 y TrMnPr41R248 y Sobre el Crecimiento de una Planta Modelo Con el fin de determinar el efecto de la aplicación del fungicida Basamid®

(Anexo 10) sobre las poblaciones microbianas del sustrato de siembra y

sobre el crecimiento y desarrollo vegetal se realizó el recuento en placa

de agar nutritivo (Difco ®) de las poblaciones bacterianas presentes en el

sustrato, siete y quince días después de la aplicación del fungicida.

Adicionalmente se sembraron semillas de trigo previamente desinfectadas

en el sustrato de siembra tratados con Basamid®.

5.6. Fase Tres: Efecto de CalChRI41R1 y TrMnPR41R248 sobre el Crecimiento y Desarrollo de Plantas de C. alliodora y T. rosea Obtenidas a partir de Semilla

En el vivero Bambusa en Pacho Cundinamarca, setecientas veinte bolsas

plásticas de 9 x 15 cm con suelo y cascarilla de arroz en proporción 2:1

fueron preparadas para dividirlas en dos ensayos diferentes, uno para

plantas jóvenes de C. alliodora y otro para plantas jóvenes de T. rosea.

C. alliodora: se preparó una pasta de 200 ml de carboximetilcelulosa 0.4%

+ 150 g del aislamiento CalChRI41R1 inmovilizado en turba, depositando

en esta pasta durante 15 minutos las raíces desnudas de 60 plantas

jóvenes. La concentración del inóculo al momento de la peletilización era

de 10 7 UFC/g turba. El inóculo preparado para esta aplicación no fue

refrigerado.

50

Este procedimiento se repitió para T. rosea utilizando el inóculo

TrMnPR41R248. 5.6.1. Siembra en Sustrato de Plantas Jóvenes de C. alliodora y T. rosea con el Hongo de Micorriza Glomus manihotis

Se empleo inóculo de G. manihotis ya que las dos especies forman

micorriza con dicho hongo (Cuervo, 1996). El hongo de micorriza fue

propagado en el Laboratorio de Asociaciones suelo - planta-

microorganismos, de la UBV. En el momento de la siembra se aplicaron

20 g de inoculo de HMA por bolsa, con 120 esporas viables/ g.

Sesenta plantas jóvenes de cada especie vegetal fueron peletilizadas con

una solución de ANA (160 ppm) (anexo 11) y carboximetilcelulosa (0.4%)

durante 15 minutos.

Tanto las plantas inoculadas con PGPB’s como aquellas a las que se les

aplicó ANA fueron sembradas con y sin hongo de micorriza arbuscular.

Los ensayos de crecimiento y desarrollo de las dos especies vegetales

se mantuvieron bajo condiciones de vivero durante 120 días. En los

primeros 30 días los individuos de los dos ensayos estuvieron bajo

polisombra. Los individuos que murieron en los primeros 15 días fueron

reemplazados por nuevos individuos con características de crecimiento

similares en todos los tratamientos. A todos los tratamientos se les

adicionó Nutrihumus® al 30% a razón de 150 ml/planta como fertilización

orgánica 15 dds y 30 dds (Anexo 11).

51

5.6.2. Recuento de las Bacterias Inoculadas en Portador Solidó Adheridas a Semillas y Raíces de C. alliodora y T. rosea en el Momento de la Siembra Con el fin de conocer la cantidad de células bacterianas adheridas a

semillas y a raíces de cada una de las especies con la inoculación

bacteriana en portador sólido, se pesó un gramo de semillas y raíces de

las dos especies peletilizadas con su respectivo inóculo bacteriano y se

realizaron diluciones seriadas de la suspensión inicial sembrando en agar

nutritivo (Difco®) las diluciones 10-3, 10-5 y 10-8 se incubó a 32° durante

24 horas.

5.6.3. Evaluación del Crecimiento y Desarrollo de Plantas Jóvenes de C. alliodora y T. rosea.

Trascurridos 120 dds de las plantas de cada especie se realizó el

muestreo para determinar las siguientes variables de crecimiento:

Peso fresco aéreo (g) PFA: peso fresco total de la parte aérea.

Peso seco aéreo (g) PSA: peso seco total de la parte aérea

luego de 72 h a 80° C

Peso fresco raíz (g) PFR: peso fresco total de la raíz

Peso seco raíz (g) PSR: peso seco total de la raíz luego de

72 h a 80° C

Longitud de raíz (cm) LR: distancia desde el cuello de la raíz

hasta el ápice de la raíz más larga

Altura (cm) H: distancia desde el cuello de la raíz

hasta el ápice del tallo principal

Área foliar (cm2) AF: unidad de superficie de hojas verdes

sanas totalmente expandidas

52

5.6.4. Porcentaje de Micorrización de Plantas Jóvenes de C. alliodora

y T. rosea y Recuento de Esporas de HMA en el Sustrato de Siembra Se tomaron dos individuos por repetición de cada tratamiento de los

ensayos de cada una de las especies, para determinar su porcentaje de

micorrización. Para el aclarado y tinción de las raíces se aplico la

metodología descrita por Phillips & Hayman (1970), ajustando los

tiempos de exposición de los reactivos de acuerdo con el comportamiento

del material vegetal (Anexo 12).

Para el recuento de esporas se tomó una muestra compuesta de 100 g de

suelo por tratamiento de cada una de las especies vegetales y se

procedió con la metodología descrita por Gerderman y Nicolson (1983)

y Sieverding (1983).

5.6.5. Reaislamiento de CaIChRI41R1 y TrMnPR41R248 de Raíces y Suelo Asociado a Raíz de Plantas Jóvenes de C. alliodora y T. rosea.

Para el reaislamiento de raíces se tomó un individuo por repetición

completamente al azar, las raíces de cada una de las especies

previamente lavadas con abundante agua fueron pesadas para calcular el

solvente necesario para cada raíz de cada uno de los individuos.

Inmediatamente fueron desinfectadas de la siguiente manera; etanol 75%,

5 minutos; Hipoclorito de sodio al 1%, 5 minutos y 5 lavados consecutivos

de agua destilada estéril. Las raíces fueron dispuestas en frascos con la

cantidad de solvente (agua destilada estéril) calculada. Se maceraron y a

partir del macerado se realizaron diluciones seriadas hasta 10-7, se

sembró por agotamiento en agar nutritivo (Difco ®). Las raíces de T. rosea

fueron sembradas por dilución en medio semisólido Nfb igualmente hasta

10-7.

53

El suelo asociado a las raíces de cada especie vegetal fue sembrado

igualmente por diluciones seriadas hasta 10-7 y sembradas de igual forma

que el material vegetal. Para estos dos procedimientos se emplearon 2

plantas por tratamiento por repetición, una planta para microorganismos

endófitos y otra para suelo asociado a raíz.

5.6.6. Análisis de la Información Para el análisis estadístico de los datos arrojados en todos los ensayos

se hizo uso de diferentes pruebas estadísticas a un nivel de significancía

de 0.05.

En los ensayos de germinación y emergencia de semillas de C. alliodora

(grandes y pequeñas) y T. rosea se determinó el efecto de cada uno de

los tratamientos en la variable respuesta: valor de germinación (VG).

Para los ensayos de crecimiento y desarrollo de plantas jóvenes de

C. alliodora y T. rosea se determinó el efecto de cada uno de los

tratamientos en las variables de respuesta de crecimiento vegetal y en las

variables de micorrización.

Tanto en los ensayos de germinación y emergencia como en los de

crecimiento y desarrollo de las dos especies vegetales se siguió el

siguiente modelo general de diseño unifactorial para cada una de las

variables de estudio:

Y=α+β*(tratamientos)+ε En los ensayos de germinación el valor de germinación (VG) se analizó

41 dds, mientras que en los ensayos de crecimiento y desarrollo las

variables de crecimiento vegetal y de micorrización se tomaron 120 dds.

Los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza se

determinaron en todos los ensayos. Para las variables que no cumplieron

54

con dichos supuestos se les aplico una de las transformaciones de la

Familia de Jonson.

Se utilizó el análisis de varianza en las variables que cumplieron con los

supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza. Cuando esta

prueba mostraba diferencias significativas entre los tratamientos se

aplicaron las pruebas de Duncan para determinar que tratamientos fueron

los mejores y Dunett para comparar cada uno de los tratamientos con

respecto al tratamiento control.

En el ensayo de crecimiento y desarrollo de plantas jóvenes de

C. alliodora la variable H cumplió con los supuestos de normalidad y de

homogeneidad de varianza, las otras variables fueron transformadas por

la familia de Jonson (logaritmo natural) y posteriormente se realizó

análisis de varianza.

Para el ensayo de crecimiento y desarrollo de plantas jóvenes de T. rosea

las variables H, LR, NH, PSR y PSA cumplieron con los supuestos de

normalidad y homogeneidad de varianza. Las variables PFR y PFA fueron

transformadas mediante la familia Jonson (logaritmo natural) y

posteriormente se realizo análisis de varianza.

Por último, a las variables de micorrización para ambas especies

vegetales se les realizó análisis de varianza y se uso la prueba de

comparación de medias múltiples pareadas de Dunett.

Las variables que no se ajustaron a los supuestos de normalidad y

homocedasticidad con diferentes modelos de transformación, se

analizaron con la prueba no paramétrica de Kruskall-Wallis (PFA, PSA,

AF, NH) para C. alliodora y para T. rosea AF.

Para el análisis estadístico se utilizaron los programas SAS 9.0 y Statistix

8.2

55

6. RESULTADOS 6.1. Fase Uno: CARACTERIZACION, SELECCIÓN Y PROPAGACION de PGPB´S de T. rosea y C. alliodora Los microorganismos utilizados en el presente trabajo fueron

seleccionados de la colección de microorganismos endófitos de raíz de

T. rosea y C. alliodora del Laboratorio Asociaciones suelo-planta

microorganismo de la Unidad de biotecnología Vegetal de la Pontificia

Universidad Javeriana. Los criterios de selección para los dos

aislamientos endorizosféricos, uno para cada especie vegetal fueron su

morfología macroscópica y microscópica, producción de acido indol

acético con y sin adición de triptófano al medio y la producción de

pigmentos difusibles en agar King B (ver Anexo 4).

6.1.1. Producción de Ácido Indol Acético Las concentraciones de AIA para los 20 aislamientos evaluados de cada

especie vegetal en medio sin triptófano se presentan en el anexo 13. Los

valores de producción de AIA oscilaron entre 1.01 ug/ml y 18.76 ug/ml

para los aislamientos de C. alliodora y de 1.26 ug/ml a 20.51 ug/ml para

los aislamientos de T. rosea. Todos los aislamientos evaluados provenían

de raíz de las dos especies vegetales.

A partir de los veinte aislamientos evaluados de cada especie vegetal, se

seleccionaron el aislamiento CaIChRI41R1 de C .alliodora y el aislamiento

TrMnPR41R248 de T. rosea. CaIChRI41R1 tuvo una producción de AIA

en caldo nutritivo sin adición de triptófano de 15.31 ug/ml y con adición de

triptófano un valor de 21.09 ug/ml. TrMnPR41R248 sin adición de

triptófano al medio produjo 3.62 ug/ml de AIA con adición de triptófano,

15.31 ug/ml.

56

6.1.2. Caracterización Bioquímica y Susceptibilidad Antibióticos de los Aislamientos Seleccionados

Los dos aislamientos seleccionados fueron caracterizados

bioquímicamente por medio del sistema Microscan® utilizando paneles

para identificación de microorganismos Gram negativos. El aislamiento

CalChRI41R1 dio presuntivo de P. fluorescens/putida (99.99%), no

presentó susceptibilidad a la kamacina ni al cetramiede y asimila malato

como fuente de carbono (Anexo 7). El aislamiento TrMnPR41R248 dio

presuntivo para P. fluorescens/putida (99.9%) (Anexos 8).

6.1.3. Cuantificación de la Fijación Biológica de Nitrógeno: Análisis de Reducción del Acétileno (ARA)

La actividad de la enzima nitrogenasa en medio semisólido NFb (nitrogen

fixing bacteria) mediante el análisis de reducción de acetileno (ARA), para

el aislamiento CalChRI41R1 arrojó un valor de 2.74 µmol/frasco/hora tras

24 horas de incubación a 32°C. El aislamiento TrMnPR41R248 mostró

una actividad nitrogenasa de 0.16 µmol/frasco/hora bajo las mismas

condiciones del aislamiento de C. alliodora (Anexo 6).

6.1.4. Crecimiento en Agar Pectina, Solubilización de Fósforo y Producción de Sideróforos por los Aislamientos Seleccionados Tanto en el medio SMRS y en el agar pectina hubo crecimiento de los

microorganismos seleccionados (Figura 4).

En agar SMRS se observaron halos amarillos alrededor de las colonias

bacterianas a las tres horas de incubados los aislamientos y se alcanzó

un viraje total del medio a las 24 horas. En agar pectina se evidenció

crecimiento luego de 24 horas de incubación.

57

CalChRI41R1 (24 h) TrMnPR41R248 (24h)

CaIChRI41R1 (3 h en SMRS) TrMnPr41R248 (3 h en SMRS)

Figura 4. Crecimiento en agar pectina (arriba) y actividad solubilizadora de fosfato (abajo) de CalChRI41R1 y de TrMnPR41248 (los halos amarillos indican la solubilización del citrato de fosfato en el medio SMRS) 6.1.5. Crecimiento de los Aislamientos CalChRI41R1 y TrMnpr41r248

La evaluación de crecimiento de CalChRI41R1 se llevó a cabo durante 42

horas en caldo nutritivo sin adición de triptófano. En este periodo la

bacteria mostró un crecimiento exponencial hasta la hora 24 con una

absorbancia de 0.484 y una concentración de 58 X 108 UFC/ml, a partir

de este momento se evidenció una fase estacionaria hasta la hora 32,

momento en el cual el recuento de UFC/ml en el cultivo bacteriano

empezó a descender (Figura 5). Las concentraciones bacterianas

obtenidas se presentan en el anexo 14.

58

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42

Tiempo (horas)

Abso

rban

cia

(540

nm

)

0

2

4

6

8

10

12

Conc

entra

ción

bac

teri

ana

(Log

UFC

/ml)

Absorbancia Concentracion

Figura 5. Curva de crecimiento de CalChRI41R1 en caldo nutritivo.

La evaluación del crecimiento de TrMnPR41R248 se llevó a cabo durante

42 horas en caldo nutritivo sin triptófano. En este período la bacteria

mostró crecimiento exponencial hasta la hora 16 con una absorbancia de

0.474 nm y una concentración de 8x107UFC/ml, a partir de esta hora se

evidencia una diauxia entre la hora 18 y la hora 22 con una recuperación

en la hora 24. Sin embargo las concentraciones se mantienen en el

mismo orden de magnitud. Se presenta un fase estacionaria corta entre

las horas 24 a 28 momento en el cual los recuentos de UFC/ml

empezaron a disminuir (Figura 6). Las concentraciones bacterianas se

presentan en el anexo 15.

59

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42

Tiempo (horas)

Abs

orba

ncia

(540

nm

)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Con

cent

raci

ón b

acte

rian

a (L

og/m

l)

Absorbancia Concentracion

Figura 6. Curva de crecimiento de TrMnPR41R248 en cultivo nutritivo

6.1.6. Inmovilización de los Aislamientos Bacterianos CalChRI41R1 y TrMnPR41R248 en Turba como Portador Microbiano 6.1.6.1. Evaluación de la Esterilidad del Portador Sólido Turba No se evidenció crecimiento microbiano sobre AN (< 103 UFC/g) para

ninguna de los tres muestreos (24, 48, 72 horas) de turba analizadas lo

que indica la esterilidad del portador.

6.1.6.2. Formulación de los Inoculantes de las PGPB’s Endorizosféricas Seleccionada para C. alliodora y T. rosea en el Portador Microbiano

El proceso de inmovilización en turba se realizó a partir de cultivos

líquidos en caldo nutritivo sin adición de triptófano de cada uno de los

microorganismos en fase exponencial, con una población inicial para

CalChRI41R1 de 12x108 UFC/ml (hora 24 según curva de crecimiento

60

previa) y para TrMnPR41R248 de 16x107 UFC/ml (hora 24 según curva

de crecimiento previa).

6.1.6.3. Cultivo Secundario de CalChRI41R1 y TrMnPR41R248 en Portador Microbiano Sólido

La bacteria CalChRI41R1 presentó concentraciones de 15x104 UFC/g tras

24 horas de incubación, 12x106 UFC/g a las 48 horas y a las 72 horas de

incubación 10x107 UFC/g.

La bacteria TrMnPR41R248 presentó una concentración de 9x105 UFC/g

a las 24 horas de incubación de 10x105 UFC/g a las 48 horas y a las 72

presento una concentración de 70x106 UFC/g.

6.1.6.4. Viabilidad de Células Inmovilizadas en Turba Durante 120 Dias

Las concentraciones durante los nueve muestreos (tabla 3) se

mantuvieron constantes para TrMnPR41R248 con una concentración

inicial de 59 x 106 UFC/g y final de 11 x 107UFC/g mientras que para

CalChRI41R1 la concentración aumento de 63 x 105 UFC/g (24 hdcs) a

10 x 107UFC/g (120 ddcs). La morfología macroscópica de las colonias

para CalChRI41R1 fue convexa, circular y cremosa transparente y su

morfología microscópica de bacilos Gram negativos a lo largo de los

nueve muestreos, mientras que TrMnPR41R248 mostró una morfología

macroscópica de las colonias convexas puntiformes y transparentes y su

morfología microscópica fue la de bacilos cortos Gram negativos.

61

Tabla 3. Viabilidad de los aislamientos de Tabebuia rosea y Cordia alliodora

inoculados en turba estéril

Tiempo TrMnPR41R248 UFC/g turba CalChRI41R1 UFC/g

turba

1 ddcs* 59 x 106 63 x 105

2 ddcs 55 x 106 46 x 106

3 ddcs 53 x 107 32 x 106

8 ddcs 53 x 107 29 x 107

15 ddcs 36 x 107 60 x 107

30 ddcs 25 x 107 20 x 107

60 ddcs 19 x 107 50 x 107

90 ddcs 12 x 107 10 x 107

120 ddcs 11 x 107 10 x 107

*ddcs: días después del cultivo secundario.

6.1.7. Prueba de Inocuidad de los Aislamientos CalChRI41R1 y TrMnPR41R248 sobre Medicago sativa Alfalfa

Las plantas de alfalfa inoculadas con los aislamientos de C. alliodora y

T. rosea seleccionados no presentaron signos ni síntomas de

enfermedades bacterianas, como pudriciones, marchites clorosis entre

otras. La medición de las variables altura (H) y longitud de raíz (LR) no

mostraron diferencias estadísticamente significativas entre los

tratamientos (Tabla 4).

62

Tabla 4. Análisis de las variables de crecimiento evaluadas de Medicago sativa.

Tratamiento n=45 H(media) LR(media) R1 10,09 13,05 CalChRI41R1 R2 10,73 13,05 R3 9,64 12,29 R1 11,00 11,89 TrMnPR41R248 R2 10,35 13,03 R3 10,55 12,25 R1 12,03 12,93 CONTROL R2 9,98 12,37 R3 10,23 12,81 Kruskal Wallis p<0.05 0.12 0.09

H: altura, LR: longitud raíz y NH: numero de hojas.

6.1.8. Viabilidad e Imbibición de Semillas de C. alliodora y T. rosea

6.1.8.1. Curva de Imbibición para Semillas de C. alliodora

Para C. alliodora se realizarón dos curvas de imbibición, la primera para

semillas pequeñas (6-8mm) y la segunda para semillas grandes

(Anexo 16). En la primera el promedio del peso fresco inicial fue de

0.34 g. El tiempo de imbibición para las semillas pequeñas fue de 23

horas, momento en el que alcanzaron un peso final promedio de 0.85 g,

aumentando su peso en un 241% (Figura 7). En la segunda curva, el

peso fresco inicial de las semillas fue de 0.42 g. El tiempo de imbibición

para las semillas grandes fue de 22 horas, con un peso máximo

alcanzado la hora 19 de 0.938 g (Figura 7, anexo 16) momento en el que

alcanzaron un peso fresco final promedio de 0.82 g, aumentando su peso

en un 192% (Figura 7).

63

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

1

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23

Tiempo (h)

Peso

(g)

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23

Tiempo (h)

Peso

(g)

Figura 7. Curva de imbibición de semillas de Cordia alliodora.

A: Semillas pequeñas; B: Semillas grandes R1: Repetición 1; R2: Repetición 2; R3: Repetición 3

6.1.8.2. Curva de Imbibición para Semillas de T. rosea Para la curva de imbibición el peso fresco promedio inicial de las semillas

fue de 0.34 g (Anexo 17). El tiempo de imbibición fue de 19 horas,

momento en el cual las semillas alcanzaron un peso promedio de 1.13 g,

aumentando un 321% su peso fresco (Figura 8).

A

B

64

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23

Tiempo (h)

Peso

(g)

Figura 8. Curva de imbibición de semillas de Tabebuia rosea

R1: Repetición 1; R2: Repetición 2; R3: Repetición 3 6.1.8.3. Prueba de Viabilidad para Semillas de C. alliodora

La prueba de viabilidad se hizo a 15 semillas de cada tamaño tanto

imbibidas como no imbibidas. Para ninguno de los tamaños a las 24 horas

se presentó tinción del embrión (figura 9). Transcurridas 48 horas las

semillas pequeñas imbibidas presentaron una viabilidad del 37% y las no

imbibidas una viabilidad del 57% en el total de semillas evaluadas. Las

semillas grandes imbibidas tuvieron una viabilidad del 23% y las no

imbibidas del 47%. Los patrones de viabilidad para cada repetición se

presentan en el anexo 9.

Figura 9. Viabilidad de Semillas de C. alliodora teñidas con azul de Tetrazolio 0.1%

6 mm

Semillas viables Semilla no viable

65

6.1.8.4. Prueba de Viabilidad para Semillas de T. rosea

La prueba de viabilidad se realizó a 15 semillas imbibidas y a 15 semillas

no imbibidas. A las 24 horas se apreció una viabilidad para las semillas

no imbibidas del 53% y para las semillas imbibidas del 83.3%. Tras 48

horas la viabilidad para las semillas no imbibidas fue del 76.6% y para

las semillas imbibidas del 83% (figura 10).

Figura 10. Viabilidad de semillas de T. rosea teñidas con Azul de Tetrazolio 0.1%

6.2. Fase Dos: Efecto de CalChRI41R1 y TrMnPR41R248 sobre Semillas de su Hospedero. 6.2.1. Germinación de Semillas de Cordia alliodora Tamaño Pequeño (6-8 mm) La curva de germinación para todos los tratamientos fue una curva

sigmoidal en la que se pueden evidenciar tres fases bien definidas

(Figura 11). La primera corresponde al periodo entre la siembra y el inicio

de la germinación, periodo aproximado al intervalo 9 con excepción de T1

y T6 que presentan su inicio de germinación en el intervalo 7 y 11

respectivamente. En la segunda fase se presenta la germinación de la

mayoría de las semillas entre los intervalos 10 y 14. Por último, la tercera

fase corresponde al periodo en que se estabiliza la germinación para

9 mm

66

todos los tratamientos alrededor del intervalo 14, excepto en T3, en el

cual la germinación se estabiliza a partir del intervalo 12.

0

5

10

15

20

25

30

35

I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8 I9 I10 I11 I12 I13 I14 I15 I16

Intervalos de tiempo (dds)

Porc

enta

je d

e ge

rmin

acio

n

T1 T2 T3 T4 T5 T6

Figura 11. Germinación de Cordia alliodora pequeña. T1: PGPR´s turba; T2: (PGPR`s caldo); T3: acido naftalanacético ANA; T4: (acido giberélico) GA3; T5: (ANA +GA3); T6: (Control absoluto). Los intervalos corresponden a mediciones realizadas cada tercer día.

6.2.1.1. Indice VG (valor de germinación) para C. alliodora Pequeña

El VG para todos los tratamientos cumplió con los supuestos de

normalidad y homogeneidad de varianza (Anexo 21). El análisis de

varianza no mostró diferencias estadísticamente significativas entre los

tratamientos (p = 0.2615) (figura 12). Pese a lo anterior, los tratamientos

que alcanzaron los mayores porcentajes de germinación fueron T2

(PGPR’s caldo) (33%) y T1 (PGPR`s en turba) y el más bajo T3 (ANA)

(20%) (Ver figura 12).

67

00,20,40,60,8

11,2

T1

T2

T3

T4

T5

T6

GDM VM VG

Figura 12. Valor de germinación de semillas pequeñas de C. alliodora. T1: PGPR´s turba; T2: (PGPR`s caldo); T3: acido naftalanacético ANA; T4: (acido giberélico) GA3; T5: (ANA +GA3); T6: (Control absoluto).

6.2.1.2. Germinación de Semillas de Cordia alliodora Fenotipo Grande (8-10 mm)

El comportamiento de la curva de germinación (Figura 13) corresponde al

descrito para las semillas pequeñas. La primera fase corresponde al

intervalo de tiempo entre la siembra y el inicio de la germinación en el

intervalo 7. En la segunda fase se presentó la germinación de la mayoría

de las semillas entre los intervalos 7 y 13. La tercera fase corresponde al

período en que se estabiliza la germinación para todos los tratamientos

aproximadamente en el intervalo 14.

68

0

10

20

30

40

50

60

70



porc

enta

je d

e ge

rmin

acio

n

T1 T2 T3 T4 T5 T6

Figura 13. Germinación de Cordia alliodora grande. T1 : PGPR´s turba ; T2 : PGPR`s caldo; T3 acido naftalanacético ANA; T4 acido giberélico GA3, T5 (ANA +GA3), T6 (Control absoluto). Los intervalos corresponden a mediciones realizadas cada tercer día.

6.2.1.3. Indice VG (Valor de Germinación) para C. alliodora Grande

El VG para todos los tratamientos cumplió con los supuestos de


varianza no mostró diferencias estadísticamente significativas entre

ningún tratamiento (p = 0.1341) (figura 14).

Por otro lado T6 presenta la velocidad de germinación y el porcentaje de

semillas germinadas más altas del ensayo (65%) seguido de T5 (49%) y

los valores más bajos los presenta T3 (9%) (Ver Figura 14).

69

0

0,5

1

1,5

2T1

T2

T3

T4

T5

T6

GDM VM VG

Figura 14. Valor de germinación de semillas grandes de C. alliodora. T1: PGPR´s turba; T2: PGPR`s caldo; T3 acido naftalanacético ANA; T4 acido giberélico GA3, T5 (ANA +GA3), T6 (Control absoluto).

6.2.1.4. Germinación de Semillas de Tabebuia rosea

La curva de germinación de T. rosea (figura 15) presentó comportamiento

diferente a las de C. alliodora. Sin embargo también se puede dividir en

tres fases de germinación, menos marcadas que las de C. alliodora.

La primera fase corresponde al periodo de tiempo entre la siembra y el

inicio de la germinación alrededor del intervalo 3. En la segunda fase

germinaron la mayoría de las semillas aproximadamente entre los

intervalos 4 y 12. Por último, la tercera fase corresponde al periodo en

que se estabiliza la germinación para todos los tratamientos alrededor del

intervalo 14. Vale la pena destacar que la fase de latencia fue más corta

para todos los tratamientos que en el caso de las semillas de C. alliodora,

en especial para el tratamiento T3 (ANA) aunque este no alcanzó el

mayor porcentaje de germinación dentro del ensayo (45%). Además, el T1

(PGPR’s turba) inició la germinación de forma mas rápida con relación a

los demás tratamientos pese a lo cual las semillas en este tratamiento

presentaron el porcentaje de germinación más bajo.

70

010203040506070



Porc

enta

je d

e G

erm

inac

ion

T1 T2 T3 T4 T5 T6

Figura 15. Curva de germinación de Tabebuia rósea. T1: PGPR´s turba ; T2: PGPR`s caldo; T3 acido naftalanacético ANA; T4 acido giberélico GA3, T5 (ANA +GA3), T6 (Control absoluto). Los intervalos corresponden a mediciones realizadas cada tercer dia. 6.2.1.5. Indice VG (Valor de Germinación) para T. rosea El VG para todos los tratamientos cumplió con los supuestos de


varianza no mostró diferencias estadísticamente significativas entre

ningún tratamiento (p = 0.3658) (figura 16). T3 (ácido naftalanacético)

presentó la velocidad de germinación y el porcentaje de germinación mas

alto frente a los demás tratamientos (63 %), mientras que T1 presenta los

menores valores con un porcentaje de germinación del 31% (Figura 16).

71

0

0,5

1

1,5

2

2,5T1

T2

T3

T4

T5

T6

GDM VM VG

Figura 16. Valor de germinación de semillas de T. rosea. T1: PGPR´s turba; T2: PGPR`s caldo; T3 acido naftalanacético ANA; T4 acido giberélico GA3, T5 (ANA +GA3), T6 (Control absoluto).

6.2.2. Efecto del Fungicida Basamid® sobre las Poblaciones Microbianas del Sustrato de Siembra y Desarrollo de Plantas Jóvenes de C. alliodora y T. rosea El análisis microbiológico del sustrato de siembra tratado con Basamid®

mostró la presencia un bacilo Gram positivo de crecimiento macroscópico

tipo spreader sobre el medio de cultivo hasta la dilución 104 (Figura 17).

Figura 17. Colonia de Bacilo gram negativo aislado del sustrato en Agar Nutritivo de transplante de C. alliodora y T. rosea en fase vivero

72

Los recuentos microbianos entre 7 y 15 días después de la aplicación del

producto no mostraron diferencias importantes sobre las unidades

formadoras de colonias de CaIChRI41R1 y TrMnPR41R248, siendo en

ambos casos de 104 UFC/g de suelo (figura 18). La adición del fungicida

no mostró un efecto fitotóxico sobre el crecimiento de Triticum aestivum L.

(trigo) al comparar las plantas sembradas en este sustrato con las

plantadas en sustrato sin tratar con el fungicida.

73

Figura 18. Reaislamiento de CaIChRI41R1 y TrMnPR41R248 de suelo tratado con Basamid.

A: CaIChRI41R1. B: TrMnPR41R248

A

B

Colonia Aislamiento TrMnPr41R248

105

104

103

105

106

103

Colonia Aislamiento CaIChRI41R1

74

6.3. Fase Tres: Efecto de CaIChRI41R1 y TrMnPR41R248 Sobre el Crecimiento y Desarrollo de Plantas de C. alliodora y T. rosea

Obtenidos a partir de Semilla 6.3.1 Crecimiento y Desarrollo de Plantas Jóvenes de C. alliodora

De las ocho variables de crecimiento vegetal evaluadas para C. alliodora

a los 120 dds, la única variable que cumplió con los supuestos de

normalidad y homocedasticidad fue la variable H (altura), las demás

variables no cumplieron con estos supuestos y se les aplicó una de las

transformaciones de la familia de Jonson (logaritmo natural). Al adecuar el

modelo con esta transformación las variables transformadas PFR y PSR

mostraron una varianza homogénea (α= 0.005) las demás variables LR,

AF, PFA y PSA fueron evaluadas con la prueba no paramétrica de

Kruskall- Wallis (anexo 24). Ninguna de ellas presentó diferencias

estadísticas entre los tratamientos.

Las variables de crecimiento vegetal que presentaron diferencias

estadísticamente significativas se muestran a continuación.

6.3.1.1. Altura

El análisis de varianza mostró diferencias significativas entre los

tratamientos para esta variables (p=0.016) (anexo 25). Según la prueba

de Duncan el tratamiento T4 (PGPB + HMA) obtuvo el valor medio

superior más alto (10,24 cm) y es estadísticamente diferente a los demas

tratamientos. T2, (HMA) con 8,27 cm obtuvo el valor medio más bajo

(figura 19). Al realizar una prueba de comparaciones múltiples (Dunett)

de los tratamientos con respecto al control, se observó que el tratamiento

T4 presentó diferencias significativas con respecto al tratamiento control

(p = 0.0366) (anexo 25).

75

baba

bbb

0

2

4

6

8

10

12

T1 T2 T3 T4 T5 T6

Tratamientos

H (c

m)

Figura 19. Altura de plantas jóvenes de Cordia alliodora 120 dds. T1: (CalChRI41R1 inmovilizado en turba); T2: (HMA): T3: (ANA); T4: (CalChRI41R1+ HMA); T5 :( HMA+ANA); T6: (control). Letras diferentes indican diferencias significativas entre los tratamientos según prueba de Duncan (α=0.05) 6.3.1.2. Peso Fresco de Raíz Esta variable se transformó con logaritmo natural. El análisis de varianza

de las variables transformadas mostró diferencias estadísticamente

significativas entre los tratamientos para la variable (p=0.032). Según la

prueba de Duncan los tratamientos T2 (HMA) y T6 (control) presentaron

diferencias significativas frente a los demás tratamientos teniendo que el

valor medio más alto lo presenta T6 (0.98g) mientras que el valor medio

más bajo lo tuvo T3 (ANA) (0.37g) (Figura 20).

La prueba de Dunett mostró que no hay diferencias estadísticamente

significativas de los tratamientos con respecto al tratamiento control

(Anexo 25).

76

a

ababb

a

ab

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

T1 T2 T3 T4 T5 T6

Tratamientos

PFR

(g)

Figura 20. Peso fresco de raíz de Cordia alliodora 120 dds. T1: (CalChRI41R1 inmovilizado en turba); T2: (HMA); T3: (ANA); T4: (CalChRI41R1+ HMA); T5:( HMA+ANA); T6 (control) Letras diferentes indican diferencias significativas entre los tratamientos según prueba de Duncan (α=0.05) 6.3.1.3. Peso Seco de Raíz

El análisis de varianza de la variable transformada mostró diferencias

altamente significativas entre los tratamientos (p=0.007) (Figura 21). La

prueba Duncan (anexo25) arrojó tres grupos homogéneos dentro de los

tratamientos para la variable LPSR, observando que el valor más alto y

estadísticamente diferente fue para T2 (0.20g) y el valor más bajo T3

(0.07g) (Figura 21).

77

abcab

bcc

a

bc

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

T1 T2 T3 T4 T5 T6

Tratamientos

PSR

(g)

Figura 21. Peso seco de raíz de Cordia alliodora 120 dds. T1: (TrMnPR41R248 inmovilizado en turba), T2: (HMA); T3 (ANA); T4: (TrMnPR41R248+ HMA); T5: (HMA+ANA); T6: (control) Letras diferentes indican diferencias significativas entre los tratamientos según prueba de Duncan (α=0.05)

6.3.1.4. Variables de Micorrización de C. alliodora

6.3.1.5. Aislamiento y Recuento de Esporas de Hongos de Micorriza Arbuscular Para C. alliodora, se presentan diferencias altamente significativas entre

los tratamientos (anexo 24) la prueba de comparaciones múltiples de

Dunnett, indicó diferencias en el porcentaje de micorrización entre el

tratamiento T1 (TrMnPr41R248 turba), respecto al T2 (HMA) y T4

(TrMnPr41R248 + HMA); entre T2 respecto a T3 y T1 (anexo 30) tanto

para las variables de número de esporas como de porcentaje de

micorrización (anexo 26). En cuanto al conteo de esporas se obtuvo el

mismo comportamiento de la micorrización pero no se presentaron

diferencias altamente significativas entre los tratamientos T2 y T3. El valor

más alto dentro de estos tratamientos es T4 con 1.07 esporas/g de suelo,

seguido de T2 con 0.87 esporas/g de suelo, mientras que el conteo más

bajo los arrojó el tratamiento T6 con 0.04 esporas/g de suelo. El

porcentaje de micorrización más alto dentro de estos cuatro tratamientos

78

lo presentó T4 con un 65.33%, T2 presentó un porcentaje de infección del

58.56%, mientras que el porcentaje de micorrización más bajo fue para T6

con un 9.5%. En términos generales, el tratamiento T5 presentó los

valores más altos de número de esporas y de porcentaje de micorrización

frente a los tratamientos T2 y T4, pese a no tener diferencias

estadísticamente significativas con estos (Figuras 21 y 22).

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

T1 T2 T3 T4 T5 T6

TRATAMIENTOS

No.

esp

oras

/g d

e su

elo

Figura 22. Número de esporas de HMA/g de suelo de C. alliodora 120 dds. T1: (CalChRI41R1 inmovilizado en turba); T2: (HMA): T3: (ANA); T4:(CalChRI41R1+ HMA); T5 :( HMA+ANA); T6: (control).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

T1 T2 T3 T4 T5 T6

TRATAMIENTOS

Por

cent

aje

de m

icor

riza

cion

Figura 23. Porcentaje de micorrización de plantas jóvenes de C. alliodrora 120 dds. T1: (CalChRI41R1 turba); T2: (HMA): T3: (ANA); T4:(CalChRI41R1+ HMA); T5 :( HMA+ANA); T6: (control).

79

6.3.2. Resultados de las Variables de Crecimiento de Plantas Jóvenes de Tabebuia rosea

De las ocho variables de crecimiento vegetal evaluadas para T. rosea a

los 120 dds, las variables que no cumplieron con los supuestos de

normalidad y homocedasticidad fueron las variables AF, PFA, y PFR a las

cuales se les aplicó una de las transformaciones de la familia de Jonson

(logaritmo natural). Al adecuar el modelo con esta transformación las

variables transformadas mostraron una varianza homogénea

(α= 0.005), (anexo28) excepto la variable AF que fue evaluada con la

prueba no paramétrica Kruskall- Wallis (anexo 27).

Las variables de crecimiento vegetal que presentaron diferencias

estadísticamente significativas se presentan a continuación.

6.3.2.1. Altura

El análisis de varianza mostró diferencias altamente significativas entre

los tratamientos para esta variable (p = 0.0010) (anexo28). Según la

prueba de Duncan el tratamiento con el mayor valor y diferente a los

demás tratamientos fue T1 (TrMnPR41R248 turba) (13.67cm), mientras

que el tratamiento con el comportamiento más bajo fue T5 (HMA+ANA)

(11.01 cm) (figura 24). La prueba de Dunett no mostró diferencias de los

tratamientos respecto al tratamiento control (Anexo 28).

80

bccabababa

0

2

4

6

8

10

12

14

16

T1 T2 T3 T4 T5 T6

Tratamientos

H (c

m)

Figura 24. Altura de plantas jóvenes de Tabebuia rosea 120 dds. T1: (TrMnPR41R248 inmovilizado en turba), T2: (HMA); T3 (ANA); T4: (TrMnPR41R248+ HMA); T5: (HMA+ANA); T6: (control). Letras diferentes indican diferencias significativas entre los tratamientos según prueba de Duncan (α=0.05)

6.3.2.2. Longitud de Raíz Según el análisis de varianza existen diferencias estadísticamente

significativas entre los tratamientos para esta variable. (p = 0.019)

(figura 25). Según la prueba de Duncan el mejor tratamiento fue T1

(PGPB´s turba) (30.63 cm), seguido por T4 (TrMnPR41R248+

HMA)(29.81 cm), mientras que T5 (HMA+ANA) (26.84 cm) presentó el

peor comportamiento para esta variable. La prueba de Dunett mostró que

el tratamiento T1 (PGPB´s turba) (30.63 cm), fue diferente respecto al

tratamiento control (T6) (27.15 cm) (p = 0.02766) (Anexo 28).

81

bcc

ababcabc

a

24

25

26

27

28

29

30

31

T1 T2 T3 T4 T5 T6

Tratamientos

LR

(cm

)

Figura 25. Longitud radical de Tabebuia rosea 120 dds. T1: (TrMnPR41R248 inmovilizado en turba), T2: (HMA); T3 (ANA); T4: (TrMnPR41R248+ HMA); T5: (HMA+ANA); T6: (control). Letras diferentes indican diferencias significativas entre los tratamientos según prueba de Duncan (α=0.05)

6.3.2.3. Peso Fresco de Raíz Se presentaron diferencias altamente significativas (p=0.0001) entre los

tratamientos. Según la prueba de Duncan el tratamiento que presentó

mayor valor para esta variable fue T4 (TrMnPR41R248+ HMA) (5.18 g) y

el tratamiento con el menor valor medio fue T5 (HMA+ANA) (2.08g).

Según la prueba de Dunett el T4 (TrMnPR41R248+ HMA) presenta

diferencias significativas frente al control (p = 1.0054E-05) (Anexo 28).

82

bcc

a

bbcbc

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

T1 T2 T3 T4 T5 T6

Tratamientos

PFR

(g)

Figura 26. Peso fresco de raíz de Tabebuia rosea 120 dds. T1: (TrMnPR41R248 inmovilizado en turba), T2: (HMA); T3 (ANA); T4: (TrMnPR41R248+ HMA); T5: (HMA+ANA); T6: (control). Letras diferentes indican diferencias significativas entre los tratamientos según prueba de Duncan (α=0.05) 6.3.2.4. Peso Seco de Raíz El análisis de varianza mostró diferencias altamente significativas para

esta variable entre los tratamientos (p = 0.0085). (Figura 28) Según la

prueba de Duncan, T2 (HMA) mostró el mejor comportamiento (0.5817 g)

mientras que tratamiento T5 (HMA+ANA) tuvo el comportamiento más

bajo (0.3614g). Según Dunett el tratamiento T2 (HMA) presenta

diferencias significativas con el tratamiento control (0.3869 g)

(p = 0.00998) (Anexo 28).

83

aba ab ab c c

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

T1 T2 T3 T4 T5 T6

Tratamientos

PS

R (g

)

Figura 27. Peso seco de raíz de Tabebuia rosea 120 dds. T1: (TrMnPR41R248 inmovilizado en turba), T2: (HMA); T3 (ANA); T4: (TrMnPR41R248+ HMA); T5: (HMA+ANA); T6: (control). Letras diferentes indican diferencias significativas entre los tratamientos según prueba de Duncan (α=0.05)

6.3.2.5. Peso Fresco Aéreo El mejor tratamiento para esta variable fue T4 (TrMnPR41R248+ HMA)

(6.64 g), mientras que T5 (HMA+ANA) mostró el valor más bajo (figura 29)

(3.28g). Según la prueba de Dunett el tratamiento T4 (TrMnPR41R248+

HMA) presenta diferencias significativas respecto al tratamiento control

(p = 0.00086) (anexo 28).

84

bcc

a

bbcbc

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

T1 T2 T3 T4 T5 T6

Tratamientos

PFR

(g)

Figura 28. Peso fresco aéreo Tabebuia rosea 120 dds. T1: (TrMnPR41R248 inmovilizado en turba), T2: (HMA); T3 (ANA); T4: (TrMnPR41R248+ HMA); T5: (HMA+ANA); T6: (control). Letras diferentes indican diferencias significativas entre los tratamientos según prueba de Duncan (α=0.05)

6.3.2.6. Peso Seco Aéreo El análisis de varianza mostró diferencias altamente significativas para

esta variable entre los tratamientos (p = 0.0078). Según la prueba de

Duncan el tratamiento más significativo para esta variable fue T1

(TrMnPR41R248 en turba) (1.040 g), mientras que el tratamiento T5

mostró la tendencia más baja (0.6905 g) (Figura 30).

85

bccababcaba

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

T1 T2 T3 T4 T5 T6

Tratamientos

PS

A (g

)

Figura 29. Peso seco aéreo de Tabebuia rosea 120 dds. T1: (TrMnPR41R248 inmovilizado en turba), T2: (HMA); T3 (ANA); T4: (TrMnPR41R248+ HMA); T5: (HMA+ANA); T6: (control). Letras diferentes indican diferencias significativas entre los tratamientos según prueba de Duncan (α=0.05) 6.3.3. Variables de Micorrización de T. rosea

Se presentaron diferencias altamente significativas entre los tratamientos

para esta variable (anexo 32). La prueba de comparaciones múltiples de

Dunnett en T. rosea mostró diferencias para los tratamientos

T1 (CalChRI41R1 + turba) y T3 (ANA) respecto al tratamiento

T4 (CalChRI41R1 + HMA), para el número de esporas (anexo 33), y

diferencias significativas entre los tratamientos T3, T5 (HMA+ANA) y

T6 (control) respecto al tratamiento T4 (TrMnPR41R248+ HMA) (anexo

33) para el porcentaje de micorrización de plantas jóvenes de C. alliodora.

El mayor conteo de esporas se obtuvo en el tratamiento T2 (0.93

esporas/g suelo), al que le siguió T5 (0.91 esporas/g suelo). El tratamiento

con el conteo más bajo de esporas fue T3 (0.08 esporas/g suelo). Las

plantas jóvenes de T. rosea presentaron el mayor porcentaje de

micorrizacion con el tratamiento T4 (TrMnPR41R248+ HMA) (76.46%),

seguido por T2 (HMA) (66.13%). Las plantas con los menores porcentajes

de micorrizacion se presentaron en los tratamientos T3 (ANA) (24.63%),

86

T5 (HMA+ANA) (22.83%) y T6 (control) (15.06%), respectivamente

(Figuras 31 y 32 ).

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

1

T1 T2 T3 T4 T5 T6

TRATAMIENTO

No.

esp

oras

/g s

uelo

Figura 30. Número de esporas de HMA/g de suelo de T. rosea 120 dds. T1: (TrMnPR41R248 inmovilizado en turba); T2: (HMA); T3: (ANA); T4: (TrMnPR41R248+ HMA); T5:(HMA+ANA); T6: (control).

0102030405060708090

T1 T2 T3 T4 T5 T6

TRATAMIENTOS

Por

cent

aje

de m

icor

riza

cion

Figura 31. Porcentaje de micorrización de plantas jóvenes de T. rosea 120 dds. T1: (TrMnPR41R248 inmovilizado en turba); T2: (HMA); T3: (ANA); T4: (TrMnPR41R248+ HMA); T5:(HMA+ANA); T6: (control).

6.3.4. Recuento de las Bacterias Inoculadas Adheridas a Semillas y Raíces en el Momento de la Siembra.

Se observó que para semillas de C. alliodora el recuento de células

inoculadas fue de 9 x 108 UFC/g semilla; para semillas de T. rosea el

87

recuento de células inoculadas fue de 8 x107 UFC/g semilla.

Adicionalmente el recuento de células bacterianas adheridas a raíces de

C. alliodora arrojó un recuento de 8 x 108 UFC /g raíz y para raíces de

T. rosea el recuento de células fue de 11 x 10 9 UFC /g raíz

Figura 32. A. Crecimiento de TrMnPR41R248 en agar nutritivo B. TrMNPr41R248 adherido a semillas de T. rosea, agar nutritivo

6.3.5. Reaislamiento de CaChRI41R1 y TrMnPR41R248 de Raices y Suelo Asociado a las Raíces de Plantas Jóvenes de las dos Especies A partir de la siembra de las diferentes diluciones realizadas de raíz y de

suelo asociado a raíz, se presentó crecimiento positivo de colonias

similares morfológicamente a los aislamientos CaChRI41R1

(5 X105UFC/g) y TrMnPR41248 (7 X107UFC/g) de las dos especies

A

B

Colonia TrMnPR41R248

Colonia adherida a semillas T.

rosea

88

donde se inocularon los aislamientos inmovilizados en turba. Sin embargo

se observó igualmente crecimiento positivo de colonias morfológicamente

similar en otros tratamientos donde los aislamientos no habían sido

inoculados (Tablas, 5,6).

Tabla 5. Reaislamiento de bacterias a partir de raíces y suelo asociado a raíz

CaChRI41R1 120dds

Tratamiento Raíz (UFC/g) Suelo asociado a raíz (UFC/g)

T1R1 5 X 105 6 X 105 T1R2 4 X 102 < 10 UFC T1R3 < 10 UFC < 10 UFC T2R1 < 10 UFC < 10 UFC T2R2 < 10 UFC 3 X 104 T2R3 6 X106 < 10 UFC T3R1 < 10 UFC < 10 UFC T3R2 < 10 UFC 2 X103 T3R3 < 10 UFC < 10 UFC T4R1 2 X 105 3 X 107 T4R2 < 10 UFC < 10 UFC T4R3 < 10 UFC 6 X 102 T5R1 5 X102 < 10 UFC T5R2 < 10 UFC < 10 UFC T5R3 6X106 < 10 UFC T6R1 < 10 UFC < 10 UFC T6R2 < 10 UFC 2 X 105 T6R3 < 10 UFC < 10 UFC

1. T: Tratamiento (T1: CalChRI41R1 inmovilizado en turba; T2: HMA: T3: ANA;

T4:CalChRI41R1+ HMA; T5 : HMA+ANA; T6: control. 2. R: Repetición 3. (-): Ninguna de las colonias encontradas presento morfología macroscópica

similar a CaChRI41R1.

89

Tabla 6. Reaislamiento de bacterias a partir de raíces y suelo asociado a raíz

TrMnPR41248

Tratamiento Raíz Suelo asociado a raíz T1R1 < 10 UFC 5 X 105 T1R2 7 X 107 < 10 UFC T1R3 3 X 105 < 10 UFC T2R1 < 10 UFC 4 X102 T2R2 < 10 UFC < 10 UFC T2R3 < 10 UFC < 10 UFC T3R1 3 X 105 < 10 UFC T3R2 < 10 UFC 5 X 103 T3R3 2 X 104 < 10 UFC T4R1 < 10 UFC 3 X102 T4R2 6 X 103 < 10 UFC T4R3 < 10 UFC 2 X106 T5R1 1 X 105 < 10 UFC T5R2 < 10 UFC 5 X 102 T5R3 < 10 UFC < 10 UFC T6R1 9 X 102 < 10 UFC T6R2 < 10 UFC < 10 UFC T6R3 < 10 UFC < 10 UFC

1. Tratamiento (T1: CalChRI41R1 inmovilizado en turba; T2: HMA: T3: ANA; T4:CalChRI41R1+ HMA; T5 : HMA+ANA; T6: control. 2. R: Repetición 3. < 10 UFC Ninguna de las colonias encontradas presento la morfología macroscópica de TrMnPr41R248

90

7. DISCUSIÓN

En este proyecto de investigación se emplearon las bacterias

CaIChRI41R1 y TrMnPR41248 como inoculantes biológicos promotores

de crecimiento vegetal. CaIChRI41R1 es un aislamiento endófito de

Cordia alliodora y TrMnPR41248 se aisló a partir de Tabebuia rosea. Los

dos aislamientos son productores de acido indol acético (AIA), crecen

sobre agar pectina y presentan halos de solubilización en agar SMRS.

Además, CaIChRI41R1 fija nitrógeno atmosférico. Los dos aislamientos

bacterianos se inocularon sobre semillas pregerminadas de alfalfa con el

fin de observar su posible acción patógena. Se estableció su curva de

crecimiento con el propósito de determinar el tiempo de incubación

necesario para la mayor producción de biomasa y AIA, parámetros bajo

los que se realizó su inmovilización en turba. Posteriormente se

inocularon sobre semillas y plantas jóvenes de C. alliodora y T. rosea,

evaluando su germinación, crecimiento y desarrollo en condiciones de

vivero.

7.1. Características Biológicas de CaIChRI41R1 y TrMnPR41248 La selección de CaIChRI41R1 y TrMnPR41248 se fundamentó en su

versatilidad biológica para sintetizar fitohormonas, solubilizar hierro y

fósforo y fijar nitrógeno, lo que las hace promisoras para generar un

paquete tecnológico dirigido a promover la germinación, crecimiento y

desarrollo de diferente material vegetal de especies forestales bajo

condiciones de vivero. La primera característica biológica determinada

para CaIChRI41R1 y TrMnPR41248 fue la síntesis de AIA, la cual indicó

la capacidad de las dos bacterias de sintetizar dicha hormona con o sin

adición de Triptófano al medio de crecimiento. Patten y Glick (2002)

reportaron la producción de AIA por la bacteria Pseudomonas putida en

medio enriquecido con triptófano. Ahdmad et al. (2005), reportaron

aislamientos de los géneros Klebsiella sp., Azospirillum sp.,

91

Pseudomonas sp. y Azotobacter sp, productores de AIA en medios

sintéticos con adición o no de triptófano. La mayoría de estos generos

bacterianos presentan características macro y microscópicas en común,

como coloración Gram negativa, colonias mucoides y crecimiento y

desarrollo sobre medios selectivos como King B y diferenciales como agar

SMRS, por lo que dichas características fueron base de selección de los

asilamientos endófitos de C. alliodora CaIChRI41R1 y de T. rosea

TrMnPR41248, pese a no presentar la mayor producción de ácido indol

acético en medio sintético sin adición de L-triptófano. Como parámetro

adicional para la selección de los dos aislamientos se tuvo en cuenta la

facilidad de su reactivación, crecimiento y mantenimiento en condiciones

de laboratorio y la homogeneidad de su crecimiento en medio líquido,

puesto que son elementos claves al momento de considerar su

escalamiento a nivel industrial.

Ahmad y colaboradores (2005), describieron la capacidad de diversos

géneros bacterianos para producir AIA en medios carentes de triptófano

exógeno, encontrando aislamientos de Azotobacter sp. con la capacidad

de producir de 2.68 µg/ml a 10.80 µg /ml de AIA sin adición de triptofano

al medio tras quince días de incubación. Además, encontró aislamientos

de Pseudomonas sp. capaces de producir AIA dentro del rango de 5.34

a 22.4 µg /ml bajo las mismas condiciones descritas para Azotobacter sp.

Los dos aislamientos evaluados en este trabajo presentan valores de

biosíntesis de AIA similares a los descritos por Ahmad (2005) para

Azotobacter sp. y Pseudomonas sp., sin adición de L-triptófano, lo que

favorece su implementación en procesos a escala industrial, debido a que

el triptófano es una materia prima costosa que restringe la formulación de

un inoculante dirigido al sector productivo forestal.

Tanto CaChRI41R1 como TrMnPR41248 corresponden según la

caracterización realizada en el Kit Microscan a Pseudomonas

92

fluorescens/putida (99.99%). Según la clasificación del manual de Bergey

(2000) se han descrito cinco biovar de Pseudomonas fluorescens y dos

biovar de P. putida con dos subtipos de la especie. CaIChRI41R1 según

Microscan® no fermenta la glucosa, teniendo que Bergey cataloga tanto a

P. fluorescens y P. putida como degradadoras del azúcar. Por otro lado la

utilización de L-arginina como fuente de nitrógeno y la nitrificación de

fuentes amoniacales a nitritos y nitratos concuerdan con las

características bioquímicas descritas para el género en el manual de

Bergey.

En 2002, Sánchez y colaboradores reportaron para la identificación de

bacilos gram negativos no fermentadores provenientes de muestras

clínicas mediante el sistema Microscan® una alta frecuencia de bacterias

del genero Pseudomonas sp., en especial de la especie P. aeroginosa,

presentando como datos relevantes una resistencia del 37% a la

gentamicina, 28.3% a Ciprofloxacina, 15.8% a imipenem, 24.1% a

cefepime y 32.5% a amikacina. Dichos resultados concuerdan con los de

este trabajo para el aislamiento CaIChRI41R1 y TrMnPR41248.

Muthukumarasam y colaboradores (2002), describen aislamientos

endófitos capaces de fijar nitrógeno, lo que concuerda con la actividad

nitrogenasa detectada para CaIChRI41R1 y TrMnPR41248 mediante

ARA. Trabajos previos realizados en el Laboratorio de Asociaciones

suelo-planta microorganismos de la Pontificia Universidad Javeriana, por

Cruz y Neira (2004), describen una actividad nitrogenasa de

Azospirillum brasilense ATCC 29710 en caldo nutritivo con y sin

triptófano a las 18 horas de crecimiento de 72.91 nmoles etileno/h*frasco

y un promedio de 4061.01 nmoles etileno/h*frasco en células de

A. brasilence inmovilizadas en alginato, adicionalmente Christiansen-

Weninger & Van-Veen (1991), citados por James et al., 2001), reportan

una actividad nitrogenasa de 40 nmoles etileno/h/2kg suelo fresco de

A. brasilense asociado a la rizosfera de trigo, los mismos citan a Han &

93

New (1998), quienes a partir de aislamientos de suelo de trigo

encontraron actividad nitrogenasa para cepas de A.brasilense de

39.2nmoles etileno/mg proteina/h en medio NFb y cepas asociadas con

raíces de la misma especie una actividad de 2.0 nmoles etileno/ raíz seca/

día. La cepa CaIChRI41R1 fue aislada en el laboratorio en 2004 a través

del protocolo de Dobereiner, por lo que su baja actividad fijadora de

nitrógeno con respecto a otros microorganismos se deba posiblemente a

sus continuos pases por medios sintéticos, por lo que el mantenimiento de

su actividad biológica y la potencialización de su capacidad de fijar

nitrógeno implicaria su pase por un hospedero vegetal.

De forma adicional a la síntesis de AIA y a la capacidad de fijar nitrógeno,

se estableció que CaIChRI41R1 y TrMnPR41248 crecen en agar pectina,

presentan halos de solubilización en agar SMRS y producen pigmentos

difusibles en el medio agar King B. William et al. (2001), describieron

como la actividad pectinasa sobre tejidos vegetales es característica

básica de microorganismos fitopatógenos, debido a que la pectina es la

primera línea de defensa de las células vegetales y esta sujeta a cambios

estructurales con el fin de evitar la entrada de dichos microorganismos.

Estos cambios suceden como respuesta a una señal elicitora mediada por

la degradación de las pectinas a causa de la bacteria inféctante. Pese a lo

anterior los dos microorganismos evaluados en este trabajo fuerón

inocuos sobre una especie vegetal sustituta y sensible a fitopatógenos

bacterianos, por lo que su actividad pectinasa se puede relacionar con

propiedades biológicas de las PGPB’s como las respuestas sistémicas

inducidas y adquiridas. Lo anterior ha sido reportado por Van loon et al.

(1998, citado por Bloemberg et al., 2001), quienes encontrarón varias

rizobacterias no patógenas del género Pseudomonas sp, con la habilidad

de inducir un estado de resistencia sistémica en las plantas, lo que provee

protección contra un amplio espectro de organismos fitopatógenos dentro

de los que se incluyen hongos, bacterias y virus.

94

Por otro lado Huang (1986) y Quadt-Hallman et al. (1997), citados por

Sturz y colaboradores (2000), describen mecanismos activos de entrada

de endófitos bacterianos a células vegetales mediante la hidrólisis de las

paredes celulares por acción enzimática, dentro de la cual la actividad

pectinasa es una de las más importantes (William, 2001). Hurek et al.

(1994), señalan la presencia de enzimas celulolitícas y pectinoliticas

producidas por numerosas bacterias endófitas dentro de las cuales esta

Pseudomonas fluorescens. La degradación enzimática de las paredes

celulares por los géneros bacterianos descritos anteriormente fue

observada únicamente cuando la epidermis de las raíces fue colonizada

pero nunca tras la colonización de los espacios intracelulares del cortes

de la raíz, lo que sugiere que la producción de este tipo de enzimas esta

regulada de forma especifica para la penetración de un hospedero vegetal

(Sturz et al. 2000). El reaislamiento de bacterias endófitas a partir de

raíces de plantas jóvenes de C. alliodora y T. rosea utilizadas en el

presente trabajo con características morfológicas macro y microscópicas

similares a las de los dos aislamientos inoculados y evaluados, sugiere su

posible entrada y establecimiento en la plantas 120 días tras la

inoculación, lo que puede ser debido en parte a la actividad pectinasa de

los dos aislamientos.

Además, esta actividad pudo tener un efecto positivo sobre variables de

crecimiento vegetal como los pesos frescos y longitud del sistema radical

de las plantas evaluadas, puesto que la hidrólisis de las paredes celulares

de las raíces permite la entrada de agua a estas y genera presión sobre

los tejidos, lo que favorece su elongación (Taiz & Zeiger, 2002). Además

de la actividad pectinasa de los dos aislamientos evaluados, su posible

actividad fosfato solubilizadora es otra característica biológica de

importancia como bacterias promotoras de crecimiento vegetal.

95

Mehta y Shekhar (2001) y Pallai (2004), reportaron que la producción de

zonas claras y/o transparentes alrededor de colonias bacterianas

rizosféricos sobre medios de cultivo selectivos como el Pikovskaya, SMRS

y NBRIP indican la presencia de organismos fosfato solubilizadores. Los

anteriores reportes concuerdan con lo observado sobre el medio SMRS

para los dos aislamientos seleccionados, donde se observaron zonas

claras alrededor de las colonias bacterianas transcurridas tres horas de

sembrados los microorganismos en el medio. Así, estos resultados son de

gran importancia, debido a que numerosas bacterias con estas

características han sido utilizadas en la preparación de inóculos de fosfato

solubilizadoras, que promueven el crecimiento y desarrollo de plantas de

interés económico (Subba, 1993; Tilak, 1993 citados por Mehta y

Sheckhar en 2001).

Autores como Raja y colaboradores (2002), reportaron la importancia que

presentan las bacterias fosfato solubilizadoras y su interacción con

hongos de micorriza arbuscular dentro de los sistemas de producción

agrícolas. Esta característica favorecería su utilización conjunta en

paquetes tecnológicos durante la propagación de especies de interés

forestal. También este tipo de interacción biológica puede constituir una

explicación para el buen comportamiento de la coinoculación de

CaIChRI41R1 + G.manihotis y TrMnPR41248 + G. manihotis sobre las

variables de crecimiento evaluadas en C. alliodora y T. rosea, en especial

en esta última para el desarrollo de su sistema radical y acumulación de

biomasa. Además, la posible relación sinérgica observada entre bacterias

y HMA, constituye una herramienta clave en el establecimiento de los

microorganismos en los suelos, puesto que la presencia de la bacteria

influyó en el establecimiento del hongo micorrícico, presentando valores

altos de infección y de número de esporas, lo que posiblemente se pueda

deber a la síntesis de hormonas como AIA por la bacteria. Los

tratamientos de coinoculación de HMA + AIA (producto comercial)

también presentaron valores significativos sobre la infección con hongos

96

de micorriza tanto de C. alliodora como de T. rosea. El anterior

comportamiento ha sido descrito por autores como Barea y colaboradores

(2005), quienes describen relaciones sinérgicas entre HMA y bacterias

fosfato solubilizadoras para la captación de P por la planta y por Garbaye

(1994), quien define la presencia de bacterias ayudadoras de micorriza

(MHB, mycorrhiza-helper-bacteria), las cuales estimulan el crecimiento

micelial del hongo y favorecen la formación de la simbiosis.

Además de la solubilización de fosfatos, las bacterias ayudadoras de la

micorriza, como Pseudomonas fluorescens, pueden presentar producción

de sideróforos. Los aislamientos CaIChRI41R1 y TrMnPr41R248

produjeron pigmentación en medio King B lo que se relaciona con la

producción de sideroforos microbianos del tipo pioverdinas. Marschner y

Romheld (1994) reportaron que las plantas utilizan sideróforos

sintetizados por sus microorganismos rizosféricos, como fuente de hierro

soluble. Cowley et al. 1988; Bar-ness et al. 1991 y Cline et al. 1984;

muestran como plantas de pepino tienen la capacidad de crecer en

presencia de sideróforos microbianos, lo que implico un incremento en su

biomasa y su contenido de clorofila en suelos con baja disponibilidad de

hierro. Lo anterior resulta de importancia, debido a que los suelos

destinados para la siembra de especies forestales en nuestro país

presentan en su mayoría un alto grado de deterioró, siendo muy común

las limitaciones de elementos esenciales para el desarrollo vegetal como

el fósforo, nitrógeno, hierro entre otras.

7.2. Crecimiento de los Aislamientos CaIChRI41R1 y TrMnpr41r248 en Medio de Cultivo Líquido

Para microorganismos promotores de crecimiento vegetal como

Azospirrilum brasilensce, Bashan et al. (2002) reportaron absorbancias de

1.00 nm a la hora 18 con un recuento de 109 UFC/ml. Para el mismo

microorganismos Zambrano (2004) reporto una absorbancia de 0.68 nm y

97

una concentración de 16 X108UFC/ml y Cruz y Neira (2004) reportaron

una absorbancia de 0.524 y una concentración de 11X109UFC/ml.

Adicionalmente para otros microorganismos diazótrofos microaerofílicos

aislados de Curatella americana se alcanzó una absorbancia de 0.990 en

caldo nutritivo a la hora 44 respecto a lo alcanzado en caldo Columbia con

una absorbancia de 0.780nm. El patrón de crecimiento y las

concentraciones máximas alcanzadas por estas PGPB’s concuerdan con

lo presentado por CaIChRI41R1 y TrMnPR41248. Sin embargo, a

diferencia de lo descrito anteriormente en este trabajo los tiempos de

generación de los dos microorganismos son cortos y su crecimiento es

estable sin diauxias aparentes en medio líquido, lo que resulta de

importancia al momento de pensar en el manejo de las condiciones de

propagación, mantenimiento y producción a escala industrial.

7.3. Viabilidad de CaIChRI41R1 y TrMnPR41R248 Inmovilizados en Turba

Los principales inoculantes en turba son de células rizobiaceas, inóculos

en los que se ha alcanzado concentraciones máximas de 108 UFC/g, por

lo que los recuentos obtenidos en nuestro trabajo de 10x107 UFC/g del

aislamiento CaIChRI41R1 y de 70x106UFC/g de TRMnPR41R248 tras 72

horas de incubación y con una viabilidad celular superior a los 4 meses,

sugieren el uso potencial de este portador para la formulación de

inoculantes basados también en bacterias endófitas.

En trabajos previos en la Unidad de Biotecnología Vegetal, se logró la

inmovilización de A. brasilense en microperlas de alginato de calcio

alcanzando concentraciones de 22x108UFC/g con caldo nutritivo sin

adición de triptófano con una viabilidad hasta de 90 días de

almacenamiento a 4°C, manteniendo recuentos entre 107 y 106 UFC/g

(Cruz y Neira, 2004). Al comparar estos resultados con los de este

trabajo, resulta importante destacar el logro de extender la viabilidad de

98

las células microbianas a 120 días, manteniéndose dentro de rangos de

concentración celular igualmente óptimos para la inoculación en plantas

(>106UFC) (INTA, 2004). Además, el uso de turba muestra otras ventajas

como su uso exitoso a nivel de campo, su menor costo, su fácil

producción a nivel industrial y más fácil manejo por parte de los

agricultores. Pese a lo cual la falta de homogeneidad del inoculo y de

estabilidad dentro del suelo, son sus mas grandes limitantes frente a otras

formas de inmovilización reportadas, lo que hace necesario el evaluar

varios portadores para la formulación de endófitos para uso forestal.

7.4. Inocuidad de CaIChRI41R1 y TrMnPR41R248 sobre Medicago sativa L. Alfalfa

La alfalfa es una especie sensible a numerosas enfermedades de origen

bacteriano. Lehmann y Neumann (1986), identificaron como agentes

causantes de enfermedad, entre otros, a Corynebacterium sp. y

Pseudomonas sp. Suazo (2005), menciona una relación directa entre el

ataque de nematodos y la marchites bacteriana en alfalfa causada por

Corynebacterium insidiosum y Pseudomonas medicaginis, en la que el

proceso infeccioso causa síntomas como la disminución en la tasa de

crecimiento, clorosis y necrosis; además las plantas enfermas producen

un gran número de tallos finos y de escaso vigor, extendiéndose la

infección por todo el tejido vascular. Además, la infección causada por

Pseudomonas medicaginis causa marchites del tallo, presentando

manchas marrones, en forma lineal sobre las que surgen gotas del

exudado bacteriano. Bajo este contexto, la inocuidad de los aislamientos

endófitos inoculados sobre alfalfa en este trabajo, permite establecer de

forma práctica y presuntiva su naturaleza no patógena ni deletérea sobre

el crecimiento y desarrollo vegetal, lo que es la base para su

inmovilización y formulación como posible inoculante microbiano

promotor de crecimiento vegetal para especies forestales en diferentes

tipos de material: semillas, plantas jóvenes obtenidas a partir de semillas

y material para propagación vegetativa.

99

7.5. Viabilidad de Semillas de C. alliodora y T. rosea

En los tres ensayos de imbibición realizados a las semillas de C. alliodora

(pequeña y grande) y de T. rosea, se observó la saturación de agua para

los tres grupos de semillas lo que se debe a un equilibrio entre el

potencial hídrico de la semilla y el potencial hídrico del ambiente

(Bewley & Black, 1985).

Para C. alliodora, tanto las semillas grandes como las pequeñas

presentaron patrones similares en la toma de agua, lo cual se puede

relacionar con los resultados obtenidos para Gmelina arborea por Salazar

(2000), quien reporto que las semillas con diferentes grados de madurez y

distinta procedencia muestran una tendencia similar en la asimilación de

agua.

Por otro lado Rodríguez y Nieto (2002) encontraron a través de la

valoración de un lote semillas de C. alliodora mediante patrones de

tinción, que el porcentaje de semillas viables era del 10.5%, el porcentaje

de semillas parcialmente tenidas del 6.5% y el de semillas no viables del

83% ,adicionalmente establecieron que las semillas de C. alliodora

presentaban una perdida de viabilidad durante su tiempo de

almacenamiento, encontrando en un lote colectado en 1999 un porcentaje

de viabilidad a los 30 días de colecta del 34.24% y a los 180 días de

colectadas del 10.25%, y para un lote de semillas recolectadas en el 2001

un porcentaje de viabilidad a los 30 días de colecta de 20.7% y a los 180

días del 15.3%; sugiriendo que dichas diferencias se deben a la población

de semillas y a su grado de madurez en relación con la época de

recolección y al efecto de las condiciones ambientales de su

almacenamiento. Dichos valores fueron obtenidos mediante imbibición y

un tiempo de tinción de 24 horas, por lo que los resultados obtenidos para

las semillas pequeñas (37%) como para las grandes (23%) de C. alliodora

imbibidas durante 24 horas y tenidas durante 48 horas coinciden con lo

100

reportado por estos autores, teniendo como posible causa de la baja

viabilidad su tiempo de almacenamiento.

En el caso de T. rosea, Rodríguez y Nieto (2002), encontraron que el

porcentaje de semillas viables era del orden 77.5%, el porcentaje de

semillas dudosas del 6% y el de semillas no viables del 16.5%. De igual

modo reportaron porcentajes de viabilidad para lotes de semilla de

T. rosea colectados entre 1999 y 2000 entre el 45.5% al 83.15% tras 30

días de almacenamiento lo que sugiere que la viabilidad de las semillas

está regulada por los mismos factores descritos para las semillas de

C. alliodora. Al igual que en el caso de C. alliodora, estos autores

imbibieron las semillas en agua durante 24 horas antes de teñirlas con el

fin de activar el proceso respiratorio, lo que se ajusta a los resultados

obtenidos en este trabajo para T. rosea, a 24 y 48 horas de tinción con un

porcentaje de viabilidad del 83% en semillas previamente imbibidas

durante 24 horas.

Rodríguez y Nieto (2002), plantean que el encontrar diferencias entre los

patrones de tinción de las semillas tanto de C. alliodora como de T. rosea

sugiere la necesidad de evaluar otras poblaciones de semillas para

precisar el protocolo de tinción de cada especie, lo que también se

advierte en este trabajo con los bajos porcentajes de germinación

respecto a los porcentajes de viabilidad establecidos para los distintos

grupos de semillas y para semillas de distintos lotes, en los que se

apreciaron diferencias en los porcentajes de viabilidad. Lo anterior se

puede deber a un estado de dormancia de las semillas de las dos

especies, el cual se caracteriza por la falta temporal en la capacidad de

germinación de una semilla viable bajo condiciones ambientales

favorables de humedad, luz y oxigeno, y es regulado por factores

estructurales o fisiológicos de las mismas semillas, como su grado de

lignificación, dureza, presencia y síntesis de sustancias químicas como el

acido absícico (ABA), etc (Li & Fonley, 1991).

101

7.6. Germinación de Semillas de Cordia alliodora y Tabebuia rosea

Inoculadas

Pese a que no se presentaron diferencias estadísticamente significativas

para los valores de germinación (VG) entre los tratamientos para ninguno

de los tres ensayos, se observó una tendencia positiva sobre la

germinación y emergencia de las semillas pequeñas de C. alliodora

inoculadas con caldo. Dicho efecto puede deberse a la producción de

enzimas y fitohormonas por el aislamiento CaIChRI41R1, lo que

favorecería la germinación de las semillas. Vale resaltar que dentro de los

microorganismos capaces de promover el crecimiento vegetal se

encuentran bacterias que inducen de forma directa el proceso de

emergencia en las semillas (Rizobacterias promotoras de emergencia,

EPR), dentro de las cuales son comunes microorganismos productores

de auxinas como Pseudomonas fluorescens y P. putida (Kloepper, 1986).

Defreitas y Germida (1989) y Turne y Backman (1989), describieron como

los aislamientos de EPR afectan la emergencia de las semillas en suelos

con baja fertilidad, teniendo incluso que algunos ellos incrementan

significativamente la emergencia en suelos con alta fertilidad. Además, la

colonización de la raíz por PGPR se basa en la sobrevivencia tras su

inoculación sobre la semilla o suelo, aumentado su población como

respuesta a los exudados ricos en carbohidratos y aminoácidos presentes

en la espermosfera. Esto se ve reflejado en los resultados de

reaislamiento de CaIChRI41R1 y TrMnPR41248 de semillas y raíces

recién inoculadas y de suelo y raíces luego de 120 dds, lo que evidencia

el potencial de estos endófitos de colonizar y establecerse en tejidos

vegetales.

Por otro lado, para los ensayos con las semillas grandes de C. alliodora y

las semillas de T. rosea, la tendencia más baja para el porcentaje de

germinación la mostró, la inoculación de los aislamientos seleccionados

102

tanto inmovilizados en turba como en caldo nutritivo, mientras que los

porcentajes mas altos los mostraron los tratamientos control

(Carboximetilcelulosa 0.4%). Este comportamiento podría deberse a la

presencia de endófitos capaces de competir con los aislamientos

inoculados por su nicho ecológico. Este comportamiento fue observado

por Jiménez et al. (2001) en semillas y plantas de arroz, en los cuales la

aplicación de Azospirillum brasilense no tuvo ningún efecto sobre la

germinación, desarrollo y crecimiento de dicha especie vegetal. En este

estudio los tratamientos no inoculados si presentaron diferencias

significativas respecto al control.

La explicación dada por estos autores es la presencia de bacterias

endófitas tanto en las semillas y raíces de arroz, que compitieron con las

inoculadas y podrían presentar efectos benéficos sobre el desarrollo

vegetal. Por otro lado, Cruz y Neira (2004), describieron resultados

similares tras la inoculación de semillas de G. arborea con A. brasilense

inmovilizado en microperlas de alginato de calcio, atribuyendo dicho

efecto a un deficiente proceso de desinfección de las semillas antes de su

inoculación, lo que permitiría la sobrévivencia de microorganismos propios

de las semillas. Dichos microorganismos tras la aplicación a las semillas

de un tratamiento como caldo nutritivo o carboximetilcelulosa estériles

serian favorecidos en sus procesos de crecimiento y colonización de la

espermosfera, llegando incluso a promover los procesos de germinación y

emergencia de las semillas.

Con respecto a esto, Buyer y colaboradores (1999), describieron las

presencia de microorganismos en semillas y la espermosfera de pepino,

rábano, maíz, soya y girasol, microorganismos con la capacidad de

colonizar dichos ambientes por la presencia de exudados

químioatractantes. Vargas (2006), reporta la presencia de endófitos

bacterianos en tejidos de plantas jóvenes obtenidas a partir de semillas de

C. alliodora y T. rosea sembradas axénicamente y atribuye esto a la

103

posible transmisión vertical de estos microorganismos. Así, estos

endófitos que no son eliminados cuando se desinfecta la semilla estarían

en capacidad de promover la germinación gracias a la síntesis de auxinas

y giberelinas y de ejercer un efecto antagónico sobre los microorganismos

aislados y reinoculados.

De forma complementaria Vargas et al. (2001), encontraron que la

inoculación de 30 aislamientos de suelo caracterizados como PGPB’s a

semillas de lechuga promovía de forma significativa la germinación en un

76.6%, no tenían un efecto evidente en un 10% y en un 13.3% redujeron

la germinación. Dentro de los aislamientos que tuvieron un efecto positivo

sobre la germinación se encontrarón Hafnia alvei, A. brasilense,

Beijerinckia indica y Klebsiella pneumoniae, mientras que tres

aislamientos pertenecientes al género Azospirillum presentarón efectos

negativos sobre la germinación. Cabe anotar, que la formulación en caldo

microbiano de los aislamientos utilizados en el presente trabajo presento

un mayor efecto sobre la germinación de semilla de C. alliodora y T. rosea

que la formulación del inoculante en turba, lo que contrasta claramente

con lo resultados obtenidos en las planta jóvenes de las dos especies,

donde la inoculación de los microorganismos en portador sólido mostró

resultados positivos, indicando la necesidad de evaluar diferentes

mecanismos de formulación de un inoculo microbiano para cada una de

las fases de crecimiento vegetal de especies forestales, con el fin de

garantizar resultados exitosos.

7.7. Crecimiento y desarrollo vegetal de plantas jóvenes de C. alliodora inoculadas con el aislamiento endófito CaChRI41R1

La coinoculación del aislamiento CaChRI41R1 y Glomus manihotis

presento efectos positivos sobre la altura de plantas jóvenes de

C. alliodora en etapa de vivero, efecto que puede ser atribuido a la

síntesis de AIA, a la fijación de nitrógeno, a la producción de sideróforos

104

y a la solubilización de fósforo por parte de la bacteria y a la relación

sinérgica de la bacteria con el HMA, la cual puede permitir un mejor

establecimiento y colonización del hongo sobre su hospedero y mayor

beneficio de la relación simbiótica sobre el crecimiento de la planta. Lo

anterior se ve reforzado con los resultados obtenidos para las variables de

micorrización de esta especie, donde las plantas jóvenes inoculadas con

la bacteria y HMA presentaron mejores porcentajes de micorrización y de

número de esporas en el suelo respecto a la inoculación individual del

hongo.

Respecto a lo anterior, García y colaboradores (2000), encontraron que la

inoculación de Bacillus licheniformis, B. pumilis y Aureobacterium sp.,

produjeron un efecto positivo sobre el desarrollo de la parte aérea de

plantas de tomate y pepino, debido a la biosíntesis bacteriana de

auxinas, giberelinas y de sideróforos, y a su posible translocación a través

de la planta mediante su sistema vascular. Radwan et al. (2001),

sugieren que además de la síntesis de AIA, el mejor desarrollo de la parte

aérea de las plantas se puede deber a la fijación de nitrógeno y a la

síntesis de otras fitohormonas como giberelinas y citoquininas por parte

de los microorganismos. Muchas de estas características fisiológicas son

presentadas por CaChRI41R1, por lo que su acción conjunta posibilitaría

el buen desarrollo de las plantas.

Continuando, gracias a la naturaleza endófita de CaChRI41R1 y a su

capacidad de fijar nitrógeno, es de esperar que el aporte de dicho

elemento a la planta es mas facil y directo, puesto que no esta expuesto a

condiciones adversas del medio rizosferico y del suelo, en las cuales es

posible la lixiviación de nitrógeno reducido o su inmovilización por la

microfauna competente presente en dicho ambiente. Lo anterior

constituye una clara ventaja de los diazótrofos endófitos frente a los

diazótrofos de vida libre, y puede llegar a constituir un aporte significativo

de nitrógeno atmosférico a la planta.

105

Read (1997) sugiere que la inoculación de HMA promociona de forma

significativa las variables de crecimiento vegetal, entre ellas la altura,

efecto relacionado con la edad de la planta y la especie inoculada, pues

se ha demostrado un alto grado de especificidad para la simbiosis entre

algunas plantas y hongos, en especial en estadios tempranos de

desarrollo. Esto se relaciona con los porcentajes de micorrización en las

plantas jóvenes de C. alliodora, los cuales fueron mayores bajo la

coinoculación del HMA con el aislamiento CaIChRI41R1 y la hormona

acido naftalenacético, lo que sugiere que posiblemente la presencia de

compuestos auxinicos favorece el proceso de micorrización de las

plantas, además de que C. alliodora es una especie micótrofa con

G. manihotis (Caballero & Cortes., 1991). Esto se puede fundamentar en

lo descrito por Glick (1995), quien encontró que la coinoculación de

Azospirillum sp. con hormonas de naturaleza auxinica promovían la

proliferación de raíces laterales y de pelos radicales, tejidos altamente

susceptibles a la infección por HMA. Dicho proceso sinérgico, fue descrito

también por Reyes y colaboradores (1999) quienes encontraron que la

inoculación de PGPB’s de forma única no promovió el desarrollo de

plantas jóvenes de aguacate, pero al combinarlas con HMA y

vermicompost se presento aumento significativo sobre el crecimiento de

dicha planta.

La inoculación de Glomus manihotis, favoreció de forma significativa tanto

el peso fresco como el peso seco del sistema radical de plantas jóvenes

de C. alliodora, lo que indica un efecto positivo del hongo sobre la

acumulación de biomasa y toma de agua de dicha planta. Al comparar

estos resultados con los obtenidos en los demás tratamientos, se aprecia

que la simbiosis entre G. manihotis y C. alliodora es altamente

beneficiosa para el desarrollo del sistema radical de dicha especie

vegetal, parámetro de importancia en el establecimiento a condiciones de

campo de plantas de interés forestal propagadas en vivero.

106

Cuervo (1997), encontró que la inoculación de Entrophospora colombiana

aumentaba en un 227% el peso seco de la raíz de plantas de C. alliodora

con respecto al testigo. Caballero & Cortes (1991) establecieron que la

biomasa radical de plantas de C. alliodora con 9.5 meses de edad

presentaba incrementos significativos con la inoculación de

A. appendiculata y G. manihotis con respecto a las plantas que no habían

sido inoculadas. Alarcón y Ferrera-Cerrato (1997) demostraron que la

asociación simbiótica de los hongos micorrizicos produce diversos

cambios a nivel fisiológico, como el incremento en la actividad

fotosintética debido a la mayor fijación de CO2 y por consiguiente el

incremento de las tasas de crecimiento y biomasa producidas por las

plantas micorrizadas en comparación con plantas control. Por ultimo,

Hooker y Atkison, 1992, citados por Reyes et al (2001), describen como

los HMA provocan modificaciones del sistema radical durante el proceso

de infección, especialmente con una mejor captación de agua y

adquisición de nutrientes, lo que influye en parámetros como los pesos

frescos y secos de los sistemas radicales de las plantas.

7.8. Crecimiento y desarrollo vegetal de plantas jóvenes de T. rosea

inoculadas con TrMnPR41248

En términos generales, la medición de las variables de crecimiento

vegetal en T. rosea permite observar una claro efecto positivo de la

inoculación de TrMnPR41248 y la coinoculación de este mismo con

G. manihotis. Así, la inoculación de TrMnPR41248 tuvo en efecto

significativo sobre el desarrollo de plantas jóvenes de T. rosea, en

especial sobre las variables H, PSA y LR, lo que se puede deber a las

características biológicas promotoras de crecimiento vegetal, descritas en

el presente trabajo: síntesis de AIA, fijación de nitrógeno, producción de

sideróforos, solubilización de fósforo y degradación de pectina. Patten &

Glick (2001), describieron como una de las principales características de

las PGPB’s es promover el rápido establecimiento de las raíces al suelo,

107

por lo que el aporte de AIA exógeno por parte de los microorganismos a la

planta le permite una mayor elongación de las raíces primarias y una

mayor proliferación de raíces laterales y adventicias, lo que influye de

modo directo en variables como la longitud de las raíces y el peso del

sistema radical. Pese a lo anterior, la aplicación de AIA en presentación

comercial no presento un efecto positivo similar a la aplicación de

TrMnPR41248, por lo que el efecto de la bacteria no solamente se puede

atribuir a la síntesis AIA, sino también a su habilidad biológica para

solubilizar nutrientes como el fósforo, nitrógeno y el hierro, elementos

esenciales para el crecimiento vegetal.

Tanto para la altura como para el peso seco de las plantas jóvenes de

T. rosea, se advierte que la mayor acumulación de biomasa se debe a

características propias del microorganismo como su capacidad biológica

de fijar nitrógeno atmosférico y solubilizar fitohormonas. Will y Sylvia

(1990), encontraron que la inoculación de Uniola paniculada con

Klebsiella pneumoniae no contribuyo con nitrógeno a la planta, aportando

sin embargo al mayor crecimiento de raíces y tamaño de la espiga (43 y

23%) respecto al control, lo cual atribuyeron a la síntesis de AIA.

Respecto a lo anterior, García y colaboradores (2000), tras la inoculación

de plantas jóvenes de tomate y pepino con las bacterias

Bacillus licheniformis, B. pumilis y Aureobacterium sp., encontraron un

efecto marcadamente positivo sobre el desarrollo de la parte aérea de las

plantas, debido posiblemente a la biosíntesis bacteriana de auxinas,

giberelinas y de sideróforos, y a su posible translocacion a través de la

planta mediante su sistema vascular. Radwan et al. (2001), sugieren que

las células del sistema radical son mas sensibles a las auxinas que la

células de la parte aérea, por lo que la promoción del crecimiento de la

parte aérea se puede deber mas a la síntesis de otras fitohormonas como

giberelinas y citoquininas por parte de los microorganismos.

Características fisiológicas como la producción de AIA y sideróforos son

presentadas por TrMnPR41248, razón por la cual su efecto positivo sobre

108

el desarrollo de la parte aérea de las plantas pueda deberse a su acción

conjunta.

Además de la producción de fitohormonas, la capacidad de

TrMnPR41248 para solubilizar fósforo puede influir en el desarrollo tanto

de la parte aérea como radical de la planta. Vessey y colaboradores

(2004), describieron como bacterias PGPB’s con actividad fosfato

solubilizadora tenían la capacidad de suplir fósforo a las plantas cuando

este es limitante en el suelo.

Sin embargo, en muchas ocasiones el fósforo solubilizado por PGPB’s

puede ser inmovilizado nuevamente en el suelo antes de entrar en

contacto con las raíces, por lo que la presencia de micelio micorrizal

puede ayudar a minimizar dicha perdida. El anterior efecto corresponde a

una relación sinérgica entre PGPB’s y HMA sobre el crecimiento y

desarrollo vegetal, lo que constituye una explicación del desarrollo

positivo de las variables vegetales de las plantas jóvenes de T. rosea

inoculadas con TrMnPR41248 y G. manihotis.

La coinoculación de TrMnPR41248 con el hongo G. manihotis influyo de

forma significativa sobre las variables NH, PFA y PFR. Azcon (2000),

señala como diversas investigaciones han podido establecer un efecto

benéfico de la doble inoculación hongo micorrizíco arbuscular-bacterias

promotoras de crecimiento vegetal, las cuales se han enfocado mas sobre

poblaciones bacterianas fijadoras de nitrógeno y sus posibles relaciones

de competencia con HMA en leguminosas, encontrando que no existe

competencia entre el hongo y la bacteria por los puntos de colonización, y

que por el contrario, la presencia simultánea de los dos microorganismos

da como resultado un mayor crecimiento del hospedero.

Así, una de las relaciones de mayor importancia es la de las bacterias

solubilizadoras de fósforo y productoras de reguladores del crecimiento

109

vegetal, ya que cuando dichos microorganismos son inoculados en

conjunto con HMA la captación de fósforo aumenta y se promueve

considerablemente el crecimiento de la planta, en especial en parámetros

como el número de hojas y área foliar. La actividad solubilizadora de

fósforo fue apreciable en el medio SMRS, lo que posibilitaría una relación

sinérgica entre los dos microorganismos. Respecto a lo anterior, Barea

(1975), describió un efecto sinérgico sobre plantas de maíz inoculadas

con HMA y bacterias fosfato solubilizadoras de los géneros Pseudomonas

sp., y Agrobacterium sp. Del mismo modo Young (1990), encontró un

efecto sinérgico de la coinoculación de bacterias fosfato solubilizadoras y

hongos de micorriza sobre el crecimiento de Leucaena sp.

La efectividad de la coinoculación de HMA y bacterias fosfato

solubilizadoras se debe a que el micelio micorrizal puede explorar

grandes superficies de área en las que se puede presentar la

solubilización de fosfatos, lo que conlleva a que las bacterias puedan

incrementar el flujo de fósforo a la planta y los HMA puedan mejorar la

toma de dicho elemento para ésta (Calvet et al. 2002).

Además, la actividad positiva sobre el crecimiento y desarrollo vegetal ha

sido observada de forma prevalente con la aplicación de

microorganismos fosfato solubilizadores en suelos deficientes de fósforo,

pese a lo cual autores como Young (1990), han demostrado que el efecto

benéfico de dichos microorganismos también se puede presentar en

suelos con altos contenidos de fósforo disponible, dependiendo de la

naturaleza del inoculo de HMA. Lo anterior se puede relacionar con el

aislamiento de colonias bacterianas tanto endorizosfericas como de suelo

rizosferico de plantas de T. rosea 120 DDS de morfología macroscópica

similar a TrMnPR41248, sugiriendo su posible presencia como endófito y

microorganismos rizosferico lo que permitiría una mayor solubilización de

fósforo. Como el caso de TrMnPR41248, muchas de las bacterias fosfato

solubilizadoras producen AIA, además de sintetizar otras fitohormonas

110

como giberelinas y citoquininas. Azcón et al., (1978), sugieren que la

acción sinérgica entre bacterias fosfato solubilizadoras y HMA puede ser

mediada por la producción de reguladores de crecimiento vegetal, debido

a que éstos pueden afectar la permeabilidad de las células radicales, lo

que las hace más susceptibles a la infección microbiana. Además,

Linderman (1992), sugiere que la acción sinérgica de bacterias fosfato

solubilizadoras con HMA sobre el crecimiento vegetal puede ser una

consecuencia del incremento en la producción de hormonas vegetales y

vitaminas en el suelo.

Los porcentajes de micorrización de las plantas jóvenes de T. rosea,

también indican una posible relación sinérgica, debido a que la aplicación

de la bacteria y el hongo incrementó el porcentaje de infección con

respecto a la sola aplicación de HMA. Esto, al igual que en el caso de

C. alliodora se puede deber a la acción de la bacteria sobre la arquitectura

radical, aumentando la longitud y número de raíces secundarias de las

plantas, estructuras altamente sensibles a la infección con HMA. Lo

anterior concuerda con lo observado por Glick (1995), quien encontró que

la coinoculación de Azospirillum sp. con hormonas auxinicas promovía la

proliferación de raíces laterales y de pelos radicales en plantas de tomate.

Gryndler (2000), describió como las poblaciones microbianas pueden

intervenir con el establecimiento benéfico de la simbiosis, presentándose

incluso microorganismos capaces de estimular el crecimiento micelial y el

incremento de la formación simbiótica (Garbaye, 1994). Lo anterior se

puede deber a la capacidad de algunos microorganismos para

incrementar las tasas de exudación radicales, lo que activa la germinación

de las esporas de HMA. Gryndler y Vosatka (1996) encontrarón que

Pseudomonas putida estimula la colonización de las raíces de maíz por

Glomus fistulosum, y que la coinoculación tenía un efecto sinérgico sobre

el crecimiento de la planta. Del mismo modo, Will y Silvia (1990)

encontraron que la colonización de Uniola paniculata (L.) por HMA se veía

111

incrementada por la inoculación de Klebsiella pneumoniae y Alcaligenes

denitrificans y el crecimiento micelial de Glomus deserticota se veia

favorecido por la presencia de K. pneumoniae, pese a que no tuvo un

efecto marcado sobre la germinación de las esporas del hongo en

condiciones in vitro.

Así, TrMnPR41248, se puede considerar como una posible bacteria

ayudadora de micorrización para T. rosea, lo que implica un mejor

desarrollo de la relación simbiótica con la presencia de la bacteria en

dicha planta. Además, los resultados obtenidos permiten establecer que

T. rosea es una especie vegetal altamente susceptible a la infección con

HMA, lo que podría mejorar potencialmente sus condiciones de

adaptación y supervivencia en campo.

Por último, el reaislamiento de colonias microbianas con características

morfológicas similares a TrMnPR41248 de plantas de T. rosea inoculadas

con dicho microorganismo, indica un posible establecimiento de

TrMnPR41248 como endófito de esta especie y en el suelo asociado a

esta, lo que resulta de importancia debido a que implicaría la presencia de

la bacteria a lo largo del desarrollo de la especie en vivero y su posible

efecto benéfico sobre el crecimiento de T. rosea. Dicho reaislamiento,

implicaría la entrada de las células bacterianas a la planta en calidad de

endófitas, lo que se puede deber a la posible actividad pectinolítica de

TrMnPR41248.

Así, el establecimiento de características biológicas en bacterias endófitas

propias de microorganismos promotores de crecimiento vegetal, posibilita

su evaluación y aplicación a nivel industrial y de campo en programas de

propagación de especies forestales de interés económico, lo que

constituiría la base de un paquete tecnológico encaminado a la obtención

de material vegetal con características uniformes en vivero y de mayor

éxito potencial en el establecimiento y desarrollo a nivel de campo.

112

8. CONCLUSIONES CaIChRI41R1 y TrMnPR41248 presentan potencial biológico para su

aplicación en la propagación masiva de material vegetal de Tabebuia

rosea y de Cordia alliodora y en su transplante a suelos con baja

disponibilidad de nutrientes como N, P y Fe, debido a su capacidad de

producir AIA, de sintetizar sideróforos difusibles en el medio, de degradar

pectina y solubilizar fósforo, además de la capacidad de CaIChRI41R1

para fijar nitrógeno.

CaIChRI41R1 y TrMnPR41248 presentan tiempos de generación cortos,

produciendo AIA en el momento de la máxima producción de biomasa, lo

que los hace microorganismos promisorios con características de interés

para la industria de bioinoculantes basados en microorganismos

promotores de crecimiento vegetal y bioprotectantes.

Tanto la inocuidad de CaIChRI41R1 y TrMnPR41248 sobre plantas

jóvenes de Alfalfa (Medicago sativa), como su viabilidad superior a los

120 días en turba en concentraciones adecuadas para su inoculación

sobre tejidos vegetales, confiere a los dos aislamientos potencial como

inoculantes bacterianos para la promoción de crecimiento de C. alliodora

y T. rosea.

La inoculación de CaIChRI41R1 y TrMnPR41248 sobre semillas de C.

alliodora y T. rosea respectivamente, no tuvo en efecto significativo sobre

los índices de germinación determinados en el proyecto, sin embargo se

observa un aumento en el total de semillas germinadas de C. alliodora

cuando se inocularon con la bacteria. Además, se evidencia un posible

efecto positivo de microorganismos endófitos de las semillas, estimulados

por la adición de caldo nutritivo, capaces de competir con CaIChRI41R1 y

TrMnPR41248 por su nicho ecológico y de promover el proceso de

germinación y emergencia.

113

La coinoculación de G. manihotis con CaIChRI41R1 y TrMnPR41248

presentó un efecto sinérgico sobre la micorrización, crecimiento y

desarrollo de plantas jóvenes de C. alliodora y T. rosea

respectivamente.

La aplicación de los endófitos bacterianos con G. manihotis en plantas

jóvenes de C. alliodora y T. rosea produjo aumento en la biomasa aérea y

radical de las dos especies, lo que puede permitir un mejor

establecimiento de este material en condiciones de campo. Estos

resultados constituyen la base para la generación de un paquete

tecnológico basado en microorganismos benéficos encaminado a su

aplicación conjunta en especies forestales en distintas etapas de

desarrollo.

El uso de bacterias endófitas promotoras de crecimiento vegetal es una

herramienta biotecnológica viable para mejorar el crecimiento y desarrollo

de especies forestales en etapa de vivero, sola o coinoculadas con

hongos glomales.

114

9. RECOMENDACIONES

Dado que CaIChRI41R1 y TrMnPR41248 pueden solubilizar nutrientes

como P y Fe, y CaIChRI41R1 puede fijar N, es deseable cuantificar el

aporte de estos nutrientes en plantas inoculadas con estos

microorganismos a nivel de vivero y en etapas tempranas de su

establecimiento en campo.

En etapa de semillero y endurecimiento tanto de C. alliodora y T. rosea

se ha evidenciado y reportado el ataque de microorganismos

fitopatógenos, lo que abre la posibilidad de evaluar el comportamiento de

los aislamientos estudiados como controladores biológicos o

bioprotectantes.

Evaluar el uso de portadores microbianos diferentes a la turba para la

inmovilización de los aislamientos CaIChRI41R1 y TrMnPR41248,

buscando materiales más económicos y de mayor disponibilidad como el

aserrín y otros desechos propios de la explotación y transformación de los

recursos forestales.

Evaluar la coinoculación de CaIChRI41R1 y TrMnPR41248 y distintas

especies de HMA nativas sobre el crecimiento y desarrollo de C. alliodora

y T. rosea, respectivamente, en etapa de vivero, evaluando además la

adaptación en condiciones de campo de las plantas inoculadas.

Evaluar el efecto de CaIChRI41R1 y TrMnPR41248 sobre estacas y

miniestacas de C. alliodora y T. rosea en procesos de propagación clonal

de las dos especies, puesto que las técnicas de propagación vegetativa

resultan de importancia para estas especies debido a la desuniformidad y

falta de comportamiento constante en la germinación de distintos lotes de

semilla tanto de C. alliodora y T. rosea.

115

La evidencia de la presencia de bacterias endófitas con características de

PGPB’s en C. alliodora y T. rosea pone de manifiesto la importancia de

estos microorganismos durante la propagación de diferentes especies

forestales y el potencial biotecnológico en el desarrollo de estrategias

para promover su actividad sobre la planta y su colonización en diferentes

tejidos vegetales, así como su establecimiento como endófito y su

transmisión vertical, por lo que el seguimiento de su colonización

mediante marcadores moleculares permitiría entender de mejor modo el

proceso de establecimiento o no de los microorganismos en las plantas

10. BIBLIOGRAFIA

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producidos por bacterias rizosféricas promotoras del crecimiento vegetal

(2003: Madrid, España) Práctico de Laboratorio para Bioquímica II [En

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IIBCE): 2003 [Madrid, España] http://iqb.fcien.edu.uy/pdf/curso_iibce.pdf.

June - July 2003 / Photography & Text by Kathryn K. de Tanzi (visit

www.hjimenez.org for more info. on the Tropical Dendrology Course)

http://homepage.mac.com/ktanzi/Dendrology/PhotoAlbum46.html

ANEXO 1 Medios de cultivo utilizados en este proyecto

Agar Papa Medio King B D-málico 2.5g Proteasa peptona 20 g Azul bromotimol (0.05% Sulfato magnesio 1.5 g en KOH 0.2N) 2 gotas Fosfato tripotasio-3hidrato 1.8g Solución micronutrientes 1 ml Agar- Agar 10 g Solución vitaminas 1 ml Glicerina 10 ml Agar 15 g Agua destilada 1000ml Papa fresca pelada Cocida durante 30 minutos Y filtrada 200 g Agua destilada 1000ml Agar Nutritivo Agar Pectina Extracto de carne 3 g Pectina cítrica metilada 10 g Peptona 5 g Extracto de levadura 2.5 g Agar-Agar 15 g Peptona Universal 2.5 g Agua destilada 1000ml Sulfato de Amonio 0.5 g Cloruro de Calcio 0.5 g Agar SMRS Fosfato monobásico de potasio 0.1 g Sulfato de amonio 0.5 g Fosfato dibásico Cloruro de potasio 0.2 g de potasio 0.1 g Sulfato de Magnesio Agar-Agar 15 g Água 1000ml monohidratado 0.3 g Sulfato de hierro heptahidratado 0.004 g Médio Picovskaya Cloruro de sódio 0.2g Glucosa 10 g Glucosa 10 g Fosfato de cálcio 5 g Extracto de levadura 0.5 g Cloruro de sódio 0.2 g Púrpura de Bromocresol 0.1 g Sulfato de amonio 0.5 g Fosfato de cálcio 5 g Sulfato de magnésio Agar-Agar 15 g heptahidratado 0.1 g Água 1000 ml Extracto de levadura 0.5 g Sulfato de manganeso 0.1 g Agar-Agar 20 g Agua 1000ml

Medio Nfb D- málico 5 g K2HPO4 5 ml MgSO4 2 ml NaCl 1 ml CaCl2 2H2O 2 ml Azul de Bromotimol (0.5% en O.2 N KOH) 2 ml Solución de Micronutrientes 2 ml FeEDTA (Solución al 1.64%) 4 ml KOH 4.5 g Solucion de vitaminas 1 ml Agar semisólido 1.8 g PH 6.8

ANEXO 2

Reactivo de Salkowsky

Ácido Sulfúrico Concentrado 150 ml Cloruro Ferríco hexahidratado 7.5 ml Agua destilada 250 ml

ANEXO 3

Curva Patrón Ácido Indol Acético

Concentración ppm Absorbancia 0.5 0.003 1 0.007 5 0.038

10 0.086 15 0.13 20 0.18 25 0.21 30 0.256 35 0.305 40 0.337 45 0.356 50 0.387

y = 0,0399x - 0,0315R2 = 0,9924

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Concentracion (ppm)

Abs

orba

ncia

(560

nm)

1. Curva patrón de AIA tomada de CRUZ y NEIRA 2004

ANEXO 4

Identificación de aislamientos de Tabebuia rosea y Cordia alliodora

seleccionados

Características CalChRI41R1 TrMnPR41R248 Medio de

aislamiento NFB KB

Formación película Positiva - Profundidad de superficie mm

5 -

Grosor película (mm)

1 -

Gram Bacilos Gram negativos

Bacilos cortos Gram Negativos

Forma de Colonia Circular Puntiforme Elevación de

Colonia Convexa Convexa

Borde de Colonia Liso Irregular Color de colonia Cremosa transparente Transparente

Tamaño 1 mm 2mm Superficie Lisa brillante Lisa brillante

Consistencia Cremosa Cremosa Oxidasa/catalasa Positiva/ positiva Positiva/positiva

TSI K/NC K/NC*

ANEXO 5

Pruebas bioquímicas evaluadas por Microscan ®

GLU GLUCOSA SUC SACAROSA SOR SORBITOL

RAF RAFINOSA

RHA RHAMNOSA

ARA ARABINOSA

INO INOSITOL ADO ADOLASA MEL MELOBIOSA

URE UREA H2S SULFURO DE H

IND INDOL

LYS LISINA ARG ARGININA ORN ORNITINA

TDA TRIPTOFANO DEAMINASA

ESC HIDRÓLISIS DE LA ESCULINA

VP VOGES PROSKAUER

ONPG GALACTOSIDASA

CIT CITRATO MAL MALONATO

ACE ACETAMIDA

TAR TARTRATO

OF/G OXIDACIÓN FERMENTACIÓN

NIT NITRATOS CET CETRIMIDE P PENICILINA

K KANAMICINA

Cl COLISTINA

Cf CEFALOTINA Fd

NITROFURANTOINA

ToTOBRAMICINA.

Pruebas de sensibilidad a antibióticos por Microscan ®

Trimetropin

T/S Piperaclina/tazobactam

P/T Amikacina AK Gentamicina Gm

Tabnamicina

To

Ceftazidime

AZ Cefuroxime CRM Cefotetan CTN Cefepine CPE Ceftriaxone

CAX Ampicilina Am Ampicilina/sulbactan

A/S

Pipenaciclina

PI Ticlaracitina/clavilanato

T/M Imipenem IMP

Aztronam Azt Cefpodoxime CF Levoflaxacin

LVX Moxiflaxacin MXF Meropenem

MER.

Anexo 6

Curva de Calibración de ARA

Curva de Calibración ARA

y = 2073,1x - 31,482R2 = 0,9964

-1000

0

1000

2000

3000

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3

micromoles de etileno

area

* Curva de Calibración tomada de Vargas, (2006)

ANEXO 7

Caracterización del aislamiento CaIChRI41R1 por el sistema

Microscan®

Codigo T/S Ak Gm To Cft Caz Cfz Crm P/T Ctn Cpe Caz Am A/S Pi Tim Imp Azt Cp Lvx Mxf MerCaIChRI41R1 R S S S I S R R S R S R R R S R S R S S S S

Donde Trimetropin T/S; Piperaclina/tazobactam P/T; Amikacina AK; Gentamicina Gm; Tabnamicina To; Ceftazidime AZ; Cefuroxime CRM; Cefotetan CTN; Cefepine CPE; Ceftriaxone CAX; Ampicilina Am; Ampicilina/sulbactan A/S; Pipenaciclina PI; Ticlaracitina/clavilanato T/M; Imipenem IMP; Aztronam Azt; Cefpodoxime CF; Levoflaxacin LVX; Moxiflaxacin MXF; Meropenem MER.

CODIGO CIT MAL ONPG TAR ACE CET OF/G P K Cl Cf Fd To NIT OXI IDENTIFICACIÓN PROB.

CalChRI41R1 POS POS NEG NEG NEG NEG POS POS NEG NEG POS NEG NEG POS P. fluorescens/ putida 99.99%

Donde GLU GLUCOSA; SUC SACAROSA; SOR SORBITOL; RAF RAFINOSA; RHA RHAMNOSA; ARA ARABINOSA; INO INOSITOL; ADO ADOLASA; MEL MELOBIOSA; URE UREA; H2S SULFURO DE H; IND INDOL; LYS LISINA; ARG ARGININA; ORN ORNITINA; TDA TRIPTOFANO DEAMINASA; ESC HIDRÓLISIS DE LA ESCULINA; VP VOGES PROSKAUER; ONPG GALACTOSIDASA; CIT CITRATO; MAL MALONATO; ACE ACETAMIDA; TAR TARTRATO; OF/G OXIDACIÓN FERMENTACIÓN; NIT NITRATOS; CET CETRIMIDE; P PENICILINA; K KANAMICINA; Cl COLISTINA; Cf CEFALOTINA; Fd NITROFURANTOINA; To TOBRAMICINA.

Anexo 8

Caracterización del aislamiento TRMnPR41R248 por el sistema Microscan®

Codigo T/S Ak Gm To Cft Caz Cfz Crm P/T Ctn Cpe Caz Am A/S Pi Tim Imp Azt Cp Lvx Mxf MerTRMnPR41R248 S S S S I S R R S R S R S R R R S S S S S S

Donde Trimetropin T/S; Piperaclina/tazobactam P/T; Amikacina AK; Gentamicina Gm; Tabnamicina To; Ceftazidime AZ; Cefuroxime CRM; Cefotetan CTN; Cefepine CPE; Ceftriaxone CAX; Ampicilina Am; Ampicilina/sulbactan A/S; Pipenaciclina PI; Ticlaracitina/clavilanato T/M; Imipenem IMP; Aztronam Azt; Cefpodoxime CF; Levoflaxacin LVX; Moxiflaxacin MXF; Meropenem MER.

CODIGO CIT MAL ONPG TAR ACE CET OF/G P K Cl Cf Fd To NIT OXI IDENTIFICACIÓN PROB. TRMnPR41R

248 POS POS NEG NEG NEG NEG POS POS NEG NEG POS NEG NEG POS P. fluorescens/putida 99.99%

Donde GLU GLUCOSA; SUC SACAROSA; SOR SORBITOL; RAF RAFINOSA; RHA RHAMNOSA; ARA ARABINOSA; INO INOSITOL; ADO ADOLASA; MEL MELOBIOSA; URE UREA; H2S SULFURO DE H; IND INDOL; LYS LISINA; ARG ARGININA; ORN ORNITINA; TDA TRIPTOFANO DEAMINASA; ESC HIDRÓLISIS DE LA ESCULINA; VP VOGES PROSKAUER; ONPG GALACTOSIDASA; CIT CITRATO; MAL MALONATO; ACE ACETAMIDA; TAR TARTRATO; OF/G OXIDACIÓN FERMENTACIÓN; NIT NITRATOS; CET CETRIMIDE; P PENICILINA; K KANAMICINA; Cl COLISTINA; Cf CEFALOTINA; Fd NITROFURANTOINA; To TOBRAMICINA.

ANEXO 9

Patrón de viabilidad de semillas de Cordia alliodora

Patrón de viabilidad de semillas de Tabebuia rosea

Fuente: Informe Final: Evaluación de algunas propiedades fisiológicas de las semillas de diez especies forestales tropicales de importancia en Colombia.2001

ANEXO 10

Composición de Fungicida

BASAMID®

Ingrediente activo Dazomet 3,5 dimetil- (2H)-tetrahidro-1,3,5-tiadazina-2-tiona 98% Ingredientes aditivos 2%

Total 100%

ANEXO 11

Composición de Fertilizantes Empleados en este Proyecto

Composición de Hormonagro Ácido alfa-naftalenacético, 0.40%. Ingredientes inertes, 99.60%.

PROGIBB®10 Sp Ingrediente activo Acido giberélico 10% Aditivos 90%

Composición de Fertilizante Orgánico Nutrihumus® Nitrógeno total 7.0 g/l Nitrógeno orgánico 7.0 g/l Potasio soluble en agua 38.0 g/l Extracto humito total 100.0 g/l Ácidos húmicos 63.0 g/l Ácidos fúlvicos 37.0 g/l Carbono orgánico 48.0 g/l Relación C/N 60 g/l pH 12.0 Densidad 1.1 g/cm3

ANEXO 12

Aclarado y Tinción de Raíces

El método utilizado para la tinción fue el descrito por Phillips y

Hayman (1970) mediante azul de Tripán

1. Lavar las raíces con abundante agua corriente.

2. Cubrir las raíces con solución de KOH al 5%.

3. En esta solución, colocarlas al baño de María (80°C) durante 20 a 30 minutos.

4. Lavar con agua corriente las raíces,

5. Lavado e inmersión en solución H2 O 2 al 10%. Se deben dejar de 5 a 10 minutos.

6. Lavar en agua corriente las raíces.

7. Acidificar con una solución de HCl al 1.0% durante 10 minutos.

8. Decantar el HCl. Sin lavar.

9. Adicionar el Azul de Tripán al 0.05% y colocar las raíces al baño de María (80° C) por 10 minutos.

10. Retirar el colorante y guardarlo en un recipiente.

11. Lavar las raíces en agua destilada y dejarlas en reposo

12. Luego montar 15 a 20 fragmentos de raíz en un portaobjetos de 76*26 mm y utilizar una laminilla de 22*22.

ANEXO 13

Producción de AIA en Medio sin Adición de Triptófano de Aislamientos Seleccionados de Raíz de Cordia alliodora y Tabebuia rosea 192 horas

1. Determinación realizada a partir de los aislamientos activados de la colección de microorganismos de la UBV (192 horas de cultivo)

CalChRI14R2 10,76 ug/ml CaIChRI41R1 15.31 ug/ml CalChRI14R3 3,26 ug/ml CalChRI14R5 8,13 ug/ml CalChRI13R23 2,63 ug/ml CalChRI14R24 18,76 ug/ml CalChRI14R25 1,01 ug/ml CalChRI41R26 1,26 ug/ml CalChRI41R27 1,88 ug/ml CalChRI13R39 3,26 ug/ml

CalChRI110R40 11,01 ug/ml CalChRI11H42 2,88 ug/ml CalChRI13R46 1,38 ug/ml

CalChRI110H51 5,01 ug/ml CalChRI41R58 1,51 ug/ml CalChRI11R59 5,26 ug/ml CalChRI11R60 8,88 ug/ml CalChRI13R61 6,01 ug/ml CalChRI13H63 5,63 ug/ml

TrMnM17R48 5,38 ug/ml TrMnPR41R246 3,63 ug/ml TrMnPR41R247 2,63 ug/ml TrMnPR41R248 3,26 ug/ml TrMnPR41R251 2,76 ug/ml TrMnCVS31R256 20,51 ug/ml TrMnCVS31R257 7,51 ug/ml TrMnCVS31R258 1,26 ug/ml TrMnCVS31R259 4,88 ug/ml TrMnCVS31R260 20,38 ug/ml TrMnCVS31R261 2,51 ug/ml TrMnCVS31R262 1,13 ug/ml TrMnCVS31R263 3,26 ug/ml TrMnCVS31R264 5,51 ug/ml TrMnCVS31R265 8,51 ug/ml TrMnCVS31R266 1,76 ug/ml TrMnM17R272 1,76 ug/ml TrMnMo32R280 2,51 ug/ml TrMnM16R286 14,01 ug/ml TrMnM16R287 3,76 ug/ml

ANEXO 14 Producción de biomasa, viabilidad y AIA de Aislamiento

CalChRI41R1 en caldo nutritivo

Horas de cultivo Absorbancia

Concentración AIA uglml

Concentración

Log UFC/ml

Absorbancia 540 nm

0 0,102 12,01 4,32 0,102 0,185 22,38 6,84 0,144 0,269 32,88 6,96 0,156 0,302 37,01 8,07 0,238 0,308 37,76 5,38 0,29

10 0,324 39,76 6,91 0,3412 0,301 36,88 7,46 0,3714 0,327 40,13 8,32 0,3816 0,314 38,51 7,72 0,4018 0,452 55,76 8,14 0,4720 0,312 38,26 8,30 0,4822 0,33 40,51 8,23 0,48

242 0,382 47,01 9,76 0,4826 0,363 44,63 9,30 0,4228 0,338 41,51 9,75 0,4030 0,461 56,88 9,84 0,4532 0,395 48,63 9,85 0,4634 0,354 43,51 8,83 0,4236 0,36 44,26 7,94 0,4638 0,398 49,01 6,74 0,4340 0,306 37,51 6,38 0,4042 0,361 44,38 5,67 0,4

1. Cultivo en caldo nutritivo sin triptófano (32°C) 2. Momento en que se realiza la inmovilización de la bacteria en turba estéril

ANEXO 15

Producción de biomasa, viabilidad y AIA de Aislamiento TrMnPR41R248 en caldo nutritivo

Horas de cultivo

Absorbancia 530 nm

Concentración

AIA ug/ml

Concentración

Log UFC/ml

Absorbancia

540nm 0 0,042 4,51 2 0,122 0,077 8,88 6,47 0,184 0,147 17,63 7,38 0,206 0,215 26,13 7 0,268 0,231 28,13 7,30 0,26

10 0,257 31,38 7,59 0,2712 0,293 35,88 8,20 0,3914 0,296 36,26 8,60 0,4116 0,306 37,51 8,90 0,4718 0,42 51,76 8,04 0,5120 0,319 39,13 8,11 0,5422 0,346 42,51 9 0,5524 0,325 39,88 9,04 0,5626 0,293 35,88 9,04 0,5628 0,357 43,88 9 0,6330 0,447 55,13 8,07 0,5832 0,232 28,26 6,95 0,5234 0,398 49,01 7 0,6036 0,439 54,13 6,90 0,6238 0,454 56,01 5,69 0,6040 0,383 47,13 5,65 0,642 0,414 51,01 5,07 0,55


ANEXO 16

Peso De Semillas de Cordia alliodora Fenotipo Pequeño 6 a 8 mm Y

Fenotipo Grande 8 a10 mm en Imbibición

Hora Peso semillas 6 a 8mm/g Peso semillas 8 a 10 mm/g 1 0,34 0,4232 0,489 0,6053 0,576 0,7204 0,616 0,7765 0,664 0,8166 0,691 0,8567 0,725 0,8358 0,735 0,8509 0,746 0,863

10 0,757 0,87011 0,755 0,87612 0,788 0,89613 0,786 0,90214 0,794 0,91215 0,801 0,91416 0,807 0,91717 0,815 0,92218 0,805 0,92319 0,825 0,94220 0,854 0,93821 0.827 0.82422 0.827 0.82423 0.827 0.824


ANEXO 17

Peso de Semillas de Tabebuia rosea en Imbibición

HORAS Peso (g) semillas

1 0,3442 0,8043 0,8794 0,915 0,9746 1,0127 1,0748 1,0779 1,036

10 1,04111 1,02612 1,07313 1,09114 1,09415 1,08416 1,08617 1,09418 1,08719 1,13120 1,08321 1.08222 1.08223 1.082

ANEXO 18

Índices de germinación semillas de Cordia alliodora fenotipo pequeño

6 a 8 mm

Tratamiento Repetición GDM VM VG

1 1 1,12 0,38 0,43 2 1,62 0,23 0,38 3 0,5 0,20 0,10

Promedio 1.09 0.27 0.30 2 1 1,87 0,2 0,37 2 0,37 0,2 0,07 3 1,12 0,18 0,20

Promedio 1.12 0.19 0.21 3 1 0,5 0,2 0,1 2 0,5 0,17 0,08 3 0,5 0,19 0,09

Promedio 0.5 0.19 0.09 4 1 0,5 0,31 0,15 2 1,12 0,41 0,46 3 0,75 1,66 1,25

Promedio 0.79 0.79 0.62 5 1 1,12 0,2 0,22 2 0,62 0,30 0,18 3 0,62 0,57 0,36

Promedio 0.79 0.35 0.67 6 1 0,62 0,15 0,09 2 0,75 0,16 0,12 3 0,87 0,30 0,26

Promedio 0.75 0.20 0.16

1. GDM: Germinación diaria media 2. VM: Valor máximo 3. VG: Valor de germinación

ANEXO 19

Índices de germinación semillas de Cordia alliodora fenotipo grande 8

a 10 mm

Tratamiento Repetición GDM VM VG 1 1 0,5 0,15 0,07 2 0,12 0,20 0,02 3 0,12 0,19 0,02

Promedio 0.08 0.18 0.12 2 1 0 0 0 2 1 1,02 1,02 3 0 0 0

Promedio 0.33 0.34 0.34 3 1 0,5 0,20 0,10 2 0,12 0,18 0,02 3 0 0 0

Promedio 0.20 0.08 0.11 4 1 0,5 0,66 0,33 2 0,25 0,29 0,07 3 0,75 0,4 0,3

Promedio 0.41 0.45 0.45 5 1 1 0,32 0,32 2 1,12 0,20 0,23 3 1,5 0,35 0,53

Promedio 1.20 0.29 0.36 6 1 1,62 0,5 0,81 2 1,87 0,25 0,46 3 1,37 0,45 0,62

Promedio 1.62 0.38 0.63 1. GDM: Germinación media diaria 2. VM: Valor máximo 3. Velocidad de germinación

Anexo 20

Índices de Germinación Semillas de Tabebuia Rosea

Tratamiento Repetición GDM VM VG 1 1 0,5 0,31 0,15 2 1,12 0,41 0,46 3 0,75 1,66 1,25

Promedio 0.79 0.79 0.62 2 1 1,12 1,19 1,33 2 1 0,41 0,41 3 0,75 1,66 1,25

Promedio 0.95 1.09 1.00 3 1 1,5 2,08 3,12 2 1,12 1,66 1,87 3 0,87 1,25 1,09

Promedio 1.16 1.66 2.03 4 1 1,12 0,76 0,86 2 0,75 0,23 0,17 3 0,87 1,53 1,34

Promedio 0.91 0.84 0.79 5 1 1,62 0,38 0,62 2 1,37 0,41 0,57 3 1 1,66 1,66

Promedio 1.33 0.82 0.76 6 1 1,87 1,42 2,67 2 1,75 0,41 0,72 3 1,25 0,41 0,52

Promedio 1.62 0.75 1.30 1. GDM: Germinación media diaria 2. VM: Valor máximo 3. Velocidad de germinación

ANEXO 21

Análisis Estadístico Variable VG Ensayo Semillas C. alliodora Pequeñas

The GLM Procedure ANOVA Dependent Variable: VG Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 0.51728868 0.10345774 1.60 0.2339 Error 12 0.77651145 0.06470929 Corrected Total 17 1.29380014 HOMOGENEIDAD DE VARIANZA: Brown and Forsythe's Test for Homogeneity of VG Variance ANOVA of Absolute Deviations from Group Medians Sum of Mean Source DF Squares Square F Value Pr > F T 5 0.2451 0.0490 1.50 0.2615 Error 12 0.3925 0.0327

MEDIA CERO Y NORMALIDAD Tests for Location: Mu0=0 Test -----p Value------ Student's t Pr > |t| 1.0000 Sign Pr >= |M| 0.8145 Signed Rank Pr >= |S| 0.7337 Tests for Normality Test --Statistic--- -----p Value------

Kolmogorov-Smirnov D 0.177808 Pr > D 0.1350

ANEXO 22

Análisis Estadístico Variable VG Ensayo Semilla C. alliodora grande

The GLM Procedure ANOVA Dependent Variable: VG Sum of Source DF Squares Mean Square FValue Pr>F Model 5 0.75762433 0.15152487 2.11 0.1341 Error 12 0.86133624 0.07177802 Corrected Total 17 1.61896058 HOMOGENEIDAD DE VARIANZA The GLM Procedure Brown and Forsythe's Test for Homogeneity of VG Variance ANOVA of Absolute Deviations from Group Medians Sum of Mean Source DF Squares Square F Value Pr > F T 5 0.2072 0.0414 0.63 0.6782 Error 12 0.7845 0.0654 MEDIA CERO Y NORMALIDAD Test for location: Mu0=0

Test -----p Value------ Student's t Pr > |t| 1.0000 Sign Pr >= |M| 0.4807 Signed Rank Pr >= |S| 0.7893 Tests for Normality Test -----p Value------ Shapiro-Wilk Pr < W 0.1270 Kolmogorov-Smirnov Pr > D >0.1500

ANEXO 23

Análisis Estadístico Variable VG Ensayo Semillas T. rosea

The GLM Procedure ANOVA Dependent Variable: VG Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 3.77039133 0.75407827 1.20 0.3658 Error 12 7.53744449 0.62812037 Corrected Total 17 11.30783582 Homogeneidad De Varianza Brown and Forsythe's Test for Homogeneity of VG Variance ANOVA of Absolute Deviations from Group Medians Sum of Mean Source DF Squares Square F Value Pr > F T 5 0.4804 0.0961 0.24 0.9359

Error 12 4.7606 0.3967 Media Cero, Normalidad Tests for Location: Mu0=0 Test -Statistic- -----p Value------ Student's t Pr > |t| 1.0000 Sign Pr >= |M| 0.8145 Signed Rank Pr >= |S| 0.8986 Tests for Normality Test -----p Value------ Shapiro-Wilk Pr < W 0.3914 Kolmogorov-Smirnov Pr > D >0.1500 Cramer-von Mises Pr > W-Sq >0.2500

Anderson-Darling Pr > A-Sq >0.2500

ANEXO 24

Análisis Estadístico No Paramétrico de Variables evaluadas de crecimiento vegetal de C. alliodora

Variable Kruskall-Wallis

value P

A (area foliar) 4.5673

0.4744

L (longitud de raíz) 2.8560 0.7265

N (número de hojas) 3.6847 0.5999

PFA (peso fresco aéreo)

0.4925 0.9927

PSA (peso seco aéreo)

5.0708

0.4101

ANEXO 25

Análisis Estadístico Variables de Crecimiento Vegetal Ensayo Plantas Jóvenes de C. alliodora

HOMOGENEIDAD, ANÁLISIS Y NORMALIDAD DE VARIANZA

VARIABLE Test de homogeneidad Análisis de Shapiro-Wilk de varianza (Levene) varianza pr < W

H 0.66 0.02 <0,100 LR* 0.10 0.61 - NH* 0.22 0.51 - AF* 0.07 0.57 -

PFR* 0.25 0.03 <0,0510 PSR* 0.66 0.01 <0,0513 PFA* 0.07 0.44 - PSA* 0.18 0.52 -

*Variable transformada con una de las transformaciones de la familia de Jonson (Logaritmo natural)

COMPARACIÓN DE MEDIAS DUNCAN

VARIABLE TRATAMIENTO A B C 4 10,2444 5 9,1389 9,1389 H 3 8,7444 6 8,7139 1 8,6056 2 8,2722 2 -0,7515 6 -0,9288

PFR 5 -1,0946 -1,0946 4 -1,2407 -1,2407 1 -1,2814 -1,2814 3 -1,5137 2 -2,2877 5 -2,3924 -2,3924

PSR 6 -2,714 -2,714 -2,714 1 -2,7825 -2,7825 4 -2,7997 -2,7997 3 -2,9888

ANEXO 26

Comparación de Medias de Dunnet para Crecimiento Vegetal Ensayo

Plantas Jóvenes de Cordia alliodora

VARIABLE TRATAMIENTO TRATAMIENTO Diferencia Error Significancía

DEPENDIENTE (I) (J) entre

medias std 1 6 -0,1083 0,5776 0,9998 2 6 -0,4417 0,5776 0,9067 H 3 6 0,0306 0,5776 1 4 6 1,5306 0,5776 0,0366 5 6 0,425 0,5776 0,919 1 6 -0,3526 0,2426 0,4532 2 6 0,1774 0,2426 0,9208

PFR* 3 6 -0,5848 0,2426 0,0678 4 6 -0,3119 0,2426 0,5706 5 6 -0,1658 0,2426 0,9387 1 6 -0,0685 0,2079 0,9975 2 6 0.4263 0,2079 0,1545

PSR* 3 6 -0,2749 0,2079 0,5443 4 6 0,0857 0,2079 0,9928 5 6 0,3215 0,2079 0,3929

ANEXO 27

Prueba de Kruskall-Wallis para la Área foliar de T. rosea

Variable Kruskall-wallis P A (area foliar) 9.1899

0.1001

ANEXO 28

Análisis Estadístico Variables de Crecimiento Vegetal Ensayo Plantas Jóvenes de T. rosea

HOMOGENEIDAD, ANALISIS Y NORMALIDAD DE VARIANZA

VARIABLE Test de homogeneidad Análisis de Shapiro-Wilk de varianza (Levene) varianza pr < W

H 0,08519 0,001 <0,6907 LR 0,874 0,0194 <0,1250 NH 0,3484 0,0207 <0,4615 AF 0,5492 0,0566 -

PFR* 0,0825 7,69E-07 <0.2671 PSR 0,2144 0,0085 <0,2873 PFA* 0,3345 1,03E-05 <0,7451 PSA 0,085 0,0078 0.0614


COMPARACION DE MEDIAS DUNCAN

VARIABLE TRATAMIENTO A B C 1 13,6717 3 13,0589 13,0589 H 2 12,841 12,841 4 12,6205 12,6205 6 12,1179 12,1179 5 11,0128 1 30,6256 4 29,8153 29,8153

LR 2 28,682 28,682 28,682 3 28,1384 28,1384 28,1384 6 27,1589 27,1589 5 26,8435 4 12,1534 3 11,8461

NH 6 11,6153 1 11,0512 11,0512 2 11 11 5 9,8205 1 1,0401 4 0,9581 0,9581

PSA 2 0,9303 0,9303 3 0,8633 0,8633 0,8633 6 0,8162 0,8162

5 0,6905 2 0,5812 3 0,4957 0,4957

PSR 1 0,4762 0,4762 4 0,4533 0,4533 6 0,3869 5 0,3614 4 1,4162 3 0,888

PFR* 2 0,7963 0,7963 1 0,7201 0,7201 6 0,6579 0,6579 5 0,5382 4 1,7475 1 1,4395

PFA* 2 1,408 3 1,3452 6 1,2655 1,2655 5 1,0494


COMPARACION DE MEDIAS DE DUNNET

VARIABLE TRATAMIENTO TRATAMIENTO Diferencia Error Significancía

DEPENDIENTE (I) (J) entre medias std 1 6 1,55384615 0,62672027 0,05690634 2 6 0,72307692 0,62672027 0,66643888H 3 6 0,94102564 0,62672027 0,42136697 4 6 0,5025641 0,62672027 0,8894482 5 6 -1,1051282 0,62672027 0,27150476 1 6 3,46666667 1,26071522 0,02766213 2 6 1,52307692 1,26071522 0,62688622

LR 3 6 0,97948718 1,26071522 0,90120841 4 6 2,65641026 1,26071522 0,13670883 5 6 -0,3153846 1,26071522 0,99931888 1 6 -0,5641026 0,71249778 0,89432423 2 6 -0,6153846 0,71249778 0,85739418

NH 3 6 0,23076923 0,71249778 0,99766265 4 6 0,53846154 0,71249778 0,91062878 5 6 -1,7948718 0,71249778 0,05140197 1 6 0,22392051 0,09609036 0,08215651 2 6 0,11415385 0,09609036 0,64155607

PSA 3 6 0,04716667 0,09609036 0,98442836 4 6 0,14196795 0,09609036 0,43705708 5 6 -0,1256282 0,09609036 0,55477586 1 6 0,08930256 0,06279532 0,47415036 2 6 0,1943 0,06279532 0,00998583

PSR 3 6 0,10880513 0,06279532 0,28693828

4 6 0,06634872 0,06279532 0,73559383 5 6 -0,0255615 0,99325131 1 6 0,06213463 0,15553071 0,99380457 2 6 0,13836637 0,15553071 0,84277351

PFR* 3 6 0,23012804 0,15553071 0,43561841 4 6 0,75832691 0,15553071 1,01E-05 5 6 -0,1197396 0,15553071 0,90440123 1 6 0,17398911 0,1269527 0,50989773 2 6 0,1425679 0,1269527 0,68862184

PFA* 3 6 0,07974516 0,1269527 0,95608813 4 6 0,4832314 0,1269527 0,00086513 5 6 -0,2160595 0,1269527 0,30302702

Anexo 29

Análisis de Varianza del Porcentaje de Micorrización Ensayo Plantas Jóvenes C. alliodora

Porcentaje de Micorrización

The GLM Procedure Dependent Variable: Micorr Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 11687.23833 2337.44767 40.74 <.0001 Error 12 688.46667 57.37222 Corrected Total 17 12375.70500

Anexo 30

Comparación de Medias Dunnet del Porcentaje de Micorrización Plantas Jóvenes C. alliodora

Multiple Comparisons(a) Dunnett T3

Dependent Variable (I) Tratamiento (J) Tratamiento Mean Difference (I-J) Std. Error Sig.

95% Confidence Interval

Lower Bound Upper Bound

Micro 1 2 -39,86666667 5,292552419 0,015526446 -68,12633249 -

11,60700085 3 4,266666667 4,402019738 0,969241267 -28,47471889 37,00805222

4 -46,63333333 5,475196597 0,009009683 -75,33016533 -

17,93650133 5 -50,86666667 9,411576796 0,077782354 -111,0176458 9,28431248 6 9,2 4,275511665 0,571628927 -26,22795309 44,62795309 2 1 39,86666667 5,292552419 0,015526446 11,60700085 68,12633249 3 44,13333333 3,556527645 0,010221381 20,0888897 68,17777697 4 -6,766666667 4,821710162 0,860286513 -31,77863862 18,24530529 5 -11 9,047037575 0,911409996 -75,16206439 53,16206439 6 49,06666667 3,398692559 0,01234942 22,54517846 75,58815487 3 1 -4,266666667 4,402019738 0,969241267 -37,00805222 28,47471889 2 -44,13333333 3,556527645 0,010221381 -68,17777697 -20,0888897

4 -50,9 3,82302963 0,009879655 -77,67209741 -

24,12790259 5 -55,13333333 8,556608882 0,09144158 -129,6157682 19,34910148 6 4,933333333 1,708150397 0,302977465 -4,636720141 14,50338681 4 1 46,63333333 5,475196597 0,009009683 17,93650133 75,33016533 2 6,766666667 4,821710162 0,860286513 -18,24530529 31,77863862 3 50,9 3,82302963 0,009879655 24,12790259 77,67209741 5 -4,233333333 9,155083591 0,999929466 -66,96416683 58,49750016 6 55,83333333 3,676653067 0,011950587 26,46910434 85,19756232 5 1 50,86666667 9,411576796 0,077782354 -9,28431248 111,0176458 2 11 9,047037575 0,911409996 -53,16206439 75,16206439 3 55,13333333 8,556608882 0,09144158 -19,34910148 129,6157682 4 4,233333333 9,155083591 0,999929466 -58,49750016 66,96416683 6 60,06666667 8,492218661 0,080334722 -16,41658779 136,5499211 6 1 -9,2 4,275511665 0,571628927 -44,62795309 26,22795309

2 -49,06666667 3,398692559 0,01234942 -75,58815487 -

22,54517846 3 -4,933333333 1,708150397 0,302977465 -14,50338681 4,636720141

4 -55,83333333 3,676653067 0,011950587 -85,19756232 -

26,46910434 5 -60,06666667 8,492218661 0,080334722 -136,5499211 16,41658779* The mean difference is significant at the .05 level.

A Planta = Cordia

Anexo 31

Comparación de Medias Dunnet del Número de Esporas Ensayo Plantas Jóvenes C. alliodora

Multiple Comparisons(a) Dunnett T3



Lower Bound Upper Bound

Esporas 1 2 -0,753333333 0,052387445 0,009693886 -1,136035854 -

0,370630812 3 -0,036666667 0,036362374 0,968373773 -0,257354906 0,184021573 4 -0,96 0,086345559 0,027923084 -1,6880691 -0,2319309 5 -1,373333333 0,272661777 0,156114534 -3,87841281 1,131746143 6 0,076666667 0,030731815 0,408053168 -0,09304138 0,246374713 2 1 0,753333333 0,052387445 0,009693886 0,370630812 1,136035854 3 0,716666667 0,05868939 0,004321413 0,382337587 1,050995746 4 -0,206666667 0,097866122 0,555526283 -0,787613629 0,374280296 5 -0,62 0,276526069 0,546687196 -3,003356206 1,763356206 6 0,83 0,055377492 0,004227816 0,481156945 1,178843055 3 1 0,036666667 0,036362374 0,968373773 -0,184021573 0,257354906

2 -0,716666667 0,05868939 0,004321413 -1,050995746 -

0,382337587

4 -0,923333333 0,090308115 0,021001009 -1,570607858 -

0,276058809 5 -1,336666667 0,273942411 0,161699013 -3,798939666 1,125606332 6 0,113333333 0,04055175 0,313581665 -0,102583053 0,32924972 4 1 0,96 0,086345559 0,027923084 0,2319309 1,6880691 2 0,206666667 0,097866122 0,555526283 -0,374280296 0,787613629 3 0,923333333 0,090308115 0,021001009 0,276058809 1,570607858 5 -0,413333333 0,284917142 0,827712918 -2,596563875 1,769897208 6 1,036666667 0,08819171 0,019478312 0,352083424 1,721249909 5 1 1,373333333 0,272661777 0,156114534 -1,131746143 3,87841281 2 0,62 0,276526069 0,546687196 -1,763356206 3,003356206 3 1,336666667 0,273942411 0,161699013 -1,125606332 3,798939666 4 0,413333333 0,284917142 0,827712918 -1,769897208 2,596563875 6 1,45 0,27325202 0,140357006 -1,035028463 3,935028463 6 1 -0,076666667 0,030731815 0,408053168 -0,246374713 0,09304138

2 -0,83 0,055377492 0,004227816 -1,178843055 -

0,481156945 3 -0,113333333 0,04055175 0,313581665 -0,32924972 0,102583053

4 -1,036666667 0,08819171 0,019478312 -1,721249909 -

0,352083424 5 -1,45 0,27325202 0,140357006 -3,935028463 1,035028463

Anexo 32

Análisis de Varianza de Porcentaje de Micorrización Ensayo Plantas Jóvenes T. rosea

Porcentaje de Micorrización The SAS System 10:20 Saturday, November 20, 2005 79 The GLM Procedure Dependent Variable: Micorr Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 9497.24444 1899.44889 8.90 0.0010 Error 12 2561.07333 213.42278 Corrected Total 17 12058.31778

Anexo 33 Comparación de Medias Dunnet del Porcentaje de Micorrización

Plantas Jóvenes T. rosea Multiple Comparisons(a)

Dunnett T3



Lower Bound Upper Bound Esporas 1 2 -0,84 0,203688215 0,22390279 -2,729023711 1,049023711 3 0,016666667 0,015634719 0,946199202 -0,114100814 0,147434147 4 -0,72 0,077602978 0,04959266 -1,436976733 -0,003023267 5 -0,816666667 0,47646849 0,728842488 -5,237807996 3,604474663 6 -0,65 0,572557615 0,925719052 -5,962942767 4,662942767 2 1 0,84 0,203688215 0,22390279 -1,049023711 2,729023711 3 0,856666667 0,204232982 0,215318521 -1,013437877 2,72677121 4 0,12 0,217919455 0,999553994 -1,434778593 1,674778593 5 0,023333333 0,518159135 1 -3,503722793 3,55038946 6 0,19 0,607691442 0,999999013 -4,257772299 4,637772299 3 1 -0,016666667 0,015634719 0,946199202 -0,147434147 0,114100814 2 -0,856666667 0,204232982 0,215318521 -2,72677121 1,013437877 4 -0,736666667 0,079021797 0,041404179 -1,409401856 -0,063931477 5 -0,833333333 0,47670163 0,716477117 -5,246251748 3,579585082 6 -0,666666667 0,572751643 0,917848307 -5,972758694 4,639425361 4 1 0,72 0,077602978 0,04959266 0,003023267 1,436976733 2 -0,12 0,217919455 0,999553994 -1,674778593 1,434778593 3 0,736666667 0,079021797 0,041404179 0,063931477 1,409401856 5 -0,096666667 0,482723754 0,999999994 -4,314132631 4,120799298 6 0,07 0,577773504 1 -5,068782197 5,208782197 5 1 0,816666667 0,47646849 0,728842488 -3,604474663 5,237807996 2 -0,023333333 0,518159135 1 -3,55038946 3,503722793 3 0,833333333 0,47670163 0,716477117 -3,579585082 5,246251748 4 0,096666667 0,482723754 0,999999994 -4,120799298 4,314132631 6 0,166666667 0,744863895 0,999999997 -3,754732546 4,088065879 6 1 0,65 0,572557615 0,925719052 -4,662942767 5,962942767 2 -0,19 0,607691442 0,999999013 -4,637772299 4,257772299 3 0,666666667 0,572751643 0,917848307 -4,639425361 5,972758694 4 -0,07 0,577773504 1 -5,208782197 5,068782197 5 -0,166666667 0,744863895 0,999999997 -4,088065879 3,754732546Micro 1 2 -27,73333333 19,28577484 0,84640154 -127,3867609 71,92009424 3 13,76666667 14,5861045 0,975111385 -87,5956308 115,1289641 4 -38,06666667 13,96296689 0,408951975 -150,4379541 74,30462079 5 15,56666667 13,5982025 0,923994189 -106,8748138 138,0081471 6 23,33333333 13,87495746 0,73923338 -91,16502926 137,8316959 2 1 27,73333333 19,28577484 0,84640154 -71,92009424 127,3867609 3 41,5 14,81808205 0,369045401 -62,24406431 145,2440643 4 -10,33333333 14,20512427 0,99442657 -125,1657679 104,4991012 5 43,3 13,84674049 0,346296261 -81,51144995 168,11145 6 51,06666667 14,11862442 0,259049365 -65,88439568 168,017729 3 1 -13,76666667 14,5861045 0,975111385 -115,1289641 87,5956308 2 -41,5 14,81808205 0,369045401 -145,2440643 62,24406431 4 -51,83333333 6,52678243 0,017868542 -89,09755891 -14,56910776 5 1,8 5,704871213 0,999998552 -43,30735814 46,90735814 6 9,566666667 6,336315088 0,810592088 -28,31249664 47,44582997 4 1 38,06666667 13,96296689 0,408951975 -74,30462079 150,4379541 2 10,33333333 14,20512427 0,99442657 -104,4991012 125,1657679 3 51,83333333 6,52678243 0,017868542 14,56910776 89,09755891 5 53,63333333 3,841296078 0,00742188 27,68873183 79,57793483 6 61,4 4,728518678 0,001737045 36,80336835 85,99663165 5 1 -15,56666667 13,5982025 0,923994189 -138,0081471 106,8748138 2 -43,3 13,84674049 0,346296261 -168,11145 81,51144995 3 -1,8 5,704871213 0,999998552 -46,90735814 43,30735814 4 -53,63333333 3,841296078 0,00742188 -79,57793483 -27,68873183 6 7,766666667 3,50792753 0,526273594 -14,8146746 30,34800794 6 1 -23,33333333 13,87495746 0,73923338 -137,8316959 91,16502926 2 -51,06666667 14,11862442 0,259049365 -168,017729 65,88439568 3 -9,566666667 6,336315088 0,810592088 -47,44582997 28,31249664 4 -61,4 4,728518678 0,001737045 -85,99663165 -36,80336835 5 -7,766666667 3,50792753 0,526273594 -30,34800794 14,8146746

ANEXO 34

Análisis de Varianza de Número Esporas

Ensayo Plantas Jóvenes T. rosea

The GLM Procedure Dependent Variable: Esporas Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 2.41111667 0.48222333 1.60 0.2334 Error 12 3.61533333 0.30127778 Corrected Total 17 6.02645000

Anexo 35

Análisis de Varianza de Número Esporas Ensayo Plantas Jóvenes C. alliodora

The GLM Procedure Dependent Variable: Esporas Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 5 5.50604444 1.10120889 25.74 <.0001 Error 12 0.51340000 0.04278333 Corrected Total 17 6.01944444

BACTERIAS ENDOFITAS DE C ordia alliodora Oken Y Tabebuia ... · bacterias endofitas de c ordia...

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