BACTERIAS ACIDO LACTICAS Y FERMENTACION … · Eflujo de protones requiere ATP ... Fuerza protón...

BACTERIAS ACIDO LACTICAS Y FERMENTACION

MALOLACTICA

Dra. Mariana CombinaLaboratorio de Microbiología Enológica

EEA Mendoza -INTA

Cocos o bacilos

BAL

Cocos o bacilosGram positivos

No Esporulados

Catalasa negativa

REACCION DE CATALASA

2 H2O2 2 H2O + 1 O2

Anaerobios aerotolerantes (citocromos, heminas)


No Esporulados

Propiedades metabólicas y nutricionales comunes

Acido lácticoCatalasa negativa

Supeóxido dismutasa 2 O2 + 2 H+ O2 + H2O2

Catalasa 2 H2O2 2 H2O + O2

Peroxidasa C-org. + H2O2 C-O + H2O

Mn+2 2Mn+2 + 2 O2 2 MnO2

2 MnO2 MnO2- + O2 + Mn+2

RELACIONES CON EL OXIGENO

Compuestos tóxicos del oxígeno

Superóxido O2

peróxido de hidrógeno H2O2


No Esporulados


Acido láctico


Poliauxótrofos

Catalasa negativa

POLIAUXOTROFOS

Mn+2Vitaminas de grupo B

aminoácidosbases púricas y pirimidínicas

Medios complejoscon peptona o Extracto de levadura

y azúcar fermentableAcido pantoténico (uva, tomate)


No Esporulados


Acido láctico


Poliauxótrofos

Catalasa negativa

Metabolismo homo y heterofermentativo

acetato

ADP ATP

Metabolismo

Azúcares: monosacáridos pentosas (arabinosa, xilosa, ribosa, ramnosa)hexosas (glucosa, fructosa)

disacáridos (sacarosa)

Ácidos orgánicos: cítrico, málico y tartáricoAlcoholes: glicerol

Pentosas se metabolizan por vía pentosa fosfato

1 pentosa 1 lactato + 1 acetato + 2 ATP

D-lactico/L-lactico

CLASIFICACION GENERAL

Pediococcus cocos 2 planos homoferment.

Lactococcus cocos 1 plano homoferment.(Streptococcus) (cadenas)

Leuconostoc cocos 1 plano heteroferment.(Oenococcus)

Lactobacillus bacilos homo L. maliL. casei (facultativo)

hetero L. plantarumL. hilgardiiL. fructivorans, otros

BAL están presentes en todas la etapas de la vinificación

Uva 103-104 ufc/mL Lb. plantarumLb. casei Lb. hilgardii

(madurez y sanidad uva) Lb. mesenteroides P. damnosus

Inicio de FOH 102-103 ufc/mL SO2

Final FOH mantiene bajo (fase latencia-variable)

Desarrollo hasta 106-108 ufc/mL Depende de distintos factores(pH, etanol, temperatura, SO2,interacción levadura, autolisis levadurasCO2)

Oenococcus oeni y algunos Pediococcus o Lactobacillus

Glucosa

Pentosa P

G3P

2 NADH

acetilP

etanol

Piruvatolactato

1 NADH

1 NAD

2 NAD

CO2

En condiciones limitantes de NAD ferm lácticano limitantes de NAD ferm. ácido mixta

Oenococcus oeni

ATP

1 ATP

acetato

ATP

FructosaF6P

1 NAD

2 ATP

Glucosa

ribulosa5P

G3P

2 NADH

acetilP

etanol

Piruvatolactato

Citrato

acetato

1 NADH

1 NAD

2 NAD

CO2

CO2

Presencia de otros aceptores externos modifica el metabolismo y estimula el crecimiento

1 NAD+

Oenococcus oeni

ATP

acetato

ATPmanitol

1 NAD

Fructosa

secuencial

Glucosa

ribulosa5P

G3P

2 NADH

acetilP

Piruvato

Citrato

CO2

diacetilo

Zaunmuller, 2006

Estimula el crecimiento bacteriano

pH elevado + acético - diacetilopH bajo - acético + diacetilo

Oenococcus oeni

Acetoina

Acido acético (0,1-0,2 g/L)

ATP

FML málico-cítrico secuencial??

Necesidad de control una vez finalizada la FML

Las bacterias permanecen largo tiempo en vino

Curvas de crecimiento (FML-espontánea)

3

4

5

6

7

8

9

4 11 21 29 38 46 53 60

Dias

log

UFC

/ml

log UfC/ml

2 per. media móvil (log

UfC/ml)

Final de degradación del ácido málico

Lavalle

1

2

3

4

5

6

7

8

9

9 19 23 27 32 39 43 63

Días

log

UF

C/m

l

log UFC/ml

2 per. media móvil (logUFC/ml)

Final de degradación del ácido málico

La Consulta

FML mecanismo adicional de energía (ATP)

Fuerza protón motriz+

Gradiente químico (pH)Potencial eléctrico (cargas + y -)

+

+++++

--

-

-

- -

H+

El mantenimiento de potencial requiere ATPasaEflujo de protones requiere ATPInflujo de protones genera ATP

H+

Membrana

FERMENTACION MALOLÁCTICA EN VINOS

FERMENTACION MALOLÁCTICA EN VINOS

Oenococcus oeni

Deben alcanzar106 cel/mL

Malato - - Malato - -

Lactato -

H+ (simporte)

ADP

ATP

H+H+

H+

lactato

CO2 alcaliniza y

aumenta gradiente de pH

interiorexterior

Fuerza protón motriz

Modificaciones en el vino- Positivas

Acidez Disminuye AT (pH aumenta 0,1-0,3 unidades)

SuavizaVolumen

Decrece astringenciaAumenta la condensación de taninosPolisacáridos

Aroma

Reducción de los herbáceosFrutales (¿?) damasco,ciruela

Madera, robleManteca y lácteos (diacetilo: 1-4 mg/L)β-glucosidasas en O.oeni

Estabilidad Consumo de azúcares-bacteriocinasFML espont.en botella

Modificaciones en el vino -negativas

Color

Puede disminuir hasta 30%:Modificación del pHAntocianasa (antocianos glucosilados)Consumo de acetaldehído

MantecaProducción de diacetilo (5-7 mg/L) (puede ser degradado por las levaduras)

Aroma Enmascara aromas varietales

Riesgo

Aromas fenolicos y piridinasAminas biógenasEtil-carbamatos

Acidez Elevar AV (0,2-0,3 g/L)

Fermentación maloláctica

Depende de factores:

azúcares-nitrógeno disponible

pH

Etanol

SO2

Temperatura

Azucares residuales (hexosas, pentosas, acidos orgánicos)

Fuentes de nitrógeno: autolisismantenimiento sobre borras

(absorción de compuestos tóxicos para BAL y generación de CO2)




pH

Etanol

SO2

Temperatura

pH <3,0 no BAL Oenocuccus más RpH crítico: 3,5 (otras BAL)

Importante: balance uso azucares y málico(óptimo enzima ML: 3,8 – 60% act: 3,0-3,2)Ensayo pH: 3,15 FML 165 días

3,8 FML 14 díasPH bajo: favorece FML y ingreso de málico

pH elevado: lenta entrada de málicofavorece el uso de azucares

aumento AV- picado




pH

Etanol

SO2

Temperatura

OH> 10% inhibe la mayoría de BAL

Importante: efecto inhibidor se potencia con pH – transporte malico

10% OH/pH 3,3: solo Oenococcus

12% OH/pH 3,2: selección de un m.o. nativo




pH

Etanol

SO2

Temperatura

Todas las formas de SO2 son activas (+ o -)Dependiente de pHDegrada acetaldehido libera SO2 ligado

10 mg/L libre sin problemaSO2

30 mg/L libre inhibe




pH

Etanol

SO2

Temperatura

Temperatura óptima creci: 28-30 ºC Temperatura óptima FML: 18-20 °C

Frío: 10-15ºC crecimiento insuficiente

106 cel/mL de mosto

Factibilidad de FML

Otros factores que afectan la FML

Taninos

Antocianos estimulan el crecimientoTaninos inhiben Solo luego de polimerización FMLExtracto de vino igual que testigo sin vino

Taninos de la piel estimulanTaninos de semilla inhiben (concentrac 10 veces sup.)Taninos de madera estimulan

Manoproteínas protegen a BAL de taninos

Evidencia en algunos tintos más FML que en otros

MERLOT Tendría fracciones tánicas que inhiben FML

Cabernet Sauvignon no dio igual – Tanah similar


Carencias nutritivas

Exceso de oxígeno

Concentración inicial de acido málico

Mantenimiento sobre borrasExcesiva clarificaciónCompactación de borras – mover

En vinos difíciles (idem + polisacáridos y

celulosa para suspensión)

En agua de hidratación (levaduras inactivas,

aa, vitaminas, minerales)

Nutrición

Debe evitarse al final de la FA

Rango 0,8 a 4 g/L


Cepa de levadura

Residuos de fungicidas

Adecuada elección de la cepa

BotriticidasSwitch (fluodioxinil+ciprodinil)

Competencia por sustratoSO2

EtanolAcidos grasos (C6-C12)Péptidos

5 4 3 2 1 0++ + + - - -- No information

QA23 DV10 EC1118 CEG M1 C1108

ICV D254 R2 PM SIMI White K1 C or R771B M2 ICV D21 2323 WAM FC9AMH W BDX 2226 Opale QD145W15 W27 BRL97 RHST T73

6U SLO T306 ALBCY3079 Cross evolution 2056 Syrah

W46 BGY RA17 M69RC212 CSM BM45 CGC62

ICV D80 VQ15 BM4x4 CKVN 228 BA11 GHM

VRB MCSICV GRE SVGICVD47

Rhone 4600CMCS2299NEMPMABC

CEG43

Yeast strains

Level of compatibility

Tabla de compatibilidad con la FML

Que hacer para si la FML no se produce

Re-inoculación

Eliminación de tóxicos

Test rápido para la FML

Paredes de levadurasBentonitaH2O2

Adecuada elección de la cepaNutriciónControl de temperaturaAdaptación de la cepa a las condiciones del vino


Espontánea Inoculada

ImpredecibleLargos retrasos

Costo Riesgo alteración (Brett)

FML sp -Aminas biógenas

Disminución de la calidad sensorial

Medio poco favorable

Falta de adaptación

Bacterias no autóctonas

Implantación deficiente

Inadecuada activación

ProblemasUso de inóculos comerciales

Optimizar el tiempo de inoculación

Tiempo de inoculación

Inoculación temprana

Inoculación tardía

Simultáneamente con laslevaduras o

tempranamente en la FA

Después de completarsela FA

Co-inoculación – experimentación desde 2004

Impacto sobre:

• viabilidad de las levaduras y FA • viabilidad de las BAL y FML. • producción de acido acético• características físico-químicas y organolépticas de los vinos Malbec.

• Comparar los resultados obtenidos con co-inoculación con la práctica tradicional de inoculación secuencial (al final de la fermentación alcohólica) utilizando inóculos 1-Step y MBR.

Objetivo:

Evaluar la factibilidad de la co-inoculación en mostos tintos

Variables:

Distintas cepas de BAL MBR y en diferentes combinaciones con levaduras (paper)

Cepas MBR y pre-aclimatadas

Tiempo óptimo de inoculación temprana (24 hs y 48 hs)

Co-inoculación – ensayos 2007

- Malbec 1 = 3,6- Malbec 2 = 3,8

D254 + Alpha 1-Step

Inoculaciónsimultanea

Inoculaciónsecuencial

24 y 48hs Control MBR

Tiempo para alcanzar concentraciones de ácido málico menores a 0,1 g/L en los mostos Malbec 1 y 2

Final FA 13 días

Mosto

Tratamiento Tiempo de FML

desde inoculación (días)

Tiempo total de fermentación

(FA+FML)(días)

24 8 13 48 5 13 FA 1-Step 6 19

1

FA MBR 8 20

24

8

13

48 5 13 FA 1-Step 6 19

2

FA MBR 8 20

Levaduras y fermentación alcohólica

Malbec 1

0,98

1

1,02

1,04

1,06

1,08

1,1

1,12

0 2 4 6 8 10 12 14Tiempo (días)

De

nsid

ad

24-1 48-1FA 1-Step-1 FA MBR-1

Malbec 2

0,98

1

1,02

1,04

1,06

1,08

1,1

1,12

0 2 4 6 8 10 12 14Tiempo (días)

De

nsid

ad

24-2 48-2FA 1-Step-2 FA MBR-2

Seguimiento de la fermentación alcohólica realizada en los mostos 1 y 2 por la levadura ICV D254 y la bacteria Uvaferm Alpha 1-Step inoculada en distintos tiempos (24, 48 y FA 1-Step) y su control MBR inoculada al final de la FA (FA-MBR).

Malbec 1-24

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Tiempo (días)

Lo

g U

FC

/mL

0

0,3

0,6

0,9

1,2

1,5

1,8

2,1

2,4

2,7

3

L-m

álico

(g/L

)

Malbec 1-48

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Tiempo (días)

Lo

g U

FC

/mL

0

0,3

0,6

0,9

1,2

1,5

1,8

2,1

2,4

2,7

3

Ác

ido

L-m

álico

(g

-L)

Malbec1 -FA 1-Step

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 3 6 9 12 15 18 21 24

Tiempo (días)

Lo

g U

FC

/mL

0

0,3

0,6

0,9

1,2

1,5

1,8

2,1

2,4

2,7

3

Ác

ido

L-m

álico

(g/L

)

Final FA Inoculación BAL

Malbec 1 - FA MBR

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 3 6 9 12 15 18 21 24

Tiempo (días)L

og

UF

C/m

L

0

0,3

0,6

0,9

1,2

1,5

1,8

2,1

2,4

2,7

3

Ác

ido

L-m

álico

(g

-L)

ICV D254 1-Step Ácido L-málico

Degradación del ácido L-málico y viabilidad de Saccharomyces cerevisiae (ICV D254) y Oenococcus oeni(Uvaferm Alpha 1-Step y MBR) en el mosto 1 (pH 3,6) en distintos tiempos de inoculación. 24: 1-Step adicionada a las 24 horas, 48: 1-Step adicionada a las 48, FA 1-Step: 1-Step adicionada al final de la FA y FA MBR: cepa MBR adicionada al final de la FA. La línea de puntos indica la población de BAL nativas previas a la inoculación con la cepa comercial

Mosto Tratamiento Acido D-Láctico

(g/L)

24 0,134 48 0,170

FA 1-Step 0,138 1

FA MBR 0,141

24 0,064 48 0,080 FA 1-Step 0,070

2

FA MBR 0,083

Evaluación del consumo de azúcares

Malbec 1

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24Tiempo (días)

AV

(g

/L a

cé

tic

o)

24-1 48-1FA 1-Step-1 FA MBR-1

Malbec 2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24Tiempo (días)

AV

(g

/L a

cé

tic

o)

24-2 48-2FA 1-Step-2 FA MBR-2

Producción de ácido acético en mostos 1 y 2 fermentados con la levadura ICV D254 inoculados con la bacteria láctica comercial Uvaferm Alpha 1-Step en distintos tiempos (24, 48 y FA 1-Step) y su control MBR inoculada al final de la FA (FA MBR).

Mosto

Tratamiento

Acidez

Volátil (g/L ac. acético)

Acidez total

(g/L ac. tartárico)

pH Etanol (% v/v)

Azúcares

reductores (g/L)

24 0,71 5,11 3,70 14,13 1,67 48 0,70 4,94 3,76 14,54 1,53 FA 1-Step 0,65 4,57 3,88 14,84 1,61

1

FA-MBR 0,68 4,72 3,85 14,87 1,95

24

0,80

5,08

3,83

14,26

1,69

48 0,60 4,51 3,95 14,72 1,83 FA 1-Step 0,70 4,62 3,93 14,97 2,03

2

FA-MBR 0,62 4,54 3,92 15,08 1,95

Valores físico-químicos finales de los vinos Malbec 1 y 2 fermentados con la levadura ICV D254 y labacteria Uvaferm Alpha 1-step inoculada en distintos tiempos (24, 48 y FA 1-Step) y su control MBRinoculada al final de la FA (FA MBR).

Fig. Nº1: Descriptores organolépticos de vinos Malbec pH 3,6. Medias correspondientes a 11 degustadores. INTA. 2007.

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

Intensidad de color

Matiz violeta

Intensidad aromática global

Frutal

Láctico

Reducido

Amargo

Astringencia

24 48 F1 FMBr

Parámetros como la viabilidad de las levaduras yperformance de la FA no fueron negativamente afectados.

En sólo un caso se observó un leve aumento en la acidez volátilfinal de los vinos comparado con los tratamientos control (dentro delos límites tolerados).

El análisis sensorial de los vinos mostró algunas diferenciassignificativas las cuales en general se presentaron a favor de lainoculación temprana con las cepas pre-aclimatadas

•Óptimo comportamiento para ser utilizados en inoculación temprana.• Buena adaptación tanto en mosto como en vino.• Rápida degradación del ácido málico.

Los inóculos de bacterias 1-Step previamente aclimatados presentan:

Conclusiones

Intentar que la FML finalice conjuntamente con la FA o días después

Evaluar el riesgo de las fermentaciones languidecientes

Mejor resistencia a los inhibidores (pesticidas)

Poco consumo de azucares (ácido D-láctico)

Cepas preaclimatadas mas rápidas que cepas de inoculacióndirecta

Importante la matriz y la elección de la cepa de levadura

Control de población nativa de BAL

Desarrollo exitoso de la FML

No afecta perfil sensorial o mejora preferencia consumidor

Consideraciones

Muchas gracias !!!

[email protected]

BACTERIAS ACIDO LACTICAS Y FERMENTACION … · Eflujo de protones requiere ATP ... Fuerza protón...

Documents

Transcript of BACTERIAS ACIDO LACTICAS Y FERMENTACION … · Eflujo de protones requiere ATP ... Fuerza protón...