DANIELA MARTÍNEZ RIVERASANTIGO MORENO RAMÍREZ

Tercer SemestreUPB

INTRODUCTIONThe analysis of microbial genomes allows identification of particular characteristics in genomes like:

Species Gender Taxonomy

Taxonomy: classification of microorganisms by common characteristics

A method for identifying these characteristics is through

molecular markers

Molecular markers:

They are biomolecules that are associated with a specific trait in the genome, they can be:1. Proteins2. DNA

In this process the DNA was used as molecular marker through overlapping genes.

Is the use of two different coding sequences of genes for the production

of multiple products , this overlap is heritable.

Gender: Burkholderia

Genome : DNA sequence coding for protein synthesis

Why Burkholderia?

Because the Burholderia has a conservative overlap in the genomes of the complex Burkhoderia cepacia (Bcc).

In addition…

The burkhodelia is a gram negative bacteria that is composed of several species with pathogenic capacity present in cystic fibrosis (CF).

macC

hisH

macC = membrane proteins with a function of multiple antibiotic resistance.

hisH = Imidazole glycerol phosphate synthase subunit HisH. Lipid metabolism.

Used methods :

1. MALDI TOF MS:   is a soft ionization technique used in mass spectrometry, allowing the analysis of biomolecules like proteins and DNA, also allow to identify macromolecules.

2. MLST: Multilocus sequence typing, genetic technique for taxonomic characterization of bacteria and microorganisms. The procedure characterizes isolates of microbial species using the DNA sequences of internal fragments of multiple housekeeping genes.

3. PCR

OBJECTIVE

Develop new molecular markers for the overlapping genes in order to specifically identify bacteria.

MATERIALES Y MÉTODOS Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento:

Origen clínico o ambiental

Cepas involucradas:

1. Cepas Bcc, 18 especies, para identificación previamente se usó recA (proteína multifuncional capaz de reconocer similitudes en secuencias de AND).

2. 3 cepas de Ralstonio.

3. 3 cepas de Cupriavidus.

4. Cepas ambientales de diferentes bacterias por CRA-ABP. 5. Cepas de origen clínico de pacientes con FC las cuales fueron

recogidas en una prueba de esputo a través de un cultivo, luego se le aplico MALDI TOF para la identificación bacteriana, dichos pacientes pertenecían al Hospital Infantil Anna Meyer.

Medios de cultivo:

1. Cepas Bcc medio agar.

2. Cepas ambientales Medio de cultivo Tryptic soy Agar (TSA).

3. Cepas de origen clínico de pacientes con FC Medio de cultivo TSA.

PCR ( Reacción en Cadena de la Polimerasa)

Clonación,Amplificación in vitro de un gen

o fragmento de DNA (directa) o RNA (indirecta)

Kary Mullis

=# de copias de una secuencia

Generalidades:

1. Desnaturalización DNA en hebras sencillas.

2. Alineamiento/Hibridación: Primer’s.

3. Síntesis/Replicación por la DNA Polimerasa (Taq Polimerasa) a partir de un priemer, dirección 5’-3’.

Características:

1. Rendimiento: cada producto sirve de molde para el siguiente.

2. Duración: depende de la secuencia a amplificar.

3. Especialidad: elevada.

4. Capacidad de detección: alta, hasta 1 molécula de DNA en cualquier tipo de muestra.

5. Fidelidad: copia con precisión y sin mutaciones.

Recuperación MacC-hisH BLAST

programa capaz de comparar una secuencia problema con una gran cantidad de secuencias que se encuentren en una base de datos (NCBI) encontrando así homólogos.

Secuencias problema

1. Burkholderia2. Ralstonia3. Capriavidus

Diseño de primers

FOR BURK REV_UN Reconocen la superposición

RESULTADOS

Fig. 1. Bacterial identification based on the use of overlapping genes.

Fig. 3. Las muestras de ADN de electroforesis en gel de agarosa amplificaron mediante PCR utilizando el conjunto de cebadores FOR_BURK y REV_UN

a) Ejemplo de los resultados obtenidos para Burkholderia ( muestras 1-12) y las cepas Ralstonia y Cupriavidus ( muestras 13-15) .

b ) Ejemplo de los resultados obtenido a partir de una selección de cepas bacterianas ambientales

c ) Ejemplo de los resultados obtenido a partir de una selección de diferentes patógenos incluyendo cepas de Burkholderia CF .

d) Resultados obtenido a partir de 8 muestras directamente extraídos del esputo de pacientes con FQ, positivo resultados sólo para la muestra 6. M = GeneRuler 1 kb escalera del ADN ( Thermo Scientific )

DISCUSIÓNAgree Desagree

CONCLUSIONS1. The overlapping proved a good molecular marker

for bacterial identification.

2. The PCR is an efficient and accurate method for amplification of specific sequences of DNA that were necessary in this case for bacterial identification.

3. The PCR is a good specific molecular marker and it can give us a new way to recognize organisms with similar genes.

4. Although two gens could be overlappings that not mean they are from the same cluster.