Bacillus Thuringiensis y Control de Tuta Absoluta[1]
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BacillusthuringiensisyelcontroldeTutaabsolutaBOOKAPRIL2012
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2AUTHORS,INCLUDING:
JavierAdolfoHernandezFernandezJorgeTadeoLozanoUniversity33PUBLICATIONS10CITATIONS
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Availablefrom:JavierAdolfoHernandezFernandezRetrievedon:08October2015
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Bacillus thuringiensis y CONTROL DE Tuta absoluta
LORENA RAMREZ REYES
NATALIA RAMREZ HERNNDEZ
JAVIER HERNNDEZ FERNNDEZ
Universidad Jorge Tadeo Lozano, Facultad de Ciencias e Ingeniera,
Laboratorio de Biologa Molecular, Grupo de Investigacin, Gentica &
Biologa Molecular GENBIMOL, Carrera 4 No 22-61 Piso 6 Modulo 7,
Bogot Colombia, Suramerica
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TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIN ................................................................................................. 14 2. MARCO TERICO .............................................................................................. 16
2.1. El cultivo del tomate en Colombia. ............................................................ 16
2.1.1. Generalidades del tomate .................................................................... 17
2.1.2. Clasificacin taxonmica del tomate .................................................. 18
2.1.3. Plagas del tomate .................................................................................. 18
2.2. El cogollero del tomate (Tuta absoluta) .................................................... 18
2.2.1. Clasificacin taxonmica de Tuta absoluta ....................................... 19
2.2.2. Descripcin y ciclo de vida de Tuta absoluta .................................... 20
2.2.3. Mtodos de control de Tuta absoluta ................................................. 23
2.2.4. Enemigos naturales de Tuta absoluta ............................................... 23
2.3 La bacteria entomopatgena Bacillus thuringiensis ................................. 23
2.3.1 Caractersticas generales de Bacillus thuringiensis (Bt) .................. 23
2.3.2. Clasificacin taxonmica de Bacillus thuringiensis.......................... 24
2.3.3. Bacillus thuringiensis en el medio ambiente .................................... 25
2.4. Intercambio gentico .................................................................................... 26
2.4.1. Conjugacin ........................................................................................... 27
2.4.2. Intercambio intra e interespecfico ...................................................... 27
2.5. Las Delta-endotoxinas ................................................................................. 28
2.5.1. Clasificacin de las -endotoxinas de B. thuringiensis ................... 28
2.5.2. Genes que codifican protenas con actividad insecticida ............... 34
2.5.3. Organizacin y estructura tridimensional de las protenas Cry ..... 36
2.5.4. Mecanismo de accin de las protenas insecticidas de cristal (ICPs) ................................................................................................................ 38
2.5.5. Aplicaciones biotecnolgicas .............................................................. 40
2.6. Tcnicas moleculares .................................................................................. 42
2.6.1. Electroforesis de protenas (SDS-PAGE): ........................................ 43
2.6.2. La Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) ............................ 43
3. FORMULACIN DEL PROBLEMA .................................................................. 46 4. JUSTIFICACIN .................................................................................................. 47 4. OBJETIVOS .......................................................................................................... 50
4.1. Objetivo general ............................................................................................ 50
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4.2. Objetivos especficos ................................................................................... 50
5. MATERIALES Y MTODOS ............................................................................. 51 5.1. Ubicacin del sitio de trabajo ...................................................................... 51
5.2. Cepas de referencia ..................................................................................... 51
5.3. Obtencin de muestras de suelos, rea de estudio................................ 51
5.5 Caracterizacin microscpica de aislamientos nativos ........................... 53
5.6. Caracterizacin bioqumica SDS-PAGE ................................................... 54
5.6.1. Obtencin de extractos crudos ........................................................... 54
5.6.1.1 Medio de cultivo LB 7 das ................................................................ 54
5.6.1.2 Medio de cultivo LB 20 das .............................................................. 55
5.6.1.3. Medio de cultivo LB y muestras con adicin de Urea, Na2CO3 y NaOH .................................................................................................................. 55
5.6.1.4. Medio de cultivo LB modificado con adicin de Sulfato de Amonio ............................................................................................................... 56
5.7. Caracterizacin molecular ........................................................................... 56
5.7.1. Extraccin de ADN ................................................................................ 56
5.7.2. Amplificacin por PCR de genes cry1. .............................................. 56
5.7.3. Estandarizacin de la amplificacin de genes cry1 ......................... 58
5.7.4. Estandarizacin de la amplificacin de genes cry1 especficos .... 58
5.7.5. Electroforesis de ADN en gel de agarosa ......................................... 59
5.8. Cuantificacin de Protenas de Extractos crudos.................................... 59
5.8.1. Obtencin de Extractos crudos ........................................................... 59
5.8.2. Cuantificacin de protenas totales en los extractos crudos por la tcnica de Bradford .......................................................................................... 60
5.9. Caracterizacin Biolgica ............................................................................ 60
5.9.1. Cra de Tuta absoluta .......................................................................... 60
5.9.2. Experimentos para la estandarizacin del sistema de bioensayo 62
5.9.3. Evaluacin de bacilos nativos preseleccionados ............................. 66
5.9.4. Determinacin de la concentracin letal 50 (CL50) .......................... 67
5.10. Conformacin de un Banco de Bacilos Nativos Esporulados ............. 68
6. RESULTADOS Y DISCUSIN .......................................................................... 69 6.1. Aislamiento de cepas a partir de muestras de suelo en 4 departamentos de Colombia .............................................................................. 69
6.2. Caracterizacin microscpica ..................................................................... 71
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6.3. Caracterizacin bioqumica ......................................................................... 77
6.3.1. Estandarizacin de electroforesis de protenas en geles de poliacrilamida .................................................................................................... 78
6.3.2. Electroforesis en geles de poliacrilamida de los extractos crudos de los bacilos nativos esporulados ................................................................ 82
6.4. Caracterizacin Molecular ........................................................................... 86
6.4.1. Extraccin de ADN ................................................................................ 86
6.4.2. Estandarizacin de la amplificacin de genes cry1 ......................... 87
6.4.3. Amplificacin de genes cry1 en bacilos nativos esporulados ........ 89
6.4.4. Estandarizacin de la amplificacin de genes cry1 especficos .... 92
6.4.5. Amplificacin de genes cry1 especficos en bacilos nativos esporulados. ...................................................................................................... 97
6.5. Seleccin de bacilos nativos para el montaje de bioensayos contra Tuta absoluta ...................................................................................................... 103
6.6. Obtencin y Cuantificacin de Protenas totales de los extractos crudos en bacilos nativos esporulados ........................................................... 105
6.7. Caracterizacin Biolgica .......................................................................... 106
6.7.1 Cra de Tuta absoluta .......................................................................... 106
6.7.2. Estandarizacin del bioensayo ......................................................... 108
6.7.3. Bioensayos discriminatorios para la evaluacin de bacilos nativos esporulados preseleccionadas ..................................................................... 112
6.8. Conformacin de un Banco de bacilos nativos esporulados ............... 124
7. CONCLUSIONES .............................................................................................. 125 8. RECOMENDACIONES ..................................................................................... 128 9. REFERENCIAS .................................................................................................. 129
10. ANEXOS ............................................................. Error! Marcador no definido.
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NDICE DE TABLAS
Tabla 1. Proteinas Cry y Cyt producidas por las diferentes variedades de B. thuringiensis. .......................................................................................................... 29 Tabla 2. Protenas Cry con actividad especfica contra un orden de insecto. ......... 35 Tabla 3. Superficie global de cultivos transgnicos en 2006: por pas (millones de hectreas)............................................................................................................... 42 Tabla 4. Condiciones empleadas en PCR y PCR mltiplex (Elnifro et al., 2000) .... 45 Tabla 5. Secuencia y posicin de los oligonucletidos universales que reconocen 25 genes de la familia cry1. (Bravo et al., 1998) .......................................................... 57 Tabla 6. Secuencia y posicin de los oligonucletidos especficos, diseados en secuencias conservadas para cada gen especfico, se presenta el tamao del producto amplificado (Cern et al., 1994). .............................................................. 58 Tabla 7. Departamento, municipio y nmero de aislamientos nativos, a partir de las muestras de suelo analizadas. ................................................................................ 70 Tabla 8. Municipio, nmero y grupo de cristales de bacilos esporulados aislados presentes en muestras de suelo analizadas. I) Am; II) Am, bp y rd; III) Am y cd; IV) Am y rd; V) Am, rd y cd; .......................................................................................... 75 Tabla 9. Relacin entre los pesos moleculares de las protenas reveladas en cada uno de los bacilos nativos esporulados y el/o los grupos de actividad biolgica establecidos. ........................................................................................................... 84 Tabla 10. Porcentaje de cepas con presencia del gen cry1 por municipio en cada departamento. ........................................................................................................ 92 Tabla 11. Variables utilizadas en los experimentos 4 y 5, para la estandarizacin de las condiciones de la M-PCR para la mezcla de oligonucletidos A y B ................. 97 Tabla 12. Perfil de genes cry1 especficos identificados en bacilos nativos esporulados en cada uno de los municipios muestreados. ................................... 101 Tabla 13. Caracterstica de las Cepas nativas de Bacillus thuringiensis aisladas de suelos colombianos seleccionados por sus caractersticas de presencia y numero de cristales, tamao de las protenas reveladas y presencia de genes cry1 especficos para bioensayos. .................................................................................................. 105 Tabla 14. Concentracin de protena total del extracto crudo de 10 cepas de B. thuringiensis escogidos para el bioensayo. .......................................................... 106 Tabla 15. Concentraciones letales 50 (CL50) de las cepas nativas y de referencia. Cepa 11, Cepa 39 y Bt var. kurstaki HD1, sobre larvas de 2do instar de Tuta absoluta, con lmites de confianza al 95% ............................................................ 120
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NDICE DE FIGURAS
Figura 1. Dao causado por Tuta absoluta en hojas de tomate. .......................... 17 Figura 2. Ciclo biolgico de Tuta absoluta. ............................................................ 22 Figura 3. Micrografa de transmisin electrnica de B. thuringiensis. .................... 25 Figura 4. Estructura tridimensional de protena Cry1Aa. ....................................... 36 Figura 5. Alineamiento de las protenas Cry que revela la posicin de los 5 bloques conservados. .......................................................................................................... 38 Figura 6. Mecanismo de accin de las -endotoxinas. .......................................... 39 Figura 7. Zonas de recoleccin de muestras de suelo en Colombia. ..................... 52 Figura 8. Cmara de cra del insecto Tuta absoluta. ............................................. 61 Figura 9. Experimento 1: inmersin de hojas de plantas de tomate en diluciones de los productos comerciales Dipel, Xentari y Turilav. ................................................. 63 Figura 10. Experimento 2: aspersin con aergrafo de hojas de tomate, con las diluciones de los insecticidas biolgicos Dipel, Xentari y Turilav. ............................ 64 Figura 11. Experimento 3: Frascos con foliolos de plantas de hojas de tomate colocadas a maera de florero, con las diluciones de los insecticidas biolgicos Dipel, Xentari y Turilav. ..................................................................................................... 65 Figura 12. Experimento 4: Medio de cultivo extracto de hojas de tomate. ............. 65 Figura 13. Experimento 5: inmersin de hojas de plantas de tomate en dilucin de los productos comerciales Dipel, xentary y Turilav. ................................................. 66 Figura 14. Cultivo por aislamiento de un bacilo nativo esporulado. ....................... 69 Figura 15. Porcentaje de las diferentes formas de cristales observadas en los bacilos nativos esporulados. ................................................................................... 72 Figura 16. Grupo o perfiles de los bacilos nativos esporulados de acuerdo a la forma del cristal observado. .................................................................................... 73 Figura 17. Diferentes formas de cristal observadas en los bacilos nativos esporulados aislados. ............................................................................................. 76 Figura 18. Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE. Bacilos nativos esporulados y cepa de referencia HD1 cultivados en medio LB 20 das. ................ 79 Figura 19. Electroforeis de protenas en gel de poliacrilamida SDS-PAGE, un bacilo nativo esporulado y una cepa de referencia HD1 cultivados en medio LB por triplicado con tres tramientos distintos Urea, Na2CO3 y NaOH. ............................... 80 Figura 20. Electroforeis de protenas en gel de poliacrilamida SDS-PAGE, medio de cultivo LB modificado. ............................................................................................. 81 Figura 21. Perfil electrofortico de protenas SDS-PAGE en cepas de referencia Bt var. kurstaki HD1, y algunos bacilos nativos esporulados. ...................................... 82 Figura 22. a) ADN general de bacilos nativos esporulados (1-11), con el mtodo Kit ULTRA CLEAMTMMicrobial isolation Kit b. ADN plasmdico. Bacilos nativos esporulados (1-11), con el mtodo Kit ULTRA CLEAMTMMicrobial isolation Kit. Gel de agarosa al 1% teida en bromuro de etdio. ....................................................... 87 Figura 23. Amplificacin de fragmentos por PCR de genes cry1 utilizando los oligonucletidos universales Bravo et al. (1998). .................................................... 90 Figura 24. Productos amplificacidos por PCR mltiple para identificar fragmentos de genes cry1Aa (246 pb), cry1Ab (216 pb), cry1Ac (180 pb) (Mezcla A) y cry1B (367 pb), cry1C (130pb), cry1D (290 pb) (Mezcla B). .............................................. 93
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Figura 25. Productos amplificados de ADN por PCR para genes cry1 especficos en cepas de referencia. .......................................................................................... 94 Figura 26. Productos de amplificacin por PCR de genes cry1 especficos en cepas de referencia y cepas nativas. ................................................................................ 96 Figura 27. Productos de la amplificacin por PCR de genes especficos cry1 en cepas de referencia y cepas nativas, utilizando la mezcla A de oligonucletidos. ... 98 Figura 28. Productos de la amplificacin por PCR de genes especficos cry1 en cepas de referencia y cepas nativas, utilizando la mezcla B de oligonucletidos. ... 99 Figura 29. Distribucin del nmero de bacilos nativos esporulados con presencia de genes cry1 especifcos en XIV grupos. ............................................................ 100 Figura 30. Instares larvales de Tuta absoluta. ..................................................... 108 Figura 31. Porcentaje de mortalidad de los productos comerciales Dipel, Turilav y Xentary, sobre larvas de 2do instar de Tuta absoluta. .......................................... 112 Figura 32. Mortalidad de las larvas de Tuta absoluta tratadas con los diferentes bacilos nativos esporulados. ................................................................................. 114 Figura 33. Mortalidad de las larvas de Tuta absoluta tratadas con los diferentes extractos crudos de los bacilos nativos esporulados, prueba de Tukey 95% de confianza. ............................................................................................................. 115 Figura 34. Mortalidades obtenidas en la evaluacin dosis- respuesta de los bacilos nativos esporulados sobre larvas de T. absoluta. a. bacilo nativo 11. b. bacilo nativo 39. c. Cepa de referencia HD1. .................................................................. 118 Figura 35. Mortalidad corregida de las cepas nativas 11 y 39 y la cepa de referencia HD1 a las diferentes dosis evaluadas. Tratamientos con la misma letra no son significativamente diferentes segn la prueba de comparacin de medios de Tukey (95%) ......................................................................................................... 121 Figura 36. Larva de Tuta absoluta muerta debido a intoxicacin con el complejo espora-cristal (extracto crudo). ............................................................................. 122 Figura 37. Prueba confirmatoria: bacilos nativos esporulados, aislada del insecto plaga Tuta absoluta. ............................................................................................. 123 Figura 38. Banco cepas de Bacilos Gram positivos esporulados. ....................... 124
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NDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Preparacin de geles y reactivos para electroforsis de SDS-page . Error! Marcador no definido. Anexo 2. ULTRA CLEANTM MICROBIAL ISOLATION KIT DE LA CASA COMERCIAL BIO-LINE ............................................. Error! Marcador no definido. Anexo 3. KIT, ULTRA CLEANTM 6 MINI PLASMID PREP KITTM DE LA CASA COMERCIAL BIOLINE ............................................. Error! Marcador no definido. Anexo 4. SOFTWARE VISION WORK AND ANALISYS VERSIN 6.4.3 UVP LSC. USA ........................................................................... Error! Marcador no definido. Anexo 5. Curva de calibracin para la determinacin de protenas por el mtodo de bradford ..................................................................... Error! Marcador no definido. Anexo 6. Caracterizacin macroscopca y microscpica de los aislamientos nativos .................................................................................. Error! Marcador no definido. Anexo 7. Cuantificacin microscpica y caracterizacin bioqumica y molcular de aislamientos nativos de bacilos esporulados ............. Error! Marcador no definido. Anexo 8. Estandarizacin Bioensayo ........................ Error! Marcador no definido. Anexo 9. Evaluacin de cepas .................................. Error! Marcador no definido. Anexo 10. Anlisis estadstico de cepas preseleccionas ........... Error! Marcador no definido. Anexo 11. Prueba de Probit para la cepas nativas 11, 39 y la cepa de referencia HD1. Biostat 2007. ..................................................... Error! Marcador no definido. Anexo 12. Anlisis estdistco de la eficacia de las cepas nativas 11 y 39 y la cepa de referencia HD1 a las diferentes dosis evaluadas. . Error! Marcador no definido.
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LISTA DE ABREVIACIONES
MIP: Manejo Integrado de Plagas
m.s.n.m : metros sobre el nivel del mar
ha: Hectreas
ton: Toneladas
T: Temperatura
ml: Mililitros
l: Microlitros
g/ml: microgramo por mililitro
aa: Aminocidos
C: grados centgrados
r.p.m: revoluciones por minuto
Agua dd: Agua destilada desionizada
h: Horas
nm: Nanmetros
L. esculentum: Lycopersicum esculentum
T. absoluta: Tuta absoluta
var: Variedad
LB: Agar Luria Bertani
Bt: Bacillus thuringiensis (B. thuringiensis)
ICPs: Protenas Insecticidas de Cristal (del ingles Insecticidal Crystal
Proteins)
cry: Genes del cristal
Cyt: Protena Insecticida con actividad citoltica
Cry: Protenas del cristal
- endotoxina Delta endotoxinas
VIP:
Protenas insecticida que se forman en la fase vegetativa de
crecimiento
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SDS-PAGE: Electroforesis de Protenas en condiciones denaturantes
kDa: Kilodaltons
SDS: Lauril sulfato sdico
PCR: Reaccin en cadena de la Polimerasa
pb: Pares de bases
ADN: cido desoxirribonucleico
mM: Milimolar
M: Micromolar
dNTPs: Desoxirribonucletidos
U: Unidades
DTT: Ditiotreitol
PMSF: Fenil metil sulfanil floruro
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RESUMEN
En Colombia, gran diversidad de insectos plaga afectan el cultivo de tomate, entre los que se destaca la polilla del tomate (Tuta absoluta Meyrick). El dao es causado por las larvas que atacan el follaje formando minas y barrenan las nervaduras, las ramas y tallos, e inclusive producen la cada de flores y frutos. Para su control, los agricultores utilizan principalmente insecticidas qumicos, que ocasionan efectos nocivos al ambiente y a la salud humana. El control biolgico surge como alternativa, y dentro de los posibles controladores biolgicos se encuentra Bacillus thuringiensis (Bt) dominando el 90% del mercado mundial de bioplaguicidas. La investigacin en este controlador microbial avanza aceleradamente en el mundo y continuamente se estn buscando nuevos aislamientos en condiciones naturales. Se considera que Colombia por su gran biodiversidad, tiene enorme potencial para esta busqueda. En el presente estudio, se recolectaron 28 muestras de suelo en 14 municipios en Colombia. Se aislaron 99 bacilos nativos esporulados que presentaron diversidad morfolgica encontrando cristales con formas amorfas, bipiramidal, cuadradas, redondas y triangulares. Se observaron bacilos con 1, 2, 3 y 4 formas de cristal, establecindose 18 perfiles diferentes. Los aislamientos positivos para cristales se sometieron a una caracterizacin bioqumica por medio de electroforesis de protenas totales (SDS-PAGE). Para estandarizar la obtencin de extractos crudos de protenas totales de los bacilos nativos esporulados, se evaluaron 4 mtodos: 1) Medio de cultivo LB 7 das; 2) Medio de cultivo LB 20 das; 3) Medio LB con adicin de Urea, Na2CO3, NaOH y 4) Medio LB modificado. El cuarto mtodo present la mejor resolucin de las bandas de protenas en geles de poliacrilamida. Se evidenciaron bandas de protenas de 10 a 150 kDa, por SDS-PAGE, que se clasificaron en 7 grupos de acuerdo a la relacin entre peso molecular y posible actividad biolgica. Se encontraron bacilos nativos esporulados que revelaron con notoriedad y abundancia ms de una banda de protena en su patrn electrofortico, encontrando 28 perfiles diferentes. La caracterizacin molecular por PCR utilizando oligonucletidos generales amplific fragmentos para la presencia de genes cry1 en 35 cepas nativas de B. thuringiensis. El ADN de estos 35 bacilos fue sometido a dos rondas de PCR Mltiple con 2 mezclas de oligonucletidos especficos, reconociendo 6 genes especficos. En los bacilos nativos se amplificaron los genes cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1B, cry1C y cry1D en el 76, 26, 21, 35, 32, y 8,8% respectivamente. De acuerdo a estas caracterizacion se seleccionaron 10 cepas nativas de B. thuringiensis como promisorios para el control de Tuta absoluta y se probaron contra larvas de 2do instar de este insecto plaga. Para estandarizar el sistema de bioensayo se evaluaron cinco mtodos con tres productos comerciales, (Bioinsecticidas basados en cristales y esporas de B. thuringiensis) Dipel, Turilav y Xentari: 1) Inmersin de la hoja; 2) Aspersin por aergrafo en hojas de tomate; 3) Frascos con foliolo de plantas de tomate; 4) Medio de cultivo extracto hojas de tomate y 5) Recipientes plsticos. La metodologa ptima para realizar los bioensayos con Tuta absoluta fue la nmero 1, sumergiendo las hojas en el producto a evaluar, con un 96% de supervivencia del testigo y 100% de mortalidad, a una concentracin de 2,5 g/L del producto comercial Dipel. Los bacilos nativos ZBUJTL39 y ZCUJTL11 presentaron mejor actividad biolgica que la cepa de referencia Bt var kurstaki HD1. El bacilo nativo ZCUJTL11 present una CL50 de 2,4 g/ml (P
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Tuta absoluta, es promisorio para posteriores investigaciones como la produccin de un biopesticida o en ingeniera gentica de tomate, para la obtencin de cultivares autorresistentes a Tuta absoluta.
ABSTRACT
In Colombia, among the great diversity of insect pests affecting the tomato crop stands up the tomato moth (Tuta absoluta Meyrick). Damage is caused by larvae which attack the foliage forming auger mines in veins, branches and stems, and even producing flowers and fruit dropping. For its control, farmers mainly use chemical insecticides, which cause adverse effects to the environment and human health. Biological control of pests comes up as alternative, and among many biological agents, Bacillus thuringiensis (Bt) dominate 90% of biopesticide global market. Research on this biocontrol agent is developing faster around the world and novel isolates are being scout continusly. In this study, 28 soil samples were collected in 14 Colombia municipalities and 99 strain native were isolated, which showed morphological diversiity in between their crystals, with, bipiramidal, square, round, triangular and amorphous forms. 1, 2, 3 and 4 forms of, bacilli crystals were observed which conform 18 different profiles. Isolates positive for crystals underwent a biochemical characterization by total protein electrophoresis (SDS-PAGE). To standardize the total protein of strain native collection of crude extracts, 4 methods were evaluated: 1) LB culture medium, 7 days, 2) LB culture medium, 20 days, 3) LB Medium with Urea, Na2CO3 and NaOH addition and 4) Middle LB amended. The fourth method presented the best resolution of protein bands in polyacrylamide gels. Protein bands of 10 to 150 kDa were evidenced by SDS-PAGE and classified into 7 groups according to the relationship between molecular weight and possible biological activity. Some strain native revealed notoriously more than one band of protein electrophoretic pattern with 28 different profiles PCR molecular characterization, using general primers, amplified fragments for cry1 genes presence in 35 strain native. ADN of these 35 bacteria was taken into two rounds of PCR with multiple 2-specific oligonucleotide mixtures, recognizing 6 specific genes. In strain native of Bt, genes cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1B, cry1C and cry1D were amplified, in 76, 26, 21, 35, 32, and 8.8% respectively. According to these characterizations, 10 native isolates were selected as promising for Tuta absoluta control and challenged against 2nd instar larvae. To carry out this procedure five methods were evaluated with three commercial products (based on bioinsecticides crystals and spores of B. thuringiensis: Dipel Turilav and Xentari : 1) immersion of the leaves, 2) by spraying airbrush on tomato leaves, 3) Bottles with leaflets of tomato plants, 4) culture medium of tomato extract leaves and 5) plastic containers. The bioassays optimum methodology to try Bt on Tuta absoluta was method 1, with immersion of leaves into the evaluated product, (96% control survival and 100% mortality at a 2.5 g/L concentration of commercial product Dipel. The strain native ZBUJTL39 and ZCUJTL11, showed better biological activity that the reference strain: Bt var kurstaki HD1. Strain native ZCUJTL11 presented a LC50 of 2.4 mg/ml (P
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1. INTRODUCCIN
El tomate (Lycopersicon esculentum Millano) es uno de los cultivos ms importantes
en Colombia, esta hortaliza presenta gran demanda en la dieta alimenticia y genera
empleo e ingresos, no slo en el campo, sino tambin en la agroindustria. En
Colombia la superficie destinada a este cultivo fue aproximadamente de 15.881
hectreas (ha), con una produccin de 420.419 toneladas (ton) y un rendimiento de
26,5 ton/ha en el ao 2006 (Agronet, 2006).
Esta solancea es afectada por una gran cantidad de plagas y enfermedades dentro
de las cuales se destaca el dao causado por las larvas de Tuta absoluta
(Lepidoptera: Gelechiidae). El cogollero del tomate Tuta absoluta es considerado
una de las principales plagas de gran importancia econmica del tomate en
Colombia, ya que ocasiona prdidas que representan un 27- 43%, debido a que
afecta directamente la produccin del cultivo (Cely et al., 2006), Este dao es
causado por larvas de la plaga, que minan el follaje y los tallos de las plantas, y
atacan las hojas jvenes, ramas, perforando adems flores y frutos (Garca, 1993;
De Vis et al., 2001) lo que ocasiona un debilitamiento gradual en la planta
disminuyendo su potencial productivo (Corporacin Colombiana de Investigacin
Agropecuaria CORPOICA, 2008).
Para su control, los agricultores utilizan principalmente insecticidas qumicos, que
ocasionan efectos nocivos al ambiente, generacin de resistencia, aparicin de
residuos qumicos en los alimentos, contaminacin de las aguas, eliminacin de la
fauna benfica y problemas para la salud humana. El control biolgico surge como
alternativa, y dentro de los posibles controladores biolgicos se encuentra Bacillus
thuringiensis (Bt) que domina el 90% del mercado mundial de bioplaguicidas
(Feiltelson et al., 1992). Bt es una bacteria aerbica, Gram positiva, que se
caracteriza por la produccin de cristales paraesporales, compuestos por Protenas
Insecticidas de Cristal ICPs (del ingles, Insecticidal Crystal Proteins) (Schnepf et al.,
1998), que poseen alta especificidad sobre larvas de insectos de diferentes ordnes.
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La investigacin en este controlador microbial avanza aceleradamente en el mundo
y continuamente se estn buscando nuevos aislamientos en condiciones naturales.
En este trabajo se aislaron y caracterizaron aislamientos nativos de bacilos
esporulados con genes especficos de la familia cry1, con actividad anti lepidptera
a partir de suelos en los que se cultiva tomate en cuatro departamentos de
Colombia: Cundinamarca, en los municipios de Susa y Cha; Boyac, en los
municipios de: Villa de Leyva, Sutamarchn, Raquir y Santa Sofa; Huila, en el
municipio de Garzn; y Santander, en los municipios de: Piedecuesta, Los Santos,
Lebrija, Betulia, Floridablanca, Rionegro y Girn. Se identificaron genes especficos
para poder seleccionar aislamientos nativos de B. thuringiensis y estimar su
potencial sobre larvas de 2do instar de T. absoluta, para de esta manera identificar
bacilos nativos potenciales para el control de esta plaga. Adicionalmente se
conform un banco de bacilos nativos esporulados caracterizados a nivel molecular
de acuerdo a la presencia de genes cry1 como un paso previo a la realizacin de
ensayos biolgicos, que permiten confirmar la efectividad de un aislamiento nativo
en el control de una determinada plaga.
Debido a la importancia que tiene el control de insectos plaga y la necesidad de
proponer alternativas para el control de T. absoluta, la bsqueda en Colombia de
nuevos genes cry que codifiquen para nuevas y novedosas delta-endotoxinas con
un espectro de accin ms amplio, contina siendo un proyecto de gran inters. Por
lo tanto, la variabilidad climtica y la biodiversidad presente en Colombia, aportan
los elementos necesarios para justificar el aislamiento y caracterizacin de bacilos
nativos esporulados que pueden ser la base para el desarrollo de insecticidas
microbiales.
Los resultados parciales de este trabajo de grado han sido presentados en tres
eventos cientficos, uno nacional: el LXIII Congreso Nacional De Ciencias
Biolgicas, Yopal, Casanare, Octubre de 2008; y dos internacionales: Congreso
Colombiano de Biotecnologa, II Seminario Internacional de Bionegocios, Bogot, 29
de Julio al 1 de Agosto de 2008 y XIX Congreso Latinoamericano de Microbiologa,
Quito, Ecuador, Octubre de 2008.
-
16
2. MARCO TERICO
2.1. El cultivo del tomate en Colombia.
El tomate es una hortaliza que pertenece a la familia Solanaceae y al gnero
Solanum (Peralta et al., 2005). Segn Vallejo (1999), el tomate constituye el 30% de
la produccin mundial de hortalizas, con alrededor de 2.9 millones de hectreas (ha)
sembradas. En Suramrica se cultivan aproximadamente 159.500 hectreas en
donde se destacan Brasil y Chile como los mayores productores. Por su parte, en
Colombia hasta el 2006, la superficie destinada a este cultivo fue aproximadamente
de 15.881 hectreas, con una produccin de 420.419 toneladas (ton) y un
rendimiento de 26,5 ton/ha (www.agronet.gov.co). Segn De Vis et al. (2001), en
Colombia la mayora de cultivos de tomate se producen al aire libre y un pequeo
porcentaje se cultiva bajo invernadero. El cultivo bajo invernadero reduce la
incidencia de plagas y enfermedades al permitir controlar las condiciones
ambientales y abre la posibilidad de utilizar con mayor facilidad el control biolgico
para mantener a las poblaciones plaga en niveles bajos.
Existe gran diversidad de enfermedades y plagas que afectan este cultivo y que
disminuyen su productividad al impedir el ptimo desarrollo del fruto. El gusano
cogollero del tomate, T. absoluta, es un lepidptero de la familia Gelechiidae que
ocupa el segundo lugar entre las plagas de importancia de esta solancea despus
de la mosca blanca (Trialeuroudes vaporariorum) (De Vis et al., 2001). El dao se
incrementa a medida que aumenta la temperatura ambiental (De Vis et al., 2001).
T. absoluta acta como: minador de las hojas, barrenador del tallo, perforador del
fruto, y puede tambin causar dao en las flores al hacer galeras dentro de ellas
(Vlez, 1997) (Figura 1). Segn Garca (2002) el dao se inicia en el semillero y
contina en todo el desarrollo de la planta. Las plantas ampliamente infestadas
presentan minas y perforaciones causadas por larvas, como tambin por la toxicidad
de los insecticidas utilizados.
-
17
Figura 1. Dao causado por Tuta absoluta en hojas de tomate.
Se observan larvas consumiendo el mesfilo de la hoja.
2.1.1. Generalidades del tomate
El tomate (Lycopersicum esculentum Mill) es una planta originaria de la planicie
costera occidental de Amrica del sur. Fue introducido por primera vez en Europa a
mediados del siglo XVI y a principios del siglo XIX se comenz a cultivar
comercialmente, luego se inici su industrializacin y la diferenciacin de las
variedades para mesa y para industria (Prez et al., 2002).
El tomate es una planta dicotilednea, perteneciente a la familia Solanaceae y al
gnero Lycopersicum. La especie L. esculentum es la especie ms cultivada y
posee nueve especies silvestres relacionadas. Esta planta es perenne y de porte
arbustivo, puede desarrollarse en forma rastrera, semi recta o erecta. La
temperatura ideal para el cultivo es de 25C. Este factor se considera limitante, al
igual que el exceso de lluvias porque favorece la incidencia de enfermedades en el
cultivo (Vallejo, 1999).
-
18
2.1.2. Clasificacin taxonmica del tomate
Reino: Plantae
Sub reino: Tracheobiota
Divisin: Magnoliopsida
Clase: Asteridae
Orden: Solanales
Familia: Solanaceae
Gnero: Solanum
Especie: S. lycopersicum
2.1.3. Plagas del tomate
El tomate es atacado por un nmero elevado de insectos plaga desde el semillero
hasta la cosecha de los frutos, aunque existen centenares de insectos y caros que
viven del consumo de esta planta, son pocos los que causan daos considerables, y
que en muchas regiones o pocas hacen difcil o casi imposible su cultivo. En
Colombia son cinco los insectos plaga que limitan la produccin y que han
conducido a los agricultores a utilizar deliberadamente insecticidas qumicos
(Vallejo, 1999). Se consideran como importantes, adems del cogollero del tomate
(Tuta absoluta): La Mosca Blanca (Trialeurodes vaporariorum), El Pasador del Fruto
(Neoleucinodes elegantalis Guene), El Minador de la hoja Liriomyza sp., y los
fidos: Aphis gossyppi, Macrosiphum euphorbiae, Myzus persicae.
2.2. El cogollero del tomate (Tuta absoluta)
El cogollero del tomate Tuta absoluta, fue descrito por primera vez por el
entomlogo E. Meyrick (1917) a partir de un ejemplar macho colectado en
Huancayo, Per, denominndolo Phthorimaea absoluta (Rojas, 1981).
Posteriormente, recibi otras cuatro denominaciones: Gnorimoschema absoluta,
Scrobipalpula absoluta, Scrobipalpuloides absoluta y finalmente se la ha ubicado en
el Gnero Tuta (Barrientos, 1997).
-
19
La polilla del tomate (Tuta absoluta Meyrick) est presente en toda Amrica del Sur,
donde se considera plaga clave para el tomate fresco e industrial. Se encuentra
principalmente en las zonas montaosas de los Andes y en Chile se distribuye entre
la Primera y Dcima Regin, en el Archipilago de Juan Fernndez y en la Isla de
Pascua (Uchoa-Fernandes et al., 1995; Artigas, 1994).
El cogollero del tomate T. absoluta es considerado una de las principales plagas del
tomate en Colombia (Corporacin Colombiana de Investigacin Agropecuaria
CORPOICA, 2008), el dao es causado por las larvas que atacan el follaje formando
minas; adems pegan las hojas del cogollo formando una telaraa y barrenan las
nervaduras, las ramas y tallos, e inclusive producen la cada de flores y frutos. Esta
plaga es de gran importancia econmica por que afecta directamente la produccin
del cultivo (Corporacin Colombiana de Investigacin Agropecuaria CORPOICA,
2008). En Colombia, se report la plaga en 1936 en el Valle del Cauca (Garca,
2002). Posteriormente, T. absoluta fue un grave problema para los cultivadores de
tomate en la misma regin entre 1970 y 1974 (Vlez, 1997). Actualmente la plaga
se encuentra presente en los principales departamentos productores de tomate que
son Cundinamarca, Santander, Valle, Caldas, Huila, Risaralda, Antioquia, Atlntico y
Guajira (Corporacin Colombia Internacional, 2006). Es importante anotar que esta
plaga no es exclusiva del tomate, se han reportado daos en plantas de papa,
tabaco y en algunas malezas de la familia Solanaceae (Vlez, 1997; De Vis et al.,
2001).
2.2.1. Clasificacin taxonmica de Tuta absoluta
Orden: Lepidptera
Suborden: Glossata
Familia: Gelechiidae
Gnero: Tuta
Especie: T. absoluta
-
20
2.2.2. Descripcin y ciclo de vida de Tuta absoluta
Durante el ciclo de vida, T. absoluta pasa por cinco estados: huevo, larva, pupa, pre
pupa y adulto. La duracin de estos estados est directamente relacionada con la
dieta a lo largo del desarrollo y factores ambientales como la temperatura (Figura 2).
Segn Vlez (1997) las principales caractersticas de los diferentes estados de T.
absoluta son:
Huevos: Son elpticos, miden en promedio 0.93 mm de largo y 0.23 mm de ancho.
La coloracin inicial es crema y a medida que avanza el desarrollo, se torna
amarillento, al final adquiere una coloracin amarillo naranja. Se encuentran
preferencialmente en el envs de las hojas, pero pueden encontrarse en cualquier
parte de la planta. Los huevos son depositados individualmente a corta distancia
entre ellos. La duracin en este estado es de a 4-8 das en promedio.
Larvas: Los dos primeros instar larvales corresponden a la fase crtica de la
especie, en donde la mortalidad presenta un alto porcentaje (79.8%), esta
mortalidad se debe principalmente a los depredadores y al control qumico. las
larvas tienen un ciclo de13-23 das.
La polilla del tomate presenta cuatro instares larvales bien definidos y diferentes en
tamao y color (Estay, 2000; Fernndez y Montagne, 1990). El primer instar
presenta color blanco y cabeza de color caf oscuro. La forma es cilndrica,
levemente aplastada dorsoventralmente con excepcin de su cabeza que es
prognata (mandbulas salientes), presenta cinco pares de pseudpodos (Vargas,
1970). Despus de la eclosin de los huevos, las larvas buscan un punto de entrada
en las hojas penetrando en la epidermis de la hoja, y en su avance, consumen el
mesfilo produciendo galeras (Fernndez y Montagne, 1990). El tamao de la
galera aumenta a medida que la larva crece y posteriormente, los tejidos se oxidan
y necrosan (Larran, 1992). La larva perfora brotes, flores y frutos, pero prefiere las
hojas en formacin y los racimos florales, pudiendo ocasionar la prdida de un
racimo completo (Lpez, 1991).
-
21
A medida que se alimenta, la larva se va tornando verde. En el momento de la
muda para pasar al segundo instar, la larva se torna nuevamente blanca. La longitud
mxima del primer instar es de aproximadamente 1,61 mm (Vargas, 1970). El
segundo instar mantiene la misma forma descrita anteriormente y cambia de color
verde a color blanco en el momento de la muda, el tamao promedio es de 2,80
mm. La larva de tercer instar presenta inicialmente un color gris blanquecino, luego
cambia a verde y luego a blanco, en el final del periodo, la longitud promedio es de
4,69 mm (Vargas, 1970). Al llegar al cuarto instar aparece una mancha rojiza dorsal
que se extiende desde los ocelos hasta el margen posterior (Gonzlez, 1989). La
larva sigue manteniendo su forma original y alcanza al final de este periodo una
longitud de 7,72 mm (Vargas, 1970). Los frutos son penetrados por las larvas en
estado inmaduro, preferentemente, por el extremo peduncular dejando tneles que
provocan deformaciones, facilitando as el ataque de agentes patgenos,
potenciando su pudricin y dejndolos inservibles comercialmente (Apablaza, 1992).
En ocasiones, la larva puede salir de un fruto para ingresar a otro dentro de un
mismo racimo (Lpez, 1991).
Pupas: La crislida o pupa es de tipo obtecta (se pueden diferenciar patas y alas),
tiene forma cilndrica, es ms ancha en el extremo anterior que el posterior. Su color
es verde en un comienzo y se va tornando a un color caf oscuro a medida que se
aproxima a la emergencia (Estay y Bruna, 2002). Presentan textura lisa y brillante
(Vlez, 1997). Sus dimensiones alcanzan 4,35 mm de largo y 1,10 mm de dimetro
horizontal (Vargas, 1970). La mayora de las veces, se encuentra cubierta de
capullos blancos y sedosos (Apablaza, 1992). En esta fase la larva deja de comer y
forma un capullo, dejndose caer al suelo por medio de un hilo de seda para
desarrollar el periodo de pupa (Vargas, 1970), tiene una duracin de 8-15 das
despus de lo cual emergen adultos completamente formados (Vlez, 1997).
Adultos: Son micro lepidpteros de alrededor de 6 mm de largo. Sus alas son
angostas y las antenas largas y filiformes. La coloracin es crptica con escamas
gris oscuro, caf claro y crema. Los adultos son de hbitos nocturnos pero
presentan una actividad diurna limitada. La cpula se produce en la noche despus
de la emergencia. El perodo de oviposicin dura en promedio 4 das. La longevidad
-
22
promedio de los adultos es de 8.6 das. La proporcin sexual de hembras y machos
es de 1 a 3, y el nmero promedio de huevos por hembra es 52, aunque el
dimorfismo sexual es escaso. Los machos tienen un abdomen gris claro y delgado
mientras que las hembras presentan un abdomen de color blanco crema y ms
ancho que el de los machos. La envergadura alar de las hembras es de 9,0 a 13,0
mm mientras que la de los machos es de 8,5 a 12,0 mm (Vlez, 1997) (Figura 2).
Figura 2. Ciclo biolgico de Tuta absoluta. 1. Los huevos son de forma elptica, de color blanco recin ovipositados, luego se tornan amarillo
o amarillo naranja al aproximarse su eclosin. Son depositados en forma individual sobre la planta. 2. La larva emerge del huevo y busca un punto de entrada, consume el mesfilo y deja reas
traslucidas conocidas como galeras; pasa por cuatro estadios larvales, cambiando de color blanco, verde, gris, rojo. 3. En estado de pre pupa la larva elabora un capullo, empupando en el
suelo. 4. Los adultos son mariposas que miden aproximadamente 6 mm de longitud, los machos
tienen un abdomen gris claro y delgado mientras que las hembras presentan un abdomen de color blanco crema y ms ancho que el de los machos.
-
23
2.2.3. Mtodos de control de Tuta absoluta
Uno de los mtodos ms empleados en Colombia para controlar a los insectos
plaga es el control qumico, en el que se requieren repetitivas aplicaciones de
insecticidas para poder evitar prdidas en la produccin y calidad de los frutos
(Salazar y Araya, 2001). En algunos cultivos del Brasil, se han utilizado mezclas de
insecticidas altamente txicos, como: Tiocyclam, Carbofuram, Metamidofos,
Cypermetrina, Metomil, Cihalotronina, Teflubenzuron, Imidacloprid y
Avermetina, en dosis y frecuencias elevadas (Souza y Reis, 1986), estos
insecticidas no son muy efectivos frente a esta plaga por el tipo de hbitos y biologa
que presenta, adems su uso inadecuado afecta al medio ambiente y provoca la
muerte de fauna natural (Guedes et al., 1994).
2.2.4. Enemigos naturales de Tuta absoluta
Existen tres especies de himenpteros que controlan diferentes estados de la
plaga: Trichogramma petiosum (Riley) y Trichogramma exiguum son parasitoides de
los huevos mientras que Apanteles gelechiidivoris (Marsh) parasita las larvas
presentndose una preferencia por el tercer instar (Escobar et al., 2004). El uso de
estos controladores ha sido muy efectivo. Sin embargo, el entomopatgeno ms
usado y conocido para el control de lepidpteros es la bacteria B. thuringiensis,
debido a que la mayora de sus cepas poseen actividad patgena contra larvas de
este orden, y entre otras cosas no presenta daos al medio ambiente.
2.3 La bacteria entomopatgena Bacillus thuringiensis
2.3.1 Caractersticas generales de Bacillus thuringiensis (Bt)
El inters por los insecticidas microbianos se remonta desde mediados del siglo XIX;
las investigaciones de la enfermedad del gusano de seda Bombix mori efectuadas
por Pasteur en 1849, enfocaron la atencin de los bacterilogos en insectos plagas
y en el descubrimiento de un sin nmero de enfermedades microbianas de insectos.
Ishiwata (1901) aisl una bacteria de un gusano de seda enfermo, denominndola
Bacillus sotto, este acontecimiento marca el comienzo del desarrollo del control
biolgico. En Thuringia, Alemania, Berliner (1911) aisl una bacteria aerbica
-
24
formadora de esporas de una larva enferma de la palomilla de la harina (Ephestia
Kuhniella Zell) y la identific como Bacillus thuringiensis (Ishiwata 1901, Berliner
1911; citado en: Whiteley y Schnepf, 1986; Hannay y Fitz-James, 1995).
Hacia 1936 se introdujo en el mercado el primer producto comercial bajo el nombre
de Sporine cuyo principio activo eran las esporas de B. thuringiensis. Angus (1954),
descubre el papel de la toxicidad de las inclusiones paraesporales o cristales de Bt
en larvas del gusano de seda. Un ao ms tarde, Hannay y Fitz (1955) encontraron
que este cuerpo es el resultado de la cristalizacin de la protena que representa
entre el 20 y el 30% de la protena total despus de la lisis celular y la liberacin de
la espora. (Angus 1954, Hannay y Fitz, 1955; citado en Hfte y Whiteley, 1989).
En 1967 Heimpel propuso la nomenclatura oficial de los cristales en donde se
designa las diferentes toxinas de B. thuringiensis y se da el nombre de -
endotoxina o protena insecticida de cristal (ICP's del ingles, Insecticidal Protein
Crystal). Actualmente se utiliza este trmino para designar el cristal proteico o la
toxina activada (Heimpel, 1967).
Actualmente existen otras designaciones para productos comerciales elaborados
con cepas de B. thuringiensis. Acrobe, Bactospeine, Berliner Dipel, Turilav (var.
Kurstaki), Certan, Xentari (var. aizawai), Javelin, Leptox, Novabac, Teknar, Thuricide
y Victory (var. israelensis) (Whiteley y Schnepf, 1986). Las tpicas formulaciones
agrcolas a base de B. thuringiensis incluyen: polvos, polvos humectables,
granulados y tabletas (Bravo y Cern, 2004).
2.3.2. Clasificacin taxonmica de Bacillus thuringiensis
B. thuringiensis pertenece al orden Eubacteriales, a la familia Bacillaceae, al
Phylum: Firmicutes, a la Clase: Bacilli y al Grupo I del Gnero: Bacillus. Es una
bacteria aerbica, Gram positiva, caracterizada por la produccin de inclusiones
paraesporales durante la fase de esporulacin. Esta inclusin contiene protenas
insecticidas de cristal (ICPSs) (Hofte y Whiteley, 1989), tambin denominadas -
endotoxinas, las cuales son codificadas por los genes cry (Schnepf et al., 1998). Es
-
25
el organismo entomopatgeno ms utilizado para el control de insectos plaga en
diversos cultivos comerciales (Lambert y Peferoen, 1992; Schnepf et al., 1998).
Las clulas vegetativas de B. thuringiensis tienen forma de bastn y oscilan entre 1
a 1,2 micras de ancho y de 3 a 5 micras de largo. Los cristales txicos oscilan entre
0,5 a 1 micra de dimetro (Claus y Berkeley, 1986) (Figura 3).
Figura 3. Micrografa de transmisin electrnica de B. thuringiensis. SP (Espora); PB (Cristal). (De Maagd et al., 2001)
2.3.3. Bacillus thuringiensis en el medio ambiente
B. thuringiensis es una bacteria cosmopolita que se encuentra en ambientes
naturales como suelo, invernaderos, superficies de hojas, conferas e insectos
muertos, pero tambin se encuentra con elevada frecuencia en muestras de agua y
polvo (Martin y Travers, 1989), en diferentes ecosistemas como desiertos, estepas,
bosque tropical hmedo, zona de alta montaa, playas y cuevas. La distribucin de
B. thuringiensis en la naturaleza no es homognea y por lo tanto depende de
condiciones ambientales determinadas. Como el nicho ecolgico de B. thuringiensis
no ha sido determinado, no esta claro si la diversidad del hbitat donde se puede
localizar responde a una amplia versatilidad ecolgica de esta bacteria, o
simplemente esta relacionado con el transporte de las esporas por factores
ambientales (Wasno et al., 1999). B. thuringiensis en diversos estudios ha sido
-
26
aislada de diferentes ambientes como: suelo (Dulmage y Aizawa, 1982; Martn y
Travers, 1989; Bernhard et al., 1997; Hossain et al., 1997; Bravo et al., 1998;
Arango et al., 2002; Uribe et al., 2003; Citado en Bravo y Cern, 2004); insectos
muertos y sus hbitats (Apoloyo et al., 1995; Bernhard et al., 1997; Chilcot y Wigley,
1993); hojas (Meadows et al., 1992); y otras fuentes naturales (Hegalson et al.,
1998). As mismo la dispersin por el hombre juega un papel importante en este
sentido especialmente por efecto del comercio de productos agrcolas de
almacenamiento (Bravo y Cern, 2004).
B. thuringiensis es un habitante ampliamente distribuido en un gran nmero de
ecosistemas, debido a la produccin de esporas, las cuales pueden permanecer por
periodos de tiempo muy largo en ausencia de humedad y nutrientes. A su vez,
cuando la espora se encuentra en un medio rico que contenga los nutrientes
necesarios puede comenzar nuevamente su crecimiento vegetativo (Martn y
Travers, 1989; Holt et al., 2000), las esporas pueden sobrevivir por algunos aos,
aunque la poblacin y la toxicidad declinen rpidamente (Addison, 1993).
2.4. Intercambio gentico
El intercambio de material gentico entre aislamientos de B. thuringiensis, puede
pensarse como una relacin benfica para la especie, en la medida que aumenta la
capacidad de supervivencia de B. thuringiensis en el ambiente, debido a que
permite incrementar la diversidad de alternativas de este, para acceder a los
recursos disponibles. Sin embargo, existen otras relaciones de antagonismo y
competencia que debe enfrentar B. thuringiensis, las cuales generan prdida de su
capacidad de supervivencia.
Otra consecuencia, de esta alta actividad gentica, es que muchas de las cepas de
B. thuringiensis al producirse intercambio de material gentico, pueden perder los
genes asociados a la formacin de cristales, generando as, gran cantidad de
aislamientos esporogenos acristalferos (Chilcott y Wigley, 1993; Theodoluz et al.,
1997; Bravo et al., 1998), los cuales comnmente son interpretados como
-
27
microorganismos diferentes y pueden estar llevando a subvalorar la riqueza de B.
thuringiensis en el ambiente (Bravo y Cern, 2004).
2.4.1. Conjugacin
El principal mecanismo de transferencia clula a clula es la conjugacin, que es
una funcin codificada por algunos plsmidos. La conjugacin es un proceso
replicativo y ambas clulas terminan con copias del plsmido.
Los plsmidos realizan su propia transferencia de una clula a otra por contacto y se
llaman conjugativos, pero no todos los plsmidos son conjugativos, debido a que la
transmisibilidad mediante conjugacin est controlada por un conjunto de genes
dentro del plsmido que constituye una regin tra. La presencia de una regin tra
en un plsmido puede tener otra importante consecuencia si el plsmido se integra
en el cromosoma. Entonces, el plsmido puede movilizar la transferencia de DNA
cromosmico de una clula a otra (Madigan et al., 2003).
2.4.2. Intercambio intra e interespecfico
La capacidad de B. thuringiensis de llevar a cabo intercambio intra e interespecfico
de informacin gentica, es realizado mediante un proceso a nivel bacteriano
conocido como conjugacin. El intercambio de material gentico intraespecfico
(entre las diferentes serovariedades de B. thuringiensis) e interespecfico (de B.
thuringiensis a B. cereus, y B. anthracis) ha sido demostrada desde hace casi 20
aos en condiciones artificiales (Battisti et al., 1985; Gonzlez et al., 1982; Reddy et
al., 1987), y ms recientemente en larvas de insectos hospederos.
- Intercambio intraespecfico: desde el punto de vista ambiental tiene varias
implicaciones, ya que aparentemente es posible realizar intercambio de los
genes codificantes para las protenas que conforman los cuerpos paraesporales,
portadores de las toxinas insecticidas (Bravo y Cern, 2004), lo cual conlleva a
que al menos potencialmente las diferentes cepas de B. thuringiensis estn
ganando o perdiendo las endotoxinas que confieren la capacidad biocida a cada
aislamiento, lo cual adems de modificar el rango de hospederos de una cepa
determinada, puede estar conduciendo hasta la creacin de nuevas -
-
28
endotoxinas (Aronson et al., 1986). Esto puede explicar de algn modo la
diversidad y la actividad de B. thuringiensis en la naturaleza.
- Intercambio interespecfico: podra ser la clave para entender aquellos
aislamientos de B. cereus que reaccionan con antgenos H de B. thuringiensis o
viceversa. De esta forma la transferencia de plsmidos interespecfica puede ser
un evento que tericamente se puede dar en la naturaleza, representando un
riesgo ambiental. Sin embargo, hay algunos reportes donde cepas nativas de B.
thuringiensis productoras de -endotoxinas, producen tambin -exotoxina y una
enterotoxina similar a la de Bacillus cereus (Perani et al., 1998). Lo cual sugiere
que es necesario confirmar la ausencia de estas toxinas al momento de
seleccionar una cepa de B. thuringiensis para uso agrcola (Bravo y Cern,
2004).
2.5. Las Delta-endotoxinas
2.5.1. Clasificacin de las -endotoxinas de B. thuringiensis
La importancia de B. thuringiensis como entomopatgeno se debe a que presenta
factores de virulencia que le permiten controlar diferentes organismos.
Estos factores de virulencia son: fosfolipasas, proteasas, quitinasas, -endotoxinas
o exotoxinas termolbiles, -exotoxinas, protenas VIP (Protenas insecticidas que
se forman en la fase vegetativa de crecimiento) y las -endotoxinas (Protenas que
se acumulan en la fase de esporulacin formando cristales paraesporales).
Las -endotoxinas se clasifican en dos grupos: las protenas Cry y Cyt. Una protena
Cry se define como cualquier protena paraesporal de B. thuringiensis que muestre
un efecto txico hacia algn organismo, demostrable por medio de bioensayos o
cualquier protena que muestre similitud de secuencia con las protenas Cry
descritas hasta el momento (Bravo, 1998; Crickmore et al., 1998); las protenas Cyt
se definen como protenas paraesporales de B. thuringiensis que muestran actividad
-
29
citoltica o que presentan similitud con la secuencia de algunas protenas Cyt
conocidas (Crickmore et al., 1998).
En la actualidad se conocen 424 protenas Cry, clasificadas en 55 familias y 121
subgrupos, lo que demuestra la gran diversidad de estos genes. Entre estos, los
genes cry1 son los ms frecuentes en todo el mundo, con variaciones entre
diferentes regiones (Wang et al., 2003). Existen 42 subgrupos que presentan
actividad txica frente a insectos lepidpteros. Adems 6 protenas a las que no se
le ha dado un nombre especfico debido a que no hay conocimiento suficiente de las
secuencias (Crickmore, 2008) (Tabla 1).
Tabla 1. Proteinas Cry y Cyt producidas por las diferentes variedades de B. thuringiensis.
(Crickmore, 2008).
Nombre
del gen
Nombre
anterior
N de
Acceso Autores Ao Cepa Fuente
Cry1Aa15 DQ062690 Sauka et al 2005 Bt INTA Mol-12
Cry1Ab22 ABW87320 Wu and Feng 2008 BtS2491Ab
Cry1Ab-
like DQ781309 Lin and Fang 2006 Bt ly4a3
Cry1Ac23 AM949588 Kashyap et al 2008 Bt
Cry1Ad2 A27531 1995 Bt PS81RR1
Cry1Ae1 CryIA(e) M65252 Lee & Aronson 1991 Bt alesti
Cry1Af1 U82003 Kang et al 1997 Bt NT0423
Cry1Ag1 AF081248 Mustafa 1999
Cry1Ah2 DQ269474 Qi et al 2005 Bt alesti
Cry1Ai1 AY174873 Wang et al 2002
Cry1A-like AF327927 Nagarathinam et al 2001 Bt kunthala nags3
Cry1Ba5 ABO20894 Song et al 2007 Bt sfw-12
Cry1Bb1 ET5 L32020 Donovan et al 1994 Bt EG5847
Cry1Bd2 AY138457 Isakova et al 2002 Bt 834
Cry1Be2 AAQ52387 Baum et al 2003
Cry1Bf2 AAQ52380 Baum et al 2003
Cry1Bg1 AY176063 Wang et al 2002
Cry1Ca11 AY955268 Cai et al 2005 Bt C-33
Cry1Cb3 EU679502 Huang et al 2008 Bt087
Cry1Cb-
like AAX63901 Thammasittirong et al 2005 Bt TA476-1
-
30
Cry1Da2 I76415 Payne & Sick 1997
Cry1Db2 AF358862 Li et al 2001 Bt B-Pr-88
Cry1Dc1 EF059913 Lertwiriyawong et al 2006
Cry1Ea8 ABX11258 Huang et al 2007 Bt HZM2
Cry1Eb1 CryIE(b) M73253 Payne & Sick 1993 Bt aizawai PS81A2
Cry1Fa2 M73254 Payne & Sick 1993 Bt aizawai PS81I
Cry1Fb7 EU679501 Huang et al 2008 Bt087
Cry1Ga2 Y09326 Shevelev et al 1997 Bt wuhanensis
Cry1Gb2 AF288683 Li et al 2000 Bt B-Pr-88
Cry1Gc AAQ52381 Baum et al 2003
Cry1Ha1 PrtC Z22513 Lambert 1993 Bt BTS02069AA
Cry1Hb1 U35780 Koo et al 1995 Bt morrisoni BF190
Cry1H-like AF182196 Srifah et al 1999 Bt JC291
Cry1Ia13 ABF83202 Martins et al 2006 Bt
Cry1Ib3 EU677422 Liu et al 2008 Bt GS8
Cry1Ic2 AAE71691 Osman et al 2001
Cry1Id1 AF047579 Choi 2000
Cry1Ie1 AF211190 Song et al 2000 Bt BTC007
Cry1If1 AAQ52382 Baum et al 2003
Cry1I-like DQ781310 Lin & Fang 2006 Bt ly4a3
Cry1Ja1 ET4 L32019 Donovan et al 1994 Bt EG5847
Cry1Jc1 AAQ52372 Baum et al 2003
Cry1Jd1 AX189651 Arnaut et al 2001
Cry1Ka1 U28801 Koo et al 1995 Bt morrisoni BF190
Cry1La1 AAS60191 Je et al 2004 Bt kurstaki K1
Cry1-like I90729 Payne et al 1998
Cry2Aa12 DQ977646 Tan et al 2006 Bt Rpp39
Cry2Ab12 ABM21764 Lin et al 2007 Bt LyD
Cry2Ac12 AM689532 Saleem & Shakoori 2007 Bt CMBL-BT3
Cry2Ad5 AM765844 Saleem et al 2007 Bt HD29
Cry2Ae1 AAQ52362 Baum et al 2003
Cry2Af1 EF439818 Beard et al 2007 Bt C81
Cry3Aa12 ABY49136 Sezen et al 2008 Bt tenebrionis
Cry3Ba2 A07234 Peferoen et al 1990 Bt PGSI208
Cry3Bb3 I15475 Peferoen et al 1995
Cry3Ca1 CryIIID X59797 Lambert et al 1992 Bt kurstaki BtI109P
Cry4Aa3 AL731825 Berry et al 2002 Bt israelensis
Cry4a-like DQ078744 Mahalakshmi et al 2005 Bt LDC-9
Cry4Ba5 AL731825 Berry et al 2002 Bt israelensis
-
31
cRY4Ba-
like ABC47686 Mahalakshmi et al 2005 Bt LDC-9
Cry4Ca1 EU646202 Shu et al 2008
Cry5Aa1 CryVAa L07025 Narva et al 1994 Bt darmstadiensis PS17
Cry5Ab1 CryVAb L07026 Narva et al 1991 Bt darmstadiensis PS17
Cry5Ac1 I34543 Payne et al 1997
Cry5Ad|1 EF219060 Lenane et al 2007 Bt L355
Cry5Ba2 EU121522 Sun et al 2008 YBT 1518
Cry6Aa3 DQ835612 Jia et al 2006 Bt 96418
Cry6Ba1 CryVIB L07024 Narva et al 1991 Bt PS69D1
Cry7Aa1 CryIIIC M64478 Lambert et al 1992 Bt galleriae PGSI245
Cry7Ab4 EU380678 Shu et al 2008 Bt
Cry7Ba1 ABB70817 Zhang et al 2006 Bt huazhongensis
Cry7Ca1 EF486523 Gao et al 2007 Bt BTH-13
Cry8Aa1 CryIIIE U04364 Narva & Fu 1992 Bt kumamotoensis
Cry8Ab1 EU044830 Cheng et al 2007 Bt B-JJX
Cry8Ba1 CryIIIG U04365 Narva & Fu 1993 Bt kumamotoensis
Cry8Bb1 AX543924 Abad et al 2002
Cry8Ca2 AAR98783 Song et al 2004 Bt HBF-1
Cry8Da3 BD133575 Asano et al 2002 Bt
Cry8Db1 AB303980 Yamaguchi and
Asano 2007 Bt BBT2-5
Cry8Ea2 EU047597 Liu et al 2007 Bt B-DLL
Cry8Ga2 DQ318860 Yan et al 2005 Bt 145
Cry8Ha1 EF465532 Fuping et al 2006 Bt 185
Cry8Ia1 EU381044 Yan et al 2008 Bt su4
Cry8 like ABS53003 Mangena et al 2007 Bt
Cry9Aa2 X58534 Gleave et al 1992 Bt DSIR517
Cry9Aa
like AAQ52376 Baum et al 2003
Cry9Ba1 CryIX X75019 Shevelev et al 1993 Bt galleriae
Cry9Bb1 AY758316 Silva-Werneck et al 2004 Bt japonensis
Cry9Ca2 AAQ52375 Baum et al 2003
Cry9Da2 AF042733 Wasano & Ohba 1998 Bt japonensis
Cry9Db1 AY971349 Flannagan et al 2005 Bt kurstaki DP1019
Cry9Ea3 EF157307 Lin et al 2006
Cry9Eb1 AX189653 Arnaut et al 2001
Cry9Ec1 AF093107 Wasano & Ohba 2003 Bt galleriae
Cry9Ed1 AY973867 Flannagan et al 2005 Bt kurstaki DP1019
-
32
Cry9 like AF093107 Wasano et al 1998 Bt galleriae
Cry10Aa3 AL731825 Berry et al 2002 Bt israelensis
Cry10A
like DQ167578 Mahalakshmi et al 2006 Bt LDC-9
Cry11Aa3 AL731825 Berry et al 2002 Bt israelensis
Cry11Aa-
like DQ166531 Mahalakshmi et al 2007 Bt LDC-9
Cry11Ba1 X86902 Delecluse et al 1995 Bt jegathesan 367
Cry11Bb1 AF017416 Orduz et al 1998 Bt medellin
Cry12Aa1 CryVB L07027 Narva et al 1991 Bt PS33F2
Cry13Aa1 CryVC L07023 Narva et al 1992 Bt PS63B
Cry14Aa1 CryVD U13955 Narva et al 1994 Bt sotto PS80JJ1
Cry15Aa1 M76442 Brown & Whiteley 1992 Bt thompsoni
Cry16Aa1 cbm71 X94146 Barloy et al 1996 Cb malaysia CH18
Cry17Aa1 cbm72 X99478 Barloy et al 1998 Cb malaysia CH18
Cry18Aa1 CryBP1 X99049 Zhang et al 1997 Paenibacillus popilliae
Cry18Ba1 AF169250 Patel et al 1999 Paenibacillus popilliae
Cry18Ca1 AF169251 Patel et al 1999 Paenibacillus popilliae
Cry19Aa1 Y07603 Rosso & Delecluse 1996 Bt jegathesan 367
Cry19Ba1 D88381 Hwang et al 1998 Bt higo
Cry20Aa1 U82518 Lee & Gill 1997 Bt fukuokaensis
Cry21Aa2 I66477 Feitelson 1997
Cry21Ba1 AB088406 Sato & Asano 2002 Bt roskildiensis
Cry22Aa2 AX472772 Isaac et al 2002 Bt
Cry22Ab2 AX472764 Isaac et al 2002 Bt
Cry22Ba1 AX472770 Isaac et al 2002 Bt
Cry23Aa1 AAF76375 Donovan et al 2000 Bt
Cry24Aa1 U88188 Kawalek and Gill 1998 Bt jegathesan
Cry24Ba1 BAD32657 Ohgushi et al 2004 Bt sotto
Cry24Ca1 AM158318 Beron & Salerno 2005 Bt FCC-41
Cry25Aa1 U88189 Kawalek and Gill 1998 Bt jegathesan
Cry26Aa1 AF122897 Wojciechowska et al 1999 Bt finitimus B-1166
Cry27Aa1 AB023293 Saitoh 1999 Bt higo
Cry28Aa2 AF285775 Moore and Debro 2000 Bt finitimus
Cry29Aa1 AJ251977 Delecluse et al 2000
Cry30Aa1 AJ251978 Delecluse et al 2000
Cry30Ba1 BAD00052 Ikeya et al 2003 Bt entomocidus
Cry30Ca1 BAD67157 Ohgushi et al 2004 Bt sotto
Cry30Da1 EF095955 Shu et al 2006 Bt Y41
-
33
Cry30Ea1 EU503140 Fang et al 2007
Cry31Ab2 AB274825 Yasutake et al 2006 Bt 31-5
Cry31Ac1 AB276125 Yasutake et al 2006 Bt 87-29
Cry32Aa1 AY008143 Balasubramanian et al 2001 Bt yunnanensis
Cry32Ba1 CryE6L BAB78601 Takebe et al 2001 Bt
Cry32Ca1 CryE6Q BAB78602 Takebe et al 2001 Bt
Cry32Da1 CryE6S BAB78603 Takebe et al 2001 Bt
Cry33Aa1 AAL26871 Kim et al 2001 Bt Dakota
Cry34Aa4 AY536897 Schnepf et al 2004 Bt PS185GG
Cry34Ab1 AAG41671 Moellenbeck et al 2001 Bt PS149B1
Cry34Ac3 AY536896 Schnepf et al 2004 Bt KR1369
Cry34Ba3 AY536898 Schnepf et al 2004 Bt PS201HH2
Cry35Aa4 AY536892 Schnepf et al 2004 Bt PS185GG
Cry35Ab3 AY536891 Schnepf et al 2004 Bt KR1369
Cry35Ac1 AAG50117 Ellis et al 2001 Bt PS167H2
Cry35Ba3 AY536893 Schnepf et al 2004 Bt PS201HH2
Cry36Aa1 AAK64558 Rupar et al 2001 Bt
Cry37Aa1 AAF76376 Donovan et al 2000 Bt
Cry38Aa1 AAK64559 Rupar et al 2000 Bt
Cry39Aa1 BAB72016 Ito et al 2001 Bt aizawai
Cry40Aa1 BAB72018 Ito et al 2001 Bt aizawai
Cry40Ba1 BAC77648 Ito et al 2003 Bun1-14
Cry40Ca1 EU381045 Shu et al 2008 Bt Y41
Cry40Da1 EU596478 Fang et al 2008 Bt
Cry41Aa1 AB116649 Yamashita et al 2003 Bt A1462
Cry41Ab1 AB116651 Yamashita et al 2003 Bt A1462
Cry42Aa1 AB116652 Yamashita et al 2003 Bt A1462
Cry43Aa2 AB176668 Nozawa 2004 P. popilliae popilliae
Cry43Ba1 AB115422 Yokoyama and
Tanaka 2003
P. lentimorbus
semadara
Cry43-like AB115422 Yokoyama and
Tanaka 2003
P. lentimorbus
semadara
Cry44Aa BAD08532 Ikeya et al 2004 Bt entomocidus INA288
Cry45Aa BAD22577 Okumura and Saitoh 2004 Bt 89-T-34-22
Cry46Aa BAC79010 Ito et al 2004 Bt Dakota
Cry46Ab BAD35170 Yamagiwa et al 2004 Bt
Cry47Aa AY950229 Kongsuwan et al 2005 Bt CAA890
Cry48Aa3 AM237206 Jones and Berry 2006 Bs NHA15b
Cry48Ab2 AM237208 Jones and Berry 2006 Bs 2173
-
34
Cry49Aa4 AM237204 Jones and Berry 2006 Bs 2173
Cry49Ab1 AM237202 Jones and Berry 2006 Bs LP1G
Cry50Aa1 AB253419 Ohgushi et al 2006 Bt sotto
Cry51Aa1 DQ836184 Meng et al 2006 Bt F14-1
Cry52Aa1 EF613489 Song et al 2007 Bt Y41
Cry53Aa1 EF633476 Song et al 2007 Bt Y41
Cry54Aa1 EU339367 Tan et al 2007 Bt MC28
Cry55Aa1 EU121521 Sun et al 2008 YBT 1518
Cyt1Aa6 ABC17640 Zhang et al 2005 Bt LLP29
Cyt1Aa-
like ABB01172 Mahalakshmi 2007 Bt LDC-9
Cyt1Ab1 X98793 Thiery et al 1997 Bt medellin
Cyt1Ba1 U37196 Payne et al 1995 Bt neoleoensis
Cyt1Ca1 AL731825 Berry et al 2002 Bt israelensis
Cyt2Aa2 AF472606 Promdonkoy &
Panyim 2001 Bt darmstadiensis73E10
Cyt2Ba9 AL731825 Berry et al 2002 Bt israelensis
Cyt2Ba-
like ABE99695 Mahalakshmi et al 2007 Bt LDC-9
Cyt2Bc1 CAC80987 Delecluse et al 1999 Bt medellin
Cyt2B-like DQ341380 Zhang et al 2005
Cyt2Ca1 AAK50455 Baum et al 2001 Bt
2.5.2. Genes que codifican protenas con actividad insecticida
Las protenas Cry son toxinas modulares que presentan actividades toxicas
altamente especficas para diferentes tipos de insectos. En la tabla 2 se presentan
31 protenas Cry con actividad especfica contra un orden de insecto susceptible.
-
35
Tabla 2. Protenas Cry con actividad especfica contra un orden de insecto. (Barloy et al., 1996; Zhang et al., 1997)
PROTENA ORGANISMOS SUSCEPTIBLES
Cry1 Lepidpteros, algunas presentan actividad dual
Cry2 Actividad dual frente a lepidpteros y dpteros
Cry3 Colepteros
Cry4 Dpteros
Cry5 Nematodos, caros himenpteros
Cry6 Nematodos, caros
Cry7 Colepteros
Cry8 Dual colepteros y fidos
Cry9 Lepidpteros
Cry10 Dpteros
Cry11 Dpteros
Cry12 Dual dpteros y colepteros
Cry13 Nematodos
Cry14 Dpteros y colepteros
Cry15 Lepidpteros
Cry16 Dpteros
Cry17 Dpteros
Cry18 Colepteros
Cry19 Dpteros
Cry20 Dpteros
Cry21 Nematodos
Cry22 Himenpteros
Cry23 Colepteros
Cry24 Dpteros
Cry25 Dpteros
Cry26 Dpteros
Cry27 Dpteros
Cry28 Dpteros
Cry29 Dpteros
Cry30 Dpteros
Cry31 Dpteros
-
36
2.5.3. Organizacin y estructura tridimensional de las protenas Cry
Existen algunas regiones altamente conservadas a nivel de secuencia primaria entre
las protenas Cry, denominadas los 5 bloques conservados, que se localizan en la
regin que codifica para la toxina. La mayora de las protenas Cry se producen
como protoxinas de un tamao de 130-140 kDa (Hfte y Whiteley, 1989). Sin
embargo, Schnepf et al. (1998), describieron otros tres bloques conservados
localizados en la regin de la protoxina.
Los 5 bloques conservados de la estructura primaria de las protoxinas estn
localizados en regiones muy importantes dentro de la estructura tridimensional, y
estas corresponden a las regiones internas de los Dominios (Figura 4).
Figura 4. Estructura tridimensional de protena Cry1Aa.
I: Dominio I; II Dominio II; III Dominio III (De Maagd et al., 2001)
Las toxinas Cry presentan una organizacin similar entre ellas, compuesta de tres
dominios estructuralmente conservados: dominio I, II y III. Con base en estos
dominios se han llevado a cabo diferentes estudios de relaciones filogenticas de
las toxinas Cry, indicando un porcentaje de identidad no muy alto y diferente
especificidad a insectos (De Maagd et al., 2001) (Figura 4).
-
37
El dominio I, consiste en 7 hlices, donde una hlice esta rodeada por otras seis,
las cuales son anfipticas, su funcin est relacionada con la formacin del poro en
la membrana del insecto susceptible. Est formada aproximadamente por los
primeros 250 aminocidos de la toxina (De Maagd et al., 2003; Li et al., 1991;
Schneph et al., 1998).
El Dominio II, tambin llamado prisma est formado por tres lminas de estructura
simtricos anti paralelos, el cual participa en la interaccin con el receptor siendo
un factor importante de la especificidad. Est formado por aproximadamente los 300
aminocidos siguientes al dominio I (De Maagd et al., 2003; Jurat-Fuentes y Adang,
2001; Schnepf et al., 1998).
El Dominio III, es similar a un sandwich, al parecer est involucrado con la
especificidad, y tambin participa en la proteccin ocasionada por proteasas
intestinales, adems reconoce al receptor y acta en la ligacin (Burton et al., 1999;
De Maagd et al., 2003; Flores et al., 1997; Masson et al., 1998).
Este anlisis ha permitido distinguir 3 subgrupos de protenas Cry. Un primer
subgrupo est integrado por las clases Cry1, Cry3, Cry4, Cry7, Cry8, Cry9, Cry10,
Cry16, Cry17, Cry19 y Cry20 que se caracterizan por tener los 5 bloques
conservados en la regin de la toxina. Un segundo grupo est formado por las
clases Cry5, Cry12, Cry13, Cry14 y Cry22. Ests toxinas se caracterizan por tener
regiones homlogas a los bloques 1,2,3,4 y 5, sin embargo, el bloque conservado 3
presenta una homologa muy baja. El tercer subgrupo est integrado por las clases
Cry2, Cry11, Cry18, estas toxinas poseen el bloque conservado 1 y presentan una
variante del bloque 2 pero carecen de los bloques 4 y 5. Nuevas investigaciones
agrupan a las protenas Cry1, Cry4, Cry7, Cry8, Cry9, Cry5, Cry12, Cry14 y Cry21
(Figura 5).
-
38
Figura 5. Alineamiento de las protenas Cry que revela la posicin de los 5 bloques conservados.
Dominio I involucrado en la formacin del poro en la membrana de las clulas del insecto susceptible; Dominio II participan en la interaccin con el receptor siendo un determinante importante de la
especificidad; Dominio III reconocimiento al receptor y ligacin (De Maagd et al., 2003).
2.5.4. Mecanismo de accin de las protenas insecticidas de cristal (ICPs)
Los estudios sobre el mecanismo de accin de las ICPs de B. thuringiensis, es
actualmente el rea donde se realiza mayor investigacin ya que se considera que
si este aspecto se llega a conocer en detalle, se podrn disear mejores
bioinsecticidas, ms txicos y de espectro de accin ms amplio (Figura 6).
-
39
Figura 6. Mecanismo de accin de las -endotoxinas. 1. Los insectos susceptibles consumen follaje tratado con B. thuringiensis. 2. Dentro de minutos la
toxina se liga al receptor especfico en la pared del intestino y el insecto detiene el alimento. 3. Dentro de horas, por los agujeros de la pared del intestino, las esporas y bacterias del intestino entran en la cavidad del cuerpo; la toxina se disuelve. 4. De 1-2 das, el insecto, muere de septicemia ya que las
esporas y las bacterias del intestino proliferan en su sangre. (Watkinson, 1994; De Maagd et al., 2001).
Las toxinas Cry difieren de las toxinas Cyt en su mecanismo de accin. Una vez el
insecto susceptible ingiere el cristal este se solubiliza en el ambiente alcalino y
reductor del intestino medio. Como la mayor parte de las protenas Cry se producen
como protoxinas, estas son activadas por accin de las proteasas (tripsina,
quimiotripsina, termolisina y catepsinas) del intestino medio de los insectos (Bravo et
al., 2002). Luego, las protenas activas se unen a sitios especficos localizados en
las microvellosidades apicales del intestino medio. (Rukmini et al., 2000; Aronson y
Shai, 2001). Una vez la toxina se encuentra activa, se inserta en la membrana como
consecuencia de un cambio conformacional drstico disparado por el receptor y
forma poros los cuales alteran el equilibrio de electrlitos y agua, interfiriendo en el
metabolismo celular normal. Diversos estudios han encontrado que las toxinas Cry
aumentan la permeabilidad de la microvellosidad apical tanto para cationes
-
40
monovalentes como para divalentes, aniones, agua y molculas de mayor tamao.
Esto causa tambin que colapse la diferencia de potencial y por tanto se pierda la
fuerza motriz que dirige la entrada de aminocidos al interior celular, as como la
redistribucin de los cationes entre el lmen y el citoplasma, obteniendo como
consecuencia la alcalinizacin del citoplasma y destruccin de las clulas
columnares y caliciformes (De Maagd et al., 2001). Al destruirse las clulas, las
esporas de B. thuringiensis tienen acceso a la hemolinfa del insecto y proliferan
dentro de esta (Van Rie et al., 1989; Knowles, 1993; De Maagd et al., 2001);
provocando en la larva parlisis del tracto digestivo, cese de la ingesta y por ltimo,
su muerte (Schnepf et al., 1998; Griffitts et al., 2005) (Figura 6).
Generalmente es asumido que los dems tipos de ICP`s emplean esencialmente la
misma ruta que las protenas Cry1. Por ejemplo muchos de los pasos anotados
arriba han sido observados en el caso de la toxina Cry3Aa. (Koller et al., 1992).
2.5.5. Aplicaciones biotecnolgicas
Entre las formulaciones biolgicas utilizadas para el control de insectos plaga en la
agricultura, se destaca B. thuringiensis (Hofte y Whiteley, 1989). La mayora de los
bioinsecticidas a base de B. thuringiensis son producidos utilizando aislamientos
nativos, y utilizan solo una pequea fraccin de las protenas Cry conocidas. La
manipulacin de los genes cry en B. thuringiensis ofrece un potencial en el
mejoramiento de la efectividad y la relacin costo beneficio de los productos a base
de B. thuringiensis.
B. thuringiensis es la bacteria entomopatgena ms ampliamente utilizada como
biopesticida, en la proteccin de especies vegetales, agricultura comercial y contra
dpteros vectores de enfermedades humanas (Clive, 2006). Desde que ocurri la
primera clonacin de un gen cry, que codifica para protenas insecticidas en Bt
(Schnepf y Whiteley, 1985) se han aislado muchos otros genes por lo cul se ha
establecido una clasificacin basada en la secuencia de la protena (Crickmore et
al., 1998).
-
41
Otra de las aplicaciones de B. thuringiensis es en cultivos biotecnolgicos. Hasta el
2006, de los 22 pases productores de transgnicos (Tabla 3), 11 constituyeron
pases industrializados, y 11 pases envas de desarrollo. Estos fueron, en orden de
hectreas de superficie: Estados Unidos, Argentina, Brasil, Canad, India, China,
Paraguay, Sudfrica, Uruguay, Filipinas, Australia, Rumania, Mxico, Espaa,
Colombia, Francia, Irn, Honduras, Repblica Checa, Portugal, Alemania y
Eslovaquia. Cabe notar que los primeros ocho pases de la lista cultivaron ms de
un milln de hectreas cada uno, lo que constituye una base amplia y estable para
la futura adopcin mundial de los cultivos biotecnolgicos.
En 2008, 13,3 millones de agricultores cultivaron 125 millones de hectreas con
variedades transgnicas. El aumento de hectreas cultivadas en 2008 supuso un
9,4% respecto a 2007.
Lo ms remarcable de 2008 es el comienzo de los cultivos biotecnolgicos en
pases africanos como Egipto y Burkina Faso. frica es considerada la barrera final
para los cultivos biotecnolgicos y quizs es el continente que puede verse ms
beneficiado por ellos. En 2008 se cultivaron en Egipto 700 hectreas de maz Bt y
en Burkina Faso se cultivaron 8.500 hectreas de algodn Bt. A estos dos pases se
une Sudfrica, donde se vienen cultivando desde 1998 algodn, maz y soja
genticamente modificados.
Las cosechas biotecnolgicas han hecho dos contribuciones importantes a la
seguridad global alimentaria. Primero han incrementado la productividad, lo que
aumenta asimismo la accesibilidad a los alimentos. Segundo, han reducido los
costos de produccin, lo que en ltima instancia ayuda a reducir los precios de los
alimentos. En 2050 9.200 millones de personas necesitarn comer. En este
escenario la biotecnologa juega un papel fundamental en satisfacer las
necesidades crecientes de alimentos.
Por esta razn, la adherencia a prcticas agrcolas adecuadas para los cultivos
transgnicos continuar a siendo tan importante como lo ha sido durante la primera
dcada, y una administracin responsable continuada tendr que ser ejercida, sobre
-
42
todo por los pases del Sur que sern los mayores productores de cultivos
transgnicos durante la prxima dcada (Clive, 2006).
Tabla 3. Superficie global de cultivos transgnicos en 2006: por pas (millones de hectreas)
2.6. Tcnicas moleculares
Dadas las caractersticas de B. thuringiensis como agente de control biolgico se ha
intensificado la bsqueda y establecimiento de colecciones de B. thuringiensis a
nivel mundial. El poder caracterizar dichas colecciones y encontrar nuevas -
endotoxinas ofrecen una alternativa para el control de insectos plaga en cultivos
econmicamente importantes. En este sentido es fundamental contar con un
sistema de anlisis que permita identificar cepas de B. thuringiensis que porten
genes ya conocidos o protenas conocidas, de aquellos que portan genes
completamente nuevos.
Entre los mtodos usados para la caracterizacin de B. thuringiensis se incluyen
electroforesis de protenas (SDS-PAGE) y caracterizacin molecular mediante PCR.
-
43
2.6.1. Electroforesis de protenas (SDS-PAGE):
La electroforesis en gel denaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE), es una
herramienta analtica y preparativa para la ciencia de las protenas, puede ser
utilizada para separar y comparar mezclas complejas de protenas, evaluar la
pureza de una protena durante el curso de su aislamiento, y proveer estimaciones
de caractersticas fsicas como la composicin de sus subunidades, punto
isoelctrico, peso molecular y carga. Por medio, del mtodo SDS-PAGE, las
protenas migran en respuesta a un campo elctrico a travs de poros en la matriz o
gel, la dimensin del poro, carga, forma y tamao, son factores que determinan la
migracin y la separacin de protena, que se basa en el peso molecular mientras
migran a travs del gel de poliacrilamida hacia el nodo.
Las protenas presentan una carga elctrica neta, si se encuentran en un medio que
tenga un pH diferente al de su punto isoelctrico y por eso tienen la propiedad de
desplazarse cuando se someten a un campo elctrico. La velocidad de migracin es
proporcional a la relacin entre las cargas de la protena y su masa. Cuanto mayor
carga por unidad de masa ms rpida ser la migracin. La migracin de las
protenas no solo es proporcional a la carga neta sino tambin al tamao y forma de
las protenas (Laemmli et al., 1970; Sambrook et al., 2001).
2.6.2. La Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Los avances en Biologa molecular han permitido desarrollar mtodos basados en
estudios de ADN capaces de diferenciar entre cepas cercanas con capacidad de ser
empleadas en control biolgico de plagas. Estos mtodos pueden ser empleados
para identificar la presencia o ausencia de genes especficos de -endotoxinas
(Bravo y Cern, 2004).
Una de estas tcnicas es la Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), esta
tcnica fue descrita por Kary Mullis y colaboradores en 1980; la PCR es un mtodo
rpido y sencillo que puede amplificar fragmentos especficos de ADN a partir de
cantidades mnimas del ADN original. La PCR, es una tcnica que sirve para la
amplificacin in vitro de secuencias de ADN especficas, razn por la cual tambin
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se le denomina clonacin acelular. La amplificacin del ADN se logra mediante la
extensin de oligonucletidos que son complementarios a secuencias situadas
hacia los dos extremos 3 del segmento bicaternario que se pretende amplificar
(Puerta y Uruea, 2005).
Por otra parte, se encuentra la PCR mltiple (M-PCR), que es un tipo especial de
PCR, donde se amplifica ms de una secuencia blanco, esto se logra agregando en
la reaccin ms de un par de oligonucletidos. Tiene la ventaja de ahorrar tiempo y
esfuerzo sin comprometer la efectividad de la prueba. Las condiciones de M-PCR se
asocian a la compatibilidad entre los oligonucletidos dentro de la reaccin y la no
interferencia son de gran importancia en esta tcnica. La M-PCR, debe evitar el uso
de oligonucletidos anidados, es decir, que requieren una segunda ronda de
amplificacin, debido, a que se pueden presentar falsos positivos, consecuencia de
la contaminacin generada (Elnifro et al., 2000). En la identificacin de B.
thuringiensis, la M-PCR, utiliza una mezcla de oligonucletidos que amplifiquen
fragmentos especficos de cada gen, que codifican las -endotoxinas (Cern et al.,
1994; Cern et al., 1995). Con los oligonucletidos especficos y la M-PCR se
pueden detectar directamente los genes cry conocidos de B. thuringiensis (Song et
al., 2003).
Ambas, tcnicas involucran la preparacin de ADN, la mezcla de oligonucletidos y
la deteccin de los productos de reaccin por medio de la repeticin de un ciclo
formado por tres etapas:
1. Desnaturalizacin del ADN de doble cadena: La doble hlice de ADN se
separa en dos hebras, para ello se realiza una incubacin de la muestra a altas T
que oscilan entre 93-97C, de esta forma las cadenas se torna accesi