Bacillus subtilis中羟基丁酮诱导的表达系统

专业：生物化工学号： 2012207258

姓名：杨绍梅导师：班睿

目录

1 对羟基丁酮的简要介绍 2 羟基丁酮的合成及调控机制 3 羟基丁酮的代谢及调控机制 4 结论及展望

1 对羟基丁酮的简要介绍 羟基丁酮（ acetoin），又名乙偶姻、甲基乙酰甲醇，具有独特的奶油香味和羟基、羰基等官能团，是一种重要的化学合成中间体和多功能材料，广泛应用于食品、制药、化工以及烟草等领域。

目前，羟基丁酮的主要生产方法有：化学合成法、酶转化法和微生物发酵法。由于微生物发酵法具有生产成本低、对环境友好、产品纯度高、反应条件温和等优势，能解决化学合成法和酶转化法所面临的环境、资源、产品质量等问题，已成为羟基丁酮的研究热点。

2 羟基丁酮的合成及调控机制2.1 羟基丁酮的合成 acetoin是许多微生物糖代谢的中间产物，自然界中可转化 糖 生 产 acetoin 的 微 生 物 主 要 有Enterobacter、 Bacillus等。

在 B.subtilis内， acetoin的合成途径主要有 2条： 2 分子丙酮酸在 ilvBN 编码的 α- 乙酰乳酸合成酶（ AHAS）的作用下合成一分子 α-乙酰乳酸， α-乙酰乳酸在酸性条件下非酶自然氧化脱羧生成 2， 3-丁二酮，2， 3-丁二酮在丁二酮还原酶或 2， 3-丁二醇脱氢酶的作用下还原生产 acetoin；

另一条途径是 2分子丙酮酸在 alsS编码的 α-乙酰乳酸合成酶（ AlsS）的作用下合成 1分子 α-乙酰乳酸， α-乙酰乳酸经 alsD编码的 α-乙酰乳酸脱羧酶（ AlsD）作用生成 acetoin。

图 1 羟基丁酮的合成代谢相关途径

alsSD操纵子的基因结构 在 B.subtilis 中， alsS和 alsD构成一个 alsSD操纵子，其表达受 alsR 的调控。 alsSD 位于B.subtilis基因图谱的 314°，和 alsR形成一对反向操纵子， alsR 与 alsSD 的转录起始位点相差64bp，两者的调控序列重合。

图 2 alsSD操纵子与 alsR基因的结构

alsSD的转录起始位点上游有类似于识别 σA启动子的序列， -35 区和 -10 区之间相差 17bp ；在 -76~-58bp有 19bp的高亲和性回文结构结合位点TAAT-N11-ATTA，是调控蛋白结合位点（ RBS）；在 -41~-27bp有 15bp的低亲和性回文结构结合位点 AT-N11-AT，是激活蛋白结合位点（ ABS）。

AlsR与这两个位点结合诱导形成转录所需的高级复合物。 alsSD中 AlsR结合位点 RBS序列与 alsR转录起始位点重合； ABS序列与 alsSD的 -35区重合；alsSD的 -35区和 alsR的 -35区有 2bp重叠。

2.2羟基丁酮合成的调控机制2.2.1 AlsR对 alsSD操纵子的调控机制 alsR的表达受自调节负控，当 AlsR水平较低时，

RBS和 ABS位点空闲， RNA聚合酶可以结合启动子，起始 alsR的转录；当 AlsR水平提高后，RBS 和 ABS 位点先后被 AlsR 占据，阻碍了RNA聚合酶与启动子的结合， alsR的转录受到抑制。

如果与 RBS和 ABS位点结合的 AlsR蛋白，以活性八聚体的形式存在于 alsSD操纵子 -10区的上游，则促进 RNA聚合酶起始 alsSD操纵子的转录。

图3 AlsR与DNA结合的形式

A ： AlsR 形成二聚体或四聚体形成延迟蛋白 /DNA 复合体 I 或 II ，结合在 alsSD 操纵子的ABS或 RBS位点。B ： AlsR 形成二聚体或四聚体形成延迟蛋白 /DNA 复合体 I 、 II 或III ，结合在 alsSD 操纵子的 ABS和 RBS位点。C ： AlsR 的活性八聚体结合在 alsSD 的操纵子调控序列处。

2.2.2 CcpA对 alsSD操纵子的调控机制 CcpA蛋白是 B.subtilis及其他革兰氏阳性菌内碳源代谢的调控中心，是转录调控蛋白 LacI/GalR 族中的一员，与目标基因启动子区域保守的 cre位点结合，对葡萄糖的应答是由 HPr/Crh 信号通路介导的。

尽管 CcpA作为阻遏蛋白阻遏关于二级碳源利用的基因的表达，但是 B.subtilis在葡萄糖培养基生长时的碳源代谢途径，包括乙酸、羟基丁酮、糖原的生成途径都需要 CcpA激活。

CcpA是碳利用基因的负调控蛋白，也是乙酸和羟基丁酮合成与分泌的正调控蛋白。

alsSD操纵子中无 cre位点， alsR基因编码LysR 族转录调控因子AlsR ，是 alsSD 转录的激活剂。在营养生长时加入外源乙酸可增加alsSD的转录，因此认为乙酸是控制 AlsR 依赖性激活的效应物。这表明： CcpA对 alsSD的影响是间接的，由于ackA/pta 路 径 对CcpA具有依赖性，因此 CcpA可能通过乙酸的积 累介导对 alsSD的调控。

图 4 CcpA介导的基因表达的控制模型

3 羟基丁酮的代谢及调控机制3.1 羟基丁酮的代谢 acetoin的意义在于抵御环境的酸化、参与NAD+/NADH

比率的调节、作为储存碳源。正常情况下 acetoin在微生物体内是不会积累的， acetoin 即使在微生物为了抵御不良环境而作为储存能源积累时，在葡萄糖等易同化碳源耗尽后也会被继续消耗来维持自身的生命活动，这充分表明微生物体内存在 acetoin的分解代谢体系。

在B.subtilis内， acetoin的分解代谢是由羟基丁酮脱氢酶酶系 ( AoDH ES) 催化完成的，包括：依赖于焦磷酸硫胺素的羟基丁酮脱氢酶 ( AoDH E1) 、二氢硫辛酰胺乙酰( 基 ) 转移酶 ( AoDH E2) 和二氢硫 辛酰胺脱氢酶( AoDH E3) ， acoABCL操纵子编码该羟基丁酮脱氢酶亚基。

acoABCL操纵子的基因结构 羟基丁酮脱氢酶酶系的结构基因

acoA( 编码 AoDH E1 的 α- 亚 单位)、acoB (编码AoDH E1的β-亚单位 )、acoC (编码AoDH E2 )和acoL基因 (编码AoDH E3)在染色体上呈线性依次排列。

acoA、 acoB、 acoC、 acoL和acoR之间的间距分别为3 bp、13 bp、28 bp和115bp。

σ54识别的启动子位于acoA上游的39bp处，四个基因的启动子识别序列是-24区的5'-TGGCAC-3'和-12区的5'-CTTGCA-3'。当σL 突变时，acoA启动子无法转录；σL结构基因中间有CcpA结合位点cre-box，并通过“路障”机制调控σL的转录。

图 5 aco基因簇的的结构 [15]

图 6 σL基因结构

3.2 羟基丁酮的调控机制 acoABCL操纵子的表达受葡萄糖的抑制，受羟基丁酮的诱导；该操纵子的启动子受 σL的调控，并需要激活剂 AcoR，编码 AcoR的 acoR基因位于 acoABCL序列的下游。

在葡萄糖存在的条件下， acoR的表达受 CcpA的强烈抑制，因此可能仅在无葡萄糖的条件下，acoR 才表达；激活剂 AcoR 识别并结合acoABCL启动子上游的 90bp 大小的调控序列，从而在羟基丁酮存在的条件下激活操纵子的表达。

3.2.1 acoR对 acoABCL操纵子的调控作用 acoR 基因位于 acoABCL 操纵子的下游，和

acoABCL是两个不同的转录单元，编码激活操纵子转录的激活蛋白 AcoR。 AcoR与 σ54 依赖型启动子的转录激活物相似，这一激活蛋白家族包含一个220-240 氨基酸残基形成的中心区域，通过与 RNA聚合酶或 σ54 相互作用，形成 RNA 聚合酶和（ -12， -24）启动子的开放复合物。

acoABCL操纵子的四个基因在 acoR 缺陷株中不能转录，需要上游激活区域 -123 ～ -85bp（该区域含有 3个拷贝的六核苷酸序列 5‘-GAGACA-3’ ）和位于 -91bp的 11个核苷酸的回文序列，这些可能与AcoR的结合有关。

图7 acoR启动子区域结构下划线表示可能的 cre-box序列，粗体字表示推测的 -10与 -35区，方括号表示 CcpA

保护区

3.2.2 CcpA对 acoABCL操纵子的调控 acoR的表达不受 acetoin的诱导，也不受自我调控，其转录受 CcpA的负调控。 acoR上游区域有 CcpA 的特殊结合位点，在 acoL 和 acoR的中间区域有两个 cre-box，位于 acoR的起始密码子 ATG上游的 45-71bp处，因此 CcpA是acoR转录的阻遏物。

B.subtilis中 σL结构基因内部有 CcpA结合位点cre-box ，通过“路障”机制调控 σL 的转录：CcpA与 σL结构基因内 cre位点的结合阻碍了该位点下游 mRNA 的有效合成，因此被称为“路障”机制。

4 结论及展望 羟基丁酮是 B.subtilis在葡萄糖或其它发酵碳源的培养基中生长时的主要溢流代谢产物，在葡萄糖等易同化碳源耗尽后又会被继续消耗来维持自身的生命活动，其中

alsSD操纵子负责羟基丁酮的生物合成； acoABCL操纵子负责羟基丁酮的分解代谢。

acoABCL操纵子的表达受葡萄糖的抑制、受羟基丁酮的诱导；其启动子受 σL的调控，同时需要激活剂 AcoR ， AcoR 识别并结合 acoABCL 启动子上游的 90bp 大小的调控序列，从而在羟基丁酮存在的条件下激活操纵子的表达；在葡萄糖存在的条件下， CcpA 强烈抑制 acoR的表达。

这些特性使 acoABCL 操纵子的启动子（ acoA启动子）成为 B.subtilis表达系统应用中最具优势的候 选者，羟基丁酮表达系统成为在B.subtilis 内表达外源基因的最具竞争力的表达系统。

谢谢！！！