des Travaux Pratiques danalyses bactriologiques

Anne universitaire : 2011-2012

Sommaire: -Objectif .. 4 Mthode par filtration sur membrane: a-Principe 4b- Mode opratoire 4-5c-Milieux utiliss5d-Rsultats..5e-Comparaison avec les normes .6f-conclusion ..6II- Analyse dune eau contamine (eaux uses)6Objectif .6 Prparation des chantillons..6Mthode par ensemencement en milieu liquide ou du nombre le plus probable(NPP)a- Principe6b-Mode opratoire: 6-7c-Dnombrement des germes tmoignant dune pollutionFCALE ..7 Recherche des coliformes fcaux et coliformes totaux :

Recherche et dnombrement des streptocoques fcaux ou Enterococcus Recherche de spores de Clostridium Sulfito-Rducteur d-Prsentation des Milieux8e-Rsultats9-10f-Dtermination de la source de pollution des eaux10

Introduction:

Lobjectif de lanalyse bactriologique dune eau nest pas deffectuer un inventaire de toutes les espces prsentes, mais de rechercher soit celle qui sont susceptibles dtre pathognes, soit celles qui sont indicatrices de contamination fcales.Lobjectif gnral est danalyser une eau use et dterminer sa source de pollution.

II- Analyse dune eau use:Objectif: Dterminer la source la pollution fcaleAvant densemencer les milieux, on effectue des dilutions en cascades de la solution 10-1 la solution 10-9.

Prparation des chantillons: Mthode par ensemencement en milieu liquide ou du nombre le plus probable (NPP)Elle est utilise le plus souvent dans le cas des eaux troubles.a- Principe:

Le principe de la mthode NPP consiste ensemencer de dilutions dchantillon dans des tubes de milieu de culture liquide.Les dilutions sont donc incorpores dans une premire srie de tubes de milieu non vritablement slectif : cest le test prsomptif (croissance ou non). Ce premier test est qualitatif et permet de conclure seulement la prsence ou labsence de microorganismes dans la prise dessai.On ensemence une deuxime srie de tubes de milieu plus slectif en repiquant les tubes ayant donn un rsultat positif dans la premire srie : cest le test confirmatif.A partir de ces rsultats, on estime la quantit de microorganismes aprs dtermination du NPP.b-Mode opratoire: On ensemence des dilutions successives de leau analyser (par exemple 1, 0.1, 0.01) raison de 3 5 tubes de milieu de culture liquide par dilution On notera le nombre de tubes inoculs prsentant une culture visible indiquant la prsence dau moins dun micro-organisme. Il doit tre tenu compte que si labsence de culture correspond labsence de micro-organisme, plus dun micro-organisme peut tre responsable dune culture positive. Les tables, en fonction du nombre caractristique (nombre de puits positifs pour chaque dilution) indiquent la valeur statistiquement la plus probable et son intervalle de confiance).c-Dnombrement des germes tmoignant dune pollutionFCALE:Les germes tmoignant dune pollution fcale: Les coliformes totaux et fcaux Les streptocoques fcaux ou Entrocoques Les spores de clostridium sulfitorducteursRecherche des coliformes fcaux et coliformes totaux :Les coliformes totaux:correspondent des bacilles Gram ngatif, non sporul, oxydase ngatif, arobie et anarobie facultatifs, capables de se multiplier en prsence de sels biliaires et de fermenter le lactose avec production de dacide et de gaz en 48h une temprature de 35- 37C.Les coliformes fcaux ou thermotolrants: prsentent les mmes proprits mais qui ils se dveloppent 44C dont lorigine fcale est plus nette.Escherichia coli: correspond des coliformes thermotolrants qui produisent de lindole partir du tryptophane 44C. Cet indicateur est le plus spcifique dune contamination fcale.

Recherche et dnombrement des streptocoques fcaux ou Enterococcus Definition:bactries Gram positif, sphriques ou ovodes, formant des chainettes, non sporules, catalase ngative, possdant lantigne D, cultivant en anarobiose 44C, et pH 9.6, et capables dhydrolyser lesculine en prsence de bile. Ils se rpartissent en deux genresstreptococcusetenterococcus. Recherche de spores de Clostridium Sulfito-Rducteur

Spores de clostridium sulfitorducteurs: Ces germes sont prsents dans lintestin de lhomme, des animaux, et dans le sol. Ce sont des bactries qui sporulent . Les spores sont des formes de rsistances qui peuvent vivre trs longtemps. Do les clostridium sulfitorducteurs sont des indicateurs de la pollution fcale.

Milieu utilisMilieu de Rothe BCP: pour la recherche des coliformesBouillo BBouillon BLBVB: Milieu de dnombrement des coliformes

Milieu viande foie: recherche des Clostridium sulfito-rducteurs ( apparition du trouble )

Milieu Litsky (Test confirmatif): streptocoques fcaux.

d-Prsentation des Milieux:Streptocoquesfcaux :

Filtration sur membraneEnsemencement en milieu liquide

Test PrsomptifMilieu Slanetz au TTCIncubation pendant 24h 37CColonies rouges ou roses Prsence de Streptocoques fcauxMilieu de Rothe Incubation 37C pendant 24 48hRsultat positif Trouble microbien

Test ConfirmatifA partir du tube positifEnsemencement en milieu de Listky Incubation 37C pendant 24h 48h

Rsultat positif Trouble microbien ou dpt violet

e-Rsultats: Milieu de Rothe (Streptocoques fcaux)

Dilution1010-1

10-210-310-410-5

Groupement des rsultats+++++++++++++++- - -

Nombre333330

A partir de ces rsultats, On choisit le nombre caractristique 330 Daprs la table de Mac Grady n=20Alors: Nombre de bactries = 2.10^6UFT/100ml

Dilution1010-1

10-210-310-410-510-6

Groupement des rsultats+++++++++++++++++- - -

Nombre2333330

Milieu BCP: (Coliformes) A partir de ces rsultats, On choisit le nombre caractristique 330 Daprs la table de Mac Grady n=20

Alors: Nombre de bactries = 2.10^7UFT/100ml

Coliformes fcaux et totaux:

Filtration sur membraneEnsemencement en milieu liquide

Test PrsomptifMilieu Tergitol au TTCIncubation pendant 24h:

44C 37CC.F C.T( colonies jaunesAvec halo jaune )Bouillon Lactos + Cloche de DirhamIncubation 24 48h 37CTubes positifs Prsence de gaz dans la cloche

Test ConfirmatifA partir du tube positif-Un ose dans un tube contenant le BLBV-Un ose dans un tube contenant leau peptone.Incubation 44C pendant 24h 48h

Rsultat positif Rsultat ngatifPrsence de gaz Absence de gazColiformes(oui) Pas de coliformes

Eau peptone

Rsultat positif Rsultat ngatifAnneau rouge Pas danneau rougeExistence dE.coli Absence

Clostridium Sulfito-rducteur: Prparer un chantillon de 5 10 ml dans un tube essai, port 80C pendant 10min et laisser refroidir Ensemencer sur une glose viande foie Incuber 16 48h 37C Dnombrer toutes les colonies entoures par une aurole noire Rsultats:Pour le milieu Viande foie (Clostridium sulfito rducteurs), on a obtenu seulement le rsultat de tube de dilution 10^-4, ce rsultats est positif, car on obtient une aurole noire, par contre les autres tubes de dilution 10^-1, 10^-2 et 10^-3, on nobtient pas les rsultats parce que on ne peut respecter le temps dincubation, on a dpass 48 h.Les rsultats de tests confirmatifs:Milieu de litsky:Dilution10-1

10-210-310-410-5

Groupement des rsultats++++++++++++- --

Nombre33330

A partir de ces rsultats, On choisit le nombre caractristique 330 Daprs la table de Mac Grady n=20Alors: Nombre de bactries =2.10^6UFT/100mlMilieu BLBV:Dilution10-210-310-410-510-6

Groupement des rsultats++++++++++++- --

Nombre33330

A partir de ces rsultats, On choisit le nombre caractristique 330 Daprs la table de Mac Grady n=20Alors: Nombre de bactries =2.10^7UFT/100mlMilieu Eau peptone:Dilution10-210-310-410-510-6

Groupement des rsultats++++++++++++- --

Nombre33330

A partir de ces rsultats, On choisit le nombre caractristique 330 Daprs la table de Mac Grady n=20Alors: Nombre de bactries =2.10^7UFT/100mlf- Conclusion:Calcul le rapport CF/SF:R=2.10^7/2.10^6=10 RAlors lorigine de pollution fcale est source exclusivement humaine.

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