1

Az áramlási citométer és sejtszorter

felépítése és működése

Az áramlási citométer diagnosztikai alkalmazásai

Ujfalusi-Pozsonyi KingaPTE ÁOK Biofizikai Intézet

2009. 04. 20.

Diagnosztikai és terápiás módszerek biofizikai alapjai

Az áramlási citométer és sejtszorter

felépítése és működése

Fogalmak•Áramlási citometria (flow cytometry)

–Eljárás vagy mérési módszer, amellyel folyadékáramban lévőönálló részecskék, pl. biológiai sejtek egyedi tulajdonságait –fizikai, kémiai, biokémiai, biológiai jellemzőit - tudjuk lemérni.

•Flow Sorting

–Sejtek vagy részecskék elkülönítése, elválasztása mért paramétereik szerint.

FACS: Fluorescence-Activated Cell Sorting

Eredetileg csak a szorting folyamatot nevezték így, ma az analizátorokra is használják. (Valójában helytelenül.)

A flow citometria fejlődése

Gucker - 1947• Áramlási citométer baktériumok detektálására

aeroszolban.

• A fejlesztés a II. Világháború idején történ, 1947-benpublikálták.

• A cél a levegőben terjedő baktériumok gyors detektálása volt, a biológiai fegyverek kimutatására.

• Készülék: Egy sötét-látóteres mikroszkóp cellájában áramoltatták a szűrt levegőt. A lámpa a Ford autógyár reflektor-lámpája volt, detektálásra PMT-t használtak.

P.J. Crossland-TaylorFolyadék áramlási rendszer (1952)

2

1953-ban szabadalmaztatott technika:

Az elektromos vezetőképesség (ellenállás) változásait detektálta miközben a sóoldatban (pufferban) szuszpendált sejtek áthaladnak egy vékony nyíláson.

Wallace CoulterCoulter orifice (1956)

Kamentsky

Az első sejt szorter. A fényszórást HeNe lézerrel mérte. A fluoreszcenciát detektáló modell elődje.

A sejtek elválasztása térfogatuk alapján történik, a Coultercounter elv szerint.

A kiválasztott sejtek elkülönítése elektrosztatikuseltérítéssel történt (a nagysebességű szorting alapja ma is ez).

A felhasznált elv: Tintasugaras nyomtató (Richard Sweet,Stanford, 1965).

Neutrofil sejteket és limfocitákat tudtak elválasztani vérből.

Vvt. probléma: a jel a térbeli orientációtól függ

Mack Fulwyler sorter (1965) Milyen funkciókra képes egy flow citométer?

• Részecskék – sejtek - számlálása sejtszupenzióban.

• “Biologiai” és “nem biologiai” elkülönítése.

• “Élő” és “nem élő” részecskék, sejtek elkülönítése.

• 105 - 106 számú részecske mérése 1 percen belül.

• Részecskék fényszórásának és/vagy belsőfluoreszcenciájának mérése.

• Szorting: egyedi részecskék elkülönítése.

A mérések alapelvei• A részecskék egy hidrodinamikailag fókuszált

folyadékáramban haladnak át egy gerjesztő fénynyalábon (lézer, Hg-gőz lámpa, stb.).

• Fény szórásjelek detektálása.

• Specifikus fluoreszcencia detektálása.

• Multiparaméteres adat analízis.

• Elektrosztatikus vagy mechanikus részecske szeparálás: szorting.

Technikai felépítés

• Fényforrás

• Detektáló rendszer

• Áramlási rendszer (folyadék)

• Szorting

• Adatgyűjtés

• Adat analízis

3

Az áramlási citométeroptikai felépítése,

optikai jelek detektálása

Technikai komponensek• Fényforrás: Gerjesztő/megvilágító rendszer

Lézerek (350-363, 420, 457, 488, 514, 532, 600, 633 nm)

Argon ion, Krypton ion, HeNe, HeCd, Yag, szilárdtest

ÍvlámpákHigany-gőz, Hg-Xenon (megfelelő vonalak)

• Detektáló rendszerFotomultiplier csövek (PMTs)

Régebben 1-2 csőJelenleg akár 12-15 db.

FotodiódákTöbbnyire az előre irányuló szórás (FSC) mérésére

A detektor rendszer

optikai elrendezésének elveAzonos helyen történő gerjesztés

Térben szétválasztott gerjesztésKülönböző színű gerjesztő lézerek alkalmazásakor.

Egyetlen lézer alkalmazásakor.

Példa a lézer gerjesztésre• 2 léghűtéses lézer

– Coherent™ Sapphire™ szilárdtest dióda-lézer488 nm, 20 mW– JDS Uniphase™ HeNe lézer 633 nm, 20 mW

• A lézer fényt optikai kábel vezeti a fókuszáló lencséhez(nem igényel optikai beállítást).

• FSC, SSC és 4 szín (kék lézer gerjesztés)• 2 további szín (piros lézer gerjesztés)

(FACSCanto)

Emissziós optika• A fluoreszcens objektív lencse optikai

géllel van a küvettához csatolva, ez nagy hatékonyságú fluoreszcens szignálgyűjtést eredményez.

• Az objektív lencse az emittált fluoreszcencia jeleket optikai szálakra fókuszálja, amelyek a jeleket rendkívül kis veszteséggel vezetik egy oktagonálisvalamint egy trigonális gyűjtő/detektálórendszerbe.

• Mindezek nagy érzékenységet és detektálási hatékonyságot eredményeznek.

Emissziós optika• Az oktagonális gyüjtőrendszer alkalmazása a többszínű

detektálás hatékonyságát jelentősen megnövelte a korábbi „soros” elrendezésekhez képest.

• Refleksziós dikroikus tükröket alkalmaz amelyek kb. 10%-al nagyobb jelátvitelt biztosítanak.

• A tükrök és színszűrők fix elrendezésűek.

• A színszűrőket a felhasználó cserélni tudja.

• Minden PMT vörös-érzékeny.• Érzékenység: < 200 MESF (Molecules of Equivalent Soluble

Fluorophores) (valamennyi standard fluorokrómra).

4

Az áramlási tér jelentősége, tulajdonságai:

Hidrodinamikai fókuszálás

ÁÁramlramláási citomsi citomééter cellater cella

Hidrodinamikai rendszerMinta

Köpenyfolyadék

Lézer nyaláb

Piezoelektromoskristály oszcillátor

Fluoreszcenciadetektorok

Fényszórás detektor

KöpenyMag

Eltérítő kondenzátor lemezek

• A köpenyfolyadék koncentrikus körökben veszi körül a mintafolyadékot (lamináris áramlás).

• Ezáltal a mintafolyadékot az áramlási fej közepére fókuszálja.

• A hidrodinamikai fókuszálás célja: a sejtek ott haladjanak, ahol a lézer megvilágítja őket.

Minta

Köpenyfolyadék

Lézer nyaláb

Piezoelektromoskristály oszcillátor

Fluoreszcenciadetektorok

Fényszórás detektor

Köpeny

Mag

Eltérítő kondenzátor lemezek

Hidrodinamikai fókuszálás

• A piezoelektromos kristály rezgése cseppekre bontja a folyadékoszlopot.

• A cseppeket a mért fényszórás és fluoreszcens jelek alapján töltik fel pozitív vagy negatív töltéssel.

Minta

Köpenyfolyadék

Lézer nyaláb

Piezoelektromoskristály oszcillátor

Fluoreszcenciadetektorok

Fényszórás detektor

Köpeny

Mag

Eltérítő kondenzátor lemezek

Szorting

(FACSVantage)

Elektromos jelfeldolgozás: Lineáris és logaritmikus

erősítés

5

Lézer késleltetés

Analóg jelek

FSC

SSC

FITC

APC

Lézer késleltetés

00000000000000136963100000000000000000000000000000000000000

00000000000000146787641000000000000000000000000000000000000

00000000000000000000000146964100000000000000000000000000000

00000000000000235653210000000000000000000000000000000000000

A memóriában megjelenő számok digitális készülékben

FSC

SSC

FITC

APC

A számok konvertálása paraméterekké

• Jelszélesség: Mintavételek száma

• Csúcsmagasság: A legnagyobb számérték

• Terület: A számok összege

• Nincs holtidő !!!!

• Csökkenti a koincidenciák számát.

Fluoreszcens jelölésA fluoreszcencia alapjai

Fluoreszcens jelölés

Coons et al. 1941 – kifejlesztették a fluoreszcens antitesttechnikát.

Anti-pneumococcus antitestet jelöltek antracénnel, szövetekben az UV-vel gerjesztett kék fluoreszcenciátdetektálták.

Coons and Kaplan (1950) - fluoreszcein és izocianátkonjugálása.

FITC: Fluoreszcein izotiocianát: Gerjesztés: 488 nm, fluoreszcencia: 532 nm

A leukociták és (más sejtek) jellegzetes molekula kombinációt expresszálnak a sejt felszínén, ami függ:

• A sejtek típusától

• A sejtek differencálódási stádiumától

• A sejtek aktivációjától, inaktivációjától

• A sejtek egyéb funkcionális állapotától

• Kóros elváltozásoktól, differenciálódási mechanizmusoktól

Tipikus detektálásuk monoklonális antitestekkel történik

Áramlási citometriás célra az antitesteket fluoreszcens festékekkel jelöljük.

Felületi marker analízis

6

Fluoreszcens festékekkel szemben támasztott követelmények:

• Emittáljanak olyan hullámhosszon, ahol kicsi az autofluoreszcencia.

• Az emissziós spektrumuk a lehető legkisebb átfedést mutassa a többi festék spektrumával (kompenzáció).

• Kvantumhatásfokuk, abszorpciós együtthatójuk legyen magas, azaz produkáljanak erős, jól detektálhatófluoreszcenciát (érzékenység).

• Aspecifikus kötődésük legyen kicsi.

• A fehérjék (antitestek) jelölése egyszerű protokollal legyen megvalósítható.

• Ne módosítsák jelentősen a jelölt molekula tulajdonságait.

• Legyenek olcsók.

Filter konfiguráció• Standard fluorokrómok

– Kék lézer: FITC, PE, PerCP or PerCP-Cy5.5, PE-Cy7– Vörös lézer: APC, APC-Cy7

• Filterek– PE-Cy7 (735 LP dikroikus tükör, 780/60 BP)– PerCP/PerCP-Cy5.5 (655 LP dikroikus tükör, 670 LP)– PE (556 LP dikroikus tükör, 585/42 BP)– FITC (502 LP dikroikus tükör, 530/30 BP)– SSC (488/10 BP)

– APC-Cy7 (735 LP dikroikus tükör, 780/60 BP)– APC (660/20 BP)

Fluoreszcens jelölés‘Single’ fluoreszcens festékkel

A donor gerjesztődik és energia transzferrel átadja a gerjesztési energiát az akceptornak. Az akceptor világít.

Donor DonorAkceptor

Akceptor

‘Tandem’ festékkel

Detektált jelek

A klaszterek pozíciója alapján azonosítjuk a detektált minta-komponenst.

Fényszórás jel (SSC, DD)Az összetapadt gyöngyök kiszűrésére. SSC

Klaszter azonosító fluoreszcens színek (paraméterek)1 vagy 2 fluoreszcens szín, színenként 8-16 fluoreszcencia intenzitás kombinációi.

C1C2

Riporter paraméter(ek)A riporter paraméter intenzitásából történik az azonosított minta-komponens mennyiségi meghatározása.

R1

Színkompenzáció

7

FL1 FL2 FL3 FL4

Hullámhossz

Fluoreszcencia emissziós

spektrumok

α12∗I1 α32∗I3

I1 I2 I3 I4

488 nm

Gerjesztés

Színátfedés - Színkompenzáció

Hullámhossz488 nm

Gerjesztés

F1 F2 F3 F4

Fluoreszcencia emissziós

spektrumok

α12∗f1 α21∗f2

I1 I2 I3 I4

Színátfedés - Színkompenzáció

A kompenzáció elkerülhető, ha olyan fluoreszcens festékeket használunk, melyeknek keskeny az emissziós spektrumuk, ezért csak egy fluoreszcens detektor detektálja őket. Ilyenek pl. a quantum dot-ok (félvezető nanokristályok, melyek emissziója a kristály méretétől függ).

A széles gerjesztési spektrum miatt egy, pl. 488 nm-es lézerrel több quantum dot gerjeszthető, és a keskeny emissziós spektrumok miatt a fluoreszcencia átfedés nélkül mérhető.

Quantum dot-ok (qdot, QD)optikai tulajdonságai

Mérési eredmények tárolása, mentése

header$FIL=pi04.LMD$INST=EPICS DIVISION OF COULTER CORPORATION$CYT=Elite$DATE=04-Jan-80$BTIM=19:21:30$SRC=tr110901$SMNO=1TESTNAME=Peter FITC/pmt4 lin/logTESTFILE=Pe000093.PRO$BYTEORD=12$DATATYPE=I$NEXTDATA=0$MODE=L$P1N=FS...$TOT=25114

Az adatok tárolása

adatokFSC SSC FL1 ...

1. sejt 674 334 8732. sejt 898 393 7993. sejt 648 417 937

Az adatok elmentése általában ún. FCS (flow cytometrystandard) file-ban történik, ahol mindensejtről elmentik az összes mért adatot = list mode file

Az adatok megjelenítése I.Egydimenziós ábrázolási mód: hisztogram

A logaritmikus skála előnye:• összenyomja a skálát a magas értékeknél• sok biológiai paraméter lognormális eloszlást mutat, ez logaritmikus skálán haranggörbének látszik.

Hátránya:• nulla és negatív számokat nem tud ábrázolni• ún. binning artefaktum

(Binning artefaktum: úgy tűnik, hogy az alacsony intenzitásúpopuláció elnyúlik balra, és az első csatornában sok sejt halmozódik fel.)

Megoldás:olyan skála, amely alacsony értékeknél lineáris, magasaknál logaritmikus: hiperlog skála

8

1. dotplot: a két tengelyen egy-egy mértparamétert tüntetünk fel, az ábrán minden pontegy sejtnek felel meg.

2. density plot: az ábrán minden pont színe asejtek számát jelenti.

3. contour plot: az azonos sejtszámú pontokatvonalakkal kötik össze.

4. 3D (surface, felszín) ábra: a sejtekszámát a z tengelyen ábrázolják (ritkánalkalmazott)

Az adatok megjelenítése II.Kétdimenziós ábrázolási módok:

Csak a piros kapun (limfociták)belül levő sejtek FL4 eloszlása.

Kapuzás

Az összes lemértsejt FL4 eloszlása.

1024

Az áramlási citométer diagnosztikai alkalmazásai

• szuszpenziós ill. könnyen szuszpendálható sejtek vizsgálatára alkalmas sejtfelszíni antigéneket (ill. fixált és permeabilizált sejtek intracelluláris antigénjeit)• monoklonális antitesttel megjelöljük. Klinikai alkalmazásokban általában elsődlegesen jelölt antitesteket használnak.

Felhasználás:• leukémiák diagnózisa• AIDS diagnosztika (CD4+ limfocita szám)

Immunfenotipizálásáramlási citometriával

9

1. a sejteket fixáljuk és permeabilizáljuk, hogy a DNSfesték hozzáférjen a DNS-hez.2. a DNS festék (pl. propidium jodid) eljut a sejtmagba, és ott sztöchiometrikusan kötődik a DNS-hez.3. a mért fluoreszcencia intenzitás arányos a sejt DNStartalmával.

Sejtciklus ésDNS tartalom analízis

Alkalmazási terület:• daganatos sejtek

- a normálisnál magasabb DNS tartalommal rendelkeznek

- magasabb S és G2/M aránnyal rendelkeznek• apoptotikus sejtek sub-G1 DNS tartalommal rendelkeznek

1. Az indikátor hidrofób, acetoximetilészter (AM) formája átjut a sejtmembránon.2. Intracellulárisan aspecifikus észterázok hidrolizálják.3. A felszabaduló, hidrofil indikátor nem képes az elő sejtek membránján átjutni, ezért intracellulárisan felhalmozódik.4. Az indikátorok egy részének fluoreszcenciája a környezet ionkoncentrációjától függ.5. Multidrog rezisztencia mérése: az MDR pumpák kipumpálják a sejtekből az indikátort és/vagy annak AM formáját. A calcein olyan indikátor, amely nem indikál semmit, tehát csak a felhalmozódását mérjük, ill. annak hiányát MDR-t mutató sejtekben.6. A negatív töltésű oxonol a membránpotenciálnak megfelelően oszlik meg a membrán két oldalán. Depolarizáció esetén nő a sejtben levőoxonol mennyisége, így nő a sejtek fluoreszcencia intenzitása.

Ionkoncentrációk, membránpotenciálés

intracelluláris enzimaktivitás mérése

Multiplex Microbead Assay(MMA)

A gyöngy-keverékhez (szuszpenzióhoz) hozzáadjuk a mintát (vér, szérum, liquor, …).

2.

A minta komponensei reagálnak a gyöngyök

felszínére kötött reagensekkel.

3.

Egyenként lemérjük a mikrogyöngyök felszínén keletkezett reakciótermékek mennyiségét.4.

Reakció cella

Különböző színűmikrogyöngyök, amelyek

felszínére reagenseket viszünk fel.

1. Befogó antitestek

Detektálandó molekulák (Antigén)Fluoreszcens festékkel jelzett detektáló antitestek

10

Fl

Klaszter azonosítófluoreszcencia színek

Riporter fluoreszcencia

Minden szín-kombináció önálló klasztert alkot.Minden klaszter más-más minta-komponens kimutatását végzi.

Egy minta-komponens a mennyiségével (koncentrációjával) egyenesen arányos riporter fluoreszcenciát „gerjeszt”.

Inzulin

Testosteron

IL-4

Amiláz

Estradiol

Képalkotó áramlási citometria (imaging flow cytometry) :• áramló sejtekről képeket készít• a sejtek fluoreszcencia intenzitását az áramlási citométerhez hasonlóan megméri, áramlási citométerhezhasonló hisztogram és dot plot formájában megjeleníti• az egy és kétdimenziós hisztogramon kiválasztott sejtek képeit vissza lehet keresni• a sejteken kolokalizációs és morfológiai analízist is lehet végezni

Átmenet a mikroszkópia és az áramlási citometria között I.Áramlási citometria:• sok szuszpenziós sejt analízise gyorsan, automatikusan• szubcelluláris felbontóképesség nélkül

Mikroszkópia:• kevés kitapadt sejt analízise jelentős felhasználói munka árán• szubcelluláris információ

1. A sejtek az áramlási citometriában megszokotthoz hasonló áramlási cellában áramlanak.2. Az áramlási cellában a sejteknek nemcsak az összes (vagy maximális) fluoreszcencia intenzitását mérjük meg, hanem róluk kép is készül.3. A sejtek képeit a készülék elmenti...4. ... és a sejtek fluoreszcencia adatait az áramlási citométerhez hasonlóan elemezhetjük.

Lézer scanning citometria (Laser scanning cytometryLSC):• tárgylemezen levő sejteket vizsgál• az egész tárgylemezt (tehát nemcsak egy mikroszkóp látóteret) beszkennel alacsony NA-jú objektívvel• a sejteket automatikusan azonosítja• a sejteken morfológiai és kolokalizációs vizsgálatokat is lehet végezni• a sejtek fluoreszcencia intenzitás adatait az áramlási citométeren megszokott egy- és kétdimenziós hisztogram formájában is meg lehet jeleníteni sok sejt mérése automatikusan szubcelluláris felbontóképességgel

Átmenet a mikroszkópia és az áramlási citometria között II.

1. A mikroszkóp tárgylemezt a lézersugár végigpásztázza.2. Magfestés alapján a sejtmagokat a szoftver azonosítja, és a magot, ill. a körülötte levő citoplazmát körülrajzolja (szegmentálás).3. A sejtek fluoreszcencia intenzitás értékeit a gép kiszámolja, és az áramlási citométeren megszokotthoz hasonlóan elemzi.

11

Néhány példa a gyakorlatból

Aktivált eosinophil granulocyták kimutatása flowcytométerrel

András Katalin*, Fent János**, Fűrész József **, Mátyus Mária**, Horváth Győző***, Lakatos Zsuzsanna***OKK-OSSKI, Budapest, **MH-EVI Kórélettani Kutató Osztály, Budapest, ***MH-EVI Sugárbiológiai Kutató Osztály, Budapest

Bevezetés: A rutin diagnosztikai laboratóriumban használatos módszer nem szolgáltat információt az aktivált eosinophilek mennyiségére vonatkozóan. Egy olyan flowcytometriás eljárást dolgoztunk ki, amellyel teljes vérben mind a nyugalmi állapotú, mind az aktivált eosinophilek jól elkülöníthetők a neutrophilektől és a monocytáktól.Anyag és módszer: Frissen levett, 4 órán át 37oC-on tartott, valamint 0,2 mikrog/ml GM-CSF-felstimulált (4h, 37oC, 5% CO2, n=7) teljes vért a következő felszíni markerek elleni monoklonálisantitestekkel jelöltük: CD16 (FcgammaIII-R), CDw125 (IL-5alfaR), CD14 (LPS-R), CD69 (eosinophil aktivációs marker), és flowcytométerrel (BD FACScan) analizáltuk.A frissen levett vérminták kvalitatív és kvantitatív vérképét a rutin diagnosztikában alkalmazott Abbot Cell-Dyn 3500 automatával is megmértük (n=31).Eredmények: A frissen levett vérminta esetén a flowcytométerrel meghatározott CDw125(+)/CD16(-) tulajdonságú populáció korrelál a legjobban (R2=0,98) a laboratóriumi automatával meghatározott eosinophil sejtszámmal. Állás hatására (4h, 37oC) a flowcytometriásfényszórási kép megváltozik, ugyanakkor a CDw125(+)/CD16(-) populáció jól azonosítható marad, amelyen a GM-CSF kezelés hatására megnő a CD69 aktivációs marker expressziója.Következtetés: A vizsgált paraméterek lehetővé teszik az eosinophilek kvalitatív és kvantitatív meghatározását, valamint aktivációs kinetikájuk követését is.

A szteroidkezelés rövid távú hatásapolymyalgia rheumaticában szenvedő betegekre

Aleksza Magdolna, Tisza Andrea, Sipka Sándor, Zeher Margit, Szegedi GyulaDebreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, III. sz. Belgyógyászati Klinika, Debrecen

Frissen diagnosztizált, korábban gyógyszeres kezelésben nem részesült, polymyalgia rheumaticábanszenvedő betegek esetében végeztünk immunológiai vizsgálatokat: A napi 32 mg Medrol hatására bekövetkezett változásokat detektáltuk szteroid beadása előtt, majd a szteroid beadása után 6, 12, 24, 48 órával és egy héttel. Vizsgálataink során sejtfelszíni CD3-, CD4-, CD8-, CD56-, CD19-meghatározást végeztünk, továbbá meghatároztuk a CD4-, illetve CD8-pozitív sejtek IFN-gamma-, IL-4- és IL-10-tartalmát. Az értékeléseket áramlási citométerrel végeztük. A szolúbilis IFN-gamma-, IL-4-, IL-10-koncentrációt ELISA-technikával határoztuk meg.

A TNF-alfa-gén-polimorfizmus és az in vitro TNF-alfa-termelés vizsgálata rheumatoid arthritises betegeknél

Balog Attila, Gál János, Gyulai Zsófia, Mándi YvetteSzegedi Tudományegyetem, ÁOK, Orvosi Mikrobiológiai Intézet, Szeged

A rheumatoid arthritis patomechanizmusában a citokinek közül a TNF-alfa kulcsfontosságú szerepet játszik, emiatt jó terápiás célpontja az anti-TNF-kezelésnek. A betegség kialakulásában, a terápiás válasz mértékében a TNF-alfa gén polimorfizmusának is szerep juthat.Célkitűzések: meghatároztuk a TNF-alfa promóter 308-as G-A mutáció gyakoriságát azon rheumatoidarthritisben szenvedő betegek esetében (n=13), akik anti-TNF-terápiában részesültek. Ezen kívül azt vizsgáltuk, hogy az anti-TNF-terápia mennyiben befolyásolja a fehérvérsejtek in vitro TNF-termelő képességét, illetve apoptosisát.Módszerek: A TNF-alfa-308 G-A mutációt, valamint a TNF1 és a TNF2 allél jelenlétét RFLP-technikávalmutattuk ki. A bakteriális stimulációt követő in vitro TNF-termelést intracelluláris citokinfestéssel, valamint a felülúszók TNF-alfa-koncentrációjának mérésével (ELISA, bioesszé) mutattuk ki. Az apoptosis detektálására az annexinjelölést követően flow citométeres mérést alkalmaztunk.Eredmények: A fokozott TNF-alfa-termelést determináló TNF2 allél gyakoriságát a rheumatoid arthritisesbetegek esetében 54%-nak találtuk, szemben a kontrollcsoport 16%-ával. Az anti-TNF-alfa-kezelés a fehérvérsejtek által termelt TNF-alfa-t neutralizálta, de magát az in vitro citokintermelő képességet nem csökkentette. Ezt az intracelluláris citokin jelenléte, valamint az ellenanyagtól "kimosott" sejtekből felszabadulóTNF kimutatása bizonyította. A jelenséget mind a rheumatoid arthritises betegcsoportban, mind az egészséges véradók sejtjeinek vizsgálatakor megfigyeltük. A monocyták apoptosisa 48 órás in vitro anti-TNF-kezelés után volt szignifikáns (34%), de az ex vivo vizsgált mintákban ezt csupán 18%-ban észleltük.Következtetés: Az anti-TNF neutralizáló hatása, amely a rheumatoid arthritis kezelésében rendkívül előnyös, nem jelenti a TNF-termelő képesség irreverzíbilis felfüggesztését, s nem jelenti a mononukleáris, potenciálisan TNF-termelő sejtek szignifikáns apoptosisát. A TNF2 allél gyakorisága még kevés számú beteg esetében is feltűnő, ennek további vizsgálata fontos lehet a terápiás válasz sikerének prognosztizálásában.

A glükokortikoid hormon hatása a T-sejtek jelátvitelére

Bartis Domonkos, Boldizsár Ferenc, Berki Tímea, Németh PéterPécsi Tudományegyetem, ÁOK, Immunológiai és Biotechnológiai Intézet, Pécs

Kísérleteinkben a rövid idejű (öt- vagy 30 perces) nagy dózisú (10-4 mol) glükokortikoidhormon-kezelés[dexamethason (DX)] hatását vizsgáltuk in vitro tenyésztett Jurkat-sejtek jelátviteli folyamataira: Fluo-3AM festékkel áramlási citométeren mértük a hormon hatását a sejtek nyugalmi citoszolikus Ca2+-szintjére és a Ca2+-szignálra ionomycin, illetve anti-CD3-antitest-aktiváció után, valamint a tirozinfoszforilációt Western-blot módszerrel. A DX-hatás gátlására RU-486-kezelést alkalmaztunk. A nyugalmi citoszolikus Ca2+-szint DX-kezelés hatására öt perc után nem változott, 30 perc után kismértékben csökkent. Az ionomycinkezelésre bekövetkező Ca2+-beáramlás mind öt, mind 30 perc DX-kezelés után fokozódott. Anti-CD3 antitesttel végzett aktiváció hatására csökkent Ca2+-szignáltmértünk a DX-kezelt sejtekben. Jurkat-sejtekben a DX-kezelés önmagában is tirozinfoszforilációtokozott: öt perc után főleg a közepes (44-47 kDa-os), 30 perc után viszont már inkább a kis molekulatömegű (32-38 kDa-os) fehérjékben. Ezt a hatást RU-486-tal gátolni tudtuk. A DX-kezelésmegváltoztatta az anti-CD3-aktiváció utáni tirozinfoszforilációs mintázatot is: a CD3 molekula foszforilációja nem változott, ötperces DX-kezelés gátolta, míg 30 perces kezelés növelte a nagy molekulatömegű (70-110 kDa-os) fehérjék tirozinfoszforilációját, míg a kis molekulatömegű fehérjék foszforilációja már ötperces DX-kezelésre nőtt, 30 perces kezelés után pedig tovább fokozódott. Ezek a hatások valószínűleg a citoplazmatikus glükokortikoid-receptorok és a CD3 jelátviteli út fehérjéinek kölcsönhatásával magyarázhatók.

A nagy affinitású IgE-receptor a-lánca elleni autoantitestek indirekt kimutatása basophil aktivációs teszt alkalmazásával

Gyimesi Edit1, Hídvégi Bernadett3, Temesvári Erzsébet3, Sipka Sándor1, Hunyadi János2, Dankó Katalin1, Kiss Emese1, Szegedi Andrea2Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, 1III. Sz. Belgyógyászati Klinika; 2Bőrgyógyászati Klinika, Debrecen;

3Semmelweis Egyetem, Bőrgyógyászati Klinika, Budapest

A krónikus urticariában szenvedő betegek 27-50%-ánál a szérumban a nagy affinitású IgE-receptor a-lánca (Fc-epszilon-RI-alfa) elleni IgG-autoantitest található. A betegeknek ezt a csoportját, akiknél autoimmun patomechanizmus tételezhető fel, autológ szérum alkalmazásával, bőrteszt segítségével diagnosztizálják. Munkánkban egy in vitro funkcionális teszt, a basophil aktiváció mérését hasonlítottuk össze az autológ szérummal végzett bőrteszttel. Harminc, krónikus urticariában szenvedő betegnél a szérumokkal végzett inkubáció után az atópiás donorok basophil sejtjein áramlási citométerrel mértük a CD63 aktivációs marker expresszióját. A sejteket előzetesen nem stimuláltuk. Kettős fluoreszcens jelölést alkalmazva, az IgE-pozitív sejtpopuláción belül határoztuk meg a CD63-pozitív sejtek számát. Eredményeinket az autológ szérummal végzett bőrtesztével hasonlítottuk össze. Pozitív kontrollként immunblot módszerrel Fc-epszilon-RI-aalfa-ellenes antitestre pozitívnak talált szérumot és FMLP-stimulálást használtunk. A basophil aktivációs tesztben stimuláló hatással rendelkező szérumok koncentrációtól függően fokozták a CD63-expressziót. Az autológ szérummal végzett bőrteszttel a szérumok 60,3%-a, míg a CD63-expresszió-méréssel 56,8%-a bizonyult pozitívnak, a két módszer jóösszefüggést mutatott. Egészséges donorok, dermatomyositisben és bőrtüneteket okozó SLE-ben szenvedőbetegek széruma nem idézett elő CD63-expresszió-emelkedést. Adataink arra utalnak, hogy a CD63 basophil aktivációs marker expressziójának meghatározása felhasználható a krónikus urticariábanszenvedő betegek diagnosztikájában.

12

A progeszteron indukálta blokkolófaktorreceptorkötő helyének meghatározása

Palkovics Tamás, Polgár Beáta, Szekeres-Barthó JúliaPécsi Tudományegyetem, ÁOK, Orvosi Mikrobiológiai és Immunitástani Intézet, Pécs

Előzmények: A progeszteron indukálta blokkolófaktor (PIBF) a terhesség normális lefolyását Th2 citokinek termelésén keresztül segíti elő, amelyek létrejöttéhez fontos az a - korábbi kísérleteinkben már megerősítést nyert - tény, hogy perifériás lymphocyták specifikus PIBF-receptorokat fejeznek ki a felszínükön. Ismert, hogy különböző szövetekben az eredetileg 89 kDa molekulatömegű fehérjéből eltérő hoszszúságú fragmentumok keletkeznek, így rendkívül fontos lehet annak tisztázása, hogy a fehérje mely részei játszanak szerepet a receptorhoz való kötődésben. Jelen munkánkban ezt kívántuk meghatározni.Anyag és módszer: Fluoreszcens anyaggal jelölt rekombináns fehérjét használva áramlásos citométerrel vizsgáltuk kötődését az összes jelenleg hozzáférhető, különféle méretű és a PIBF-molekula különböző részein elhelyezkedő fragmentumsejtek felszínéhez, elemeztük a kötés specificitását.Eredmények: A 48 kDa-os N-terminális PIBF-rész specifikusan kötődik a lymphocyták felszínéhez; más fragmentumokkal is hasonló eredményeket kaptunk. A specifikus kötődés nem köthető szorosan egyik lymphocyta-szubpopulációhoz sem. Egyéb sejtek (például különféle tumorok sejtjei) változómértékben kötik a fragmentumokat.Következtetések: Az a tény, hogy bizonyos sejtek képesek specifikusan kötni a progeszteron indukálta blokkolófaktort, munkacsoportunk azon megfigyelését is támogatja, hogy a fehérjekötődés STAT-foszforilációt indukál, és e folyamatok egymásra épülése eredményezi a progeszteron indukálta blokkolófaktor citokinegyensúlyra gyakorolt hatásait.

Különböző eredetű egér makrofágokantigénprezentáló képességének összehasonlítása

Uzonyi Barbara V. évf. biológus hallgató ELTE Immunológiai Tanszék, Budapest

A kórokozókkal szembeni hatékony védelemben az adaptív immunválasz specifikus válasza mellett alapvetőszerepet játszanak a természetes immunrendszer sejtjei és szolúbilis elemei. Az adaptív immunválaszban kulcsszereplő T-limfociták aktivációjához antigénbemutatásra van szűkség, mely feladatot különböző eredetű és funkciójú sejtek, a dendritikus sejtek (DC), a makrofágok és a B-limfociták látják el. A makrofágoknak a kórokozók fagocitózisa, intracelluláris elpusztítása és az immunválaszt szabályozó citokinek szekréciója mellett komplement-termelõ, valamint antigénprezentáló (APC) képessége is elengedhetetlen része a természetes és az adaptív immunválasz szabályozott együttműködésének. Mindhárom APC sejttípus rendelkezik komplement receptorokkal, és az ezekhez kötődő ligandumok befolyásolják a sejt működését. A DC-ek és a makrofágokegyaránt a csontvelői mieloid progenítorokból differenciáltathatók, és az őket érés illetve antigénfelvétel közben érő hatások nemcsak azt fogják meghatározni, hogy milyen sejt jön létre, hanem azt is, hogy a sejt aktivációt vagy toleranciát fog kiváltani.Munkánkban makrofág eredetű sejtvonalakon (J774, P388D1, RAW, WEHI-3, WEHI-3b), csontvelőből vagy embrionális őssejtekből differenciáltatott, valamint különbözőképpen kezelt (ConcanavalinA, paraffinolaj, proteóz pepton, tioglikolát) egerekből származó peritoneális makrofágokon vizsgáltuk, hogy megjelenik-e a komplement kaszkádban és a szabályozó folyamatokban központi szerepet betöltő C3 fragmentumait kötő CR1 és/vagy CR2, valamint ha igen, akkor ezek keresztkötésével indukálható, illetve fokozható-e az antigénprezetációban fontos B7 molekulák száma.A RAW és a WEHI-3 kivételével a sejteken a CR2 kismértékű jelenlétét mutattuk ki áramlási citométerrel. A sejteket különbözőképpen aktiváltuk: LPS ± IFNγ, aggregált C3, anti-CR2 scFv, anti-FcγRII. Az aktivációmértékére a sejtfelszíni molekulák expressziójából a sejtek C3-és citokin-termeléséből valamint APC képességéből következtettünk. A CR2 aggregált C3-mal történő keresztkötése ugyanolyan változásokat indukált a vizsgált sejtfelszíni molekulák expressziója tekintetében, mint a CR2-specifikus ellenanyaggal valókeresztkötés. Az eddigi kísérleteink eredményei szerint a komplementreceptorok keresztkötése a vizsgált sejttípusokon negatív szabályozó szerepet tölt be, szemben a B-sejteknél leírt pozitív regulációval.

A γ/δTCR+ subpopulációk aránya egészséges és fenyegető koraszülésklinikai tüneteit mutató terhes nők perifériás vérében

Szereday László*, Barakonyi Alíz*, Mikó Éva*, Varga Péter**, Szekeres-Barthó Júlia*(*PTE ÁOK, Orvosi Mikrobiológiai és Immunitástani Intézet, Pécs **Baranya Megyei Kórház, Szülészet-Nőgyógyászat, Pécs)

Célkitűzések: Korábbi adataink szerint egészséges terhesekben a γ/δ T sejteknek két funkcionálisan elkülönülő csoportját lehet megkülönböztetni: a potenciálisan citotoxikus Vδ2+ T sejteket illetve a Th2 jellegzetességeket mutató Vδ1+ T sejteket. Munkánk célja az volt, hogy megvizsgáljuk, hogy az egyes γ/δ subpopulációk milyen arányban fordulnak elő egészséges illetve pathológiás terhesek valamint nem terhes egyének periferiás vérében.Módszerek: Nyolcvanhat terhes egyén (59 egészséges terhes, ill. 27 pathológiás terhes) perifériás vérében az egyes γ/δ subpopulációk (Vδ1, Vδ2) arányát flow citométeres analízis segítségével határoztuk meg. 14 nem terhes egészséges alkotta a kontroll csoportot. A pathológiás terhesek csoportját a fenyegető koraszülés klinikai tüneteit (vérzés vagy méhkontrakciók) mutató terhesek ill. habituális vetélő nők alkották.Eredmények: Pathológiás terhesek periferiás vérében szignifikánsan emelkedett a citotoxikus Vδ2+ T sejtek aránya egészséges terhes nőkhöz, ill. nem terhesekhez képest. Ezzel szemben a Vδ1+ T sejtek aránya szignifikánsan lecsökkent a pathológiás terhes csoportban egészséges terhesekhez viszonyítva.Következtetések: Eredményeink azt sugallják, hogy a γ/δ T sejtek fontos szerepet játszanak a fenyegetőkoraszülés ill. habituális vetélés pathogenezisében.

Immunológiai eltérések Hodgkin-kórban

Aleksza Magdolna, Miltényi Zsófia, Keresztes Katalin, Sipka Sándor, Illés ÁrpádDebreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, III. Sz. Belgyógyászati Klinika

Munkánk során 127, komplett remisszióban lévő, Hodgkin-kórban szenvedő beteg sejtfelszíni CD markereit és intracitoplazmatikus, valamint szolúbilis citokinszintjeit vizsgáltuk áramlási citométerrel és ELISA technikával. Hasonlóan az irodalmi adatokhoz, az egészséges kontrollok eredményeihez képest csökkent a CD3+ T-sejtek aránya, ezen belül csökkent a T-helper és fokozódott a T-citotoxikus sejtarány. A B- és NK-sejt aránya fokozódott. Az intracitoplazmatikuscitokinekkel kapcsolatban eddig nem álltak rendelkezésre irodalmi adatok. A CD4+ és a CD8+ sejtek stimulációra bekövetkezett IFN-gamma-expressziójában nincs eltérés a referens egyénekhez képest, azonban a T-helper sejtek IL-4-expressziója csökkent. A CD4+ és a CD8+ sejtek IL-10-expressziója egyaránt szignifikánsan emelkedett. A szolúbilis IFN-gamma-, IL-4- és IL-10-szintek nem követik az intracitoplazmatikus változásokat.Munkánk során arra is választ kerestünk, hogy a tapasztalt immunológiai eltéréseket okozhatta-e Helicobacter pylori-(HP-) fertőzés. A HP-átfertőzöttség és az eltérések között nem tapasztaltunk összefüggést, míg a 13C-ureakilégzési teszttel kimutatott friss Helicobacter pylori-fertőzöttHodgkin-kóros betegek CD8+ sejtjeinek IFN-gamma-expressziója szignifikánsan magasabb volt, mint a nem fertőzött betegcsoporté.

A PIBF biológiailag aktív régióinak azonosítása II.

Mikó Éva1, Polgár Beáta1, Szereday László1, Berki Tímea2, Nagy Eszter3, Szekeres-Barthó Júlia1Pécsi Tudományegyetem, ÁOK,

1Orvosi Mikrobiológiai és Immunitástani Intézet, 2Immunológiai és Biotechnológiai Intézet, 3INTERCELL AG, Bécs, Ausztria

Előzmények: A terhesség során a lymphocyták által termelt, progeszteron indukálta blokkolófaktor (PIBF) immunológiai hatásai közül kiemelendők az NK-sejtek aktivitásának gátlása és a citokintermelés eltolása Th2 irányba. Újabb adataink szerint a PIBF malignus tumorsejtekben is szintetizálódik - például az MCF-7 tumorsejtvonalban -, hozzájárulva a daganat növekedéséhez.Célkitűzés: Jelen munka során arra kerestük a választ, hogy a molekula mely régiója felelős az immunmodulációs hatásokért. Funkcionális tesztekben megvizsgáltuk a PIBF rekombináns konstruktjaivalkezelt lymphocyták "killer" aktivitását az MCF-7 tumorsejtekkel szemben, valamint az anti-PIBF antitesttel inkubált MCF-7 sejtekkel szembeni citotoxicitást mértük.Módszerek: Nem terhes, egészséges egyénekből származó lymphocytákat rekombináns PIBF-konstruktokkalkezeltünk elő, majd MCF-7 tumorsejtekkel inkubáltuk. Áramlásos citométerrel vizsgáltuk az elölt tumorsejtekarányát. Az MCF-7 daganatsejteket - anti-PIBF poliklonális ellenanyaggal előkezelve - egészséges egyének lymphocytáival hoztuk össze, a citotoxicitás mértékét szintén áramlásos citométerrel határoztuk meg.Eredmények: A 48 kDa-os N-terminális darab és a PN1-konstrukt szignifikánsan csökkentette az egészséges egyének lymphocytáinak az MCF-7 tumorsejtekkel szemben kifejtett citotoxikus aktivitását; ugyanakkor az anti-48 kDa-os ellenanyaggal kezelt MCF-7 sejtek érzékenyebbé váltak a lymphocyták mediálta lízisselszemben.Következtetés: A PIBF-molekulán belül a PN1 és a 48 kDa-os N-terminális régó segíti elő a daganatok lokális immunológiai tumorellenes hatásokkal szembeni túlélését.

A képalkotó citometria alkalmazási lehetőségei

Bacsó Zsolt1, Megyeri Attila2, Szabó Gábor1 és James F. Eliason31DE OEC, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet, Debrecen,

2DE OEC, Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet, Debrecen,3Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, Michigan, USA

A sejtbiológia és az orvostudomány fejlődése szorosan kapcsolódik modern technológiák kifejlesztéséhez. Így kapcsolódott a patológia a fénymikroszkóp feltalálásához és így lett napjainkban az áramlási citométer a klinikai labordiagnosztika egyik sarokpillére. Az áramlási citometriaszuszpenziós mintákban egyedi sejtek tömeges és gyors kvantitatív analízise révén lehetőséget adott az immunfenotipizálásra, a tumorok ploiditásának vizsgálatára, vagy intracelluláris fehérjéinek mennyiségi meghatározására. A szövettani képi információknak az áramlási citometriában mért sejtek kvantitatív adataihoz való direkt hozzárendelésnek ugyanakkor korlátot szabott a tárgylemezen végezhető statisztikai analízisek hiánya. A képalkotó citometria letapadó sejtkultúráknak az áramlási citometriához hasonló egyedi sejteken történő kvantitatív képi analízisét biztosítja, lehetővé téve ilyen módon a szövettani és a citometriás ismeretek integrálását.