Avances en el manejo de la reproducción en peces teleósteos

Gustavo M. Somoza

Laboratorio de Ictiofisiología y Acuicultura. IIB-INTECH Chascomús. Provincia de Buenos Aires. Argentina

En qué casos debo intentar controlar la reproducción

en cautiverio?

1.Control de la gametogénesis

2.Control de la maduración final

1. Control de toda la gametogénesis • Para inducir pubertad.

• Para adelantar la reproducción.

• Para retrasar la reproducción.

• Para obtener más de un desove del mismo

stock de reproductores en una misma temporada.

• Para extender la temporada reproductiva.

2. Control de la maduración final • La espermiación ocurre pero la producción de

esperma es pobre.

• Aunque la gametogénesis ocurre normalmente la ovulación está a menudo bloqueada por falta de estímulos ambientales.

• Para sincronizar la reproducción entre peces.

• Para evitar manipulación repetida durante la estación reproductiva (estres, anestesias repetidas, daños en la piel y patologías asociadas).

Disfunciones reproductivas en hembras

•Ausencia completa de vitelogénesis en cautiverio (Anguilla anguilla).

•La vitelogénesis progresa pero no se produce la maduración final (Paralichthys lethostigma, Pleuronectes ferrugineus, Morone saxatilis)

•Ausencia de desove a pesar que los oocitos han sido ovulados (Oncorhynchus mikiss, Epinephelus aeneus)

•Ausencia completa de espermatogénesis en cautiverio (Anguilla anguilla).

• Reducción en la cantidad o calidad de esperma (Mylonas et al., 1998; Mylonas & Zohar, 2001).

Disfunciones reproductivas en machos

I A2

A1 A1 ( 2) A0 ?

B1 (2)

B2 (4)

B3 (8)

B4 (16)

B5 (32)

B6 (64)

II

a

b

c

Spermatocytes I (128)

Spermatocytes II (256)

Spermatids (512)

III, IV V, VI

previtelogénesis

vitelogénesis

Pro

fase p

rime

r divisió

n

Maturación oocitaria Hidratación

Prim

er d

ivisión

Ovulación

Espermiación 1º cuepo

polar

Espermatogénesis Ovogénesis

Fase

s FS

H d

ep

en

die

nte

s

Fase

s LH

de

pe

nd

ien

tes

LH (GtH II) FSH (GtH I)

Cerebro

Hipófisis

Gonada

Factores ambientales +/-

DA (-)

GnRH (+)

Inducción. Cómo???? Domesticación Manejo de los factores ambientales Uso de extractos hipofisarios Uso de gonadotrofinas heterólogas Uso de gonadotrofinas homólogas (ej. SGG100) Uso de hormonas liberadora de gonadotrofinas Uso de hormonas esteroideas

Cerebro

Hipófisis

Gonadas

LH FSH

GnRH

Factores ambientales = activación del eje cerebro-hipófisis-gonada para: -control a largo tiempo del ciclo reproductivo para estimular FSH - inducir el pico ovulatorio de LH

Estimulación de la secreción de GtHs endógenas. Estimulación de la secreción de LH por el uso de análogos de GnRH.

Inyección de gonadotrofinas exógenas, extractos hipofisarios = hipofisación, para iniciar maduración final y ovulación

Injección de esteroides inductores de la maduración para iniciar maduración final y ovulación

Niveles de intervención

• Domesticación

• Manejo de los factores ambientales

Cerebro

Hipófisis

Gonadas

LH FSH

GnRH

Factores ambientales = activación del eje cerebro-hipófisis-gonada para: -control a largo tiempo del ciclo reproductivo para estimular FSH - inducir el pico ovulatorio de LH

Niveles de intervención

Los factores ambientales no aptos, pueden evitarse con la adaptación/domesticación

Ejemplo, seabream Sparus auratus.

Cuando comenzó su cultivo al comienzo de los ´70 sólo se lograba el desove por inducción hormonal y stripping (Gordin & Zohar, 1978; Zohar & Gordin, 1979, Zohar & Mylonas, 2001).

Se logró luego que desove diariamente durante los tres meses de la estación reproductiva, usando inducción sólo para aquellos peces que no responden (Barbaro et al., 1997).

Du

raci

ón

de

l dia

en

ho

ras

Desove natural

2do desove avanzado bajo fotoperíodo controlado

Me puedo reproducir dos veces al año bajo fotoperíodo controlado

Hembras que ovulan % del total en:

Fotoperíodo natural A: luz continua desde el comienzo de la alimentación B: luz continua desde primavera

Pero con mucha luz no puedo!!!!!!!

• Uso de extractos hipofisarios

• Uso de gonadotrofinas heterólogas

• Uso de gonadotrofinas homólogas

Cerebro

Hipófisis

Gonadas

LH FSH

GnRH

Inyección de gonadotrofinas exógenas, extractos hipofisarios = hipofisación, para iniciar maduración final y ovulación

Niveles de intervención

Ejemplos de aplicaciones de preparaciones de gonadotrofinas

Zohar & Mylonas, 2001

Sin embargo puede tener sus dificultades!!!!! Morone saxatilis

hCG 500 UI/Kg

Zohar & Wehage

Hormonas liberadora de gonadotrofinas

(GnRH)

Análogos superactivos

Cerebro

Hipófisis

Gonadas

LH FSH

GnRH

Estimulación de la secreción de GtHs endógenas. Estimulación de la secreción de LH por el uso de análogos de GnRH.

Niveles de intervención

mammalian sea bream salmon whitefish catfish herring chicken-II pejerrey

His

-

-

-

-

-

-

-

Trp

-

-

-

-

-

-

-

Ser

-

-

-

-

-

-

-

Tyr

-

-

-

His

His

His

Phe

Gly

-

-

-

-

-

-

-

Leu

-

Trp

Met

-

-

Trp

-

Arg

Ser

Leu

Asn

Asn

Ser

Tyr

Ser

Pro

-

-

-

-

-

-

-

Gly NH2

-

-

-

-

-

-

-

pGlu

-

-

-

-

-

-

-

Secuencia aminoacídica de los ocho GnRHs encontrados en teleósteos

Ventajas del uso de GnRH

• Libera las propias gonadotrofinas

• Similaridad estructural no hay especificidad

• Decapétidos no respuesta inmune

• Puede ser sintetizado a bajo costo

• Se sintetizan análogos superactivos

La vida media de GnRH es muy corta P

lasm

a G

nR

H n

M

10

0.1

1

segundos

2400 600

% t

ota

l / m

l su

ero

160

64

32

16

40

minutos

sGnRH en circulación luego de la inyección intravenosa en seabream Gothilf & Zohar, 1996

125I-sGnRH en cirulación luego de la inyección intravenosa en goldfish Huang et al., 1991

Las endopeptidasas degradan GnRH

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Un proceso similar ocurre en hígado y riñon

pGLU-HIS-TRP-SER-TYR

GLU-TRP-LEU-PRO-GLYNH2

pGLU-HIS-TRP-SER-TYR - GLU-TRP-LEU-PRO

pGLU-HIS-TRP-SER-TYR - GLU-TRP-LEU-PRO -GLYNH2

En hipófisis

Degradación de sGnRH y mGnRH nativos por diferentes tejidos Sparus aurata

Hipófisis Riñón Hígado % degradación % degradación % degradatción

T 1/2 45m 180m 45m 180m 45m 180m

sGnRH 77 35.4 78.3 62 36.6 88 81 33.2 77 mGnRH 48 50.2 87.7 42 50.1 93.1 48 48.8 91

Análogos Superactivos de GnRH

Diseñados para evitar la degradación enzimática por sustitución de aminoácidos en la posición 6 por D-aminoácidos.

pGLU-HIS-TRP-SER-TYR - GLU-TRP-LEU-PRO -GLYNH2

pGLU-HIS-TRP-SER-TYR - D-TRP-TRP-LEU-PRO -net etilamida

sGnRH-A

pGLU-HIS-TRP-SER-TYR - GLU-LEU-ARG- PRO –GLYNH2

pGLU-HIS-TRP-SER-TYR - D-ALA-LEU-ARG- PRO -net etilamida

mGnRH-A

Degradación de sGnRH, mGnRH, sGnRH-A y mGnRH-A por diferentes tejidos Sparus aurata

Hipófisis Riñón Hígado % degradación % degradación % degradación

T 1/2 45m 180m 45m 180m 45m 180m

sGnRH 77 35.4 78.3 62 36.6 88 81 33.2 77 mGnRH 48 50.2 87.7 42 50.1 93.1 48 48.8 91 D-Ala6

mGnRH 454 12.6 24.2 232 15.3 36.1 294 6.5 15.7 D-Arg6

sGnRH 2186 3.9 7.0 867 4.1 10.9 >2500 1.8 2.2

Los análogos de GnRH son más potentes que los nativos para estimular la liberación de LH

Lib

era

ció

n d

e L

H

0

100

50 %

dosis de GnRH

ED50

Eficiencia de varios análogos sobre la liberación de LH por células hipofisarias dispersas en goldfish

Además, la pegada al receptor está igualmente incrementada

Habibi et al., 1989

Todas las variantes de GnRH tienen efectos hipofisotrópicos?

En seabream, es cGnRH-II la más activa

Zohar et al., 1995

Los análogos de GnRH son usados en muchas especies

Especie análogo dosis antagonista µg/kg Af. Catfish D-Ala 6 5 Pim goldfish D-Ala6 50 Pim goldfish D-Arg6 10 Pim, Dom carpa D-Ala6 10 Pim, Dom In. catfish D-Arg6 25 Dom Yellow perch D-Ala6 100 Pim Black carp D-Ala6 10+20 Dom

En otras se precisa combinar con antagonistas dopaminérgicos como (domperidona, pimozide, etc.)

En algunas especies (salmónidos, y especies marinas), una sola inyección induce ovulación

% d

e o

vula

ció

n

No todos los análogos (20 µg /kg) tienen la misma potencia

DTrp6-LHRH

Control

DTrp6Pro9net-sGnRH

DAla6Pro9net-LHRH

DArg6Pro9net-sGnRH

Breton et al. 1988

Formas de administración

• Administración aguda

• Administración crónica

• Intraperitoneal, intramuscular

• En el agua

• En la comida

Liberación lenta de GnRH-A

La liberación sostenida de análogos de GnRH estimula la secreción de LH en forma prolongada

sostenido

10

20

30

40

50

60

LH p

lasm

a n

g /

ml

1 3 9 24

horas

2 5 8 12 15 dias

Efecto de adinistración aguda y sostenida de D-Trp6 mGnRH sobre la secreción de LH en trucha (20 µg / kg)

Breton et al. 1988

Agudo

Breton et al. 1988

La liberación lenta es más eficiente para inducir ovulación

% d

e o

vula

ció

n a

cum

ula

da

Dias de post tratamiento

Agudo Sostenido

Control

DTrp6Pro9net-sGnRH

DTrp6-LHRH

DAla6Pro9net-LHRH

DArg6Pro9net-sGnRH

Breton et al., 1988

Estos análogos también promueven espermiación

Sorbera et al., 1996

Sistemas de liberación sostenida

• Pellets de colesterol

• Pellets de celulosa

• EVAc (polietilen-vinil-acetato)

• FAD-sa (poli-lactitide-glicolide)

• Met (polymetacrilato)

Cuál es el problema principal? Un buen criterio para verificar la madurez de los huevos

Central Migrando Periférica

Los más usuales - apariencia externa: abdomen dilatado, papila genital Luego de la biopsia: * posición de la vesícula germinal en la periferia del oocito luego del aclaramiento * diámetro del oocito * distribución de los diámetros de los oocitos, presencia de oocitos en la clase más madura

Un ejemplo en pejerrey

Odontesthes bonariensis Foto: CA Strüssmann

1. Es una especie endémica cuyo cultivo despierta mucho interés y

aún está en vías de desarrollo.

2. Es un desovador múltiple.

3. Posee vitelogénesis y desove asincrónico.

4. Los machos poseen muy poco esperma liberable

2. Control de la maduración final • La espermiación ocurre pero la producción de

esperma es pobre.

• Aunque la gametogénesis ocurre normalmente la ovulación está a menudo bloqueada por falta de estímulos ambientales.

• Para sincronizar la reproducción entre peces.

• Para evitar manipulación repetida durante la estación reproductiva (estres, anestesias repetidas, daños en la piel y patologías asociadas).

• Inducción de espermiación mediante el uso de hCG.

• Inducción de espermiación mediante el uso de extractos heterólogos de hipófisis.

• Inducción de espermiación mediante el uso de análogos superactivos de GnRH-A (GnRH-A).

• Inducción del desove por implante de pellets de liberación sostenida de GnRH-A.

CEREBRO

HIPOFISIS

GONADAS

LH FSH

GnRH

GnRH-A

hCG Extractos hipofiarios

Niveles de intervención

Procedimiento

Efecto de hCG sobre producción de esperma en pejerrey

Miranda et al., 2005

1

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

625UI/kg312 UI/kg156 UI/kg78 UI/kg39 UI/kgControl

c

c

c

b

b

a

MIL

T V

OLU

ME

(%

body

weig

ht)

Efecto de extractos hipofisarios de salmón sobre producción de esperma de pejerrey

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

30 mg/Kg 40 mg/Kg20 mg/Kg10 mg/kgControl 5 mg/Kg

c

c

c

b

b

a

MIL

T V

OLU

ME

(%

body

weig

ht)

Miranda et al., 2005

• No hubo diferencias significativas en la concentración de espermatozoides.

• No hubo cambios en la motilidad de los espermatozoides.

• No se observaron diferencias entre los porcentajes de fecundación entre los distintos tratamientos.

Tratamiento % Fecundación

Control 77.5 ± 6.1

hCG (156 UI/kg) 74.2 ± 5.3

CPE (10 mg/Kg ) 76.5 ± 4.2

SPE (20 mg/Kg ) 78.6 ± 2.9

sGnRH-A (5μg/Kg ) 80.4 ± 6.9

mGnRH-A (10μg/Kg) 75.6 ± 3.2

Miranda et al., 2005

Inducción del desove mediante el uso de implantes de sGnRH-A

Crecimiento primario

Oogonia Proliferación mitótica

Crecimiento secundario

Maduración Final

Gametogénesis en peces teleósteos hembra

Ovulación

Primario

Perinucleolar

Gránulos corticales o lipídicos

Vitelogénico

Migración de vesícula germinal

Vesícula germinal periferica

Desaparición de vesícula

Células foliculares

Arresto meiótico (Profase I)

Síntesis de proteínas

Vesícula germinal

Granulosa Teca

Alvéolos corticales (glicoproteinas)

Gotas lípidos

Deposición de gránulos de vitelo (fosfoglico- lipoproteina)

Dos capas de células foliculares

Gran aumento en el tamaño del ovario

Vesícula germinal excéntrica

Vesícula germinal periférica

Fusión del vitelo

Coalescencia de gotas lipídicas

Gran gota lipídica

Clarificación del ooplasma

Disolución de la membrana nuclear

Hidratación

Contracción del folículo

Ruptura del Folículo

Oocito maduro

Desarrollo del Corion

Adaptado de C. Sullivan

• Peces nacidos y criados en cautiverio • Peso corporal = 202 ± 19 gramos • Estanques interiores (3000 litros) • Sistema de circulación abierto

• Fotoperíodo natural y temperatura controlada (18 ± 2 ºC) • Caracterización del estadío gonadal por biopsia • Implante de pellets de sGnRH-A (75 μg/pez)

10 hembras de pejerrey en fin de vitelogénesis con pellets de sGnRH-A + 10 machos sin tratamiento. Grupo control: 10 hembras de pejerrey en fin de vitelogénesis con pellets de colesterol + 10 machos sin tratamiento.

Procedimiento

Tratados: 80%

Controles: 20%

41.000 huevos en 10 dias! Miranda & Somoza, 2009

En plena temporada reproductiva

• Peces nacidos y criados en cautiverio • Peso corporal = 477.1 ± 6.3 gramos • Estanques interiores (3000 litros) • Sistema de circulación abierto

• Fotoperíodo (15L:9O) y temperatura natural (19.4 ± 0.4˚C) • Caracterización del diámetro de la apertura genital • Implante de pellets de sGnRH-A (75 μg/pez)

Tratados: 80%

Controles: 30% 60.000 huevos en 10 dias!

Hacia el fin de la temporada reproductiva

Miranda & Somoza, 2009

7th International Symposium on Fish Endocrinology Buenos Aires, Argentina

Septiembre 3-6, 2012

Comité Organizador Local Canosa, Fabián Fernandino, Juan I. Lo Nostro, Fabiana Miranda, Leandro Pandolfi, Matías Somoza, Gustavo (Chair) Vissio, Paula

ISFE International Committee Chang, Ching-Fong (Taiwan) Elizur, Abigail (Australia) Ge, Wei (China) Habibi, Hamid (Canada) Kah, Olivier (France) Kobayashi, Makito (Japan) Levavi-Sivan, Berta (Israel) Schreck, Carl (USA) Schulz, Rüdiger (The Netherlands) Swanson, Penny (USA) Takei, Yoshio (Japan) Tyler, Charles (UK) Van Der Kraak, Glen (Canada)

Comité Científico Arranz, Silvia Eda (Argentina) Awruch, Cynthia (Argentina) Bernier, Nicholas (Canada) Carriquiriborde, Pedro (Argentina) Cerdá-Reverter, José Miguel (Spain) Cussac, Víctor (Argentina) Guiguen, Yann (France) Joy, Keerikkatil (India) Trudeau, Vance (Canada) Vizziano, Denise (Uruguay) Wong, Anderson (China) Zanuy, Silvia (Spain)

7th International Symposium on Fish Endocrinology Buenos Aires, Argentina

Septiembre 3-6, 2012

Symposia S.1 Evolution and origin of the peptide hormones structure and function S.2 Neurosteroids S.3 Neuroendocrinology S.4 Steroid/Thyroid hormones and receptors S.5 Pituitary gland: Molecular and cellular endocrinology S.6 Endocrine disruption S.7 Endocrine control of ion and osmoregulation S.8 Gonadal endocrinology S.9 Endocrine regulation of feeding and growth S.10 Developmental endocrinology and sex differentiation S.11 Endocrine aspects of behavior S.12 Omics on fish endocrine systems S.13 Endocrinology of stress S.14 Aquatic biotechnology related to fish endocrinology

www.7isfe.org

Muchísimas gracias!!