AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES GENOTÓXICA, ANTIGENOTÓXICA ... · Cumarinas e chalconas são...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
LABORATÓRIO DE RADIOBIOLOGIA E MUTAGÊNESE
AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES GENOTÓXICA, ANTIGENOTÓXICA,
MUTAGÊNICA, ANTIMUTAGÊNICA E RECOMBINOGÊNICA DO
HÍBRIDO CUMARINA-CHALCONA (7-METOXI-3-(E)-3-(3,4,5-
TRIMETOXIFENIL)ACRILOIL)-2H-CROMEN-2-ONA) EM BACTÉRIAS,
CAMUNDONGOS E DROSOPHILA MELANOGASTER
CAMILA REGINA DO VALE
GOIÂNIA-GO
2017
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CAMILA REGINA DO VALE
AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES GENOTÓXICA, ANTIGENOTÓXICA,
MUTAGÊNICA, ANTIMUTAGÊNICA E RECOMBINOGÊNICA DO
HÍBRIDO CUMARINA-CHALCONA (7-METOXI-3-(E)-3-(3,4,5-
TRIMETOXIFENIL)ACRILOIL)-2H-CROMEN-2-ONA) EM BACTÉRIAS,
CAMUNDONGOS E DROSOPHILA MELANOGASTER
GOIÂNIA-GO
2017
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Biológicas do Instituto de Ciências Biológicas
da Universidade Federal de Goiás, como requisito
parcial para obtenção do título de Doutor em Ciências
Biológicas.
Área de Concentração: Bioquímica e Genética.
Orientadora Profa. Dra. Lee Chen Chen
Co-Orientador Prof. Dr. Guilherme Roberto de Oliveira
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CAMILA REGINA DO VALE
AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES GENOTÓXICA, ANTIGENOTÓXICA,
MUTAGÊNICA, ANTIMUTAGÊNICA E RECOMBINOGÊNICA DO
HÍBRIDO CUMARINA-CHALCONA (7-METOXI-3-(E)-3-(3,4,5-
TRIMETOXIFENIL)ACRILOIL)-2H-CROMEN-2-ONA) EM BACTÉRIAS,
CAMUNDONGOS E DROSOPHILA MELANOGASTER
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________ Profa. Dra. Lee Chen Chen
Universidade Federal de Goiás
_____________________________________________ Profa. Dra. Carolina Ribeiro e Silva
Universidade Federal de Goiás
_____________________________________________ Profa. Dra. Cristiene Costa Carneiro
Pontifícia Universidade Católica de Goiás
_____________________________________________ Prof. Dr. Paulo Roberto de Melo Reis
Pontifícia Universidade Católica de Goiás
_____________________________________________ Prof. Dra. Wanderlene Blanco Nunes
Universidade Federal de Goiás
Aprovada em: ____/____/_____
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AGRADECIMENTOS
Primeiramente meu agradecimento é para Deus por tudo que tens feito em minha
vida.
À minha orientadora Prof.ª Dr.ª Lee Chen Chen, pela oportunidade e por me orientar
desde o mestrado. Agradeço pela confiança depositada, pelo conhecimento
compartilhado, pela paciência e carinho dispensado.
Ao Prof. Dr. Guilherme Oliveira, meu co-orientador, pelas contribuições para a
realização deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Salvador de Carvalho pela amizade, carinho e todos os ensinamentos.
Aos professores da banca por dedicarem um pouco do seu tempo na análise desta
tese, contribuindo com preciosas sugestões para o seu engrandecimento.
Às minhas mães Maria Aparecida do Vale (in memoriam) e Florentina Santos do Vale
principais responsáveis pela minha formação, oferecendo todas as condições, seja
financeira ou moral, que me permitiram alcançar esse objetivo.
Às minhas tias Maria Madalena do Vale Pereira e Zélia Maria do Vale por todo carinho,
apoio e orações.
Ao meu querido e amado esposo Rafael Guimarães Dias por ser tudo que eu sempre
precisei e meu companheiro de todas as horas a qual quero viver junto o resto da
minha vida.
À amiga-irmã Débora Cristina da Silva Lima, companheira de vida, pois nossa
amizade vai muito além da vida acadêmica, obrigada pelo carinho, apoio em tudo.
Ao mestre Murilo Machado dos Anjos pela ajuda na síntese do composto.
Ao Jefferson Hollanda Véras pelo apoio e por contribuir muito com a realização do
trabalho.
Aos amigos do Laboratório de Radiobiologia de Microorganismos e Mutagênse Aroldo
Vieira de Moraes Filho, Carolina Ribeiro e Silva, Cristiene Costa Carneiro, Rangel
Moreira Silva pela ajuda com os experimentos e pelo companheirismo.
À todos os demais amigos e colegas do laboratório, por toda colaboração com as
atividades e por tornarem o cotidiano tão agradável.
À toda equipe de profissionais do Colégio Cruzeiro do Sul e em especial à diretora
Vilma Lemes e às coordenadoras Eduvirgens Maria dos Santos Neves e Márcia Alves
Almeida por todo apoio e incentivo.
À FAPEG pelo auxílio financeiro concedido.
À Universidade Federal de Goiás pela formação acadêmica.
5
Sumário
Resumo ..................................................................................................................... 10 Abstract........ ........ ............ ........ ........ ....... ..... ........ ........ ... ......... .....12
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 14 1.1. Cumarinas e Chalconas ..................................................................................... 14 1.2. Mutagenicidade e Genotoxicidade ..................................................................... 17 1.3. Antimutagenicidade/ Antigenotoxicidade ............................................................ 19 1.4. Ensaios de Genética Toxicológica para Avaliação dos Efeitos Mutagênicos e Antimutagênicos de Composto...................................................................................20 1.4.1. Teste de mutagenicidade com Salmonella typhimurium (Teste de Ames) ...... 21 1.4.2. Teste do Micronúcleo em Medula Óssea de Camundongos ........................... 24 1.4.3. Ensaio Cometa ou Single Cell Gel Electrophoresis (SGE) .............................. 27 1.4.4. Teste para Detecção de Mutação e Recombinação Somática (Somatic Mutation and Recombination Test- SMART). ........................................................................... 30 2. OBJETIVOS .......................................................................................................... 34 2.1. Objetivo Geral .................................................................................................... 34 2.2. Objetivos Específicos ......................................................................................... 34 3. MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 35 3.1. Experimento Químico ......................................................................................... 35 3.1.1. Síntese de 4-MET ........................................................................................... 35 3.1.2. Híbrido cumarina-chalcona (4-MET) ............................................................... 35 3.1.3. Síntese do híbrido cumarina-chalcona (4-MET) .............................................. 35 3.1.3.1. Preparação do 3-acetil-7-metoxi-2H-chromen-2-ona ................................... 36 3.1.3.2. Preparação do híbrido de cumarina-chalcona (4-MET) ................................ 36 3.2. Experimentos Biológicos .................................................................................... 37 3.2.1. Teste de Mutagenicidade de Ames em cepas de S. typhimurium ................... 37 3.2.1.1. Cepas bacterianas........................................................................................ 37 3.2.1.2. Meios de cultura, reagentes e soluções ....................................................... 37 3.2.1.3. Controles ...................................................................................................... 39 3.2.1.4. Procedimento experimental .......................................................................... 39 3.2.1.5. Análise estatística ........................................................................................ 40 3.2.2. Teste em Camundongos ................................................................................. 41 3.2.2.1. Protocolos de Tratamento dos Animais ........................................................ 41 3.2.2.2. Teste do Micronúcleo em Medula Óssea ..................................................... 42 3.2.2.3. Ensaio Cometa ............................................................................................. 43 3.2.2.4. Análise Estatística dos Testes Micronúcleo e Cometa ................................. 45 3.2.4. Teste SMART .................................................................................................. 45 3.2.4.1. Linhagens de Drosophila melanogaster ....................................................... 45 3.2.4.2. Agentes Químicos ........................................................................................ 46 3.2.4.2. 1. Controles .................................................................................................. 46 3.2.4.2.2. Meios de Cultura e Condições de Cultivo .................................................. 46 3.2.4.3. Cruzamentos ................................................................................................ 46 3.2.4.4. Procedimento Experimental - Tratamento Crônico ....................................... 47 3.2.4.5. Análise citogenética...................................................................................... 48 3.2.4.6. Análise Estatística ........................................................................................ 48 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 50 8. PRODUÇÃO CIENTÍFICA ..................................................................................... 63 8.1. Manuscrito submetido à revista Plos One (ISSN: 1099-1263): Teste de Ames, Micronúcleo e Cometa .............................................................................................. 63
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8.2. Manuscrito a ser submetido à revista Científica: SMART/asa. ........................... 88 9. CONCLUSÃO GERAL......................................................................................... 112 ANEXO 1: Parecer Favorável do Comitê de Ética......................................................................................................................... 113
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AS Azida sódica
ANOVA Análise de variância
CIF Ciclofosfamida
DMSO Dimetilsulfóxido
DP Desvio padrão
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
ENC Eritrócitos normocromáticos
EPC Eritrócitos policromáticos
EPCMN Eritrócitos policromáticos micronucleados
FDA Food and Drug Administration
i.p. Intraperitoneal
IM Índice de mutagenicidade
MN Micronúcleo
MMC: Mitomicina C
4NQO 4-nitroquinolina 1-óxido
OTM Momento da cauda de Olive
PBS Tampão salina fosfato
p.c. Peso corpóreo
PI Porcentagem de inibição da mutagenicidade
RM Razão de mutagenicidade
SCGE Eletroforese em gel de célula única alcalina
SMART Somatic Mutation and Recombination Test
TRIS Tris-hidroximetilaminometano
4-MET- Híbrido Cumarina-Chalcona (7-metoxi-3-(E)-3-(3,4,5-trimetoxifenil)acriloil-2H-
cromen-2-ona)
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LISTA DE FIGURAS Figura 1: Núcleo fundamental das cumarinas ...................................................... 14 Figura 2: Núcleo fundamental das chalconas ....................................................... 15 Figura 3: Estrutura Química do of (E)-7-metoxi-3-(3-(3,4,5-trimetoxifenil)acriloil-2H-cromen-2-ona ou 4-MET ....................................................................................... 16 Figura 4: Esquema do teste de mutagenicidade de Ames. Colônias de revertentes são contadas após exposição a substâncias tratadas (Zanoni, 2010) .................. 22 Figura 5: Processo de maturação das células da linhagem eritrocitária (Ribeiro, 2003) .............................................................................................................................. 26 Figura 6: Formação de micronúcleos em eritrócitos da medula óssea (Ribeiro, 2003) .............................................................................................................................. 26 Figura 7: Fotomicrografia de eritrócitos da medula óssea de camundongos. ...... 29 Figura 8: Imagens de cometas células do fígado após tratamento com mutágenos26 Figura 9: Fenótipos dos pelos de D. melanogaster (microscopia eletrônica) ....... 32 Figura 10: Linhagens teste de D. melanogaster ................................................... 33 Figura 11: Fotomicrografia mostrando pelos múltiplos, flare (seta A) e mancha gêmea .............................................................................................................................. 33 Figura 12: Estrutura Química do (E)-7-metoxi-3-(3-(3,4,5-trimetoxifenil)acriloil-2H-cromen-2-ona ou 4-MET 1 .................................................................................... 35 Figura 13: Síntese de 4-MET 1 de 1 from 3-acetil-7-metoxi-2H-cromen-2-ona 2. Reagentes e condições ......................................................................................... 36 Figura 14: Representação dos Experimentos Realizados em Camundongos ...... 42 Figura 15: Tela de captura do software Open Comet, versão 13 ......................... 44
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LISTA DE TABELAS Tabela 1: Means ± standard deviation (SD) of histidine revertant colonies (obtained from three independent experiments carried out in triplicate.....................................74 Tabela 2: Effects of treatments with different doses of the coumarin-chalcone hybrid 7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl-2H-chromen-2-one (4-MET) on the frequency of micronucleated polychromatic erythrocytes (MNPCE) and polychromatic/normochromatic erythrocytes ratio (PCE/NCE) in bone marrow cells of mice ................................... ....................................................................................77 Tabela 1: Frequency of mutant spots observed in somatic cells of marker-heterozygous (mwh/flr3) Drosophila melanogaster descendants of standard cross (ST) and high bioactivation cross (HB) treated with four different concentrations (5, 50, 100, and 400 µg /mL) of the coumarin–chalcone hybrid 7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl-2H-cromen-2-one (4-MET) ........................................... 96 Tabela 2: Frequency of mutant spots observed in marker-heterozygous (mwh/flr3) and balancer-heterozygous (mwh/TM3) Drosophila melanogaster descendants of standard cross (ST) co-treated with four different concentrations (5, 50, 100, and 400 µg /mL) of the coumarin–chalcone hybrid 7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl-2H-cromen-2-one (4-MET) and mitomycin C (MMC)……………………………………98 Tabela 3: Frequency of mutant spots observed in marker-heterozygous (MH) and balancer-heterozygous (BH) Drosophila melanogaster descendants of high bioactivation cross (HB) co-treated with four different concentrations (5, 50, 100, and 400 µg /mL) of the coumarin–chalcone hybrid 7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl-2H-cromen-2-one (4-MET) and mitomycin C (MMC)........99
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RESUMO
Cumarinas e chalconas são moléculas derivadas de compostos fenólicos e que
podem ser sintetizadas por fungos, bactérias e plantas. Além disso, também podem
ser sintetizadas em laboratório. Esses compostos exercem diversas atividades
biológicas, tais como: antioxidante, anti-inflamatória, antiviral e antitumoral. Com base
na relevância das cumarinas e chalconas, o objetivo do presente estudo consistiu em
avaliar as atividades genotóxica, antigenotóxica, mutagênica e antimutagênica de um
híbrido sintético de cumarina-chalcona, 7-metoxi-3-(E)-3-(3,4,5-trimetoxifenil)acriloil-
2H-cromen-2-ona (4-MET), utilizando o método in vitro teste de Ames e três métodos
in vivo: teste do micronúcleo e ensaio cometa em medula óssea de camundongos
utilizando três tratamentos (pré, co e pós-tratamento) e teste SMART/asa em
Drosophila melanogaster. No teste de mutagenicidade de Ames não foi observado um
aumento significativo no número de revertentes prototróficas em cepas de Salmonella
typhimurium TA98 e TA100 (p > 0,05), desta forma demonstrando ausência de ação
mutagênica. Na avaliação antimutagênica pelo teste de Ames, 4-MET apresentou
atividade antimutagênica em todas as doses e nas duas cepas testadas (p < 0,05). Os
resultados do teste do micronúcleo mostraram que a concentração de 50 mg/kg de 4-
MET não aumentou a frequência de eritrócitos policromáticos micronucleados
(EPCMN) nos dois tempos (24 h e 120 h) testados, evidenciando ausência de efeito
mutagênico deste composto. Não houve diminuição na razão de eritrócitos
policromáticos/normocromáticos (EPC/ENC) no tempo de 24 h, indicando ausência
de ação citotóxica de 4-MET. No entanto, para o tempo de 120 h houve diminuição na
razão EPC/ENC, mostrando atividade citotóxica. Na avaliação da antimutagenicidade
pelo teste do micronúcleo, 4-MET diminuiu significativamente a frequência de EPCMN
em ambas as doses testadas (25 e 50 mg/kg) nos três tipos de tratamento (pré, co e
pós-tratamento), demonstrando ação antimutagênica (p < 0,05). Além disso, 4-MET
aumentou a razão de EPC/ENC na dose de 50 mg/kg em co e pós-tratamento,
evidenciando seu efeito anticitotóxico. No ensaio cometa, 4-MET não aumentou
significativamente o número de danos no DNA na concentração de 50 mg/kg (p >
0,05), demonstrando ausência de atividade genotóxica. Entretanto, na avaliação da
antigenotoxicidade de 4-MET, em todos os tratamentos houve diminuição no número
de danos no DNA (p < 0,05) em ambas as doses utilizadas (25 e 50 mg/kg), indicando
atividade antigenotóxica. Na avaliação das atividades mutagênica e recombinogênica
pelo SMART, em nenhuma das concentrações utilizadas (5, 50, 100 e 400 μg/mL)
11
houve efeito mutagênico e/ou recombinogênico nos cruzamentos padrão (ST) e
aprimorado (HB). Atividades antimutagênica e anti-recombinogênica foram
observadas em todas as doses para ambos os cruzamentos (p < 0,05). Com base nos
resultados obtidos, bem como em estudos descritos na literatura acerca das
atividades de cumarinas e chalconas, podemos inferir que as atividades
antigenotóxica, antimutagênica e antirecombinogênica observadas no presente
estudo podem ser atribuídas, pelos menos parcialmente, à estrutura química do
híbrido cumarina-chalcona 4-MET, que possibilita sua interação com moléculas
bioativas e sua atividade antioxidante.
Palavras-chave: Antigenotoxicidade. Antimutagenicidade. Anti-
recombinogenicidade. Genotoxicidade. Mutagenicidade. Quimioprevenção.
12
ABSTRACT
Coumarins and chalcones are molecules derived from phenolic compounds that can
be synthesized by fungi, bacteria, and plants. In addition to this, these molecules can
also be synthesized in laboratory. These compounds are known to have multiple
biological activities such as antioxidant, anti-inflammatory, antiviral and anti-tumoral
activities. Based on the relevance of coumarins and chalcones, the aim of the present
study was to evaluate the genotoxic, antigenotoxic, mutagenic, and antimutagenic
activities of a coumarin-chalcone synthetic hybrid, 7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-
trimethoxyphenyl)acryloyl-2H-cromen-2-one (4-MET), using the in vitro Ames
Mutagenicity test and three in vivo methods: the micronucleus test and the comet
assay in mice bone marrow using three treatments (pre-, co-, and post-treatment) and
the SMART/wing test in Drosophila melanogaster. In the Ames mutagenicity test, at
none of the doses of 4-MET tested (1, 10, 50, 100, and 500 μg/plate) did not showed
an increase in the number of His+ revertants in Salmonella typhimurium tester strains
TA98 and TA100 (p > 0.05), thus demonstrating lack of mutagenic action. In the
antimutagenic evaluation of the Ames test, 4-MET presented antimutagenic activity at
all doses and both strains tested (p < 0.05). The results of the micronucleus test
showed that the dose of 50 mg/kg of 4-MET did not increase the frequency of
micronucleated polychromatic erythrocytes (MNPCE) at both times tested (24 h and
120 h), evidencing lack of mutagenic effect of this compound. The
polychromatic/normochromatic erythrocyte ratio (PCE/NCE) did not decrease at 24 h,
indicating lack of cytotoxic action of 4-MET. However, at 120 h, PCE/NCE ratio
decreased, showing cytotoxic effect. In the assessment of antimutagenicity using the
micronucleus test, 4-MET significantly decreased the frequency of MNPCE at both
doses tested (25 and 50 mg/kg) and in the three treatments (pre-, co- and post-
treatment), demonstrating antimutagenic action (p < 0.05). Moreover, 4-MET
increased PCE/NCE ratio at the dose of 50 mg/kg in co- and post-treatment,
evidencing its anticytotoxic effect. In the comet assay, 4-MET did not significantly
increase DNA damage at the dose of 50 mg/kg (p > 0.05), demonstrating lack of
genotoxic activity. Nonetheless, in the antigenotoxicity assessment of 4-MET in all
treatments a significant decrease in DNA damage (p < 0.05) was observed at both
doses tested (25 and 50 mg/kg), indicating antigenotoxic activity. In the evaluation of
the mutagenic and recombinogenic activities using SMART, at none of the
concentrations used (5, 50, 100, and 400 μg/mL) mutagenic and/or recombinogenic
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effects were found in the standard (ST) and bioactivation (HB) crosses. Antimutagenic
and antirecombinogenic activities were observed at all doses in both crosses (p >
0.05). Based on the results obtained and also studies carried out in the literature about
coumarins and chalcone, it was possible to infer that the antigenotoxic, antimutagenic,
and antirecombinogenic activities observed in the present study may be, at least
partially, attributed to the chemical structure of the coumarin-chalcone hybrid 4-MET,
which allows its interaction with bioactive molecules and its antioxidant activity.
Keywords: Antigenotoxicity. Antimutagenicity. Antirecombinogenicity,
Chemoprevention. Genotoxicity. Mutagenicity.
14
1. INTRODUÇÃO
1.1. Cumarinas e Chalconas
O conhecimento sobre as plantas e a descoberta de suas possíveis
propriedades curativas acompanhou a evolução do homem por meio dos tempos e
têm revelado amplo potencial no tratamento de numerosas doenças (Gaspi, 2011;
Kaur et al., 2012). Diversos produtos derivados de plantas têm sido empregados como
matéria-prima para a síntese de substâncias bioativas e contribuído para a obtenção
de novos agentes terapêuticos. Esses agentes podem, muitas vezes, ser obtidos mais
facilmente e a custos menores (Chiaradia, 2006, Silva, 2015). Dentre essas
substâncias extraídas de plantas, podem-se inserir as cumarinas e as chalconas.
As cumarinas representam uma grande classe de compostos fenólicos naturais
encontrados principalmente em plantas, mas também com ocorrência em fungos e
bactérias. Nas plantas, são encontradas, predominantemente, em angiospermas. As
cumarinas são lactonas do ácido o-hidroxi-cinâmico, e o principal representante é a
1,2-benzopirona, denominada simplesmente de cumarina (Figura 1). Esses
constituintes vegetais são derivados do metabolismo da fenilalanina, tendo como
precursores iniciais os ácidos cinâmico e o p-hidroxi-cinâmico, a partir dos quais as
cumarinas e seus derivados são biossintetizados por diferentes vias (Witaicenis et al.,
2014).
Figura 1: Núcleo fundamental das cumarinas
Esse composto vem se tornando alvo atrativo para síntese orgânica e também
para indústria farmacêutica, principalmente devido à baixa toxicidade, valor nutricional
e relativa facilidade de síntese e baixo custo (Al-Amiery et al., 2012).
Atualmente, as cumarinas têm estado em destaque devido à ampla gama de
atividades biológicas deste composto, tais como, anti-inflamatória (Lee et al., 2011;
Witaicenis et al., 2014), antitumoral (Huang et al., 2011; Musa et al., 2011; Gacch e
15
Jadhav, 2012; Bubols et al., 2013), hepatoprotetora, antialérgica, anti HIV-1 (Musa et
al., 2011; Bubols et al., 2013; Slapsyte et al., 2013), antiviral, antifúngica,
antimicrobiana, antiasmática, antioxidante (Kaur et al., 2012; Anand et al., 2012;
Slapsyte et al., 2013), antinociceptiva (Barros et al., 2010), antidiabética,
antidepressiva (Sashidhara et al., 2011), antigenotóxica e anticoagulante (Musa et al.,
2011).
Outra importante classe de compostos naturais bioativos são as chalconas
(Kandaswamy e Raveendiran, 2014). Quimicamente, as chalconas podem ser
definidas como cetonas aromáticas α-β-insaturadas com dois anéis aromáticos, um
ligado diretamente à função cetona e outro à dupla ligação, conectados por uma
cadeia aberta de três átomos de carbono, ficando conjugados uma porção olefínica e
um grupamento carbonílico (Figura 2) (Sakirolla et al., 2012).
Figura 2: Núcleo fundamental das chalconas
As chalconas são amplamente distribuídas em frutas, legumes, especiarias,
chá e soja (Sakirolla et al., 2012). Esses compostos têm recebido grande atenção
devido à abundância em plantas e facilidade de obtenção (Sashidhara et al., 2010).
As chalconas apresentam diversas atividades biológicas, tais como: atividade
antimutagênica (Silva et al., 2015), anti-inflamatória (Reddy et al., 2011), antifibrótica
(Lee et al., 2011), antibacteriana (Mascarello et al., 2010), antiprotozoária (Aponte et
al., 2010) e antioxidante (Xue et al., 2012; Kandaswamy e Raveendiran, 2014).
Derivados de chalconas apresentaram atividade citotóxica e antimitótica. Esses
compostos são capazes de se ligar ao sítio da colchicina na β-tubulina, inibindo,
assim, a sua polimerização. Consequentemente, os microtúbulos, elementos
celulares essenciais ao processo de mitose, não são formados (Dyrager et al., 2011;
Ruan et al., 2011).
16
As atividades biológicas de cumarinas e chalconas estão relacionadas,
principalmente, à atividade antioxidante e interação com várias enzimas, tais como
glutationas e peroxidases (Bubols et al., 2013; Kandaswamy e Raveendiran, 2014;
Sandhu et al., 2014). Cumarinas são potentes agentes sequestradores de espécies
reativas de oxigênio (EROS) e são agentes quelantes de metais (Marques et al.,
2015). Chalconas mostram atividade antioxidante contra os radicais tanto hidroxila e
peroxila (Kandaswamy e Raveendiran, 2014).
Em virtude da importância considerável desses dois compostos naturais,
cumarinas e chalconas, e das propriedades biológicas destas moléculas, um conjunto
de híbridos de cumarina-chalcona recentemente estão sendo sintetizados e
estudados (Datta et al, 2011; Zhang et al., 2011; Xue et al., 2012 Kandaswamy e
Raveendiran, 2014; Witaicenis et al., 2014; Arsenyan et al., 2015; Marques et al.,
2015; Xi e Liu, 2015). Na concepção de novos agentes bioativos, o desenvolvimento
de moléculas híbridas por meio da combinação de diferentes compostos pode
conduzir perfis biológicos interessantes (Sashidhara et al., 2010; Pingaew et al., 2014;
Sandhu et al., 2014). Essas moléculas combinadas, provavelmente, oferecem
algumas vantagens, tais como: superação da resistência a medicamentos e melhoria
da eficiência biológica, podendo ser utilizado no tratamento de numerosas doenças
(Pingaew et al., 2014; Sandhu et al., 2014). Ressalta-se, assim, a importância do
estudo realizado nesta tese, onde foi sintetizado e avaliado as atividades biológicas
de um novo híbrido de chalcona-cumarina, 4-MET (Figura 3).
Figura 3: Estrutura Química de (E)-7-metoxi-3-(3-(3,4,5-trimetoxifenil)acriloil-2H-
cromen-2-ona ou 4-MET.
Apesar das diversas atividades biológicas e do uso generalizado de cumarinas
e/ou chalconas, pesquisas sobre a sua genotoxicidade ou efeitos protetores são
parcialmente contraditórios e escassos (Fedato e Maistro, 2012), demonstrando
17
assim, a necessidade e importância de avaliações precisas os efeitos biológicos
desses compostos.
1.2. Mutagenicidade e Genotoxicidade
A informação genética dos organismos vivos está armazenada em moléculas
de DNA e RNA. Essa informação é conservada e transmitida para cada célula por
sucessivas gerações por meio de um processo de replicação fiel e preciso (Snustad e
Simmons, 2013). A fidelidade desse processo é assegurada por várias respostas
celulares aos danos genéticos que podem ocorrer, como paralisação do ciclo celular,
indução de mecanismos de reparo e apoptose. Ainda assim, algumas alterações
presentes no DNA podem não ser reparadas e serão fixadas como mutações (Levitt
et al., 2007).
Mutações são alterações súbitas e hereditárias no material genético de um
organismo (Nelson e Cox, 2014). Tais alterações podem ser decorrentes de processos
celulares normais (espontâneas) ou podem ser induzidas pela exposição a agentes
físicos, químicos biológicos e também pelo estresse oxidativo (Olinsk et al., 2002,
Wogan et al., 2004).
Os organismos vivos estão, frequentemente, expostos a diversos agentes
físicos, químicos e biológicos que podem causar danos celulares. Os danos podem
afetar processos vitais como a duplicação e a transcrição gênica, podendo levar a
processos neoplásicos ou à morte celular. Pelo fato de causarem lesões no material
genético, essas substâncias são conhecidas como substâncias mutagênicas e/ou
genotóxicas (Kovacica e Somanathana, 2014).
Os agentes que causam mutações podem ser basicamente classificados em
autobióticos ou xenobióticos. Os autobióticos são mutágenos endógenos, a exemplo
das espécies reativas de oxigênio (EROs) produzidas in vivo. Os xenobióticos são
mutágenos existentes no ambiente externo, sendo, portanto, estranhos ao sistema
biológico, tais como contaminantes (poluentes do ar e da água), alimentares (aminas
heterocíclicas, aditivos e concervantes) e os relacionados com o estilo de vida
(nitrosaminas, tabaco e álcool) (Kryston et al., 2011).
Um agente mutagênico pode desencadear diversas respostas de acordo com
o organismo afetado (Gatehouse, 1990). Isso ocorre devido a uma série de fatores,
como ativação metabólica (pró-mutágenos), processo de detoxificação de compostos
18
químicos, variedade de sistemas de reparo e efeito do mutágeno na célula (Klaassen
e Watkins,1999). Os agentes mutagênicos podem induzir mudanças genômicas por
interagir diretamente com o DNA ou por interagir com proteínas envolvidas na
manutenção da integridade do genoma (Zaha, 2014).
Alguns agentes mutagênicos podem exercer mais de um mecanismo de ação,
que depende de vários fatores, incluindo a natureza das alterações no DNA
(modificações de base, de resíduos de açúcar, de fosfato ou quebras nos filamentos
de DNA), e os subsequentes efeitos secundários causados pela resposta do
organismo a essas modificações. Esses efeitos secundários podem incluir a ação de
várias formas de reparo do material genético e a duplicação de cromossomos sobre
moldes modificados (Nias, 1998; Dowd e Tilson, 1999; Zaha, 2014).
Existem dois tipos de mutações, quanto a estrutura do material genético, as
mutações gênicas e as cromossômicas (Frank, 2010). As mutações gênicas são
ocasionadas por substituição de bases (transições e transversões), frameshifts,
inserções, deleções e translocações. As alterações cromossômicas podem estar
relacionadas à estrutura do cromossomo em consequência de deleções, duplicações,
inversões e translocações ou ao número de cromossomos em decorrência de falhas
na citocinese, por não disjunção mitótica. (Olivier et al., 2010)
As mutações também podem ser classificadas de acordo com o tipo de célula
afetada em germinativas ou somáticas. As mutações nas células germinativas são
responsáveis por produzir mudanças na hereditariedade, acarretando o
desenvolvimento de efeitos teratogênicos e de desordens hereditárias. As mutações
em células somáticas podem estar envolvidas na patogênese de algumas doenças
crônico-degenerativas, tais como as cardiovasculares (arteriosclerose) e
neurodegenerativas (Alzheimer). Além disso, as mutações somáticas estão
intrinsecamente relacionadas com o processo de carcinogênese (Carter et al., 2012;
Khalil, 2014).
Mutações atuam em diversas etapas do processo de carcinogênese (Yong et
al., 2014) A mutação pode ser o primeiro estágio no processo de formação de um
tumor (O’Connor, 2015). Dessa forma, ensaios que detectam componentes
genotóxicos permitem identificar substâncias com risco potencial para
desenvolvimento de neoplasias nos seres humanos. Isso revela a importância de
trabalhos de avaliação da genotoxicidade de diferentes compostos.
19
Estudos epidemiológicos têm mostrado que há relação entre o
desenvolvimento de neoplasias e hábitos alimentares, pois a dieta é uma das
principais vias de exposição do organismo a diferentes componentes mutagênicos
e/ou carcinogênicos (Ahmed et al., 2013). Acredita-se que um terço de todos os
cânceres humanos possa estar relacionado ao hábito alimentar (Ferrini et al., 2015).
Diante desse cenário, várias pesquisas científicas ressaltam a necessidade de
mudanças nos hábitos alimentares da população na tentativa de minimizar os riscos
de desenvolvimento de câncer. Para tanto, observa-se uma tendência geral de se
investigar o efeito genotóxico, carcinogênico, embriotóxico e/ou teratogênico de
substâncias químicas, especialmente os presentes em alimentos (Hussain et al.,
2001).
1.3. Antimutagenicidade/ Antigenotoxicidade
Fatores da dieta têm grande importância na metabolização e detoxificação de
compostos químicos genotóxicos, podendo diminuir assim a taxa de danos
acumulados no DNA e ser utilizados na prevenção de doenças (Bárta et al., 2006). Já
se conhecem que diversos componentes utilizados na dieta oriundos de produtos
naturais e/ou sintéticos podem proteger o DNA de um dano ou modularem a ação de
agentes genotóxicos. Essas substâncias são denominadas agentes antigenotóxicos
ou antimutagênicos (Rigo, 2009).
O termo “antimutagênico” foi usado, originalmente, em 1952 para descrever os
agentes que reduzem a frequência de mutações espontâneas ou induzidas,
independentemente do mecanismo envolvido (Von Borstel et al., 1996, Carneiro,
2016). Os estudos com agentes antimutagênicos se iniciaram na década de 1950,
porém somente a partir da década de 1990 o interesse se concentrou na identificação
de agentes antimutagênicos de origem natural (Wargovich, 1997).
Antimutágenos têm sido descritos, principalmente, em frutas e legumes (Vieira
et al., 2015). Diversos metabólitos presentes em plantas impedem ou atenuam a
ocorrência de processos mutagênicos. Dentre esses estão o ácido ascórbico (vitamina
C), ácidos graxos, ácidos linoleicos conjugados, o ácido p-aminobenzóico (PABA), as
clorofilas e seus derivados, cumarinas, flavonoides, fibras dietéticas, fitoestrógenos,
as glutationas, os isotiocianetos aromáticos, a N-acetil-I-cisteína, taninos, tocoferóis
(vitaminas E) e outros (Hiramatsu et al., 2004).
20
As plantas possuem metabólitos secundários com inúmeras funções, dentre
elas a captura de radicais livres, proteção contra radiação Ultravioleta (UV) e contra o
ataque de patógenos. Esses metabólitos podem ser antioxidantes naturais que
previnem os danos oxidativos ao DNA e, portanto, podem ser considerados agentes
antimutagênicos (Kris-etherton et al., 2002; Malins et al., 2002; Khan et al., 2005).
Atualmente, diversos metabolitos extraídos de plantas estão sendo utilizados
para a quimioprevenção. A quimioprevenção consiste na suplementação da dieta com
alimentos, medicamentos e compostos naturais para reverter ou suprimir o processo
de formação do câncer. As estratégias de quimioprevenção almejam prevenir ou
interromper cada uma das etapas da carcinogênese. A estratégia anti-iniciação
consiste em inibir alterações e induzir reparos na molécula de DNA. A estratégia de
anti-promoção consiste em realizar a detoxificação, como por exemplo, o sequestro
de radicais livres e de metabólitos carcinogênicos. A estratégia de anti-progressão
consiste em suprimir a proliferação, aumentar a imunidade, reduzir o processo
inflamatório e aumentar a apoptose (Namasivayam, 2011).
A quimioproteção, por meio dos componentes da dieta, requer não apenas
avaliação da segurança e eficácia dos possíveis agentes quimiopreventivos em
modelos animais e em humanos, mas também maior conhecimento dos possíveis
mecanismos de ação (De Flora e Ferguson, 2005). Para isso, diversos sistemas testes
estão disponíveis permitindo assim identificar estes agentes protetores (Antunes e
Araújo, 2000).
As metodologias clássicas para avaliar a genotoxicidade de agentes químicos
e físicos podem ser empregadas para avaliação e identificação de agentes
antigenotóxicos. Assim, ensaios com células de microrganismos ou de mamíferos têm
sido amplamente utilizados tanto nos estudos de genotoxicidade como nos de
antigenotoxicidade (Luiz, 2002).
1.3. Ensaios para a Avaliação dos Efeitos Mutagênicos e Antimutagênicos de
Compostos
Existem diversos ensaios que detectam compostos genotóxicos e/ou
antigenotóxicos (Umbuzeiro e Vagas, 2003). Esses ensaios detectam mutações
gênicas e danos cromossômicos. Essa possibilidade de avaliar diversos tipos de
lesões tem fortalecido a importância dos testes de genotoxicidade (Ribeiro e Marques,
21
2003). Esses ensaios podem avaliar o aumento e/ou diminuição da frequência de
lesões e/ou mutações induzidas em relação à frequência basal (Westman, 2006).
Muitos dos testes de detecção de atividades genotóxicas têm sido propostos
para identificação de possíveis agentes carcinógenos (Zeiger, 1998), visto que os
testes de mutagenicidade são referenciais para carcinogenicidade (Erdtmann, 2003).
Além disso, o conhecimento de substâncias capazes de modular os efeitos
genotóxicos de agentes químicos e físicos também é de grande importância, porque
podem auxiliar no entendimento dos mecanismos de ação desses agentes
genotóxicos e contribuir na diminuição das alterações gênicas que possivelmente
resultam no aparecimento de doenças, tais como câncer (Takahashi et al., 2001).
No presente estudo, foram realizados testes de genética toxicológica, in vitro e
in vivo, visando investigar o efeito de 4-MET sobre os principais tipos de danos ao
DNA. Foram realizados um ensaio bacteriano: o Teste de mutagenicidade de Ames,
um teste em D. melanogaster o teste para a detecção de mutação e recombinação
somática (SMART/asa) em D. melanogaster (SMART/asa) e dois ensaios em
camundongos: o teste do micronúcleo e o ensaio do cometa. Os ensaios como o teste
de Ames, teste SMART/asa, teste do micronúcleo e o ensaio cometa são amplamente
utilizados e adequados para a avaliação de diferentes eventos genotóxicos e
antigenotóxicos de diversas substâncias.
1.4.1. Teste de mutagenicidade com Salmonella typhimurium (Teste de Ames)
O teste de mutagenicidade de Ames foi desenvolvido por Bruce Ames e
colaboradores na década de 1970 (Ames, 1971; Ames et al., 1973) e foi
posteriormente revisado ao longo dos anos para melhorar a sensibilidade para muitos
tipos de agentes mutagênicos (Maron e Ames, 1983; Wilcox et al., 1990; OECD,
1997). Este ensaio é utilizado para detectar a ação mutagênica e antimutagênica de
agentes indutores que atuam ao nível do DNA bacteriano (Maron e Ames, 1983; Aiub
e Felzenszwalb, 2011). O teste de Ames é considerado um ensaio que apresenta
grande sensibilidade, reprodutibilidade e versatilidade (Moreira et al., 2002;
Umbuzeiro e Vargas, 2003).
Esse ensaio é utilizado em todo o mundo e reconhecido pela comunidade
científica e agências governamentais como um ensaio inicial para determinar o
potencial mutagênico de novos produtos químicos e medicamentos. Diversos agentes
22
mutagênicos detectados, pelo teste de Ames muitas vezes são apresentados,
posteriormente, como agentes carcinogênicos em testes que utilizam animais
(Mortelmans e Zeiger, 2000). Isso faz com que esse teste seja um dos principais
ensaios empregados na determinação da mutagenicidade de um grande número de
compostos químicos (Umbuzeiro e Vargas, 2003).
O teste de Ames emprega linhagens de S. typhimurium derivadas da linhagem
parental LT2, auxotróficas para histidina (his-), apresentando diferentes mutações no
operon desse aminoácido, sendo construídas para detectar mutações do tipo
deslocamento do quadro de leitura ou substituição de pares de base no DNA. Essas
linhagens são incapazes de crescer em meio de cultura mínimo, sem histidina, a
menos que ocorram mutações que restaurem a sua capacidade de síntese
(Umbuzeiro e Vargas, 2003). O número de revertentes é facilmente medido pela
contagem de colônias que crescem em meio mínimo, após a exposição de uma
população de células à substância a ser testada (Ames et al., 1973; Maron e Ames,
1983; Umbuzeiro e Vargas, 2003; Aiub e Felzenszwalb, 2011).O composto-teste é
considerado mutagênico, se o aumento no número de colônias revertentes excede 2
vezes o número de colônias revertentes do controle negativo, e/ou se o aumento é
estatisticamente significativo (Escobar et al., 2013) (Figura 4).
Figura 4: Esquema do teste de mutagenicidade de Ames. Colônias de revertentes
são contadas após exposição a substâncias tratadas (Zanoni, 2010).
23
O teste de Ames permite o conhecimento dos mecanismos de interação de
mutágenos com o DNA, fornecendo informações sobre o tipo de mutação induzida,
podendo ser do tipo substituição de pares de bases ou deslocamento no quadro de
leitura do DNA (frameshift) (Mortelmans e Zeiger, 2000; Claxton et al., 2010; Escobar
et al., 2013). As linhagens de S. typhimurium possuem diversas mutações que
auxiliam no processo de identificação de substâncias que lesam o DNA, como a
mutação rfa que está presente em todas as linhagens e causa perda parcial da
barreira de lipopolissacarídeos da parede bacteriana, tornando a bactéria mais
permeável a moléculas grandes, como as aminas aromáticas e hidrocarbonetos
(Mortelmans e Zeiger, 2000; Tejs, 2008; Escobar et al. 2013). A maioria das cepas
apresentam uma deleção do gene uvrB, o que causa a perda da capacidade de reparo
por excisão de nucleotídeos, permitindo que mais lesões no DNA sejam reparadas
por mecanismos sujeitos a erros, aumentando assim a possibilidade de ocorrência de
mutações, elevando a sensibilidade do teste na detecção do mutágeno. A deleção do
gene uvrB é estendida até o gene responsável pela síntese da biotina, tornando as
linhagens dependentes dessa vitamina (Villela, 2003; Tejs, 2008).
Em algumas linhagens de S. typhimurium, foi introduzido o plasmídio pKM101,
que, além de conferir resistência à ampicilina (Valent, 1990), possui o gene muc, cuja
expressão causa estímulo no sistema de reparo suscetível ao erro (“error prone”),
aumentando tanto a mutagênese espontânea como a induzida, pois o produto desse
gene interfere na fidelidade da DNA polimerase (Bhamre et al., 2001; Villela, 2003).
As linhagens TA98 e TA100, selecionadas para o presente estudo, são
comumente utilizadas para estudos de triagem, mostrando eficiência na detecção de
grande número de agentes mutagênicos (Umbuzeiro e Vargas, 2003). A mutação
existente na cepa TA100, denominada hisG46, resulta da substituição de uma leucina
(GAG/CTC) por uma prolina (GGG/CCC), e pode ser revertida para o estado selvagem
por um composto mutagênico que cause uma substituição de pares de bases num
dos pares GC. A mutação que ocorre na cepa TA98, denominada hisD3052,
consequência de um frameshift, que afeta a leitura correta de uma sequência próxima,
constituída de oito resíduos GC – C-G-C- G-C-G-C-G- repetitivos. Nessa cepa, a
reversão para o fenótipo his+ ocorre pela deleção de um ou dois pares de bases ou
pela adição de um par. Essa mutação é revertida por agentes mutagênicos como 2-
nitrofluoreno e derivados nitro aromáticos (Maron e Ames, 1983). Assim, a aplicação
24
das duas cepas acima mencionadas permite a identificação de mutágenos ou
antimutágenos com diferentes mecanismos de ação.
1.4.2. Teste do Micronúcleo em Medula Óssea de Camundongos
O teste do micronúcleo foi proposto inicialmente por Heddle (1973) como uma
alternativa simples para avaliar danos cromossômicos. Esse ensaio avalia danos no
DNA ao nível cromossômico. É um teste de mutagenicidade utilizado para detecção
de agentes clastogênicos (que quebram cromossomos), e de agentes aneugênicos
(que induzem aneuploidia ou segregação cromossômica anormal) (Kirsch-Volders et
al., 2011).
Esse ensaio é internacionalmente aceito como parte da bateria de testes
recomendada na avaliação do potencial mutagênico para o registro de novos produtos
químicos que entram no mercado mundial e como um método de triagem no
desenvolvimento de novos fármacos. A alta confiabilidade e o baixo custo da técnica
contribuem para o sucesso mundial e adoção desse biomarcador para estudos de
danos genéticos in vivo (Bonassi et al., 2007). Além disso, a maioria dos protocolos
internacionais indica, pelo menos, um teste citogenético em células hematopoiéticas
de roedores para avaliação de danos genéticos in vivo, sendo o teste do micronúcleo
o mais recomendado (Rothfuss et al., 2011).
Esse teste pode ser executado praticamente em qualquer população de células
que estejam constantemente em divisão, sendo a medula óssea de mamíferos uma
das regiões mais adequadas, visto que suas células levam de 22 a 24 horas para
completar um ciclo de divisão (Heddle, 1973) (Figura 5), sendo, portanto, um período
adequado para administração e absorção de um composto.
Na medula óssea, um agente clastogênico pode induzir a ocorrência de
quebras cromossômicas, gerando fragmentos acêntricos que se atrasam em relação
aos elementos com centrômero, ou causar distúrbios no aparato mitótico, de modo
que algumas cromátides podem também se atrasar em relação às demais. Assim, um
cromossomo inteiro ou fragmentos acêntricos não conseguem se migrar para os polos
da célula durante a anáfase e podem não ser incluídos nos núcleos das células-filhas
após a divisão celular, formando, assim, os chamados micronúcleos (MN), observados
no citoplasma dos eritrócitos policromáticos (EPC) (Kirsch-Volders et al., 2011)
(Figura 6).
25
Os EPC, quando sofrem maturação, se transformam em eritrócitos
normocromáticos (ENC), os quais são lançados na corrente sanguínea. O teste do
MN se caracteriza pela observação do efeito do agente testado em EPC anucleados,
que têm vida curta e qualquer micronúcleo encontrado representa dano cromossômico
recente (Salvadori et al., 2003). Se contarmos os MN apenas em EPC, saberemos
que eles se formaram na mitose anterior, na presença do agente mutagênico (Rabelo‐
Gay, 1991).
Na técnica do MN em medula óssea de roedores, a avaliação do número de
células micronucleadas é obtida por meio da contagem de 2000 EPC por animal, onde
são utilizados 5 animais para cada grupo tratado e respectivos controles. Também é
feita a avaliação da relação EPC/ENC em total de 1000 EPC registrando,
simultaneamente, a frequência de ENC, para avaliar a citotoxicidade de um composto
(Heddle e Salamone, 1981). Uma diminuição na proporção de EPC reflete em uma
diminuição na relação EPC/ENC, de modo que a diminuição dessa relação é um
parâmetro para a ação tóxica medular e depressão celular. Dessa forma, essa relação
constitui parâmetro de citotoxicidade ou depressão celular (Shahrim et al., 2006).
Os MN aparecem nas células filhas em decorrência de danos induzidos nas
células parentais (Ribeiro, 2003). São considerados MN clássicos estruturas
circulares, delimitadas por membrana, de mesma refringência que o núcleo, porém
não ligadas a esse e com um tamanho que corresponda de 1/5 a 1/20 do tamanho do
núcleo principal (Heddle, 1973; Schmid, 1975; Rabello-Gay, 1991) (Figura 7).
26
Figura 5: Processo de maturação das células da linhagem eritrocitária (Ribeiro,
2003).
Figura 6: Formação de micronúcleos em eritrócitos da medula óssea (Ribeiro,
2003).
27
Figura 7: Fotomicrografia de eritrócitos da medula óssea de camundongos. (A-
eritrócitos normocromáticos -ENC; B- eritrócitos policromáticos - EPC; C- eritrócitos
policromáticos micronucleados - EPCMN). Fonte: Laboratório de Radiobiologia e
Mutagênese/ ICB – UFG
Os eventos que levam à formação do MN podem ser induzidos pelo estresse
oxidativo, exposição a agentes clastogênicos ou aneugênicos, defeitos genéticos nos
checkpoints do ciclo celular e nos genes de reparo do DNA (Rajagopalan et al., 2004;
Fenech et al., 2005; Bonassi et al., 2007). Todos esses eventos que causam a
formação do MN, como rearranjos cromossômicos, expressão gênica alterada, ou
aneuploidia são efeitos associados com a instabilidade cromossômica geralmente
observada no câncer (Fenech, 2002; Rajagopalan et al., 2004).
É importante também ressaltar que o potencial de muitos compostos naturais
de modular os efeitos genotóxicos de xenobióticos tem sido identificado utilizando-se
o teste do MN como parâmetro de análise (Azevedo et al., 2003). Ensaios com animais
in vivo se tornam importantes para a avaliação da genotoxicidade e/ou
antigenotoxicidade, por melhor se aproximarem das condições do organismo humano
e levarem em consideração elementos como distribuição, metabolismo, detoxificação,
mecanismos de reparo do DNA, conjugação e excreção (Butterworth, 2006). Por essa
razão, no estudo proposto nesta tese, foram também realizados diferentes testes in
vivo, tais como o teste do Micronúcleo e o ensaio cometa.
1.4.3. Ensaio Cometa ou Single Cell Gel Electrophoresis (SGE)
O ensaio cometa, também chamado Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE), é
amplamente aceito como um método padrão para avaliar danos no DNA (McKenna et
28
al., 2008). Esta é uma técnica utilizada para detectar lesões genômicas, que, após
serem processadas, podem resultar em mutação. Diferentemente das mutações, as
lesões detectadas com o ensaio cometa são passíveis de correção (Gontijo e Tice,
2003), constituindo, portanto, lesões pré-mutagênicas (Kammann et al., 2001).
O ensaio cometa foi primeiramente descrito por Ostling e Johanson (1984) e foi
denominado como “estudo microeletroforético” de danos no DNA em células
individuais. Essa técnica tem sido modificada e extensivamente validada ao longo dos
anos, e é agora comumente referida como ensaio cometa (Wong et al., 2005). O
ensaio cometa pode ser aplicado em qualquer tecido in vivo, desde que uma
suspensão de células individuais nucleadas possam ser obtidas (Hartmann et al.,
2003).
As vantagens do ensaio cometa incluem a simplicidade, rápida performance e
alta sensibilidade para vários tipos de danos no DNA (Gonçalves et al., 2013; Wong
et al. 2005). Essa metodologia apresenta algumas vantagens sobre os testes
bioquímicos e citogenéticos, entre as quais a utilização de um pequeno número de
células que não necessariamente estejam em divisão (Gonçalves et al., 2013).
Devido às numerosas vantagens do ensaio cometa, essa técnica tem sido
amplamente utilizada na avaliação da genotoxicidade de medicamentos, aditivos
alimentares, agroquímicos, em sistemas in vitro e/ou in vivo, bem como nos estudos
de reparo do DNA, estudos de ecotoxicologia, biomonitoramento humano e ambiental
(Wong et al., 2005; Piperakis, 2009; Liao et al., 2009).
Esse teste detecta quebras de fita simples e duplas, ligações cruzadas, sítios
de reparo por excisão e/ou lesões alcali-lábeis. Nesse ensaio, as células são
englobadas em gel, espalhadas sobre uma lâmina e o genoma nuclear é desenrolado
e submetido a uma corrente elétrica que proporciona a migração de segmentos de
DNA livres para fora do núcleo. Quebras no DNA causam um relaxamento local do
material genético superenrolado, permitindo que alças de DNA sejam arrastadas
durante a eletroforese. As células que apresentam um núcleo redondo são
identificadas como normais, sem dano detectável no DNA. Por outro lado, as células
lesadas são identificadas visualmente por uma espécie de cauda, similar a um
cometa, formada pelos fragmentos de DNA (Tice et al., 2000; Azqueta et al., 2009;
Oliveira et al., 2009).
A partir do núcleo, fragmentos de DNA migram no sentido do ânodo. Quanto
mais intensa for a indução de quebras, menores serão os fragmentos e maior a
29
extensão de migração. Após coloração específica, o DNA da célula que não
apresentar dano migrará de forma homogênea formando um círculo. Em
contrapartida, o DNA danificado formará fragmentos de diversos tamanhos,
originando forma similar à de um cometa, com a cauda correspondendo aos
fragmentos que migraram. O dano pode ser quantificado em células individuais. Para
interpretação dos resultados, o cometa é dividido entre cabeça e cauda. Assim células
sem ou com pouco dano no DNA não apresentam cauda, enquanto células com mais
danos apresentam caudas maiores (Perez-Cerezales et al. 2009).
Há duas versões do Ensaio Cometa: a neutra, que é considerada menos
sensível porque detecta apenas lesão de fita dupla de DNA (Ostling e Johanson,
1984); e a alcalina, descrita por Singh et al. (1988) a qual é adotada pela maioria dos
laboratórios por detectar maior variedade de lesões de DNA, como quebra de fita
simples, lesões de sítios alcalinos lábeis, locais de reparos incompletos e crosslinks.
Os cometas resultantes da corrida eletroforética do DNA necessitam passar por um
processo de coloração, que pode ser feito alternativamente por técnicas de
fluorescência, usando brometo de etídio, iodeto de propídio e cyber Green; ou por
histotécnica convencional com sal de prata (Dusinska e Collins, 2008; Brianezi et al.,
2009).
Para a visualização do dano no DNA, em geral, são analisadas 100 células por
indivíduo (Figura 8). As lâminas são feitas em duplicata, sendo contadas 50 células
de cada lâmina, para que se tenha um total de 100 células para cada indivíduo. As
lâminas são analisadas em aumento de 40x com microscópio óptico. (Vilella et al.,
2003).
Figura 8: Imagens de nucleóides do pós-tratamento da medula óssea de
camundongos tratados com o composto 4-MET. Figura 4-A, nucleóide com danos no
DNA e figura 4-B nucleóide sem danos no DNA (Laboratório de Radiobiologia e
Mutagênese, 2015).
A B
30
O uso de ensaio cometa associado ao teste de micronúcleo é recomendado.
Enquanto o ensaio do cometa detecta lesões reversíveis, o teste de micronúcleo
detecta lesões mais persistentes no DNA ou efeitos aneugênicos que não podem ser
reparados (Hartmann et al., 2003; Rothfuss et al., 2011). Os danos mensurados pelo
ensaio cometa aparecem mais cedo do que os micronúcleos, que requerem uma
divisão celular para serem visualizados (Dusinska e Collins, 2008). Diante disso,
destaca-se a importância de avaliar o potencial genotóxico e mutagênico de 4-MET
no presente estudo por meio dois ensaios, micronúcleo e cometa.
1.4.4. Teste para Detecção de Mutação e Recombinação Somática (Somatic
Mutation and Recombination Test- SMART)
O teste SMART é um ensaio que permite a quantificação simultânea de
recombinação mitótica e mutação usando D. melanogaster. O SMART constitui um
ensaio de curto prazo, caracterizado por ser rápido, barato, produzir resultados
confiáveis e facilmente reproduzíveis. Esse ensaio é amplamente utilizado na
detecção de efeitos mutagênicos e antimutagênicos de agentes químicos e misturas
complexas (Spanó et al., 2001; Thomé et al., 2012; Franchi et al., 2013; Andrade et
al., 2014).
A D. melanogaster, um organismo eucarioto conhecida popularmente como
mosca da fruta, tem sido utilizada há mais de 90 anos em pesquisa genética, em
diversos testes para o monitoramento de agentes genotóxicos (Rand, 2010). Segundo
Akmoutsou et al. (2011) e Perkhulyn et al. (2015), o extensivo conhecimento acerca
do genoma da D. melanogaster tem feito desse organismo um modelo para estudos
genéticos em eucariontes, bem como na avaliação dos efeitos tóxicos, genotóxicos e
antigenotóxicos.
A comparação do genoma humano com o da Drosophila aponta para a alta
conservação evolutiva, não apenas em nível da sequência do DNA, mas,
principalmente, em relação às funções gênicas. São também relevantes os dados
obtidos com base em análises proteômicas, uma vez que 60% dos 289 genes
relacionados a doenças humanas apresentam homologia em Drosophila, dos quais,
31
75% portam sequências proteicas similares nesses dois organismos (Tickoo e Russel,
2002).
O teste SMART/asa foi desenvolvido para detectar a perda de heterozigose de
genes marcadores específicos que determinam a expressão de fenótipos detectáveis
nas asas da mosca adulta. Esse teste baseia-se na identificação de pelos ou tricomas
com fenótipos mutantes que representam a expressão fenotípica da ocorrência de
lesões em nível de DNA (Graf et al., 1984; Dias, 2008).
As lesões são primordialmente induzidas nas células dos discos imaginais que,
por diversas divisões mitóticas, darão origem a estruturas do corpo da mosca adulta,
como as asas. Caso ocorra alguma alteração genética em uma das células do disco
imaginal, tal alteração estará presente em todas as células descendentes, formando
clone de células mutantes detectadas como mancha de pelos diferentes na asa da
mosca adulta. Essas manchas, com fenótipos característicos indicam a ocorrência de
eventos genéticos relacionados com mutações pontuais, aberrações cromossômicas
e rearranjos estruturais devidos à recombinação mitótica (Graf et al., 1984; 1989;
1996).
Diversos trabalhos apontam que a recombinação homóloga (RH) consiste em
um dos mecanismos responsáveis pela perda de heterozigose de genes que estão
envolvidos na regulação do ciclo celular. A RH também pode induzir eventos como a
conversão gênica, deleção de segmentos cromossômicos e translocações e é
considerada como um dos principais processos de alterações genéticas envolvidos
na gênese e progressão de processos carcinogênicos (Bishope e Schiestl, 2001;
Lehmann, 2003; Andrade et al., 2014; Koksal e Gurbuzel, 2015). Revelando assim a
importância do uso do teste SMART/asa juntamente com outros bioensaios na
avaliação de agentes genotóxicos e antigenotóxicos.
Para a realização do teste SMART são utilizadas 3 linhagens mutantes de D.
melanogaster:
1) Linhagem multiple wing hairs (mwh): os indivíduos dessa linhagem possuem um
gene marcador no braço esquerdo do cromossomo 3 e é caracterizado por expressar
três ou mais pelos por célula (pelos múltiplos) (Figura 9b), diferentemente da
linhagem selvagem em que há a expressão de apenas um pelo por célula (Figura 9a)
(Dias, 2008);
2) Linhagem flare3 (flr3): os indivíduos dessa linhagem possuem o gene marcador
flr3 localizado também no braço esquerdo do cromossomo 3, em uma região mais
32
proximal do centrômero, e é caracterizado por expressar um pelo modificado na
célula, com a base alargada e semelhante a uma “chama de vela” (Figura 9c). Esse
gene marcador é letal em homozigose recessiva e as moscas não se desenvolvem
até a fase adulta (Graf et al., 1984; Guzmán-Rincon e Graf, 1995). Em virtude dessa
letalidade, foi desenvolvido cromossomo balanceador TM3, Bds (Third Multiple 3,
beaded-serrate), que mantém a heterozigose da linhagem. O balanceador impede
eventos de recombinação (Lindsley e Zimm, 1992);
3) Linhagem Oregon R, flare3 (ORR): essa linhagem é caracterizada por ser capaz
de ativar promutágenos, de forma mais eficiente, que dependem da ativação
metabólica por enzimas citocromo P450, também conhecidas como CYP6A2. A
linhagem ORR possui alta capacidade de bioativação devido a altos níveis de
expressão de enzimas citocromo P450 (Hallstrom e Blanck, 1985).
A partir dessas três linhagens, são realizados dois tipos de cruzamentos para
o teste SMART/asa:
a) Cruzamento padrão (ST) fêmeas virgens flr3 são cruzadas com machos mwh
(Graf et al., 1989);
b) Cruzamento de alta bioativação metabólica (HB) fêmeas virgens ORR são
cruzadas com machos mwh (Graf e Van Schaik, 1992).
De ambos os cruzamentos, é possível a obtenção de dois tipos de
descendentes: trans-heterozigotos para os marcados recessivos mwh e flr3 (MH-
mwh+/+flr3) que possuem asas arredondadas e os heterozigotos para o cromossomo
balanceador TM3 (BH- mwh+/TM3Bds) que possuem asas serrilhadas (Figura 10)
(Dias, 2008).
A B C
Figura 9: Fenótipos dos pelos de D. melanogaster (microscopia eletrônica): a) pelos
normais; b) pelos mwh e c) pelos flr3 (Dias, 2008).
33
Figura 10: Linhagens teste de D. melanogaster: (A) flr³, (B) mwh.
Os pelos mutantes são classificados em manchas: simples quando
expressam apenas um dos marcadores mwh ou flr3 originadas por mutação, deleção
ou recombinação distal; e gêmeas quando expressam os dois marcadores mwh e
flr3 na mesma mancha e são originadas exclusivamente por eventos recombinacionais
(Graf et al., 1984) (Figura 11).
Conforme o momento de indução do dano genético e do tempo de ação da
genotoxina durante a embriogênese, pode-se encontrar variações no número de
células mutantes presentes nas manchas. Quanto ao tamanho, as manchas se
classificam em simples pequenas, quando possuem um ou dois pelos mutantes por
célula, caracterizadas por se formarem durante o último e penúltimo ciclo de divisão
mitótica, que ocorrem na fase de pupa. Ou manchas simples grandes, se houver três
ou mais pelos mutantes, são alterações produzidas mais cedo, ou seja, são formadas
durante o desenvolvimento larval no início das divisões mitóticas. Como células
monossômicas ou portadoras de grandes deleções, dividem-se raramente, aumentos
restritos ao número de manchas simples pequenas podem ser indicativos de
Clastogênese ou Aneugênese (Graf et al., 1995).
Figura 11: Fotomicrografia mostrando pelos múltiplos, flare (seta A) e mancha
gêmea (B).
A B
34
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Avaliar a atividade genotóxica, antigenotóxica, mutagênica, antimutagênica,
recombinogênica e anti-recombinogênica de 4-MET em diversos níveis celulares e
organismos.
2.2. Objetivos Específicos
-Avaliar a atividade mutagênica e antimutagênica de 4-MET pelo teste de
mutagenicidade de Ames em linhagens de Salmonella typhimurium.
-Avaliar a atividade mutagênica e antimutagênica de 4-MET pelo teste do micronúcleo
em medula óssea de Camundongos in vivo.
-Avaliar a atividade genotóxica e antigenotóxica de 4-MET pelo ensaio cometa em
medula óssea de camundongos.
-Avaliar a atividade mutagênica, recombinogênica, antimutagênica e anti-
recombinogênica de 4-MET pelo teste SMART/asa com D. melanogaster.
35
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Experimento Químico
3.1.1. Síntese de 4-MET
Todos os reagents comerciais foram obtidos da Sigma-Aldrich (S. Luis, MO,
USA). cromatografia em camada delgada (CCD) foi realizada em de placas de gel de
silica 60 F254 (Merck KGaA). Espectros 1H NMR e 13C NMR foram registrados em um
espectofotometro Bruker Advance (Bruker Optik GmbH, Ettlingen, Germany).
Espectros infravermelhos foram feitos com um espectometro Bomem M102 (Bomem
Inc., Vanier, Quebec, Canada).
3.1.2. Híbrido cumarina-chalcona (4-MET)
O Híbrido cumarina-chalcona 4-MET (Figura 12) foi sintetizado no Instituto de
Química, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brasil em parceria com o
Professor Dr. Guilherme Roberto de Oliveira. O composto foi ressuspendido em
dimetilsufoxido (DMSO) usado imediatamente nos tratamentos.
Figura 12: Estrutura Química do (E)-7-metoxi-3-(3-(3,4,5-trimetoxifenil)acriloil-2H-
cromen-2-ona ou 4-MET.
3.1.3. Síntese do híbrido cumarina-chalcona (4-MET)
O composto foi preparado seguindo a condensação do 3-acetil-7-metoxi-2H-
cromen-2-ona previamente sintetizado. A Sintese do 4-MET está detalhada na Figura
13.
36
O
O
O
OMe
OMe
OMe
MeO
CH3
O
OHMeO
+ CH3 OCH3
O O
O O
CH3
O
MeO
A
B
A: dietilamina/etanol
B: 3,4,5-trimetoxi benzaldeído e
dietilamina/etanol anidro refluxo
Figura 13: Síntese de (E)-7-metoxi-3-(3-(3,4,5-trimetoxifenil)acriloil-2H-cromen-2-
ona ou 4-MET.
3.1.3.1. Preparação do 3-acetil-7-metoxi-2H-chromen-2-ona
A cumarina 3-acetil foi sintetizada como descrito previamente por Bhatnagar et
al. (2012). Para a solução de 2-hidroxi-4-metoxibenzaldeido (2 mmol e acetoacetato
de metila e (2.2 mmol) em 3.0mL de etanol, uma quantidade de 0,2 mL de dietilamina
foi adicionada. Depois foi agitada por 6 horas a temperature ambiente, o sólido foi
filtrado, lavado com éter etílico gelado e recristalizado em etanol. ¹H NMR
(CDCl3) δ: 8.48 (s; 1H), 7.55 (d; 1H; J = 8.7 Hz), 6.90, 6,82(1H; J=2,4) (dd; 1H; J = 8.7
Hz e 2.4 Hz), 3.92 (s; 3H), 2.70 (s; 3H). ¹3C NMR (CDCl3) δ: 195.7; 165.5; 159.9; 147.9;
131.7; 120.9; 114.1; 112.3;100.6; 56.3; 30.7.
3.1.3.2. Preparação do híbrido de cumarina-chalcona (4-MET)
Para uma mistura de 3-acetil-7-metoxi-2H-cromen-2-ona (2 mmol) e 3,4,5-
trimetoxi benzaldeido (2 mmol) em 3.0 mL de etanol anidro, uma quantidade de 0,2
mL de piperidina foi adicionada, a mistura foi agitada por 10 minutos e depois colocada
em refluxo overnight. O sólido foi filtrado e recristalizado em etanol, resultando em 4-
MET. IR (KBr) max cm-1: 3040, 2980, 1737 e 1211. ¹H NMR (CDCl3) δ: 8,60 (s;
37
1H), 7,92 (d; 1H; J= 15,69 Hz), 7,79 (d; 1H; J= 15,69 Hz), 7,58 (d; 1H; J= 8,71), 6,93
(dd; 1H; J= 8,71 e 2,45 Hz), 6,91 (s; 2H), 6,86 (d; 1H; J= 2,45 Hz), 3,94 (s; 3H), 3,93
(s; 6H) e 3.91 (s; 3H).
3.2. Experimentos Biológicos
3.2.1. Teste de Mutagenicidade de Ames em cepas de S. typhimurium
3.2.1.1. Cepas bacterianas
Foram utilizadas as cepas bacterianas de S. typhimurium TA98 e TA100. As
linhagens utilizadas foram gentilmente cedidas pela Divisão de Toxicologia,
Genotoxicidade e Microbiologia Ambiental da Companhia de Tecnologia de
Saneamento Ambiental do Estado de São Paulo (CETESB, São Paulo, SP, Brasil).
3.2.1.2. Meios de cultura, reagentes e soluções
Foram utilizados Top-ágar; Solução de Cloreto de Sódio a 0,5%; Solução de
Histidina/Biotina (0,5 mM); Caldo Nutriente; Meio Mínimo Glicosado (MMG) contendo
solução de sais de Vogel-Bonner 50X (sulfato de magnésio heptahidratado, ácido
cítrico monohidratado, fosfato de potássio dibásico, fosfato de sódio e amônio) e
solução de dextrose (40%).
Antes de serem utilizadas, todas as soluções preparadas foram colocadas em
autoclave a 120ºC durante 20 minutos.
Solução de sais de Vogel-Bonner
Sulfato de magnésio hidratado...................................................................................1 g
Ácido cítrico monohidratado P.A..............................................................................10 g
Fosfato de potássio dibásico P. A............................................................................50 g
Fosfato de sódio e amônio P. A............................................................................17,5 g
Água morna destilada...........................................................................................65 mL
Solução de glicose 40%
Dextrose P. A...........................................................................................................40 g
Água destilada....................................................................................................100 mL
38
Ágar Mínimo Glicosado
Ágar..........................................................................................................................15g
Solução de sais de Vogel-Bonner.........................................................................20 mL
Solução de glicose 40%........................................................................................50 mL
Água destilada....................................................................................................930 mL
Para a preparação do Meio Mínimo Glicosado (placa-teste) foram distribuídos
30 mL do meio de cultura em placas de Petri. Posteriormente as placas contendo o
ágar mínimo glicosado foram colocadas em repouso por 12 horas em estufa a 37ºC
para posterior utilização.
Solução de Biotina (0, 5 mM)
Biotina...................................................................................................................18 mg
Água destilada....................................................................................................125 mL
Solução de Histidina (125 mL)
Histidina................................................................................................................50 mg
Água destilada .....................................................................................................10 mL
Placa Máster
Ágar........................................................................................................................7,5 g
Solução de sais de Vogel-Bonner.........................................................................10 mL
Solução de glicose 40%........................................................................................25 mL
Solução de biotina...................................................................................................3 mL
Solução de histidina................................................................................................5 mL
Água destilada....................................................................................................500 mL
Caldo Nutritivo
Caldo nutritivo............................................................................................................5 g
Água destilada....................................................................................................200 mL
39
Solução Histidina/Biotina 0,5 mM
D-Biotina...............................................................................................................62 mg
L-Hitidina...............................................................................................................48 mg
Água destilada....................................................................................................500 mL
Ágar de superfície com traços de biotina/histidina (top-ágar)
Bacto ágar..................................................................................................................3 g
Cloreto de sódio (NaCl)...........................................................................................2,5 g
Solução de histidina/biotina..................................................................................50 mL
Água destilada....................................................................................................500 mL
3.2.1.3. Controles
Nos experimentos realizados foram utilizados controles positivos: 4-
nitroquinolina (4NQO) para a cepa TA98 (0,5 µg), azida sódica para a cepa TA100
(1,5 µg). Como controle negativo utilizou-se dimetilsulfóxido (DMSO) diluído em água.
3.2.1.4. Procedimento experimental
As cepas de S. typhimurium TA98 e TA100 foram inoculadas em caldo
nutriente, a 37°C, com agitação constante por 12h até atingir a fase estacionária de
crescimento.
Para avaliação da atividade mutagênica, alíquotas de culturas das cepas
bacterianas (100 µL) foram incubadas em diferentes concentrações (1 µg, 10 µg, 50
µg 100 µg e 500 µg) de 4-MET em tubos de ensaio em triplicata com agitação e
aeração constantes, durante 25 minutos. Juntamente aos grupo tratados foram
incluídos os controles positivos específicos para cada cepa (0,5 µg de 4-NQO para
TA98 e 1,5 µg de azida sódica para TA100) e o controle negativo (DMSO diluído em
água). Após o período de incubação, foram adicionados 2 mL de ágar glicosado
liquefeito (top-ágar), contendo a solução de histidina/biotina 0,5 mM, mantido à
temperatura de 45ºC. A mistura foi homogeneizada e vertida em placa, contendo meio
mínimo glicosado, que foi incubada a 37ºC durante 48h. Em seguida, foi feita a
contagem do número de colônias revertentes por placa. Cada dose constou de três
repetições e foram realizados três experimentos para cada cepa.
Na avaliação da atividade antimutagênica, alíquotas de culturas das cepas
bacterianas (100 µL) foram incubadas em diferentes concentrações (1 µg, 10 µg, 50
40
µg 100 µg e 500 µg) de 4-MET concomitante aos controles positivos específicos para
cada cepa (0,5 µg de 4-NQO para TA98 e 1,5 µg de azida sódica para TA100) em
tubos de ensaio em triplicata com agitação e aeração constantes, durante 25 minutos.
Após o período de incubação, foram adicionados 2 mL de ágar glicosado liquefeito
(top-ágar), contendo a solução de histidina/biotina 0,5 mM, mantido à temperatura de
45ºC. A mistura foi homogeneizada e vertida em placas, contendo meio mínimo
glicosado, as quais foram incubadas a 37ºC durante 48h. Em seguida foi feita a
contagem do número de colônias revertentes por placa. Cada dose constou de três
repetições e foram realizados ao todo três experimentos para cada cepa.
3.2.1.5. Análise estatística
Na avaliação da mutagenicidade, após a contagem do número de colônias
revertentes foi calculada a razão de mutagenicidade (RM), dada pela seguinte
equação:
RM = (número de revertentes em placa teste (espontâneos + induzidos)
número de revertentes em placa do controle negativo (espontâneos))
O resultado é considerado positivo para mutagenicidade quando o
número de colônias revertentes nas placas for igual ou superior ao dobro do número
de colônias revertentes espontâneas do controle negativo (Maron e Ames, 1983).
Além disso todos os resultados também foram submetidos à Análise de Variância
(ANOVA), seguido do teste Tukey. Os valores de P < 0,05 foram considerados
significativos quando comparados com o controle negativo.
Para a avaliação da antimutagenicidade foi calculada a porcentagem de
inibição de mutagenicidade (PI) pela utilização da equação de Sghaier et al., 2011:
PI(%) = [1 − ( número de revertentes em placa teste − RE
número de revertentes em placa do controle positivo − RE )] X 100
RE: revertentes espontâneos
PI: porcentagem de inibição
Considera-se como resultado positivo quando a porcentagem de inibição é
relevante, pelo menos acima de 30 % e para verificar significância estatística os
resultados também foram submetidos a testes estatísticos, Análise de Variância
41
(ANOVA), seguido do teste Tukey. Os valores de P < 0,05 foram considerados
significativos quando comparados com o controle positivo.
3.2.2. Teste em Camundongos
O protocolo usado neste estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
Animal da Universidade Federal de Goiás (CEP/UFG no. 014/2014- ANEXO 1). Este
experimento seguiu todas as normas de manejo e experimentação animal
preconizadas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).
Foram utilizados 50 camundongos Mus musculus (Swiss Webster) out bred, do
sexo masculino, pesando entre 30 e 40g com idade variando de 7 a 12 semanas,
procedentes do Biotério Central da Universidade Federal de Goiás. Antes da
realização dos experimentos, os animais permaneceram por 7 dias no laboratório,
mantidos em gaiolas de polipropileno com dimensão de 40x30x16 cm com 5 animais
cada, forradas com maravalha trocada diariamente, e alimentados com ração
comercial e água filtrada, ambos oferecidos "ad libitum". Os animais foram mantidos
a temperatura ambiente de 25ºC, umidade 50% ± 20% e um ciclo de luz 12h claro/12h
escuro.
3.2.2.1. Protocolos de tratamento dos animais
No presente estudo foram utilizados os mesmos animais para o Teste do
Micronúcleo e Ensaio Cometa. Os animais foram divididos em 10 grupos com 5
animais cada e pesados antes da administração do composto. Em todos os
tratamentos duas doses de 4-MET (25 e 50 mg/Kg de peso corporal - pc) foram
administradas oralmente para os grupos de 5 animais. Cada animal do grupo 1
recebeu DMSO (0,15 mL) administrado oralmente, sendo o grupo 1 o controle
negativo, os animais do grupo 2 receberam ciclofosfamida (CIF) administrada
intraperitoneal (ip) em uma dose de 50 mg/Kg pc, sendo o grupo controle positivo. Os
grupos de 3 a 10 receberam diferentes tratamentos com 4-MET, conforme a seguir,
totalizando 10 grupos (Figura 14).
Genotoxicidade e citotoxicidade: Os animais do grupo 3 receberam uma dose
simples de 50 mg/Kg pc de 4-MET (24 h) e os animais do grupo 4 receberam 50 mg/kg
pc de 4-MET durante um período de 5 dias consecutivos (120 h).
Co-tratamento: animais do grupo 5 e 6 foram tratados, respectivamente, com 25 e 50
mg/Kg pc de 4-MET juntamente com a administração da CIF via ip.
42
Pre-tratamento: os animais do grupo 7 e 8 receberam, respectivamente 25 e 50
mg/Kg pc de 4-MET, durante 5 dias. No quinto dia duas horas depois da administração
de 4-MET foi administrado CIF ip.
Pós-tratamento: animais do grupo 9 e 10 foram tratados com CIF e depois de 6h e
12h de administração do agente inductor, esses animais receberam 4-MET em doses
de 25 e 50 mg/kg, respectivamente, totalizando 50 e 100 mg/kg.
Todos grupos de animais (tratados e controles) foram sacrificados por
deslocamento cervical 24 horas após a última administração deste agente alquilante
e os animais que receberam apenas 4-MET foram sacrificados 24 horas após a
adiministração deste composto. As células da médula óssea dos fêmures dos animais
foram lavadas em soro fetal bovino, e depois centrifugados (300 x g, 5 min), e
utilizadas para a confecção de lâminas para o Teste do Micronúcleo e Ensaio Cometa.
Figura 14: Representação dos experimentos realizados em camundongos.
3.2.2.2. Teste do Micronúcleo em Medula Óssea de Camundongo
O teste do micronúcleo foi realizado conforme os métodos descritos por Heddle
(1973) e Schmid (1975). Conforme mencionado anteriormente, as células da medula
óssea de camundongos foram utilizadas para a confecção de esfregaços celulares em
43
lâminas de vidro, que ao secarem foram fixadas em metanol absoluto durante 5
minutos, e posteriormente coradas em solução de Giemsa tamponada (fosfato de
sódio dibásico e fosfato de sódio monobásico) com pH 6,8. Para cada animal, três
lâminas foram preparadas, e um total de 2.000 eritrócitos policromáticos (EPC) foram
contados para determinar a frequência de eritrócitos policromáticos micronucleados
(EPCMN). A genotoxicidade e a antigenotoxicidade foram avaliadas pela frequência
de EPCMN, enquanto a citotoxicidade e a anticitotoxicidade foram avaliados pela
razão de EPC e eritrócitos normocromáticos (ENC).
A análise das lâminas foi realizada em microscopia óptica de luz, com a
finalidade de se detectar possíveis alterações e/ou perdas cromossômicas
(micronúcleos) nos eritrócitos da medula óssea dos animais submetidos aos
diferentes tratamentos. As células foram visualizadas utilizando objetiva de imersão
(100x), avaliando-se 2000 eritrócitos policromáticos (EPC) por animal e para cada
grupo foram utilizados 5 animais. Para avaliação da citotoxicidade, contou-se até
1000 EPC registrando simultaneamente a frequência de eritrócitos normocromáticos
(ENC), a razão EPC/ENC foi então determinada conforme modelo proposto por
Schmid (1975).
3.2.2.3. Ensaio Cometa
O ensaio cometa foi feito usando o método alcalino baseado nos métodos de
Sigh et al (1988) e Atia et al. (2013).
As células da medula óssea dos mesmos camundongos utilizadas para a
realização do Teste do Micronúcleo foram utilizadas para a realização do Ensaio
Cometa. Após a centrifugação dessas células, 10 µL da solução da medula óssea foi
homogeneizado com 120 µL de agarose low-melting (baixa fusão) e imediatamente
espalhado em lâminas de pré-cobertura, previamente preparadas e acrescido de
lamínula. Essas lâminas de pré-cobertura foram preparadas por imersão em solução
contendo 100 mL de PBS (tampão fosfato-salino) e 1,5 g de agarose e,
posteriormente, foram secas overnight na horizontal e em temperatura ambiente.
Essa lâmina foi mantida a 4°C por 5 minutos para solidificação. Após este
período, a lamínula foi retirada e as lâminas foram incubadas em uma solução de lise
(2,5M NaCl, 10mM Tris, 100mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 1% Triton X-
100 e 10% dimetilsulfóxido (DMSO), pH 10) e colocadas a 4°C por 24 horas para
remover proteínas e membranas. Posteriormente, as lâminas foram colocadas em
44
tampão de eletroforese (300mM NaOH, 1mM EDTA, pH > 13,0) por 30 minutos. Em
seguida, foi realizada a corrida de eletroforese por 25 minutos, a 0,9 V/cm e 300 mA
e a 4°C. Todo o procedimento foi feito no escuro para prevenir danos ao DNA. Após
a corrida eletroforética, as lâminas foram mergulhadas em solução de neutralização
(0,4M Tris, pH 7,5), lavadas com água destilada e secas a temperatura ambiente.
Para a captura das imagens, as lâminas foram coradas com 20 µL de Brometo
de Etídeo (0,02 mg/mL), 5 minutos antes da análise. As lâminas foram preparadas em
duplicatas e 100 nucleóides analisados (50 nucleóides para cada lâmina) utilizando
microscópio de fluorescência Axioplan - Imaging® usando o software Isis com um filtro
de excitação de 510-560 nm e um filtro barreira de 590 nm no aumento de 200 X.
Os nucleóides foram avaliados pelo software OpenComet, versão 1.3 (Figura
15). Para avaliação dos resultados foi selecionado o parâmetro Porcentagem de DNA
na cauda (% DNA in tail) que tem sido o parâmetro mais utilizado para quantificação
de danos no DNA (Collins, 2014).
Figura 15: Imagem analisado no software Open Comet, versão 1.3.
45
3.2.2.4. Análise Estatística dos Testes Micronúcleo e Cometa
Para análise estatística do teste do micronúcleo a avaliação de genotoxicidade
e antigenotoxicidade foi realizada por meio da comparação das frequências de
eritrócitos policromáticos micronucleados (EPCMN) dos grupos tratados, em relação
ao grupo controle negativo (genotoxicidade) ou positivo (antigenotoxicidade) pelo
teste ANOVA. Em seguida, foi utilizado o teste de comparação múltipla (teste de
Tukey). Para a avaliação de citotoxidade as frequências de EPC/ENC de cada grupo
foram comparadas pelo teste Qui-quadrado. Foram considerados significativos
valores de p< 0,05.
A porcentagem (%) de redução da genotoxicidade induzida pela CIF foi
calculada pela média de EPCMN de cada tratamento, usando a seguinte fórmula
(Waters et al. 1990; Fedato e Maistro, 2012):
% Redução = (A − B
A − C) X 100
*Onde A corresponde a media de EPCMC observada nos tratamentos com CIF
(controle postitivo), B corresponde a média de EPCMC observada em tratamentos de
antigenotocxicidade (4-MT associado com CIF) e C corresponde a media de EPCMC
no controle negativo.
Para análise estatística do ensaio cometa, foi realizado o teste ANOVA, seguido
do teste de Tukey, utilizando o softwere estatístico SigmaStat, versão 3.5. Em todas
as situações foi considerado como significativo quando p < 0.05.
3.2.4. Teste para a Detecção de Mutação e Recombinação Somática
(SMART/asa)
3.2.4.1. Linhagens de Drosophila melanogaster
Para a realização desse ensaio foram utilizadas três linhagens de D.
melanogaster que são portadoras de diferentes marcadores genéticos em seus
cromossomos (Graf e Van Schaik, 1992). As linhagens apresentam a seguinte
constituição genética:
-multiple wing hairs (mwh): mwh/mwh, com constituição fenotípica apresentando
múltiplos pelos por célula;
-flare3(flr3): flr3/In(3LR)TM3, ri pp sep I(3)89Aa bx34e e BdS, com constituição
fenotípica apresentando pelos com a base alargada;
46
-ORR; flare3(ORR; flr3): ORR; flr3 /In(3LR)TM3, ri pp sep I(3)89Aa bx34e e BdS, com
constituição fenotípica apresentando altos níveis de enzimas de metabolização da
classe citocromo p450.
3.2.4.2. Agentes Químicos
3.2.4.2. 1. Controles
- Foi utilizado como controle positivo a mitomicina C (MMC) e como controle negativo
o Dimetilsulfóxido (DMSO).
3.2.4.2.2. Meios de Cultura e Condições de Cultivo
Para a manutenção das linhagens de D. melanogaster e para a realização dos
cruzamentos das moscas adultas foi utilizado o meio de cultura banana-ágar (Marques
et al., 1966), distribuído em garrafas estéreis de 250 mL (Graf et al., 1984). A coleta
de larvas de terceiro estágio provenientes dos cruzamentos ST e HB foi realizada a
partir do meio de ovoposição constituído por uma camada de fermento biológico
(Saccharomyces cerevisiae) e açúcar sobre uma base sólida (1 cm) de ágar a 3%
(Graf et al., 1984). Para o tratamento crônico das larvas foi utilizado, por tubo, 900mg
de purê de batata comercial (Yoki alimentos S.A), hidratados com 3 ml das diferentes
concentrações selecionadas da 4-MT (5, 50, 100, and 400 µg/mL) e os respectivos
controles positivo (MMC a 0, 05 mM) e negativo (DMSO a 0,05%).
As linhagens foram mantidas em uma câmara com temperatura constante a
25ºC e umidade relativa de aproximadamente 60%.
3.2.4.3. Cruzamentos
Foram utilizados nesse bioensaio, dois tipos de cruzamentos:
a- Cruzamento Padrão (ST)- fêmeas virgens da linhagem flr3 foram cruzadas com
machos mwh. Esse cruzamento apresenta níveis basais de expressão de enzimas de
metabolização, complexo citocromo P-450 (Graf et al., 1989).
b- Cruzamento de Alta Bioativação Metabólica (HB) - fêmeas da linhagem ORR;
flr3 foram cruzadas com machos mwh. Este cruzamento apresenta níveis elevados de
expressão de enzimas de metabolização, especialmente as do complexo citocromo
P-450 (Graf e Van Schaik, 1992).
47
Os cruzamentos tiveram a duração de 48 horas, realizados em garrafas
contendo uma proporção de 80 fêmeas para 40 machos, previamente preparadas com
meio de cultura banana-ágar. Posteriormente, os reprodutores dos cruzamentos ST e
HB foram transferidos para o meio de cultura de ovoposição por um período de 8
horas, para obtenção de larvas de terceiro estágio. De ambos os cruzamentos foram
obtidos dois tipos de descendentes: trans-heterozigotos para os marcadores mwh
e flr3 (MH)- apresentando asas arredondadas; e heterozigoto para o balanceador
TM3 (BH)- que possuem asas serrilhadas devido à presença do cromossomo
balanceador TM3 (Graf et al., 1996).
3.2.4.4. Procedimento Experimental - Tratamento Crônico
Os experimentos foram realizados de acordo com Graf e colaboradores (1984).
Após 72±4 horas do início da ovoposição as larvas de terceiro estágio de ambos os
cruzamentos foram coletadas por flotação em água corrente com auxílio de peneiras
de malha fina. Para a avaliação do efeito tóxico, foram utilizadas 100 larvas em tubos
de vidro (2,5 cm de diâmetro e 8,0 cm de altura) submetidas a tratamento crônico por
administração oral da 4-MET. Para cada tubo foram adicionados 0,9 g de meio de
cultura purê de batata instantâneo (Yoki Alimentos S.A.). Para cada um dos tubos foi
adicionado 3 mL das concentrações de 4-MET (tubo 1-1 µg/mL de 4-MET, tubo 2- 5
µg/mL de 4-MET, tubo 3- 20 µg/mL de 4-MET, tubo 4- 50 µg/mL de 4-MET, tubo 5-
100 µg/mL de 4-MET, tubo 6- 200 µg/mL de 4-MET e tubo 7- 400 µg/mL de 4-MET)
para gerar as curvas de sobrevivência das larvas em função da dose e também o
controle negativo (água destilada estéril) e positivo (MMC 0,05 mM).
Na avaliação da atividade genotóxica, seguindo os mesmos procedimentos
adotados para a curva de sobrevivência, foram usados 100 larvas/tubo provenientes
de ambos os cruzamentos selecionados (ST e HB). Cada tubo foi previamente
preparado com 0,9 g de purê de batata, que foram hidratados com 3 mL de 4
diferentes concentrações de 4-MET selecionadas a partir dos resultados da curva de
sobrevivência mencionada acima (5, 50, 100, and 400 µg/mL).
Para avaliação da antigenotoxicidade também foram colocadas 100 larvas/tubo
de ambos os cruzamentos. Os tubos contendo 0,9 g de purê de batata, foram
hidratados com 1,5 mL do controle positivo (solução de MMC a 0,05 mM) associadas
com 1,5 mL das mesmas concentrações da 4-MET utilizadas para avaliação da
genotoxicidade (5, 50, 100, and 400 µg/mL).
48
Os adultos emergentes de cada tubo foram fixados em etanol 70% e armazenados à
temperatura ambiente, até o momento da montagem das asas e posterior análise
microscópica.
3.2.4.5. Análise citogenética
As moscas, conservadas em etanol 70%, tiveram suas asas retiradas com o
auxílio de pinças de relojoeiro, distendidas e fixadas sobre a superfície de lâminas
secas e embebidas com solução de FAURE (30g de goma arábica, 20 mL de glicerol,
1,5g de hidrato cloral e 50 mL de água destilada). As lâminas foram mantidas a 40ºC,
em uma placa aquecedora, por um período mínimo de 24 horas. Posteriormente,
foram colocadas lamínulas (24 x 32 mm), contendo uma gota da solução de FAURE,
permanecendo por mais 24 horas a 40ºC (Graf et al., 1984). Cada lâmina foi composta
por 20 asas, sendo 10 asas de machos e 10 asas de fêmeas. Para cada dose foram
analisadas 80 asas.
As lâminas foram analisadas em microscópio óptico com 400X de ampliação.
A análise constitui-se no registro da frequência, tipo de manchas encontradas (simples
pequena, grandes ou gêmeas), bem como o tamanho das mesmas e a posição em
que se encontram na asa.
3.2.4.6. Análise Estatística
Para análise estatística de possíveis efeitos genotóxicos foi realizada uma
comparação entre a frequência de manchas mutantes dos grupos tratados com a 4-
MT e o controle negativo. Estas comparações foram realizadas utilizando-se o teste
binominal condicional de Kastenbaum e Bowman (1970), com nível de significância
de 5%. Esse procedimento utilizado baseou-se em duas hipóteses:
(I) Ho: não há diferença entre as frequências de mutações do grupo controle e dos
grupos tratados com a 4-MET.
(II) Ha: as frequências de mutação induzida nos grupos tratados são “m” vezes
maiores que a frequência de mutações espontâneas obtida no grupo controle
negativo.
Onde “m” é o fator de multiplicação inserido para minimizar os riscos de falso-
positivo: m=2 para manchas simples pequenas e total de manchas, pois elas
apresentam altas frequências espontâneas e m=5 para manchas simples grandes e
49
gêmeas, porque raramente surgem de forma espontânea (Graf et al., 1984; Frei e
Wurgler, 1988; Frei et al., 1992).
Com base nos resultados obtidos dessa análise estatística foi feito um procedimento
de múltiplas decisões de acordo com Frei e Wurgler (1988):
(I) Aceita-se ambas as hipóteses, como elas não podem ser verdadeiras
simultaneamente, nenhuma decisão pode ser tomada, tendo-se assim, resultados
inconclusivos.
(II) Aceita-se Ho e rejeita-se Ha, o resultado será negativo.
(III) Rejeita-se Ho e se aceita Ha, o resultado será positivo.
(IV) Rejeitam-se ambas as hipóteses e o resultado será fraco-positivo.
Para análise estatística da antigenotoxicidade, a frequência de manchas
mutantes dos grupos tratados com a 4-MET foram comparadas com o controle
positivo (agente genotóxico isolado (MMC) versus 4-MET + agente genotóxico-MMC),
por meio do teste-U não paramétrico de Mann-Whitney (Frei e Würgler,1995).
Devido a fraca expressão do marcador de flr3 em clones pequenos e sua
letalidade em clones grandes de células mutantes (Graf, 1995), apenas os clones mwh
(manchas mwh simples e gêmeas) foram utilizados para calcular as frequências
formação de clones por 105 células. Estes valores foram depois utilizadas para estimar
a contribuição de recombinação e mutação para a incidência do total de manchas
mutantes em moscas MH (Andrade et al., 2004). As percentagens de inibição (PI)
foram calculados usando o total de manchas por asa com a seguinte fórmula
(Abraham, 1994):
% PI = {MMC − (MMC + 4 MT)
MMC } × 100
50
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63
8. PRODUÇÃO CIENTÍFICA
8.1. Manuscrito submetido à revista Plos One
PONE-D-17-03247
Chemopreventive Effect and DNA Repair Induction of the Coumarin-Chalcone Hybrid
[7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl)-2H-chromen-2-one] (4-MET)
Against DNA Damage In Vitro and In Vivo
Dr. Lee Chen-Chen
Dear MsC Camila Vale,
You are receiving this e-mail because you have been listed as an author on a
manuscript recently submitted to PLOS ONE and entitled "Chemopreventive Effect and
DNA Repair Induction of the Coumarin-Chalcone Hybrid [7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5
trimethoxyphenyl)acryloyl)-2H-chromen-2-one] (4-MET) Against DNA Damage In Vitro
and
In Vivo".
The corresponding author for the submission process is: Dr. Lee Chen-Chen
The full author list for the submission is: Camila Regina do Vale; Débora Cristina da
Silva Lima; Murilo Machado dos Anjos; Jefferson Hollanda Véras; Guilherme Roberto
de Oliveira; Lee Chen-Chen, PhD
If you are not aware of this submission, or if you should not be listed as a co-author,
then please contact the journal office at [email protected].
Kind regards,
PLOS ONE- http://pone.edmgr.com/
64
Chemopreventive Effect and DNA Repair Induction of the Coumarin-Chalcone
Hybrid [7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl-2H-chromen-2-one]
(4-MET) Against DNA Damage In Vitro and In Vivo
Running title: Chemopreventive effect of a coumarin-chalcone hybrid In Vitro and In
Vivo
Camila Regina do Vale1, Débora Cristina da Silva Lima1, Murilo Machado dos
Anjos2, Jefferson Hollanda Véras1, Guilherme Roberto de Oliveira2, and Lee
Chen-Chen1*
1 Department of Genetics, Institute of Biological Sciences, Federal University of Goiás,
Goiânia, GO, Brazil, 2 Institute of Chemistry, Federal University of Goiás, Goiânia, GO,
Brazil
The authors contributed equally to this work.
Abstract
Chalcones and coumarins are natural and/or synthetic compounds which have been
associated with numerous biological activities such as antioxidant, anti-inflammatory
and anti-tumoral effects. Based on their biological activities, we synthesized a
coumarin-chalcone hybrid [7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl-2H-
chromen-2-one] (4-MET) and assessed its genotoxic, cytotoxic, antigenotoxic, and
anticytotoxic effects, as well as DNA repair action using different types of treatment
(co-, pre- and post-treatment) in in vitro and in vivo assays. The Ames test,
micronucleus test, and comet assay revealed that 4-MET did not exhibit genotoxic
effects. Regarding cytotoxicity, 4-MET exhibited moderate cytotoxicity in mouse bone
marrow cells by micronucleus test (120 h). Results from co-, pre- and post- treatments
with 4-MET clearly showed their protective action against cyclophosphamide -induced
micronuclei and DNA damage. The obtained results suggested that this compound
may act both preventing DNA damage induced by cyclophosphamide (CPA) and also
in subsequent steps of damage, as well as the cellular repair process. These findings
revealed that 4-MET triggers chemopreventive properties and induced DNA repair
systems and therefore is a potential chemopreventive and therapeutic agent.
65
Introduction
Chalcones and coumarins are natural or synthetic compounds of widespread
occurrence in plants and belong to flavonoid class. These compounds have been
reported to exhibit a wide range of biological activities [1][2], including antioxidant, anti-
inflammatory, anti-ulcerative, antiviral, antifungal, antimutagenic and anti-tumoral
properties [3] [4] [5]. They are also effective chemopreventive agents [6]. These
biological features of coumarins and chalcones are related their radical scavenging
effect and interaction with several enzymes [1][7][8] [9].
Due to the considerable importance of these two compounds and their antioxidant
properties, a series of coumarin-chalcone hybrids have recently been synthesized [10]
[11] [12] [13][14][15]. The synthesis of hybrids is an important strategy to develop novel
compounds with improved features, in order to overcome drug resistance, display
antioxidant properties [16], and even enhance their biological potency in the treatment
of numerous diseases [9] [17] [18].
It is well known that several hybrids molecules can present varied biological
activities as well as modified selectivity profile and improved modes of action [6].
Recently, coumarin-chalcone hybrids have received significant attention due to their
anticancer, antimicrobial, antioxidant and anti-inflammatory properties [9]. Considering
the importance of these cumarin-chalcone hybrids for further therapeutic development,
we synthesized the new coumarin-chalcone hybrid 7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-
trimethoxyphenyl)acryloyl-2H-chromen-2-one (4-MET) and evaluated the genotoxic
and antigenotoxic activities of this compound.
Among the numerous tests for the detection of genotoxic and antigenotoxic agents,
the Ames mutagenicity test, the micronucleus test, and the comet assay are widely
used and the results of these assays are considered hallmarks of carcinogenicity.
These assays detect compounds which are capable of causing base-pair substitution
and frameshift mutations (Ames test), clastogenesis and aneugenesis, i.e. DNA
damage at the chromosomal level (micronucleus test), DNA strand breaks, alkali-labile
sites, intercalation and oxidation sites (comet assay) [19][20][21][22][23].
Therefore, the aim of this study was to evaluate the genotoxic and antigenotoxic
effects of 4-MET using the Ames mutagenicity test in vitro, the micronucleus test and
the comet assay, in mice. In order to assess both protective effects of 4-MET against
DNA damage induced by CPA and its DNA repair capacity, we performed in vivo co-,
66
pre- and post-treatment using the micronucleus test and comet assay in mice bone
marrow cells.
Materials and Methods
Chemicals
All commercially available reagents were purchased from Sigma-Aldrich (St.
Louis, MO, USA), unless stated otherwise. Thin-layer chromatography (TLC) was
conducted on silica gel 60 F254 plates (Merck KGaA, Darmstadt, Germany). 1H NMR
(Proton Nuclear Magnetic Resonance) and 13C NMR (Carbon-13 Nuclear Magnetic
Resonance) spectra were recorded on a Bruker Advance III (500 MHz) spectrometer
(Bruker Optik GmbH, Ettlingen, Germany). Infrared (IR) spectrum was performed on a
Bomem M102 spectrometer (Bomem Inc., Vanier, Quebec, Canada).
Synthesis of compounds
Preparation of 3-acetyl-7-methoxy-2H-chromen-2-one
The synthesis of 3-acetyl coumarin was carried out at the Institute of Chemistry,
Federal University of Goiás, Goiânia, GO, Brazil as described by Bhatnagar [24] with
few modifications. An aliquot of 0.2 mL diethylamine was added to a solution of 2-
hydroxy-4-methoxybenzaldehyde (2.0 mmol) and methyl acetoacetate (2.2 mmol) in
3.0 mL ethanol. After stirring for 6 h at room temperature, the solid was filtered, washed
with cold ethyl ether, and recrystallized in ethanol. ¹H NMR (CDCl3) δ: 8.48 (s; 1H),
7.55 (d; 1H; J = 8.7 Hz), 6.90, 6.82 (1H; J = 2.4 Hz) (dd; 1H; J = 8.7 Hz and 2.4 Hz),
3.92 (s; 3H), 2.70 (s; 3H). 13C NMR (CDCl3) δ: 195.7; 165.5; 159.9; 147.9; 131.7;
120.9; 114.1; 112.3; 100.6; 56.3; 30.7.
Synthesis of the coumarin-chalcone hybrid 4-MET
The coumarin-chalcone hybrid 4-MET was also synthesized at the Institute of
Chemistry through aldolic condensation of 3-acetyl-7-methoxy-2H-chromen-2-one
previously synthesized (as described above) and the appropriate aldehyde (Figure 1).
An aliquot of 0.2 mL piperidine was added to a solution of 3-acetyl-7-methoxy-2H-
chromen-2-one (2.0 mmol) and 3,4,5-trimethoxy benzaldehyde (2.0 mmol) in 3.0 mL
anhydrous ethanol. The mixture was stirred for 10 min and refluxed overnight. The
67
solid was filtered and recrystallized in ethanol, resulting in 4-MET. IR (KBr) max cm-1:
3040, 2980, 1737, and 1211. ¹H NMR (CDCl3) δ: 8.60 (s; 1H), 7.92 (d; 1H; J = 15.69
Hz), 7.79 (d; 1H; J = 15.69 Hz), 7.58 (d; 1H; J = 8.71), 6.93 (dd; 1H; J = 8.71 and 2.45
Hz), 6.91 (s; 2H), 6.86 (d; 1H; J = 2.45 Hz), 3.94 (s; 3H), 3.93 (s; 6H), and 3.91 (s; 3H).
The compound 4-MET was dissolved in 0.5% dimethyl sulfoxide (DMSO) immediately
before use in the treatments.
FIG 1. Synthesis of the coumarin-chalcone hybrid 7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-
trimethoxyphenyl)acryloyl)-2H-chromen-2-one (4-MET) (1) from 3-acetyl-7-methoxy-
2H-chromen-2-one (2). Reagents and conditions: (a) 3,4,5-trimethoxy benzaldehyde
and piperidine/anhydrous ethanol (reflux).
Doses of 4-MET used in in vitro and in vivo assays
In the Salmonella mutagenicity test (Ames test), the doses of 4-MET used were 1,
10, 50, 100, 500 µg/plate. These doses used in our study cover a range from 1 to 500
µg/plate in accordance to Mortelmans and Zeiger [33], which recommended a
minimum of five doses and a range of at least three logs.
The doses of 25 and 50 mg/kg of 4-MET used in the animal testing were based on
previous studies in mice that used coumarins and chalcones for biological activity
evaluations [2] [12] [17]. Dimethylsulfoxide (DMSO) was used to dissolve 4-MET and
it was used as negative control in all performed assays.
Ames test
Bacterial Strains
Salmonella typhimurium tester strains TA98 (hisD3052) (rfa) (uvrB) (AmpR) and TA100
(hisG46) (rfa) (uvrB) (AmpR), as described by Maron and Ames [22], were kindly
supplied by the Divisão de Toxicologia, Genotoxicidade e Microbiologia Ambiental
68
from the Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental do Estado de São
Paulo (CETESB, São Paulo, SP, Brazil).
Experimental procedure in vitro
The Salmonella mutagenicity assay proposed by Maron and Ames [22] was
followed. A 0.1-mL aliquot of bacterial suspension (1–2 × 109 cells/mL) of each strain
(TA98 and TA100) was incubated with 1, 10, 50, 100, and 500 µg/plate 4-MET diluted
in 20 μL DMSO (lot no. 0900221, Vetec, Duque de Caxias, RJ, Brazil) at 37ºC for 25
min. A 2.0-mL aliquot of top agar [0.6% Difco agar (lot no. 082613209, Kasvi, Curitiba,
PR, Brazil), 0.5% NaCl, 50 μM L-histidine, and 50 μΜ biotin, at 45ºC] was added to the
test tubes and poured onto Petri dishes containing minimal agar medium [1.5% agar
(lot no. 082613209, Kasvi, Curitiba, PR, Brazil), 2% glucose, and Vogel-Bonner
medium E (MgSO4H2O, lot no. 1109865; C6H8O.7H2O, lot no. 1100795; K2HPO2, lot
no. DCBB4100; Na2NH2PO4.H2O, lot no. 1208265, Vetec Química Fina Ltda., Duque
de Caxias, RJ, Brazil)]. Each assay was performed three times in triplicate. A negative
control (20 µL DMSO) and a positive control [0.5 μg 4-nitroquinoline 1-oxide (4-
NQO)/plate (lot no. SLBD6960V, Sigma-Aldrich, São Paulo, SP, Brazil) for TA98 and
3.0 μg sodium azide (lot no. 26628–22–8, Merck, Cotia, SP) for TA100] were included.
For the evaluation of antimutagenicity, the same doses of 4-MET used in the mutagenic
evaluation were incubated and combined with their respective positive controls (co-
treatment). After incubation at 37ºC for 48 h, His+ revertant colonies were counted.
Statistical analysis of the Ames test
The software Sigma Stat 3.5 was used in all analyses. The results were tabulated
and the experimental values were expressed as mean ± standard deviation (SD).
Mutagenicity data were evaluated using analysis of variance (ANOVA) and the Tukey’s
test for differences among the means. Mutagenicity induction was measured using the
mutagenic index (MI), calculated as the ratio between the number of colonies in the
test treatment and the number of colonies in the negative control treatment. The
inhibition percentage of mutagenicity (IP) induced by each mutagen was calculated in
relation to the number of revertant colonies obtained in the control group treated with
the mutagen alone, using the following formula [25]:
𝐼𝑃 (%) = [ 1 − ( 𝑇𝑃 − 𝑆𝑅
𝑃𝐶𝑃 − 𝑆𝑅 )] 𝑋 100
69
where:
TP: number of His+ revertants on test plates (plates incubated with mutagen and test
compound)
SR: spontaneous His+ revertants on negative control plates (tester strains incubated
in the absence of test compound and mutagen)
PCP: number of His+ revertants on positive control plates (plates incubated with the
mutagen alone)
Animal tests: micronucleus test and comet assay
This study was approved by the Animal Research Ethics Committee of the
Federal University of Goiás (CEUA/UFG no. 014/14) and followed all the rules of
animal management and experimentation from the Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal [26] and the Toxicology Society [27]. Healthy, young male
adult (8–12 weeks) outbred mice (Mus musculus, Swiss Webster), weighing 25–30g,
obtained from the animal facilities of the same university, were brought to the
laboratory five days before the experiments and housed in plastic cages (40 cm × 30
cm × 16 cm), at 24 ± 2ºC and 55 ± 10% humidity, with a light-dark natural cycle of 12
h. Standard food pellets (appropriate commercial rodent diet Labina, Ecibra Ltda.,
Santo Amaro, SP, Brazil) and water were provided ad libitum.
Experimental procedure in vivo
The animals were randomized into control and experimental groups, divided into
ten groups of five animals each and weighed before the administration of the
chemicals. The animals in Group 1 received 0.1 mL/10 g body weight (BW) DMSO
(negative control) administered orally, while the animals in Group 2 received 50 mg/kg
BW cyclophosphamide (CPA, lot no. 5L091, Baxter Hospitalar Ltda., São Paulo, SP,
Brazil) (positive control) in a single intraperitoneal (ip) administration.
Genotoxicity and cytotoxicity. The animals in Group 3 received a single dose of
50 mg/kg BW 4-MET (24 h), whereas the animals in Group 4 received 50 mg/kg BW
4-MET for five consecutive days (120 h).
Co-treatment. The animals in Groups 5 and 6 were respectively treated with 25
and 50 mg/kg BW 4-MET and concomitantly received a single dose of 50 mg/kg BW
CPA ip each.
70
Pre-treatment. The animals in Groups 7 and 8 received 25 and 50 mg/kg BW 4-
MET, respectively, for five consecutive days. On the last day, the animals in both
groups received a single dose of 50 mg/kg BW CPA ip 2 h after the administration of
4-MET.
Post-treatment. The animals in Groups 9 and 10 were treated with a single dose
of 50 mg/kg CPA. After 6 h and 12 h, the animals in Group 9 received 25 mg/kg 4-
MET, totalizing a final dose of 50 mg/kg, whereas the animals in Group 10 received 50
mg/kg 4-MET, totalizing a final dose of 100 mg/kg.
All animals were euthanized by cervical dislocation 24 h after the last
administration of all kind of treatments (control and treated groups). The bone marrow
cells from both femurs of the animals were flushed using fetal calf serum (lot no.
61005001, Laborclin, Pinhais, PR, Brazil) and, after centrifugation (300× g, 5 min),
were used for the preparation of micronucleus test slides and the comet assay.
Micronucleus test
The micronucleus test was performed according to von Ledebur and Schmid
[23] . Bone marrow cells prepared as described above were smeared on glass slides,
coded for blind analysis, air-dried, and fixed with absolute methanol (CH4O, lot no.
1207433COD: 000102.06, Vetec, Duque de Caxias, RJ, Brazil) at room temperature
for 5 min. The smears were stained with Giemsa (lot no. 21101108C, Newprov,
Pinhais, PR, Brazil), dibasic sodium phosphate (lot no. 982162, Vetec, Duque de
Caxias, RJ, Brazil), and monobasic sodium phosphate (lot no. 983831, Vetec, Duque
de Caxias, RJ, Brazil. In the micronucleus test we analyzed 2,000 polychromatic
erythrocytes (PCE) per animal. Five animals were analyzed for each dose, thus a total
of 10,000 PCE were analyzed per dose to determine the frequency of micronucleated
polychromatic erythrocytes (MNPCE) using light microscopy (Olympus BH-2 10 × 100,
Tokyo, Japan). Genotoxicity and antigenotoxicity were assessed by the frequency of
MNPCE, whereas cytotoxicity and anticytotoxicity were evaluated by the PCE and
normochromatic erythrocytes (NCE) ratio (PCE/NCE).
Comet assay
The comet assay was performed using the alkaline method [28]. Slides previously
coated with normal melting point agarose (1.5%) received a mixture that contains 15
71
μl of bone marrow cells and 120 μl of low melting point agarose (0.75%) at 37ºC. The
mixture was spread on the slides with coverslips and taken to a cold chamber. After
gelation, the coverslips were carefully removed. The slides were immersed in lysis
solution protected from light [1% triton X-100 (lot no. DCBB3232, Vetec Química Fina
Ltda., Duque de Caxias, RJ, Brazil), 10% DMSO, 2.5 M NaCl (lot no. 73516, Dinâmica
Química Contemporânea Ltda., Diadema, SP, Brazil), 100 mM EDTA (lot no.
2965C504, Invitrogen by Life Technologies, Itapevi, SP, Brazil), and 10 mM Tris (lot
no. 0805008, Vetec Química Fina Ltda., Duque de Caxias, RJ, Brazil), pH 10.0] at 4ºC
for 12–24 h. Subsequently, the slides were incubated with freshly made alkaline
solution [300 mM NaOH (lot no. 19804, Neon Comercial Ltda., São Paulo, SP, Brazil),
1 mM EDTA, pH > 13] at 4ºC for 20 min for DNA unwinding. The electrophoresis was
performed in the same buffer at 300 mA and 25 V/cm at 4ºC for 30 min. After the
electrophoresis, the slides were placed in a staining tray, covered with a neutralizing
buffer (0.4 M Tris-HCl, pH 7.5), stained with ethidium bromide, and analyzed. For each
treated group 500 nucleoids were analyzed,100 nucleoids per animal, using an
epifluorescence Leica DM 2000 Citogen microscope (Leica Microsystems, Wetzlar,
Germany), equipped with a Jenoptik ProgRes® MF camera (Optronics, Goleta, CA,
USA), driven by Lucia CytogeneticsTM version 2.5 software (Laboratory Imaging Ltd,
Prague, Czech Republic), 200 x magnification.
For the assessment of the genomic damage using the comet assay, the
OpenCometTM software, version 1.3 (Cometbio-OpenComet, Singapore) was
employed. Using a novel and robust method for finding comets based on geometric
shape attributes, this open-source software tool provides automated analysis of comet
assay images segmenting the comet heads through image intensity profile analysis.
As a result of automation, it is more accurate, less prone to human bias, and faster
than manual analysis [29]. Since percentage of DNA in the tail (%DNA in tail) is
commonly used in several studies for quantification of DNA damage [30–32], this
parameter was also chosen in our study.
Statistical analysis for the micronucleus test and comet assay
The genotoxic and antigenotoxic activities in the micronucleus test and comet assay
were evaluated using one-way ANOVA followed by the Tukey’s test. The cytotoxicity
and anticytotoxicity were analyzed by chi-square (𝜒2) test. For genotoxicity and
cytotoxicity evaluation, groups 3 and 4 were compared to the negative control (group
72
1). In the evaluation of antigenotoxicity, groups 5 and 6 (co-treatment), groups 7 and
8 (pre-treatment), groups 9 and 10 (post-treatment) were compared with the positive
control (group 2) in order to evaluate 4-MET effects against damage induced by CPA.
The results were considered statistically significant when p < 0.05. In the micronucleus
test the percentage reduction in CPA-induced genotoxicity was calculated using the
following formula [18]:
% Reduction = (A − B
A − C) X 100
where:
A: MNPCE mean in CPA treatment (positive control)
B: MNPCE mean in antigenotoxic treatment (4-MET + CPA)
C: MNPCE mean in negative control
Results
Ames test
The results of the mutagenic evaluation are presented in Table 1. All results were
obtained from three independent experiments carried out in triplicate. The data
obtained for the positive and negative control are in accordance with Maron and Ames
[22] and Mortelmans and Zeiger [33].
In the evaluation of mutagenicity, the doses of 4-MET tested (1, 10, 50, 100, and
500 µg/plate) did not cause an increase in the number of His+ revertant colonies in
both tester strains, TA98 or TA100, since no significant difference was observed
between the negative control and any doses of the coumarin-chalcone hybrid (p >
0.05). Moreover, none of the treatments with 4-MET reached MI ≥ 2 or dose-response
effects, with the highest induction in the strain TA100, which reached MI = 1.07 at dose
of 100 mg/plate. Thus, based on the results of the Ames test, 4-MET did not exhibit
mutagenic effect.
The results of the antimutagenic assessment showed that all tested doses of 4-MET
caused a significant decrease in the number of His+ revertant colonies in tester strains
TA98 and TA100 compared to the respective positive controls (p < 0.05). At doses of
1, 10, 50, 100, and 500 µg/plate, these treatments resulted in IP of 26.00%, 35.50%,
63.00%, 72.63%, and 77.78% for strain TA98, and 17.64%, 17.05%, 34.12%, 58.24%,
73
and 61.58% for strain TA100, respectively. Therefore, at all tested doses, 4-MET was
able to significantly reduce the mutagenic effects of sodium azide and 4-NQO.
74
TABLE 1. Means ± standard deviation (SD) of histidine revertant colonies (obtained from three independent experiments carried
out in triplicate), mutagenic index (MI), and inhibition percentage of mutagenicity (IP) for two tester strains of Salmonella
typhimurium, TA98 and TA100, after treatment with different doses of the coumarin-chalcone hybrid 7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-
trimethoxyphenyl)acryloyl)-2H-chromen-2-one (4-MET).
Treatment Mutagenicity Antimutagenicity
TA 98 TA 100 TA 98 TA 100
Mean ± SD MI Mean ± SD MI Mean ± SD IP (%) Mean ± SD IP (%)
Negative control1 21.10 ± 0.95 1.00 128.00 ± 6.00 1.00 24.67 ± 2.08 _ 178.00 ± 37.00 _
Positive control2 637.55 ± 41.66 30.21 2259.00 ±81.00 15.53 524.86 ± 21.27 _ 2269.33 ±205.89 _
4-MET 1 µg/plate 21.55 ± 3.97A 1.02 124.00 ± 22.00A 0.96 394.55 ± 27.60D 26.00 1900.46 ± 25.25D 17.64
4-MET 10 µg/plate 19.77 ± 1.70A 0.93 124.00 ± 16.00A 0.96 347.47 ± 22.36D 35.50 1912.96 ± 31.47D 17.05
4-MET 50 µg/plate 18.55 ± 0.19A 0.87 137.00 ± 3.00A 1.06 211.22 ± 16.32D 63.00 1555.82 ± 45.66D 34.12
4-MET 100 µg/plate 19.33 ± 0.33A 0.91 138.00 ± 14.00A 1.07 161.54 ± 8.08D 72.63 1051.45 ± 8.42D 58.24
4-MET 500 µg/plate 13.99 ± 1.45A 0.66 119.00 ± 2.00A 0.92 135.77 ± 12.40D 77.78 981.67 ± 22.55D 61.58
1 Negative control: 20 µL dimethylsulfoxide (DMSO).
2 Positive control: 0.5 μg 4-nitroquinoline-1-oxide (4NQO) per plate for TA98 and 3.0 μg of sodium azide for TA100.
All values are means ± SD of three independent experiments.
Mutagenicity: A No significant difference compared to the negative control (p > 0.05). B Significant difference compared to the
negative control (p < 0.05). Antimutagenicity: C No significant difference compared to the positive control (p > 0.05). D Significant
difference compared to the positive control (p < 0.05).
Analyzed using one-way ANOVA and Tukey’s test.
75
Micronucleus test
No clinical signs of toxicity were observed in any treated groups and all animals
survived the treatment. Table 2 shows the frequencies of MNPCE and PCE/NCE ratio
in groups co-, pre-, or post-treated with 4-MET and CPA.
In this study, the negative control group (Group 1) exhibited low MNPCE values, as
expected, and the positive control group (Group 2) had a significant increase in
MNPCE compared to the negative control group (p < 0.05), confirming the sensitivity
of the test.
Genotoxicity: group 3, which received a single dose of 50 mg/kg 4-MET (24 h),
and group 4, which received 50 mg/kg 4-MET for five consecutive days (120 h), were
not able to significantly increase the MNPCE frequencies compared to the negative
control (p > 0.05). These results demonstrated the absence of genotoxic effects of 4-
MET in both treated groups.
Cytotoxicity: in group 3, the PCE/NCE ratio was 1.22, while in the negative control
group it was 1.1. According to this result, 4-MET exhibited absence of cytotoxic effect
at this dose (p>0.05). On the other hand, in group 4, the PCE/NCE ratio was 0.87,
while in the negative control group it was 1.1. Thus, the treatment with 50 mg/kg 4-
MET for 120 h (Group 4) caused a significant decrease in PCE/NCE ratio compared to
the negative control group (p<0.05), evidencing a moderate cytotoxic effect in this
dose.
Co-treatment: groups 5 and 6, respectively treated with 25 and 50 mg/kg 4-MET
and concomitantly treated with a single dose of 50 mg/kg CPA, presented a significant
decrease in MNPCE frequencies compared to the positive control group (p < 0.05),
reducing CPA-induced genotoxicity to 41% and 81%, respectively. These results
indicated the antigenotoxic effect of 4-MET.
Regarding to the anticytotoxicity assessment, in groups 5 and 6 the PCE/NCE ratios
were 0.69 and 1.07, respectively, while in the positive control group it was 0.71. The
dose of 4-MET used in group 5 did not cause a significant increase in the PCE/NCE
ratio compared to the positive control group (p > 0.05), therefore showing absence of
anticytotoxic effects. The dose of 4-MET employed in group 6 caused a significant
increase in PCE/NCE ratio compared to the positive control group (p < 0.05), showing
an anticytotoxic effect, demonstrating a protective action against the cytotoxicity
induced by CPA.
76
Pre-treatment: groups 7 and 8 were able to significantly reduce (p < 0.05) the
genotoxic activity of CPA to 64% and 70%, respectively. Thus, both doses of 4-MET
presented antigenotoxic effects.
In the assessment of 4-MET anticytotoxicity, the PCE/NCE ratios in groups 7 and 8
were 0.69 and 0.74, respectively, whereas in the positive control group it was 0.71.
Both doses did not cause a significant increase in PCE/NCE ratio compared to the
positive control group (p > 0.05), demonstrating the absence of anticytotoxic effect.
Post-treatment: Animals treated with 4-MET in the groups 9 and 10 significantly
reduced the MNPCE frequencies compared to the positive control group (p < 0.05).
These findings showed that at both doses 4-MET reduced the genotoxic activity of
CPA, to 79% and 83%, respectively, exhibiting an antigenotoxic effect in post-
treatment.
In relation to 4-MET anticytotoxicity, in Groups 9 and 10 the PCE/NCE ratios were
0.64 and 1.09, respectively, whereas in the positive control group it was 0.71. Thus,
the treatment with 25 mg/kg of 4-MET (Group 9) did not cause a significant increase
in PCE/NCE ratio compared to the positive control group (p > 0.05), showing the
absence of anticytotoxic effect. On the other hand, the treatment with 50 mg/kg 4-MET
(Group 10) caused a significant increase in PCE/NCE ratio compared to the positive
control group (p < 0.05), evidencing an anticytotoxic effect and demonstrating a
protective action against the cytotoxicity induced by CPA.
77
TABLE 2. Effects of treatments with different doses of the coumarin-chalcone hybrid
7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl)-2H-chromen-2-one (4-MET) on
the frequency of micronucleated polychromatic erythrocytes (MNPCE) and
polychromatic/normochromatic erythrocytes ratio (PCE/NCE) in bone marrow cells of
mice.
Group Treatment MNPCE/2000 PCE
(mean ± SD)
MNPCE Reduction
(%)
PCE/NCE
(mean ± SD)
1 Negative control (DMSO)1 4.2 ± 0.45 1.1 ± 0.05
2 Positive control (CPA)2 27.2 ± 1.3 0.71 ± 0.02
Genotoxicity and Cytotoxicity
3 4-MET 50 mg/kg BW (24 h) 5.2 ± 1.1 1.22 ± 0.06
4 4-MET 50 mg/kg BW (120 h) 5.5 ± 1.3 0.87 ± 0.03§
Co-treatment
5 4-MET 25 mg/kg BW (24 h) + CPA 17.8 ± 1.13* 41 0.69 ± 0.12
6 4-MET 50 mg/kg BW (24 h) + CPA 8.6 ± 1.1* 81 1.07 ± 0.08*
Pre-treatment
7 4-MET 25 mg/kg BW (120 h) + CPA 12.4 ± 2.2* 64 0.69 ± 0.06
8 4-MET 50 mg/kg BW (120 h) + CPA 11.6 ± 1.1* 70 0.74 ± 0.02
Post-treatment
9 CPA + 4-MET 25 mg/kg BW 9.2 ± 1.6* 79 0.64 ± 0.11
10 CPA + 4-MET 50 mg/kg BW 8.2 ± 4.9* 83 1.09 ± 0.02*
1 Negative control: Dimethylsulfoxide (DMSO) administered orally.
2 Positive control: 50 mg/kg BW cyclophosphamide (CPA) diluted in saline and
administered ip.
Groups 3 and 4, treated only with 4-MET, were compared to the negative control group.
Groups 5, 6, 7, 8, 9, and 10, co-, pre-, or post-treated with CPA, were compared to the
positive control group.
§ Significant compared to the negative control (p < 0.05).
*Significant compared to the positive control (p < 0.05).
Analysis using one-way ANOVA, Tukey’s test, and chi-square test.
78
Comet assay
The results of the comet assay, which was applied to evaluate the primary level
of DNA damage in bone marrow cells of mice treated with 4-MET are shown in Figure
2. 4-MET did not significantly induce DNA damage at dose 50 mg/kg (Groups 3 and 4)
compared to the negative control group (p > 0.05), demonstrating absence of genotoxic
effect at 24 h and 120 h.
FIG 2. Assessment of the genotoxic activity of the coumarin-chalcone hybrid 7-
methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl)-2H-chromen-2-one (4-MET) in
mouse bone marrow cells using the comet assay estimated by the parameter
percentage of DNA in tail. DMSO, dimethylsulfoxide (negative control); CPA,
cyclophosphamide (50 mg/kg) (positive control). ANOVA and the Tukey’s test.
Figure 3 shows the percentage of DNA damage in mice bone marrow cells exposed
to 4-MET and CPA. The doses of 25 and 50 mg/kg, in co-, pre- and post-treatments,
showed a significant reduction of DNA damage compared to the group treated with
CPA alone (p < 0.05). The highest reductions of DNA damage were 41% (co-
treatment), 42% (pre-treatment) and 50% (post-treatment). Thus, 4-MET exhibited
antigenotoxic effects in all treatment.
79
FIG 3. Assessment of the antigenotoxic activity of the coumarin-chalcone hybrid 7-
methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl)-2H-chromen-2-one (4-MET) in
mouse bone marrow cells using the comet assay estimated by the parameter
percentage of DNA in the tail. DMSO, dimethylsulfoxide (negative control); CPA,
cyclophosphamide (50 mg/kg BW) (positive control). ANOVA and the Tukey’s test. *
Difference in comparison with the positive control (p < 0.05).
Discussion
Based on the features of coumarins and chalcones, we designed and synthesized
the coumarin-chalcone hybrid 4-MET. In order to evaluate the genotoxic, cytotoxic,
and protective effects of this compound, we used in vitro and in vivo assays. The
results of the mutagenic assessment of 4-MET revealed that it did not exhibit
mutagenic effects on S. typhimurium tester strains TA98 and TA100 at any doses
tested. Similarly, previous studies reported the absence of mutagenic effects of
coumarins and/or chalcones on S. typhimurium strains TA98, TA1535, TA1537, and
TA1538 using the Ames test [34] [35][36] [37].
In the antimutagenicity evaluation using the Ames test, 4-MET showed significant
antimutagenic activity at all tested doses against both mutagens, 4-NQO and sodium
azide. Sodium azide and 4-NQO induce intracellular oxidative stress, generating
reactive oxygen species (ROS) and metabolic products that can interact with cellular
enzymes and DNA, causing point mutations [38] [39]. This significant antimutagenic
effect of 4-MET could be attributed to an antioxidant action already described in many
chalcone derivatives, which present α,β-unsaturated ketones [17][40]. This
unsaturation creates a nucleophilic center at β-carbon that may have interacted with
4NQO and sodium azide metabolites, reducing their mutagenic effects and oxidative
80
stress on DNA [12][4]. Therefore, 4-MET was able to protect DNA against frameshift
and base pair substitution mutations.
The use of the in vitro Ames mutagenicity test in combination with the in vivo
micronucleus test has been recommended in several international guidelines to
evaluate the genotoxic/antigenotoxic activity of substances [40]. Furthermore, a variety
of methods have been used to assess DNA damage, including the comet assay [41],
and the micronucleus test [42].
In the present study, 4-MET did not present genotoxic and cytotoxic effects (24 h)
by micronucleus test, and did not promote a significant increase in DNA damage by
comet assay. Similar results were found for other chalcones and coumarin, which did
not display cytotoxic and genotoxic effects by in vivo micronucleus test in mice, or in
vitro chromosome aberration assay [43] [44]. In the other hand, 4-MET in pre-treatment
caused a decrease in PCE/NCE ratio, evidencing a moderate cytotoxic effect. This
cytotoxicity could be due to a cumulative effect that 4-MET provoked by a long-term
treatment (120 h).
In the antigenotoxicity evaluation of 4-MET by micronucleus test and comet assay,
this compound caused significant reduction in MNPCE frequencies and DNA breaks
in all treatments. This antigenotoxic effect of 4-MET may suggest a relevant protective
action of this compound against the harmful effects induced by CPA. The alkylating
agent CPA is converted by cytochrome P450 enzymes to multiple active metabolites
that cause crosslink in DNA. Moreover, CPA induces the generation of oxidative stress
mediated by the disruption of the redox balance, resulting in increased ROS and lipid
peroxidation [45].
The obtained results in comet assay and micronucleus test indicate that this
compound was able to act in DNA damage prevention (co- and pre-treatment). The
significant antigenotoxic and anticytotoxic activities of 4-MET may have been resulted
from an antioxidant effect of this compound, along with the interaction with enzymes,
such as gutatione [1][7][9][46]. Previous studies related the antioxidant properties of
coumarins with the aromatic ring (ring B) presented in their structures. This ring
induces a resonance in the structure and creates an electrostatic potential, which might
lead this molecule to interact with ROS and enzymes [47][48]. Thus, this protective
effect of 4-MET might be due to a ROS scavenging activity and its interaction with
detoxifying enzymes, that decreased the CPA-damage action.
81
The post-treatment showed a decreasing in the number of DNA breaks and
reduction of MNPCE, suggesting the induction of DNA-repair systems. The reduction
in DNA damage observed in comet assay indicates that 4-MET might have avoided
the formation of chromosome mutations (micronuclei), confirmed by the reduction of
MNPCE induced by CPA observed in the micronucleus test. These findings are in
accordance with other reports which showed that coumarins can enhance DNA repair,
resulting in potential chemopreventive and antimutagenic effects [18][42].
Computational modelling studies predict that the two oxygen atoms in the lactone ring
(ring B) of coumarins may interact via hydrogen bonding with several amino acid
residues in different classes of enzymes and receptors [47][48]. The significant
antigenotoxic and anticytotoxic effects of 4-MET in the post-treatment could indicate a
possible interaction of this molecule with DNA-repair enzymes, which made 4-MET
capable to recover the DNA integrity without decreasing the cell viability. However,
further studies are required to better understand the mechanism of action of 4-MET in
the DNA repair process.
Therefore, this study showed that the new coumarin-chalcone hybrid 4-MET
demonstrated a protective effect against cell damage and mutations, and also a
possible role in DNA repair system. Also, this molecule could be used for future
development of chemopreventive and anticancer agents.
Conclusion
The results of the present study showed that the new hybrid molecule 4-MET,
composed of coumarin and chalcone, exhibited antimutagenic, antigenotoxic, and
anticytotoxic activities. Although 4-MET did not exhibit mutagenic/genotoxic effect at
the tested doses, this compound displayed relevant antimutagenic and antigenotoxic
actions in co-, pre-, and post-treatment and presented a moderate cytotoxic effect in
mouse bone marrow cells. This compound action is possible related to damage
prevention or to DNA-repair induction. Our findings indicate that 4-MET is a probable
candidate for the development of chemopreventive therapies. Further investigation
using different long-term tests in animals and research on molecular biology are
necessary to clarify the beneficial properties of this compound.
82
Acknowledgments
This study was financially supported by the Brazilian agency Fundação de Amparo à
Pesquisa do Estado de Goiás (FAPEG) under the auspices of the Federal University
of Goiás (UFG).
Author Contributions
Conceived and designed the experiments: CRV GRO LCC. Performed the
experiments: CRV DCSL MMA. Analyzed the data: CRV JHV LCC. Contributed
reagents/materials/analysis tools CRV GRO LCC. Wrote the paper: CRV DCSL JHV
MMA GRO LCC.
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88
8.2. Manuscrito a ser submetido à revista científica.
Modulating effect of a novel coumarin–chalcone hybrid [7-methoxy-3-(E)-3-
(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl-2H-cromen-2-one] against mitomycin-induced
genotoxicity in somatic cells of Drosophila melanogaster
Camila Regina do Vale1, Débora Cristina da Silva Lima1, Aroldo Vieira de Moraes
Filho1, Murilo Machado dos Anjos2, Guilherme Roberto de Oliveira2, Salvador de
Carvalho1 and Lee Chen-Chen1*
1Departamento de Genética, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal
de Goiás, Goiânia, GO, Brazil, 2Instituto de Química, Universidade Federal de Goiás,
Goiânia, GO, Brazil
*To whom correspondence should be addressed. Tel.: +55 62 3521-1483; Email:
Abstract
Coumarins comprise a large class of molecules derived from phenolic compounds
found mainly in plants, and exhibit multiple biological activities such as antioxidant,
anti-inflammatory, and anti-tumoral properties. Chalcones are one of the major classes
of natural compounds widespread in fruits and vegetables and display many biological
properties, including antibacterial, antiviral, and anti-inflammatory activities. Based on
the biological activities of these two types of natural compounds, we synthesized a new
coumarin–chalcone hybrid [7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl-2H-
cromen-2-one] (4-MET) aiming to evaluate its recombinogenic/anti-recombinogenic
and mutagenic/antimutagenic activities using the somatic mutation and recombination
test (SMART) in Drosophila melanogaster. To assess the mutagenic and
recombinogenic activities, 3-day-old larvae derived from standard cross (ST) and high
bioactivation cross (HB) were treated with different concentrations of 4-MET for 48 h.
The anti-recombinogenic and antimutagenic activities were assessed using larvae
derived from both crosses co-treated with the same concentrations of 4-MET and
mitomycin C. SMART revealed no mutagenic or recombinogenic effects, but
antimutagenic and anti-recombinogenic activities were observed in somatic cells of D.
89
melanogaster from both crosses. We suggest that the antimutagenic and anti-
recombinogenic activities observed in the present study may have been a result of the
antioxidant activity of 4-MET.
Introduction
Coumarins, also known as benzopyrones, comprise a large class of cinnamic
acids derived from phenolic compounds. They are found in fungi, bacteria, and plants,
particularly in edible plants from different families. Exposure to coumarins in human
diet is quite significant, since they have a wide distribution in plant based foods and
beverages (1), mainly vegetables, fruits, seeds, nuts, coffee, tea, and wine (2).
Coumarins have attracted intense interest in recent years, and they have
already been proven to display a large variety of biological activities, including
prevention of cancer and anti-HIV effect (3–5). These compounds are known to exert
antitumoral effects (2,4,6), and they can cause significant changes in cell growth and
differentiation (7). Coumarins exhibit various other properties, including antithrombotic,
antiviral, immunomodulatory (8), anti-inflammatory (1), and antioxidant activities (5).
Chalcones constitute another important class of natural products and belong to
the flavonoid family (9–11). Chemically, they can be considered open-chain flavonoids
with two aromatic rings joined by a three-carbon α,β-unsaturated carbonyl system.
Chalcones are widely distributed in fruits, vegetables, spices, tea, and soybean (12).
Since they are abundant in plants and easily synthesized, these compounds have
attracted great interest due to possible therapeutic uses (9).
Chalcones have been reported to possess many beneficial biological activities,
including anti-inflammatory, antibacterial, antioxidant, antimalarial, antiviral, anti-
diabetic, anti-ulcer, and anticancer properties (11,13). They are also effective as cell
proliferating inhibitors and chemopreventive agents (9).
Coumarins and chalcones exhibit biological properties related to radical
scavenging effect, due to their antioxidant activities, along with other possible
mechanisms such as anti-inflammatory effects and interaction with several enzymes
(4,11,14). Coumarins can be potent reactive oxygen species (ROS) scavengers and
metal chelating agents (15), whereas chalcones show antioxidant activity against both
hydroxyl and peroxyl radicals (11).
90
A series of coumarin–chalcone hybrids have recently been designed and
synthesized (1,11,13,15–19). The development of hybrid molecules through the
combination of different pharmacophores in order to design new bioactive agents may
lead to the synthesis of compounds with interesting biological profiles (9,10,14). These
combined pharmacophores probably offer some advantages such as overcoming drug
resistance (20), improving biological potency of therapeutic drugs, and treating
numerous diseases (10,14).
Despite the various biological activities of coumarins and/or chalcones, their
widespread use, and the numerous derivatives of these compounds already
synthesized for potential use in humans, the results of researches about their
genotoxicity or protective effects are partially conflicting (4). Moreover, studies on their
possible mutagenic/antimutagenic effects are lacking (21).
Due to the biological activities and wide distribution of coumarins and chalcones
in plant based foods and beverages used in the human diet, and in view of the
considerable importance of both compounds and their antioxidant properties, we
synthesized the new coumarin–chalcone hybrid 7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-
trimethoxyphenyl)acryloyl-2H-chromen-2-one (4-MET) and assessed its effect on DNA
damage. The aim of the present study was to evaluate the recombinogenic/anti-
recombinogenic and mutagenic/antimutagenic activities using the somatic mutation
and recombination test (SMART) in Drosophila melanogaster (22).
SMART uses wings of D. melanogaster and is a flexible and sensitive short-
term test for the detection of genotoxicity of inductor agents (23–25). This test is based
on loss of heterozygosity (LOH), which occurs through several mechanisms such as
chromosome loss and deletion, half-translocation, mitotic recombination, mutation,
and non-disjunction. Genetic alterations in somatic cells of wing imaginal discs result
in mutant clones in wing blades (26). SMART exploits the increased rate of mutant
spots in the presence of a genotoxic compound to detect genotoxicity (27), this assay
also identifies antigenotoxicity of several compounds (28), and allows the simultaneous
detection and quantification of mutations and mitotic recombinations, the main factors
related to carcinogenesis (28,29).
91
Materials and methods
Synthesis of compounds
All commercially available reagents were purchased from Sigma-Aldrich (St.
Louis, MO, USA), unless stated otherwise. Thin-layer chromatography (TLC) was
conducted on silica gel 60 F254 plates (Merck KGaA, Darmstadt, Germany). 1H NMR
and 13C NMR spectra were recorded on a Bruker Advance III (500 MHz) spectrometer
(Bruker Optik GmbH, Ettlingen, Germany). Infrared (IR) spectrum was performed on a
Bomem M102 spectrometer (Bomem Inc., Vanier, Quebec, Canada).
Preparation of 3-acetyl-7-methoxy-2H-chromen-2-one
The synthesis of 3-acetyl coumarin was carried out at the Institute of Chemistry,
Universidade Federal de Goiás, Goiânia, GO, Brazil, following Bhatnagar et al. (30)
with slight modifications. An aliquot of 0.2 mL diethylamine was added to a 2-hydroxy-
4-methoxybenzaldehyde (2.0 mmol) and methyl acetoacetate (2.2 mmol) solution in
3.0 mL ethanol. After stirring the mixture for 6 h at room temperature, the solid was
filtered, washed with cold ethyl ether, and recrystallized in ethanol. ¹H NMR
(CDCl3) δ: 8.48 (s; 1H), 7.55 (d; 1H; J = 8.7 Hz), 6.90, 6.82 (1H; J = 2.4 Hz) (dd; 1H; J
= 8.7 Hz and 2.4 Hz), 3.92 (s; 3H), 2.70 (s; 3H). 13C NMR (CDCl3) δ: 195.7; 165.5;
159.9; 147.9; 131.7; 120.9; 114.1; 112.3; 100.6; 56.3; 30.7.
Synthesis of the coumarin–chalcone hybrid 4-MET
The coumarin–chalcone hybrid 4-MET (1) was synthesized at the same
laboratory through aldolic condensation of 3-acetyl-7-methoxy-2H-chromen-2-one (2)
previously synthesized (as described above) and the appropriate aldehyde (Figure 1).
An aliquot of 0.2 mL piperidine was added to a solution of 3-acetyl-7-methoxy-2H-
chromen-2-one (2.0 mmol) and 3,4,5-trimethoxy benzaldehyde (2.0 mmol) in 3.0 mL
anhydrous ethanol. The mixture was stirred for 10 min and refluxed overnight. The
solid was filtered and recrystallized in ethanol, resulting in 4-MET. IR (KBr) max cm-1:
3040, 2980, 1737, and 1211. ¹H NMR (CDCl3) δ: 8.60 (s; 1H), 7.92 (d; 1H; J = 15.69
Hz), 7.79 (d; 1H; J = 15.69 Hz), 7.58 (d; 1H; J = 8.71), 6.93 (dd; 1H; J = 8.71 and 2.45
Hz), 6.91 (s; 2H), 6.86 (d; 1H; J = 2.45 Hz), 3.94 (s; 3H), 3.93 (s; 6H), and 3.91 (s; 3H).
92
The compound 4-MET was suspended in 0.5% dimethyl sulfoxide (DMSO)
immediately before use in the treatments.
FIG. 1. Synthesis of the coumarin-chalcone hybrid 7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-
trimethoxyphenyl)acryloyl)-2H-chromen-2-one (4-MET) (1) from 3-acetyl-7-methoxy-
2H-chromen-2-one (2). Reagents and conditions: (a) 3,4,5-trimethoxy benzaldehyde
and piperidine/anhydrous ethanol (reflux).
Somatic Mutation and Recombination Test (SMART) in Drosophila melanogaster
In the SMART wing assay, three strains of D. melanogaster were used: 1.
multiple wing hairs (mwh): y;mwh j (mwh, 3-0.3); 2. flare3 (flr3, 3-38.8) [flr3/In(3LR)TM3,
ri pp sep I(3)89Aabx34e and BdS]; 3. ORR/ORR; flr3/In(3LR)TM3, ri pp sep I(3)89Aabx34e
and BdS. To produce the standard cross (ST), stocks of flare3 virgin females were
crossed with stocks of mwh males (31,32). To produce the high bioactivation cross
(HB), stocks of ORR;flare3 virgin females were crossed with stocks of mwh males (23).
HB has high sensitivity to promutagens and procarcinogens since the ORR;flr3/
TM3,BdS strain carries chromosomes 1 and 2 from a DDT-resistant Oregon R (R) line,
with an increased level of cytochrome P-450 (33).
Both crosses produce two types of progeny phenotypically distinguished by the BdS
marker, i.e. marker-heterozygous (MH) flies (mwh +/+ flr3), with phenotypically wild-
type wings, and balancer-heterozygous (BH) flies (mwh/TM3, BdS), with phenotypically
serrate wings. For a detailed analysis of genetic markers, consult Lindsley and Zimm
(34).
Experimental procedure
The experiments were carried out following Graf et al. (22). Eggs from both
crosses were collected over an 8-hour period and kept in culture bottles containing a
solid agar base (3%, w/v) covered with a layer of live Saccharomyces cerevisiae
93
supplemented with sucrose. Third instar (72 ± 4 h) larvae were removed from the
culture bottles, washed in tap water, and collected with a fine mesh stainless steel
sieve.
Batches of equal numbers of larvae (100 larvae/concentration) were collected
from both crosses and transferred to glass vials containing 0.9 g mashed potato flakes
hydrated with 4-MET. To verify the toxic potential of the test coumarin–chalcone hybrid,
we employed different concentrations of 4-MET (1, 5, 20, 50, 100, 200, and 400 µg/mL)
and generated larval survival curves. To assess mutagenicity and antimutagenicity of
the test compound, four concentrations of 4-MET (5, 50, 100, and 400 µ/mL) were
administered to the larvae, and for the latter, the larvae were simultaneously treated
with MMC (0.05 mM). Treatments with DMSO (0.5%) and MMC (0.05 mM) were
included in the experiments as negative and positive controls, respectively. Larvae
were reared on the medium for the remainder of their larval life (~48 h) until hatching.
The experiments were carried out at 25°C and 60% relative humidity.
After hatching, flies were killed and stored in 70% ethanol until used for analysis.
Wings of MH flies were removed, mounted on glass slides with Faure’s solution (30 g
gum arabic, 20 mL glycerol, 50 g chloral hydrate, and 50 mL water), and examined for
spots using a compound microscope at 400X magnification. Wings of BH flies were
mounted and analyzed following the same procedure described above whenever a
positive response was obtained for MH progeny. During the analysis, the positions of
the spots were recorded per wing section (22).
Single spots result from point mutations, chromosomal aberrations, or recombination
events, whereas twin spots (flare and mwh) result from mitotic recombination between
the proximal flare marker and the centromere of chromosome 3 (35,36). Therefore, the
results obtained for MH and BH flies were compared to quantify the recombinogenic
potential (24,37,38).
Statistical analysis
The frequencies of spots per fly were compared with the concurrent control
series (38,39). The conditional binomial test (40) was used to make statistical
comparisons followed by a multiple-decision procedure (39), in which three potential
diagnoses were possible: positive, negative, or inconclusive. The results were
considered statistically significant when p < 0.05.
94
The treatment is considered effective if the frequency of mutant clones in the
treated series is at least m (multiplication factor) times greater than in the control series.
Since small single spots and total spots have a comparatively high spontaneous
frequency, m is fixed at a value of 2 (testing for a doubling of the spontaneous
frequency). For large single spots and twin spots, with a low spontaneous frequency,
m is fixed at a value of 5 (41).
Only mwh clones (mwh single and mwh twin spots) were used to calculate the
clone formation frequencies per 105 cells because of the weak expression of the flr3
marker in small clones and its lethality in large clones of mutant cells (42). The
calculated values were used to estimate the contribution of recombination and
mutation to the incidence of total mutant spots per fly in trans-heterozygous flies (43).
The inhibition percentages (IP) were calculated using the total number of spots per
wing with the following formula (44,45):
% IP = {MMC alone − (MMC + 4 − MET)
MMC alone} × 100
Results
Based on the results of the survival curves generated (Figure 2), none of the
concentrations of 4-MET used (1, 5, 20, 50, 100, 200, and 400 µg/mL) had significant
effects on the number of survivors and, therefore, the doses tested were not toxic to
D. melanogaster larvae.
95
Fig. 2: Survival curves of descendants of Drosophila melanogaster from standard
(ST) and high bioactivation (HB) crosses fed different concentrations (1, 5, 20, 50,
100, 200 and 400 µ/mL) of 4-MET.
The choice of the final concentrations of 4-MET was based on two main criteria:
reduction of percentage of survival of larvae, which is a clear indication that the
compounds affect the larvae, and number of emerging adults, which must be
sufficiently high to allow the implementation of the treatments (32,46,47).
Table 1 shows the frequencies of mutant spots observed in MH descendants from ST
and HB individuals treated with 4-MET alone. In the mutagenicity evaluation, none of
the four doses of 4-MET employed (5, 50, 100, and 400 µg/mL) significantly increased
the frequency of any categories of spots or total spots (p > 0.05). Hence, it is possible
to infer that 4-MET is not mutagenic to ST and HB at these concentrations.
96
Table 1. Frequency of mutant spots observed in somatic cells of marker-heterozygous (mwh/flr3) Drosophila melanogaster descendants of standard cross (ST) and high bioactivation cross (HB) treated with four different concentrations (5, 50, 100, and 400 µg /mL) of the coumarin–chalcone hybrid 7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl-2H-cromen-2-one (4-MET)
Treatment 4-MET
Individuals (no.)
Frequency of mutant spots per individual (no. of spots)a
SSS (1–2 cells)b, m = 2
LSS (>2 cells)b, m = 5
TWS, m = 5 TOS, m = 2
ST mwh/flr3
Negative controlc 40 0.68 (27) 0.15 (6) 0.05 (2) 0.88 (35) Positive controld 40 11.25 (450)+ 6.65 (266)+ 2.45 (98)+ 20.35 (814)+ 5 µg/mL 40 0.35 (14)– 0.08 (3)– 0.00 (0)i 0.43 (17)– 50 µg/mL 40 0.15 (6)– 0.03 (1)– 0.00 (0)i 0.18 (7)– 100 µg/mL 40 0.50 (20)– 0.03 (1)– 0.00 (0)i 0.52 (21)– 400 µg/mL 40 0.60 (24)– 0.08 (3)– 0.05 (2)i 0.73 (29)–
HB mwh/flr3
Negative control 40 0.88 (35)– 0.20 (8)– 0.00 (0) 1.08 (43)– Positive control 40 11.65 (466)+ 5.40 (216)+ 1.20 (48)+ 18.25 (730)+ 5 µg/mL 40 0.18 (7)– 0.05 (2)– 0.00 (0)i 0.23 (9)– 50 µg/mL 40 0.10 (4)– 0.08 (3)– 0.03 (1)i 0.20 (8)– 100 µg/mL 40 0.18 (7)– 0.05 (2)– 0.00 (0)i 0.23 (9)– 400 µg/mL 40 0.23 (9)– 0.08 (3)– 0.03 (1)i 0.33 (13)–
aStatistical diagnosis following Frei and Würgler (38): –, negative; +, positive; i, inconclusive. bIncluding rare f lr3 single spots. cNegative control: 0.5% dimethylsulfoxide (DMSO). dPositive control: 0.05 mM mitomycin C (MMC). SSS, small simple spots; LSS, large simple spots; TWS, twin spots; TOS, total spots; m, multiplication factor.
97
The frequencies of mutant spots observed in MH and BH descendants from ST
individuals treated with 4-MET and co-treated with MMCGIKLUPO are in Table 2. In
the antimutagenicity assessment of ST, 4-MET reduced the genotoxicity induced by
MMC in all mutant spot categories in MH and BH descendants. In ST, MH descendants
inhibition ranged from 42% to 64%.
Table 3 shows the frequencies of mutant spots observed in MH and BH
descendants of HB individuals treated with 4-MET and co-treated with MMC. In the
antimutagenicity evaluation of HB, 4-MET reduced the mutagenicity induced by MMC
in all mutant spot categories in MH and BH descendants. The inhibition in MH
descendants of HB ranged from 32% to 59%. Based on these findings, 4-MET
modulated the genotoxic activity of MMC, which demonstrates its antimutagenic
activity.
In the present study, the treatment with MMC alone produced a positive
response in both MH and BH descendants of ST and HB, showing that the coumarin–
chalcone hybrid was mutagenic under these experimental conditions (Tables 2 and 3).
This result agrees with the expected value and confirms the sensitivity of the test to
produce mutant spots.
Considering the clone induction frequency per 105 cells, we compared the
number of observed spots in MH flies to those of BH flies and quantified the relative
contribution (%) of mutation and recombination to the total number of spots (37,44,49).
Clone induction frequency of a treatment with MMC alone was compared between
genotypes, and we found that 30% of the mutant clones produced in ST flies occurred
due to mutation, whereas 70% of them occurred due to recombination. Similarly, 35%
of the spots induced in HB flies resulted from mutation and 65% from recombination.
The recombination rates resulting from treatments with 5, 50, 100, and 400 µg/mL 4-
MET co-treated with MMC in ST descendants were 70%, 71%, 80%, and 86%,
respectively. Furthermore, in HB cross descendants, the frequencies of recombination
produced by MMC combined with 5, 50, 100, and 400 µg/mL 4-MET were 64%, 66%,
54%, and 49%, respectively. These results demonstrate that induced spots occurred
mostly due to recombination (Tables 2 and 3).
98
Table 2. Frequency of mutant spots observed in marker-heterozygous (mwh/flr3) and balancer-heterozygous (mwh/TM3) Drosophila melanogaster descendants of standard cross (ST) co-treated with four different concentrations (5, 50, 100, and 400 µg /mL) of the coumarin–chalcone hybrid 7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl-2H-cromen-2-one (4-MET) and mitomycin C (MMC)
Treatment Individuals (no.)
Frequency of mutant spots per individual (no. of spots)a Total mwh
clonesc (no.)
Frequency of clone induction per 105 cellsd
(n/NC)e
Recombination
(%)f
Inhibition (%) SSS
(1–2 cells)b
m = 2
LSS (>2 cells)b
m = 5
TWS m = 5
TOS m = 2
4-MET (µg/mL)
MMC (mM)
ST mwh/flr3
0 0 40 0.60 (24) 0.10 (4) 0.05 (2) 0.75 (30) 29 1.54 0 0.05 40 11.25(450)+ 6.65 (266)+ 2.45 (98)+ 20.35(814)+ 765 41.70(40.1) 76 5 0.05 40 6.83 (273)* 4.03 (161)* 1.20 (48)* 12.05 (482)* 458 24.69(23.1) 70 42 50 0.05 40 5.65 (226)* 3.95 (158)* 0.45 (18)* 10.05 (402)* 393 20.59(19.0) 71 52 100 0.05 40 4.55 (182)* 3.18 (127)* 0.13 (5)* 7.85 (314)* 311 16.09(14.5) 80 64 400 0.05 40 4.08 (163)* 3.90 (156)* 0.55 (22)* 8.53 (341)* 330 17.47(15.9) 86 60
ST mwh/TM3
0 0 40 0.40 (16) 0.05 (2) 1.30 (52)+ 0.90 (36)* 1.18 (47)* g 0.58 (23)* 0.65 (26)*
0.45 (18) 18 0.92
0 0.05 40 3.78 (151)+ 5.08 (203)+ 203 10.40 (9.48)
5 0.05 40 2.95 (118)* 3.85 (154)* 154 7.89 (6.97) 26
50 0.05 40 1.95 (78)* 3.13 (125)* 125 6.40 (5.48) 42
100 0.05 40 1.38 (55)* 1.95 (78)* 78 4.00 (3.07) 67
400 0.05 40 0.90 (36)* 1.55 (62)* 62 3.18 (2.25) 76 aStat ist ical diagnosis following Frei and Würgler (38): +, posit ive; *, signif icant difference compared with the posit ive control group (p < 0.05). b Including rare f lr3 s ingle spots. cConsidering clones mwh for single spots mwh and twin spots. dFrequency of clone formation: clones/wings/24,400 cells (48). en, number of spots mwh; NC, number of cells. fPercentage of recombination calculated according to the formula: R = 1 – [(n/NC in mwh/TM3 flies)/(n/NC in mwh/flr3 flies)] ×100 (34). Control corrected frequencies were used for these calculations. gOnly single spots mwh can be observed in balancer-heterozygous individuals. SSS, small simple spots; LSS, large simple spots; TWS, twin spots; TOS, total spots; m, multiplication factor; m, multiplication factor.
99
Table 3. Frequency of mutant spots observed in marker-heterozygous (MH) and balancer-heterozygous (BH) Drosophila melanogaster descendants of high bioactivation cross (HB) co-treated with four different concentrations (5, 50, 100, and 400 µg /mL) of the coumarin–chalcone hybrid 7-methoxy-3-(E)-3-(3,4,5-trimethoxyphenyl)acryloyl-2H-cromen-2-one (4-MET) and mitomycin C (MMC)
Treatment Individuals (no.)
Frequency of mutant spots per individual (no. of spots)a Total mwh
clonesc (no.)
Frequency of clone induction per 105 cellsd
(n/NC)e
Recombination
(%)f
Inhibition (%) SSS
(1–2 cells)b
m = 2
LSS (>2 cells)b
m = 5
TWS m = 5
TOS m = 2
4-MET (µg/mL)
MMC (mM)
HB mwh/flr3
0 0 40 0.88 (35) 0.20 (8) 0.00 (00) 1.08 (43) 43 2.20 0 0.05 40 11.65(466)+ 5.40 (216)+ 1.20 (48)+ 18.25(730)+ 706 37.30(35.0) 65 5 0.05 40 8.28 (331)* 4.15 (166)* 0.30 (12)* 12.73 (509)* 503 26.08(23.8) 64 32 50 0.05 40 8.60 (344)* 3.50 (140)* 0.93 (37)* 13.03 (521)* 502 26.69(24.4) 66 30 100 0.05 40 8.28 (331)* 2.73 (109)* 0.33 (13)* 11.33 (453)* 446 23.21(21.0) 54 41 400 0.05 40 4.60 (184)* 2.90 (116)* 0.55 (22)* 8.05 (322)* 311 16.50(14.2) 49 59
HB mwh/TM3
0 0 40 0.15 (6) 0.13 (5) 1.33 (53)+ 0.88 (35)* g 1.25 (50)* 0.63 (25)* 0.55 (22)*
0.28 (11) 11 0.56
0
0.05
40
4.85 (194)+
6.18 (247)+
247
12.65(2.09)
5 0.05 40 3.43 (137)* 4.30 (172)* 172 8.81 (8.25) 32
50 0.05 40 2.93 (117)* 4.18 (167)* 167 8.56 (7.99) 31
100 0.05 40 4.38 (175)* 5.00 (200)* 200 10.25(9.68) 20
400 0.05 40 3.25 (130)* 3.89 (152)* 152 7.79 (7.22) 40 aStat ist ical diagnosis following Frei and Würgler (38): +, posit ive; *, signif icant difference compared with the posit ive control group (p < 0.05). b Including rare f lr3 s ingle spots. cConsidering clones mwh for single spots mwh and twin spots. dFrequency of clone formation: clones/wings/24,400 cells (48). en, number of spots mwh; NC, number of cells. fPercentage of recombination calculated according the formula: R = 1 – [(n/NC in mwh/TM3 flies)/(n/NC in mwh/flr3 flies)] ×100 (34). Control corrected frequencies were used for these calculations. gOnly single spots mwh can be observed in balancer-heterozygous individuals. SSS, small simple spots; LSS, large simple spots; TWS, twin spots; TOS, total spots; m, multiplication factor; m, multiplication factor
100
Discussion
The aim of the present study was to evaluate the mutagenic/antimutagenic and
recombinogenic/anti-recombinogenic activities of the novel coumarin–chalcone hybrid
4-MET using the SMART test in D. melanogaster. SMART was developed to detect
LOH of suitable genetic markers that have detectable phenotypes expressed on D.
melanogaster wings. This assay is an efficient and quick method for quantifying the
recombinogenic and mutagenic potential of chemical and physical agents (24,29,50).
The results of the mutagenic assessment using SMART showed that 4-MET did
not significantly increase the frequency of any classes of spots in ST or HB. These
findings indicated that 4-MET did not induce somatic mutation or recombination in D.
melanogaster. Similarly, previous studies reported the absence of mutagenic effects
of coumarins and/or chalcones on in vivo assays (51). Moreover, two chalcones,
namely 4-hydroxyderricin and xanthoangelol, were not genotoxic to bone marrow
erythrocytes of mice using the chromosome aberration assay and the micronucleus
test (52). Similar results were described in other in vivo study using the coumarin 4-
methylesculetin, no genotoxic effects were found (21). Various tests (Ames
mutagenicity test, comet assay, micronucleus test in mice, and SMART) have shown
that coumarins and chalcones are not genotoxic (2,5,15,21, 53–56). Our results
corroborate these findings, since 4-MET did not induce somatic mutation or
recombination in D. melanogaster.
In the evaluation of antimutagenicity, the chronic co-treatment of ST and HB
larvae with MMC and different concentrations of 4-MET led to significant reductions in
all three categories of spots in flies. Therefore, 4-MET acted as an antimutagenic agent
on MMC-induced DNA lesions. This result is consistent with the literature, since
coumarins and chalcones have been described as compounds that reduce induced
mutagenicity (54), inhibit carcinogenesis in rodents (57), and possess potential
chemopreventive and antimutagenic properties (21,56,58,59,60,61,62,63,64,65).
In the present study, 4-MET revealed antimutagenic effect against damage
induced by MMC in somatic cells of D. melanogaster. The mutagenic action of MMC
is related to its ability to produce reactive free radicals (66). Free radicals generated
by exogenous chemicals, such as MMC, or endogenous metabolites may cause
oxidative damage, resulting in cell death and tissue damage (67). Oxidative damage
involves single- or double-strand DNA breaks, purine and pyrimidine modifications,
DNA intrastrand adducts, and DNA cross links (68–71). Data from numerous
101
experiments suggest that oxidative damage to DNA contributes to aging and the
etiology of many human diseases, including atherosclerosis, neurodegenerative
diseases, and even cancers (72–74).
The antimutagenic effect of 4-MET observed in our study might be attributed to
its antioxidant activity, since the genotoxic action of MMC is related to its ability to
produce reactive free radicals (66). Thus, the primary action of 4-MET might be
associated with the protection of nucleophilic sites in DNA. These results show
similarity to literature reports. The antigenotoxic potential of coumarin in the bone
marrow cells of golden Syrian hamsters was probably due to its antioxidant potential
and modulating effect on phases I and II of the detoxification cascade (75). Vazquez-
Rodriguez et al. (65) demonstrated the antioxidant activity of several coumarin–
chalcone hybrids. Several others research groups, also have proved the antioxidant
activities of these compounds (9,10).
This antioxidant activity relies on the chalcone and/or coumarin nucleus, which
serves as nucleophiles to scavenge the reactive metabolites (76). Chalcones presents
α,β-unsaturated ketones (77,78, 79). This unsaturation creates a nucleophilic center
at β-carbon that may have interacted with MMC metabolites, reducing their mutagenic
effects and oxidative stress on DNA. Furthermore , previous studies related the
antioxidant properties of coumarins with the aromatic ring (ring B) presented in their
structures. This ring induces a resonance in the structure and creates an electrostatic
potential, which might lead this molecule to interact with ROS (77,78). Therefore, the
antimutagenic effect of 4-MET observed in our study may be attributed, at least
partially, to its molecular structure, composed of both a coumarin and a chalcone,
which facilitates radical scavenging activity and prevents DNA damage.
Previous studies have demonstrated the importance the SMART, since it is
suitable for the detection of recombinogenic activity of several chemicals (24). Mitotic
recombination is related to the development of several types of tumor (29,81).
Therefore, highlight the importance of defining the recombinogenic profile of 4-MET.
We observed that 4-MET displays both antimutagenic and anti-recombinogenic
activity. Thus, from the overall results of this study, it can be concluded that 4-MET is
a potential chemopreventive compound.
Therefore, all the results of this study demonstrate that the novel coumarin–
chalcone hybrid 4-MET exhibits antimutagenic and anti-recombinogenic activities.
102
These properties may have been the result of its antioxidant activity, and support the
use of this compound as a chemopreventive agent.
Conclusion
In conclusion, the present results indicate that 4-MET was not mutagenic and/or
recombinogenic at the doses tested. Additionally, it protected D. melanogaster somatic
cells against the mutagenic and/or recombinogenic effects of MMC. The assay used
in this study clearly showed that 4-MET is an efficient modulator of mutagenic action.
This property may be attributed to the antioxidant activity of this compound, already
described in the literature. By decreasing the formation of free radicals, this novel
coumarin–chalcone hybrid inhibits oxidative genetic damage and therefore can be
used in primary health care. Our results indicate that 4-MET is a probable candidate
to the development of chemopreventive therapies. However, more research is
necessary to clarify the beneficial properties of this compound.
103
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9. CONCLUSÃO GERAL
Considerando os objetivos propostos e de acordo com os resultados obtidos
neste trabalho, pôde-se concluir que o híbrido cumarina-chalcona 7-metoxi-3-(E)-3-
(3,4,5-trimetoxifenil)acriloil)-2H-cromen-2-ona (4-MET), nas condições experimentais
realizadas:
-4-MET não foi capaz de induzir mutações do tipo substituição nos pares de base e
“frameshift” (mudança no quadro de leitura) em cepas de Salmonella thyphimurium
TA100 e TA98, pelo teste de Ames;
Ainda pelo teste de Ames, 4-MET foi capaz de proteger o DNA bacteriano contra a
ação dos mutágenos 4-NQO e azida sódica;
Utilizando o teste do micronúcleo em medula óssea de camundongos, nenhum efeito
genotóxico foi apresentado por 4-MET, em três tipos de tratamentos, pré, co e pós-
tratamento.
Pelo ensaio cometa, nenhum efeito genotóxico foi apresentado por 4-MET, em três
tipos de tratamentos, pré, co e pós-tratamento;
Em todas as doses de 4-MET testadas no pré, no co e pós-tratamento com a
ciclofosfamida houve redução significativa na frequência de MN induzidos por esse
agente de alquilação no DNA.
- Os resultados obtidos na avaliação da genotoxicidade e antigenotoxicidade, tanto no
teste do micronúcleo, quanto no ensaio cometa foram similares. Os efeitos
antigenotóxicos observados, em ambos os testes, em diferentes tipos de tratamento
(co, pré e pós-tratamento) indicaram que este composto atua tanto na prevenção de
danos, quanto no processo de reparo celular.
Em todas as concentrações utilizadas não houve aumento significativa no número
de manchas mutantes observadas no teste SMART/asa, demonstrando ausência de
efeitos mutagênicos e /ou recombinogênicos;
Em todas as concentrações utilizadas juntamente com a MMC, houve uma redução
significativa no número de manchas mutantes observadas no teste SMART/asa,
demonstrando efeitos antimutagênico e /ou anti-recombinogênico.
Assim, os efeitos protetores de 4-MET, em diferentes organismos testes in vitro
e in vivo, demonstraram que esse composto pode ser utilizado no desenvolvimento
de novas terapias quimiopreventivas. Entretanto, futuras pesquisas, ainda serão
necessárias para esclarecer os mecanismos de ação quimiopreventivo de 4-MET.
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ANEXO 1: Parecer Favorável do Comitê de Ética