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LEILANE HESPPORTE IWAMOTO

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE FARMACOLÓGICA DE EXTRATO

BRUTO DICLOROMETÂNICO DAS FOLHAS DE PIPER

UMBELLATUM MICROENCAPSULADO E LIVRE PADRONIZADO

EM 4-NEROLIDILCATECOL

PHARMACOLOGICAL ACTIVITY EVALUATION OF

MICROENCAPSULATED AND FREE CRUDE DICHLOROMETHANE

EXTRACT FROM LEAVES OF PIPER UMBELLATUM

STANDARDIZED IN 4-NEROLIDYLCATECHOL

Piracicaba

2014

ii

iii

Universidade Estadual de Campinas

Faculdade de Odontologia de Piracicaba

LEILANE HESPPORTE IWAMOTO

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE FARMACOLÓGICA DE EXTRATO BRUTO

DICLOROMETÂNICO DAS FOLHAS DE PIPER UMBELLATUM

MICROENCAPSULADO E LIVRE PADRONIZADO EM 4-NEROLIDILCATECOL

PHARMACOLOGICAL ACTIVITY EVALUATION OF MICROENCAPSULATED

AND FREE CRUDE DICHLOROMETHANE EXTRACT FROM LEAVES OF

PIPER UMBELLATUM STANDARDIZED IN 4-NEROLIDYLCATECHOL

Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba

da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos

exigidos para a obtenção do título de Mestra em Odontologia, na Área

de Farmacologia, Anestesiologia e Terapêutica

Dissertation presents to the Piracicaba Dental School of University of

Campinas in partial fulfillment of the requiriments for the degree of

Master in Dentistry in Farmacology, Anesthesiology and Terapeutics

area.

Orientador(a): Prof. Dr. Rodney Alexandre Ferreira Rodrigues

Coorientador: Prof(a). Dr(a). Mary Ann Foglio

Coorientador: Prof. Dr. João Ernesto de Carvalho

Este exemplar corresponde à versão final da dissertação defendida por Leilane HespporteIwamoto e orientada pelo Prof. Dr. RodneyAlexandre Ferreira Rodrigues

____________________

Assinatura do orientador

Piracicaba 2014

iv

v

vi

vii

RESUMO

A espécie Piper umbellatum L., sinonímia Pothomorphe umbellata (L.) Miquel, é

conhecida popularmente como pariparoba, caapeba e malvarisco. Tendo em vista

as diferentes atividades biológicas comprovadas para a espécie Piper umbellatum

e a técnica de microencapsulação por Spray Dryer, o objetivo desse trabalho foi

avaliar a atividade farmacológica de extrato bruto padronizado (EBP) de P.

umbellatum em modelos de câncer, inflamação, úlcera e verificar se as

micropartículas de EBP apresentam atividade antiproliferativa in vitro. O extrato

bruto diclorometânico de P. umbellatum possui 23,9% de 4-nerolidilcatecol

aproximadamente. Foi avaliado a sua atividade anticâncer em modelo in vivo de

tumor sólido de Ehrlich, atividade anti-inflamatória no edema da pata induzido por

carragenina e peritonite. EBP foi capaz de reduzir o crescimento do tumor, quando

administrado diariamente por via oral, sem sinais de toxicidade. Além disso,

diminuiu o edema de pata e a migração de leucócitos no modelo de peritonite dessa

forma, acredita-se existir uma relação entre a atividade anticâncer e anti-

inflamatória. Também foi comprovada sua a atividade antiulcerogênica e

gastroprotetora, relatada pelo uso popular no tratamento de úlceras gástricas. Os

mecanismo de ação gastroprotetor envolvido na manutenção dos grupos

sulfidrílicos, aumento de glutationa e de muco relacionam sua atividade

antiulcerogênica à atividade antioxidante já descrita na literatura. O processo de

microencapsulação por Spray Dryer do extrato bruto diclorometânico de P.

umbellatum com o amido modificado Purity Gum 1773® permitiu alterar a

propriedade graxa inerente a este extrato, insolúvel em água e foi capaz de manter

sua atividade antiproliferativa in vitro. Dessa forma, a técnica de Spray Dryer pode

ser um caminho para desenvolver um extrato seco de P. umbellatum. Portanto,

podemos concluir que P. umbellatum pode ser fonte promissora para o

desenvolvimento de novos agentes terapêuticos, tanto para o tratamento de úlceras

gástricas quanto para inflamação e câncer.

Palavras chaves: Piper umbellatum, câncer, inflamação, úlcera, spray dryer.

viii

ix

ABSTRACT

The species Piper umbellatum, is popularly known as “pariparoba”, “caapeba” and

“malvarisco”. Despite the different biological activities certified for the species P.

umbellatum and the technique of microencapsulation by Spray Dryer, the aim of this

study was to evaluate the pharmacological activity of dichloromethane crude extract

(DCE) from Piper umbellatum leaves in models of cancer, inflammation and gastric

ulcer and also evaluate the antiproliferative activity of microparticles containing

standardized crude extract (SDE) in a panel of human tumor cell lines. The SDE

from P. umbellatum containing 23,9% of 4-nerolidylcatechol approximately and its in

vivo anticancer activity in the Ehrlich solid tumor model as well as its anti-

inflammatory activity on carrageenan induced paw edema and peritonitis. The SDE

presented in vitro and in vivo antiproliferative activity, being capable to reduce tumor

growth when administered daily by oral route, without signals of toxicity. It was also

reduced paw edema induced and leukocyte migration on carrageenan induced

peritonitis model. Thus establishing a relationship between the anticancer and anti-

inflammatory activities.It was also confirmed the popular use of P. umbellatum in the

treatment of gastric ulcers, as SDE presented gastroprotective action dependent of

the sulfhydryl groups, increase glutatione and mucus pathway and possibly for its

antioxidant potential. The microencapsulation process by Spray Dryer of SDE of P.

umbellatum with modified starch (Purity Gum 1773®) allowed improvement of the

extract solubility, without interfere on its in vitro antiproliferative activity. Thus, the

technique of Spray Dryer may be a good alternative to the development of a dry

extract of P. umbellatum. Therefore, we conclude that P. umbellatum is a promising

source for the development of new therapeutic agents for the treatment gastric

ulcers, inflammation and cancer.

Key words: Piper umbellatum, cancer, inflammatory, ulcer, spray dryer.

x

xi

SUMÁRIO

DEDICATÓRIA xiii

AGRADECIMENTOS xv

LISTA DE FIGURAS xvii

LISTA DE TABELAS xix

INTRODUÇÃO 1

CAPÍTULO 1: Anticancer and anti-inflammatory activities of a Piper

Umbellatum leaves standardized dichloromethane extract.

9

CAPÍTULO 2: Atividade antiulcerogênica de extrato bruto

diclorometânico de Piper umbellattum e estudo de mecanismo de ação

envolvido.

35

CAPÍTULO 3: Microencapsulação do extrato de pariparoba através de

spray drying, empregando-se um amido modificado: atividade

antiproliferativa in vitro e características das partículas

61

DISCUSSÃO 77

CONCLUSÃO 81

REFERÊNCIAS 83

ANEXO 1: Comitê de ética de uso animal (CEUA/UNICAMP 2868-1) 87

ANEXO 2: Comitê de ética de uso animal (CEUA/UNICAMP 3182-1) 88

ANEXO 3: Comitê de ética de uso animal (CEUA/UNICAMP 3052-1) 89

ANEXO 4: Comitê de ética de uso animal (CEUA/UNICAMP 3301-1) 90

ANEXO 5: Autorização de acesso e de remessa de componente do

patrimônio genético (CGEN)

91

ANEXO 6: Confirmação de submissão de artigo na revista científica

Phytomedicine

92

xii

xiii

Dedicatória

Esse trabalho é dedicado à minha

família, meu porto seguro, meu tudo.

E também ao meu noivo pela força e

compreensão.

Amo vocês!!!

xiv

xv

AGRADECIMENTOS

A Deus, por me guiar e estar presente em todos os momentos;

Ao meu orientador, Prof Dr. Rodney Alexandre Ferreira Rodrigues pela confiança,

amizade e compreensão;

Aos meus co-orientadores João Ernesto de Carvalho e Mary Ann Foglio pelo

carinho e atenção em todos os momentos;

À Faculdade de Odontologia de Piracicaba e ao programa de Farmacologia

Anestesiologia e Terapêutica;

À minha família, por permitir buscar meus sonhos e me apoiar sempre.

Ao meu noivo Lindo pelo amor, apoio nos momentos mais difíceis e compreensão;

Às minha amigas Gica e Marias (Leila e Gabis). Não importa a distância, sempre

estaremos juntinhas.

Aos meus queridos amigos e colegas do laboratório da Divisão de química de

produtos naturais: Ilzinha, Núbia, Natália, Rô. E também da Farmacologia: Sica,

Paulete, Mi, Paula, Karissima, Thais, Aninha, Fabi, Rafa,

Dri, Laricota, Gi L., Ana P.

Em especial, gostaria de agradecer à Debora Barbosa Vendramini Costa por estar

presente em todos os momentos, mesmo estando nos EUA.

Muito obrigada!!!!

À família CPQBA, que me ensinou a trabalhar em equipe e onde quer que esteja,

sempre estará no meu coração....

Amo muito tudo isso!!!!

Ao CNPQ, pela concessão da minha bolsa de mestrado;

À CAPES e FAPESP

xvi

xvii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Foto de folhas de Piper umbellatum no campo experimental

do CPQBA/UNICAMP.

2

Figura 2 - Estruturas químicas de compostos isolados das folhas de

Piper umbellatum.

3

Capítulo 1:

Figure S1: Analytical curve of 4-nerolidylcatechol. 18

Figure S2: HPLC/DAD chromatogram of dichloromethane extract from

P. umbellatum leaves.

18

Figure 1: Relative tumor weight of Ehrlich solid tumor after oral daily 12

day-treatment with Vehicle and P. umbellatum SDE.

23

Figure 2: Anti-inflammatory effect of P.umbellatum SDE versus time

after inflammatory stimulus on carrageenan-induced paw edema.

25

Figure 3: Effect of P.umbellatum SDE on carrageenan induced

peritonitis, expressed as leukocyte count (cells/mL).

28

Capítulo 2:

Figura 1: Efeito da administração oral única de EBP em modelo de

úlcera induzida por etanol com tratamento prévio de NEM em ratos

Wistar.

46

Figura 2: Efeito da administração oral única de EBP em modelo de

úlcera induzida por etanol com tratamento prévio de L-Name em ratos

Wistar.

47

Figura 3: Efeito da administração oral única de EBP em modelo de

úlcera induzida por etanol com tratamento prévio de Indometacina em

ratos Wistar.

48

Figura 4: Efeito da administração oral de EBP (18 mg/kg) na produção

do muco gastroprotetor em modelo experimental de úlcera induzida por

etanol em ratos Wistar.

49

xviii

Capítulo 3:

Figura 1: As amostras de micropartículas de Piper umbellatum e o

controle processados por Spray drying (A e B= M10, M20 e C= controle).

67

Figura 2: Morfologia externa de micropartículas de EBP e controle pela

técnica de Spray drying por microscopia eletrônica de varredura

(MEV/FEG) em um aumento de 2000 e 5000 X. (1 e 2- M10 e 3 e 4-M20

e 5-6 Controle).

68

Figura 3: Gráficos demonstrativos da atividade antiproliferativa in vitro

das amostras 1- Doxo (controle positivo), 2- Controle (controle

negativo), 3- EBP, 4- M10, 5- M20 em cultura de células tumorais

humanas relacionando porcentagem de crescimento versus

concentração (µg/ml). Ensaio da Sulforrodamina B após 48h de

exposição).

70

xix

LISTA DE TABELAS

Capítulo 1:

Table 1: Concentration (µg/mL) of Piper umbellatum SDE and

Doxorubicin (DOXO) required for total growth inhibition of cell lines

(TGI valuesa).

19

Table 2: Haemogram parameters and organs weight (mean ± SEM)

from animals treated (p.o) with Vehicle and P. umbellatum SDE during

21 days.

21

Table S1: Inhibitory effect of P.umbellatum SDE versus time after

inflammatory stimulus on carrageenan-induced paw edema.

26

Capítulo 2:

Tabela 1: Parâmetros avaliados nas lesões ulcerativas no estômago. 39

Tabela 2: Efeito da administração oral única de EBP em modelo de

úlcera gástrica induzida por etanol em ratos Wistar.

44

Tabela 3: Efeito da administração oral única de EBP em modelo de

úlcera gástrica induzida por AINEs em ratos Wistar.

45

Tabela 4: Efeito da administração intraduodenal de EBP em modelo

de ligadura do piloro em ratos.

48

Tabela 5: Efeito da administração oral de EBP (18mg/kg) na

determinação de níveis de glutationa em modelo experimental de

úlcera induzida por etanol em ratos Wistar

49

Capítulo 3:

Tabela 1: Formulação de emulsão para obter microcápsula de EBP de

Piper umbellatum secas em mini - Spray Dryer.

64

Tabela 2: Distribuição granulométrica das amostras de EBP de Piper

umbelatum microencapsuladas (M10, M20) e seu respectivo controle

expresso µm

67

xx

Tabela 3: Valores de TGI em µg/mL, de Doxo (controle positivo), EBP,

M10, M20 e PLA (controle negativo), concentrações necessárias para

inibir totalmente o crescimento celular.

69

1

INTRODUÇÃO

Atualmente, a descoberta de novos fármacos é um grande desafio para

a indústria farmacêutica. Os investimentos em pesquisa e desenvolvimento são

grandes, porém contrasta com poucos medicamentos que chegam ao mercado

(Ferreira et al., 2011; Munos, 2009). No Brasil, ainda é muito pouco explorada a

diversidade dos biomas como fonte de novas substâncias de interesse

farmacêutico, contudo, as pesquisas para descoberta de protótipos de fármacos e

também de fitoterápicos, desencadeiam além do avanço da pesquisa, o

desenvolvimento tecnológico do país (Barreiro e Bolzani, 2009).

O uso de plantas na medicina popular é considerado como uma prática

frequente e antiga, utilizada pelo homem no tratamento de vários tipos de

enfermidades. Esse uso está ligado à sabedoria popular, uma vez que isso acontece

dentro de um contexto histórico (Oliveira e Araújo, 2007). Dessa forma, as plantas

medicinais possuem um enorme potencial terapêutico. Estudos recentes, estimam

que cerca de 75% de todos os fármacos utilizados são derivados diretamente ou

indiretamente de produtos naturais (Newman e Cragg, 2013).

A espécie Piper umbellatum L., sinonímia Pothomorphe umbellata (L.)

Miquel (Figura 1), nome popular pariparoba, caapeba e malvarisco é utilizada

popularmente como analgésica, antimalárica, sedativa, diurética (Hammer e Johns,

1993) e antiulcerogênica (Balbach, 1971).

Na literatura científica, o extrato etanólico das folhas de P. umbellatum

possui ação anti-inflamatória e analgésica (Perazzo et al., 2005), antifúngica

(Rodrigues et al., 2012) e antioxidante (Lopes et al. 2013). Além disso, esse mesmo

extrato etanólico de raízes é fotoprotetor (Ropke et al., 2003, 2005, 2006),

antioxidante (Tabopda et al., 2008) e antituomoral (Brohem et al., 2009). Já o

extrato metánólico das folhas é antioxidante (Agbor et al., 2007), o extrato

diclorometânico é considerado antitumoral (Sacoman et al., 2008) e o extrato

aquoso anticonvulsivante (Okunrobo et al., 2013). Existe cerca de 94 usos

medicinais tradicionais para P. umbellatum (Roersch, 2010).

2

P. umbellatum é um arbusto ereto de até 2,5 metros de altura, ramificado

com hastes articulares, possui influrescência em formato de espigas de 4 a 8 cm de

comprimento. As folhas são largas (15 - 23 cm), pecioladas e codiformes (em

formato de coração) (Gilbert e Favoreto, 2010). Segue foto de P. umbellatum no

campo experimental do CPQBA/UNICAMP.

Figura 1: Foto de Piper umbellatum no campo experimental do CPQBA/UNICAMP.

Legenda: 1-Arbusto, 2- espigas e 3- folhas.

Além dos compostos fitoquímicos isolados, alguns estudos de toxicidade

aguda, sub-crônica e de mutagenicidade através do teste de micronúcleo não

revelaram toxicidade (Perazzo et al., 2005; Barros et al., 2005; Bouzada et al., 2009;

Valadares et al., 2007).

Por meio dos estudos fitoquímicos, foram identificados nos extratos de

P. umbellatum o terpeno glicosilado (roseosídeo presente também na Vinca rosea),

lignanas como sesamina e diidrocubebina, favonas e 4-nerolidilcatecol

3

(fenilpropanoide e principal metabólito secundário dessa espécie) (Kijoa et al., 1980;

Isobe et al., 2002; Tabopda et al., 2008; Baldoqui et al., 2009) (Figura 2).

Figura 2: Estruturas químicas de compostos isolados das folhas de Piper umbellatum.

(Fonte: Adaptado de Tabopda et al., 2008 e Baldoqui et al., 2009). Legenda: 1-

piperumbellactama A, 2- piperumbellactama B, 3 - piperumbellactama C, 4 –

piperumbellactama D, 5 – N-hidroxi-aristolactama II , 6- N-p-cumaroil-tiramina ama, 7- 4-

Nerolidilcatecol, 8 -rel-(6S, 9S)-roseosídeo (terpeno glicosilado), 9- C-glicosilflavona-O-

glicosídeo, vitexina 2"-O-β-D-glucopiranosídeo, 10- C-glicosilflavonas, apigenina-8-C-β-D-

glucopiranosídeo, 11- orientina 8-C-β-D-glucopiranosídeo, 12- sesamina, 13- 5-hidroxi-

7,3',4'-trimetoxi-flavona, 14- Velutina, 15- diidrocubebina.

CÂNCER E INFLAMAÇÃO

O câncer consiste em alterações celulares caracterizadas pela falta de

controle sobre a proliferação, diferenciação e morte celular (Mesquita et al., 2009).

Essas alterações podem originar um conjunto de mais de 100 doenças nas quais

as células apresentam um crescimento desordenado e podem espalhar-se para

4

outras regiões do corpo (INCA, 2014). No Brasil, as estimativas realizadas para o

ano de 2014 e válidas para 2015 apresentam 576.000 novos casos de câncer sendo

os mais incidentes: pele do tipo não melanoma, próstata e mama feminina (INCA,

2014).

O surgimento do câncer (carcinogênese) se caracteriza pela progressiva

aquisição de um fenótipo neoplásico pelas células normais (Hanahan e Weinberg,

2011). Cada modificação genética adquirida proporciona, às células tumorais, um

tipo de vantagem, constituindo características como a proliferação auto-sustentada,

evasão dos sinais de supressão de crescimento, ativação de invasão e metástase,

imortalidade replicativa, indução de angiogênese e resistência aos sinais de morte

celular (Hanahan e Weinberg, 2000).

Em 1863, Rudolf Virchow foi o primeiro pesquisador a relatar a presença

de um infiltrado leucocitário no tecido neoplásico, que foi interpretado como prova

da origem de um tumor, a partir de regiões inflamadas (Balkwill e Mantovani, 2001).

A inflamação é uma resposta fisiológica à infecção ou lesão tecidual, caracterizada

por vasodilatação com aumento da permeabilidade vascular e recrutamento de

células inflamatórias como neutrófilos, monócitos, macrófagos e linfócitos.

(Medzzhitov, 2010).

Há uma ligação entre câncer e inflamação, que pode ser descrita em

duas vias: uma extrínseca, onde as condições inflamatórias ajudam no

desenvolvimento do câncer e uma intrínseca, cujas células tumorais promovem o

início do processo inflamatório, constituindo um microambiente favorável ao

desenvolvimento tumoral (Colotta et al., 2009). Schetter e seus colaboradores

(2010) demonstraram que 25% dos tipos de câncer estão relacionados a infecções

crônicas e outros tipos de inflamação.

Atualmente, maioria dos agentes antineoplásicos utilizados possuem

ação antiproliferativa, atuando sobre o processo de divisão celular, porém, afetam

também as células normais de proliferação rápida, promovendo efeitos tóxicos

indesejáveis. Nesse sentido, a busca por novos medicamentos que tenham como

5

alvos componentes do microambiente tumoral e que tenham menos efeitos

colaterais torna-se um desafio.

Estudos prévios realizados por nosso grupo avaliaram a ação in vitro e in

vivo do extrato bruto diclorometânico (EBP) obtido das folhas de P. umbellatum,

mostrando que o tratamento intraperitoneal com EBP (200 mg/kg) aumentou o

tempo de sobrevida de animais portadores de tumor ascítico de Ehrlich (Sacoman

et al., 2008).

Tendo em vista a necessidade por novas terapias, especialmente

focando o ambiente tumoral e o potencial de Piper umbellatum como um agente

anticâncer, um dos objetivos desse estudo foi avaliar a ação do extrato bruto

diclorometânico, agora padronizado em 23,92% de 4-NC em modelo de tumor sólido

de Ehrlich, bem como avaliar sua toxicidade após tratamento de 21 dias. Além disso,

avaliou-se também sua ação anti-inflamatória, buscando evidências da relação

entre a ação antitumoral e anti-inflamatória.

ÚLCERA

As úlceras pépticas são caracterizadas por danos na mucosa gástrica ou

duodenal e afetam cerca de 4 milhões de pessoas por ano em todo o mundo

(Thorsen et al., 2013). Segundo a Federação Brasileira de Gastroenterologia (2014)

não há uma estatística em relação ao número de potenciais portadores de úlcera

péptica no país.

A fisiopatologia da úlcera consiste em um desequilíbrio de fatores

protetores como prostaglandina, muco, bicarbonato, fluxo sanguíneo adequado e

óxido nítrico e fatores lesivos como pepsina, ácido clorídrico e radicais livres

(Malfertheiner et al., 2009). Também pode ser causada em processo infeccioso por

Helicobacter pylori, agentes antiplaquetários tais como o ácido acetilsalicílico,

fármacos anti-inflamatórios não-esteróides (AINES), bisfosfonatos orais, cloreto de

potássio, medicações imunossupressoras, consumo de álcool e tabagismo (Al

Batran et al., 2013).

6

O muco e o bicarbonato constituem a primeira linha de defesa da mucosa

gástrica, sendo secretados pelas células superficiais do epitélio gástrico. O muco é

viscoso, como um gel transparente, é constituído de 95% de água e 5% de

glicoproteínas (mucinas) cuja produção é estimulada pela gastrina, secretina,

agentes colinérgicos e prostaglandinas (Reppeto e Lleusy, 2002). Já o bicarbonato

após ser liberado é retido pelo muco, mantendo o pH neutro na superfície das

células epiteliais (Banić et al., 2011).

Um importante tratamento para a úlcera gástrica é a administração de

antagonistas de receptores H2, tais como cimetidina, ranitidina, famotidina e

nizatidina, que competem com a histamina pela ação sobre o receptor. A

administração de inibidores da bomba de prótons (omeprazol, lanzoprazol,

rabeprazol, pantoprazol e esomeprazol) também constitui uma importante linha

terapêutica (Goodman e Gilman, 2010). As substâncias antiácidas como

bicarbonato de sódio, magnésio, alumínio ou anti-ácidos neutralizam o ácido

gástrico e são usados como adjuvantes no tratamento da úlcera gástrica (Rang e

Dale, 2007).

No tratamento da úlcera induzida por Helicobacter pylori, administra-se

antibióticos associados aos antagonistas ou inibidores da bomba de prótons,

conhecido como esquema tríplice com omeprazol 20 mg, lanzoprazol 30 mg,

pantoprazol 40 mg, rabeprazol 20 mg ou esomeprazol 40 mg + claritromicina 500

mg + amoxicilina 1g. Ainda tratamentos baseados na inclusão de azitromicina

possibilitaram redução dos efeitos colaterais (Mincis et al., 2011).

Por outro lado, o uso crônico dos inibidores de bomba de prótons inibe

irreversivelmente a enzima H+/K+-ATPases, como consequência há aumento da

secreção gástrica compensatória e hipergastrinemia. Os efeitos adversos são

náuseas, dor abdominal, prisão de ventre, flatulência e diarréia (Goodman e Gilman,

2010). Segundo Braga e colaboradores (2011), o uso a longo prazo de omeprazol

em humanos pode estar relacionado com a proliferação de células e tumores

carcinoides.

7

Apesar da eficiência das terapias em uso, muitas apresentam efeitos

colaterais, o que estimula a busca por novos agentes antiulcerogênicos. Nesta

busca, os produtos naturais se destacam pois muitas plantas são usadas na

medicina popular por suas propriedades antiulcerogênicas. Dentre as espécies

relatadas popularmente como antiulcerogênica encontra-se a Piper umbellatum. A

fim de comprovar seu uso popular, um dos objetivos desse trabalho foi avaliar a

ação gastroprotetora do extrato diclorometânico das folhas de P. umbellatum.

Novas tecnologias e inovações para garantir o efeito terapêutico das

plantas medicinais vêm sendo empregados na fabricação de medicamentos

fitoterápicos (Feltrin e Chorilli, 2010).

MICROENCAPSULAÇÃO

A microencapsulação é uma tecnologia capaz de encapsular materiais

sólidos, líquidos ou gasosos em pequenas cápsulas permitindo a liberação

controlada sob condições específicas (Fang e Bhandari, 2010).

A primeira aplicação deste processo foi em 1954 com a produção de um

papel de cópia sem carbono. Nessa mesma década, ocorreram as primeiras

pesquisas na área farmacêutica, com o uso das microcápsulas visando aumentar a

estabilidade tanto física, quanto química de uma droga ou modificar sua liberação

em alvos específicos de ação (Ré, 2000)

A microencapsulação pode originar partículas com diferentes morfologias

que podem ser definidas como microesferas e microcápsulas. Nas microesferas, o

recheio (princípio ativo) está uniformemente distribuído na matriz do material

encapsulante, já nas microcápsulas existe um núcleo único envolvido por uma

cápsula do material encapsulante (Munin e Edwards-Lévy, 2011). Além disso, o

tamanho da micropartícula deve ser entre 1 e 1000 µm (Pereira, 2006).

A obtenção das micropartículas pode ser método físico: atomização

(spray drying), leito fluidizado, extrusão centrífuga com múltiplos orifícios, co-

cristalização e liofilização (freeze drying); métodos químicos: inclusão molecular e

8

polimerização interfacial; métodos físico-químicos: coacervação, separação por

fase orgânica, pulverização em agente formador de reticulação química e

envolvimento lipossômico (Munin e Edwards-Lévy, 2011)

A técnica de Spray Drying consiste na formação de micropartículas por

meio da atomização de uma solução constituída de princípio ativo e material

encapsulante. A formação das micropartículas ocorre por contato destas com um

gás (ar) aquecido promovendo a evaporação do solvente. As micropartículas

passam pelo ciclone e caem no frasco coletor (Fang e Bhandari, 2010).

Existem muitos materiais de paredes usados como encapsulantes para

compor a microcápsula, como amido, ciclodextrinas, dióxido de silício coloidal,

fosfato tricálcico, gelatina, goma arábica, lactose, maltodextrina, celuloses

(carboximetilcelulose, acetilcelulose, metilcelulose, etilcelulose e nitrocelulose);

lipídios (parafina, cera, ácido esteárico, triesterina, monoglicerídeo, óleos, gordura

hidrogenada e diglicerídeos); proteínas (glúten, caseína, isolado protéico de soro de

leite, gelatina e albumina).

O amido é um tipo de polímero degradável renovável, oriundo de várias

fontes tais como o milho, a mandioca, dentre outras (Zhang et al., 2010). Apresenta-

se de forma modificada, obtida por processos físicos, químicos, enzimáticos ou por

meios genéticos, para melhorar suas propriedades funcionais específicas não

encontrada nos amidos nativos (Zavareze et al., 2010). Essas modificações

químicas e físicas podem ser por intercruzamento, a substituição, a oxidação e a

pré-gelatinização (Kaur et al., 2012), tornando-se uma alternativa para melhorar

suas limitações, aumentando sua viabilidade na indústria (Spier et al., 2010).

Dessa forma, considerando as diferentes atividades biológicas

comprovadas para a espécie Piper umbellatum e a técnica de microencapsulação

por Spray drying, o objetivo desse trabalho foi verificar a atividade farmacológica de

extrato bruto padronizado (EBP) de Piper umbellatum para a obtenção de um

fitoterápico. Assim, avaliou-se sua ação em modelos de câncer, inflamação e úlcera

gástrica e verificou se a microencapsulação foi capaz de melhorar as características

do extrato e manter sua atividade antiproliferativa in vitro.

9

CAPÍTULO 1: Anticancer and anti-inflammatory activities of a Piper

umbellatum leaves standardized dichloromethane extract

L.H. Iwamotoa,b,#, D.B. Vendramini-Costab,c,#,*, P.A. Monteirob, A.L.T.G. Ruiza,b,

I.M.O. Sousab, M.A. Foglioa,b,d, J.E. de Carvalhoa,b,d, R.A.F. Rodriguesa,b

Affiliation

a Department of Pharmacology, Anesthesiology and Therapeutics, Faculty of

Dentistry, University of Campinas. Av. Limeira, 901, Piracicaba-SP, 13414-903,

Brazil.

b Chemical, Biological and Agricultural Pluridisciplinary Research Center, CPQBA,

University of Campinas. Rua Alexandre Cazelatto, 999, Vila Betel, Paulínia – SP,

13148-218, Brazil.

c Department of Organic Chemistry, Institute of Chemistry, University of Campinas.

Rua Josué de Castro s/n, Cidade Universitária Zeferino Vaz, Barão Geraldo,

Campinas –SP, 13081-970, Brazil.

d Faculty of Pharmacy, University of Campinas, Cidade Universitária Zeferino Vaz,

Campinas – SP, 13081-970, Brazil.

# equally contribution

* Correspondence to: Débora Barbosa Vendramini Costa. 8048 Oxford Avenue,

B24. Philadelphia, PA, 19111, United States of America. Phone +1 (267) 9922027.

Email: vendramini.debora@gmail.com

Abstract

Despite anticancer drug discovery advances, the worldwide cancer incidence is

remarkable. Thus, there is continuous necessity on new therapies development

considering also the tumor microenvironment that offers multiple targets for cancer

therapy, including inflammation. Nature has been a source of medicinal substances

for millennia. Nowadays, almost 75% of the anticancer agents used in chemotherapy

10

are derived from natural products. Continuing our research on Piper umbellatum

leaves anticancer activity, we evaluated a P. umbellatum leaves standardized

dichloromethane extract (SDE), containing 23.92 ± 0.46% of 4-nerolidylcatechol,

with anticancer (in vitro antiproliferative activity and Ehrlich solid tumor model) and

anti-inflammatory (carrageenan-induced paw edema and peritonitis models)

activities. SDE showed in vitro and in vivo antiproliferative activity, being capable to

reduce Ehrlich tumor growth when administered daily by oral route, without signals

of toxicity. SDE also reduced carrageenan-induced paw edema and leukocyte

migration on carrageenan-induced peritonitis model. These results corroborated with

our previous report suggesting that Piper umbellatum leaves anticancer activity

could evolve antiproliferative and anti-inflammatory effects.

Key words: Piperaceae, Piper umbellatum, cancer, inflammation, mice, 4-

nerolidylcatechol.

Abbreviations: 4-NC (4-nerolidylcatechol), SDE (standardized dichloromethane

extract), DCE (dichloromethane crude extract), DMSO (dimethyl sulfoxide), DOXO

(doxorubicin), total growth inhibition (TGI), phosphate buffered saline (PBS), one-

way ANOVA (analysis of variance) sulforhodamine B (SRB), maximum tolerated

dose (MTD), cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LOX), phospholipase A2 (PLA2).

1 Introduction

Nature has been a source of medicinal products for millennia, going along

with the history of humanity. Due to the improvement on methods for isolation,

identification and synthesis during the last century, many drugs have surged from

natural sources. In chemotherapy field, around 75% of the anticancer agents used

nowadays are derived from natural products of different origins, including plants,

microorganisms and marine organisms (Newman and Cragg, 2012). One important

example is the Piper genus (Piperaceae family), which comprises approximately

2000 species, distributed mainly in tropical areas and widely valued for their

medicinal properties (Wang et al., 2014). Piper umbellatum L. is a shrub, popularly

known in Brazil as “pariparoba”, “caapeba” and “malvarisco” (Roersch, 2010).

11

This specie was included in the Brazilian Pharmacopoeia first edition

(1926) and 94 traditional medicinal uses for P. umbellatum are registered (Roersch,

2010). Indeed, there are several pharmacological activities described, such as

antioxidant (Lopes et al., 2013), anti-inflammatory and analgesic (Perazzo et al.,

2005), antibacterial (Isobe et al., 2002), antifungal (Rodrigues et al., 2012), antitumor

(Sacoman et al., 2008), protection against photoaging (Silva et al., 2009) and

anticonvulsants (Okunrobo et al., 2013). Moreover, phytochemical studies of P.

umbellatum leaves extracts have demonstrated the presence of terpenes, alkaloids,

flavonoids, sterols, being the catechol 4-nerolidylcatechol (4-NC) the mainly

compound (Isobe et al., 2002; Baldoqui et al., 2009; Roersch, 2010).

Previous studies performed by our group evaluated the in vitro and in vivo

anticancer activities of P. umbellatum leaves dichloromethane crude extract (DCE)

and its fractions, showing that intraperitoneal (i.p.) treatment with DCE (200 mg/kg)

increased life span of Ehrlich ascitic tumor-bearing animals (Sacoman et al., 2008).

Another study conducted by our group demonstrated that Piper regnellii DCE and its

fractions were capable of inhibiting Ehrlich solid tumor development in mice model

(Longato et al., 2011).

The emergence of a cancer (carcinogenesis) is a complex and multi-step

process during which normal cells progressively acquire a neoplastic phenotype.

Each genetic modification confers to tumor cells a kind of advantage, constituting

the hallmarks of cancer, such as self-sustained proliferation, evasion of suppressing

growth signals, resistance to cell death, limitless replication, inducing angiogenesis,

and activating invasion and metastasis (Hanahan and Weinberg, 2011). Besides

cancer hallmarks, tumor microenvironment also influence cancer development, and

one prominent microenvironment stimuli in carcinogenesis is inflammation

(Grivennikov et al., 2010).

Despite the advances in the field of anticancer drug discovery, the

statistics are noteworthy; in 2012, 14.1 million new cases of cancer were diagnosed

worldwide, with 8.2 million of deaths (Ferlay et al., 2013). Thus, there is still a

necessity for the development of new therapies and in this search the tumor

12

microenvironment offers multiple targets for cancer therapy, including inflammation

(Li et al., 2007).

Bearing in mind the need for new therapies, specially focusing in the

tumor microenvironment and the potential of Piper umbellatum as an anticancer

agent, in this study we evaluated the in vitro and in vivo antiproliferative activities of

a standardized dichloromethane crude extract (SDE) from P. umbellatum leaves,

containing 23.92% of 4-NC. We also evaluated its anti-inflammatory activity, looking

for evidences of the relationship between the SDE anticancer and anti-inflammatory

activities.

2 Materials and Methods

2.1 Phytochemistry

2.1.1 Plant material. Piper umbellatum (L.) Miq. leaves were collected in February

2013 at experimental field of the Chemical, Biological and Agricultural

Pluridisciplinary Research Center (CPQBA – UNICAMP, Paulínia-SP, Brazil). A

voucher specimen was deposited at the Herbarium of Institute of Biology, University

of Campinas (UEC nº181.451). As P. umbellatum is a Brazilian native genetic

material, the Genetic Patrimony Management Board (CGEN/MMA) has approved

the present study, through Access and Shipment Component of Genetic Heritage

for scientific research purpose (no. 010646/2012-4).

2.1.2 Dichloromethane crude extract production. Milled fresh leaves (1kg) were

extract by maceration with dichloromethane (Dinamica®) (1:5 leaves:solvent, 3 x 90

min) at room temperature. After filtration, the filtrates were pooled, evaporated (40°C,

BUCHI model RE 215) and lyophilized (Virtis, model 8L) until dryness, affording DCE

(2% yield).

13

2.1.3 Isolation of 4-Nerolidycatechol. DCE was previously cleaned-up for

pigments and other lipophilic compounds (1g) through liquid partition with hexane:

acetonitrile (1:1) (3 x 100mL). The acetonitrile phase (680mg) was then applied on

a solid-phase extraction (SPE) cartridges C18-E (55 µM, 70 A, 5 g/20 mL)

Phenomenex® preliminarily conditioned with 10 mL methanol and 10mL water, at 5

mL/min flow rate. SPE cartridge was eluted with 2 × 10 mL water:methanol (95:5;

50:50; 85;15 and 0:100, named as FA, FB, FC and FD, respectively), at 3.5 mL/min

flow rate. Fraction FC (190mg) was analysed by RMN1H and 13C.

2.1.4 Chromatographic analysis. HPLC analysis followed a previously described

protocol (Rezende and Barros, 2004). It was performed with a Shimadzu series

HPLC system equipped with on-line degasser (DUG-2A), quaternary pump (LC-

10AT), autosampler (SIL 20A HT), column heater (CTO 10AS Vp), and photodiode

array detector (SPD-M10Vp), using a C18 column (4.6 mm X 250 mm, 5 µm particle

size, Gemini, Phenomenex, Mac-clesfield, UK). Instrument control and data analysis

was carried out using software Class VP 6.13 edition. The isocratic mobile phase

was methanol-acetonitrile-water (62:20:18). Flow was set at 1.0 mL/min, injection

volume 20µL and ultraviolet detection was at 282nm.

2.1.5 Quantification of 4-Nerolidycatechol. 4-NC was quantified in SDE by

analytical curve. Stock solutions (2396 µg/mL) were prepared in methanol and

successively diluted in the range of 48 to 957 μg /mL, two replicates each, in

methanol. All samples were analyzed by HPLC as described in Chromatographic

Analysis. A graphic correlating area under the curve (AUC) with the respective

concentration was plotted and analyzed by linear regression using MS Excel

software (supplementary information section).

14

2.2 In vitro antiproliferative assay

2.2.1 Cell lines. Human tumor cell lines [UACC-62 (melanoma), U251 (glioma),

MCF-7 (breast), NCI-H460 (lung, non-small cells), HT-29 (colon), PC-3 (prostate),

786-0 (kidney), NCI-ADR/RES (ovarian expressing multiple drugs resistance

phenotype) and OVCAR-3 (ovary)] were kindly provided by National Cancer Institute

(Frederick, MA, USA). Non-tumor cell line HaCat (human keratinocytes) was donate

by Prof. Dr. Ricardo Della Coletta, FOP/UNICAMP.

2.2.2 Cell culture. Stock cultures were grown in medium RPMI 1640 (GIBCO)

supplemented with 5% fetal bovine serum (FBS, GIBCO) and 10 U/mL penicillin, 10

µg/mL streptomycin at 37 ºC with 5% CO2.

2.2.3 Antiproliferative assay. Cells in 96-well plates (100 µL cells/well) were

exposed to SDE (0.25, 2.5, 25 and 250 µg/mL in DMSO/RPMI) at 37 ºC, 5% of CO2

in air for 48 h. Doxorubicin (DOXO) was used as standard (0.025, 0.25, 2.5 and 25

µg/mL). Final DMSO concentration did not affect cell viability (0.25%). Before (T0

plate) and after sample addition (T1 plates), cells were fixed with 50% trichloroacetic

acid and cell growth determined by spectrophotometric quantification (540 nm) of

cellular protein content using sulforhodamine B (SRB) assay (Monks et al., 1991).

The TGI (concentration that produces total growth inhibition) was determined

through non-linear regression analysis using the concentration-response curve for

each cell line in software ORIGIN 8.0® (OriginLab Corporation) (Shoemaker, 2006).

2.3 In vivo assays

2.3.1 Animals. Experiments were conducted with Balb/C and Swiss female mice

(20-30g, 90 days old) from the Multidisciplinary Centre for Biological Investigation on

Laboratory Animals Sciences (CEMIB-UNICAMP). Animals were maintained at the

Animal facilities of Pharmacology and Toxicology Division, CPQBA, UNICAMP

15

(Paulínia-SP, Brazil), in a room with controlled temperature 25 ± 2ºC for 12 h

light/dark cycle, with free access to food and water. Animal care and research

protocols were in accordance with the principles and guidelines adopted by the

Brazilian College of Animal Experimentation (COBEA). Protocols were approved by

the Ethical Committee for Animal Research (CEUA), Institute of Biology, UNICAMP

(# 2868-1, 3182-1, 3052-1 and 3183-1). Euthanasia was performed by deeping

anaesthesia followed by cervical dislocation.

2.3.2 Drugs. Indocid (indomethacin 50 mg; Merck Sharp & Dohme), Carrageenan

(Sigma-Aldrich), Dexametasone (Sigma-Aldrich). SDE was emulsified in Tween 80

(Sinth) 0.3% and dissolved in PBS, pH 7.0. Vehicle was PBS, pH 7.0 + Tween 80

(Sinth) 0.3%.

2.3.3 Acute toxicity. Swiss mice (n = 5) were kept in 12h fasting and then treated

orally with SDE 1000 and 2000 mg/kg. Groups were observed during 4 hours and

then daily for 15 days, for general toxicity signals evaluation [body weight loss,

locomotion, behavior (agitation, lethargy), respiration, salivation, tearing eyes,

cyanosis and mortality] (Lapa et al., 2008).

2.3.4 Subcronic toxicity. Balb/C mice (n = 6) were treated orally with vehicle and

SDE (100, 200 and 400 mg/kg), daily, for 21 days. Mice were weighted (every three

days) and daily observed for possible signals of toxicity (Lapa et al., 2008). At the

21th day, blood was collected from retro orbital plexus of each animal for hemogram

analyses (Sysmex ® model Poch-100iV) evaluating total leukocytes (WBC),

erythrocytes (RBC) and platelets (Pt) parameters. Animals were euthanized and

liver, spleen and kidneys were macroscopically evaluated and weighted.

16

2.3.5 Ehrlich solid tumor assay

2.3.5.1 Cells maintenance and preparation. Ehrlich tumor cells were maintained

in the ascitic form in Swiss mice by weekly transplantation of 5x105 cells/animal in

PBS (pH 7.0) (Oloris et al., 2002). For the experiments, cells were prepared at the

density of 1x106 cells/50 L/animal in PBS (Marchetti et al., 2012) after counting in

Neubauer chamber with trypan blue, to exclude non-viable cells and debris.

2.3.5.2 Induction and treatments. Ehrlich cells suspension (1x106 cells/50

L/animal) were inoculated subcutaneously in the flank of Balb/C mice (n = 8). On

5th day, animals with palpable tumors were randomly divided into negative control

(vehicle) and experimental (SDE – 100, 200 and 400 mg/kg) groups that were

treated every day, orally, for 12 days. On 17th day, animals were euthanized and

tumors were removed and weighted. The relative tumor weight was calculated as

tumor weight divided by corporal weight. The growth inhibition ratio was calculated

according to the formula: [(A-B)/A] x100, where A: mean of group control relative

tumor weight, B: mean of group treated relative tumor weight (Marchetti et al., 2012).

2.3.6 Carrageenan-induced paw edema. Experiments were designed according to

Posadas et al. (2004) with modifications. Right hind paw basal volume of Balb/C

mice (n = 8) was measured using a caliper (Mitutoyo®) according to the elipse oblate

formula: V=4

3𝜋𝑎2𝑏, where a is the paw latero-lateral width and b is the dorsal-ventral

width. Then animals were randomly divided into negative control (vehicle), positive

control (indomethacin, 10 mg/kg) and experimental (SDE – 100, 200 and 400 mg/kg)

groups that were orally treated one hour before inflammation induction by

carrageenan solution inoculation (2.5 mg/mL, 40 µL/animal) into the right hind

footpad. The right footpad volume was evaluated at 1.5, 3.0, 4.5, 6.0, 24, 48, and 72

h after carrageenan inoculation. Results were expressed as paw edema variations

(mL, difference between measured and basal paw volumes) versus time.

17

2.3.7 Carrageenan-induced peritonitis. Balb/C mice (n = 8) were randomly divided

into negative control (vehicle), positive control (dexamethasone, 2.5 mg/kg) and

experimental (SDE, 200 mg/kg) groups that were orally treated one hour before

peritonitis induction by carrageenan solution inoculation (500 μg/250μL/animal) into

peritoneal cavity. Four hours later, mice were euthanized and the peritoneal cavity

was washed with 5 mL of PBS containing heparin 5 IU/mL. Total leukocyte was

analysed in peritoneal fluid using a haematology analyser (Sysmex ® model Poch-

100iV).

2.4 Statistical analyses. The results are shown as mean ± SEM. The statistical

significance of difference between groups was assessed by one-way ANOVA,

followed by Newman-Keuls post hoc test using Graph Pad Prism 5.0 software.

Values of p ≤ 0.05 were considered significant.

3 Results and Discussion

3.1 Quantification of 4-NC

4-nerolidylcatechol (94% of analytical purity) was identified by

experimental data comparison with those reported by Baldoqui et al. (2009). In our

study, it was possible to determine by HPLC-DAD quantitative analysis (correlation

coefficient R2 = 0.9995 ± 0.0005; detection limit (LOD) = 11.6 µg/mL; quantification

limit (LOQ) = 35.1 µg/mL) that P. umbellatum SDE presented 23.92 ± 0.46% of 4-

NC yield, considering initial fresh leaves mass.

In spite of Sacoman et al. (2008) described that the most active fraction

in vitro comprised a mixture of steroids instead of the 4-NC fraction, this last

compound was selected as a chemical marker for extract standardization since this

compound is readily isolated and easily quantified both by HPLC-UV-DAD or by

18

GC/MS. Moreover, considering 4-NC activity as a potent antioxidant, this substance

may be involved in the possible anti-inflammatory activity of SDE.

Figure S1: Analytical curve of 4-nerolidylcatechol.

Figure S2: HPLC/DAD chromatogram of dichloromethane extract from P.

umbellatum leaves.

19

3.2 In vitro antiproliferative assay

SDE showed a potent antiproliferative activity, leading to total growth

inhibition of almost all tumor cell lines (TGI values between 6.8 and 14.9 µg/mL),

excepting HT-29 cell line (colon, TGI = 207.3 µg/mL) (Table 1). Moreover, TGI value

(144.6 µg/mL) for HaCaT cells (non-tumor cell line) was higher than those observed

for most tumor cell lines, thus suggesting a selectivity for tumor cell lines. These

promising in vitro antiproliferative results were in accordance with our previous work

(Sacoman et al., 2008) and prompted the study in vivo models.

Table 1. Concentration (µg/mL) of Piper umbellatum SDE and Doxorubicin (DOXO)

required for total growth inhibition of cell lines (TGI valuesa).

Cell lines Total growth inhibition (µg/ml)

Doxo SDE

UACC-62 0.9 6.8 U251 1.6 8.2

MCF-7 0.2 9.3 NCI-ADR/RES 1.9 14.9

786-0 1.1 9.1 CNI-H460 1.9 11.5

PC-3 1.9 8.2 OVCAR-3 1.2 8.3

HT-29 6.2 207.3 HaCat 29.1 144.6

aTGI values were determined by non-linear regression analysis using the ORIGIN 8.0®

(OriginLab Corporation). Experiments were conducted in triplicate and results are

representative of three different experiments.

Considering SDE chemical composition, the observed antiproliferative

effect could be partially attributed to the presence of 4-NC and sterols β-sitosterol,

stigmasterol and campesterol, as Sacoman et al. (2008) and Lopes et al. (2013) had

identified these compounds in P. umbellatum dichloromethane extracts.

β-sitosterol induces apoptosis and G2/M arrest in MDA-MB-231 (breast), PC-

3 (prostate) and HCT (colon) human tumor cell lines (Awad et al., 2001). Moon et

20

al., (2008) in murine fibrosarcoma cells and human leukaemia also reported a pro-

apoptotic activity of β-sitosterol. Moreover, 4-NC also induces alterations in cell cycle

profile of SK-Mel-147 (melanoma), promoting a G1 arrest (Brohem et al., 2012). It is

interesting to notice that Sacoman et al. (2008) described that the steroids fraction

showed a higher in vitro antiproliferative effect compared to the 4-NC fraction, and

that Lopes et al. (2013) observed that dichloromethane extract was more potent than

the 4-NC and sterol fractions in an in vitro antioxidant activity model, hypothesizing

a synergic activity of these compounds.

3.3 In vivo assays

In order of confirm the in vitro P. umbellatum antiproliferative effect, SDE

was evaluated in an Ehrlich solid tumor model in mice. Previous studies with P.

umbellatum DCE had described its in vivo activity in the Ehrlich ascitic tumor model

after intraperitoneal treatment (Sacoman et al., 2008). This model allows evaluation

of bearing-animals life span; however, presents one limitation: when treatments were

conducted by intraperitoneal route, samples were applied at the same place of

Ehrlich tumor cells growth. This way, it was difficult to elucidate parameters of

sample absorption and distribution. Herein, we described the systemic effects of P.

umbellatum SDE, as treatments were performed by oral route and tumor cells were

implanted in the flank subcutaneous of the animals.

3.3.1 Acute and Subchronic toxicity

Before the in vivo anticancer and anti-inflammatory experiments, an acute

toxicity evaluation was conducted in order to determine the maximum tolerated dose

(MTD) that could be used in the long-term studies without adverse effects. No

evidence of toxicity was observed 4 hours after administration of SDE 1000 mg/kg

by oral route, as well as during the following 14 days, when the animals were kept

under observation. However, animals treated with 2000 mg/kg died after 4 hours.

21

Therefore, MTD was determined as 1000 mg/kg dose for single treatment and to

determine doses for repetitive treatments we considered the higher dose as 40% of

MTD, as described by Mi et al. (2009), together with two lower doses. This way, in

vivo experiments were carried out with 100, 200 and 400 mg/kg of SDE, oral route.

In our previous study, a LD50 of 533.71 mg/kg was determined for a single

treatment with P. umbellatum DCE by intraperitoneal route (Sacoman et al., 2008).

Herein, oral LD50 of SDE could be considered in the range of 1000 to 2000 mg/kg.

Such loss of toxicity after change the treatment route (intraperitoneal to oral route)

may suggest that substances responsible for adverse effects in SDE could show low

bioavailability and/or be quickly metabolized when administrated by oral route.

Moreover, when mice were treated every day, during 21 days, with P.

umbellatum SDE 100, 200 and 400 mg/kg, none toxic signals and none

haematological alterations were observed (Table 2). As most chemotherapeutic

agents induce collateral effects, the observed results for P. umbellatum SDE were

encouraging.

Table 2. Haemogram parameters and organs weight (mean ± SEM) from animals

treated (p.o) with Vehicle and P. umbellatum SDE during 21 days.

Organs Vehicle 100 200 400

Liver (g)

0.048 ± 0.001 0.045 ± 0.001 0.046 ± 0.0029 0.051 ± 0.0009

Kidneys (g)

0.012 ± 0.0001 0.012 ± 0.0002 0.013 ± 0.0002 0.012 ± 0.0003

Spleen (g)

0.004 ± 0.0002 0.005 ± 0.0002 0.005 ± 0.0007 0.004 ± 0.0001

Haemogram

WBC (106 /µL)

4.4 ± 0.001 3.3 ± 0.3 3.7 ± 0.7 4.7 ± 0.6

Haemoglobin (g/dL)

0.012 ± 0.0001 14.2 ± 0.2 13.9 ± 0.5 13.9 ± 0.2

Platelet (103/µL)

0.004 ± 0.0002 1278 ± 28.9 1403 ± 76.3 1388 ± 61.9

Vehicle = PBS + tween 80 0.3%, pH 7.0; SDE doses = 100, 200 and 400 mg/kg

22

3.3.2 In vivo Ehrlich solid tumor assay

Solid tumors are structures resembling organs in their complexity and

heterogeneity. Inside these tumors there are differences in pH, oxygen pressure,

and nutrient flux which often contribute to tumor resistance to chemotherapy due to

irregular drugs distribution inside the tumor matrix. Therefore, the development of

experimental models to complement in vitro drug screening is necessary due to the

limitations inherent to cell cultures to predict the behavior of solid tumors to

chemotherapy (Tredan et al., 2007; Smith et al., 2005).

The in vivo anticancer activity of P. umbellatum SDE was evaluated in the

Ehrlich solid tumor in mice. Ehrlich tumor is an aggressive and fast growing murine

breast adenocarcinoma, which is able to develop both in ascitic or in solid form,

depending on whether inoculated (intraperitoneally or subcutaneously, respectively)

(Oloris et al., 2002). Ehrlich tumor cells generate a local inflammatory response

characterized by the increased vascular permeability, which accounts for edema

formation, cell migration and recruitment of the immune response (Stewart, 1959).

After 12 days of P. umbellatum SDE daily treatment, doses of 200 and

400 mg/kg inhibited tumor growth in 38.7 and 52.2%, respectively (p < 0.05), without

signals of toxicity, while 100 mg/kg treatment was not effective (Figure 1). These

results are in accordance with those previous described by our group (Sacoman et

al., 2008), with the benefit of the toxicity loss by changing route and treatment

frequency. As discussed for P. umbellatum SDE in vitro antiproliferative activity, 4-

NC and sterols presents in SDE could be partly responsible for SDE in vivo antitumor

activity.

23

Figure 1. Relative tumor weight of Ehrlich solid tumor after oral daily 12 day-treatment with

Vehicle and P. umbellatum SDE. Relative tumor weight expressed as tumor weight divided

by body weight; Groups (n = 8) were treated daily (during 12 days) by oral route with Vehicle

(PBS, pH 7.0 + Tween 80 0.3%) and SDE 100, 200 and 400 mg/kg; ANOVA (one-way),

Newman-Keuls Multiple Comparison Test, *p<0.05, **p<0.01 = a significant compared to

vehicle group.

Solid tumors are among the leading death causes in western countries,

with growing incidence every year. Although the prognosis of these patients has

been evolved because of early diagnosis and new antitumor therapies, there is still

a need for new treatments (de Groot et al., 2007). Therefore, inhibition of tumor

development by P. umbellatum SDE associated with low toxicity is an exciting result.

Certain types of cancers induce an inflammatory microenvironment

formation, which contributes to tumor development (Walczak, 2011). As previously

mentioned, Hanahan and Weinberg (2011) included inflammation as a facilitator

process, as it provides bioactive molecules such as growth, survival and angiogenic

factors, enzymes that modify the extracellular matrix, among others. In some cases,

the inflammation is already evident in early stages of tumor progression by promoting

tumor development since the action of inflammatory cells can lead to mutagenic

agents’ release (Vendramini-Costa and Carvalho, 2012).

24

In view of the relationship between cancer and inflammation, we

evaluated P. umbellatum SDE anti-inflammatory potential in experimental

inflammation models in mice.

3.3.3 In vivo anti-inflammatory assays

The administration of carrageenan 2.5% in mouse hind footpad induced

a biphasic inflammatory edema (Henriques et al., 1987). Immediately after

carrageenan injection, there is a cascade of mediators release initiates with

histamine, serotonin, bradykinin and phospholipase A2 (PLA2). These mediators

promote an increase in vascular permeability and signal for arachidonate

metabolites (prostaglandins, leukotrienes) and nitric oxide release, until the 6th hour.

The second phase initiates after 24 hours, coinciding with a decrease in edema,

associated with an increase in leukocytes migration, amplifying the inflammatory

response and promoting a second edema within 72h (Posadas et al., 2004).

P. umbellatum SDE treatment significantly inhibited the first phase of

inflammation, in an independent-dose way, as well as indomethacin 10 mg/kg

(Figure. 2). SDE was capable to inhibit inflammation up to 4.5 hours, period

coincident with prostaglandin release, which could suggest an action on

prostaglandins production (Fig. 2). In the second phase, all SDE doses inhibited

inflammation at 48 hours while 400 mg/kg dose also inhibited the second

inflammatory peak (72 h). This result suggests an effect on neutrophil mobilization,

quite similar to the corticosteroids effects that greatly inhibit the cellular phase of

inflammation. Table with % of inhibition per group can be found on support

information section (Table S1).

25

Figure 2. Anti-inflammatory effect of P.umbellatum SDE versus time after inflammatory

stimulus on carrageenan-induced paw edema. Paw edema was measured with a caliper;

results expressed as paw edema in mm3 (mean ± SEM); treatments: P.umbellatum SDE

(100, 200 and 400 mg/kg), Vehicle (PBS, pH 7.0 + Tween 80 0.3%) or indomethacin (10

mg/kg) one hour before intraplantar carrageenan 2.5% injection, n = 8 animals/group.

ANOVA (one-way), Newman-Keuls Multiple Comparison Test; *p<0.05, **p<0.01 and

***p<0.001 in comparison to vehicle group.

26

Table S1. Inhibitory effect of P.umbellatum SDE versus time after inflammatory

stimulus on carrageenan-induced paw edema.

Treatments (mg/kg)

Time (hours) and % inhibition

1.5 3 4.5 6 24 48 72

96

Vehicle 0.15 ± 0.03

0.25 ± 0.03

0.19 ± 0.03

0.05 ± 0.01

0.04 ± 0.001

0.15 ± 0.01

0.16 ± 0.01

0.10 ± 0.02

Indometacin 10

0.11 ± 0.03

(28.7%)

0.10 ± 0.01*** (60.6%)

0.09 ± 0.02**

(54.6%)

0.10 ± 0.02

0.02 ± 0.001

(51.2%)

0.08 ± 0.02

(45.3%)

0.13 ± 0.03

(17.7%)

0.10 ± 0.03

(4.9%)

SDE 100

0.10 ± 0.02

(35.6%)

0.08 ± 0.02 *** (69.6%)

0.05 ± 0.02*** (74.5%)

0.03 ± 0.01

(45.6%)

0.01 ± 0.01

(75.3%)

0.11 ± 0.03

(27.3%)

0.11 ± 0.03

(29.8%)

0.07 ± 0.03

(29.9%)

SDE 200

0.03 ± 0.01*** (79.7%)

0.04 ± 0.01*** (83.1%)

0.04 ± 0.01*** (77.0%)

0.07 ± 0.02

0.021 ± 0.01

(44.2%)

0.06 ± 0.02*

(59.2%)

0.08 ± 0.02

(47.5%)

0.06 ± 0.02

(37.3%)

SDE 400 0.02 ± 0.01*** (82.4%)

0.06 ± 0.01*** (76.9%)

0.058 ± 0.01*** (67.8%)

0.045 ± 0.01

(20.9%)

0.20 ± 0.01

(47.7%)

0.05 ± 0.02*

(69.9%)

0.05 ± 0.02

(70.9%)

0.03 ± 0.01

(69.8%)

Paw edema was measured with a caliper; results expressed as paw edema in mm3 (mean

± SEM); treatments: P.umbellatum SDE (100, 200 and 400 mg/kg), Vehicle (PBS, pH 7.0 +

Tween 80 0.3%) or indomethacin (10 mg/kg) one hour before intraplantar carrageenan 2.5%

injection, n = 8 animals/group. ANOVA (one-way), Newman-Keuls Multiple Comparison

Test; *p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 in comparison to vehicle group.

Previous studies performed with P. umbellatum ethanolic extract

demonstrated its anti-inflammatory activity, with inhibition of the first phase of

inflammation (Perazzo et al., 2005). Another study showed the anti-inflammatory

activity of a β-sitosterol rich fraction obtained from Sideris foetens, which was able

to inhibit paw edema from 3 to 7 hours after inflammatory stimulus (Navarro et al.,

2001). According to these authors, β-sitosterols could be responsible for inhibition of

27

arachidonate metabolites generation and neutrophil migration phase. This way, the

anti-inflammatory effect herein described for P. umbellatum SDE, at higher dose,

could be partly explained by the presence of sitosterols derivatives. Additionally,

Nuñez et al. (2005) observed that P. umbellatum ethanolic crude extract and 4-NC

inhibited the PLA2 enzymatic activity, which could also explain the SDE inhibitory

effect on the first phase of inflammation (arachidonate metabolites generation).

Cytotoxic agents are able to inhibit the cellular phase of inflammation as

demonstrated by Vendramini-Costa et al. (2010). These authors showed that

doxorubicin inhibited the second phase of carrageenan-induced inflammation (after

24 hours of inflammation induction). As P. umbellatum SDE was able to inhibit

carrageenan-induced inflammation second phase (Fig. 2,) and tumor cell

proliferation (Table 1 and Fig. 1), we performed the carrageenan-induced peritonitis

model to evaluate SDE activity on leukocyte migration.

Carrageenan when inoculated in the peritoneum exerts a chemotactic

effect on inflammatory cells mediated by a synergistic action between

prostaglandins, leukotriens and other chemotactic agents producing a sustained

increase in postcapillary venule permeability, which leads to cellular infiltration

(Damasceno et al., 2014).

In carrageenan-induced peritonitis model, leukocytes migration was

inhibited both by dexamethasone (60.5%, 5 mg/kg) and P. umbellatum SDE (52%,

200mg/kg) (Figure. 3). These results corroborated that SDE could inhibit PLA2

activity in a similar way as dexamethasone. PLA2 is involved in arachidonic acid

release from membrane phospholipids, which can be metabolized by COX,

lipoxygenase (LOX) and cytochrome P450 enzymes. (Vendramini-Costa and

Carvalho, 2012).

28

Figure 3. Effect of P.umbellatum SDE on carrageenan induced peritonitis, expressed as

leukocyte count (cells/mL). Results expressed as mean ± SEM (n = 8 animals/group);

treatment: P.umbellatum SDE (200 mg/kg), Vehicle (PBS, pH 7.0 + Tween 80 0.3%) or

dexamethasone (5 mg/kg) one hour before intraperitoneal carrageenan (500 µg/250 µL)

injection. Peritoneal fluid was collected 4 hours after carrageenan stimulus. ANOVA,

Newman-Keuls Multiple Comparison Test, **p<0.01 in comparison to vehicle group.

Based on the results presented here, we conclude that P.umbellatum SDE

has promising antitumor and anti-inflammatory activities, which could be partially

attributed to 4-nerolidylcatechol and phytosterols. In line with P. umbellatum SDE

profile on paw edema and peritonitis model and previously described results on PLA2

inhibition, we hypothesize that SDE interferes on arachidonate metabolites

generation, by inhibiting PLA2 or COX-2 activities. Further studies will be performed

to clarify the biochemical pathways involved in these activities.

Acknowledgments

The authors thank the Chemical, Biological and Agricultural

Pluridisciplinary Research Center (CPQBA/UNICAMP) for the infrastructure.

Authors are grateful to financial support from the Coordenação de Aperfeiçoamento

de Pessoal de Nível Superior (CAPES) and the National Council for Scientific and

29

Technological Development (CNPq) for the research fellowship (L.H. Iwamoto,

133897/2012-5).

Conflict of Interest

The authors declare no conflict of interests.

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35

CAPÍTULO 2: Atividade antiulcerogênica de extrato bruto padronizado de

Piper umbellattum e estudo de mecanismo de ação envolvidos

Resumo

Relevância etnofarmacológica: Na medicina popular, Piper umbellatum é utilizada

como analgésica, antimalárica, sedativa, diurética e antiulcerogênica. O objetivo

desse trabalho foi investigar seu uso popular sobre a atividade antiulcerogênica e

avaliar os possíveis mecanismos de ação envolvidos nessa atividade.

Materiais e métodos: a atividade antiulcerogênica foi avaliada pelo teste de úlcera

induzida por etanol e por indometacina e os mecanismos de ação avaliados foram

a participação do grupo sulfidrilas, NO e prostaglandina, além da avaliação da

secreção gástrica no modelo de ligadura de piloro.

Resultados: O extrato bruto padronizado (EBP) apresentou como dose efetiva em

50 % dos animais (DE50) de 18 mg/kg em modelo de úlcera induzido por etanol e

DE50 de 99,4 mg/kg em modelo de úlcera induzido por indometacina. Seu

mecanismo está ligado a participação do grupo sulfidrilas, aumento de muco e

glutationa.

Conclusão: os resultados comprovam que o uso popular e o mecanismo de ação

está relacionada a sua atividade antioxidante já descrita na literatura. Dessa forma,

Piper umbellatum pode ser fonte promissora para o desenvolvimento de novos

agentes terapêuticos para o tratamento de úlceras gástricas.

1 Introdução

A úlcera péptica é uma desordem do trato gastrintestinal caracterizada

pela presença de lesão na mucosa e considerada uma das principais causas de

morbidade e mortalidade, afetando cerca de 4 milhões de pessoas por ano em todo

o mundo (Malfertheiner et al., 2009; Thorsen et al., 2013), além de ser fator de risco

para o desenvolvimento de câncer gástrico (Vendramini-Costa, Carvalho, 2012).

36

Diversas plantas são usadas na medicina popular por suas propriedades

antiulcerogênicas (Vyahaware et al., 2009). Dentre as espécies relatadas

popularmente para o uso no tratamento de úlceras está a Piper umbellatum L.,

conhecida popularmente como pariparoba, caapeba e malvarisco (Di Stasi e

Hiruma-Lima, 2002). Pertencente à família Piperaceae, esta planta aparece descrita

na primeira edição da Farmacopeia Brasileira de 1926 (Silva, 1929).

Na medicina popular, P. umbellatum possui 94 usos medicinais

tradicionais (Roersch, 2010) como analgésica, antimalárica, sedativa, diurética e

antiulcerogênica (Hammer e Johns, 1993; Balbach, 1971). Na literatura científica

apresenta sua ação anticonvulsivante (Okunrobo et al., 2013), antioxidante (Lopes

et al. 2013; Tabopda et al., 2008; Agbor et al., 2007), anti-inflamatória e analgésica

(Perazzo et al., 2005), antitumoral (Sacoman et al., 2008; Brohem et al., 2009; Lopes

et al., 2013), antifúngica (Rodrigues et al., 2012) e proteção contra o

fotoenvelhecimento (Ropke et al., 2003, 2005, 2006).

Com relação aos estudos fitoquímicos foram identificados terpenos,

flavonas, lignanas, esteróides e 4-nerolidilcatecol (fenilpropanóide) que consiste no

principal metabólito secundário desta espécie (Kijoa et al., 1980; Baldoqui et al.,

2009; Tabopda et al., 2008).

Tendo em vista as diferentes atividades biológicas comprovadas em

animais para a espécie Piper umbellatum e o relato de seu uso pela população como

agente antiulcerogênico, o objetivo desse trabalho foi investigar o uso popular sobre

a atividade antiulcerogênica e avaliar os possíveis mecanismos de ação envolvidos

nessa atividade.

2 Materiais e métodos

2.1 Preparação do extrato bruto padronizado, identificação e quantificação do

4-nerolidilcatecol

37

Folhas de Piper umbellatum foram coletadas em fevereiro de 2013 no

campo experimental do Centro de Pluridisciplinar de Pesquisa Química, Biológicas

e Agronômica (CPQBA/UNICAMP) localizado em Paulínia-SP, Brasil. A sua

exsicata foi depositada no herbário do Instituto de Biologia da Unicamp sob o

nº181451 e supervisão da Dra Maria do Carmo Estanislau do Amaral.

As folhas frescas foram trituradas em moinho de facas Trapp (Brasutil,

trap 40) extraídas por maceração com diclorometano na proporção 1:5 (m/v) durante

3 vezes de 1 ½ h cada, à temperatura ambiente. O extrato bruto padronizado (EBP)

obtido foi concentrado sob vácuo a 40ºC depois liofilizado com rendimento de 2%.

Para o isolamento de 4-NC o EBP foi limpo através da técnica de líquido

partição com acetonitrila e n-hexano (1:1, v/v) 3 x. Depois a fração acetonitrila foi

fracionada em cartucho C-18 (55 µM, 70 A, 5 g/20mL, Phenomenex®) pré-

condicionado com metanol (10 mL) e água com uma taxa de fluxo de 5 mL/min. Em

seguida, a amostra foi aplicada no cartuchos eluído com 2 × 10 ml de água: metanol

(95: 5; 50:50; 85, 15 e 0: 100), originando 190 mg de 4-NC. Esse composto foi

analisado e identificado por RMN de 1H e 13C e comparado com os dados

experimentais relatados por Baldoqui et al. (2009).

Já a quantificação foi feita em HPLC Shimadzu equipado com bomba

quaternária (LC-10 AT), amostrador automático (SIL 20A HT), aquecedor de coluna

(CTO 10 AS Vp) e detector de arranjo de diodos (SPD-M10 Vp), coluna C18 (4,6

mm X 250 mm, 5 um de tamanho de partícula, Phenomenex, Mac-clesfield, Reino

Unido). A fase móvel utilizada foi isocrática com metanol-acetonitrila:água

(62:20:18). O fluxo foi ajustado a 1,0 mL/min, volume de injecção de 20 uL e a

detecção ultravioleta a 282 nm. Para análise dos dados utilizou-se Classe VP

Edição 6.13 (Rezende & Barros, 2004). Preparou-se uma solução estoque de 4-NC

com 2396 µg/mL de 4-NC diluida em metanol. A curva de calibração apresenta 8

concentrações entre 48 e 957 μg /mL. As análises foram feitas em duplicatas

diluídas em metanol.

38

2.2 Animais

Os animais provenientes do Centro Multidisciplinar para Investigação

Biológica na Área da Ciência de Animais de Laboratório (CEMIB) da UNICAMP

foram mantidos durante 40 dias em adaptação ao ambiente do ensaio, em gaiolas

apropriadas, com ciclo de claro-escuro regulado para 12/12 h com temperatura (25

± 2°C) e umidade controlada. Para a avaliação da atividade antiulcerogênica foram

utilizados ratos Wistar fêmeas (180 a 220 g) e no teste de toxicidade aguda

camundongos Swiss fêmeas (25-30 g). Os experimentos foram aprovados pela

Comissão de Ética no Uso de Animais da UNICAMP (Protocolo CEUA 3301-1,3186-

1 e 2868-1).

2.3 Drogas e reagentes

Etanol P.A. (J.T.Baker), Carbenoxolona (Sigma-Aldrich), Ranitidina

(Medley), Indometacina (Indocid- Merck Sharp & Dohme), N-etilmaleimida (NEM)

(Sigma-Aldrich), L-NG-Nitroarginine Methil Ester (L-Name - Sigma-Aldrich), Metanol

(J.T.Baker), Tween 80 (Sinth).

2.4 Toxicidade aguda

Camundongos Swiss foram mantidos em jejum de 12 horas e tratados

por via oral com o EBP nas doses de 1000 e 2000 mg/kg e controle negativo tratado

com o veículo (tampão fosfato e Tween 80, 10ml/kg). Os grupos foram observados

durante 4 horas e então diariamente durante 14 dias. Foram avaliados os

parâmetros de toxicidade como perda de peso corporal, locomoção, comportamento

(agitação, letargia), respiração, salivação, olhos lacrimejantes, cianose e

mortalidade (Lapa et al., 2003).

39

2.5 Úlcera induzida por etanol

Os animais foram tratados com EBP (12.5, 25, 50, 100, 200 e 400 mg/kg),

Carbenoxolona (200 mg/kg) como controle positivo e veículo (10 mL/kg) como

controle negativo, por via oral. A lesão gástrica foi induzida após 1 hora de

tratamento através da administração oral de 4 mL/kg de etanol absoluto. Após 1

hora da indução, os animais foram eutanasiados por aprofundamento da anestesia,

seus estômagos retirados e abertos ao longo da curvatura maior, lavados e

analisados através da contagem e avaliação das lesões ulcerativas (Bighetti et al.,

2005). O índice de lesões ulcerativas (ILU) foi calculado, para cada animal, através

da soma dos parâmetros descrito por Gamberini et al. (1991) (tabela 1). A partir

desse experimento foi determinada a dose efetiva 50 (DE50) de EBP, através da

curva dose-resposta por regressão linear, sendo essa dose selecionada para os

estudo de mecanismo de ação.

Tabela 1 – Parâmetros avaliados nas lesões ulcerativas no estômago.

Descrição Pontos

Perda de pregas da mucosa 1

Descoloração da mucosa 1

Edema 1

Hemorragias 1

Petéquias ≤10 2

Petéquias > 10 3

Úlceras até 1mm *n x 2

Úlceras maiores que 1mm *n x 3

Úlceras perfuradas *n x 4

* n refere ao número de úlceras encontradas.

Após a somatória dos parâmetros foi calculada a inibição do índice de

lesões ulcerativas expresso em porcentagem através da fórmula abaixo:

40

ILU médio controle – ILU médio tratado X 100 = inibição (%)

ILU médio controle

2.6 Úlcera induzida por AINES

Os animais foram tratados com EBP (100, 200 e 400 mg/kg), Ranitidina

(50 mg/kg) como controle positivo e veículo (10 mL/kg) como controle negativo, por

via oral. Após 1 hora de tratamento, a úlcera foi induzida pela administração

subcutânea de indometacina e após 4 horas, os animais foram eutanasiados por

aprofundamento da anestesia. Os estômagos foram retirados, analisados como

descrito no item 2.5. A partir desse experimento determinou-se a dose efetiva DE50

do EBP, através da curva dose resposta por regressão linear (Bighetti et al., 2005).

2.7 Avaliação dos fatores protetores da mucosa gástrica

2.7.1 Determinação do papel dos compostos sulfidrílicos na proteção

gástrica

Os animais foram divididos em quatro grupos de cinco animais. Dois

grupos receberam tratamento prévio, via subcutânea, com N-etilmaleimida (NEM)

na dose de 10 mg/Kg. Após 30 minutos, dois grupos foram tratados com veículo

(controle negativo, 10 mL/kg) e outros dois com EBP (18 mg/kg) (Matsuda et al.,

1999). Após 1 hora seguiu-se o protocolo de úlcera induzida por etanol (Bighetti et

al., 2005).

2.7.2 Determinação do papel do óxido nítrico na proteção gástrica

Os animais foram divididos em quatro grupos de cinco animais. Dois

grupos experimentais receberam anestesia via intraperitoneal e depois foram

41

administrado por via endovenosa (veia peniana) com solução de L-NG-Nitro

arginina Metill Ester (L-Name) na dose de 5 mg/kg para bloqueio da via do óxido

nítrico. Após 30 minutos, dois grupos foram tratados com veículo (controle negativo,

10 ml/kg) e os outros dois com EBP (18 mg/kg) (Sikiric et al., 1997). Após 1 hora,

seguiu-se o protocolo de úlcera induzida por etanol (Bighetti et al., 2005).

2.7.3 Determinação do papel da prostaglandina na proteção gástrica

Os animais foram divididos em 4 grupos de 6 animais. Dois grupos

receberam tratamento prévio com indometacina na dose de 8 mg/kg via

intraperitoneal. Após 30 minutos dois grupos foram tratados com veículo (controle

negativo, 10 ml/kg) e outros dois grupos com EBP (18 mg/kg) (Curtis et al., 1995).

Depois de 1 hora, seguiu-se o protocolo de úlcera induzida por etanol (Bighetti et

al., 2005).

2.7.4 Avaliação da ação sobre parâmetros relacionados ao suco gástrico –

Ligadura de piloro

Os animais foram anestesiados com Xilazina (10 mg/kg) e Quetamina

(100 mg/kg), depois foi realizada a laparoscopia e ligadura de piloro. Os grupos

receberam tratamentos via intraduodenal com Cimetidina (100 mg/kg - controle

positivo), veículo (10 mL/kg - controle negativo) e EBP (18 mg/kg). Após 4 horas, os

animais foram eutanasiados por aprofundamento de anestesia, seus estômagos

retirados e o líquido duodenal total extraído para avaliação de volume, pH e acidez

total [H+] (mM/L) por titulação simples com NaOH 0,1 N, utilizando fenolftaleína 2

% como indicador ácido-base (Monteiro et al., 2012).

2.7.5 Dosagem de muco

Os animais foram tratados com EBP (18 mg/kg), Carbenoxolona (200 mg/kg)

como controle positivo e veículo (10 mL/kg) como controle negativo por via oral.

42

Após 1 hora foi administrado 4 mL/kg de etanol absoluto. Depois de 1 hora os

animais foram eutanasiados, seus estômagos lavados em solução salina 0,9 % para

posterior determinação quantitativa do muco gastroprotetor. A região fundica do

estômago foi retirada, sendo o corpo glandular pesado e mergulhado em solução

de Alcian Blue 0,1 % (10 mL) por duas horas. Em seguida, os estômagos foram

lavados com 10mL de solução de sacarose 0,25 M (2x - sendo a primeira por 15

segundos e a segunda por 45 minutos). A seguir, os estômagos foram transferidos

para uma solução de MgCl 0,5 M (10mL) por duas horas para a extração do corante

complexado com o muco gástrico. Obteve-se uma solução que misturou-se com 10

mL de éter etílico depois foi centrifugou-se por 10 minutos a 3600 rpm, a fase etérea

foi desprezada e a fase aquosa submetida à leitura espectrofotométrica em 598 nm.

Para a quantificação do muco utilizou-se uma curva de calibração de Alcin Blue

(6.25–100 µg) e os resultados foram expressos em µg de Alcian Blue/g de tecido

(Corne et al., 1974).

2.7.6 Determinação dos níveis de glutationa

Os animais foram tratados com EBP (18 mg/kg), veículo (10 mL/kg) e

Carbenoxolona (200 mg/kg). Depois de 1 hora induziu-se a úlcera por etanol com

administração de 4 ml/kg. Após 1 hora os animais foram eutanasiados e os

estômagos retirados, a camada glandular da mucosa gástrica foi pesada e

homogeneizada com um tampão de 200 mM de fosfato de potássio (pH 6,5) em

gelo, utilizando um homogeneizador. Adicionou-se ácido tricloroacético (12,5 %)

foram agitados e centrifugados por 15 min a 3000 rpm. As aliquotas do

sobrenadante foram misturados com um tampão de 0,4 M Tris-HCl (pH 8,9) e 0,01

M de DTNB [5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)], em uma placa de 96 poços. A

absorbância foi medida utilizando um espectrofotómetro a 415 nm. O procedimento

foi realizado a 4 ° C, e os valores individuais obtidos utilizando uma curva padrão

de GSH e expressos como ug de GSH / g de tecido (Sedlak e Lindsay,1968).

43

3 Análise estatística

Os resultados foram expressos através de média ± erro padrão da média. A análise

estatística significativa entre os grupos foi avaliada por ANOVA seguida de teste de

Tukey com p≤0,05. Todas as análises foram realizadas no Software Prisma.

4 Resultados

4.1 Toxicidade oral

A toxicidade aguda foi avaliada com o intuito de observar os eventuais

efeitos secundários e/ou tóxicos e assim, determinar as doses seguras a serem

utilizadas durante o estudo da atividade antiulcerogênica de Piper umbellatum. Não

houve evidência de toxicidade aparente durante as 4 horas após a administração

de EBP 1000 mg/kg por via oral e durante os 14 dias seguintes. No entanto, os

animais tratados com 2000 mg/kg morreram depois de 4 horas. Dessa forma, a dose

de 1000 mg/kg foi considerada segura e nos experimentos foram administrados

EBP nas doses de 100, 200 e 400 mg/kg, via oral.

Em estudo anterior do grupo, foi determinada a DL50 de 533,71 mg/kg

para os tratamentos com extrato bruto diclorometano por via intraperitoneal

(Sacoman et al., 2008), diferente do que foi observado nos animais tratados com

1000 mg/kg por via oral, onde não verificou sinais de toxicidade aparentes. Essa

perda de toxicidade pode estar relacionada à metabolização dos princípios ativos

e/ou a uma baixa biodisponibilidade devido ao tratamento via oral.

4.2 Úlcera induzida por etanol

As doses de 100, 200 e 400 mg/kg de EBP foram avaliadas na úlcera

induzida por etanol e inibiram quase totalmente a úlcera com 92,2; 88,8 e 94 %.

Dessa forma, foram estudadas as doses de 100, 50 e 25 mg/kg que

apresentaram significativo efeito antiulcerogênico, obtendo-se uma gastroproteção

de 91,6 %, 88,6 % e 71,5 % respectivamente e a carbenoxolona mostrou-se eficaz

44

em 92,7 %. A menor dose do EBP (12,5 mg/kg) não foi capaz de prevenir a formação

de úlceras, promovendo somente 23,8 % de inibição o que não foi significativo

estatisticamente (Tabela 2). A partir desses dados, foi possível definir a DE50 para o

EBP de 18 mg/kg.

Tabela 2. Efeito da administração oral única de EBP em modelo de úlcera gástrica

induzida por etanol em ratos Wistar.

Tratamentos Dose (mg/kg) ILU (m±e) Inibição (%)

PBS 10 ml/kg 125,8 ± 12,8 -

EBP

12,5 95,9 ± 17,6 23,8

25 35,9 ± 8,8*** 71,5

50 14,3 ± 4,1*** 88,6

100 10,6 ± 2,8*** 91,6

Carbenoxolona 200 9,2 ± 1,6*** 92,7

Os resultados (índice de lesão ulcerativa) são expressos como média ± erro padrão. Análise

estatística ANOVA seguida de teste de Tukey: *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001.

4.3 Úlcera induzida por AINES

O EBP nas doses avaliadas pelo modelo de úlcera induzido por

indometacina apresentou atividade antiulcerogênica significativa para as doses de

400, 200 e 100 mg/kg com uma proteção de 82 %, 72,7 % e 46,9 %

respectivamente. A ranitidina, controle positivo, na dose de 50 mg/kg foi capaz de

inibir a ulceração em 81,7 % (Tabela 3). Dessa forma, foi possível calcular a DE50

de 99,4 mg/kg para o EBP.

45

Tabela 3. Efeito da administração oral única de EBP em modelo de úlcera gástrica

induzida por AINEs em ratos Wistar.

Tratamentos Dose (mg/kg) ILU (m±e) Inibição (%)

PBS 10 ml/kg 61,2 ± 8,7 -

EBP

100 32,5 ± 10,3* 46,9

200 16,7 ± 3,1*** 72,7

400 11,0 ± 1,1*** 82

Ranitidina 50 11,2 ± 2,2*** 81,7

Os resultados (índice de lesão ulcerativa) são expressos como média ± erro padrão. Análise

estatística ANOVA seguida de teste de Tukey: *p<0,05 **p<0,01 ***p<0,001.

4.4 Avaliação dos fatores protetores da mucosa gástrica

4.4.1 Determinação do papel dos compostos sulfidrílicos na proteção

gástrica

No modelo de úlcera gástrica induzida por etanol com administração

prévia de NEM, o EBP (18 mg/kg) e o EBP+NEM apresentaram atividade

significativas em relação ao veículo e veículo +NEM. Além disso, o EBP exerceu

uma proteção gástrica de 35 %, enquanto que no grupo sem o bloqueio foi de 87,6

%, evidenciando-se desta forma uma perda significativa de atividade do EBP

quando a ação dos compostos sulfidrílicos foi inibida (Figura 1). Dessa forma, pode-

se dizer que a ação gastroprotetora do EBP envolve a ação dos grupos sulfidrilas,

relacionando-se também com uma ação antioxidante.

46

Veí

culo

EBP

EBP+

Nem

Veí

culo

+Nem

0

50

100

150

200

###

***

*

UIL

(m

e)

Figura 1. Efeito da administração oral única de EBP em modelo de úlcera induzida por

etanol com tratamento prévio de NEM em ratos Wistar. Os resultados (índice de lesão

ulcerativa) são expressos como média ± erro padrão. Análise estatística ANOVA (one-way)

seguido por teste de Tukey: *p<0.05, ***p<0.001 (em comparação ao veículo) e ###

p<0.001 (comparação entre EBP e EBP+ NEM).

4.4.2 Determinação do papel do óxido nítrico na proteção gástrica

Na figura 2 é possível verificar queos animais tratados com EBP (18

mg/kg) e o EBP + NEM apresentaram atividade significativas em relação ao veículo

e veículo + NEM. Além disso, o EBP bloqueado continuou sua atividade

gastroprotetora, mostrando assim que sua ação parece ser independente da via do

óxido nítrico.

47

Veí

culo

EBP

EBP +

L-N

ame

Veí

culo

+ L

-Nam

e

0

50

100

150

200

** ***

ILU

(m

e)

Figura 2. Efeito da administração oral única de EBP em modelo de úlcera induzida por

etanol com tratamento prévio de L-Name em ratos Wistar. Os resultados (índice de lesão

ulcerativa) são expressos como média ± erro padrão. Análise estatística ANOVA (one-way)

seguido por teste de Tukey: ** p<0.01, ***p<0.001 (em comparação ao veículo).

4.4.3 Determinação do papel da prostaglandina na proteção gástrica

No modelo de úlcera induzida por etanol com tratamento prévio de

Indometacina, tanto o EBP quanto o EBP + Indometacina conseguiram diminuir

significativamente a úlcera em relação ao veículo. Já em entre eles a porcentagem

de inibição do ILU do EBP (18 mg/kg) foi de 43,9 % e da mesma maneira no grupo

sem o tratamento prévio foi de 40,7 % (Figura 3). Não há diferença estatística entre

os resultados, dessa forma, o mecanismo gastroprotetor do EBP não envolve a

participação de prostaglandinas.

48

Vei

culo

EBP

EBP+I

ndo

Vei

culo

+Indo

0

50

100

150

200

**

***

UL

I (m

± e

)

Figura 3: Efeito da administração oral única de EBP em modelo de úlcera induzida por

etanol com tratamento prévio de Indometacina em ratos Wistar. Os resultados (índice de

lesão ulcerativa) são expressos como média ± erro padrão. Análise estatística ANOVA

(one-way) seguido por teste de Tukey: ** p<0.01, ***p<0.001 (em comparação ao veículo).

4.4.4 Avaliação da ação sobre parâmetros relacionados ao suco gástrico –

Ligadura de piloro

O tratamento com EBP não interferiu em nenhum dos parâmetros

relacionados ao suco gástrico (pH e volume) podendo sua atividade gastroprotetora

estar relacionada a outros fatores (Tabela 4).

Tabela 4- Efeito da administração intraduodenal de EBP em modelo de ligadura do

piloro em ratos.

Tratamentos Dose Secreção gástrica

(mL) pH [H+] (mM/L)

Veículo 10 ml/kg 3,7 ± 0,3 2,9 ± 0,4 0,0152 ± 0,0068

EBP 18 mg/kg 4,6 ± 0,8 2,6 ± 0,3 0,0219 ± 0,0087

Cimetidina 100 mg/kg 2,9 ± 0,1 5,3 ± 0,5** 0,0039 ± 0,0079

Análise estatística ANOVA (one-way) seguido por teste de Tukey: ** p<0.01, ***p<0.001

(em comparação ao veículo).

49

4.4.5 Dosagem de muco

Os animais submetidos ao tratamento de EBP e Carbenoxolona foram

capazes de aumentar a quantidade de muco gástrico secretado no estômago, 1412

± 107 mg/kg e 1661 ± 106,2 mg/kg respectivamente, significativos em relação ao

controle negativo (veículo) 1093 ± 49,85 mg/kg, confirmando assim, a atividade

gastroprotetora do EBP (Figura 4).

Veículo Carbenoxolona EBP

0

500

1000

1500

2000

***

Mu

co

gá

str

ico

(

g/g

)

Figura 4: Efeito da administração oral de EBP (18 mg/kg) na produção do muco

gastroprotetor em modelo experimental de úlcera induzida por etanol em ratos Wistar.

Análise estatística ANOVA (one-way) seguida de teste de Tukey: p<0,001 (*p<0,05

**p<0,01 ***p<0,001) comparado ao veículo.

4.4.6 Determinação dos níveis de glutationa

O EBP foi capaz de aumentar os níveis de glutationa (36,3 %)

significativamente em relação ao veículo. Não houve diferença entre o controle

positivo Carbenoxolona (37,9 %) (Tabela 5).

50

Tabela 5- Efeito da administração oral de EBP (18 mg/kg) na determinação de

níveis de glutationa em modelo experimental de úlcera induzida por etanol em ratos

Wistar.

Tratamento (oral) GSH (µg/g de tecido) % de aumento

Veículo 752.1 ± 84.9 -

Carbenoxolona (200 mg/kg) 1037 ± 11.5 ** 37.9

EBP (18 mg/kg) 1025 ± 26.8 ** 36.3 Análise estatística ANOVA (one-way) seguida de teste de Tukey: p<0,001 (*p<0,05

**p<0,01 ***p<0,001) comparado ao veículo.

5 Discussão

Úlceras induzidas por etanol e por AINEs são modelos clássicos de lesão

gástrica aguda, além de representarem dois dos fatores etiológicos mais

importantes das patologias gástricas humanas, que são o uso crônico de álcool e

de anti-inflamatórios não esteroidais (Murata et al., 2011; Lemos et al., 2011).

O etanol promove lesão na mucosa gástrica pois, ao penetrar

rapidamente, bloqueia a citoproteção gástrica através da precipitação de proteínas,

da liberação de radicais livres e da diminuição dos compostos sulfidrílicos,

promovendo aumento da permeabilidade vascular, necrose e hemorragias, com

consequente formação de lesões gástricas (Ochi et al., 2005). Além disso, a

atividade ulcerogênica do etanol também envolve sua capacidade em dissolver

constituintes do muco gástrico diminuindo assim o potencial de ação transmucosal,

aumentando o fluxo de Na+ e H+ no lúmen e estimulando a secreção de histamina,

pepsina e íons H+ (Szabo e Brown, 1987).

A integridade da mucosa gástrica contra agentes necrotizantes, depende

da produção de prostaglandinas através das ciclooxigenases (COX-1 e COX-2).

Entre os diferentes mecanismos de proteção gástrica, quase todo os processo são

51

estimuladas ou facilitado por prostaglandinas, por isso a inibição da sua síntese

pelos AINEs torna mais susceptível a lesão (Tarnawski et al., 2013).

O presente estudo demonstrou que o tratamento oral com o extrato bruto

diclorometano de Piper umbellatum apresentou atividade gastroprotetora em

modelos de úlcera induzida por etanol e por AINEs, com DE50 de 18 e 99,4 mg/kg

respectivamente. Esses resultados corroboram com seu uso popular (Balbach,

1971) e com os dados encontrados na literatura para outras espécies do gênero

Piper como P. betle, P. carpunya, P. longum, P. aleyreanum e P. tuberculatum que

apresentam efeitos gastroprotetores em diferentes modelos de úlceras (Agrawal et

al., 2000; Morikawa et al., 2004; Trabadela et al., 2008; Burci et al., 2013).

A primeira linha de defesa da mucosa gástrica consiste na barreira muco-

bicarbonato (Laine et al., 2008). Sendo assim avaliou-se a produção de muco em

modelo de úlcera induzida por etanol. Os animais submetidos ao tratamento de EBP

e Carbenoxolona conseguiram aumentar significativamente a quantidade de muco

gástrico secretado no estômago em relação ao controle negativo (veículo),

sugerindo uma ação gastroprotetora do EBP.

A úlcera induzida por etanol está associada a níveis reduzidos de

compostos sulfidrílicos, especialmente glutationa. A participação dos grupos

sulfidrílicos foi estudada através do tratamento prévio com NEM, um composto que

promove alquilação desses grupos encontrados na mucosa gástrica, inativando-os

(Takeuchi et al., 1989). O bloqueio dessa via levou à perda da atividade

gastroprotetora do EBP, sugerindo que sua ação possa estar vinculada aos grupo

sulfidrilas. Além disso, o EBP foi capaz de aumentar significativamente a quantidade

de GSH (glutationa) na mucosa gástrica em relação ao controle negativo (veículo)

impedindo a ação lesiva dos radicais livres sobre as células do estômago. Acredita-

se que esse fato esteja correlacionado com o potencial antioxidante de Piper

umbellatum, já descrito na literatura.

A atividade antioxidante in vitro de P. umbellatum foi descrita pela

primeira vez por Barros et al. (1996). O 4-Nerolidilcatecol, principal metabólito

secundário presente no extrato, possui atividade antioxidante significativa (Barros

52

et al., 1996; Desmarchelier et al., 1997). Além disso, tanto o extrato quanto o 4-NC

atuam na prevenção de danos causados por oxidação na pele em modelo de

estresse oxidativo in vitro e in vivo (Ropke et al., 2002). As metaloproteinases de

matriz (MMPs) 2 e 9 também foram inibidas na presença de 4-NC, em um modelo

de fotoenvelhecimento da pele em ratos (Ropke et al., 2006). O 4-NC inibiu a

produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) através da inibição da atividade

das enzimas catalase e superóxido desmutase (SOD) em fibroblastos humanos e

em células de melanoma humano (Brohem et al., 2012). Segundo Lopes et al.

(2013) avaliou a atividade do extrato etanólico de P. umbellatum e do 4-NC isolado

em ensaio de microplaca para produção de espécies reativas usando para detecção

a sonda fluorescente DCFH-DA nas células de HL-60: o extrato etanólico

apresentou atividade antioxidante com IC50= 1.2 𝜇g/mL, próxima a da vitamina C

(controle positivo, IC50=1.7 𝜇g/mL) e superior ao do 4-Nerolidilcatecol (IC50= 8.6

𝜇g/mL). Lopes et al. (2013) acredita-se que o sinergismo seja o responsável por

essa diferença na atividade antioxidante.

A via de citoproteção através do óxido nítrico também foi avaliada por ser

importante na regulação da secreção de ácido gástrico e da modulação da

integridade da mucosa (Khalifa et al., 2002 e Taha et al., 2012). No trato gastro

intestinal superior, o NO é um potente vasodilatador, aumentando o fluxo sanguíneo

da mucosa gástrica, regulando a secreção de muco e bicarbonato, inibindo a

secreção gástrica no que resulta em proteção da mucosa gástrica. Dessa forma, a

inibição de NO sintase por L-NAME agravou a lesão em modelo de úlcera gástrica

nos animais tratados apenas com o veículo (Konturek et al., 1993). Porém, o

tratamento prévio com L-NAME não interferiu na atividade gastroprotetora do EBP,

demonstrando que seu mecanismo de ação independe da síntese de óxido nítrico.

Já as prostaglandinas desempenham um papel importante na

modulação da integridade da mucosa, ao inibir a secreção de ácido, estimular a

secreção de muco, bicarbonato e fosfolipídeos, aumentar a resistência das células

epiteliais contra danos causados por citotoxinas, além de manter o fluxo sanguíneo,

facilitando a remoção de agentes necrotizantes e ulcerogênicos (Takeuchi e

53

Amagase, 2010). Além disso, inibem a ativação de leucócitos, mastócitos e

aderência plaquetária no endotélio vascular. A maior parte das ações protetoras das

prostaglandinas na mucosa gástrica é mediada por receptores do tipo EP1, os quais

aumentam a secreção de bicarbonato e o fluxo sanguíneo e reduz a motilidade

gástrica, enquanto EP3 e EP4 afetam a secreção de ácido e muco, respectivamente

(Laine et al., 2008). A ação de prostaglandina foi inibida através da administração

prévia de indometacina, por via intraperitoneal, o que potencializou a formação de

úlceras pela administração do etanol nos animais tratados com o veículo. O EBP

por sua vez manteve sua atividade gastroprotetora, sugerindo que não houve ação

do EBP sobre a produção de prostaglandinas, tal como atuam os anti-inflamatórios

não esteroidais.

A secreção ácida é um fator agressor endógeno da mucosa gástrica, é

regulada pelo sistema nervoso central e entérico, células neuroendócrinas e do

sistema imune. Essas células possuem a enzima H +-K+ATPase ou bomba de

prótons, a qual é ativada pela interação da histamina, gastrina e acetilcolina com

seus respectivos receptores e que são responsáveis pela produção de HCl (Gill et

al., 2011). Nossos resultados demonstraram que o EBP, quando administrada por

via intraduodenal, em animais com hipersecreção induzida por ligadura do piloro,

não foi capaz de alterar o volume ou acidez, total e livre, do conteúdo gástrico.

Dessa forma, a atividade gastroprotetora do EBP não está relacionada ao

mecanismo anti-secretor e sua ação foi considerada local pois ao ser avaliado nesse

modelo cujo o tratamento foi sistêmico não houve citoproteção.

6 Conclusão

O extrato bruto diclorometânico de Piper umbellatum apresentou

atividade antiulcerogênica, comprovando o uso popular no tratamento de úlceras

gástricas. Através dos estudos realizados verificou-se que o mecanismo de ação

gastroprotetor envolve a manutenção dos grupos sulfidrílicos, relacionando a

atividade antiulcerogênica à atividade antioxidante já descrita na literatura. Dessa

54

forma, P. umbellatum pode ser fonte promissora para o desenvolvimento de novos

agentes terapêuticos para o tratamento de úlceras gástricas.

7 Agradecimentos

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

(CNPq) pelo apoio financeiro (bolsa de mestrado e pesquisa) de Leilane H. Iwamoto,

João Ernesto de Carvalho e Mary Ann Foglio. A Fapesp e Capes.

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61

CAPÍTULO 3: Microencapsulação do extrato de pariparoba através de spray

drying, empregando-se um amido modificado: atividade antiproliferativa in

vitro e características das partículas

Resumo: A espécie Piper umbellatum é conhecida popularmente como pariparoba, caapeba e

malvarisco. Tendo em vista as diferentes atividades biológicas comprovadas para a essa

espécie seu potencial para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos, o objetivo

desse trabalho foi microencapsular o extrato bruto diclorometânico de Piper umbellatum

com amido modificado (Purity Gum 1773®) por Spray Drying e avaliar sua atividade

antiproliferativa in vitro. A distribuição do tamanho de partículas foi determinado pela técnica

de difração de raio laser e expressaram um diâmetro médio do volume de distribuição de

EBM10 (12 µm) e EBM20 (17 µm) característico para esta técnica. Na microscopia

eletrônica de varredura com fonte de emissão de campo (MEV/FEG) o material

microencapsulado apresentou superfície predominantemente rugosa. O processo de

microencapsulação com o amido modificado permitiu melhorar a característica graxa do

extrato, insolúvel em água, além de manter sua atividade antiproliferativa in vitro.

Palavras chaves:

Piper umbellatum, Spray dryer, amido modificado, câncer

1 Introdução

A espécie Piper umbellatum, pertence à família Piperaceae e é

popularmente conhecida como pariparoba, caapeba e malvarisco. (Di Stasi, 2002)

e usada como analgésico, antimalárico, sedativo, diurético (Hammer & Johns,

1993). Estudo experimentais demonstraram sua ação anti-inflamatória e analgésica

(Perazzo et al., 2005), antioxidante (Lopes et al. 2013; Tabopda et al., 2008, Agbor

et al., 2007), antitumoral (Sacoman et al., 2008, Brohem et al., 2009, Lopes et al.,

2013) e antifúngica (Rodrigues et al., 2012).

62

Nessa espécie estão presentes terpenos glicosilados, flavonas, lignanas,

esteróides e um fenilpropanóide identificado como 4-nerolidilcatecol que é

considerado seu principal metabólito secundário (Baldoqui et al., 2009; Tabopda et

al., 2008, Isobe et al., 2002, Kijoa et al., 1980).

O EBP de Piper umbellatum é viscoso, de característica pastosa, verde

escuro, com comportamento elástico e insolúvel em água, consequentemente difícil

de ser armazenado e de ser administrado.

Hoje na fabricação de medicamentos fitoterápicos busca-se a utilização

de novas tecnologias e inovações para garantir o efeito terapêutico das plantas

medicinais (Feltrin & Chorilli, 2010). Dentre as técnicas de secagem empregadas

com sucesso na preparação de extratos secos pode-se citar a aspersão ou Spray

drying, o leito de jorro, liofilização e evaporação rotativa. Esses processos são

utilizados para obtenção de insumos farmacêutico de interesse para a produção de

fitoterápicos (Silva et al., 2012).

O conceito de microcápsula surgiu da idealização do modelo de uma

célula em que a membrana controla as trocas com o meio externo (Ré, 2000).

Entre os materiais de paredes utilizados para compor a microcápsula

como adjuvantes nesse processo podemos citar o amido, ciclodextrinas, dióxido de

silício coloidal, fosfato tricálcico, gelatina, goma arábica, lactose, maltodextrina entre

outros (Oliveira e Petrovick, 2010).

O amido é um polímero degradável renovável e pode ser obtido a partir

de várias fontes botânicas (Zhang et al., 2010). Além disso, há possibilidade de ser

modificado por processos físicos, químicos, enzimáticos ou por meios genéticos,

para promover propriedades funcionais especificas não encontrada nos amidos

nativos (Zavareze et al.2010). Dentre as modificações químicas e físicas

importantes aplicadas a amidos podemos citar o intercruzamento, a substituição, a

oxidação e a pré-gelatinização (Kaur et al., 2012). Essas modificações de amido

nativo são uma alternativa que vem sendo estudada com o intuito de superar suas

limitações, aumentando sua viabilidade na indústria (Spier et al., 2010).

Tendo em vista as diferentes atividades biológicas comprovadas para a

63

espécie P. umbellatum e seu potencial para o desenvolvimento de novos agentes

terapêuticos o objetivo desse trabalho foi microencapsular o extrato bruto

diclorometano de Piper umbellatum com amido modificado (Purity Gum 1773®) por

Spray drying, para melhorar a sua solubilidade e manter sua atividade

antiproliferativa in vitro.

2 Material e métodos

2.1 Preparação do extrato padronizado, isolamento e quantificação do 4-

nerolidicatecol

Piper umbellatum (folhas) foram coletadas em fevereiro de 2013 no

campo experimental do CPQBA/UNICAMP localizado em Paulínia-SP, Brasil. A sua

exsicata foi depositada no Herbário do Instituto de Biologia da Unicamp sob o

número 181451 e supervisão da Dra Maria do Carmo Estanislau do Amaral.

As folhas frescas foram extraídas por maceração com diclorometano 1:5

(m/v, 3x). O extrato bruto padronizado (EBP) obtido foi concentrado sob vácuo e

depois liofilizado com rendimento de 2%.

O EBP foi purificado pela técnica de liquido partição com acetonitrila:n-

hexano (1:1). A fração acetonitrila foi fracionada em cartucho C-18 (55 µM,70A, 5

g/20mL, Phenomenex®) pré-condicionado com metanol (10 mL) e água com uma

taxa de fluxo de 5 mL/min. Depois, 680mg da fração acetonitrila foi aplicada no

cartucho e eluída com 2 × 10 ml de água: metanol (95: 5; 50:50; 85, 15 e 0: 100),

resultando em 190 mg de 4-NC que foi analisado e identificado por RMN de 1H e

13C e comparado com os dados experimentais relatados por Baldoqui et al. (2009).

Após o isolamento foi feita uma solução estoque de 4-NC com 2396

µg/mL diluida em methanol e curva de calibração com 8 concentrações (48 - 957

μg/mL) para a quantificação de 4-NC em HPLC Shimadzu equipado com bomba

quaternária (LC-10AT), amostrador automático (SIL 20A HT), aquecedor de coluna

(CTO 10AS Vp) e detector de arranjo de diodos (SPD-M10Vp), coluna C18 (4,6 mm

X 250 mm, 5 um de tamanho de partícula, Phenomenex®, Mac-clesfield, Reino

64

Unido). A fase móvel utilizada foi isocrática com metanol-acetonitrila:água

(62:20:18). O fluxo foi ajustado a 1,0 mL/min, volume de injecção de 20 uL e a

detecção ultravioleta a 282 nm. As análises foram feitas em duplicatas diluídas em

metanol e os dados foram analisados através de Classe VP Edição 6.13.

2.2 Preparo da emulsão

Para o preparo da emulsão misturou-se o EBP com Tween 80 (Mapric,

Brasil) até completa dispersão, depois adicionou o etanol 96% GL (Synth, Brasil) e

metade da quantidade de água destilada sob agitação mecânica. Colocou Pluronic®

(Sigma-Aldrich, EUA) e deixou agitar até completa homogeneização. Em um outro

béquer o amido modificado Purity Gum 1773® (National Starch Corn Products UK

Ltd, Reino Unido) foi ressuspendido em água destilada. Depois que as duas fases

estavam prontas gotejou-se o extrato na solução de amido sob agitação em Ultra

Turrax T10 (IKA®, Brasil) a 17.500 rpm (Tabela 1).

Tabela 1: Formulação de emulsão para obter microcápsula de EBP de Piper

umbellatum em mini - Spray Dryer.

Massa (g)

Formulação

EBP

Tween

80 Etanol Pluronic®

Purity Gum

1773® Água

M10 2,06 3,32 2,17 0,49 16,00 75,96

M20 4,93 3,34 2,32 0,57 19,28 69,56

Controle - 2,00 3,00 0,5 20,00 74,5

M10 e M20 (micropartícula com 10 e 20% de EBP) e controle (formulação sem extrato

bruto).

2.3 Microencapsulação por Spray drying

As partículas de EBP de Piper umbellatum foram preparadas em Mini

Spray dryer® – 190 sob as condições operacionais a seguir: temperatura de entrada

65

de ar 140 ± 5° C; 90 - 110 ± 5° C, vazão de ar de 10 L/min, vazão de bombeamento

10 mL/min.

2.4 Caracterização de partícula

2.4.1 Distribuição granulométrica por difração de raio laser

A distribuição granulométrica de partículas foi avaliada pelo método de

difração a laser através do equipamento Laser Scattering Spectrometer Master

Sizer S (modelo MAM 5005, Malvern®, Reino Unido). O diâmetro médio foi

determinado considerando-se o diâmetro médio de uma esfera de mesmo volume

(D[4,3]). Uma pequena quantidade de amostra foi dispersa em isopropanol (Synth),

sob agitação magnética (Tabela 2).

2.4.2 Morfologia da partícula (MEV)

As amostras secas em spray dryer foram fixadas com uma fita dupla face

de cobre em suportes cilíndricos de alumínio de 1 cm de altura por 1 cm de diâmetro

(stubs) (Rosenberg e Young, 1993). Esses cilindros foram submetidos à

metalização com o recobrimento de uma fina camada de ouro, através de uma

corrente de 40 mA durante 180 s, sob vácuo. Todo o processo foi realizado em um

evaporador (Balzer).

As amostras foram avaliadas por microscopia eletrônica de varredura

com fonte de emissão de campo (MEV/FEG) As análises foram realizadas em alto

vácuo, com uma tensão de aceleração do feixe de elétrons de 20 kV.

2.5 Atividade antiproliferativa in vitro

2.5.1 Linhagens celulares

66

As amostras de EBP livre, M10, M 20 e C (controle negativo) e

Doxorrubicina (controle positivo) foram testadas na atividade antiproliferativa in

vitro. Foram selecionadas 10 linhagens celulares, oriundas de tumores humanos,

cedidas pelo Instituo Nacional do Câncer de Frederick, MA, USA: K562 (leucemia),

MCF-7 (mama), NCI-ADR (mama com fenótipo de resistência a múltiplas drogas),

UACC-62 (melanoma), NCI460 (pulmão), PCO3 (próstata), HT29 (cólon), OVCAR

(ovário), 786-0 (rim), U251 (glioma) e linhagem celular não tumoral HaCat

(queratinócitos humanos) foi doada pelo Prof Dr. Ricardo Della Coletta, FOP /

UNICAMP.

2.5.2 Cultura de célula

Célula estoque cresceram em meio de cultura com 5ml de RPMI 1640

(GIBCO BRL) suplementado com 5% de soro fetal bovino (FBS, GIBCO) a 37° com

5% de CO2. Foram adicionados ao experimento da cultura Peniclina:streptomicina

(1000 µ/L: 1000 u/L, 1 ml/L).

2.5.3 Atividade antiproliferativa

Placa de 96 poços foram tratadas por 48horas com EBP livre, M10, M20

e microcápsula vazia nas concentrações de 0.25, 2.5, 25 e 250 µg/ml. Depois as

células foram fixadas com ácido tricloroacético 50 % e a proliferação celular foi

analisada por espectrofotômetro (540 nm) usando método de Sulforrodamina B

(Monks et al., 1991).

A atividade antiproliferativa foi expressa através de valores de inibição

total de crescimento (TGI - Total Growth Inhibition), que representa a concentração

de amostra necessária para que não ocorra crescimento celular foi determinada por

regressão não linear usando software ORIGIN 7.5 (OriginLab Corporation) (Skehan

et al., 1990; Shoemaker et al., 2006).

67

3 Resultados

3.1 Microencapsulação por Spray drying

O aspecto final de micropartículas de EBP de Piper umbellatum e o seu

controle (microcáspula vazia) estão ilustrados na Figura 1.

Figura 1: As amostras de micropartículas de Piper umbellatum e o controle processados

por Spray drying (A e B= M10, M20 e C= controle).

3.2 Caracterização de partícula

3.2.1 Distribuição do tamanho de partícula obtido por difração de raios laser

Após a diluição das amostras e avaliação da distribuição do tamanho de

partícula por difração de raio laser as partículas foram expressas pelo diâmetro

médio do volume de distribuição na Tabela 2.

Tabela 2: Distribuição granulométrica das amostras de EBP de Piper umbelatum

microencapsuladas (M10, M20) e seu respectivo controle expresso µm.

Amostra Tamanho de partícula

(µm)

M10 12

M20 17

Controle 12

A B C

C

68

3.2.2 Morfologia da partícula (MEV)

As amostras M10, M20 e o controle (microcáspula vazia), foram

avaliados por microscopia eletrônica de varredura com fonte de emissão de campo

(MEV/FEG) no aumento de 2000 e 5000 x (Figura 2).

Figura 2: Morfologia externa de micropartículas de EBP e controle pela técnica de Spray

drying por Microscopia eletrônica de varredura (MEV/FEG) em um aumento de 2000 e 5000

X. (1 e 2- M10 e 3 e 4-M20 e 5-6 Controle).

1 2

3 4

6 5

69

Segundo a microscopia as partículas apresentam dm <10 µm o que sugere

uma agregação exressa pela difração de raio laser dm aproximadamente entre 12-

17 µm.

3.3 Atividade antiproliferativa in vitro

As amostras de EBP, M10, M20 e controle (controle negativo) e

Doxorrubicina (controle positivo) foram avaliadas em culturas de células tumorais

humanas (Tabela 3). Com o processo de microencapsulação por Spray drying não

houve diferença significativa na sua atividade avaliada e o controle (formulação sem

o EBP) não inibiu o crescimento celular. Isso é evidenciado na figura 3 onde é

possível verificar que o perfil de atividade antiproliferativa manteve-se o mesmo.

Dessa forma, o processo de microencapsulação do extrato foi satisfatório, melhorou

a solubilidade de EBP e a sua atividade farmacológica continuou.

Tabela 3- Valores de TGI em µg/mL, de Doxo (controle positivo), EBP, M10, M20 e

Controle (controle negativo), concentrações necessárias para inibir totalmente o

crescimento celular.

Células Tratamentos

Doxo Controle EBP M 10 M 20

U251 0,16 >250 7,7 7,6 19,3 MCF-7 1,1 >250 8,6 11,9 11,6 NCL -

ADR/RES 1,2 >250 5,5 11,8 33,1

786-0 0,65 >250 7,5 6,8 10,1 NCI-H460 0,31 >250 15,4 26,6 22,8

PC-3 0,41 >250 9,7 8,2 9,6 OVCAR-03 1,4 >250 6,5 8,9 12

HT29 2,8 >250 8,8 9,6 10,7 HaCat 0,16 >250 11 11,5 26,3

70

Figura 3: Gráficos demonstrativos da atividade antiproliferativa in vitro das amostras

1- Doxo (controle positivo), 2- controle (microcápsula vazia), 3- EBP (extrato bruto

71

padronizado), 4- M10 e 5- M20 (microcápsula com 10 e 20% de EBP) em cultura de

células tumorais humanas relacionando porcentagem de crescimento versus

concentração (µg/ml). Ensaio da Sulforrodamina B após 48h de exposição.

4 Discussão

P. umbellatum é uma planta com tantas atividade farmacológicas

estudadas que a torna promissora para o desenvolvimento de um fitoterápico.

Através da técnica de Spray drying há possibilidade de resolver

problemas relacionados às limitações tecnológicas de extratos vegetais secos e

proteger contra evaporação, oxidação ou reação dos compostos ativos (Belcak-

Cvitanovic et al., 2011). Além deste pode modificar as características físicas, facilitar

a manipulação do material, mascarar odores, sabores e melhor a solubilidade.

A atomização do extrato por Spray Dryer consiste na dispersão da

emulsão através do bico aspersor formando gotículas que entram em contato com

uma corrente de ar aquecido levando a evaporação do solvente (água), e formando

partícula sólida (Oliveira e Petrovick, 2010). As cápsulas podem ser classificadas

de acordo com o tamanho: nanocápsulas (partículas menores que 0,2 µm),

microcápsulas (partículas entre 0,2 e 500 µm) ou macrocápsulas (partículas

maiores que 500 µm) (Ré, 1998).

O material de parede utilizado no processo foi o amido de milho Purity

Gum 1773® comumente usados na preparação de emulsões de aromas, bebidas,

vitamínicos e alimentos líquidos contendo óleos e gorduras. Consiste em um

anidrido octenilsuccínico (OSA) modificado, obtido através de esterificação de

amido nativo com anidrido octenilo succínico (Ruan et al., 2009; Sweedman et al,

2013). Como resultado de tais anfifilicidade, este derivado de amido tem sido

relatado como sendo um emulsionante eficaz (Trubiano, 1995), e usado

preferencialmente como um veículo de liberação controlada do material. Além disso,

é recomendado para substituir a goma-arábica em emulsões de aromas e como um

72

estabilizador para outras emulsões alimentares. É solúvel em água fria e exibe boa

estabilidade e viscosidade.

As partículas oriundas do processo de atomização apresentaram baixo

rendimento devido perdas do extrato que ficou retido nas paredes da coluna

principal de secagem do equipamento. Apesar desse resultado, ao serem avaliadas

na distribuição granulométrica por difração de raios laser expressaram um diâmetro

médio do volume de distribuição desejáveis dentro da escala de

microencapsulação, ou seja, M10 (12 µm), M20 (17 µm) e controle (12 µm). Além

disso, as imagens obtidas por microscopia eletrônica de varredura com fonte de

emissão de campo (MEV/FEG) demonstraram que o material microencapsulado

possui superfície predominantemente rugosa, o que é muito comum para este tipo

de técnica devido à contração das partículas durante a rápida secagem (Rosemberg

et al., 1990).

A atividade anticâncer in vitro foi avaliada através da exposição de

células tumorais humanas, em fase exponencial de crescimento, a diferentes

concentrações das amostras, sendo a quantificação final de células realizada pelo

ensaio da sulforrodamina B (SRB). O ensaio da SRB é consideravelmente rápido,

simples e apresenta sensibilidade comparável àquelas das metodologias

fluorescentes e superior aos ensaios que utilizam corantes visíveis, mesmo em

baixas concentrações celulares (Skehan et al., 1990).

No entanto, estudos adicionais serão realizados para melhorar a

formulação, aumentar seu rendimento e consequentemente melhorar sua atividade

antiproliferativa in vitro através de formulações de liberação controlada e verificar

sua biodisponibilidade em modelos in vivo.

5 Conclusão

O processo de microencapsulação por Spray Dryer do extrato bruto

diclorometânico de Piper umbellatum com o amido modificado Purity Gum 1773®

permitiu modificar a propriedade graxa inerente a este extrato, insolúvel em água,

73

além de manter sua atividade antiproliferativa in vitro. Portanto, a técnica de Spray

drying pode ser um caminho para desenvolver uma microcápsula de Piper

umbellatum.

6 Agradecimentos

Nossos agradecimentos ao CNPq pela bolsa de mestrado.

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77

DISCUSSÃO

A espécie P. umbellatum estudada apresenta muitas atividades

farmacológicas descritas na literatura, porém a maioria dos estudos foram

realizados com o extrato bruto etanólico ou aquoso. Nosso grupo observou que o

extrato bruto diclorometânico possui atividade anticâncer tanto in vitro quanto in vivo

e sua ação estava relacionada com o 4-Nerolidicatecol e o esteróides presentes

nesse extrato (Sacoman et al., 2008). Lopes e colaboradores (2013) também

observaram que na atividade antioxidante in vitro que o extrato etanólico apresentou

maior potência do que as frações contendo 4-NC, sugerindo então uma ação

sinérgica entre os compostos presentes no extrato.

O estudo prévio conduzido por nosso grupo com o EBP das folhas de P.

umbellatum avaliou a ação do tratamento intraperitoneal do extrato em modelo de

tumor ascítico de Ehrlich. Esse modelo permitiu a avaliação da sobrevida dos

animais, mas apresentou a limitação do tratamento ter sido conduzido na mesma

via de inóculo das células de tumor de Ehrlich. Complementando esses dados,

nossos resultados mostraram que o EBP, mesmo quando administrado por via oral,

apresenta atividade antiproliferativa, o que foi comprovado no modelo de tumor

sólido de Ehrlich. Os tumores sólidos estão entre as maiores causas de morte por

câncer (Groot et al., 2007), portanto, a inibição do desenvolvimento do tumor sólido

de Ehrlich pelo tratamento com EBP das folhas de P. umbellatum por via oral é um

resultado promissor.

O surgimento de um câncer (carcinogênese) é um processo complexo e

multi-etapas, onde células normais progressivamente adquirem um fenótipo

neoplásico (Vendramini-Costa e Carvalho, 2012). Nesse processo o ambiente

tumoral tem papel essencial, sendo que a inflamação atua como um importante

estímulo para o desenvolvimento tumoral, influenciando todos os estágios da

carcinogênese (Grivennikov et al., 2010). Tendo-se em vista a íntima associação

entre câncer e inflamação, avaliou-se a ação anti-inflamatória do EBP de P.

78

umbellatum em modelo de edema de pata e peritonite, ambos induzidos por

carragenina.

A administração de carragenina induz um edema inflamatório que é

bifásico; imediatamente após o inóculo de carragenina há liberação de histamina,

serotonina, bradicinina e fosfolipase A2 (PLA2) (Henriques et al., 1987). Esses

mediadores promovem aumento na permeabilidade vascular e sinalizam para a

produção de metabólitos do ácido araquidônico (prostaglandinas e leucotrienos) e

liberação de óxido nítrico. A segunda fase do edema inflamatório (após seis horas

da indução) há a migração leucocitária, o que amplifica a resposta inflamatória e

promove um segundo pico de edema após 72 horas da indução (Posadas et al.,

2004).

O tratamento com EBP inibiu as duas fases do processo inflamatório,

sugerindo uma ação sobre a produção de mediadores iniciais, tais como os

derivados de ácido araquidônico e sobre a migração leucocitária, perfil semelhante

ao de corticóides como a dexametasona que inibe a ação da enzima PLA2 que está

envolvida na liberação de ácido araquidônico dos fosfolipídios de membrana,

inibindo por consequência a produção de prostaglandinas e leucotrienos. De fato,

Nuñez et al. (2005) observaram que o extrato bruto etanólico de P. umbellatum e o

4-NC inibiram a ação enzimática da PLA2 in vitro, demostrando a importância da

padronização do extrato diclorometânico P.umbellatum. .

Acredita-se que o EBP possa atuar sobre o microambiente inflamatório e

também exercer uma ação citotóxica. Vendramini-Costa e colaboradores (2010)

demostraram que o quimioterápico doxorrubicina inibiu a migração leucocitária em

modelo de edema de pata induzido por carragenina, demonstrando que os agentes

citotóxicos são capazes de inibir a fase celular da inflamação, como ocorreu após

tratamento com o EBP.

Pensando no uso contínuo de P.umbellatum como um fármaco para o

tratamento de câncer avaliou-se também a presença de seus efeitos colaterais.

Após 21 dias de tratamento contínuo com o extrato bruto diclorometânico

padronizado em 4-NC, os animais não apresentaram perda de peso corporal, nem

79

alterações em parâmetros hematológicos nas doses terapêuticas, sugerindo

ausência de toxicidade. A dose letal desse extrato é maior que 1000 mg/kg,

enquanto que a maior dose terapêutica utilizada foi a de 400 mg/kg via oral.

Um dos efeitos colaterais mais notáveis nos agentes antiproliferativos é

sua ação sobre a proliferação celular, principalmente as células que possuem alta

taxa replicativa, tais como as da medula óssea e as de mucosas, como a mucosa

gástrica. Tendo em vista a necessidade de agentes que possuam efeitos colaterais

reduzidos e o fato de que a espécie P. umbellatum é utilizada popularmente no

tratamento de úlceras gástricas, verificou-se sua ação gastroprotetora em modelo

de úlcera gástrica em ratos, a fim de comprovar o seu uso popular.

Para os primeiros testes de úlcera escolheu-se o modelo de úlcera

induzido por etanol e por AINES, modelos clássicos de lesão gástrica aguda que

representam dois dos fatores etiológicos mais importantes das patologias gástricas

humanas como o uso crônico de álcool e de anti-inflamatórios não esteroidais

(Murata et al., 2011; Lemos et al., 2011). Através desses modelos verificou-se a

ação gastroprotetora do EBP com DE50 de 18 mg/kg em modelo de úlcera induzido

por etanol e DE50 de 99,4 mg/kg em modelo de úlcera induzido por indometacina,

confirmando assim seu uso popular.

Dentre os agentes gastroprotetores mais importantes estão os

antagonistas de receptores H2 como Ranitidina, os inibidores da bomba de prótons,

omeprazol (Goodman e Gilman, 2010). Dessa forma, investigou-se o mecanismo

de ação que o EBP poderia estar atuando. Assim, o primeiro mecanismo protetor

investigado foi a produção de muco gástrico. O EBP conseguiu aumentar a sua

produção significativamente em relação ao controle negativo. O muco e o

bicarbonato constituem a primeira linha de defesa da mucosa gástrica (Laine et al.,

2008). A ação gastroprotetora do EBP também está relacionada com a participação

de grupos sulfidrilas, pois apresentou uma diminuição significativa da atividade

antiulcerogênica de EBP (de 87,6 % para 35 %) após o pré-tratamento com NEM,

que bloqueou a geração de agentes sulfidrílicos como a glutationa. Além disso, o

modelo de úlcera induzida por etanol na mucosa gástrica está vinculada a

80

diminuição dos níveis de SH, principalmente da glutationa, diminuindo a

gastroproteção (Szabo et al., 1987). O EBP conseguiu aumentar os níveis de

glutationa em modelo de úlcera induzido por etanol. A glutationa consiste em um

tripeptídeo (g-L-glutamil-L-cisteinil-glicina), está presente no organismo em suas

formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) e participa direta ou indiretamente da

síntese de proteínas, metabolismo e proteção celular (Rover Júnior et al., 2001).

Dessa forma, acredita-se que a citoproteção exercida pelo EBP esteja relacionada

com sua ação antioxidante já descrita na literatura. Segundo Reppeto e Llesuy

(2002) os flavonóides conseguem sequestrar o ânion superóxido, radicais hidroxilas

e peroxilas aumentando a secreção de prostaglandinas e muco na mucosa gástrica.

Além disso, a atividade antioxidante de EBP confirmou a proposta de Di Carlo et al.

(1999) de que a atividade antioxidante constitui um dos principais mecanismos

antiulcerogênicos envolvidos com a presença de flavonóides.

Tendo em vista as atividades farmacológicas aqui descritas para o EBP

de Piper umbellatum e o seu potencial como um novo fitoterápico, utilizou-se a

técnica de microencapsulação por spray drying visando a melhora da solubilidade.

Foram desenvolvidas micropartículas com 10 e 20 % de EBP (M10 e M20) e a

partícula controle (formulação sem extrato), utilizando como material de parede

Purity Gum 1773®, amido modificado, na proporção de 20 % de sólidos totais. As

micropartículas foram avaliadas quanto à atividade antiproliferativa in vitro em painel

de linhagens tumorais humanas e sua ação comparada à do EBP livre.

Como esperado, o processo de microencapsulação não interferiu na

atividade antiproliferativa do EBP, ou seja, seu perfil de atividade foi o mesmo

apresentado pelo EBP livre, havendo ainda o benefício da melhora da solubilidade.

Dessa forma, a técnica de Spray Drying representa uma técnica eficiente a ser

aplicada no desenvolvimento de um fitoterápico a partir de Piper umbellatum.

Estudos futuros serão realizados a fim de verificar sua biodisponibilidade in vivo e

bem como sua segurança.

81

CONCLUSÃO

O extrato bruto padronizado de Piper umbellatum demonstrou:

-Atividade anticâncer ao inibir o crescimento do tumoral in vitro e em

modelo de tumor sólido de Erlich in vivo.

-Atividade anti-inflamatória como descrita tanto no uso popular quanto na

literatura e foi possível relacioná-la com sua atividade anticâncer.

-Atividade antiulcerogênica e gastroprotetora relatada pela população no

tratamento de úlceras gástricas. Os mecanismo de ação gastroprotetora envolve a

manutenção dos grupos sulfidrílicos, aumento de glutationa e muco, relacionando

assim atividade antiulcerogênica à atividade antioxidante já descrita na literatura.

O processo de microencapsulação não interferiu na atividade

antiproliferativa do EBP e aumentou sua sobulidade. Dessa forma, a técnica de

Spray Drying representa uma técnica eficiente a ser aplicada no desenvolvimento

de um fitoterápico a partir de Piper umbellatum. Estudos futuros serão realizados a

fim de verificar sua biodisponibilidade in vivo e bem como sua segurança

Portanto, podemos concluir que Piper umbellatum pode ser fonte

promissora para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos tanto para o

tratamento de úlceras gástricas quanto para inflamação e câncer.

82

83

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ANEXO 1

88

ANEXO 2

89

ANEXO 3

90

ANEXO 4

91

ANEXO 5

92

ANEXO 6