AVALIAÇÃO DO EFEITO ADAPTOGÊNICO DA Hydrocotyle bonariensis (Lam.) Spreng.(APIACEAE) EM CAMUNDONGOS RESTRITOS DE SONO

Évani Maia Noronha de Paula Barbosa; Paulo César Ghedini; Lais Morais de Oliveira; Walter Dias Junior; Adryano Augustto Valadão D. Carvalho; Carolina Fernanda Ataídes da Silva; Caio César Barbosa; Thamyres Cunha Rodrigues; Allana Nunes Batista; Renata Mazaro e Costa.

Resumo

Esse estudo visa demonstrar o efeito anticolinesterásico sobre o aprendizado do

tratamento com Hydrocotyle bonariensis em camundongos restritos de sono durante 21

horas por dia, durante 14 dias, pelo método de plataforma múltipla modificada. Foram

usados 88 camundongos Swiss machos, sendo 10 animais para cada grupo

experimental. O tratamento com Hydrocotyle bonariensis, nas doses de 500, 1000 e

2000 mg/kg dia, ocorreu durante os protocolos de restrição de sono. A avalição do

aprendizado foi realizada, utilizando o aparelho de esquiva passiva, no qual a latência

que animal permanece em uma plataforma refere-se ao seu aprendizado. A atividade

colinesterásica foi dosada por método colorimétrico. Nos animais com sono

preservado, somente a dose de 2.000 mg/kg de Hydrocotyle bonariensis promoveu

redução de 60% na atividade colinesterásica (p<0,05), comparando-o ao controle.

Mesmo apresentado diminuição na atividade colinesterásica, não ocorreu alteração no

aprendizado. A restrição de sono isoladamente promoveu aumento significativo de

47% (p<0,05) na atividade colinesterásica dos animais em comparação com o grupo

controle, não interferindo na avaliação do aprendizado. Os animais submetidos à

restrição de sono por 14 dias, tratados concomitantemente com as doses de 500 e

1.000 mg/kg de Hydrocotyle bonariensis, apresentaram latência na plataforma de

100% maior (p<0,05) quando comparado ao controle restrito, que recebeu apenas

água. Esses resultados podem estar associados à redução da atividade colinesterásica

de 30% e 18% (p<0,05) observada nos animais que receberam 500 e 1.000 mg/kg,

respectivamente. Contudo, na dose de 2.000 mg/kg o efeito sobre o aprendizado não

foi observado, apesar da redução significativa de 21% (p<0,05) da atividade

colinesterásica. Dessa forma, a melhora no aprendizado ocorreu nos animais

submetidos à restrição de sono e numa faixa de eficácia entre 500 a 1.000 mg/kg de

Hydrocotyle bonariensis.

Palavras Chaves

Acetilcolinesterase, Memória, Efeito nootrópico.

Introdução

Apesar do uso milenar das plantas na medicina Ayurvédica, muitas espécies

não possuem ainda ensaios farmacológicos que comprovem a ação terapêutica, uma

delas é a Hydrocotyle bonariensis Lam. pertencente à família Apiaceae, que possuí

sinonímia de Hydrocotyle umbellata var. bonariensis (Lam.) Spreng. (MOBOT, 2009). É

uma planta nativa da flora brasileira e presente em todo continente americano,

conhecida popularmente como acariçoba (LORENZI; MATOS, 2008).

Pela medicina Ayurvédica, Hydrocotyle bonariensis possui o efeito Rasayana

(retardo do envelhecimento precoce) que é um dos mais apreciados, principalmente

nos casos de senilidade, envelhecimento precoce, queda de cabelos, perda de

memória e outros sintomas de desgaste psicofísico (GOIÁS, 1988; MELO e FREITAS,

2004, CARNEIRO, 2007). Ainda na base Ayurveda, Reis et al. (1992) e Carneiro

(2009) descrevem ser uma planta eutônica do sistema nervoso central (SNC),

ansiolítica leve, tônica do coração, diurética, depurativa da pele e sistema urinário,

cicatrizante de úlceras cutâneas, podendo ser consumida como a planta toda ou

apenas as suas folhas.

Hydrocotyle bonariensis apresenta como características: planta herbácea,

perene, prostrada, acaule, rizomatosa, aquática. As folhas são simples, peltadas,

espessas, brilhantes, glabras, apresentando nervuras radiadas com traqueídeos

evidentes entre as nervuras, bordo crenado-lobado e pecíolo longo (MARTINS et al.

2008; LORENZI; MATOS, 2002). Muito semelhante à Centella asiatica, contudo a

inserção do pecíolo é diferente.

Quanto à toxicidade de Hydrocotyle bonariensis Santana (2001) demonstrou um uso

seguro em dose aguda de 5.000 mg.kg-1, v.o.

Há hipótese que Hydrocotyle bonariensis atua também estimulando o eixo

hipotálamo-hipófise regularizando funções endócrinas e metabólicas do organismo,

atuando como adaptógena (CHOPRA et al., 1982; NADAKARNI, 1982). Assim, ao

entender que Hydrocotyle bonariensis possui uso na Ayuverda em situações de

estresse, visando reduzir o efeito negativo deste sobre os sistemas orgânicos, buscou-

se nesse estudo, avaliar a ação adaptógena dessa planta em um modelo experimental

de estresse envolvendo o sono.

O sono é uma atividade que ocupa cerca de um terço de nossas vidas e é

fundamental para uma boa saúde mental e emocional, além de ser essencial na

manutenção de uma vida saudável. Contudo, no último século o tempo médio de sono

reduziu em 1 hora e meia e a pressão sobre o tempo de dormir continua crescendo

devido aos hábitos atuais da nossa sociedade (MEERLO et al, 2008).

Em mamíferos, o sono apresenta duas fases distintas: o sono de ondas lentas

(SOL) ou NREM e o sono paradoxal ou REM. Diferentes metodologias vêm sendo

utilizadas para tentar esclarecer a importância das fases do sono. Entre elas, a

privação total de sono, a restrição de sono ou a privação seletiva de uma fase do sono,

como por exemplo, a privação de sono paradoxal.

Sabe-se que a privação crônica de sono promove elevações recorrentes das

concentrações de glicocorticóides e aumenta significativamente a carga alostástica, o

que pode afetar as neuroadaptações (reduções na neuroplasticidade e na

neurogênese) que incidem diretamente no desenvolvimento de doenças (ex:

depressão e insônia crônica), principalmente em indivíduos vulneráveis (MEERLO et

al., 2008). Assim, é importante ressaltar que a privação de sono e o estresse são

fatores indissociáveis.

Dentre os prejuízos diversos promovidos pela perda de sono está a memória. Xu

e colaboradores (2010) demonstraram déficits na memória e aprendizado espacial em

camundongos restritos de sono por 20 dias. Há resultados com crianças que apontam

que a perda de sono interfere negativamente principalmente no desempenho de

tarefas de memórias mais complexas e que exigem abstração, o que envolve áreas

mais superiores corticais (KOPASZ et al., 2010). Uma noite de privação de sono

prejudica significativamente a função do hipocampo, que institui um déficit na

capacidade de assimilar novas experiências para a memória (WALKER, 2008).

O controle do ciclo sono-vigília e os mecanismos que envolvem

memória/aprendizado possuem um elemento em comum, o sistema colinérgico, que

pode ser avaliado por bioensaios que possibilitem quantificar a atividade da

acetilcolinesterase central. Neste contexto, entre prejuízo de sono e perda memória há

intrínseca relação com sistema colinérgico.

Assim, esse estudo foi delineado baseado no entendimento que Hydrocotyle

bonariensis é indicada para reduzir os efeitos do estresse pela medicina Ayurvédica.

Para tanto, o modelo de estresse usado foi a perda de sono. Dessa forma, a hipótese

de trabalho é que Hydrocotyle bonariensis é capaz de reduzir os efeitos negativos da

perda de sono sobre a memória de camundongos.

Metodologia

1. Obtenção da solução de Hydrocotyle bonariensis

A droga vegetal foi gentilmente cedida pela divisão de Farmácia do Hospital de

Medicina Alternativa (HMA) da SES-GO, em um total de 2 kg de pó. Após a

higienização das plantas, a amostra de folha de Hydrocotyle bonariensis foi

fragmentada e dessecada em estufa com circulação de ar a 40 ºC. Em seguida, o

material foi triturado até a forma de pó em moinho de faca tipo Willey. Por ser a via

preconizada para uso humano, as soluções aquosas foram administradas por via oral,

pelo método de gavage. As soluções do pó da planta foram preparadas de maneira a

não exceder 1 mL/100 g de peso corporal. Foram usadas 3 doses: 500 mg/kg dia;

1.000 mg/kg dia (dose para humanos usada no HMA); 2.000 mg/kg dia, ajustadas para

roedores segundo Reagan-Shaw et al., 2008.

2. Material botânico

Os materiais botânicos foram coletados no Hospital de Medicina Alternativa –

HMA, Goiânia/GO, sendo identificados pelo Prof. Emérito Dr. José Ângelo Rizzo do

Instituto de Ciências Biológicas (ICB) da Universidade Federal de Goiás (UFG) e as

exsicatas depositadas no herbário da UFG, sendo o seguinte número para:

Hydrocotyle bonariensis Lam. – UFG 43190 (RIBEIRO-SOUZA et al., 2010).

3. Animais de experimentação

Foram usados 88 camundongos Swiss machos provenientes do Biotério Central

da UFG, sendo 10 animais para cada grupo experimental que ficaram acondicionados

no biotério setorial do Laboratório de Fisiologia e Farmacologia da Reprodução,

Departamento de Ciências Fisiológicas-ICB II. O tratamento com Hydrocotyle

bonariensis ocorreu durante os protocolos de restrição de sono (RS). Após, o 15º dia

os animais foram submetidos à eutanásia por deslocamento cervical seguido de

decapitação para extração do sangue para futuras dosagens de corticosterona. Após a

eutanásia, o encéfalo foi retirado para dosagem de acetilcolinesterase. Esse estudo foi

aprovado pela Comissão de Ética e Uso de Animais da UFG, sob o no. 383/10.

4. Condições laboratoriais de manutenção e seleção dos animais

Os camundongos foram distribuídos em gaiolas de polipropileno devidamente

identificadas (41 X 34 X 17,5 cm) em número de 5 animais por gaiola. A limpeza das

gaiolas era feita três vezes por semana para remoção da serragem utilizada para

forração. Foram mantidos sob temperatura controlada de (23+/- 2ºC) e com ciclo de

claro-escuro de doze horas (das 7:00 às 19:00 h) controlado automaticamente, e com

ração e água à vontade Durante o experimento os animais foram expostos ao

enriquecimento ambiental utilizando-se de folhas de papel e rolinhos de papelão, para

melhorar a qualidade do ambiente e reduzir o estresse (BAUMANS, 2010).

5. Restrição de sono (RS)

Os camundongos foram expostos a RS durante 14 dias pelo método de

plataforma múltipla modificada que consiste em colocar 5 animais em um caixa de

polipropileno (41 X 34 X 17,5 cm) contendo 11 plataformas circulares de 3 cm de

diâmetro, com o nível da água 1 cm abaixo da sua superfície. O número de

plataformas maior que o de animais permite que eles possam mover-se de uma para

outra. Os animais foram restritos de sono por 21 horas por dia. Às 11:00 h os animais

eram alojados em gaiolas de polipropileno com serragem, onde permaneceram até às

13:00 h, permitindo assim 2 horas de sono. A troca de água nas caixas foi feita

diariamente.

6. Dosagem de Acetilcolinesterase (AChE)

Com o desenvolvimento da ciência, a compreensão dos mecanismos de

doenças e dos fenômenos que ocorrem no corpo humano vem aumentando, tal avanço

é possível devido ao aumento de sistemas eficientes e rápidos de bioensaios, tais

como a utilização da enzima acetilcolinesterase, como uma alternativa para a detecção

e seleção de plantas como com ação anticolinesterase (TREVISAN & MACEDO,

2003).

Na avaliação da atividade acetilcolinesterásica (ELLMAN et al., 1961) a enzima

foi obtida de cérebro total de grupos de camundongos homogeneizados em tampão

fosfato, sendo que 1,5 mL de DTNB 0,01 M; 1,8mL de ASCh 0,075 M; 20 mL da

enzima (20 mg proteína/mL) foram colocados em placas espectrofotométricas. A

reação foi monitorada por 10 minutos a 412 nm.

7. Teste de Aprendizado por Esquiva Passiva

O aparelho de esquiva passiva permite avaliar processos mnemônicos

(FORNARI et al, 2006). Esse aparelho consiste em uma caixa contendo o assoalho de

grade que conduz corrente elétrica e uma plataforma isenta de condução de corrente.

O animal é exposto a uma sessão de treino, na qual ele é punido com choque nas

patas após descer de uma plataforma. Na sessão teste, 24 h após a sessão treino, é

registrado o tempo que o animal leva para descer novamente da plataforma, contudo

dessa vez sem a aplicação do choque. Isso é utilizado como uma medida de

aprendizado. A intensidade do choque usada foi de 0,4 mA durante 2 segundos. Sendo

a latência máxima de permanência na plataforma de 150 segundos. O aparelho foi

limpo com álcool a 70%, antes do teste comportamental para eliminar os odores

deixados por camundongos anteriores. Cada animal foi submetido uma vez ao teste.

8. Grupos experimentais

- Sono Preservado com tratamento por 15 dias

C - sono preservado animais receberam água destilada (n= 18 animais)

C500 - recebeu 500 mg/kg/dia de solução aquosa de Hydrocotyle bonariensis (n= 8)

C1000 - recebeu 1.000 mg/kg/dia de solução aquosa de Hydrocotyle bonariensis (n= 8)

C2000 - recebeu 2.000 mg/kg/dia de solução aquosa de Hydrocotyle bonariensis (n= 8)

- Restritos de sono por 15 dias com tratamento concomitante

CR - animais restritos de sono que receberam água destilada (n=16 animais)

R500 - recebeu 500 mg/kg/dia de solução aquosa de Hydrocotyle bonariensis (n=10)

R1000 - recebeu 1.000 mg/kg/dia de solução aquosa de Hydrocotyle bonariensis

(n=10)

R2000 - recebeu 2.000 mg/kg/dia de solução aquosa de Hydrocotyle bonariensis

(n=10)

9. Análise estatística

Os dados foram testados quanto à normalidade e homogeneidade. As amostras

paramétricas foram analisadas pela ANOVA, seguida do teste de Tukey. Nas amostras

não-paramétricas foi usado o teste Kruskal Wallis. O nível de significância foi p≤0,05.

Resultado e Discussão

Na medicina Ayuvérdica a Hydrocotyle bonariensis é usada como adaptógeno e

com ação protetora na memória, com um efeito nootrópico (GOIÁS, 1988; MELO e

FREITAS, 2004, CARNEIRO, 2007). Os resultados obtidos nesse estudo corroboraram

o uso milenar Ayuverda, pois demonstrou que Hydrocotyle bonariensis é um agente

anti-colinesterásico em potencial, e, com efeito nootrópico em animais restritos de

sono.

Os modelos experimentais envolvendo o estudo sobre memória reduzem a

aquisição de novas memórias sob condições de deficiência colinérgica (Ex: usando um

antagonista colinérgico, a escopolamina) (PETERSEN 1977; SARTER et al. 2003,

apud GAIS et al, 2004). Por outro lado, é comum o uso de anticolinesterásicos (Ex:

fisostigmina) como drogas para melhorar aprendizado (GAIS et al, 2004). De acordo

com a literatura, animais submetidos a 96 horas de privação de sono paradoxal antes

do treino mostrou prejudicada aquisição/retenção do aprendizado, em tarefas de

esquiva inibitória (PERRY et al, 2008). Dessa forma, optou-se para induzir

fisiologicamente uma condição de deficiência no aprendizado, usando para tanto, uma

metodologia de restrição de sono.

Como resultados deste estudo, tem-se nos animais com sono preservado, que o

uso da dose de 2.000 mg/dia de Hydrocotyle bonariensis (C2000) promoveu redução

de 60% na atividade colinesterásica, em tecido cerebral, quando comparado ao

controle (C) (p<0,05) (Figura 1).

A restrição de sono, como método para induzir alteração no eixo hipotálamo-

hipófise-adrenal, promoveu aumento significativo de 47% na atividade colinesterásica

dos animais do grupo CR em comparação com o grupo controle (C) (p<0,05). Contudo,

nos animais restritos de sono e tratados com Hydrocotyle bonariensis, quando

comparados com os animais controles restritos (CR), apresentaram redução

significativa da atividade colinesterásica em todas as doses. Houve diminuição de 30%

(R500), 18% (R1000) e 21% (R2000). Esses valores obtidos nesses grupos são

próximos daqueles encontrados no grupo controle com sono preservado (C) (Figuras 1

e 2).

Figura 1. Atividade colinesterásica obtida em cérebros de camundongos com sono

preservado e tratados com Hydrocotyle bonariensis nas doses de 500 mg/kg (C500,

n=8); 1.000 mg/kg (C1000, n=7) e 2.000 mg/kg (C2000, n=8) durante 15 dias, e grupo

controle (C, n= 17) tratado com água destilada no volume de 0,5 ml durante o mesmo

período. Dados expressos em média ± EPM. * p<0,05 em comparação com C.

Figura 2. Atividade colinesterásica obtida em cérebros de camundongos restritos de

sono durante 15 dias e tratados com Hydrocotyle bonariensis nas doses de 500 mg/kg

(R500, n=10); 1.000 mg/kg (R1000, n=10) e 2.000 mg/kg (R2000, n=10), e grupo

controle (CR, n=16) restrito de sono e tratado com água destilada no volume de 0,5 ml

durante o mesmo período. Dados expressos em média ± EPM. * p<0,05 em

comparação com CR.

Os animais com sono preservado e tratados com Hydrocotyle bonariensis não

modificaram a latência na plataforma, comparados com grupo controle (C), ou seja,

não ocorreu efeito nootrópico (Figura 3). Mesmo o grupo C2000 que apresentou

diminuição na atividade colinesterásica, não mostrou diferença no tempo de latência.

Os animais do grupo controle submetidos à restrição de sono (CR), apesar de

apresentaram aumento da atividade colinesterásica em comparação com o grupo

controle com sono preservado (C), não modificaram a latência na plataforma. Os

animais submetidos à restrição de sono por 15 dias e tratados concomitantemente com

as doses de 500 e 1.000 mg/dia de Hydrocotyle bonariensis, apresentaram latência

100% maior quando comparado ao controle restrito (CR), que recebeu apenas água,

(Figura 4). Esses resultados podem estar associados à redução da atividade

colinesterásica observada nesses animais. Contudo, na dose de 2.000 mg/kg o efeito

nootrópico não foi observado, apesar da redução significativa da atividade

colinesterásica (Figura 2). Dessa forma, o efeito nootrópico ocorreu nos animais

submetidos à restrição de sono e numa faixa de eficácia entre 500 a 1.000 mg/kg de

Hydrocotyle bonariensis.

Figura 3. Latência na plataforma da esquiva passiva de camundongos com sono

preservado e tratados com Hydrocotyle bonariensis nas doses de 500 mg/kg (C500,

n=8); 1.000 mg/kg (C1000, n=7) e 2.000 mg/kg (C2000, n=8) durante 15 dias e grupo

controle (C, n= 17) tratado com água destilada no volume de 0,5 ml durante o mesmo

período. Dados expressos em média.

Figura 4. Latência na plataforma da esquiva passiva de camundongos com sono

preservado e tratados com Hydrocotyle bonariensis nas doses de 500 mg/kg (R500,

n=10); 1.000 mg/kg (R1000, n=10) e 2.000 mg/kg (R2000, n=10) durante 15 dias e

grupo controle (C) tratado com água destilada no volume 0,5 ml durante o mesmo

período. Dados expressos em média, * p<0,05 em comparação com CR.

Baseados na quimiotaxonomia, que considera que uma mesma via bioquímica é

mantida entre espécies de uma mesma família botânica (Di STASI, 1999), os dados

obtidos, com Hydrocotyle bonariensis serão discutidos com os dados de Centella

asiatica (L) Urban., Cuminium cyminum Linn e Angelicae sinensis, sendo todas

espécies da mesma família botânica, ou seja, Apiaceae. Uma vez que não foram

encontrados na literatura, até o momento, estudos com Hydrocotyle bonariensis neste

cenário.

Dessa forma, resultados obtidos com o tratamento da Hydrocotyle bonariensis

corroboram com aqueles obtidos com o uso de Centella asiatica, planta conhecida

como Mandookaparni ou Brahmi na medicina Ayuvérdica, que também é utilizada para

promover uma melhora nos déficits cognitivos, por apresentar ação neuroprotetora

(SOUMYANATH et al., 2012). O extrato aquoso de Centella asiatica tem propriedades

de reforço cognitivo e anti-oxidante, de forma dose-dependente (100, 200 e 300 mg/kg

durante 21 dias) mostrou um aumento no comportamento cognitivo na esquiva passiva

e labirinto em cruz elevado (VEERENDRA et al, 2003).

Cuminium cyminum Linn, conhecida como cominho, também da família

Apiaceae, apresentou melhora na cognição de ratos de forma dose-dependente, os

animais receberam doses do extrato de 100, 200 e 300 mg/Kg. Mostrando-se eficiente

no combate ao estresse e transtornos relacionados (KOPPULA et al, 2011).

Outro fator que pode explicar o efeito anti-colinesterásico de Hydrocotyle

bonariensis, é a possível presença de Z-ligustilide, que é o principal ingrediente ativo

da família Apiaceae, encontrado em Angelicae sinensis. Um estudo demonstrou que Z-

ligustilide pode aumentar sinergicamente a cognição e neuroproteção, por via

colinérgica (CHENG et al, 2011).

O sistema colinérgico possui um papel significativo no aprendizado e memória

(GOMES et al, 2010) também apresenta um papel fundamental no ciclo sono-vigília.

Uma das regiões mais envolvidas com os aspectos de cognição, incluindo aprendizado

e memória, é o prosencéfalo basal (McKINNEY et al, 2005). Região associada,

também, ao ciclo sono-vigília (Alóe et al, 2005). Para indução do sono NREM (Non-

Rapid Eye Movements), um dos fatores é a redução da atividade colinérgica no

prosencéfalo basal (ALÓE et al, 2005), o que também é necessário durante o sono de

ondas lentas (SOL).

Segundo, Hasselmo (1999), durante vigília a atividade colinérgica é elevada o

que permite a codificação de novas memórias declarativas, contudo, a atividade

colinérgica reduzida durante SOL, possibilita a repetição espontânea de informação

recém-adquirida no hipocampo. Essa repetição é entendida como necessária para

transferir a informação temporária a partir do hipocampo para o armazenamento

neocortical permanente, para então, promover a consolidação da memória (BUZSÁKI

1989; HASSELMO, 1999).

Como o modelo de restrição de sono usado caracteriza-se por inibir,

preferencialmente, o sono REM (Rapid Eye Movements), pode sugerir que durante os

15 dias de restrição usados nesse estudo, foi estabelecido um mecanismo central

compensatório para manter o sono NREM, aumentando, portanto a atividade

colinesterásica e reduzindo a acetilcolina, o que foi observada nos animais restritos de

sono sem tratamento com Hydrocotyle bonariensis, grupo CR (Figura 2). Contudo,

essa alteração enzimática, não foi suficiente para modificar o padrão de aprendizado

dos animais restritos de sono em comparação com o grupo controle na sessão teste.

Por outro lado, os animais restritos de sono que foram tratados com Hydrocotyle

bonariensis apresentaram efeito nootrópico, ao aumentarem a latência na plataforma.

Essa resposta positiva pode estar associada ao fato da Hydrocotyle bonariensis

apresentar um efeito anticolinesterásico significativo. Assim, essa planta ao reduzir a

ação colinesterásica, promoveu aumento na acetilcolina cerebral, acarretando um

efeito protetor no aprendizado durante a restrição de sono.

Os resultados apontam que Hydrocotyle bonariensis melhora o aprendizado em

animais restritos de sono provavelmente restabelecendo a atividade colinesterásica,

modificada pela restrição de sono.

Conclusão

Hydrocotyle bonariensis possui efeito nootrópico associado à redução da

atividade colinesterásica na presença de restrição de sono.

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